KR20200086665A - 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 신장 오가노이드 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 오가노이드 및 방법은 다양한 적용 예컨대 질환 모델링, 약물 스크리닝, 재생 의료 및 신장 세포의 5 규모확대 생산에 사용될 수 있다.

Description

조성물 및 방법
본 개시내용은 신장 오가노이드 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 오가노이드 및 방법들은 다양한 적용 예컨대 질환 모델링, 약물 스크리닝, 재생 의료 및 신장 세포의 생산 규모확대에 사용될 수 있다.
신장은 노폐물의 제거 및 체액 부피를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 기능성 작업 단위는 네프론으로 알려져 있다. 인간 신장은 혈액 여과를 담당하는 최대 2백만개 상피 네프론을 함유하고 이들 모두는 출생후에 발생한다. 출생후 인간 신장에 네프론 전구체는 존재하지 않는다. 이 전구체 모집단의 부재는 네프론 자기-재생 능력이 없음을 보증하고, 따라서 후속적인 손상, 노화 및 질환은 말기 신장 질환(ESDR)으로 이어질 수 있다. ESDR의 치료를 위해 사용된 제한된 치료 선택은 일반적으로 이미 손상된 신장에 추가의 스트레스를 준다. 신장 질환의 말기 단계에서 유일하게 이용 가능하지만 고비용의 치료 선택은 투석 및/또는 신장 이식이며, 이 둘 모두는 상당한 단점이 있고 환자의 삶의 질에 영향을 미친다.
인간 배아 줄기 세포(hES: human embryonic stem cell) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPS: human induced pluripotent stem cell)를 포함한, 인간 만능 줄기 세포(hPSC: human pluripotent stem cell)의 뚜렷한 세포 종점으로의 지향된 분화는 신장을 포함한 다양한 인간 조직의 오가노이드 모델의 생성을 가능하게 하였다. 이전의 오가노이드 모델 예컨대 문헌 [Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568]에서 논의된 것들은 비싸고, 복잡한 3차원 구조를 가지는 오가노이드를 생성할 수 있어, 이미지형성 및 스크리닝 적용에서 이들의 사용을 제한한다. 이들 오가노이드 또한 배양 3주 후에 확산 제한의 대상이 되어, 증가된 세포 수를 생성하는 그것의 능력 및 성숙하는 그것의 능력을 제한한다. 이것은 차례로 신장 오가노이드 생산에 대한 현행 프로토콜을 재생 의료 또는 질환 모델링을 위한 차선의 세포 공급원으로 만든다. 신규한 신장 오가노이드 및 그것의 제조 방법이 따라서 필요하다.
본 발명자들은 간소화한 3차원 구조를 갖는 신장 오가노이드를 놀랍게도 확인했다. 그와 같은 오가노이드는 이들이 이미지화하고 장기간 배양하기에 용이하기 때문에 유리하다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 50개 미만의 네프론을 포함하는 신장 오가노이드를 포괄한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 25개 미만의 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 15개 미만의 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 5 내지 12개의 네프론을 포함한다. 일 예에서, 신장 오가노이드는 신장 오가노이드 발달을 촉진시키기에 충분한 조건 하에서 세포 배양 배지에서 중간 중배엽(IM: intermediate mesoderm) 세포의 모집단을 스월링(swirling)시킴에 의해 생산된다. 이 실시예에서, IM 세포 배양 배지는 약 180 내지 220 ng/ml FGF9을 포함할 수 있다.
일 예에서, 신장 오가노이드는 0.5 x 106 내지 1.5 x 106 IM 세포/ml를 스월링시킴에 의해 생산된다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 약 0.8 내지 1.2 x 106 IM 세포/ml를 스월링시킴에 의해 생산된다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 네프론 마커를 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2, LHX1, SIX1, OSR1, WNT11 및 GATA3 중 임의의 하나 이상을 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2, LHX1, SIX1, OSR1, WNT11 및 GATA3을 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11, GATA3, PAX8, EYA1 및 CITED1 중 임의의 하나 이상 및/또는 낮은 수준의 PDGFRA, MEIS2, WT1 및/또는 C-RET 중 임의의 하나 이상을 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2, LHX1, SIX1, OSR1, WNT11, GATA3, PAX8, EYA1 및 CITED1을 발현하는 세포를 포함한다.
다른 예에서, 신장 오가노이드는 H9, hES3, iPSC GAPTrap td-Tomato, CRL1502.C32, CLR1502.3, hES3 SOX17mCherry 또는 H9 GAPTrap Luc2로 구성된 군으로부터 선택된 줄기 세포로부터 유래된다.
다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 기질 마커(stromal marker)를 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 PDGFRA, MEIS2, WT1 및/또는 C-RET를 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 NPHS+ 발세포(podocyte), LTL+ 근위 분절, ECAD+ 원위 분절, ECAD+/GATA3+ 집합관 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 약 1 x 104 내지 5 x 104 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 약 1.5 x 104 내지 2.5 x 104 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 약 250 내지 500 μm의 직경을 갖는다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 18일 동안 스월러(swirler) 배양에서 생존가능하게 남는다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 3주 동안 스월러 배양에서 생존가능하게 남는다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 4주 동안 스월러 배양에서 생존가능하게 남는다. 다른 예에서, 신장 오가노이드 네프론은 집합관(GATA3+; ECAD+), 초기 원위 요세관(GATA3-; LTL-; ECAD+), 초기 근위 요세관(LTL+; ECAD-) 및 사구체(WT1+)를 포함한다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도 본원에 개시된 신장 오가노이드의 세포는 스월러 배양에서 7일 후 분열을 지속한다(예를 들어 D7+7)는 것을 확인했다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 이것은 스월러 배양을 사용하여 생산된 오가노이드가 치료적 적용 예컨대 이식에 보다 적합하다는 것을 나타낼 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 신장 오가노이드를 포함하는 조성물을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 신장 오가노이드 또는 이의 소화물을 포함하는 조성물을 포괄한다. 예를 들어, 본 개시내용은 본원에 정의된 신장 오가노이드 또는 이의 효소 소화물을 포함하는 조성물을 포괄한다.
다시, 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본원에 개시된 신장 오가노이드의 낮은 복잡성은 이들을 이식용 조성물을 생산하는데 더 적합하게 할 수 있다고 생각된다. 예를 들어, 낮은 복잡성 신장 오가노이드로부터 생산된 조성물은 기형종 또는 연골을 형성하기보다는 바른 세포 유형으로 분화하는 것으로 더 기울어 질 수 있다. 다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 신장 오가노이드의 효소 소화를 포함하는 조성물을 포괄한다.
다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신장 질환을 치료하는 방법을 포괄한다. 일 예에서, 본 조성물은 전체의 오가노이드를 포함한다. 다른 예에서, 본 조성물은 본원에 개시된 오가노이드의 소화물을 포함한다. 예를 들어, 신장 질환은 신부전일 수 있다. 일 예에서, 본 조성물은 정맥내로 투여된다. 다른 예에서, 본 조성물은 신장 동맥 주입, 신장 실질 주입, 이식(implantation) 또는 피막하 이식(subcapsular transplantation)을 통해 투여된다.
다른 예에서, 본 개시내용은 신장 오가노이드를 생성하는 시험관내 방법을 포괄하고, 상기 방법은 FGF를 포함하는 세포 배양 배지에서 중간 중배엽(IM) 세포의 모집단을 스월링하는 단계를 포함한다.
일 예에서, 본 방법은 시험관내 신장 세포 유형의 생산을 규모-확대하기 위한 비용-효율적인 수단을 제공한다. 일 예에서, IM 세포는 FGF, CHIR 및 헤파린을 함유하는 배양 배지에서 스월링된다. 일 예에서, IM 세포는 적어도 5일 동안 배양물에서 스월링되고, 여기서 처음 24시간은 FGF, 헤파린, CHIR 및 ROCK 억제제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 스월링하는 단계를 포함하고 다음 4일은 FGF, 헤파린 및 CHIR을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이 실시예에서, ROCK 억제제는 처음 24시간 동안 세포 배양 배지에 존재하고 다음 날 동안은 세포 배양 배지에서 부재한다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 100 내지 300 ng/ml FGF9를 포함한다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 180 내지 220 ng/ml FGF9를 포함한다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 PVA 및 MC를 포함한다. 일 예에서, 처음 24시간은 FGF, 0.5 내지 1.5 μg/ml 헤파린, 0.5 내지 1.5 μΜ CHIR 및 9 내지 11 μΜ ROCK 억제제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 스월링하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 다음 4일은 FGF, 0.5 내지 1.5 μg/ml 헤파린 및 0.5 내지 1.5 μΜ CHIR을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 스월링하는 단계를 포함한다. 이 실시예에서, ROCK 억제제는 다음 4일 동안 세포 배양 배지에서 부재한다. 다른 예에서, 다음 4일은 FGF9, 헤파린, CHIR, MC 및 PVA를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 다음 4일은 FGF9, 헤파린, CHIR, 0.05 내지 0.2% MC 및 0.05 내지 0.2% PVA를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 배양에서 나머지 일인 적어도 5일 후, 세포는 0.05 내지 1.5% PVA 및 0.05 내지 1.5% MC를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된다. 이 실시예에서, 세포 배양 배지는 FGF9, 헤파린, CHIR 또는 ROCK 억제제 없이 PVA 및 MC를 함유할 수 있다. 다른 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 적어도 100 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 적어도 150 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 150 내지 250 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 180 내지 220 ng/ml FGF9를 포함한다.
일부 예에서, 본원에 개시된 신장 오가노이드를 생산하는 방법은 문헌 [Takasato et al. (2015)]에 기재된 것과 같은 스월링하는 단계 없이 생산된 오가노이드로부터 수득된 세포 수율과 비교하여 개선된 세포 수율을 초래한다. 일 예에서, 스월러 배양에 첨가된 IM 세포의 개시 수로부터 세포 수율에서 30 배수 증가가 스월러 배양에서 10일 후에 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 스월러 배양에 첨가된 IM 세포의 개시 수로부터 세포 수율에서 35 배수 증가가 스월러 배양에서 10일 후에 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 스월러 배양에 첨가된 IM 세포의 개시 수로부터 세포 수율에서 40 배수 증가가 스월러 배양에서 12일 후에 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 스월러 배양에 첨가된 IM 세포의 개시 수로부터 세포 수율에서 45 배수 증가가 스월러 배양에서 12일 후에 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 스월러 배양에 첨가된 IM 세포의 개시 수로부터 세포 수율에서 30 내지 40 배수 증가가 스월러 배양에서 12일 후에 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 스월러 배양에 첨가된 IM 세포의 개시 수로부터 세포 수율에서 30 내지 40 배수 증가가 스월러 배양에서 18일 후에 관찰될 수 있다.
일 예에서, IM 세포는 30 내지 90 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, IM 세포는 18 내지 24일 동안 스월링된다.
다른 예에서, IM 세포는 적어도 7일 동안 줄기 세포의 모집단을 배양함에 의해 생산되고, 여기서 처음 4 내지 5일은 적어도 6 Μμ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 배양에서의 나머지 일은 FGF 및 적어도 0.5 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 예에서, Wnt/β-카테닌 효능제는 CHIR이다. 이들 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 100 내지 300 ng/ml FGF9를 포함할 수 있다. 이들 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 0.5 내지 1.5 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 이들 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 0.5 내지 1.5 μg/ml 헤파린을 더 포함할 수 있다. 일 예에서, IM 세포는 EDTA 또는 트립신 또는 TrypLE™ select로 해리되고 스월링 단계 전에 메쉬 스크린을 통해 통과된다. 일 예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS: induced pluripotent stem) 세포이다. 일 예에서, 줄기 세포는 H9, hES3, iPSC GAPTrap td-Tomato, CRL1502.C32, CLRl 502.3, hES3 SOX17mCherry 또는 H9 GAPTrap Luc2로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명자들 본 개시내용의 방법은 상대적으로 낮은 개시 세포 수를 필요로 한다는 것을 확인했다. 이것은 오가노이드 및 세포 배양의 비용 효과적인 규모 확대를 가능하게 하기 때문에 유리하다. 따라서, 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 0.5 x 106 IM 세포/ml 내지 3 x 106 IM 세포/ml의 모집단을 스월링하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 약 0.8 x 106 IM 세포/ml 내지 1.2 x 106 IM 세포/ml의 모집단을 스월링하는 단계를 포함한다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 신장 오가노이드를 포괄하고, 여기서 상기 오가노이드는 IM 세포의 모집단을 스월링시킴에 의해 생산된다. 신장 오가노이드를 생산하기 위해 IM 세포의 모집단을 스월링하기 위해 사용된 예시적인 타이밍 및 배양 배지는 본원에서 개시되어 있다. 일 예에서, 오가노이드는 0.5 x 106 IM 세포/ml 내지 3 x 106 IM 세포/ml를 포함하는 IM 세포 모집단을 스월링시킴에 의해 생산된다. 다른 예에서, 오가노이드는 2 x 106 미만 IM 세포를 포함하는 IM 세포 모집단을 스월링시킴에 의해 생산된다. 다른 예에서, 오가노이드는 0.5 x 106 IM 세포/ml 내지 1.5 x 106 IM 세포/ml를 포함하는 IM 세포 모집단을 스월링시킴에 의해 생산된다. 다른 예에서, 오가노이드는 약 0.8 x 106 IM 세포/ml 내지 1.2 x 106 IM 세포/ml를 포함하는 IM 세포 모집단을 스월링시킴에 의해 생산된다.
다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 방법에 의해 생산된 신장 오가노이드를 포괄한다.
다른 예에서, 본 개시내용은 신독성에 대한 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 본원에 정의된 신장 오가노이드를 후보 화합물과 접촉시켜 후보 화합물이 신장독성인지 아닌지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일 예에서, 후보 화합물은 소분자이다.
다른 예에서, 본 개시내용은 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생산하기 위해 사용되는 경우 본원에 정의된 신장 오가노이드, 세포 모집단 또는 조성물을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용은 신장 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 신장 오가노이드, 세포 모집단 또는 조성물을 포괄한다. 일부 예에서, 세포 모집단은 신장 오가노이드의 효소 소화로부터 유래된 세포를 지칭한다.
본 발명자들은 또한 저농도의 CHIR을 포함하는 배지에서 줄기 세포를 배양하고 오랜 기간 동안 Wnt/β-카테닌 신호전달을 활성화시키는 것이 개선된 중간 중배엽을 생성하는데 유익하다는 것을 놀랍게도 확인했다.
일 예에서, 본 개시내용은 중간 중배엽(IM) 세포를 생성하는 시험관내 방법을 포괄하며, 상기 방법은 FGF 및 4 μΜ 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 2 내지 5일 동안 후측 원시선(PPS: posterior primitive streak) 세포의 모집단을 배양하는 단계를 포함한다.
다른 예에서, 줄기 세포는 대략 7일 동안 CHIR에서 초기에 배양될 수 있고 여기서 상기 줄기 세포는 처음 4 내지 5일 동안 고농도 CHIR을 포함하는 배양 배지에서 배양되고 나서 나머지 일 동안 저농도 CHIR 및 FGF를 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 따라서, 다른 예에서, 본 개시내용은 중간 중배엽(IM) 세포를 생성하는 시험관내 방법을 포괄하며, 상기 방법은 적어도 7일 동안 줄기 세포의 모집단을 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 처음 4 내지 5일은 적어도 6 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 배양에서의 나머지 일은 FGF 및 적어도 0.5 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 예에서, 배양에서의 나머지 일은 0.5 내지 3 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 FGF를 포함한 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 배양에서의 나머지 일은 0.8 내지 1.2 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 FGF를 포함한 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 처음 4일은 적어도 6 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 처음 4일은 7 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 100 내지 300 ng/ml FGF9를 포함한다. 일 예에서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 180 내지 220 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, FGF9를 포함하는 세포 배양 배지는 헤파린을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 1.0 μg/ml 헤파린을 포함할 수 있다. 일 예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS: induced pluripotent stem) 세포이다. 다른 예에서, 줄기 세포는 H9, hES3, iPSC GAPTrap td-Tomato, CRL1502.C32, CLR1502.3, hES3 SOX17mCherry 또는 H9 GAPTrap Luc2로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 오가노이드 또는 세포 모집단으로부터 바이오잉크를 제조하는 단계 및 신장을 바이오-프린팅하는 단계를 포함하는 신장을 바이오-프린팅하는 방법을 포괄한다. 일부 예에서, 세포 모집단은 신장 오가노이드의 효소 소화로부터 유래된 세포를 지칭한다.
다른 예에서, 본 개시내용은 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생성하기 위해 사용된 경우 본원에 정의된 오가노이드, 조성물 또는 세포 모집단을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용은 세포 요법을 위한 네프론 세포 유형을 생성하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 본원에 정의된 IM 세포의 모집단 또는 방법을 사용하여 신장 오가노이드를 생성하는 단계를 포함한다.
본원에서 임의의 예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 필요한 부분만 약간 수정하여 임의의 다른 예에 적용하도록 되어야 한다.
본 개시내용은 단지 예시의 목적으로 의도된 본원에 기재된 특정 예에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 기능적으로-동등한 제품, 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이 분명히 본 개시내용의 범위 내로 된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 문맥 상 달리 요하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 군 또는 물질 조성의 군에 대한 언급은 이들 단계, 물질의 조성, 단계의 군 또는 물질 조성의 군 중 하나 및 복수 (즉, 하나 이상)를 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.
본 개시내용은 하기 비-제한적인 예의 방식에 의해 그리고 수반되는 도면들과 관련하여 이하에 기재된다.
도 1. 현탁 배양에서 신장 마이크로-오가노이드 생성. (A) CRL1502.C32 세포를 사용하여 수행된 분화로부터 이미지를 갖는 신장 마이크로-오가노이드 분화 프로토콜의 개요. (B) 7+18일째에서 균일한 신장 마이크로-오가노이드를 도시하는 명시야 이미지(스케일 100 mm). (C, D1 및 D2) 혈관 구조의 발달을 포함하여, 마이크로-오가노이드 크기 및 형상과 독립적인 네프론 분절의 형성을 도시하는 마이크로-오가노이드의 면역형광 및 공초점 이미지(스케일 100 mm). (E) FGF9 +/- 1μΜ CHIR99021에 대한 7+0일째에서 Qpcr에 의한 중간 중배엽 유전자 발현 프로파일링에 대한 평균 배수 변화를 도시하는 막대 그래프. 데이터는 평균으로 제시된다, (F) FGF9 +/- 1μΜ CHIR99021 처리에 대한 PAX2에 대한 면역형광(스케일 50 μm) (D7+11). (G) 신장 마이크로-오가노이드 내의 네프론 구획; 발세포 ( PHS1+ 및 MAFB+), 근위 세관 (LTL+, CUBN+, LRP2+ 및 HNF4A+), 원위 소관 (ECAD), 집합관 (ECAD+ GATA3+) 및 내피세포 (SOX17+ 및 PECAM1+)의 면역형광 및 공초점 이미지(스케일 50 μm).
도 2. 현탁 배양에서 마이크로-신장 오가노이드는 기능성 근위 세관 및 초기 Wnt 신호전달이 신장 오가노이드 발달 및 성숙에 중요하다는 것을 도시한다. (A) FITC 알부민 흡수를 도시하는 7+18일째에서 마이크로-신장 오가노이드 소관의 공초점 이미지(스케일 5 μm). (B) 상이한 네프론 분절을 표지하는 항체로 7+18일째에 hES (H9 GAP-Trap Luc2, hES3 SOX17mCheny) 및 iPS (CRL1502.C32 및 CRL1502.3)를 포함한, 4개의 상이한 세포주를 사용하여 생성된 마이크로-신장 오가노이드의 공초점 이미지(스케일 50 μm). (C, D 및 E) 명시야를 나타내는 3, 4, 5 및 6일 처리 동안 초기 7 μΜ CHIR99021의 상이한 날에 노출 후 생성된 hES3 SOX17mCherry 유래된 마이크로-오가노이드(C, 스케일 100 μm) 및 SOX17+ 맥관구조 (D) 및 MEIS 1/2/3+ 기질(stroma) (E)을 나타내는 면역형광 공초점 이미지(스케일 100 μm).
도 3. 마이크로-오가노이드 내 신장 분화의 전사 검증. (A) 11개의 상이한 클러스터를 나타내는 7+18일째 CRL1502-C32 마이크로-오가노이드의 단일 세포 RNA-seq의 쇠라(Seurat) 클러스터링 후의 t-S E 플롯. (B) 클러스터 내 핵심 마커 유전자의 스케일링된 유전자 발현을 나타내는 열-지도. (C) 선택된 네프론 세포 유형에 대한 핵심 마커 유전자의 발현을 나타내는 t-SNE 플롯. 색상 강도는 유전자에 따라 확장되며, 청색은 더 높은 발현을 나타낸다.
도 4. 신장 마이크로-오가노이드는 효율적인 hPSC-유래된 신장 세포 규모확대에 대해 더 나은 플랫폼을 제공한다. (A) 7+11일째에 표준 신장 오가노이드의 비추어진 부분 이미지(좌측, 스케일 500 μm), 오가노이드의 가장자리로 네프론 구조의 공간적 제한을 나타내는 전체 표준 오가노이드의 면역형광 및 공초점 이미지(타이틀 스캔) (중간 스케일 200 μm) 및 그 오가노이드 내 네프론의 확대된 이미지(우측, 스케일 200 μm). (B) D7+11에서 신장 마이크로-오가노이드의 공초점 이미지인, 단일 신장 마이크로-오가노이드의 확대된 비추어진 부분 이미지와 신장 마이크로-오가노이드의 비추어진 부분 이미지(스케일 200 μm). (C) 상이한 발달 단계에서 오가노이드의 크기에서의 변화. (D) 표준 오가노이드에 비하여 경시적으로 개시 세포 수로부터 총 세포 수 및 마이크로-오가노이드의 확장가능한 수용력에서의 변화. (E-F) D7+18에서 C32 마이크로-오가노이드의 면역형광 및 Bitplane-Imaris 3D 재건은 사구체 (NPHS1), 근위 세관 (LTL+), 원위 소관 (ECAD+), 집합관 (ECAD+ GATA3+) 및 간질성 세포 (GATA3+)로부터 개시한 분극된 방식으로 서로에 대해서 연결된 명확한 네프론 분절을 도시했다.
도 5. 표준 신장 오가노이드 및 마이크로-오가노이드의 비교 단일 세포 전사 프로파일링은 동등한 신원발성 패턴화를 입증한다. (A) 7+18일째에서부터 신장 마이크로-오가노이드(Micro-org) 및 표준 오가노이드(Stand-org)10x scRNA-Seq 데이터의 통합된 쇠라 분석 후 t-SNE 플롯 (CRL1502.32). (B) 오가노이드 유형에 의해 착색된, 각각의 클러스터에서 세포 유형에 대한 마이크로-오가노이드 및 표준 오가노이드 기여를 나타내는 t-SNE 플롯 (C) 각각의 전사 클러스터 및 분화 계열 유형에 배정된 각각의 Micro-org 또는 Stand-org 데이터세트의 비율을 나타내는 막대 그래프. (D) 신장 마이크로-오가노이드와 표준 오가노이드 사이 각각의 클러스터에서 신장 마커의 유전자 발현을 나타내는 분할점 플롯. (E) Micro-org 및 Stand-org 내의 네프론 (PAX2, SIX1, LHX1) 및 기질 관련된 유전자(PDGFRA, MEIS2)에 대한 세포당 로그-정상화된 계수를 나타내는 바이올린 및 산포도. (F) 신장 Micro-org와 Stand-org 사이의 PAX2 및 MEIS1/2/3의 발현을 나타내는 면역형광(스케일 50 μm).
도 6. 마이크로 및 표준-오가노이드 내의 네프론과 기질 마커의 비교. (A 및 B) 표준 및 마이크로-오가노이드 scRNA-Seq 데이터에서 네프론 및 기질 유전자에 대한 t-SNE 특징 플롯.
도 7. 모든 트랜스-레틴산이 신장 마이크로-오가노이드에서 사구체 성숙의 개선에 도움이 된다. 스월러 현탁 배양에 의해 생성된 C32 스월러 오가노이드의 면역형광 분석. (A) atRA에 보충 없이 생성된 오가노이드. (B) D7+5에서부터 D7+10까지 atRA로 생성된 오가노이드는 개선된 사구체 발세포 성숙을 나타낸다. (C) 상이한 시점(D7+11 및 D7+18)에서 atRA로 및 atRA 없이 생성된 오가노이드의 qPCR 분석.
도 8. 신장 마이크로-오가노이드는 약물 독성 스크리닝에 대한 플랫폼을 제공한다. (24시간) 동안 아드리아마이신 처리는 세포자멸적 마커 TUNEL의 발현을 증가시킴에 의해 신장 마이크로-오가노이드에 대한 용량 의존적 독성을 유발한다(A-C). (D) 아드리아마이신 처리는 또한 마이크로-오가노이드에서 신장 특이 유전자의 발현을 감소시킨다.
구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당해 분야(예를 들어, 분자 생물학, 세포 배양, 줄기 세포 분화, 세포 요법, 유전자 변형, 질환 모델링, 생화학, 생리학, 및 임상 연구)의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다.
달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용에서 이용된 분자 및 통계적인 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 표준 절차이다. 그와 같은 기술은 공급원인 문헌 예컨대 문헌[J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], 문헌[J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)], 문헌[T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], 문헌[D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)], 및 문헌[F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트를 포함함)], 문헌[Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)], 문헌[J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트를 포함함)], 문헌[Michos Odysse (editor) Kidney Development: Methods and Protocols (Springer)], 문헌[Robert Lanza (editor) Handbook of Stem Cells, Volume 1, Embryonic Stem Cells (Elsevier)]의 전반에 걸쳐 기재되고 설명되어 있다.
본 명세서 및 부가된 청구항에서 사용된 바와 같이, 예를 들어, 단수 및 단수 형태 "a", "an" 및 "the"에서의 용어들은 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 선택적으로 포함한다. 따라서, 예를 들어, "신장 오가노이드"에 대한 언급은 선택적으로 하나 이상의 신장 오가노이드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 반대로 언급되지 않는 한 지정된 값의 +/- 10%, 더 바람직하게는 +/- 5%, 더 바람직하게는 +/- 1%를 지칭한다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되며, 둘 모두를 의미하거나 또는 어느 하나를 의미하는 것에 대한 명백한 지지를 제공하도록 취해져야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다", 또는 변형형 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계들의 그룹의 봉입을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
다양한 대상체가 본 개시내용에 따른 세포 조성물을 투여받을 수 있다. 일 예에서, 상기 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 반려 동물 예컨대 개 또는 고양이, 또는 가축 동물 예컨대 말 또는 소일 수 있다. 다른 예에서, 상기 대상체는 인간이다. 용어들 예컨대 "대상체", "환자" 또는 "개체"는 문맥 상 본 개시내용에서 교환가능하게 사용될 수 있는 용어들이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 임상 병리의 과정 동안 치료되는 개체 또는 세포의 자연스러운 과정을 변경하도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. 바람직한 치료 효과는 질환 진행률의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 예를 들어, 질환과 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 제거되는 경우, 개체는 성공적으로 "치료"된다. 일 예에서, 용어 "치료"는 대상체가 표적화된 장애를 역전, 예방 또는 둔화(약화)하기 위한 신장 질환, 빈혈, EPO 결핍, 관형 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍에 대한 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료의 필요성이 있는 이들은 이미 신장 질환, 빈혈, EPO 결핍, 관형 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍이 있는 이들, 그러한 장애가 있는 경향이 있는 이들 또는 그러한 장애가 예방되어야 하는 이들을 포함한다. 일 예에서, 치료는 신장 기능의 안정화 및/또는 개선을 포괄한다.
"유효량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 투약량에서 그 기간 동안 적어도 효과적인 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여로 제공될 수 있다. 본 개시내용의 일부 예에서, 용어 "유효량"은 위에서 기재된 바와 같은 신장 장애 또는 병태의 치료에 영향을 미치는 데 필요한 양을 지칭하기 위해 사용된다. 유효량은 치료되는 질환 또는 병태에 따라, 그리고 또는 치료되어 지는 포유동물에 관련된 체중, 연령, 인종 배경, 성별, 건강 및/또는 신체 조건 및 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 전형적으로, 유효량은 의료 종사자의 일상적인 시험 및 실험과정을 통해 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위(예를 들어, "투약량" 범위) 내에 속할 것이다. 유효량은 단일 용량으로 또는 치료 기간에 걸쳐 1회 또는 수회 반복된 용량으로 투여될 수 있다.
"치료 유효량"은 특정 신장 장애(예를 들어 신염, 신장 세포 암종)의 측정가능한 개선에 영향을 미치기 위해 필요한 적어도 최소 농도이다. 본원에서의 치료 유효량은 또한 환자의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 세포 조성물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 조성물의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 더 큰 양인 것이다. 신장 세포 암종의 경우에, 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고; 일차 종양 크기를 감소시키고; 주변 기관 안으로 암 세포 침윤을 억제하고 (즉, 어느 정도까지 늦추고, 일부 예에서, 멈추고); 종양 전이를 억제하고 (즉, 어느 정도까지 늦추고, 일부 예에서, 멈추고); 종양 성장 또는 종양 진행을 어느 정도까지 억제하거나 지연시키고; 및/또는 신장 세포 암종과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도까지 경감시킬 수 있다. 신장 세포 암종 요법의 경우, 생체내 효능은, 예를 들어, 생존 기간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 반응 속도 (RR), 반응 기간, 및/또는 삶의 질을 평가함에 의해 측정될 수 있다.
"중간 중배엽(IM)" 세포는 후측 원시선으로부터 차례로 유래된 최종적인 중배엽으로부터 생기고 궁극적으로, 요관 및 신장 및 다른 조직 예컨대 생식샘을 포함한, 비뇨생식기 시스템으로 발전할 수 있는 배아 중배엽 세포를 의미한다. 중간 중배엽의 특징적인 또는 대표적인 마커의 비-제한적인 예는 PAX2, OSR1 및/또는 LHX1을 포함한다.
IM 세포의 생산은 IM 세포가 다른 세포 유형이 존재하지 않는 IM 세포의 순수하거나 균질한 모집단(예컨대 최종적인 중배엽)임을 암시하는 것을 의미하지 않는다는 것이 또한 인정될 것이다. 따라서, "IM 세포" 또는 "IM 세포의 모집단"에 대한 언급은 세포 또는 세포 모집단이 IM 세포를 포함한다는 것을 의미한다. 적합하게, 본 발명에 따르면 IM 세포는 IM 세포로 후측 원시선 세포의 분화를 촉진하는 하나 이상의 제제와 후측 원시선 세포를 접촉시킴에 의해 생산될 뿐만 아니라, 이하에서 더 상세히 기재될 것이다. 바람직하게는, IM 세포는 IM 세포로 후측 원시선 세포의 분화를 촉진하는 하나 이상의 제제와 후측 원시선 세포를 접촉시킴에 의해 생산된다.
"후측 원시선(PPS)" 세포로는 포유동물 배아 발생의 초기 단계 동안 주머니배에서 형성되는 원시선 구조의 후측 말단의 세포로부터 얻어질 수 있는 세포, 또는 이에 기능적으로 및/또는 표현형으로 상응하는 세포를 의미한다. 후측 원시선은 좌우 대칭을 확립하고, 낭포형성의 부위를 결정하고 그리고 배엽층 형성을 개시한다. 전형적으로, 후측 원시선은 중배엽의 전구체(즉, 추정 중배엽)이고 전측 원시선은 내배엽의 전구체(즉 추정 내배엽)이다. 후측 원시선의 특징적인 또는 대표적인 마커의 비-제한적인 예는 브라큐리(T)를 포함한다. 전측 원시선의 특징적인 또는 대표적인 마커의 비-제한적인 예는 SOX17이다. MIXL1은 후측 및 전측 원시선 둘 모두에 의해 발현될 수 있다.
후측 원시선 세포의 생산은 후측 원시선 세포가 다른 세포 유형이 존재하지 않는 후측 원시선 세포의 순수하거나 균질한 모집단임을 암시하는 것을 의미하지 않는다는 것이 또한 인정될 것이다. 따라서, "후측 원시선 세포" 또는 "후측 원시선 세포의 모집단"에 대한 언급은 세포 또는 세포 모집단이 후측 원시선 세포를 포함한다는 것을 의미한다. 후측 원시선 세포는 후측 원시선 세포로 hPSC 세포의 분화를 촉진하는 하나 이상의 제제와 hPSC 세포를 접촉시킴에 의해 생산될 뿐만 아니라, 이하에서 더 상세히 기재될 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 제제는 뼈 형태형성 단백질 4 (BMP4), 액티빈 A 및/또는 Wnt 효능제 예컨대 CHIR99021을 포함할 수 있다.
신장 오가노이드
본 개시내용은 중간 중배엽(IM) 세포의 생산을 포괄한다. 용어 "중간 중배엽(IM)"은 본 개시내용의 맥락에서 후측 원시선으로부터 차례로 유래된 최종적인 중배엽으로부터 생기고 궁극적으로, 요관 및 신장 및 다른 조직 예컨대 생식샘을 포함한, 비뇨생식기 시스템으로 발전할 수 있는 배아 중배엽 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 중간 중배엽의 특징적인 또는 대표적인 마커의 비-제한적인 예는 PAX2, OSR1 및/또는 LHX1을 포함한다.
일 예에서, 배양 조건은 이들 IM 세포가 '자기-조직화하고' 신장 오가노이드를 형성하는 것을 허용하도록 하기 위해 제공된다. 용어 "신장 오가노이드"는 본 개시내용의 맥락에서 천연 신장에 존재하는 세포 자기-조직화, 아키텍처 및 신호전달 상호작용의 양태를 요약하는 세포의 이종 3D 응집을 지칭하기 위해 사용된다. 신장 오가노이드의 예는 문헌[Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568], WO 제2014/197934호 및 WO 제2016/094948호에 기재되어 있다. 용어들 "신장 오가노이드" 및 "신장 오가노이드"는 본 개시내용의 맥락에서 교환가능하게 사용될 수 있다.
본 발명자들은 간소화한 3차원 구조를 갖는 신장 오가노이드를 놀랍게도 확인했다. 그와 같은 오가노이드는 이들이 이미지화하고 장기간 배양하기에 용이하기 때문에 유리하다. 예를 들어, 건강한 성인은 각각의 신장에 0.8 내지 2백만 네프론, 전형적으로 대략 1백만개를 갖는다. 그에 반해서, 본 개시내용에 의해 포괄된 오가노이드는 훨씬 낮은 네프론 수를 포함한다.
따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 감소된 수의 네프론을 갖는 천연 신장의 건축 특질을 포함하는 신장 오가노이드를 포괄한다. 일 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 하나 이상의 네프론을 포함할 수 있다. 일 예에서, 네프론(들)은 원위 및 근위 세관, 헨리의 초기 루프, 및 사구체로 분할된다. 다른 예에서, 오가노이드는 내피세포, 혈관주위세포 및 신장 간질에 의해 둘러싸인 분절된 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 오가노이드는 맥관구조의 존재를 나타내지 않는다.
다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 적어도 부분적으로 혈관화된다. 예를 들어, 오가노이드는 발 과정을 정교화하고 혈관화를 겪는 발세포를 함유하는 네프론을 포함할 수 있다.
일 예에서, 신장 오가노이드는 % 네프론, % 기질 및/또는 % 맥관구조의 관점에서 특징화된다. 이 예에서, 신장 오가노이드는 단일 세포 RNA 서열분석을 사용하여 특징화될 수 있다. 단일 세포 서열분석의 예는 아래에 제공된다. 일 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 20% 성숙한 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 25% 성숙한 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 30% 성숙한 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 31% 성숙한 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 32% 성숙한 네프론을 포함한다. 이들 예에서, 신장 오가노이드는 또한 적어도 15% 기질을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 또한 적어도 20% 기질을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 또한 적어도 25% 기질을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 임의의 실질적인 맥관구조를 포함하지 않는다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 맥관구조를 포함하지 않는다.
일 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 100개 미만의 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 90개 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만의 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 50개 미만 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 40개 미만, 30개 미만, 20개 미만, 10개 미만의 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 5개 미만의 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 4개 미만, 3개 미만의 네프론을 포함한다.
다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 2 내지 100개 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 2 내지 50개 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 2 내지 10개 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 5 내지 12개 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 6 내지 10개 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 2 내지 6개 네프론을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 신장 오가노이드는 2 내지 4개 네프론을 포함한다.
"네프론"은 혈액/혈장으로부터 폐기물의 제거 및 체액 부피의 유지에 중요한 역할을 하는 신장의 기능적 작업 단위이다. 이들은 다양한 방법을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 본원에 개시된 오가노이드에서 확인되고 계수될 수 있다. 예를 들어, 네프론은 공초점 현미경검사 및 면역형광 라벨링을 사용하여 시각화되고 계수될 수 있다(예를 들어 WT1+ 사구체; NPHS+ 발세포, LTL+ECAD- 근위 세관, ECAD+ 원위 소관 및 ECAD+GATA3+ 집합관).
일반적으로, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드의 종 동일성은 그것이 포유동물, 예컨대 마우스, 인간이든 또는 그렇지 않든 무관하게 신장 오가노이드를 생성하기 위해 사용된 세포에 의해 지시된다. 일 예에서, 본 개시내용은 포유동물 신장 오가노이드를 포괄한다. 이 예에서, 신장 오가노이드를 생성하기 위해 포유동물 만능 줄기 세포가 사용된다. 포유동물 신장 오가노이드는 반려 동물 예컨대 갯과 또는 고양이, 또는 가축 동물 예컨대 말 또는 소과 동물로부터의 신장을 대표할 수 있다. 따라서, 이들 예에서, 개, 고양이 등으로부터의 줄기 세포가 신장 오가노이드를 생성하기 위해 사용된다. 다른 예에서, 포유동물 신장 오가노이드는 마우스 또는 랫트로부터의 신장을 대표한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 고차 영장류 예컨대 사이노몰구스 원숭이 또는 붉은털원숭이로부터의 신장을 대표한다. 다른 예에서, 포유동물 신장 오가노이드는 인간으로부터의 신장을 대표한다. 특정 종으로부터의 만능 줄기 세포가 신장 오가노이드를 생성하기 위해 사용된 경우, 얻어지는 신장 오가노이드는 그 종에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 신장 오가노이드를 생성하기 위해 인간 줄기 세포를 사용한 경우, 얻어진 신장 오가노이드는 인간 신장 오가노이드로 확인될 수 있다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 인간 줄기 세포로부터 유래된 인간 신장 오가노이드를 포함한다. 신장 오가노이드를 생성하기에 적합한 줄기 세포의 다양한 다른 예가 하기에 논의되어 있다.
다른 예에서, 신장 오가노이드는 분자 마커의 발현에 기초하여 특징되어 질 수 있다. 마커 발현은 다양한 기술 예컨대 면역조직화학 또는 형광 활성화된 세포 분류를 사용하여 특징되어 질 수 있다. 면역조직화학은 일반적으로 관심 있는 마커에 특이적인 일차 항체를 사용하는 것을 포함한다. 마커에 일차 항체의 결합은 다양한 알려진 방법을 통해 시각화될 수 있다. 예를 들어, 일차 항체를 인식하는 표지된 이차 항체가 사용될 수 있다. 이 예에서, 표지는 효소 예컨대 호스 라디쉬 페록시다아제, 방사성 동위원소, 형광 리포터, 전기-화학발광 태그일 수 있다. 일차 항체에 표지된 이차 항체의 결합은 세포학적 평가 또는 자동화 플레이트 리더를 통해 검출될 수 있다.
특정 예에서, 신장 오가노이드 또는 이들의 섹션이나 샘플은 특이적 일차 항체와 접촉된다. 신장 오가노이드 또는 이들의 섹션이나 샘플은 그 다음 세정되어 임의의 미결합된 일차 항체 및 그 다음 일차 항체에 대해 특이적이고, 샘플에 적용되는 페록시다아제 효소에 연결된 이차 항체를 제거한다. 신장 오가노이드 또는 이들의 섹션이나 샘플은 그 다음 세정되어 임의의 미결합된 이차 항체를 제거하고 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)은 샘플에 적용된다. DAB의 착색된 생성물로의 전환은 마커가 샘플에 존재한다는 것을 나타내는 착색된 생성물의 존재로 일상적인 세포학적 평가에 의해 시각화된다. 일 예에서, 착색된 생성물의 수준은 Perkin Elmer 및 Leica와 같은 공급자로부터 상업적으로 입수 가능한 이미지 J 또는 다양한 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 정량화될 수 있다.
다른 예에서, 세포 현탁액은 대표적인 신장 오가노이드, 이들의 모집단 또는 이들의 섹션이나 샘플로부터 생산된다. 현탁액에서 세포는 특정 메이커에 특이적인 형광으로 표지된 항체와 접촉된다. 특정 마커에 대해 양성인 세포는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)와 같은 기술을 사용하여 확인된다.
주어진 마커에 대해 "양성"인 것으로 언급된 세포는 세포 표면 상에 마커가 존재하는 정도에 의존하여 그 마커의 낮은 (lo 또는 흐름) 또는 높은 (밝은, bri) 수준 중 어느 하나를 발현할 수 있고, 여기서 용어들은 세포의 분류 과정에 사용된 형광 또는 다른 마커의 강도에 관한 것이다. lo (또는 흐름 또는 탁함) 및 bri의 구별은 분류되는 특정 세포 모집단에 대해 사용된 마커의 맥락에서 이해될 것이다. 주어진 마커에 대해 "음성"인 것으로 언급된 세포는 그 세포로부터 반드시 완전히 부재하다는 것은 아니다. 이 용어는 마커가 그 세포 또는 모집단에 의해 상대적으로 낮은 또는 매우 낮은 수준으로 발현되고, 검출가능하게 표지되거나 배경 수준, 예를 들어 아이소타입 대조군 항체를 사용하여 검출된 수준 이상으로 검출될 수 없을 때 매우 낮은 신호를 생성한다는 것을 의미한다.
일 예에서, 본원에 기재된 신장 오가노이드의 마커는 형광 리포터 유전자를 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 특정 마커의 발현은 실시간으로 이를 포함하는 신장 오가노이드 또는 세포의 발달을 추적하기 위해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 주어진 세트의 조건하에서 하나 이상의 형광 또는 화학발광 리포터(들)를 발현하도록 유전자적으로 조작될 수 있다. 리포터는 세포 동일성, 세포 생존력 또는 세포 기능을 실시간으로 추적하기 위해 사용될 수 있다.
내인성 MAFB 유전자좌(MAFBmTagBFP2/+)의 시작 코돈에 삽입된 mTagBFP2 형광 리포터 유전자를 담지하는 녹-인 iPSC 라인이 생성되는, 적합한 리포터 유전자의 예가 아래에 예시되어 있다. MAFB는 발달 중의 발세포에서 고도로 발현되고 따라서, MAFB의 발현은 신장 오가노이드에서 발세포의 전개를 실시간으로 추적하기 위해 모니터링될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 리포터 세포주의 다른 예는 GATA3mCherry, RETtdTomato 또는 Six2Cre을 포함한다.
다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 하나 이상의 네프론 마커를 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11, GATA3, PAX8, EYA1 및 CITED1 중 하나 이상을 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함한다. 예를 들어, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2를 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 SIX1을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 LHX1을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 OSR1을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 WNT11을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 GATA3을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11 및 GATA3을 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11, GATA3, PAX8, EYA1 및 CITED1을 발현하는 세포를 포함한다. 이들 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 100개 네프론을 갖는 신장 오가노이드에 비하여 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11, GATA3, PAX8, EYA1 및 CITED1 중 하나 이상과 같은 언급된 마커의 높은 수준을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 50개 초과의 네프론을 갖는 신장 오가노이드에 비하여 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11, GATA3, PAX8, EYA1 및 CITED1 중 하나 이상과 같은 언급된 마커의 높은 수준을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 1 x 105 세포를 포함하는 신장 오가노이드에 비하여 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11 및 GATA3 중 하나 이상과 같은 언급된 마커의 높은 수준을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 1 x 106 세포를 포함하는 신장 오가노이드에 비하여 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11 및 GATA3 중 하나 이상과 같은 언급된 마커의 높은 수준을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 문헌 [Takasato et al. (2015)]에서 기재된 것들과 같은 스월링 없이 생산된 신장 오가노이드에 비하여 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11 및 GATA3 중 하나 이상과 같은 언급된 마커의 높은 수준을 발현할 수 있다.
다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 WT1을 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 C-RET를 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 FOXD1을 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 PDGFRA를 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 MEIS2를 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 WT1 및 C-RET를 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 낮은 수준의 WT1, C-RET 및 FOXD1을 발현하는 세포를 포함한다. 이들 예에서, 신장 오가노이드는 적어도 100개 네프론을 갖는 신장 오가노이드에 비하여 WT1, C-RET 및 FOXD1 중 하나 이상과 같은 언급된 마커의 낮은 수준을 발현할 수 있다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 50개 초과 네프론을 갖는 신장 오가노이드에 비하여 WT1, C-RET 및 FOXD1 중 하나 이상과 같은 언급된 마커의 낮은 수준을 발현할 수 있다.
다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11 및 GATA3과 낮은 수준의 WT1, C-RET, PDGFRA, MEIS2 및 FOXD1을 발현하는 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 높은 수준의 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11, GATA3, PAX8, EYA1 및 CITED1과 낮은 수준의 WT1, C-RET, PDGFRA, MEIS2 및 FOXD1을 발현하는 세포를 포함한다.
상기 예에서, 높은 및 낮은 수준의 발현은 문헌 [Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568]에서 기재된 것들과 같은 스월링 없이 배양된 신장 오가노이드에 대한 것이다. 이 예에서, 높은 발현은 적어도 1배 더 높다. 다른 예에서, 높은 발현은 적어도 1.5배 더 높다. 다른 예에서, 높은 발현은 적어도 2배 더 높다. 일 예에서, 낮은 발현은 적어도 1배 더 낮다. 다른 예에서, 낮은 발현은 적어도 1.5배 다 낮다. 다른 예에서, 낮은 발현은 적어도 2배 더 낮다.
발현 수준은 관심 있는 마커에 대한 적절한 프라이머를 포함한 중합효소 연쇄 반응과 같은 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 총 RNA는 역 전사되기 전에 오가노이드로부터 추출될 수 있고 PCR 및 분석 대상이 된다.
일 예에서, 신장 오가노이드는 WT1+ 사구체, NPHS+ 발세포, LTL+ECAD- 근위 세관, ECAD+ 원위 소관 및 ECAD+GATA3+ 집합관 중 하나 이상을 포함하는 네프론(들)을 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 NPHS+ 발세포, LTL+ 근위 분절, ECAD+ 원위 분절 및 ECAD+GATA3+ 집합관을 포함하는 네프론(들)을 포함한다. 상기 예시된 성분을 포함하는 신장 오가노이드는 다양한 방식으로 확인될 수 있다. 일 예에서, 신장 오가노이드는 공초점 현미경검사 및 면역형광 라벨링을 사용하여 시각적으로 평가되기 전에 고정되고 전체가 실장될 수 있다.
일 예에서, 신장 오가노이드는 하기 논의된 스크리닝의 방법에서 사용 후 상기 언급된 마커 중 하나 이상에 기초하여 특징되어 질 수 있다. 다른 예에서, 더 넓은 모집단 중 대표적인 신장 오가노이드는 하기 논의된 스크리닝의 방법에서 사용하기 위해 적절한 마커를 발현하는 신장 오가노이드를 선정하기 전에 상기 언급된 마커 중 하나 이상에 기초하여 특징되어 질 수 있다. 예를 들어, 신장 오가노이드의 모집단은 본원에 개시된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 상기 마커 중 하나 이상의 발현은 신장 오가노이드가 하기 논의된 스크리닝의 방법에서 사용하기 위해 선택되기 전 모집단으로부터의 신장 오가노이드에서 확인될 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 0.5x104 내지 8x104 세포를 포함한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 0.8x104 내지 7x104 세포를 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 lx104 내지 5x104 세포를 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 적어도 lx104 세포를 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 3x104 미만 세포를 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 2x104 내지 2.5x104 세포를 포함한다.
다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 2,500 μm 미만의 직경을 갖는다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 2,000 μm 미만의 직경을 갖는다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 1,000 μm 미만의 직경을 갖는다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 500 μm 미만의 직경을 갖는다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 400 μm 미만의 직경을 갖는다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 300 μm 미만의 직경을 갖는다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 150 내지 600 μm의 직경을 갖는다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 200 내지 500 μm의 직경을 갖는다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 200 μm 내지 2,000 μm의 직경을 가질 수 있다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 200 μm 내지 1,000 μm의 직경을 가질 수 있다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 200 μm 내지 400 μm의 직경을 가질 수 있다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 200 μm 내지 300 μm의 직경을 가질 수 있다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 250 μm 내지 300 μm의 직경을 가질 수 있다.
오가노이드 크기는, 예를 들어, 광학 현미경검사 및 수반하는 소프트웨어 예컨대 ImageJ에 의해 측정될 수 있다는 것이 당해 기술의 숙련가에 의해 인정될 것이다. 예를 들어, 당해 분야의 숙련가는 그것의 3차원 구조의 가장 넓은 지점에 걸쳐 폭을 측정함으로써 상기 예시된 크기의 오가노이드를 식별할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 배양에서 적어도 3주 동안 생존가능한 상태로 유지한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 배양에서 적어도 4주 동안 생존가능한 상태로 유지한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 배양에서 적어도 6주 동안 생존가능한 상태로 유지한다. 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 오가노이드는 배양에서 적어도 3 내지 4주 동안 생존가능한 상태로 유지한다. 예를 들어, 본원에 개시된 신장 오가노이드는 배양에서 3 내지 6주 후 확산 제한(즉, 오가노이드 구조를 포함하는 세포로 영양소의 전달에 영향을 미치는 제한) 만을 전개할 수 있다. 이들 예에서 상기 언급된 기간은 D7+1로부터 측정된다. 따라서, 또 다른 방식으로 본 개시내용에 따른 오가노이드는 적어도 D7+21, D7+28 또는 D7+42까지 배양에서 생존가능한 상태로 유지한다. 일 예에서, 세포 증식 속도는 확산 한계의 척도로서 사용될 수 있다. 이것은 충분한 영양분이 없는 상태에서 세포가 전형적으로 계속 분열하지 않을 것이기 때문이다. 따라서, 본원에 개시된 오가노이드에서의 세포 증식은 확산 제한이 언제 발생하는지를 결정하기 위해 경시적으로 추적될 수 있다. 일 예에서, 3 내지 6일 기간에 걸친 세포 증식 속도에서의 감소는 확산 제한을 나타낸다. 다른 예에서, 3 내지 6일 기간에 걸친 세포 증식에서의 안정기는 확산 제한을 나타낸다.
본 개시내용은 인간 신장에 비교하여 작은 수의 네프론을 포함하는 신장 오가노이드를 포괄한다. 당해 분야의 숙련가는 신장 오가노이드는 인공 생성물이고, 이들이 포유동물 신장의 수많은 생리적 및 생화학적 특질을 공유하는 반면 이들은 자연적으로 발생하지 않는다는 것을 인정할 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 신장 오가노이드는 온전한 맥관구조에 연결되지 않을 수 있고, 그리고/또는 하기 특징 중 하나 이상일 수 있다:
- 50개 미만 네프론을 가지고;
- 약 0.5 x 104 내지 8 x 104 세포를 포함하고;
- 1000μm 미만 (바람직하게는 약 250 내지 350μm) 직경을 가지고;
- 조직 또는 장기의 일부가 아닌 독립적인 3-차원 구조이고; 그리고,
- 시험관내 줄기 세포의 분화를 포함하는 방법에 의해 생산된다.
세포 조성물 및 치료 방법
본 개시내용의 오가노이드 또는 세포는 치료적 조성물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일 예에서, 본원에 개시된 전체의 오가노이드는 치료적 조성물로 제공될 수 있다. 다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 신장 오가노이드로부터 생산된 세포 조성물을 포괄한다. 예를 들어, 세포 조성물은 본 개시내용에 따른 오가노이드를 효소적으로 소화함에 의해 제조된다. 예를 들어, 세포 조성물은 프로테아제 예컨대 트립신을 단독으로 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 조합하여 사용하여 본원에 정의된 오가노이드를 소화함에 의해 제조될 수 있다. 다른 예에서, 세포 조성물은 콜라겐분해효소 예컨대 콜라겐분해효소 I 및/또는 콜라겐분해효소 II (예를 들어 상업적으로 입수 가능한 Liberase™ (Roche))로 본원에 정의된 오가노이드를 소화함에 의해 제조될 수 있다. 일 예에서, 효소 소화는 부분적으로 정제되거나 또는 정제되어 하나 이상의 세포 유형을 고갈시킨다. 예를 들어, 혈관 및/또는 내피세포는 고갈될 수 있다. 다른 예에서, 효소 소화는 부분적으로 정제되거나 또는 정제되어 하나 이상의 세포 유형을 풍부하게 한다. 예를 들어, 효소 소화는 부분적으로 정제되거나 또는 정제되어 네프론 전구체 및/또는 요관 상피 전구체 세포의 풍부한 조성물을 제공할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 조성물은 본원에 개시된 방법을 사용하여 배양된 세포를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 높은 수준의 PAX2, LHX1 및 OSR1 (캡 간충직) 및 Wnt11 및 GATA3 (요관 상피)을 발현하는 개선된 IM 세포를 포함할 수 있다. 상기 예에서와 같이, IM 세포는 본원에 정의된 방법을 사용하여 배양될 수 있고 부분적으로 정제되거나 또는 정제되어 하나 이상의 세포 유형 예컨대 네프론 전구체 및/또는 요관 상피 전구체를 풍부하게 할 수 있다.
따라서, 다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 방법에 의해 생산된 오가노이드 또는 세포 모집단으로부터 정제된 네프론 전구체 세포 및/또는 요관 상피 전구체 세포의 모집단을 포함하는 세포 조성물을 포괄한다.
일 예에서, 본원에 개시된 치료적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 용어들 "담체" 및 "부형제"는 활성 화합물의 보관, 투여, 및/또는 생물학적 활성을 촉진하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용된 물질의 조성물 지칭한다(예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)] 참고). 담체는 또한 활성 화합물의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 수 있다. 적합한 담체는, 예를 들어, 안정하고, 예를 들어, 조성물에서 다른 성분과 반응할 수 없다. 일 예에서, 담체는 치료에 사용되는 투약량 및 농도에서 수령체에게 유의한 국소 또는 전신 역효과를 일으키지 않는다.
본 개시내용에 대한 적합한 담체는 통상적으로 사용된 것들을 포함하고, 예를 들어, 염수, 수성 덱스트로스, 락토스, 링거액, 완충 용액, 하이알루로난 및 글리콜이 특히 (등장성 경우) 용액에 대한 예시적인 액체 담체이다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제는 전분, 셀룰로스, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산마그네슘, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올, 및 기타 동종의 것을 포함한다.
다른 예에서, 담체는, 예를 들어, 세포 또는 전체의 오가노이드가 그 안에서 성장 또는 현탁되는 배지 조성물이다. 예를 들어, 이와 같은 배지 조성물은 그것이 투여되는 대상체에서 어떠한 역효과도 유발하지 않는다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 본원에 개시된 기본 배지를 포함할 수 있다. 일 예에서, 기본 배지는 PVA 및 MC를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 0.05 내지 0.5% PVA 및 0.05 내지 0.5% MC를 포함할 수 있다.
일 예에서, 담체 또는 부형제는 세포를 적합한 pH로 유지하여 완충 활성을 제공하고 그것에 의해 생물학적 활성을 발휘하는데, 예를 들어 담체 또는 부형제는 포스페이트 완충 식염수(PBS)이다. PBS는 세포 및 인자와 최소한으로 상호작용하고 세포 및 인자의 신속한 방출을 허용하기 때문에 매력적인 담체 또는 부형제를 나타내고, 그와 같은 경우에, 본 개시내용의 조성물은 혈류에 또는 신장 또는 신장 주위 또는 인접한 영역에, 예를 들어 주사에 의해, 직접적인 적용을 위한 액체로 생산될 수 있다. 따라서, 일 예에서, 본원에 개시된 세포 조성물 또는 전체의 오가노이드는 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 제공된다.
다른 예에서, 세포 조성물 또는 전체의 오가노이드는 수령체-양립가능하고 수령체에 유해하지 않은 생성물로 분해되는 스캐폴드 내에 편입되거나 또는 포매될 수 있다. 이들 스캐폴드는 수령 대상체 안으로 이식되어 지는 세포에 대한 지지 및 보호를 제공한다. 천연 및/또는 합성 생분해성 스캐폴드는 이와 같은 스캐폴드의 예이다. 다양한 상이한 스캐폴드가 본 개시내용의 실시에서 성공적으로 사용될 수 있다. 예시적인 스캐폴드는, 비제한적으로 생물학적, 분해성 스캐폴드를 포함한다. 천연 생분해성 스캐폴드는 콜라겐, 파이브로넥틴, 및 라미닌 스캐폴드를 포함한다. 세포 이식 스캐폴드에 대해 적합한 합성 물질은 광범위한 세포 성장 및 세포 기능을 지지할 수 있어야 한다. 그와 같은 스캐폴드는 또한 흡수가능할 수 있다. 적합한 스캐폴드는, 예를 들어, 문헌 [Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23 :3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38: 145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 1991]에 기재된 바와 같은 폴리글리콜 산 스캐폴드; 또는 합성 폴리머 예컨대 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 포함한다. 다른 예에서, 세포는 겔 스캐폴드(예컨대 Upjohn Company로부터의 젤폼)로 투여될 수 있다. 다른 예에서, 세포는 탈-세포질화된 신장 스캐폴드로 투여될 수 있다. 일 예에서, 세포는 탈-세포질화된 인간 신장 또는 이들의 세포외 기질(ECM) 성분으로 투여될 수 있다.
일 예에서, 본 조성물은 유효량 또는 치료 유효량의 세포 또는 전체의 오가노이드를 포함한다. 다른 예에서, 세포 또는 전체의 오가노이드는 대상체의 순환으로 세포 또는 오가노이드가 빠져나가지 못하게 하지만, 세포 또는 오가노이드에 의해 분비된 인자가 순환으로 들어가게 하는 챔버 내에 함유된다. 이런 식으로 가용성 인자는 세포 또는 오가노이드가 인자를 대상체의 순환안으로 분비하게 함으로써 대상체에게 투여될 수 있다. 그와 같은 챔버는 예를 들어 신장 내에 또는 그 근처에 이식되는 가용성 인자의 국소 수준을 증가시키기 위해 대상체에서의 부위에서 동등하게 이식될 수 있다.
일 예에서, 본원에 개시된 조성물은, 예컨대, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 또는 복강내 투여에 의해 전신으로 투여될 수 있다. 일 예에서, 본원에 개시된 조성물은 정맥내로 투여된다. 다른 예에서, 조성물은 동맥내로 투여된다. 다른 예에서, 조성물은 정상 또는 이환 신장 안으로 신장 동맥 주입, 신장 실질 주입 또는 피막하 이식을 통해 투여된다. 다른 예에서, 조성물은 이식된다. 예를 들어, 전체의 오가노이드는 대상체의 신장에 근접하여 이식될 수 있다.
일 예에서, 본 개시내용에 따른 세포 조성물은 동결보존될 수 있다. 세포 또는 전체의 오가노이드의 동결보존은 당업계에서 알려진 느린-속도 냉각 방법 또는 '빠른' 동결 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 동결보존의 방법은 동결되지 않은 세포 또는 전체의 오가노이드와 비교하여 동결보존된 세포 또는 전체의 오가노이드의 유사한 표현형, 세포 표면 마커 및 성장률을 유지한다. 동결보존된 조성물은 동결보존 용액을 포함할 수 있다. 동결보존 용액의 pH는 전형적으로 6.5 내지 8, 바람직하게는 7.4이다.
세포보존 용액의 예는 비-발열성 등장성 용액 예컨대, 예를 들어, PlasmaLyte A®를 포함한다. 100 mL의 PlasmaLyte A®는 526 mg의 염화나트륨, USP (NaCl); 502 mg의 나트륨 글루코네이트 (C6H11NaO7); 368 mg의 아세트산나트륨 3수화물, USP (C2H3NaO2·3H2O); 37 mg의 칼륨 클로라이드, USP (KC1); 및 30 mg의 마그네슘 클로라이드, USP (MgCl2·6H2O)를 포함한다. 이것은 항미생물제를 함유하지 않는다.
일 예에서, 본 개시내용은 세포 요법의 방법을 포괄하며, 상기 방법은 본원에 개시된 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 본원에 개시된 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여함에 의해 신장 질환을 치료하는 방법을 포괄한다. 용어 "신장 질환"은 본 개시내용의 맥락에서 혈액 여과 및 혈액으로부터 과잉 유체, 전해질, 및 폐기물의 제거의 기능을 수행하는 신장의 능력의 손실을 초래하는 급성 또는 만성 신부전의 임의의 단계 또는 정도와 관련된 장애를 지칭하기 위해 사용된다. 신장 질환의 예는 내분비 기능이상 예컨대 빈혈 (에리트로포이에틴-결핍), 및 미네랄 불균형 (비타민 D 결핍)을 포함한다. 신장 질환은 또한 신장에서 유래할 수 있거나 또는 (비제한적으로) 심부전, 고혈압, 당뇨병, 자가면역 질환, 또는 간 질환 또는 약물 유도된 독성을 포함한, 다양한 병태에 부차적일 수 있다. 일 예에서, 신장 질환은 신장에 대한 급성 손상 후에 발생하는 만성 신부전의 상태일 수 있다. 예를 들어, 허혈 및/또는 독물에 노출에 의한 신장에 대한 손상은 급성 신부전을 야기할 수 있다; 급성 신장 손상 후 불완전한 회복은 만성 신부전의 전개로 이어질 수 있다. 신장 질환의 다른 예는 스테로이드 저항성 신장 증후군 및 핀란드 신병증, 국소 분절사구체신염 (FSGS), 알포트 증후군 및 피어 슨 증후군을 포함한 선천성 신장 증후군(CNS)을 포함한다.
일 예에서, 본 개시내용은 그것을 필요로 하는 대상체 안으로 본원에 개시된 전체의 오가노이드를 이식함에 의해 신장 질환을 치료하는 방법을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용은 그것을 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 세포 조성물을 투여함에 의해 신장 질환을 치료하는 방법을 포괄한다.
다른 예에서, 본원에 개시된 조성물 또는 세포는 탈-세포화된 신장 스캐폴드의 재-세포화를 위해 제공될 수 있다. 다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 조성물 또는 세포를 포함하는 생체적합물질 또는 스캐폴드를 포괄한다.
줄기 세포
본 개시내용의 양태는 줄기 세포의 배양을 포괄한다. 용어 "줄기 세포"는 본 개시내용의 맥락에서 특정 상황 하에서 보다 특화되거나 분화된 표현형으로 분화하는 능력 또는 잠재력을 가지고, 특정 상황 하에서 실질적으로 분화함이 없이 증식하는 능력을 보유하는 전구체의 서브셋을 지칭하기 위해 사용된다. 일 예에서, 용어 줄기 세포는 일반적으로 후손(자손)이 배아 세포 및 조직의 진행성 다양성에서 발생하는 것과 같이 분화, 예를 들어 완전히 개별적인 특성을 획득함에 의해 종종 상이한 방향으로 특별화하는 자연 발생 모체 세포를 지칭한다. 세포 분화는 많은 세포 분열을 통해 전형적으로 발생하는 복합 공정이다. 분화된 세포는 그 자체가 다분화능 세포 등으로부터 유래된 다분화능 세포로부터 유래될 수 있다. 각각의 이들 다분화능 세포는 줄기 세포로 간주될 수 있지만, 각각의 세포 유형의 범위는 상당히 다양할 수 있다. 일부 분화된 세포는 또한 발달 잠재력이 더 큰 세포를 발생시키는 능력을 갖는다. 그와 같은 능력은 자연적일 수 있거나 또는 다양한 인자로 치료에 의해 인공적으로 유도될 수 있다. 많은 생물학적 사례에서, 줄기 세포는 또한 이들이 1 초과의 뚜렷한 세포 유형의 자손을 생성할 수 있기 때문에 "다분화능"이지만 이것은 "줄기성"에 대해 필요하지는 않다. 자기-재생은 줄기 세포 정의의 다른 고전적인 부분이다. 이론상, 자기-재생은 2개의 주요한 기전 중 어느 하나에 의해 일어날 수 있다. 줄기 세포는 비대칭으로 분할될 수 있어, 하나의 딸 세포는 줄기 상태를 유지하고 다른 딸 세포는 일부 뚜렷한 다른 특정 기능 및 표현형을 발현한다. 대안적으로, 모집단에서 줄기 세포의 일부는 대칭으로 2개의 줄기로 분할될 수 있으며, 따라서 모집단 내의 일부 줄기 세포를 전체적으로 유지하는 반면, 모집단에서의 다른 세포는 분화된 자손만을 야기한다.
일 예에서, 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다. 일 예에서, 줄기 세포는 배양 팽창된 인간 줄기 세포의 모집단이다. 일 예에서, 줄기 세포는 시험관내 또는 생체외 배양 팽창될 수 있다. 일 예에서, 배양 팽창된 줄기 세포는 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 계대되었다.
일 예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 다른 예에서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 일반적으로, 만능 줄기 세포는 만능성 상태에 있을 때 OCT4, NANOG 및 SSEA1의 발현을 나타내고 이들 마커의 발현은 일반적으로 분화에 의해 상실된다. 다른 예에서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 용어들 "인간 배아 줄기 세포" 및 이들의 약어 예컨대 "hES" 및 "hESC"는 성숙한 동물에 존재하는 모든 세포 유형을 생성하는 능력을 갖는, 자가-재생 및 다분화- 또는 전능성인 인간 배아 또는 배반포로부터 유래되거나, 수득가능하거나 또는 유래하는 세포를 지칭한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESC)는, 예를 들어, 인간 생체내 착상 배아, 시험관내 수정된 배아, 또는 배반포 단계로 팽창된 1-세포 인간 배아로부터 수득된 인간 배반포로부터 단리될 수 있다.
다른 예에서, 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포이다. 예를 들어, 줄기 세포는 인간 유도 만능 줄기 세포일 수 있다. 용어 "유도 만능 줄기 세포" 및 이들의 약어 "iPSC"는 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC의 바람직한 조합을 포함한, 전사 인자와 같은 외인성 유전자의 발현을 통해 만능 상태로 재 프로그래밍된 임의의 유형의 성인 체세포로부터 유래가능거나, 얻을 수 있거나 또는 유래되는 세포를 지칭한다. 인간 iPSC는 hESC에 동등한 만능성의 수준을 나타내지만, 분화 및 세포 전달 전에 동반 유전자 교정이 있거나 없는 자가 요법을 위해 환자로부터 유래될 수 있다. 유도 만능 줄기 세포의 생성에 적합한 공정은, 예를 들어, US 제7,615,374호 및 US 제2014273211호, 문헌 [Barberi et al; Plos medicine, Vol 2(6):0554-0559 (2005)], 및 [Vodyanik et al. Cell Stem cell, Vol 7:718-728 (2010)]에 기재되어 있다. 일 예에서, iPSC는 섬유모세포로부터 유래된다. 다른 예에서, iPSC는 혈액으로부터 유래된다. 예를 들어, iPSC는 백혈구로부터 유래될 수 있다. 다른 예에서, iPSC는 섬유모세포로부터 유래된다. 다른 예에서, iPSC는 백혈구 또는 섬유모세포로부터 유래된다.
일 예에서, 줄기 세포는 H9 또는 hES3이다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 신장 오가노이드를 포괄하고, 여기서 상기 신장 오가노이드는 H9 줄기 세포로부터 유래된다. 다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 신장 오가노이드를 포괄하고, 여기서 상기 신장 오가노이드는 hES3 줄기 세포로부터 유래된다(Kao et al., 2016; Ng et al., 2016; van den Berg et al., 2018). 예를 들어, 신장 오가노이드는 hES3-SOX17mCherry 또는 H9 GAPTrapLuc2로부터 유래될 수 있다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 50개 미만 네프론을 포함하는 신장 오가노이드를 포괄하며, 여기서 상기 신장 오가노이드는 H9 또는 hES3 줄기 세포로부터 유래된다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 15개 미만의 네프론을 포함하고 H9 또는 hES3 줄기 세포로부터 유래된다. 이들 예에서, 줄기 세포는 리포터 유전자를 발현할 수 있다.
다른 예에서, 줄기 세포는 iPSC GAPTrap td-Tomato, CRL1502.C32 또는 CLR1502.3이다(Briggs et al., 2013; Takasato et al., 2015). 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 신장 오가노이드를 포괄하며, 여기서 상기 신장 오가노이드는 iPSC GAPTrap td-Tomato로부터 유래된다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 50개 미만 네프론을 포함하는 신장 오가노이드를 포괄하며, 여기서 상기 신장 오가노이드는 iPSC GAPTrap td-Tomato, CRL1502.C32 또는 CLR1502.3으로부터 유래된다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 15개 미만의 네프론을 포함하고 iPSC GAPTrap td-Tomato, CRL1502.C32 또는 CLR1502.3으로부터 유래된다. 다시, 이들 예에서, 줄기 세포는 리포터 유전자를 발현할 수 있다.
일 예에서, 특정 대상체 및/또는 질환을 대표하는 신장 오가노이드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 이 구현예의 다양한 예가 아래에 기재되어 있다. 이 부문에 관련된 것은 신장 오가노이드를 생성하기 위해 사용될 수 있는 iPS 세포이다. 일 예에서, 인간 iPS 세포는 유전적 신장 질환이 있는 인간 대상체로부터 유래된다. 이 예에서, 혈액 샘플은 유전적 신장 질환이 있는 대상체로부터 단리될 수 있고 iPS 세포는 혈액 샘플의 세포(예를 들어 백혈구)로부터 유도될 수 있다. 상기 대상체는 다양한 예시적인 유전적 신장 질환 중 하나를 가질 수 있다. 그 예는 스테로이드 저항성 신장 증후군 및 핀란드 신병증, 국소 분절사구체신염 (FSGS), 알포트 증후군 및 피어슨 증후군을 포함한 선천성 신장 증후군(CNS)을 포함한다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 스테로이드 저항성 신장 증후군 및 핀란드 신병증, 국소 분절사구체신염 (FSGS), 알포트 증후군 및 피어슨 증후군을 포함한 선천성 신장 증후군(CNS)로 구성된 군으로부터 선택된 신장 질환을 대표하는 신장 오가노이드를 포괄한다. 따라서, 일 예에서, 신장 오가노이드는 CNS를 대표한다. 다른 예에서, 신장 오가노이드는 스테로이드 저항성 신장 증후군을 대표한다.
일 예에서, 신장 오가노이드는 발달하는 신장 및/또는 신장 질환을 모델링하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 신장 오가노이드를 포괄하며, 여기서 상기 신장 오가노이드는 신장 발달을 모델링하기 위해 사용된다. 다른 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 신장 오가노이드를 포괄하며, 여기서 상기 신장 오가노이드는 신장 질환을 모델링하기 위해 사용된다. 일 예에서, 신장 질환은 CNS 또는 상기 언급된 질환 중 또 다른 것이다. 이 예에서, 질환은 상기 언급된 신장 질환을 갖는 대상체로부터 iPS 세포를 유도하고 그로부터 신장 오가노이드를 생성함에 의해 모델링될 수 있다. 이 예에서, 신장 질환 발증에 관련되거나 또는 잠재적으로 관련된 대상체 유래된 iPS 세포 안으로 돌연변이를 도입하기 위해 유전자 편집(예를 들어 CRISPR/Cas9 유전자 편집)이 이용될 수 있다. 다른 예에서, 대상체 유래된 iPS 세포에서 돌연변이를 교정하기 위해 유전자 편집이 이용된다. 일 예에서, 등질 유전자 편집된 iPS 세포가 생성될 수 있다(예를 들어 Forbes et al. (2018) Am J Hum Genet. 102:816-831). 신장 발달 및 질환은 다양한 발달 단계 예컨대 하기에 논의된 것들 중 하나 이상(예를 들어 d7+15)에서 신장 오가노이드를 사용하여 경시적으로(예를 들어 2, 5, 10 또는 그 초과 일) 모델링될 수 있다. 이들 예에서, 오가노이드 사구체는 상이한 발달 단계(예를 들어 d7+11, d7+15, d7+18, d7+20)를 나타내고 그리고/또는 규정된 시간의 기간(예를 들어 스월러 배양에서 2, 5, 및 10일) 동안 배양되는 각각의 그룹으로 그룹 단위로 배양될 수 있다. 신장 오가노이드는 발달 또는 질환 단계를 결정하기 위해, 예를 들어, 시각적 평가, 면역조직화학, 유전자 및 단백질 발현 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 일 예에서, 신장 오가노이드는 또한 이들 연구 동안 신장세포독소, 후보 화합물 및/또는 치료 화합물과 접촉될 수 있고, 신독성 및/또는 치료적 효능이 결정될 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 예에서 사용된 신장 오가노이드는 리포터 유전자를 발현하도록 유전자 변형된 iPS 세포로부터 생성될 수 있다.
세포 배양 방법
세포 배양과 관련하여 사용되는 용어 "배지" 또는 "배지들"은 세포를 둘러싼 환경의 성분을 포함한다. 배지는 세포 분화 및 오가노이드 형성에 충분한 조건에 기여하고/하거나 이를 제공하는 것으로 구상된다. 배지는 고체, 액체, 기체성 또는 상 및 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 성장 배지뿐만 아니라 세포 성장을 유지하지 않는 액체 배지를 포함할 수 있다. 배지는 또한 젤라틴성 배지 예컨대 한천, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 예시적인 기체성 매질은 페트리 접시 또는 다른 고체 또는 반고형 지지체 상에서 성장하는 세포가 노출되는 기상을 포함한다. 용어 "배지"는 또한 세포와 아직 접촉되지 않았더라도 세포 배양에 사용하기 위해 의도된 물질을 지칭한다.
본 개시내용의 방법 사용된 배양 배지는 기본 배양 배지로서 줄기 세포 또는 IM 세포의 배양에 사용된 배양 배지를 사용함에 의해 제조될 수 있다. 상기 기본 배양 배지는, 예를 들어, 이글 최소 필수적 (MEM) 배양 배지를 포함하고 줄기 세포 또는 IM 세포의 배양에 사용될 수 있다면 특히 제한되지는 않는다. 또한, 본 개시내용의 배양 배지는 임의의 성분 예컨대 지방산 또는 지질, 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 산화방지제, 완충제, 무기 염 및 기타 동종의 것을 함유할 수 있다. 본 개시내용에 사용된 세포 배양 배지는 모든 필수 아미노산을 함유하고 또한 비-필수 아미노산을 함유할 수 있다. 일반적으로, 아미노산은 필수 아미노산(Thr, Met, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Lys, His) 및 비-필수 아미노산(Gly, Ala, Ser, Cys, Gln, Asn, Asp, Tyr, Arg, Pro)으로 분류된다. 다른 예에서, 기본 배양 배지는 예를 들어 APEL, mTESR-E6 또는 E8 화학적 한정 배지(StemCell Technologies)를 포함한다. 기본 배양 배지에는 또한 단백질 유리 하이브리도마 배지(PFHM) (예를 들어 3.5%)가 보충될 수 있다. 일 예에서, 기본 배지에는 혈청 대체물질이 보충된다. 예를 들어, 기본 배양 배지에는 녹아웃 혈청 대체물질(Thermo Fisher)이 보충될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에 의해 인정되는 바와 같이, 본원에 개시된 배양 배지는 경시적으로 대체될 필요가 있을 것이다. 매체 대체에 대한 적절한 타이밍을 식별하는 것은 상기 숙련된 수신자의 기술 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 예를 들어, 배지가 언제 대체를 필요로 하는지를 나타내기 위해 세포 배양 배지에서 통상적으로 사용되는 다양한 상업적으로 입수 가능한 비색계 지표가 있다. 다중-웰 배양 접시에서의 세포 배양을 위한 가이드로서, 배양 배지는 24시간 또는 48시간마다 대체될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지는 2일마다 대체될 수 있다.
신장 오가노이드
본 개시내용은 신장 오가노이드를 생산하는 방법을 포괄한다. 일 예에서, 신장 오가노이드는 중간 중배엽(IM) 세포의 모집단을 포함하는 배양 배지를 스월링시켜 의해 생산된다. 일 예에서, IM 세포는 현탁 배양에서 스월링된다. 의심할 여지를 없애기 위해, "현탁 배양"은 본 개시내용의 맥락에서 단일 세포 또는 작은 세포의 응집체가 진탕된 액체 배지에 현탁되면서 증식하는 세포 배양을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 단일 세포 또는 작은 세포의 응집체는 현탁 배양에서 증식하고 신장 오가노이드를 형성한다.
일 예에서, IM 세포 배양 배지는 FGF를 포함한다. 일부 예에서, FGF는 FGF9, FGF16 및 FGF20을 포함하는 FGF9 수퍼패밀리로부터 선택될 수 있다. 일부 예에서, FGF는 FGF9이다. 예를 들어, IM 세포 배양 배지는 D7로부터 적어도 D7+10까지의 FGF를 포함할 수 있다. 일 예에서, IM 세포 배양 배지는 D7로부터 적어도 D7+15까지의 FGF를 포함할 수 있다. FGF의 농도 예가 아래에 제공된다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 50 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 100 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 150 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 200 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 300 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 350 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 400 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 500 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 및 400 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF를 포함한다.
일 예에서, IM 세포 배양 배지는 FGF9를 포함할 수 있다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 50 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 100 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 150 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 200 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 300 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 350 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 400 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 500 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF9를 포함한다.
다른 예에서, 상기 언급된 수준의 FGF9는 FGF2에 대해 치환된다. 예를 들어, IM 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF2를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF2를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF2를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF2를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF2를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF2를 포함한다.
다른 예에서, 상기 언급된 수준의 FGF9는 FGF16에 대해 치환된다. 예를 들어, IM 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF16을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF16을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF16을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF16을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF16을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF16을 포함한다.
다른 예에서, 상기 언급된 수준의 FGF9는 FGF20에 대해 치환된다. 예를 들어, IM 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF20을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF20을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF20을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF20을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF20을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF20을 포함한다. 일 예에서, 스월러 배양에서 5일 후에 배양 배지로부터 FGF가 제거된다. 일 예에서, 스월러 배양에서 6일 후에 배양 배지로부터 FGF가 제거된다. 일 예에서, 스월러 배양의 4 내지 6일에 이어 배양 배지로부터 FGF가 제거된다.
일 예에서, 신장발생은 배양 배지에 Wnt/β-카테닌 효능제를 보충함에 의해 오가노이드에서 개시된다. 용어 "Wnt/β-카테닌 효능제"는 본 개시내용의 맥락에서, 바람직하게는 다른 비-정식인, Wnt 신호전달 경로의 맥락에서가 아닌, 정식 Wnt 신호전달 경로의 맥락에서 GSK3(예를 들어 GSK3-β)를 억제하는 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 예에서, Wnt/ β-카테닌 효능제는 GSK 3β 억제제이다. Wnt β-카테닌 효능제의 예는 Santa Cruz Biotechnology 및 R & D Systems과 같은 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능한 CHIR99021 (CHIR), LiCl, SB-216763, CAS 853220-52-7 및 다른 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함한다.
따라서, 일 예에서, IM 세포 배양 배지는 상기 언급된 수준의 FGF 및 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 예를 들어, IM 세포 배양 배지는 적어도 0.5 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 0.6 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 0.7 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 0.8 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 0.9 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 약 1 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.1 μΜ 또는 그 미만의 Wnt^-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.2 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.3 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.4 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.5 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 배양 배지는 Wnt/β-카테닌 효능제의 농도에 대한 이들 상한 및 하한의 임의의 조합을 포함할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.5 μΜ 내지 1.5 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.8 μΜ 내지 1.2 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 0.5 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 포함할 수 있다 적어도 0.6 μΜ CHIR 을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 0.7 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 0.8 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 0.9 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 약 1 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.1 μΜ 또는 그 미만의 CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.2 μΜ 또는 그 미만의 CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.3 μΜ 또는 그 미만의 CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.4 μΜ 또는 그 미만의 CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.5 μΜ 또는 그 미만의 CHIR을 포함할 수 있다. 배양 배지는 CHIR의 농도에 대한 이들 상한 및 하한의 임의의 조합을 포함할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.5 μΜ 내지 1.5 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.8 μΜ 내지 1.2 μΜ CHIR을 포함할 수 있다.
다른 예에서, IM 세포 배양 배지는 Rho 키나제 억제제 (ROCKi) 예컨대 Y-27632 (StemCell Technologies)를 포함할 수 있다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 8 μΜ ROCKi를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 약 10 μΜ ROCKi를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 12 μΜ 또는 그 미만 ROCKi를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 8 μΜ 내지 12 μΜ ROCKi를 포함할 수 있다.
상기 예에서, IM 세포 배양 배지는 FGF9, Wnt/β-카테닌 효능제 예컨대 CHIR 및 하나 이상 또는 모든 헤파린, 폴리(비닐 알코올) (PVA) 및 메틸 셀룰로스 (MC)를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 또한 ROCKi를 포함할 수 있다.
일 예에서, IM 세포 배양 배지는 적어도 0.5 μg/ml 헤파린을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 약 1 μg/ml 헤파린을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.5 μg/ml 또는 그 미만의 헤파린을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 2 μg/ml 또는 그 미만의 헤파린을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.2 μg/ml 내지 2 μg/ml의 헤파린을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.5 μg/ml 내지 1.5 μg/ml의 헤파린을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.8 μg/ml 내지 1.2 μg/ml의 헤파린을 포함한다.
일 예에서, IM 세포 배양 배지는 적어도 0.05% PVA를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 약 0.1% PVA를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.15% 또는 그 미만의 PVA를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.1% 내지 0.15% PVA를 포함한다.
일 예에서, IM 세포 배양 배지는 적어도 0.05% MC를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 약 0.1% MC를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.15% 미만의 MC를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.1% 내지 0.15% MC를 포함한다.
용어들 "스월링시킨", "스월링하다" 및 "스월링"은 본 개시내용의 맥락에서 원형, 비틀림 또는 나선형 패턴으로 세포 배양 배지의 운동을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 세포 배양에 원형 운동으로 충분한 진탕을 적용함에 의해 스월링된다. 예를 들어, 세포 배양물은 회전식 진탕기를 사용하여 스월링될 수 있다. 세포 배양물을 스월링하기에 적합한 장치의 다른 예는 진탕기 플랫폼, 진탕기 인큐베이터 또는 스피닝 플라스크를 포함한다. 스월링하는 것에 대해 적절한 rpm은 IM 세포가 응집하고 오가노이드를 형성할 수 있게 한다.
일 예에서, IM 세포 배양은 적어도 30 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 적어도 40 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 적어도 50 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 적어도 60 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 적어도 70 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 적어도 80 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 40 내지 80 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 50 내지 70 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 55 내지 65 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 30 내지 150 rpm에서 스월링된다. 다른 예에서, 세포 배양은 30 내지 90 rpm에서 스월링된다.
일 예에서, IM 세포는 적어도 5일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 적어도 7일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 적어도 10일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 적어도 12일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 적어도 14일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 적어도 20일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 최대 42일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 5 내지 20일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 5 내지 18일 동안 배양된다. 다른 예에서, IM 세포는 7 내지 14일 동안 배양된다. 예를 들어, IM 세포는 적어도 10일 동안 스월링하면서 배양될 수 있다. 예를 들어, IM 세포는 적어도 20일 동안 스월링될 수 있다. 다른 예에서, IM 세포는 적어도 30일 동안 스월링될 수 있다. 일 예에서, IM 세포는 10 내지 30일 동안 스월링된다. 다른 예에서, IM 세포는 15 내지 30일 동안 스월링된다.
일 예에서, IM 세포의 모집단은 상기 언급된 배양 배지에서 스월링하면서 해리되고 배양된다. 일 예에서, IM 세포는 EDTA를 사용하여 해리될 수 있다. 다른 예에서, IM 세포는 트립신 또는 TrypLE를 사용하여 해리될 수 있다. 일 예에서, 해리된 IM 세포는 추가로 배양되기 전에 메쉬 스크린을 통해 통과된다. 일 예에서, 세포는 해리 후 적어도 12일 동안 스월링하면서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 해리 후 적어도 13일 동안 스월링하면서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 해리 후 적어도 14일 동안 스월링하면서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 해리 후 적어도 15일 동안 스월링하면서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 해리 후 적어도 20일 동안 스월링하면서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 해리 후 적어도 25일 동안 스월링하면서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 해리 후 적어도 35일 동안 스월링하면서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 해리 후 5 내지 18일 동안 스월링하면서 배양된다.
다른 예에서, 본원에 정의된 IM 세포는 상이한 성분을 포함하는 다양한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 단계들에서 배양될 수 있고 여기서 각각의 단계는 상이한 배양 배지와 연관된다. 일 예에서, IM 세포는 두 단계에서 스월링하면서 배양된다. 이 예에서, 단계 1 배양 배지는 상기 언급된 수준의 FGF 예컨대 FGF9, CHIR, ROCKi, 헤파린, PVA 및 MC를 포함하는 반면 단계 2 배양 배지는 상기 언급된 수준의 FGF 예컨대 FGF9, CHIR, 헤파린, PVA 및 MC를 포함한다. 예를 들어, 단계 1 배양 배지는 200 ng/ml FGF9, 1 μΜ CHIR, 10 μΜ ROCKi, 1 μg/ml 헤파린, 0.1% PVA 및 0.1% MC를 포함할 수 있고 반면 단계 2 배양 배지는 FGF9, 1 μΜ CHIR, 1 μg/ml 헤파린, 0.1% PVA 및 0.1% MC를 포함할 수 있다.
다른 예에서, IM 세포는 세 단계에서 스월링하면서 배양된다. 이 예에서, 단계 1 및 2 배양 배지는 상기에 정의된 바와 같고 단계 3 배양 배지는 상기 언급된 수준의 PVA 및 MC를 포함한다. 예를 들어, 단계 3 배양 배지는 0.1% PVA 및 0.1% MC를 포함할 수 있다.
일 예에서, IM 세포는 4일 동안 단계 2 배양 배지에서 배양되기 전에 1일 동안 단계 1 배양 배지에서 배양된다. 일 예에서, 세포는 배양된 4일 동안 단계 2 배양 배지에서 배양되기 전에 18 내지 24시간 동안 단계 1 배양 배지에서 배양된다. 이들 예에서, 세포는 7 내지 20일 동안 단계 3 배양 배지에서 추가로 배양될 수 있다. 다른 예에서, 세포는 적어도 15일 동안 단계 3 배양 배지에서 추가로 배양될 수 있다. 다른 예에서, 세포는 적어도 30일 동안 단계 3 배양 배지에서 추가로 배양될 수 있다.
본 발명자들은 스월러 배양에서 약 5 내지 10일 후 IM 세포에 레틴산의 첨가는 오가노이드에서 사구체 성숙(개선된 사구체 발세포 성숙)을 개선한다는 것을 또한 확인했다. 따라서, 일 예에서, 레틴산은 스월러 배양에서 5 내지 10일 후 세포 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 모든 트랜스 레틴산(atRA)이 세포 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 적어도 0.07 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 적어도 0.1 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 적어도 0.2 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 적어도 0.5 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다.
다른 예에서, 적어도 1.5 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 적어도 1.8 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 적어도 2.0 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 적어도 2.5 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 1.5 μΜ 내지 3 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 2.0 μΜ 내지 3 μΜ 레틴산이 세포 배양 배지에 첨가된다.
다른 예에서, 단계 1 및 2 배양 배지는 상기에 정의된 바와 같고 단계 3 배양 배지는 상기 언급된 수준의 PVA, MC 및 atRA를 포함한다. 예를 들어, 단계 3 배양 배지는 0.1% PVA 및 0.1% MC. 2.5 μΜ atRA를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 적절한 배지에서 낮은 수의 IM 세포가 스월러 배양되게 하는 것은 간소화한 3차원 구조를 갖는 신장 오가노이드의 발생을 유도할 수 있다는 것을 확인했다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용의 방법은 5x105 미만 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 4x105 미만 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 3x105 미만 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 lx105 미만 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 5x104 미만 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 4x104 미만 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 1x104 내지 1x105 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 2x104 내지 1x105 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 5x103 내지 3x105 IM 세포를 포함하는 IM 세포의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다.
다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 1 x 105 IM 세포/ml 내지 5 x 106 IM 세포/ml를 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 5x105 내지 4 x106 IM 세포/ml를 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 5x105 내지 3 x106 IM 세포/ml를 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 5x106 미만 IM 세포/ml의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 4x106 미만 IM 세포/ml의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 3x106 미만 IM 세포/ml의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 2x106 미만 IM 세포/ml의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 1x106 IM 세포/ml 또는 그 미만의 모집단을 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 5x105 내지 2 x106 IM 세포/ml를 스월링하는 것을 포괄한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 5x105 내지 1.5 x106 IM 세포/ml를 스월링하는 것을 포괄한다. 이들 예에서, 대략 5,000 내지 15,000 오가노이드가 생산될 수 있다. 다른 예에서, 대략 8,000 내지 10,000 오가노이드가 생산될 수 있다. 이들 예에서, 총 세포 수는 스월러 배양의 개시에서의 세포 수로부터 배양하는 기간에 걸쳐 30 내지 40배 증가한다. 이들 예에서, 총 세포 수는 문헌 [Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568]에 기재된 프로토콜을 사용한 총 세포 수의 증가에 비교하여 3 내지 4 배 증가한다. 이 예에서, 총 세포 수는 약 1 x 105 내지 5 x 106 세포/ml에서 약 3 x 106 내지 2 x 108 세포/ml로 증가한다.
일 예에서, IM 세포는 본원에 개시된 방법을 통해 수득된다.
일 예에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는 신장 오가노이드를 생산하는 방법을 포괄한다:
- 7일 동안 줄기 세포의 모집단을 배양하여 IM 세포를 생산하는 단계로, 여기서 처음 4 내지 5일은 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 예컨대 CHIR에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고 나머지 일은 FGF9 및 저농도의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 단계;
- IM 세포를 해리하는 단계;
- 적어도 5일 동안 FGF9를 포함하는 세포 배양 배지에서 IM 세포를 스월링시킴에 의해 신장 오가노이드를 생산하는 단계로, 여기서 처음 24시간은 FGF9, 헤파린, 저농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 및 ROCKi를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고 이어지는 3 또는 4일은 FGF9, 헤파린, 저농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 PVA 및 MC를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 단계.
상기 예에서, 줄기 세포는 7일 동안 배양될 수 있고, 여기서 처음 4일은 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 예컨대 CHIR에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고 나머지 일은 FGF9 및 저농도의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 예에서, Wnt/β-카테닌 효능제는 CHIR이다. 일 예에서, 고농도의 CHIR은 약 3 μΜ 내지 약 12 μΜ이다. 다른 예에서, 고농도의 CHIR은 약 4 μΜ 내지 약 10 μΜ, 약 5 μΜ 내지 약 9 μΜ, 약 6 μΜ 내지 약 8 μΜ, 약 6.5 μΜ 내지 약 8 μΜ, 또는 약 6.5 μΜ 내지 약 7 μΜ이다. 일 예에서, 저농도의 CHIR은 1 μΜ이다. 일 예에서, IM 세포는 트립신을 사용하여 해리된다. 다른 예에서, 세포는 EDTA를 사용하여 해리된다. 일 예에서, IM 세포는 적어도 4일 동안 200 ng/ml FGF9를 포함하는 세포 배양 배지에서 스월링되고, 여기서 처음 24시간은 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml 헤파린, 1 μΜ CHIR 및 10 μΜ ROCKi를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고 이어지는 3 또는 4일은 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml 헤파린, 1 μΜ, 0.1% PVA 및 0.1% MC를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
다른 예에서, 본 방법은 CHIR 또는 FGF9를 포함하지 않는 PVA 및 MC를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 스월링하는 단계를 추가로 포함한다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 0.1% PVA 및 0.1% MC를 포함한다. 일 예에서, 세포는 5일 또는 더 오래 동안 CHIR 또는 FGF9를 포함하지 않는 PVA 및 MC를 포함하는 세포 배양 배지에서 스월링된다.
중간 중배엽
본 발명자들은 또한 저농도의 CHIR을 포함하는 배지에서 줄기 세포를 배양하는 것과 더 긴 기간 동안 wnt/β-카테닌 신호전달을 활성화하는 것이 개선된 중간 중배엽을 생산하는데 유익하다는 것을 놀랍게도 확인했다. 시험관내 배양 방법은 후측 원시선 (PPS) 세포 및 중간 중배엽(IM) 세포를 통해 줄기 세포를 분화하기 위한 시스템을 제공하여 신장 오가노이드를 생성한다.
따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 중간 중배엽 (FM) 세포를 생성하는 시험관내 방법을 포괄하며, 상기 방법은 FGF 및 4 μΜ 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 2 내지 5일 동안 후측 원시선 (PPS) 세포의 모집단을 배양하는 단계를 포함한다. FGF 및 Wnt/β-카테닌 효능제의 적합한 농도와 배양하는 기간은 처음 3 또는 4일의 배양 후 기간 동안 중간 중배엽 (FM) 세포를 생성하는 방법과 관련하여 아래에 기재된 바와 같다.
따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 중간 중배엽(IM) 세포를 생성하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 대략 7일 동안 CHIR을 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포의 모집단을 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 FGF 예컨대 FGF9는 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 150 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 175 ng/ml 내지 225 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 195 ng/ml 내지 205 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 약 200 ng/ml FGF9가 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 헤파린이 또한 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 0.5 μg/ml 내지 2 μg/ml 헤파린이 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 0.5 μg/ml 내지 1.5 μg/ml 헤파린이 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 0.8 μg/ml 내지 1.2 μg/ml 헤파린이 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 다른 예에서, 1 μg/ml 헤파린이 처음 3 또는 4일의 배양 후 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 상기 언급된 수준의 FGF 및 헤파린이 배양에서 4일 후 배양 배지에 첨가된다. 일 예에서, 줄기 세포는 7일 동안 CHIR을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된다.
특히, 본 발명자들은 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 예컨대 CHIR에서 줄기 세포를 배양하고 이어서 저농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 및 FGF 예컨대 FGF9에서 줄기 세포를 배양하는 것은 개선된 IM 세포를 생성한다는 것을 확인했다. 예를 들어, 개선된 IM 세포는 높은 수준의 PAX2, LHX1 및 OSR1 (캡 간충직) 및 Wntl1 및 GATA3 (요관 상피)를 발현한다. 따라서, 일 예에서, 줄기 세포는 저농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 및 FGF 예컨대 FGF9, FGF16, FGF20 또는 FGF2를 포함하는 배양 배지에서 배양되기 전에 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 예컨대 CHIR을 포함하는 배양 배지에서 배양될 수 있다.
일 예에서, 본 개시내용은 중간 중배엽 (FM) 세포를 생성하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 저농도의 CHIR 및 FGF 예컨대 FGF9를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포의 모집단을 배양하기 전에 고농도의 CHIR을 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포의 모집단을 배양하는 것을 포함한다. 이 예에서, "고농도"의 CHIR은 적어도 5 μΜ이고 "저농도"의 CHIR은 3 μΜ 미만이다. 다른 예에서, "고농도"의 CHIR은 적어도 6 μΜ이고 "저농도"의 CHIR은 2 μΜ 미만이다. 다른 예에서, "고농도"의 CHIR은 적어도 7 μΜ이고 "저농도"의 CHIR은 1 μΜ 또는 그 미만이다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 방법은 중간 중배엽 (IM) 세포를 생성하는 시험관내 방법을 포괄한다. 일 예에서, IM 세포를 생성하는 방법은 대략 7일 동안 줄기 세포의 모집단을 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 처음 4 내지 5일은 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제 예컨대 CHIR에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고 나머지 일은 FGF9 및 저농도의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, IM 세포를 생성하는 방법은 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 FGF9 및 적어도 0.5 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포의 모집단을 배양하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.6 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.7 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.8 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.9 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 약 1 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 1.1 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 1.2 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 1.3 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 1.4 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 1.5 μΜ 또는 그 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 Wnt/β-카테닌 효능제의 농도에 대한 이들 상한 및 하한의 임의의 조합을 포함할 수 있다는 것이 인정될 것이다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 0.5 μΜ 내지 1.5 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 0.8 μΜ 내지 1.2 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 2 μΜ 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 Wnt/β-카테닌 효능제에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 1.5 μΜ 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함할 수 있다.
일 예에서, Wnt/β-카테닌 효능제는 CHIR이다. 따라서, 일 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.5 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.6 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.7 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.8 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 적어도 0.9 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 약 1 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 0.5 μΜ 내지 1.5 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 0.8 μΜ 내지 1.2 μΜ CHIR을 포함할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 2 μΜ 미만의 CHIR을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 1.5 μΜ 미만의 CHIR을 포함할 수 있다.
일 예에서, 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 저농도의 CHIR 예컨대 상기 예시된 것들 및 FGF9를 포함할 수 있다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 50 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 100 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 150 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 200 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 300 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 350 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 400 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 500 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF9를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF9를 포함한다.
다른 예에서, 상기 언급된 수준의 FGF9는 FGF2에 대해 치환된다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF2를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF2를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF2를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF2를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF2를 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF2를 포함한다.
다른 예에서, 상기 언급된 수준의 FGF9는 FGF16에 대해 치환된다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF16을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF16을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF16을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF16을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF16을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF16을 포함한다.
다른 예에서, 상기 언급된 수준의 FGF9는 FGF20에 대해 치환된다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 400 ng/ml FGF20을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 300 ng/ml FGF20을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml FGF20을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 100 ng/ml 내지 200 ng/ml FGF20을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 180 ng/ml 내지 220 ng/ml FGF20을 포함한다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 190 ng/ml 내지 210 ng/ml FGF20을 포함한다.
일 예에서, 고농도 CHIR을 포함하는 배양 배지는 FGF를 포함하지 않는다.
다른 예에서, 세포 배양 배지는 고농도의 CHIR에서 처음 4 내지 5일의 배양 후 저농도의 CHIR 예컨대 상기 예시된 것들, 상기 예시된 수준의 FGF 및 헤파린을 포함할 수 있다. 일 예에서, 저농도의 CHIR 및 FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 또한 헤파린을 포함한다. 이 예에서, 세포 배양 배지는 1 μg/ml 헤파린을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 1.5 μg/ml 헤파린을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 2 μg/ml 헤파린을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.5 μg/ml 내지 2 μg/ml 헤파린을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.5 μg/ml 내지 1.5 μg/ml 헤파린을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 0.8 μg/ml 내지 1.2 μg/ml 헤파린을 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 개시내용의 방법은 IM 세포를 생성하는 상기 언급된 방법을 조합하는 것과 이들 IM 세포를 신장 오가노이드를 생성하는 상기 예시된 방법에 사용하는 것을 포괄한다.
일 예에서, 줄기 세포는 상기 언급된 방법을 사용하여 배양되어 신장 오가노이드를 생성하기 위한 상기 언급된 스월러 배양에서 해리되고 배양되기 전에 IM 세포를 생성할 수 있다. 이 예에서, IM 세포는 EDTA, 트립신 또는 TrypLE를 사용하여 해리될 수 있다. 다른 예에서, 세포는 신장 오가노이드를 생성하기 위한 메쉬 스크린을 통해 통과되고 상기 언급된 스월러 배양에서 배양되기 전에 EDTA를 사용하여 해리될 수 있다. 다른 예에서, 세포는 신장 오가노이드를 생성하기 위한 원심분리되고 수득한 펠릿이 상기 언급된 스월러 배양에 재현탁되기 전에 트립신을 사용하여 해리될 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 배양에서의 일수에 기초하여 기술될 수 있다. 배양에서의 일수는 줄기 세포로부터 IM 세포의 생성을 위한 일수(X) 및 IM 세포로부터 신장 오가노이드의 형성을 위한 일수(Y)를 포함한 2개 성분으로 분리될 수 있다. 일 예에서, 줄기 세포로부터 IM 세포의 생성과 IM 세포로부터 신장 오가노이드의 생성을 구분하는 단계는 IM 세포의 해리이다. 줄기 세포로부터 IM 세포의 생성을 위한 배양 일과 IM 세포로부터 신장 오가노이드의 형성을 위한 일을 나타내는 하나의 방식은 일(d) X+Y이다 (예를 들어 d7+12는 줄기 세포로부터 IM 세포를 생성하고 이어서 IM 세포의 해리의 7일과 IM 세포로부터 신장 오가노이드 형성의 12일을 기술할 것이다 (즉 Y = 오가노이드로서 일자의 수).
일 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+12 신장 오가노이드이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+14 신장 오가노이드이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+15 또는 그 후 신장 오가노이드이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+17 신장 오가노이드이다.
다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+20 신장 오가노이드이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+22 신장 오가노이드이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+25 신장 오가노이드이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+30 신장 오가노이드이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+13 내지 d7+30이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+14 내지 d7+30이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+15 내지 d7+30이다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 d7+15 내지 d7+25이다. 상기 언급된 예에서 IM 세포는 8, 9 또는 10일 동안 배양될 수 있다(즉 d8+Y, d9+Y 또는 d10+Y).
다른 예에서, 본원에 개시된 신장 오가노이드의 세포는 D7+7 후에 증식한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 신장 오가노이드의 세포는 D7+10 후에 증식한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 신장 오가노이드의 세포는 D7+12 후에 증식한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 신장 오가노이드의 세포는 D7+5 내지 D7+10 사이에 증식한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 신장 오가노이드의 세포는 D7+5 내지 D7+12 사이에 증식한다. 이들 예에서, 세포 증식은 본원에 개시된 방법을 사용하여 오가노이드의 모집단을 준비하고, 특이적 시점(예를 들어 D7+5, D7+7, D7+10 등)에서 모집단으로부터 오가노이드를 분리 및 분해하고, 예를 들어, 자동화 세포 계수기(예를 들어 Life Technologies)에서 트립판 청색 염료 배제 테스트를 사용하여 각각의 시점에서 세포 수를 결정함에 의해 검출될 수 있다.
스크리닝
본 개시내용에 의해 포괄된 신장 오가노이드는 다양한 스크리닝 적용에 사용될 수 있다. 일 예에서, 신장 오가노이드는 독성에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 신장 오가노이드는 신독성에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 신독성에 대해 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 본원에 개시된 신장 오가노이드를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 후보 화합물이 신장독성인지 아닌지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일 예에서 본원에 기재된 신장 오가노이드는 신장독성 부작용에 대해 평가되기 전에 후보 화합물과 접촉된다. 예시적인 신장독성 부작용은 직접적인 관형 효과, 발세포 손상, 간질성 신염 및 사구체신염을 포함한다. 신독성은 또한 예를 들어, Qiagen으로부터 인간 신독성 RT2 Profiler™ PCR 어레이 또는 Eurofins로부터 높은 함량 분석 (HCA) 다중화된 신독성 검정을 포함하여 상업적으로 입수 가능한 도구를 사용하여 바이오마커 발현의 분석을 포함한, 시험관내 신장 세포 기능에 대한 임의의 적절한 테스트에 의해 평가 또는 측정될 수 있다. 다른 예에서, 신독성은 후보 화합물과 접촉에 이어서 본원에 개시된 신장 오가노이드에서 사구체 세포의 급성 세포자멸사를 측정함에 의해 평가된다. 다른 예에서, 신독성은 전자 현미경검사 예컨대 투과 EM 또는 스캐닝 EM을 사용하여 평가될 수 있다. 신독성을 나타내는 기준의 다른 예는 발세포 마커 유전자 발현 또는 단백질 발현의 손실 및 발 과정의 손실(폐색의 손실)을 포함한다.
다른 예에서, 본 개시내용은 신장 질환을 치료하는 치료적 효능에 대해 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 본원에 개시된 신장 오가노이드를 후보 화합물이 치료적으로 효과적인지 아닌지 여부를 결정하는 조건하에서 후보 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 예에서, 본 방법은 본원에 개시된 신장 오가노이드를 신장독성 화합물의 존재에서 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 후보 화합물이 치료적으로 효과적인지 아닌지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
치료적 효능에 대해 스크리닝하는 다른 예는 신장 질환을 나타내는 신장 오가노이드를 평가하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 신장 질환은 스테로이드 저항성 신장 증후군 및 핀란드 신병증, 국소 분절사구체신염(FSGS), 알포트 증후군 및 피어슨 증후군을 포함한 선천성 신장 증후군(CNS)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 예에서, 신장 질환은 CNS이다.
용어 "치료적 효능"은 본 개시내용의 맥락에서 후보 화합물 또는 이를 포함하는 조성물의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유익한 효과를 넘어서는 반응을 지칭하기 위해 사용된다. 치료적 효능은 개선된 신장 세포 기능; 유지된 신장 세포 기능; 신장 세포 기능에서 감퇴 억제(즉, 어느 정도까지 둔화 및, 일부 예에서, 중단); 신장 세포사 억제(즉, 어느 정도까지 둔화 및, 일부 예에서, 중단)에 기초하여 결정될 수 있다. 일 예에서, 치료적 효능은 적절한 발세포 단백질 존재 및 이들이 적절하게 분극화된 증거에 기초하여 결정된다. 예는 발세포의 막에 NPHS1, NPHS2 및 NEPH-1의 국소화를 포함하며, 여기서 NPHS1, NPHS2 및 NEPH-1은 면역조직화학을 사용하여 결정된다.
신장 질환을 나타내는 신장 오가노이드를 포함한 연구에 대해, 신독성 및 치료적 효능은 무-질환 신장 오가노이드에서 상응하는 신장 세포 기능에 기초하여 확인된 사전결정된 표준에 대비해 결정될 수 있다. 다른 예에서, 개선된 신장 세포 기능은 신장 질환을 나타내는 신장 오가노이드와 건강한 신장을 나타내는 신장 오가노이드 사이의 신장 세포 기능의 비교에 기초하여 결정될 수 있다.
신장독성 화합물 및 후보 화합물과 신장 오가노이드를 접촉시키는 단계를 포함하는 연구에 대해, 개선된 신장 세포 기능은 신장독성 화합물과 접촉되지 않은 신장 오가노이드 및/또는 신장독성 화합물 단독과 접촉된 신장 오가노이드와의 비교에 기초하여 결정될 수 있다.
용어 "후보 화합물"은 본 개시내용의 맥락에서 선별되어 진 제제를 지칭하기 위해 사용된다. 후보 화합물은, 예를 들어, 소분자 예컨대 작은 유기 화합물(예를 들어, 약 50 내지 약 2,500 Da의 분자량을 갖는 유기 분자), 펩타이드 또는 이들의 모방체, 펩타이드 및 비-펩타이드 리간드를 포함한 리간드, 폴리펩타이드, 핵산 분자 예컨대 압타머, 펩타이드 핵산 분자, 및 이들의 성분, 조합, 및 유도체를 포함할 수 있다.
용어들 예컨대 "접촉하는", "노출하는" 또는 "적용하는"은 문맥 상 본 개시내용에서 교환가능하게 사용될 수 있는 용어들인 것으로 간주된다. 본 용어 접촉시키는 단계는 후보 화합물(들)이 본원에 개시된 사구체와 접촉되어 지는 것을 요한다. 일 예에서, 화합물은 본 화합물이 수용성이거나 또는 수-불혼화성인 경우 세포 배양 배지에 용해될 수 있다. 그렇지 않으면, 적합한 기질이 화합물에 침지되고 배양에서 신장 오가노이드 상에 배치될 수 있다. 휘발성 후보 화합물의 스크리닝을 위해, 본원에 개시된 신장 오가노이드는 화합물(들)을 포함하는 공기 또는 다른 가스 혼합물에 노출될 수 있다. 대안적으로, 신장 오가노이드는 세포 배양 배지에서 휘발성 화합물의 용액 또는 현탁액에 노출될 수 있다. 또한, 가능하다면, 휘발성 화합물은 용해되거나 안정화될 수 있다. 그렇지 않으면, 적합한 기질이 화합물에 침지되고 배양에서 신장 오가노이드 상에 배치될 수 있다.
본 개시내용의 방법을 수행함에 있어서 복수의 후보 화합물이 신장 오가노이드와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 최소 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 3,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 40,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 200,000 또는 그 초과 후보 화합물이 신장 오가노이드와 접촉될 수 있다. 일 예에서, 후보 화합물은 동일 또는 별개의 신장 오가노이드와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물의 특이적 조합이 선별될 수 있다.
일 예에서, 후보 화합물은 스크리닝 이전에 표지된다. 일 예에서, 후보 화합물은 조성물일 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물은 제형에 존재할 수 있거나 또는 화합물 또는 분자의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물은 혈청일 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물은 신장 질환이 있는 대상체로부터 단리된 혈청일 수 있다. 일 예에서, 혈청은 CNS가 있는 대상체로부터 단리된다. 예를 들어, 혈청은 스테로이드 저항성 신장 증후군이 있는 대상체로부터 단리될 수 있다. 다른 예에서, 혈청은 신장 이식을 받은 대상체로부터 단리된다. 다른 예에서, 혈청은 신장 이식 후 제시된 신장 증후군이 있는 대상체로부터 단리된다.
예시적인 신장세포독소는 아미노글리코시드 항생제, β 락탐 항생제, 시스플라틴, 방사선조영제, NSAID, ACE 억제제, 리튬, CsA 및 항-간질 약물 예컨대 페나이토인을 포함한다.
다양한 시간의 길이 동안 배양된 신장 오가노이드가 본원에 개시된 스크리닝 적용에 사용될 수 있다. 따라서, 일 예로서, d7+15 또는 더 늦은 신장 오가노이드가 스크리닝에 사용될 수 있다. 다른 예에서, d7+18 내지 d7+25 신장 오가노이드가 스크리닝에 사용될 수 있다. 다른 예에서, 미성숙한 신장 오가노이드가 스크리닝에 사용될 수 있다. 예를 들어, d7+11 내지 d7+18이 스크리닝에 사용될 수 있다. 다양한 예에서, IM 세포는 더 길게 배양될 수 있고 따라서 d8+Y, d9+Y 또는 d10+Y 신장 오가노이드가 스크리닝에 사용될 수 있다.
일 예에서, 스크리닝 방법은 후보 화합물(들)을 신장 오가노이드의 라이브러리와 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 후보 화합물은 상이한 발달 단계에서 신장 오가노이드를 사용하여 선별될 수 있다. 예를 들어, d7+10, d7+15 내지 d7+25 신장 오가노이드가 사용될 수 있다. 다른 예에서, 후보 화합물은 상이한 신장 질환을 나타내는 신장 오가노이드를 사용하여 선별될 수 있다.
숙련가가 인정하는 바와 같이, 후보 화합물을 선별하기 위해 적응될 수 있는 다양한 상이한 스크리닝 절차가 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 신장 오가노이드는 단일 또는 다중웰 형식으로 제공되고 설정된 기간 동안 후보 화합물과 접촉될 수 있다. 일 예에서, 신장 오가노이드는 다중-웰 플레이트에 제공된다. 일 예에서, 웰당 1개 신장 오가노이드가 제공된다. 다른 예에서, 웰당 2개 신장 오가노이드가 제공된다. 다른 예에서, 웰당 3개 신장 오가노이드가 제공된다. 다른 예에서, 웰당 4개 신장 오가노이드가 제공된다. 다른 예에서, 웰당 5개 신장 오가노이드가 제공된다. 다른 예에서, 웰당 10개 신장 오가노이드가 제공된다. 다른 예에서, 웰당 20개 또는 그 초과 신장 오가노이드가 제공된다. 일 예에서, 신장 오가노이드는 96 웰 플레이트에 제공된다.
고처리량 스크리닝 방법이 본 개시내용에 포괄된다. 이 예에서, 고처리량 스크리닝은 다수의 후보 화합물을 함유하는 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 그와 같은 라이브러리는 그 다음 원하는 수준의 활성(예를 들어, 치료적 효능)을 나타내는 이들 라이브러리 구성원(예를 들어, 특정 화학 종 또는 서브클래스)을 식별하기 하나 이상의 검정에서 선별된다.
고처리량 스크리닝 시스템은 상업적으로 입수 가능하고 전형적으로 검정에 적절한 검출기에서 모든 샘플 및 시약 피펫팅, 액체 분배, 적시의 인큐베이션, 및 배양판(예를 들어 96 웰 포맷)의 최종 판독을 포함한, 전체 절차를 자동화한다. 이들 구성가능한 시스템은 신속한 시작뿐만 아니라 고도의 유연성 및 맞춤화를 제공한다. 이와 같은 시스템의 제조자(예를 들어 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 등)는 사용에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다.
일 예에서, 상기 언급된 방법은 치료적 효능을 나타내는 화합물을 선정하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 신장세포독소의 존재에서 그리고/또는 신장 질환을 나타내는 신장 오가노이드와 접촉될 때, 신장 세포 기능을 유지하고; 신장 세포 기능에서 감퇴를 억제하고 (즉, 어느 정도까지 늦추고, 일부 예에서, 멈추고); 신장 세포사를 억제하고 (즉, 어느 정도까지 늦추고, 일부 예에서, 멈추는), 화합물. 다른 예에서, 상기 언급된 방법은 신독성을 감소시키는 화합물을 선정하는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 사구체신염을 억제하는 화합물이 선택될 수 있다. 다른 예에서, 신장 세포 기능을 개선하는 화합물이 선택될 수 있다. 이들 예에서, 신장 세포 기능은, 예를 들어, Qiagen 또는 High Content로부터의 인간 신독성 RT2 Profiler™ PCR 어레이를 포함한 상업적으로 입수 가능한 도구를 사용한 바이오마커 발현에 기초하여 결정될 수 있다.
개인화된 의약 및 계층화
대상체에서 신장 질환을 나타내는 신장 오가노이드에서 치료적 효능을 나타내는 후보 화합물은 대상체에서 치료적 효능을 나타내는 경향이 더욱 있을 수 있다. 따라서, 일 예에서, 이들 신장 오가노이드는 대상체에서 신장 질환의 치료 또는 예방에 보다 영향을 줄 수 있는 제제를 선정하는데 사용될 수 있다.
다른 예에서, 다수의 대상체에서 신장 질환을 나타내는 신장 오가노이드가 제조될 수 있다. 이들 신장 오가노이드는 다수의 대상체에서 신장 질환의 치료 또는 예방에 보다 영향을 줄 수 있는 제제를 선정하거나 또는 특정 제제로 치료에 대해 보다 반응하기 쉬운 대상체의 군을 식별하는데 사용될 수 있다. 그와 같은 방법은 신장 질환을 치료하는 능력에 대해 시험되어 지는 제제의 임상시험에서 대상체를 계층화하는데 유용할 수 있다. 신장 오가노이드 스크리닝에 기초한 대상체 집단을 그룹화하는 것은 유전적 인자로 인한 치료 결과의 변동을 제거하거나 감소시켜 잠재적 약물의 효능을 보다 정확하게 평가할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 치료제의 임상시험을 위해 대상체의 그룹을 계층화하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 대상체의 그룹으로부터 iPS 세포 모집단을 수득하는 단계, 각각의 대상체 iPS 세포 모집단으로부터 신장 오가노이드 또는 이의 모집단을 생성하는 단계, 치료제가 치료적으로 효과적인지 여부를 결정하는 단계, 및 요법에 보다 반응하기 쉬운 대상체를 선정하는 결정의 결과를 사용하는 단계를 포함한다. 이 예에서, 상기 방법은 치료제가 치료학적으로 효과적인지를 결정하기 전에 신장 오가노이드를 치료제 및 신장세포독소와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 치료제의 예는 상기 논의된 후보 화합물 예컨대, 예를 들어, 하나 이상의 소분자, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 항체, 항체 단편, 바이러스, 박테리아, 줄기 세포, 신장 질환 환자 유래된 혈청을 포함한 혈청을 포함한다. 의심할 여지를 없애기 위해, 혈청은 특정 신장 질환이 있는 대상체로부터 단리될 수 있고 본원에 개시된 신장 오가노이드와 접촉된다. 신장 질환의 다양한 예는 본원에 논의되고 혈청은 이들 질환을 나타내는 다양한 대상체로부터 단리될 수 있다. 대상체로부터 혈청을 단리하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 일 예에서, 혈청은 원심분리를 사용하여 전혈 샘플로부터 정제된다.
바이오-프린팅
일 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 조성물 또는 세포를 사용하여 생산된 "바이오-프린트된" 신장 구조 예컨대 신장 또는 다른 네프론-함유 기관, 오가노이드 또는 장기-유사 구조를 포괄한다. 용어들 예컨대 "바이오프린팅된" 또는 "바이오프린팅"은 본 개시내용의 맥락에서 자동화, 컴퓨터-보조된, 3차원 프로토타이핑 장치(예를 들어 바이오-프린터)와 양립가능한 방법론을 통해 3차원, 정확한 세포의 침착(예를 들어, 세포 용액, 세포-함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농도, 다중세포 응집체, 다중세포체, 바이오-잉크 등)을 이용하는 공정을 지칭하기 위해 사용된다. 바이오-프린팅에 대한 적합한 방법의 예가 WO 2012/054195호 및 WO 2013/040087호에 개시되어 있다. 일 예에서, 바이오-프린팅은 인간 기관(예를 들어 Organovo/Invetech)을 재창제하기 위해 원하는 방향으로 인간 세포를 배치하는 하이드로겔 스캐폴드를 사용하는 장기 프린터를 사용하여 수행된다.
일 예에서, 신장 구조는 바이오-잉크로부터 바이오-프린트된다. 용어 "바이오-잉크"는 본 개시내용의 맥락에서 본원에 정의된 조성물 또는 세포를 포함하는 액체, 반-고체, 또는 고체 조성물을 지칭하기 위해 사용된다. 일 예에서, 바이오-잉크는 세포 용액, 세포 응집체, 세포-포함 겔, 다중세포체, 또는 조직을 포함한다. 다른 예에서, 바이오-잉크는 추가로 지지 물질을 포함한다.
본 개시내용에 의해 포괄된 바이오-프린트된 신장 구조는 신장 또는 이들의 성분의 하나 이상의 기능성 특성을 가지고 신장 또는 이들의 성분의 하나 이상의 기능성 특성을 전개할 수 있다. 예를 들어, 바이오-프린트된 신장 구조는 사구체, 방사구체 장치, 간질 조직, 집합관, 보우먼 캡슐, 근위 및/또는 원위 극세관을 포함할 수 있다. 일 예에서, 바이오-프린트된 신장 구조는 혈관화되지 않는다. 다른 예에서, 바이오-프린트된 신장 구조는 맥관구조 예컨대 세동맥, 동맥, 정맥 및/또는 모세관을 포함한다.
일 예에서, 바이오프린트된 신장 구조는 이식가능하거나 달리는 입양으로 숙주 내로 이식가능하다.
조성물/키트
일 예에서, 본 개시내용은 스크리닝 적용에 사용하기 위한 키트 또는 검정에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용은 신독성 및/또는 치료적 효능에 대한 후보 화합물을 스크리닝하는데 사용하기 위한 키트 또는 검정을 포괄한다. 일 예에서, 본원에 기재된 신장 오가노이드는 배양에 제공되고, 후보 화합물은 그 다음 신장 오가노이드와 접촉될 수 있고 신독성 및/또는 치료적 효능에 대해 선별된다. 따라서, 일 예에서, 본 개시내용은 스크리닝에 사용될 때 검정을 포괄하고, 상기 검정은 배양에 본원에 개시된 신장 오가노이드를 포함한다. 일 예에서, 검정은 신독성 스크리닝을 위해 사용된다. 일 예에서, 검정은 치료적 효능 스크리닝을 위해 사용된다. 일 예에서, 신장 오가노이드에는 배양에서 신장 오가노이드를 유지하기 위해 배양 배지 또는 다른 성분이 제공된다. 일 예에서, 신장 오가노이드에는 본 개시내용의 방법을 수행하기 위한 지침서가 제공된다. 일 예에서, 검정은 본원에 기재된 신장 오가노이드를 포함한다. 다른 예에서, 검정은 1 초과의 신장 오가노이드를 포함한다. 예를 들어, 검정은 10, 20, 30 또는 그 초과의 신장 오가노이드를 포함할 수 있다. 신장 오가노이드는 단일 또는 다중-웰 형식 예컨대 96 웰 플레이트에 제공될 수 있다.
실시예
실시예 1 - hPSC의 배양 및 유지
인간 ES 세포(H9 세포)는 10% KOSR(Life technologies) 및 bFGF가 보충된 DMEM 배지 내 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 공급기 상에서 성장되었다. 세포는 TrypLE(Life technologies)를 사용하여 분할 전 80% 밀집도로 배양되었다. 분화 전, ES 세포는 MEF 조건적 배지 및 bFGF에서 MEF 공급기의 부재에서 매트리겔(Corning) 표면에 적응되었다.
인간 iPS 세포는 E8 배지(Life technologies)에서 겔트렉스(Life technologies) 코팅된 플레이트 상에서 개별 콜로니로서 성장되었다. 세포가 60-70% 밀집도에 도달된 경우 또는 3일마다 EDTA로 iPS 세포의 계대가 1회 수행되었다.
단일 세포로 hPSC의 해리는 TrypLE를 사용하여 달성되었고 세포는 15,000 세포/cm2으로 도말된 코팅된 매트리겔 상에 씨딩되었다. 세포 수는 혈구계산기를 사용하여 결정되었다. 매트리겔 적응된 hES 세포는 MEF 조건적 배지를 사용하여 씨딩되었다. 인간 iPS 세포는 밤새 매트리겔 코팅된 플레이트 상에 레비타 세포(1:100 희석)를 사용하여 E8 배지에 단일 세포로 씨딩되었다.
실시예 2 - 개선된 IM의 생산
hPSC 또는 hES는 3.5% 단백질 유리 하이브리도마 배지 (PFHM) (Thermo Fischer), APEL (Stem cell technologies) 또는 E6 배지 (Stem cell technologies)를 갖는 APEL2 또는 TeSR-E6 배지 (Stem cell technologies) 배지에서 처음 4일 동안 세포를 고농도의 CHIR(7 μΜ)에 노출함에 의해 중간 중배엽으로 분화되었다. 배지는 2일째에 신선하게 되었다. 배양물은 FGF9 및 헤파린에 부가하여 저농도의 CHIR(1 μΜ)에 추가의 3일(씨딩으로부터 5 내지 7일째)을 거쳤다(도 1 A, 실시예 1-3). 이것은 중간 중배엽(IM) 세포의 혼합물의 유도를 초래한다.
D7+0에서 스월링하는 현탁 배양물 상에서 qPCR에 의해 수행된 유전자 발현 프로파일은 CHIR의 저농도 및 더 긴 기간 노출의 부가는 더 짧은 노출에 비교하여 캡 간충직 세포에서 증가를 초래했다는 것을 나타냈다(도 1e 좌측 패널). PAX2, LHX1 및 OSR1 세포의 발현은 짧은 CHIR 노출 군에 비교하여 2배 초과로 더 높았다(도 IE 좌측 패널). 저농도의 CHIR에 세포의 노출은 또한 짧은 CHIR 노출 군에 비교하여 Wnt11 및 GATA3의 발현에서 2배수 초과 증가에 의해 예시된 요관 상피에서의 증가를 초래했다(도 1e 우측 패널). 더 긴 기간 동안 Wnt/β-카테닌 신호전달을 활성화하기 위해 저농도의 CHIR의 첨가는 개선된 중간 중배엽을 생성하는 방법을 입증한다.
실시예 3 - 현탁 배양물 스월링
7일째에, 실시예 2에서의 방법을 사용하여 생산된 IM 세포는 1 mL의 EDTA 용액을 사용하여 해리되고, 37℃에서 3분 동안 1 ml EDTA에서 추가로 인큐베이되고 EDTA 용액은 IM 세포 층을 방해하지 않으면서 흡인에 의해 제거되었다(도 1a). IM 세포는 또한 37℃에서 3분 동안 1.5 mL의 TrypLE™ select를 사용하여 해리될 수 있고 과잉 TrypLETM은 15ml 팔콘 튜브에서 1500 RPM에서 원심분리에 의해 제거되었다.
단계 1 배지(기본 배지, FGF9 200 ng/ml, 헤파린 1 μg/ml, 1 μΜ CHIR, 0.1% PVA, 0.1% MC)(2ml)가 10 μΜ Rho 키나제 억제제(ROCKi, 1:1000 희석 10μΜ, Stem cell technologies)와 함께 첨가되었고 세포는 Gilson 피펫을 사용하여 덩어리로서 부드럽게 탈착되었다. 세포 현탁액은 6 cm2 낮은 접착 접시(Greiner bio)로 이전되었고 40 μm 셀 스트레이너(BD biosciences)를 통해 통과되었다.
단계 1 배지는 최대 5 ml로 토핑되었고 접시는 37℃ 및 5% CO2에서 표준 세포 배양 인큐베이터 내에서 60 rpm에서 Ratek 회전식 진탕기에서 스월링되었다. 회전식 진탕기 상에 배양 접시를 24시간에 배치한 후 20 내지 40 μm 직경의 오가노이드가 자발적으로 형성되었다. 단계 1 배지는 스월러에서 배양 24시간 후 단계 2 배지(기본 배지, FGF9 200 ng/ml, 헤파린 1 μg/ml, 1 μΜ CHIR, 0.1% PVA, 0.1% MC)로 대체되었다. 세포는 또 다른 4일 동안 단계 2 배지에서 배양되었다. 일 7+5 이후로부터, 모든 오가노이드는 격일마다 단계 3 배지(기본 배지, 0.1% PVA, 0.1% MC)로 신선하게 되었고 일 7+18까지 배양되었다.
응집-후 18일(일 7+18) 후, 각각의 신장 오가노이드는 명-시야, 주기적 산 Schiff(PAS) 염색 및 공초점 현미경적 분석에 의해 확인된 바와 같이 관형 상피 구조를 나타내어 6-10개 네프론의 존재를 확인하였다(도 1 및 도 2). 이들 네프론은 초기 패턴화 및 분절화의 증거를 보여주었다. 사구체의 형성은 NPHS1 및 MAFB에 대한 양성 염색으로부터 분명하였다. 근위 네프론 분절은 EpCAM+였고 LTL, CUBN, LRP2 및 HNF4A에 대해 양성 염색되었다(도 1g). LTL+ 분절은 배양 배지의 첨가의 24시간 이내에 FITC-알부민을 세포안으로 끌어들일 수 있어, 기능성 알부민 흡수 경로를 나타낸다. 원위 네프론 분절은 ECAD 및 EpCAM으로 염색되었고 반면 추정 집합관은 ECAD+/GATA3+으로 염색되었다. 내피세포(PECAM1+/SOX17+)의 존재는 또한 신장 오가노이드가 SOX17mCherry 리포터 세포주 (Ng et al., 2016)를 사용하여 생성될 때 인지되었다(도 1d; 도 2c, d 및 e). 인간 만능 줄기 세포주 사이의 프로토콜의 전달성의 표지로서, hESC 리포터 라인 (H9 GAPTrapLuc2, hES3-SOX17mCherry) (Kao et al., 2016; Ng et al., 2016; van den Berg et al., 2018) 및 인간 iPSC(CRL1502.C32, CRL1502.3) (Briggs et al., 2013; Takasato et al., 2015)를 포함한, 4개 상이한 세포주로부터 신장 오가노이드의 성공적인 생성에 대한 데이터가 제공된다. 모든 hPSC 라인은 프로토콜에 균일하게 반응하였고 신장 오가노이드에 유사하게 패턴화되었다(도 2b).
실시예 4 - 신장 오가노이드 패턴화에 대한 정식 Wnt 신호전달의 기간, 농도 및 타이밍의 효과
신장 오가노이드 프로토콜 내에서 분화를 최적화하기 위해, hPSC의 단일층이 낮은 CHIR 및 FGF9 + 헤파린의 존재에서 7일차까지 계속된 배양 전에 다양한 기간(3, 4, 5 및 6일) 동안 고정된 농도의 CHIR99021(7 μΜ)을 사용하여 자극되었다(도 2c, 2d 및 2e). 18일 후, 수득한 신장 오가노이드는 공초점 현미경검사를 사용하여 신장 구조에 대해 평가되었다(도 2c, 2d 및 2e). 단지 3일 동안 정식 Wnt 활성화는 신장 형태를 생성하는데 실패하였다(도 2b, 좌측 패널). 대신에, 존재하는 상피 구조는 큰 낭포 내강을 갖고 네프론 형성의 증거가 없는 미정의된 상피를 나타냈다. 7 μΜ CHIR99021의 4 또는 5일로 초기 유도는 각각 내피 및 간질성 기질세포를 시사하는 주위 SOX17+ 및 MEIS1/2/3+ 모집단의 존재를 포함하는, 패턴화 네프론을 함유하는 신장 오가노이드를 생성했다(도 2e, 2d 및 2e, 중간 패널). 그러나, 더 큰 PHS1 염색을 갖는 더 큰 신장 오가노이드를 생성하면서 6일 동안 Wnt 활성화는 상피 구조를 명백하게 손상하는 팽창된 MEIS1+ 기질 모집단을 함유했다(도 2c, 2d 및 2e, 우측 패널;). 초기 7 μΜ CHIR99021 유도의 4일은 최적인 것으로 확인되었고 추가 연구에 사용되었다.
실시예 5 - 신장 오가노이드의 해리
신장 오가노이드는 직경이 대략 250-300 μm인 이종 상피 구조를 나타낸다. 가혹한 효소의 사용은 세포 표면 마커를 파괴하여 추후의 사용을 위한 세포 동일성의 손실로 이어질 수 있다. 차가운 활성 프로테아제(LiberaseTM, Roche)로 온건한 해리가 수행되어 최대 생존가능한 단일 세포를 생성하였다. 신장 오가노이드는 5ml 혈청학적 피펫을 사용하여 15ml 팔콘 튜브로 이전되고 침전되도록 하였다. 배지 상청액은 진공을 사용하여 제거되었고, 그 다음 오가노이드 펠릿은 0.1M PBS를 사용하여 3회 세정되었다. 오가노이드는 그 다음 500 μl의 1μg/ml 용액의 Liberase™으로 처리되고 5분 마다 분쇄를 계속하면서 20분 동안 4℃에서 인큐베이션되었다. 20분 후 신장 오가노이드는 단일 세포로 해리되었고, 10% FCS를 갖는 DMEM 배지를 사용하여 2회 세정되어 Liberase™을 불활성화시키고 최종 세포 펠릿은 10% FCS를 갖는 DMEM 배지에 현탁되었다.
실시예 6 - 중간 중배엽 세포를 스월링하는 것은 현탁 배양에서 마이크로 신장 오가노이드를 생성한다
신장 오가노이드를 생성하기 위한 존재하는 방법은 노동 집약적이고 비싸며 품질이 낮은 오가노이드를 생성한다. 본 발명자들은 현탁 배양에서 신장 오가노이드를 생성하는 경제적이고 간단하며 빠른 방법을 만들었다. 이전의 방법과 대조적으로, 세포 응집체는 낮은 부착 배양 플레이트에서 배양하기 전에 단일층의 최소 해리 및 저속 스월링의 결과로서 분화의 중간 중배엽(IM) 단계(7일째)에서 형성된다. 이것은 이전의 방법을 사용하여 생성된 것보다 훨씬 작은 8,000 - 10,000개의 신장 오가노이드의 형성을 초래한다. 현탁 배양에서 18일 후, 각각의 신장 오가노이드는 근위 및 원위 상피 및 사구체 함유 발세포의 형성을 포함하여, 초기 패턴화 및 분절화의 증거를 갖는 대략 6 - 10개의 네프론을 포함한다. 중요하게는, 단일 세포 전사 프로파일링은 이들 더 작은 오가노이드와 세포 다양성 및 성숙도와 관련하여 이전의 방법을 사용하여 생성된 표준 오가노이드 사이의 동등성을 밝혀냈다. 지향된 분화를 위해 이 접근법을 사용하는 것은 배양의 21일에 걸쳐 30 - 40배의 세포 확장을 초래하였으며, 이는 이전의 접근법 예컨대 문헌 [Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568]에 기초한 것에 비교하여 백만 오가노이드-유래된 신장 세포당 비용에서 4배수 감소와 수율에서 3 내지 4배 개선을 나타낸다.
도 1a에 예시되고 실시예 1-3에 기재된 개시된 방법은 3D 구형 오가노이드로 자발적으로 응집하도록 중간 중배엽(IM) 세포의 응집력을 향상시키기 위해 스월러 배양의 배양 배지에 0.1% 폴리 비닐 알코올(PVA) 및 0.1% 메틸 셀룰로스(MC)의 첨가를 포함한다. 스월링 배양에서 24시간 후, 오가노이드는 외부 라미닌 기저막을 형성했다.
추가의 12 내지 18일 동안 배양된 C32 오가노이드가 수집되었고, 공초점 현미경적 분석을 위해 전체 실장되고 NPHS, LTL, ECAD 및 GATA3에 대해 염색되었다. 맥관구조의 존재를 평가하기 위해 오가노이드는 마우스 항 인간-CD31(1:300, BD biosciences)로 염색되었고, 성숙한 근위 세관에 대해 염소 항 인간-CUBN이 사용되었다. D7+12에서 오가노이드의 면역형광 염색 분석은 네프린 양성 사구체, LTL 양성 근위 세관, ECAD 양성 원위 소관 및 GATA3 양성 기질 세포를 포함한 ECAD와 GATA3 이중 양성 집합관 세포의 뚜렷한 발현의 형태에서 주요 네프론 분절화를 나타냈고(도 1g 및 4e 및 f) 이것은 트랜스웰 오가노이드 시스템에 비교할만하였다(도 4a). 스월러 마이크로 신장 오가노이드는 네프론의 수(각각의 오가노이드에서 5 내지 10개 네프론) 및 비-신장 세포 유형의 존재와 관련하여 트랜스웰 오가노이드에 비교하여 간단한 형태를 나타냈다.
이와 함께, 결과는 조직화된 오가노이드를 생성하고 모든 네프론 분절을 갖는 복합 다중세포 신장 오가노이드를 생성하는 능력을 갖는 스월링하는 현탁액 방법을 입증한다. 본 방법은 인간 ES뿐만 아니라 오가노이드가 생산된 iPS 세포주로 성공적으로 시험되었다. 상이한 기본 배지 조건 예컨대 APEL, APEL 2 및 E6은 개시된 방법에 적합한 것으로 실증되었다. 이와 같이, 본 방법은 개인화된 의료, 약물 스크리닝 및 재생 세포 요법을 위한 신장 세포 배양의 규모 확대에 잠재적으로 유용하다.
실시예 7 - iPS 유래된 신장 세포의 규모 확대에 적합한 현탁 배양에서 마이크로 신장 오가노이드
규모 확대에 대한 현탁 배양을 평가하기 위해, C32 iPS 세포가 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 IM을 생성하도록 분화되었다. D7+0으로부터 배양물에서 세포의 크기 및 총수를 측정함에 의해 오가노이드의 성장이 모니터링되었다(도 4c 및 4d).
스월러 현탁 배양을 사용하여 생성된 C32 오가노이드의 명시야 이미지는 크기 증가 및 유지된 상피 구조를 나타냈다(도 4a 및 4b). 오가노이드 크기는 NIS-Elements 현미경검사 소프트웨어(Nikon) 상에 최대 10개의 무작위로 샘플링된 오가노이드의 명-시야 이미지에서 측정되었다. 최대 10개 오가노이드의 랜덤 샘플이 상이한 성장률 간격으로 취하여 졌고 오가노이드의 직경이 측정되었다. 크기는 낮은 범위에서 높은 범위로 보고되었다. 시간이 경과함에 따른 오가노이드 크기에서의 일관된 증가가 검출된 직경에서 30 μm에서 300 μm의 오가노이드로 관측되었다(도 4c). 총 세포 수는 TrypLE™ select로 해리 후 평가되었고 혈구계산기를 사용하여 수작업으로 카운트되었다. D7+0에서 씨딩 밀도에 비교하여 D7+12에서 D7+18까지 세포 수에서 40배수 증가가 관측되었다(도 4d).
실시예 8 - 현탁 배양에서 마이크로 신장 오가노이드는 조직화된 네프론 분절 및 명확한 관형 내강을 나타낸다
고전적 트랜스웰 오가노이드는 개별 네프론의 3D 구조를 연구하는 능력을 제한하는 복잡한 형태를 나타낸다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 스월러 마이크로 신장 오가노이드는 훨씬 단순하고 적은 수의 네프론을 함유한다.
본 오가노이드는 3D 공간에서 네프론의 연구를 허용하는 명확한 3D 형태를 나타낸다. C32 유래된 신장 오가노이드는 실시예 1-3의 기재된 방법을 사용하여 생성되었고, 면역 염색은 NPHS1, LTL, ECAD 및 GATA3에 대한 항체를 사용하여 수행되어 핀홀에 매칭하는 Z 분할인, 고처리량 공초점 현미경에서 네프론 분절을 시각화하였다.
신장 오가노이드는 15ml 플라콘(flacon) 튜브에 수집되었고 PBS로 세정되어(2회) 과잉 배지가 제거되고 20분 동안 4℃에서 새롭게 제조된 2% PFA에 고정되었다. 과잉 PFA가 그 다음 오가노이드를 0.3% TritonX100을 갖는 PBS(PBST)로 3회 세정함에 의해 제거되고 염색할 때까지 4℃에서 PBST에 보관되었다. 고정된 오가노이드는 PBST에서 10% 당나귀 혈청(차단 완충액)으로 적어도 1시간 동안 차단되었고 그 후 차단 완충액에서 희석된 일차 항체로 인큐베이션되었다. 신장 오가노이드의 분화 능력의 평가는 주요 네프론 분절에 대한 염색에 의해 확인되었고, 사용된 일차 항체는 다음과 같다: 양 항 인간- PHS1(1:300 R&D Systems), 바이오틴 항 인간-LTL (1:300 Vector laboratories), 마우스 항 인간-ECAD (1:300 Life technologies) 및 토끼 항 인간-GATA3 (1:300 Cell signalling technologies) 마우스 항 인간-CD31 (1:300, BD biosciences) 및 염소 항 인간-CUBN (1:300 Santa Cruz) 및 LRP2 (1:300 Sapphire Bioscience). 오가노이드는 4℃에서 어버닝하기 위해 일차 항체에서 인큐베이션되었고, 그 다음 PBST에서 5회 세정되고, 그리고 그 다음 형광 라벨을 갖는 종-매칭된 이차 항체로 인큐베이션되었다. 염색 후, 오가노이드는 상이한 농도의 메탄올을 사용하여 탈수되고 이어서 문헌 [Dodt HU et al (Dodt et al., 2007)]에 의해 이전에 기재된 바와 같이 BABB(벤질 알코올 및 벤질 벤조에이트, 1:2 비)를 사용하여 깨끗하게 되었다. 깨끗하게 된 오가노이드는 MatTek 유리 최하부 접시 상에 실장되었고 역전된 Zeiss LSM 780 현미경을 사용하여 공초점 현미경검사가 수행되었다. ZEN 소프트웨어(Zeiss)를 사용하여 이미지가 분석되었다.
획득된 공초점 이미지의 3D 렌더링을 재구성하기 위해 Imaris 소프트웨어를 사용하여 이미지가 분석되었다(도 4E 및 4F). 3D 이미지는 사구체 (NPHS1), 근위 세관 (LTL+), 원위 소관 (ECAD+), 집합관 (ECAD+, GATA3+) 및 간질성 세포 (GATA3+)로부터 시작하는 분극된 방식으로 서로에 대해서 연결된 깨끗한 네프론 분절을 나타냈다(도 5E). 스니핑 도구의 사용은 관형 세포에 형성된 내강의 가시화를 허용했다(도 5F). 도 5E 및 5F의 결과는 본원에 기재된 스월러 방법이 3D 공간에서 신장 오가노이드를 전개시키는 형태의 연구를 허용하는데 유용하다는 것을 입증한다.
실시예 9 - 단일 세포 RNA 서열화 분석은 유망한 신장 표현형을 나타낸다
스월러 신장 오가노이드를 더욱 광범위하게 특성화하기 위해, D7+18에서 C32 유래된 마이크로 신장 오가노이드의 단일 세포 RNA 서열화 분석이 수행되었다. 대략 40-50개 마이크로 신장 오가노이드 및 1 하나의 전체 표준 오가노이드가 동일한 hPSC 라인(APEL 배지에서 CRL1502.C32)을 사용하여 7+18일째까지 배양되었다. 오가노이드는 수집되고 과잉 배지를 제거하기 위해 PBS로 3회 세정되었다. 오가노이드는 5분 마다 1ml 피펫을 사용하여 진탕함에 의해 20분 동안 4℃에서에서 400 μl의 1 μg/ml 용액의 Liberase™(Roche)로 처리되었다. 20분 이내에 오가노이드는 단일 세포로 해리되었다. 세포 배양 배지(2 ml)가 불활성 Liberase™에 첨가되었다. 세포는 펠릿을 형성하기 위해 3-5분 동안 1300-1500 rpm에서 원심분리되었다. 상청액은 제거되고, 펠릿은 신선한 DMEM F12 배지에서 재현탁되고 그리고 20 μm 셀 스트레이너를 통해 통과되어 덩어리가 제거되고 분석시까지 얼음 상에 보관되었다. 생존력 및 세포 수는 자동화 세포 계수기(life technologies)에서 FACS 및 트립판 청색 염료 배제 테스트에 의해 분석되었다. 세포는 분석시까지 얼음 상에 보관되었다. 세포는 넓은 구멍 1 ml 피펫 팁을 사용하여 철저하게 혼합되었고 대략 4000개 생존 세포가 RNA 서열화 분석에 사용되었다. 10X 게놈 기술에 의해 개발된 크로뮴 단일 세포 3' 용액이 사용되었다. 샘플 준비는 10x 게놈 단일 세포 프로토콜에 따라 수행되었다(추가 정보는 온라인 접근가능한 Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide에서 이용가능함). 단일 세포 현탁액, 겔 비드 및 분배 오일이 10x 크로뮴 칩의 적절한 웰 안으로 장입될 것이다. 칩은 10x 가스킷으로 고정될 것이고 완전한 어셈블리가 10x 크로뮴 컨트롤러 안으로 장입될 것이다. 이것은 각각의 세포에 대해 독특한 UMI를 함유하는 오일 액적에 코팅된 단일 세포의 현탁액을 자동으로 생성할 것이다. 이 현탁액은 전사체를 증폭하기 위해 통상적인 RT-PCT에 대해 취해질 것이다.
세포는 나노 나노리터-척도 겔 비드-인-에멀젼(GEM) 및 UMI를 사용하여 각각의 세포의 전사체를 별도로 색인하도록 바코딩되었다. 바코딩 후 잔존물 시약 및 프라이머를 제거하기 위해 자기 비드가 사용되었다. 라이브러리 구축에 충분한 질량을 생성하기 위해 전사체를 PCR 증폭하도록 전장 바코딩된 cDNA가 사용되었다. 이들 라이브러리는 2개 상이한 판독에서 UMI 및 cDNA 단편에 대해 동시에 서열분석되었다. 라이브러리 분석은 단일 세포 해상도에서 발현 데이터의 연구를 가능하게 하는 셀 레인저(Cell Ranger)™을 사용하여 수행되었다. 셀 레인저 파이프라인 (v1.3.1)이 사용되어 샘플 역다중화(demultiplexing), 바코드 가공 및 단일-세포 유전자 계수를 수행하였다(Zheng et al., 2017). 샘플은 역다중화되어 각각의 샘플에 대한 한 쌍의 FASTQ 파일을 생성했다. 서열 정보를 함유하는 판독은 GRCh38 참조 게놈에 대해 정렬되었다. 세포 바코드는 여과되어 비어있는 액적을 제거하고 PCR 복제물은 추가 분석을 위해 사용되었던 유전자 발현 매트릭스인 최종 결과로 세포 바코드, UMI 및 유전자 ID의 독특한 조합을 선정함에 의해 제거되었고, 이것은 단일 세포 해상도에서 발현 데이터의 연구를 가능하게 한다. 쇠라 R 패키지(버전 2.3.1)를 사용하여 세포 클러스터링, 세포 유형 분류, 및 차별적인 유전자 발현을 나타내도록 추가 분석이 수행되었다.
셀 레인저에서 생성된 유전자 발현 매트릭스는 품질관리 및 추가로 분석을 위해 쇠라 안으로 도입되었다(Satija et al., 2015). 모든 세포는 초기 필터링을 통과하여 3개 미만의 세포로 발현된 유전자, 및 발현된 200개 미만의 유전자를 갖는 세포를 제거했다. 추가의 필터링은 15% 초과의 미토콘드리아 전사체를 갖는 1개 세포를 제거했다. Sscran에서의 사이클론 기능(Lun et al., 2016; Scialdone et al., 2015)은 각각의 세포가 G1, S 또는 G2M 단계 중 어느 하나에 있을 가능성에 관련된 점수 및 이 점수에 기초하여 배정된 세포 주기 단계를 할당하기 위해 사용되었다.
발현 데이터는 UMI의 수, 미토콘드리아 발현 백분율, 리보솜 발현 백분율 및 쇠라 ScaleData 함수를 사용하여 회귀된 G2M 점수에 관련된 가변성으로 정상화되고 확장되었다. 세포는 처음 15개 주성분 및 1.2의 분할 값을 사용하여 쇠라에서 시행된 공유된 최근접한 이웃 모듈식 최적화 기초 클러스터링 알고리즘을 사용하여 클러스터링되었다. 마커 유전자 목록은 쇠라 FindAllMarkers 함수를 사용하여 생성되어 0.25 이상의 로그 배수 변화로 클러스터 간에 차등적으로 발현된 유전자를 검색하였다.
표준 및 신장 오가노이드 데이터세트의 조합된 분석을 위해 유전자-세포 매트릭스가 상기와 같이 셀 레인저에서 생성되었다. 모든 세포는 3개 미만의 세포에서 발현된 유전자 및 200개 미만의 유전자를 갖는 세포에 대해 초기 필터링을 통과하였다. 각각의 데이터세트는 다수의 UMI, 백분율 미토콘드리아 발현, 백분율 리보솜 발현 및 S, G1 및 Scran에서 생성된 G2M 점수에 대한 회귀로 정상화되고 확장되었다. 클러스터링은 RunCCA 및 AlignSubspace 함수를 사용하여 쇠라에서 계산된 정렬된 조합된 성분에 기초하였다(Butler et al., 2018). 조합된 데이터세트에 대해 클러스터링은 0.6의 해상도로 수행되었다(Butler et al., 2018).
본원에 기재된 방법 및 고전적 트랜스웰 방법에 의해 생산된 오가노이드의 단일 세포 RNA 유전자 발현 프로파일링이 분석되었다. UMI 계수는 tS E 플롯으로 플롯팅되었고 자동 클러스터링이 세포 내에 존재하는 유전자에 기초하여 수행되었다(도 6a-6b). 모든 클러스터의 GO 강화 분석은 22.3% 네프론, 37.5% 총 기질 및 9.8% 맥관구조를 나타냈고(도 6a), 반면에 스월러 마이크로 신장 오가노이드는 32.5% 성숙한 네프론(캡 간충직 및 네프론 전구체 배제), 25.9% 기질을 나타냈지만, 그러나 스월러 C32 오가노이드는 맥관구조의 존재를 나타내지 않았다(도 6b). 따라서, 스월러 마이크로 신장 오가노이드는 트랜스웰 오가노이드에 비교하여 신장 발생의 보다 양호한 마커를 나타냈다. 마이크로-신장 오가노이드는 또한 트랜스웰 배양된 오가노이드에 비교하여 향상된 네프론 조성을 나타냈다(도 4).
실시예 10 - 신장 오가노이드 내 전사적 신장 분화의 검증
신장 오가노이드 내에 존재하는 세포 유형의 특징화가 단일 세포 RNA-서열분석을 사용하여 수행되었다(scRNA-seq). 20-30개 신장 오가노이드의 풀이 차가운 활성 프로테아제 Liberase™를 사용하여 생존가능한 단일 세포로 해리되었다. 이것은 그 중 88.5% 세포가 살아 있는 89.4% 단일 세포의 생성을 초래했다(데이터 도시되지 않음). 세포당 UMI 계수의 매트릭스를 생성하기 위해 셀 레인저(10x 게놈)가 사용되었으며 이것은 쇠라 R 패키지(버전 2.3.1)를 사용한 추가의 분석으로 도입되었다(Satija et al., 2015). 여과된 데이터는 세포당 3759개의 표현된 유전자의 중앙을 갖는 1673개의 세포를 제시했다. 쇠라 R 패키지를 사용한 클러스터링은 0.6 해상도에서 7개의 뚜렷한 세포 클러스터를 생산했다(도 3a 및 3b, 표 1). 각각의 클러스터의 마커를 식별하기 위해 차별적인 발현 시험이 수행되었고 각각의 클러스터에서 최상부의 상당히 상향조절된 유전자에 대한 유전자 온톨로지 및 기능성 강화 분석이 PANTHER 유전자 온톨로지 스위트를 사용하여 수행되었다(Mi et al., 2013; 표 1).
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전체의 장착 오가노이드의 면역형광을 사용하여 분명히 명백하지만, 내피(클러스터 1의 서브셋) 및 발세포(클러스터 6, 18 세포)에는 scRNA-seq 데이터에서 작은 수의 개별 세포만이 제시되었다. 클러스터 3(293 세포) 및 클러스터 5(122 세포)는 신장 소포/ S-형상화된 바디 유전자(초기 네프론)의 발현을 나타내는 클러스터 0을 갖는 신장 네프론 상피와 일치하는 유전자의 발현을 나타냈고 반면 상피 세포 클러스터 5는 또한 원위 소관/ 집합관 마커 예컨대 GFRA1의 발현을 나타냈다(도 3c). 클러스터 2는 네프론 전구체 마커 SIX1, SIX2 및 CITED1뿐만 아니라 이전에 근육생성 윌름스 종양과 연관된 기질 마커 PAX3의 발현을 나타냈다(Hueber et al., 2009). 클러스터 2에서의 세포는 또한 PAX7, MYOD1 및 TBX6이 아닌 근육생성 운명의 마커 예컨대 MYF5 및 MYF6을 발현한다. 최대 클러스터를 나타내는 클러스터 0(430개 세포)은, 인간 NP 마커 LYPD1 내지 ADAPL1뿐만 아니라 초기 신장 소포 마커 PAX2, PAX8, LHX1 및 JAG1의 발현으로 보다 더 관여된 네프론 전구체 특성을 나타냈다(Lindstrom et al., 2018). 클러스터 1(337개 세포)은 PDGFRB 및 MEIS2와 같은 기질 특성을 나타냈다. 클러스터 4는 초기 네프론 마커 카드헤린 CDH6을 발현하면서 신장 오가노이드에서 이전에 보고된 바와 같이, 신경 오프타겟 모집단(neural off target population)의 존재를 시사하는 신경 전사 특성을 나타냈다(Wu et al., 2017). 이 분석은 면역형광의 수준에서 신장 오가노이드 내에서 관측된 세포 유형의 동일성을 강력하게 지지했다.
실시예 11 - 표준 및 신장 오가노이드의 비교적인 단일 세포 전사 프로파일링은 신원발성 패턴화의 동등성을 입증한다.
신장 오가노이드 내의 세포 성분을 또 다른 신장 오가노이드 방법에 직접적으로 비교하기 위해, 신장 오가노이드 scRNA-seq 데이터가 동일한 iPSC 세포주(CRL1502.C32) 및 문헌 [Takasato et al., 2016]의 표준 신장 오가노이드 프로토콜을 사용하여 생성된 1421개 신장 오가노이드 세포로부터의 데이터와 조합되었다. 2개의 데이터세트는 상관된 성분 분석에 이어서 동적 시간 왜곡을 사용하는 쇠라에서 시행된 정렬 알고리즘을 사용하여 조합되었다(Butler et al., 2018). 클러스터링은, 관여된 네프론 전구체(클러스터 0), 네프론 상피(클러스터 6), 발세포(클러스터 7), 기질(클러스터 1 및 3), 내피세포(클러스터 5), PAX3+ve 세포(클러스터 2) 및 신경 오프타겟 모집단(클러스터 4)을 나타내는, 조합된 데이터세트 내의 8개 전사 클러스터를 확인하였다(도 5a 및 도 5b). 각각의 클러스터에 기여한 세포의 비율은 다양하지만, 모든 클러스터는 양 데이터세트에 제시되었다(도 5b-5d). 각각의 클러스터의 주요 마커의 직접적인 비교는 프로토콜 간에 각각의 클러스터에 기여하는 비율에 명백한 차이가 있었지만 (도 5b 및 5c), 양 프로토콜 사이에서 임의의 주어진 클러스터에서 식별된 세포 사이에 강한 전사 합동이 있음을 나타낸다(도 5D). 신장 오가노이드에서 확인된 신경 오프타겟 모집단은 또한 표준 오가노이드에서 분명했다. 전반적으로, 신장 오가노이드 데이터세트는 표준 오가노이드 데이터세트보다 더 높은 비율의 네프론 세포 및 더 낮은 비율의 기질 세포를 함유했다(도 5E). 표준 오가노이드에 비교하여 신장 오가노이드에서 PAX2 발현 네프론 세포에서의 이 증가와 MEIS1/2/3 발현 기질 세포에서의 감소는 전체의 장착 오가노이드의 면역형광 분석을 사용하여 확인되었다(도 5F 및 도 6).
실시예 12 - 신장 오가노이드는 효율적인 hPSC 유래 신장 세포 규모확대에 대해 더 나은 플랫폼을 제공한다
Transwell™ 필터상에 배양된 표준 신장 오가노이드는 생성된 오가노이드 조직의 크기로 인해 배양에서 3주 후에 확산 제한에 직면할 수 있다(도 4a). 이 시간 후 네프론 분절에 대한 면역형광 염색은 오가노이드의 가장자리에 네프론 구조의 공간적 제한을 제안했다. 대조적으로, 신장 오가노이드는 구조 전반에 걸쳐 신장 소관을 함유한다(도 4b). 신장 오가노이드는 또한 표준 오가노이드 프로토콜에 관여된 지루한 수동 처리의 과정을 피하면서, 회전식 진탕기를 사용하여 다수로 동시에 형성될 수 있다. 그 결과, 표준 오가노이드 프로토콜에 대해 60분에 대략 30개 오가노이드에 비교하여 5-10분에 균일한 크기의 대략 8000 내지 10000개 신장 오가노이드를 생성하는 것이 가능하다. 신장 오가노이드는 표준 오가노이드(3000-5000 μm)에 비교하여 훨씬 더 작은 최종 크기(250-300 μm)를 나타낸다(도 4c). 면역형광에 의해 나타난 바와 같이, 표준 오가노이드 내에 형성되는 네프론은 신장 오가노이드와 비교하여 조직의 주변 주위의 림에 존재한다(도 4a). 그러나, 이들 구조는 신장 오가노이드보다 훨씬 더 크다. 각각의 접근법의 효율과 비용을 직접적으로 비교하기 위해, iPSC 및 hESC 리포터 라인을 사용하여 각각 생성된 표준 오가노이드 및 신장 오가노이드가 총 세포 수의 정량화를 위해 7일째부터 분화 프로토콜에 걸쳐 여러 시점에서 단일 세포 현탁액으로 해리되었다(도 4D). 표준 오가노이드는 7+7일째 후 오가노이드 당 총 세포수에서의 실질적인 변화를 나타내지 않았고, 반면에 신장 오가노이드는 7+12째를 넘어 총 세포 수에서 증가를 계속했다. 전반적으로, 세포수는 표준 오가노이드 조건 하에서 8-10배 증가하였으나 신장 오가노이드의 경우는 최대 30-40배 증가하였다. 이것은 이 변형된 프로토콜을 사용하여 세포 수율에서의 3 내지 4배 개선을 나타낸다.
실시예 13 - 모든 트랜스 레틴산의 첨가는 사구체 발세포 성숙을 개선한다
모든 트랜스 레틴산(atRA)의 첨가가 실시예 1-3에 기재된 스월러 배양 방법에 의해 생산된 오가노이드의 사구체 성숙을 촉진할 수 있는지를 결정하기 위해, atRA가 D7+0 후 배지에 보충되었다. 모든 트랜스 레틴산(2.5 μΜ)은 C32 유래된 스월러 오가노이드 상에 D7+5부터 D7+10까지 첨가되었다(도 5). D7+18 후 면역형광 분석은 atRA의 첨가가 대조군과 비교하여 발세포 표현형을 개선시켰다는 것을 나타냈다(도 7a 및 7b). 결과는 D7+11 및 D7+18 샘플의 qPCR 분석인, mRNA 발현에 의해 확인되었으며, 이것은 2.5 μM atRA의 첨가가 대조군과 비교하여 PHS1과 같은 사구체 마커 및 CUBN 같은 근위 관형 마커의 발현을 증가시켰음을 보여주었다(도 7c).
실시예 14 - 마이크로 신장 오가노이드에서 약물 독성 시험
시험관내 신장의 약물 독성에 대해 시험하기 위해 본원에 기재된 현탁 배양 방법을 사용하는 적합성을 평가하기 위해, 약물 독성 연구가 수행되었다. 7+18일째에서 본 방법에 의해 생산된 오가노이드가 수집되고 250 μl의 배지에 24 웰 낮은 부착 플레이트에서의 처리 그룹으로 무작위화되었다. 오가노이드는 24시간 동안 상이한 농도의 세포독성 약물 아드리아마이신(0, 2.5 및 5 μg/ml)으로 자극되었다. 자극 후, 배지가 제거되고 오가노이드는 TU EL 염색을 사용함 의한 세포자멸사에 대해 면역형광 염색 분석을 위하여 2% PFA로 고정되었고 일부 오가노이드는 RNA 분석을 위해 용해되었다(도 8a-8d).
실시예 15 - 신장 오가노이드 생성에서 개선의 요약
상기 예시된 방법으로부터 유래된 신장 오가노이드는 단일 세포 전사 수준에서 이전에 기재된 신장 오가노이드 프로토콜(Takasato et al., 2016; Takasato et al., 2015) 내에 존재하는 것과 동등한 신장 네프론 상피, 기질 및 내피세포 성분의 신뢰할 수 있는 형성을 나타낸다. 그러나, 배양 조건에서의 변경은 생성된 백만개 신장 세포당 4배 낮은 비용으로 상대적 세포 수율에서 3-4배 개선을 초래했다. 예시된 방법의 강건성은, hES3 SOX17mCherry, H9 GAPTrap Luc2 및 iPSC GAPTrap td-Tomato 형광 리포터 라인을 포함한, 2개의 상이한 hESC(H9 및 hES3) 및 3개의 상이한 iPSC 라인(iPSC GAPTrap td-Tomato, CRL1502.C32 및 CLR1502.3)을 사용하여 성공적인 신장 오가노이드 생성을 재현하는 능력에 의해 입증된다.
수많은 변형 및/또는 수정이 광범위하게 기술된 바와 같이 본 개시내용의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 특정 구현예에 나타낸 바와 같이 본 개시내용에 대해 이루어 질 수 있음이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 것이다. 본 구현예는, 따라서, 모든 관점에서 예시적이고 비제한적인 것으로 간주되어야 한다.
본원은 2017년 10월 31일에 출원된 AU 제2017904424호의 우선권을 주장하며, 그것의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
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참고문헌
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Claims (58)

  1. 50개 미만의 네프론을 포함하는 신장 오가노이드.
  2. 제1항에 있어서, 25개 미만의 네프론을 포함하는, 신장 오가노이드.
  3. 제1항에 있어서, 15개 미만의 네프론을 포함하는, 신장 오가노이드.
  4. 제1항에 있어서, 5 내지 12개의 네프론을 포함하는, 신장 오가노이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11, GATA3, PAX8, EYA1 및 CITED1 중 임의의 하나 이상의 높은 수준 및/또는 PDGFRA, MEIS2, WT1 및/또는 C-RET 중 임의의 하나 이상의 낮은 수준을 발현하는 세포를 포함하는, 신장 오가노이드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 높은 수준의 PAX2, SIX1, LHX1, OSR1, WNT11 및 GATA3을 발현하는 세포를 포함하는, 신장 오가노이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, NPHS+ 발세포(podocyte), LTL+ 근위 분절, ECAD+ 원위 분절, ECAD+/GATA3+ 집합관 또는 이들의 조합을 포함하는, 신장 오가노이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오가노이드는 H9, hES3, iPSC GAPTrap td-Tomato, CRL1502.C32, CLR1502.3, hES3 SOX17mCherry 또는 H9 GAPTrap Luc2로 구성된 군으로부터 선택된 줄기 세포로부터 유래된, 신장 오가노이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 x 104 내지 5 x 104 세포를 포함하는, 신장 오가노이드.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1.5 x 104 내지 2.5 x 104 세포를 포함하는, 신장 오가노이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 250 내지 500 μm의 직경을 갖는, 신장 오가노이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 적어도 3주 동안 스월러(swirler) 배양에서 생존가능하게 남아 있는, 신장 오가노이드.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 적어도 4주 동안 배양에서 생존가능하게 남아 있는, 신장 오가노이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오가노이드 네프론은 집합관(GATA3+; ECAD+), 초기 원위 요세관(GATA3-; LTL-; ECAD+), 초기 근위 요세관(LTL+; ECAD-) 및 사구체(WT1+)를 포함하는, 신장 오가노이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오가노이드는 신장 오가노이드 발달을 촉진하기에 충분한 조건하에서 세포 배양 배지에서 중간 중배엽(IM) 세포의 모집단을 스월링(swirling)시킴에 의해 생산된, 신장 오가노이드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 200 ng/ml FGF9를 포함하는, 신장 오가노이드.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 0.5 x 106 내지 1.5 x 106 IM 세포/ml를 스월링시킴에 의해 생산된, 신장 오가노이드.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 0.8 x 106 내지 1.2 x 106 IM 세포/ml를 스월링시킴에 의해 생산된, 신장 오가노이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 신장 오가노이드 또는 이들의 효소 소화물을 포함하는 치료적 조성물.
  20. 제19항의 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 신장 질환을 치료하는 방법.
  21. 신장 오가노이드를 생성하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 FGF를 포함하는 세포 배양 배지에서 중간 중배엽(IM: intermediate mesoderm) 세포의 모집단을 스월링하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 IM 세포는 적어도 5일 동안 배지에서 스월링되고, 여기서 처음 24시간은 FGF, 헤파린, CHIR 및 ROCK 억제제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 스월링하는 단계를 포함하고, 다음 4일은 FGF, 헤파린 및 CHIR을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 배양에서 나머지 일은 PVA 및 MC를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 100 내지 300 ng/ml FGF9를 포함하는, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처음 24시간은 FGF, 0.5 내지 1.5 μg/ml 헤파린, 0.5 내지 1.5 μΜ CHIR 및 9 내지 11 μΜ ROCK 억제제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 스월링하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다음 4일은 FGF, 0.5 내지 1.5 μg/ml 헤파린 및 0.5 내지 1.5 μΜ CHIR을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 스월링하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다음 4일은 FGF9, 헤파린, CHIR, MVA 및 PVC를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 0.05 내지 0.2% MVA 및 0.05 내지 0.2% PVC를 포함하는, 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양에서 나머지 일은 FGF, 헤파린 CHIR 또는 ROCK 억제제 없이, 0.05 내지 0.2% PVA 및 0.05 내지 0.2% MC를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IM 세포는 30 내지 90 rpm에서 스월링되는, 방법.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IM 세포는 18 내지 24일 동안 스월링되는, 방법.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IM 세포는 적어도 7일 동안 줄기 세포의 모집단을 배양함에 의해 생성되고, 여기서 처음 4 내지 5일은 적어도 6 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고 배양에서 나머지 일은 FGF 및 적어도 0.5 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 Wnt/β-카테닌 효능제는 CHIR이고, FGF는 FGF9인, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 100 내지 300 ng/ml FGF9를 포함하는, 방법.
  35. 제33항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 0.5 내지 1.5 μΜ CHIR을 포함하는, 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 0.5 내지 1.5 μg/ml 헤파린을 더 포함하는, 방법.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IM 세포는 스월링하기 전에 EDTA 또는 트립신으로 해리되고 메쉬 스크린을 통해 통과되는, 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기(iPS: induced pluripotent stem) 세포인, 방법.
  39. 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 0.5 x 106 IM 세포/ml 내지 1.5 x 106 IM 세포/ml를 포함하는 IM 세포 모집단을 스월링하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 신장 오가노이드.
  41. 신독성에 대한 후보 화합물을 스크리닝하는 방법으로, 상기 방법은 제1항 내지 제18항 또는 제40항 중 어느 한 항에 따른 신장 오가노이드를 후보 화합물이 신장독성인지 아닌지 여부를 결정하기 위해 후보 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 후보 화합물은 소분자인, 방법.
  43. 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생성하기 위해 사용될 때의, 제1항 내지 제18항 또는 제40항 중 어느 한 항에 의해 정의된 신장 오가노이드 또는 제19항에 따른 조성물.
  44. 중간 중배엽(IM) 세포를 생성하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 FGF 및 4 μΜ 미만의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 2 내지 5일 동안 후측 원시선(PPS: posterior primitive streak) 세포의 모집단을 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 중간 중배엽(IM) 세포를 생성하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 적어도 7일 동안 줄기 세포의 모집단을 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 처음 4 내지 5일은 적어도 6 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고 배양에서 나머지 일은 FGF9 및 적어도 0.5 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 FGF를 포함하는 배양 배지는 0.5 내지 3 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 배양 배지는 0.8 내지 1.2 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처음 4일은 적어도 6 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처음 4일은 7 μΜ의 Wnt/β-카테닌 효능제를 포함하는 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 100 내지 300 ng/ml FGF9를 포함하는, 방법.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF를 포함하는 세포 배양 배지는 헤파린을 더 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 0.5 내지 2 μg/ml 헤파린을 포함하는, 방법.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포인, 방법.
  54. 제20항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내로 투여되는, 방법.
  55. 제20항에 있어서, 상기 조성물은 신장 동맥 주입, 신장 실질 주입, 이식(implantation) 또는 피막하 이식(subcapsular transplantation)을 통해 투여되는, 방법.
  56. 하기 단계를 포함하는 신장을 바이오-프린팅하는 방법:
    - 제1항 내지 제18항 또는 제40항 중 어느 한 항에 의해 정의된 오가노이드로부터 바이오잉크를 제조하는 단계;
    - 신장을 바이오-프린팅하는 단계.
  57. 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생성하기 위해 사용될 때의 제1항 내지 제18항 또는 제40항 중 어느 한 항에 의해 정의된 신장 오가노이드 또는 제19항에 따른 조성물.
  58. 세포 요법을 위한 네프론 세포 유형을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에서 정의된 방법을 사용하여 신장 오가노이드를 생성하는 단계 또는 제44항 내지 제53항에 의해 정의된 방법을 사용하여 IM 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
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