WO2023007779A1 - 末梢神経損傷の治療のための医薬組成物 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating peripheral nerve injury, containing a substance that inhibits the formation of extracellular neutrophil extracellular traps (NETs) in injured peripheral nerves.
  • the present invention also relates to a method for evaluating the peripheral nerve regeneration-promoting activity of a test substance, using the activity of suppressing the formation of extraparenchymal NETs in injured peripheral nerves as an index.
  • Peripheral nerve regeneration is more vigorous than that of the central nerve, but the clinical results in cases of proximal injury, severe injury, and reconstruction are not good. Muscles tend to lose their sensitivity to reinnervation after 3 to 6 months of denervation, so in the treatment of peripheral nerve injury, axons should be regenerated as early as possible to reach the muscles and be reinnervated. It is important to establish However, considering that the axon regeneration rate is usually about 1 to 2 mm/day, in proximal injury, which generally requires long-distance axon regeneration of about 30 cm to 90 cm, regenerating axons By the time the ions reach the muscle, the sensitivity to reinnervation is lost. Also, in severe injury and reconstruction cases, more axons need to regenerate.
  • peripheral nerve injury to regeneration is as follows.
  • Wallerian degeneration occurs distal to the rupture, resulting in axonal and myelin fragmentation. Fragmented axons and myelin are removed by phagocytosis of Schwann cells and macrophages. Activated Schwann cells then align distal to the rupture and serve as scaffolds for axonal regeneration, promoting axonal sprouting and elongation. Nerve regeneration is then completed by remyelination of axons and re-formation of synapses with target organs.
  • the present invention provides a new means for promoting axonal regeneration that can be used for regenerative treatment of damaged peripheral nerves.
  • Section 1 A pharmaceutical composition for treating peripheral nerve injury, comprising a substance that inhibits the formation of neutrophil extracellular traps (NETs) outside the parenchyma of injured peripheral nerves.
  • Section 2. A substance that suppresses the formation of NETs outside the parenchyma of injured peripheral nerves is a substance that inhibits accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves, a substance that inhibits NETs production by neutrophils, or a substance that degrades NETs.
  • the pharmaceutical composition according to item 1.
  • Item 3 Antibodies and antigen-binding fragments thereof against neutrophils, aptamers against neutrophils, inhibitors against neutrophil migration stimulating factors, and inhibitors of neutrophil migration Item 3.
  • the pharmaceutical composition according to Item 2 which is selected from the group consisting of factors. Section 4. Substances that inhibit the production of NETs by neutrophils suppress the expression or function of macrophage migration inhibitory factor (MIF), and suppress the expression of CXC motif-type chemokine receptor 4 (CXCR4). 3.
  • the pharmaceutical composition according to item 2 which is selected from the group consisting of a substance that suppresses or inhibits the function of peptidylarginine deiminase 4 (PAD4) and a substance that suppresses the expression or inhibits the function of peptidylarginine deiminase 4 (PAD4).
  • Item 4 wherein the substance that suppresses MIF expression or functions is selected from the group consisting of nucleic acids that suppress MIF expression, antibodies against MIF and antigen-binding fragments thereof, aptamers against MIF, and MIF inhibitors.
  • the pharmaceutical composition according to Item 5 which is (2,4-Difluorophenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazolyl]-1-(4-morpholinyl)ethanone).
  • Item 7. Item 4, wherein the substance that suppresses the expression or function of CXCR4 is selected from the group consisting of nucleic acids that suppress the expression of CXCR4, antibodies against CXCR4 and antigen-binding fragments thereof, aptamers against CXCR4, and CXCR4 inhibitors.
  • Item 8 The pharmaceutical composition according to Item 7, wherein the CXCR4 inhibitor is plelixafor.
  • Item 4 wherein the substance that suppresses the expression or function of PAD4 is selected from the group consisting of nucleic acids that suppress the expression of PAD4, antibodies against PAD4 and antigen-binding fragments thereof, aptamers against PAD4, and PAD4 inhibitors.
  • the pharmaceutical composition according to . Item 10. Item 10. The pharmaceutical composition according to Item 9, wherein the PAD4 inhibitor is Cl-amidine.
  • Item 11. Item 3.
  • the pharmaceutical composition according to Item 2, wherein the substance that degrades NETs is DNase I.
  • Item 12. Item 12. The pharmaceutical composition according to any one of Items 1 to 11, which is used by being placed around the distal side of the injured peripheral nerve. Item 13.
  • the activity of suppressing the formation of NETs outside the parenchyma of injured peripheral nerves is the activity of inhibiting accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves, the activity of inhibiting NETs production by neutrophils, or the activity of degrading NETs. 14.
  • the method of paragraph 14 selected from the group consisting of substances.
  • Section 1A A pharmaceutical composition for treating peripheral nerve injury, containing a substance that inhibits the accumulation of neutrophils in damaged peripheral nerves, or a substance that inhibits the expression or function of MIF.
  • Section 2A The substance that inhibits the accumulation of neutrophils in damaged peripheral nerves is selected from the group consisting of antibodies against neutrophils and antigen-binding fragments thereof, inhibitors against neutrophil migration stimulating factors, and neutrophil migration inhibitory factors.
  • Item 1 The pharmaceutical composition according to item 1, which is at least one substance that is Section 3A.
  • the substance that suppresses MIF expression or functions is at least one substance selected from the group consisting of nucleic acids that suppress MIF expression, antibodies against MIF and antigen-binding fragments thereof, and MIF inhibitors.
  • Section 4A If the MIF inhibitor is ISO-1 ((S,R)-3-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid) or ( ⁇ )-CPSI 1306 (2-[3-(3- Item 4.
  • Section 5A Item 5.
  • Section 7A A method for evaluating the peripheral nerve regeneration-promoting activity of a test substance, using the activity of suppressing the expression or the activity of inhibiting the function of MIF as an index.
  • peripheral nerve injury can be realized through promotion of axonal regeneration.
  • Representative HE-stained images of rat sciatic nerve longitudinal sections 12 hours after creation of crush injury The upper row is a low-magnification image, the middle row is a high-magnification image of the region corresponding to the epineurium (area marked with * in the low-magnification image), and the lower row is a high-magnification image of the region corresponding to the nerve parenchyma (area marked with ** in the low-magnification image).
  • Arrows indicate neutrophils.
  • the three images on the left and center are merged images of Ly-6G immunostaining, type I collagen immunostaining, and DAPI staining.
  • the lower center is a high-magnification image of the area corresponding to the nerve parenchyma (inside the lower square frame of the left image).
  • the two images on the right are merged images of Neutrophil elastase (NE) immunostaining and DAPI staining.
  • the upper right is a high-magnification image of the area corresponding to the epineurium, and the lower right is the area corresponding to the nerve parenchyma.
  • FIG. 12 is a graph plotting the number of neutrophils per unit nerve area detected in the rat sciatic nerve 12 hours after the creation of the crush injury versus the distance from the injury site.
  • 1 is a graph showing the number of neutrophils per nerve unit area detected in a rat sciatic nerve after crush injury for each distance from the injury site and elapsed time from injury creation.
  • It is a representative CD68 (macrophage marker) immunostaining image of rat sciatic nerve longitudinal section 7 days after creation of crush injury.
  • the dashed line in the image indicates the demarcation line between the neuroparenchyma and extraneuronal parenchyma (epineurium).
  • 1 is a graph showing the number of macrophages per unit area of nerve parenchyma detected in a rat sciatic nerve after crush injury for each distance from the injury site and elapsed time from injury creation.
  • the dashed line in the image indicates the demarcation line between the neuroparenchyma and extraneuronal parenchyma (epineurium).
  • Rats intraperitoneally administered with anti-neutrophil antibody or control antibody immediately after creation of crush injury (anti-PMN antibody and Ctrl antibody, respectively in the figure), and rats only subjected to crush injury (injury alone ) is a graph showing changes in the blood neutrophil count over time.
  • 5 mm distal to the site of sciatic nerve injury 12 hours after crush injury in rats intraperitoneally administered anti-neutrophil antibody or control antibody immediately after crush injury and in rats only subjected to crush injury Representative HE-stained images of longitudinal sections in .
  • FIG. 10 is a graph showing the number of neutrophils per wound for each distance from the injured site. 12 hours (upper) and 7 days (lower) after crush injury in rats intraperitoneally administered with anti-neutrophil antibody or control antibody immediately after crush injury, and in rats only subjected to crush injury.
  • Fig. 3 is a graph plotting the number of macrophages per unit area of nerve parenchyma detected in the sciatic nerve against the distance from the lesion.
  • the rate of sciatic nerve axonal regeneration 7 days after the crush injury was measured in rats intraperitoneally administered with an anti-neutrophil antibody or control antibody immediately after the crush injury, or in rats that received only the crush injury. It is a graph plotted against the distance from the part.
  • Representative MBPs of sciatic nerve longitudinal sections 7 days after crush injury in rats intraperitoneally administered with anti-neutrophil antibody or control antibody immediately after crush injury and in rats with only crush injury Myelin Basic Protein
  • the bottom row is a high-magnification image of the region corresponding to the epineurium (within the square frame of the corresponding top row image).
  • the dashed line in the image indicates the boundary between the neuroparenchyma and the extraneuronal (epineurium), the area surrounded by the dashed line indicates the neuroparenchyma, and the arrows indicate neutrophils.
  • the number of neutrophils per nerve unit area detected in the sciatic nerve 12 hours after the crush injury in mice that received intravenous administration of neutrophils or PBS and in mice that only received the crush injury was It is a graph represented for each distance from the part.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram of control of axonal regeneration process by neutrophils. Representative immunostaining images of an untreated normal rat sciatic nerve longitudinal section and a rat sciatic nerve longitudinal section 20 mm distal to the injury site 12 hours after creating a crush injury.
  • Each image is an image of CitH3 immunostaining, Ly6G immunostaining, CD68 immunostaining, DAPI staining, or a merged image of a plurality of these.
  • the upper center and upper right images are weakly magnified images (scale bar 100 ⁇ m), and the strongly magnified images in each rectangular frame are three images each (lower center row and lower right row) (scale bar 10 ⁇ m).
  • the dashed line in the image indicates the boundary between the neuroparenchyma and the extraneuronium (epineurium), and the arrow indicates the co-localization of NETs and neutrophils.
  • 12 is a graph of representative CitH3 and Ly-6G immunostaining images and CitH3-positive areas of sciatic nerve longitudinal sections 20 mm distal to the injury site after 12 hours.
  • the image on the left side is a weakly magnified image (scale bar 100 ⁇ m)
  • the strongly magnified image in each square frame is an image on the right side (scale bar 10 ⁇ m).
  • the dashed line in the image indicates the boundary between the neuroparenchyma and the extraneural (epineurium).
  • the number of macrophages per unit area of nerve parenchyma detected in the sciatic nerve 7 days after the creation of the crush injury in rats treated with a sheet containing DNase I at a distance of 5 mm to 25 mm distal to the injury site was calculated as follows: It is a graph plotted against the distance from the part.
  • the two upper images and the lower left image are weakly magnified images, and the three images on the lower right side are strongly magnified images of the region corresponding to the epineurium indicated by the rectangular frame in the lower left image.
  • the image labeled "Merge" in the lower right is a merged image of MIF immunostaining, Ly-6G immunostaining and DAPI staining.
  • the dashed line in the image indicates the demarcation line between the neuroparenchyma and extraneuronal parenchyma (epineurium).
  • Fig. 2 is a graph plotting the rate of axonal regeneration against the distance from the injury site (left panel) and a graph of the longest axon length (right panel). Representative immunostaining images of an untreated normal rat sciatic nerve longitudinal section and a rat sciatic nerve longitudinal section 20 mm distal to the injury site 12 hours after creating a crush injury.
  • the second image from the left is CXCR4 immunostaining
  • the third image from the left is Ly-6G immunostaining
  • the other images are merged images of CitH3 immunostaining, Ly-6G immunostaining and DAPI staining.
  • the four images on the left are weakly magnified images (scale bar 20 ⁇ m), and the strongly magnified images in the square frame are the images on the right (scale bar 10 ⁇ m).
  • the dashed line in the image indicates the boundary between the neuroparenchyma and the extraneuronium (epineurium), and the arrow indicates the co-localization of CXCR4 and neutrophils.
  • Representative ⁇ 3 tubulin immunostaining images of longitudinal sections of the sciatic nerve 7 days after the creation of the crush injury in rats treated with a sheet containing AMD3100, 5 mm to 25 mm distal to the injury site, and ⁇ 3 tubulin immunostaining (upper row) 2 is a graph (bottom row) showing the axonal regeneration rate of the sciatic nerve for each distance from the injury site.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram of control of axonal regeneration process by neutrophils via NETs.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating peripheral nerve injury, containing a substance that suppresses the extraparenchymal formation of NETs in injured peripheral nerves.
  • Neutrophils are a type of granulocyte, and after differentiation and maturation in the bone marrow, they are usually stored in the bone marrow (storage pool), peripheral blood (circulating pool), and blood vessel walls and tissues (marginal pool). There is When inflammation occurs due to tissue damage, neutrophils react to neutrophil migration-stimulating factors such as inflammatory cytokines and chemokines produced at the site of inflammation, accumulate at the site of injury, and participate in tissue repair and regeneration. It is known.
  • NETs are mesh-like structures composed of chromatin containing citrullinated histone proteins and intracellular antibacterial proteins released by neutrophils. NETs are known to be involved in host defense and autoimmune diseases (Kely Campos Navegantes et al., Journal of Translational Medicine, 2017, vol. 15, no. 36, DOI 10.1186/s12967-017-1141- 8).
  • neutrophils first accumulate outside the nerve parenchyma at the distal site of peripheral nerve injury, and then macrophages accumulate within the nerve parenchyma as neutrophils disappear. Inhibition of accumulation results in early and large accumulation of macrophages in the nerve parenchyma, promoting axon regeneration and myelin clearance. Conversely, increasing the number of accumulated neutrophils suppresses macrophage accumulation. It was also found that axonal regeneration and myelin clearance were suppressed.
  • NETs exist outside the nerve parenchyma at the distal site of peripheral nerve injury, and that their localization overlaps with that of neutrophils. We found that it accumulated in the nerve parenchyma and promoted axonal regeneration. Agents that inhibit the formation of NETs are useful in treating peripheral nerve injury.
  • the nerve parenchyma of the peripheral nerve means the inner region of the peripheral nerve surrounded by the epineurium, and the parenchyma includes nerve bundles formed by axons wrapped in the perineurium.
  • Extraparenchymal of a nerve means the epineurium and its surrounding areas, especially the epineurium.
  • Substances that inhibit the formation of NETs outside the parenchyma of injured peripheral nerves include substances that inhibit the accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves, substances that inhibit the production of NETs by neutrophils, and substances that degrade NETs. can be mentioned.
  • the substance that inhibits the accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves used in the present disclosure has the ability to inhibit the accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves.
  • the group consisting of antibodies to neutrophils and antigen-binding fragments thereof, aptamers to neutrophils, inhibitors to neutrophil migration stimulating factors, and neutrophil migration inhibitory factors At least one substance is selected.
  • An example of a substance that inhibits the accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves is an antibody against neutrophils or an antigen-binding fragment thereof.
  • Antibodies to neutrophils can bind to neutrophils, e.g., to proteins present on the cell surface of neutrophils, and reduce neutrophil numbers or inhibit neutrophil function. Any antibody may be used, and a specific antibody against neutrophils is preferable.
  • Specific antibodies against neutrophils include, for example, antibodies against Ly-6G, a GPI-anchored protein of the Ly-6 family (also called myeloid cell differentiation antigen Gr-1), anti-PMN (polymorphonuclear neutrophil) antibodies, and anti-RP3 antibodies. etc.
  • a specific antibody can also be referred to as an antibody that can preferentially bind a target protein over a non-target protein, or an antibody that has a high binding affinity for a target protein.
  • a specific antibody binds to the target protein with an affinity that is at least 5 times stronger, preferably at least 10 times stronger, more preferably at least 100 times stronger, most preferably at least 1000 times stronger than it binds to the non-target protein. It can be an antibody.
  • a specific antibody may also be an antibody that binds to the target protein with a dissociation constant of 10 ⁇ 7 M, preferably 10 ⁇ 8 M, more preferably 10 ⁇ 9 M.
  • Antibodies used in the present disclosure can originate from any species including, for example, mouse, rat, shark, rabbit, pig, hamster, camel, llama, goat or human. Antibodies can also be of any class (eg IgG, IgE, IgM, IgD or IgA) and subclass of immunoglobulin molecule, but are preferably IgG.
  • Antibodies can also be of any class (eg IgG, IgE, IgM, IgD or IgA) and subclass of immunoglobulin molecule, but are preferably IgG.
  • the antibodies used in the present disclosure may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • Antibodies can also be chimeric, humanized or human antibodies.
  • an antigen-binding fragment of an antibody is defined as a partial fragment of an antibody that retains the ability to bind to the target protein.
  • the antigen-binding fragment of an antibody is preferably a partial fragment of a specific antibody that retains the ability to specifically bind to the target protein, such as Fab (fragment of antigen binding), Fab', F(ab')2, They may be, but are not limited to, single chain antibodies (single chain Fv), disulfide stabilized antibodies (disulfide stabilized Fv), peptides containing CDRs, and the like.
  • Antibodies and antigen-binding fragments thereof can be produced using methods known to those skilled in the art.
  • a target protein is prepared by genetic recombination based on the amino acid sequence of the target protein or the nucleotide sequence of the DNA encoding it, and by immunizing a suitable animal with this as an antigen, the B cells of the animal are further transformed into myeloma. It can be produced by fusing with cells to obtain a hybridoma. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164 Please refer to Etc.
  • Antibodies or antigen-binding fragments thereof may be antibody-drug conjugates further bound to other drugs.
  • aptamer for neutrophils Another example of a substance that inhibits the accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves is an aptamer for neutrophils.
  • Aptamers to neutrophils can bind to neutrophils, e.g., to proteins present on the cell surface of neutrophils, and reduce neutrophil numbers or inhibit neutrophil function.
  • An example of an aptamer to neutrophils is the aptamer to Ly-6G.
  • Aptamers are molecules that have the ability to specifically bind to target substances due to their three-dimensional structure. Aptamers composed of nucleic acids are called nucleic acid aptamers, and aptamers composed of amino acids are called peptide aptamers. In the present disclosure, both nucleic acid aptamers and peptide aptamers can be used.
  • the nucleic acid aptamers used in the present disclosure can be deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), or chimeric nucleic acids containing both deoxyribonucleotides and ribonucleotides as constituent units.
  • Nucleic acid aptamers can be produced by methods known to those skilled in the art, such as the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method.
  • Peptide aptamers can be produced by methods known to those skilled in the art, such as phage display methods and cell surface display methods.
  • IL-8 interleukin-8
  • IL-17 IL-17
  • Gro ⁇ Rowth-related gene products ⁇
  • NAP-2 Neurotrophil Cytokines such as Activating Protein-2
  • MIP-2 Macrophage Inflammatory Protein-2
  • lipid mediators such as leukotriene B4, fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylanine)
  • complement components such as C5a
  • a substance that exhibits inhibitory activity against a factor that promotes migration of spheres also called neutrophil migration stimulating factor, neutrophil migration factor, or neutrophil migration activating factor
  • inhibitors include antibodies against neutrophil migration stimulating factors, antagonists against neutrophil migration stimulating factor receptors, and the like.
  • substances that inhibit neutrophil recruitment to injured peripheral nerves are factors that inhibit neutrophil migration (also called neutrophil migration inhibitory factors) such as colchicine, resolvins, protectins, and 17 ⁇ -estradiol. be.
  • NETs a substance that inhibits neutrophil NETs production, is involved in the citrullination of histone proteins by protein arginine deiminase 4 (PAD4) in the neutrophil nucleus, disaggregation of chromatin, and breakdown of the nuclear membrane. It is formed in the cytoplasm by the influx of the accompanying nuclear chromatin into the cytoplasm, the subsequent binding of the chromatin to the antibacterial protein in the granules, and is released outside the cell following the cell membrane disruption of neutrophils. Neutrophils that release NETs undergo cell death called NETosis.
  • PAD4 protein arginine deiminase 4
  • Substances that inhibit NETs production of neutrophils used in the present disclosure include substances that suppress the expression or function of MIF, substances that suppress the expression or function of CXCR4, and substances that suppress the expression of PAD4. or from the group consisting of substances that inhibit the function, i.e., a substance that suppresses the expression of MIF, a substance that inhibits the function of MIF, a substance that suppresses the expression of CXCR4, a substance that inhibits the function of CXCR4, and a substance that suppresses the expression of PAD4 and substances that inhibit the function of PAD4.
  • MIF Glycosylation-Inhibiting Factor
  • GIF Glycosylation-Inhibiting Factor
  • L-dopachrome isomerase Phenylpyruvate tautomerase
  • cytokines expressed in cytoplasm, involved in both innate and adaptive immunity, and is known to induce the production of inflammatory molecules.
  • the nucleotide sequence of the human MIF gene has been registered with NCBI Reference Sequence as NC_000022.11, the mRNA nucleotide sequence as NM_002415.2, and the amino acid sequence as NP_002406.1 (all retrieved on July 19, 2021).
  • a substance that suppresses the expression or inhibits the function of MIF is used in a pharmaceutical composition for treating peripheral nerve injury.
  • a substance that suppresses the expression or functions of MIF used in the present disclosure is any substance that has the ability to suppress the expression of MIF at the gene or protein level or the ability to inhibit the function of MIF.
  • it is at least one substance selected from the group consisting of nucleic acids that suppress MIF expression, antibodies against MIF and antigen-binding fragments thereof, aptamers against MIF, and MIF inhibitors.
  • Nucleic acids that suppress MIF expression include nucleic acids that can suppress transcription of mRNA from the MIF gene (MIF mRNA), nucleic acids that can degrade MIF mRNA, and nucleic acids that can suppress protein translation from MIF mRNA. Examples of these include antisense nucleic acids or nucleic acids that cause RNA interference, which can be designed and produced by those skilled in the art based on the base sequence of the MIF gene or the base sequence of MIF mRNA. siRNA, shRNA or miRNA may be mentioned.
  • An example of a substance that inhibits the function of MIF is an antibody against MIF, preferably a specific antibody against MIF, or an antigen-binding fragment of an antibody against MIF.
  • Another example of substances that inhibit the function of MIF are aptamers against MIF. Definitions and other explanations of antibodies, specific antibodies, antigen-binding fragments and aptamers are as described above.
  • MIF inhibitor is any substance that has the ability to inhibit the function of MIF.
  • MIF inhibitors include ISO-1 (CAS No. 478336-92-4, (S,R)-3-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid), ( ⁇ )-CPSI 1306 (CAS No.
  • the substance that suppresses the expression or functions of MIF is a MIF inhibitor, particularly ISO-1 or ( ⁇ )-CPSI 1306.
  • CXCR4 is a G protein-coupled receptor belonging to the CXC motif-type chemokine receptor family. is known to induce Nucleotide sequence of human CXCR4 gene is NC_000002.12 in NCBI Reference Sequence, nucleotide sequence of mRNA is NM_001008540.2, NM_001348056.2, NM_001348059.2, NM_001348060.2, NM_003467.3, amino acid sequence is NP_001008540.1, NP_0010348540.1 .1, NP_001334988.1, NP_001334989.1, and NP_003458.1 (all retrieved December 20, 2021).
  • CXCR4 exists outside the nerve parenchyma at the distal site of peripheral nerve injury, and its localization overlaps with that of neutrophils, and that inhibition of CXCR4 inhibits the production of NETs by neutrophils outside the nerve parenchyma. Inhibition of CXCR4 promoted the early and abundant accumulation of macrophages in the nerve parenchyma, promoting axonal regeneration. Substances that suppress the expression or inhibit the function of CXCR4 are useful in treating peripheral nerve injury.
  • a substance that suppresses the expression or function of CXCR4 is any substance that has the ability to suppress the expression of CXCR4 at the gene or protein level or has the ability to inhibit the function of CXCR4, preferably CXCR4 , antibodies and antigen-binding fragments thereof against CXCR4, aptamers against CXCR4, and CXCR4 inhibitors.
  • Nucleic acids that suppress CXCR4 expression include nucleic acids that can suppress transcription of mRNA from the CXCR4 gene (CXCR4 mRNA), nucleic acids that can degrade CXCR4 mRNA, and nucleic acids that can suppress protein translation from CXCR4 mRNA.
  • Examples include nucleic acids that can be designed and produced by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the CXCR4 gene or the nucleotide sequence of CXCR4 mRNA, antisense nucleic acids, or nucleic acids that cause RNA interference, such as siRNA, shRNA or miRNA may be mentioned.
  • CXCR4 One example of a substance that inhibits the function of CXCR4 is an antibody against CXCR4, preferably a specific antibody against CXCR4, or an antigen-binding fragment of an antibody against CXCR4.
  • Another example of substances that inhibit the function of CXCR4 are aptamers against CXCR4. Definitions and other explanations of antibodies, specific antibodies, antigen-binding fragments and aptamers are as described above.
  • a CXCR4 inhibitor is any substance capable of inhibiting the function of CXCR4.
  • Examples of CXCR4 inhibitors include Plerixafor (also known as AMD3100; general formula 1,4-Bis[(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl]benzene), WZ811 (CAS No.
  • PAD4 is an enzyme that induces NETs formation by returning specific arginine residues of histone proteins (H3, H4, etc.) to citrulline residues.
  • the nucleotide sequence of the human PAD4 gene has been registered in the NCBI Reference Sequence as NC_000001.11, the mRNA nucleotide sequence as NM_012387.3, and the amino acid sequence as NP_036519.2 (all retrieved on December 20, 2021).
  • the present inventors found that inhibition of PAD4 inhibited the production of neutrophils' NETs outside the parenchyma of injured peripheral nerves, and that inhibition of PAD4 led to an early and abundant accumulation of macrophages in the nerve parenchyma. . Accumulation of macrophages in the nerve parenchyma can promote axonal regeneration, so substances that suppress the expression or function of PAD4 are useful for treating peripheral nerve damage.
  • a substance that suppresses the expression or functions of PAD4 used in the present disclosure is any substance that has the ability to suppress the expression of PAD4 at the gene or protein level or has the ability to inhibit the function of PAD4.
  • it is at least one substance selected from the group consisting of nucleic acids that suppress PAD4 expression, antibodies against PAD4 and antigen-binding fragments thereof, aptamers against PAD4, and PAD4 inhibitors.
  • Nucleic acids that suppress PAD4 expression include nucleic acids that can suppress transcription of mRNA from the PAD4 gene (PAD4 mRNA), nucleic acids that can degrade PAD4 mRNA, and nucleic acids that can suppress protein translation from PAD4 mRNA. Examples of these include antisense nucleic acids or nucleic acids that cause RNA interference, which can be designed and produced by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the PAD4 gene or the nucleotide sequence of PAD4 mRNA, such as siRNA, shRNA or miRNA may be mentioned.
  • PAD4 One example of a substance that inhibits the function of PAD4 is an antibody against PAD4, preferably a specific antibody against PAD4, or an antigen-binding fragment of an antibody against PAD4.
  • Another example of substances that inhibit the function of PAD4 are aptamers against PAD4. Definitions and other explanations of antibodies, specific antibodies, antigen-binding fragments and aptamers are as described above.
  • PAD4 inhibitors are PAD4 inhibitors.
  • a PAD4 inhibitor is any substance that has the ability to inhibit the function of PAD4.
  • PAD4 inhibitors include Cl-amidine ( N2 - Benzoyl-N5-(1-imino-2-chloroethyl)-L-ornithinamide/trifluoroacetic acid), BMS-P5 (no generic name, Cas #, 1550371 -22-6), GSK121 trifluoroacetate (no generic name, Cas #, 1652591-80-4), and the like.
  • DNA capable of inducing transcription of an antisense nucleic acid or a nucleic acid that causes RNA interference against any of the above MIF, CXCR4 and PAD4 by being placed under the control of an appropriate expression promoter and these antisense nucleic acids or Nucleic acids in which part of the nucleotide residues constituting nucleic acids that cause RNA interference are modified are also included in the expression-suppressing nucleic acids of the present disclosure as nucleic acids that are functionally equivalent to antisense nucleic acids or nucleic acids that cause RNA interference. be done. Modifications of nucleotide residues include 2'O-methylation, 2'-Fation, 4'-thiolation, and the like.
  • chimeric RNAs in which part of the ribonucleotides of the expression-suppressing RNA are replaced with corresponding deoxyribonucleotides or nucleotide analogues are also included in the expression-suppressing nucleic acids of the present disclosure.
  • Nucleotide analogs include, for example, 5-position modified uridine or cytidine, such as 5-(2-amino)propyluridine, 5-bromouridine, etc.; 8-position modified adenosine or guanosine, such as 8-bromoguanosine; deaza nucleotides, Examples include 7-deaza-adenosine and the like; O- or N-alkylated nucleotides such as N6-methyladenosine and the like. There are no particular restrictions on the type or number of modified or substituted bases, as long as they do not lose the ability to suppress the expression of the target molecule.
  • Nucleic acids that suppress expression can be artificially synthesized using genetic recombination technology or chemical synthesis technology. Genetic recombination methods, methods for chemically synthesizing nucleic acids, methods for synthesizing unnatural bases, and methods for synthesizing nucleic acids containing these are well known to those skilled in the art.
  • substances that inhibit NETs production by neutrophils include lactoferrin described in WO2014/168253; thrombin-like enzymes such as batroxobin, ancrod, crotalase, etc. described in WO2018/131724; and Btk described in WO2019/208805.
  • Compounds with inhibitory activity e.g. Immunoglobulins such as sulfonated human immunoglobulin G (Uozumi et al., Modern Rheumatology, 2020, 30(3):544-550.
  • PA-dPEG24 peptide: C-terminal of IALILEPICCQERAA PEG-modified peptide with a 24-mer PEG moiety
  • Prostaglandin E2 inhibitor of NETosis through cAMP -PKA
  • degrading NETs causes macrophages to accumulate early and in large amounts in the damaged peripheral nerve parenchyma, promoting axonal regeneration. Agents that degrade NETs are useful in treating peripheral nerve injury.
  • a substance that degrades NETs is any substance that has the ability to degrade chromatin or antibacterial proteins that constitute NETs, especially chromatin. 2013. 342(6160): 863-866. doi: 10.1126/science.1242255).
  • compositions comprise an amount of a substance that inhibits extraparenchymal formation of NETs in injured peripheral nerves in an effective amount for treating peripheral nerve injury.
  • the pharmaceutical composition contains an effective amount for treating peripheral nerve injury, a substance that inhibits the accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves, or a substance that inhibits the expression or function of MIF.
  • the effective dose is appropriately determined according to the usage, subject's age, sex, body weight, site and degree of peripheral nerve damage, and other factors.
  • the pharmaceutical composition may contain at least one substance selected from the group consisting of substances that inhibit the accumulation of neutrophils in damaged peripheral nerves, substances that suppress the expression of MIF, and substances that inhibit the function of MIF. . That is, the pharmaceutical composition may contain one or more substances that inhibit the accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves, may contain one or more substances that suppress the expression of MIF, or It may contain a substance that inhibits the functions of multiple types of MIF.
  • the pharmaceutical composition may contain one or more substances that suppress the expression of CXCR4, may contain one or more substances that inhibit the function of CXCR4, and may contain one or more substances that inhibit the expression of PAD4. , may contain one or more substances that inhibit the function of PAD4, and may contain one or more substances that degrade NETs.
  • the pharmaceutical composition can contain other agents for the treatment of peripheral nerve damage, or pharmaceutically acceptable additives such as buffers, stabilizers, preservatives, excipients, and the like.
  • pharmaceutically acceptable additives are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected and used within the scope of the ordinary ability of those skilled in the art.
  • treatment includes all types of medically acceptable therapeutic intervention aimed at curing, temporary remission, etc. of a disease or condition. Therefore, the treatment of peripheral nerve injury includes medical treatment for various purposes, including promotion of regeneration of damaged peripheral nerves, improvement of functional impairment due to peripheral nerve injury, delay or halt of progression of functional impairment, prevention of onset, etc. Includes permissible interventions.
  • the pharmaceutical composition can be used for peripheral nerve damage caused by axonal rupture, and is particularly preferably used for severe peripheral nerve damage that cannot be expected to recover spontaneously.
  • a preferred example of peripheral nerve injury that can be treated with the pharmaceutical composition is traumatic peripheral nerve injury (wound, compression, traction, amputation, defect, iatrogenic, etc.).
  • the pharmaceutical composition can be used in subjects with peripheral nerve damage, e.g., rodents including mice, rats, hamsters, guinea pigs, primates including humans, chimpanzees and rhesus monkeys, livestock including pigs, cattle, goats, horses, sheep, dogs. , to mammals such as companion animals, including cats.
  • peripheral nerve damage e.g., rodents including mice, rats, hamsters, guinea pigs, primates including humans, chimpanzees and rhesus monkeys, livestock including pigs, cattle, goats, horses, sheep, dogs.
  • mammals such as companion animals, including cats.
  • a preferred subject is a human.
  • the pharmaceutical composition can suppress the extraparenchymal formation of NETs in the injured peripheral nerve, for example, as long as it can inhibit the accumulation of neutrophils in the injured peripheral nerve, or the expression of MIF in the injured peripheral nerve
  • the dosage form and administration method as long as it can suppress or inhibit the function.
  • the pharmaceutical composition can be prepared in the form of a solution and administered intravenously or intraperitoneally.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in the form of a solution, which may be used as it is or impregnated with a biocompatible medical material by placing it around the distal side of the injured peripheral nerve.
  • placement may be performed, for example, by injection of a solution agent around the distal side of the injured peripheral nerve, impregnating the solution agent with a biocompatible medical material, which is applied distally to the injured peripheral nerve. It may be done by placing around the sides.
  • the pharmaceutical composition contains a substance that suppresses extraparenchymal formation of NETs in injured peripheral nerves, such as a substance that inhibits accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves, or suppresses the expression or function of MIF. It can also be used by preparing a form of a biocompatible medical material that retains the inhibitory substance and placing this biocompatible medical material around the distal side of the injured peripheral nerve.
  • any method can be used to hold the substance on the biocompatible medical material.
  • the substance may be directly fixed to the biocompatible medical material, or fixed via an appropriate linker molecule or adapter molecule. Alternatively, it may be fixed using a binder or coating agent. Said substance may be retained on the biocompatible medical material by non-specific adsorption.
  • the biocompatible medical material when the biocompatible medical material is a water-absorbing material, the biocompatible medical material may retain the substance by impregnating the biocompatible medical material with a liquid containing the substance. Furthermore, when the biocompatible medical material is a gel material, the substance may be retained in the biocompatible medical material by including the substance in the raw material solution during the gel preparation process.
  • a biocompatible medical material containing a substance that inhibits the formation of NETs outside the parenchyma of injured peripheral nerves such as a substance that inhibits the accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves or suppresses the expression of MIF
  • biocompatible medical materials include polymeric compounds such as polyethylene fluoride and polystyrene, inorganic compounds such as silica, and biodegradable polymers, with biodegradable polymers being preferred.
  • biodegradable polymers include synthetic polymer materials such as polyglycolic acid, polylactic acid, polyethylene glycol, polycaprolactone, polydioxanone, and other copolymers such as lactic acid-glycolic acid copolymers; and inorganic materials such as ⁇ -phosphorus.
  • Natural polymer materials include collagen, gelatin, alginic acid, hyaluronic acid, agarose, chitosan, fibrin, fibroin, chitin, cellulose, silk, and the like.
  • the shape of the biocompatible medical material may be any shape suitable for placement around the distal side of the injured peripheral nerve, such as sheet-like or gel-like.
  • a sheet-shaped medical material can be used by covering the distal portion of a peripheral nerve injury site.
  • a gel-like medical material such as fibrin glue, alginic acid, etc. can be used by spraying or coating around the distal side of the injured peripheral nerve, or by indwelling on the distal side of the injured area.
  • the pharmaceutical composition was administered at a time from immediately after peripheral nerve injury until neutrophils accumulated outside the nerve parenchyma distal to the injury site and then disappeared.
  • Axonal regeneration can be promoted by acting on the distal side of peripheral nerve injury that causes Wallerian degeneration for a relatively short period of time. Therefore, the pharmaceutical composition need not be present throughout the injured peripheral nerve, nor need it be present throughout the period immediately following peripheral nerve injury until axonal regeneration is complete.
  • the pharmaceutical composition is administered after peripheral nerve injury anywhere within the period during which neutrophils accumulate outside the nerve parenchyma distal to the injury, e.g.
  • distal to the injured peripheral nerve anywhere within the period of time during which neutrophils accumulate outside the nerve parenchyma and then disappear It can be placed and used in the periphery, particularly in the vicinity of the distal side of the injured site.
  • the pharmaceutical composition may be administered immediately after, 3 hours, 6 hours or 9 hours after peripheral nerve injury, 12 hours, 15 hours, 18 hours, 21 hours or 24 hours after peripheral nerve injury. It can be used by placing it around the distal side of the injured peripheral nerve for a relatively short period of time during the post-tinal period.
  • the pharmaceutical composition can be used for a period from immediately after peripheral nerve injury to 24 hours, from 3 hours to 18 hours, from 6 hours to 15 hours, or from 9 hours to 12 hours after peripheral nerve injury. It can be used by placing it around the distal side of the injured peripheral nerve for a relatively short period of time.
  • peripheral nerve reconstruction, suturing, etc. are performed after some time has passed after injury, the surgical invasion may cause neutrophil infiltration in the same way as immediately after peripheral nerve injury.
  • the pharmaceutical composition is administered after a peripheral nerve injury, somewhere during the period when neutrophils are accumulating outside the nerve parenchyma distal to the injury, for example immediately after surgical insult to distal to the injury.
  • the distal side of the injured peripheral nerve For a relatively short period of time, e.g., 30 minutes to 7 days, around the distal side of the injured peripheral nerve, anywhere during the period of neutrophil accumulation and subsequent disappearance outside the nerve parenchyma, In particular, it can be used by arranging it around the vicinity of the distal side of the injured part.
  • the pharmaceutical composition can be administered immediately after, 3 hours, 6 hours or 9 hours after surgical insult, and 12 hours, 15 hours, 18 hours, 21 hours or 24 hours after surgical insult. It can be used by placing it around the distal side of the injured peripheral nerve for a relatively short period of time within the terminal period.
  • the pharmaceutical composition can be used for a period from immediately after surgery to 24 hours, from 3 hours to 18 hours, from 6 hours to 15 hours, or from 9 hours to 12 hours after surgery. It can be placed around the distal side of the injured peripheral nerve for a relatively short period of time within the period of .
  • the time the pharmaceutical composition is placed around the distal side of the peripheral nerve injury site can be, for example, 30 minutes or more, 60 minutes or more, or 90 minutes or more, and can be 7 days or less, 24 hours or less, 12 hours or less, 6 It can be an hour or less, 4 hours or less, or 3 hours or less.
  • the pharmaceutical composition is used by placing it around the distal side of the peripheral nerve injury for 30 minutes to 3 hours within a period of 9 hours to 12 hours after peripheral nerve injury. obtain.
  • the pharmaceutical composition can exert its effect even by such a temporally and spatially limited treatment, for example, when performing nerve suturing in the case of peripheral nerve injury. It is also possible to place the pharmaceutical composition around the nerve, perform nerve suture, and remove the pharmaceutical composition after about several tens of minutes to several hours, for example, about 30 minutes to 3 hours have passed since the placement.
  • the present invention provides a subject with peripheral nerve damage with an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a substance that inhibits the formation of extraparenchymal NETs in the damaged peripheral nerve.
  • a method of treating peripheral nerve injury comprising applying a pharmaceutical composition comprising a substance that inhibits accumulation or a substance that inhibits the expression or function of MIF.
  • the application is preferably performed by placing the pharmaceutical composition around the periphery of the peripheral nerve distally, particularly near the distally injured site.
  • the present invention also provides, in one aspect, a substance that inhibits the formation of NETs extraparenchymal in injured peripheral nerves for use in treating peripheral nerve injury.
  • the present invention further provides, in one aspect, use of a substance that suppresses extraparenchymal formation of NETs in injured peripheral nerves in the manufacture of a pharmaceutical composition. Definitions and other explanations for each term are as described above.
  • the present invention provides a method for evaluating the peripheral nerve regeneration-promoting activity of a test substance, using the activity of suppressing the formation of extraparenchymal NETs in injured peripheral nerves as an index.
  • Activities to suppress the formation of NETs outside the parenchyma of injured peripheral nerves include activity to inhibit accumulation of neutrophils in injured peripheral nerves; activity to inhibit NETs production by neutrophils, such as suppression of MIF expression or function-inhibiting activity, CXCR4 expression-inhibiting or function-inhibiting activity, and PAD4 expression-inhibiting or function-inhibiting activity; and NETs-degrading activity.
  • the evaluation method using the activity of inhibiting the accumulation of neutrophils in damaged peripheral nerves as an index is in vitro, in the presence and absence of a test substance, respectively, the survival rate of neutrophils or It includes determining the peripheral nerve regeneration-promoting activity of the test substance by comparing the migration ability.
  • a test substance that reduces the survival rate or migration ability of neutrophils can be determined to have peripheral nerve regeneration-promoting activity.
  • the evaluation method using the activity of inhibiting the accumulation of neutrophils in damaged peripheral nerves as an indicator is in vivo, the blood neutrophil count in the presence and absence of a test substance Alternatively, by comparing the number of neutrophils accumulated in peripheral nerve injury sites, it includes determining the peripheral nerve regeneration-promoting activity of the test substance. In this embodiment, a test substance that reduces the number of neutrophils in blood or the number of neutrophils accumulated in peripheral nerve injury sites can be determined to have peripheral nerve regeneration-promoting activity.
  • the evaluation method using the activity of inhibiting NETs production of neutrophils as an index is in vitro, in the presence and absence of a test substance, and any one of MIF, CXCR4, or PAD4 genes ( hereinafter referred to as an indicator gene) to determine the peripheral nerve regeneration-promoting activity of the test substance.
  • the evaluation method includes, for example, a test substance, a cell containing a nucleic acid having a marker gene under the control of a promoter region that controls the expression of an indicator gene, and conditions under which expression of the marker gene by the promoter is induced.
  • the marker gene is not particularly limited as long as the expression induction of the gene can be detected, for example, a gene encoding a fluorescent protein such as GFP or a chemiluminescent protein such as luciferase, or a drug resistance gene or auxotrophy of cells Genes that confer a phenotypic change on a cell, such as genes that can complement , can be used.
  • Cells containing a nucleic acid having a marker gene under the control of the promoter region of the indicator gene for example, originally, the nucleotide sequence of the open reading frame region of the indicator gene in the cell having the indicator gene is combined with the nucleotide sequence encoding the marker gene. It can be produced by recombination with Also, based on the human genome base sequence information, an expression vector containing the promoter region of a human indicator gene and a marker gene recombined under its control is constructed, and the expression vector is introduced into an appropriate cell. can also
  • Incubation can be performed by coexisting the cells and the test substance in a medium or buffer solution in an appropriate container. Conditions such as incubation temperature and time may be conditions that allow the cell to express the marker gene. In addition, marker gene-derived signals can be measured by a method suitable for the marker gene used.
  • the evaluation method is to compare the expression of an indicator gene or the expression of any protein of MIF, CXCR4 or PAD4 (hereinafter referred to as an indicator protein) in the presence and absence of a test substance. and determining the peripheral nerve regeneration-promoting activity of the test substance.
  • the evaluation method includes, for example, the step of incubating a test substance with cells capable of expressing an indicator gene or indicator protein; measuring the intensity of the indicator gene- or indicator protein-derived signal in the cells after incubation comparing the measured intensity of the indicator gene- or indicator protein-derived signal with the intensity of the indicator gene- or indicator protein-derived signal in the absence of the test substance; and reducing the intensity of the indicator gene- or indicator protein-derived signal
  • a step of determining that the test substance has peripheral nerve regeneration-promoting activity may be included.
  • a cell capable of expressing an indicator gene or indicator protein preferably expresses a human indicator gene or indicator protein.
  • a cultured cell line into which a human indicator gene, such as a human MIF gene, is integrated can be used.
  • Incubation can be performed by coexisting the cells and the test substance in a medium or buffer solution in an appropriate container.
  • Conditions such as incubation temperature and time may be conditions that allow cells to express the indicator gene or indicator protein.
  • Signals derived from indicator genes can be measured by general methods capable of detecting and quantifying specific gene expression, such as hybridization using base sequence information of indicator genes, quantitative PCR, and RNA-Seq. .
  • the signal derived from the indicator protein should be measured by a general method that can detect and quantify the expression of a specific protein, such as ELISA using a specific antibody against the indicator protein, or an immunological detection method such as Western blotting. can be done.
  • a test substance that reduces the intensity of an indicator gene- or indicator protein-derived signal in cells that have been incubated with the test substance compared to cells that have not been incubated with the test substance under conditions that induce the expression of the indicator gene or protein can be determined to have peripheral nerve regeneration promoting activity.
  • the evaluation method using the activity of inhibiting NETs production by neutrophils as an index compares MIF function, CXCR4 function, or PAD4 function in the presence and absence of a test substance. By doing so, it includes determining the peripheral nerve regeneration promoting activity of the test substance. For example, in an evaluation method that uses the activity of inhibiting NETs production by neutrophils as an index, by comparing the macrophage migration inhibitory activity of MIF in the presence and absence of the test substance, peripheral nerve regeneration of the test substance was evaluated. including determining stimulatory activity. In this embodiment, a test substance that has been determined to have activity to inhibit MIF function can be evaluated as having activity to promote peripheral nerve regeneration. A comparison of MIF activity in the presence and absence of a test substance can be performed using methods employed in evaluation or screening of the inhibitory action of known MIF inhibitors.
  • the evaluation method using the NETs-degrading activity as an indicator is to compare the degradation of NETs in the presence and absence of the test substance, thereby determining the peripheral nerve regeneration-promoting activity of the test substance. Including judging.
  • the evaluation method includes, for example, a step of incubating a test substance with NETs produced by neutrophils; a step of measuring the intensity of the NETs-derived signal after incubation; A step of comparing the intensity of the NETs-derived signal with the intensity of the NETs-derived signal in the absence of the test substance; and a step of determining that the test substance that reduced the intensity of the NETs-derived signal has peripheral nerve regeneration-promoting activity.
  • a NETs-derived signal is, for example, a signal derived from a known NETs marker molecule such as citrullinated histone H3, and can be measured by a method suitable for the molecule, such as an immunological detection method.
  • a test substance determined to have NETs-degrading activity can be evaluated as having peripheral nerve regeneration-promoting activity.
  • the animal's right atrial appendage was incised under anesthesia to exsanguinate blood, and PBS solution was poured into the left heart to exsanguinate blood.
  • PBS solution was poured into the left heart to exsanguinate blood.
  • GFP-labeled neutrophils used in Test Example 2 were prepared as follows. Bone marrow cells of the femur and crus of C57BL/6 GFP mice (8-10 weeks old) were expelled with PBS and harvested. Red blood cells contained in bone marrow cells were lysed with RBC lysis buffer (Funakoshi) to purify bone marrow cells. Neutrophils were isolated from bone marrow cells using the Neutrophil isolation kit, mouse (Miltenyi Biotec).
  • Test Example 1 Spatiotemporal distribution analysis of neutrophils and macrophages in peripheral nerve injury site (1) Neutrophils A rat sciatic nerve was crushed and 12 hours later, the sciatic nerve was excised. Staining and immunohistochemical staining were performed. Representative HE-stained images from 5 mm proximal (-5 mm) to 25 mm distal from the injury site are shown in Figure 1, and immunostained images are shown in Figure 2.
  • extraparenchymal is used synonymously with “epineurium”
  • 15 mm and In Wallerian degeneration 25 mm distal it was absent in the nerve parenchyma, but only extraparenchymal.
  • sciatic nerves were excised from rats subjected to crush injury 1 hour, 6 hours, 12 hours, 1 day, 3 days, or 7 days after injury. Immunohistochemical staining of the sciatic nerve was performed in the same manner as above, and CD68-positive cells present in the nerve parenchyma were counted as macrophages. The number of macrophages distal to the injury site increased 3 days after injury and peaked 7 days after injury (Fig. 6). Like neutrophils, macrophages accumulated in the epineurium 12 hours after injury (Fig. 7).
  • Example 1 Evaluation of the effect of anti-neutrophil antibody on nerve regeneration process
  • PMN polymorphonuclear
  • the sciatic nerve was excised, and longitudinal sections were subjected to HE staining and immunohistochemical staining. The number of neutrophils in the nerve and the number of macrophages in the nerve parenchyma were counted from the stained image, and the axonal regeneration rate was calculated. In addition, the area of the MBP-positive region in the MBP-immunostained image was divided by the total area to calculate the MBP-positive rate, which is an index of the amount of axonal debris.
  • Fig. 8 shows the time course of the blood neutrophil count.
  • the number of neutrophils in blood peaked at 12 hours after injury, and neutrophil recruitment to the circulating pool was observed.
  • the blood neutrophil count did not change significantly after injury.
  • Figure 9 shows a representative HE-stained image 5 mm distal to the injury site 12 hours after injury
  • Figure 10 shows the distribution of neutrophils distal to the injury site.
  • the number of neutrophils observed distal to the injured site in the anti-neutrophil antibody-administered group was lower than in the injury alone group and the control antibody-administered group.
  • Fig. 11 shows the distribution of macrophages distal to the sciatic nerve injury 12 hours and 7 days after injury.
  • the antineutrophil antibody-administered group accumulation of many macrophages was observed earlier than in the injury alone group and the control antibody-administered group.
  • Fig. 12 shows typical ⁇ 3 tubulin immunostaining images from 5 mm to 30 mm distal to the injury site 7 days after injury
  • Fig. 13 shows the axonal regeneration rate.
  • the antineutrophil antibody-administered group showed a higher axonal regeneration rate than the injury alone group and the control antibody-administered group.
  • Fig. 14 shows representative MBP immunostaining images and MBP positive rates 7 days after injury.
  • the MBP positive rate was lower and the amount of myelin sheath debris decreased compared to the injury alone group and the control antibody-administered group.
  • This example shows that reducing the number of neutrophils that accumulate in Wallerian degeneration sites with anti-neutrophil antibodies increases the accumulation of macrophages, promotes axonal regeneration, and promotes myelin clearance. confirmed.
  • the sciatic nerve was removed, and HE staining and immunohistochemical staining of cross sections at 4 mm, 6 mm, 8 mm, and 10 mm distal to the injury site were performed.
  • the number of neutrophils in the nerve and the number of macrophages in the nerve parenchyma were counted, and the axonal density and the MBP positive rate were calculated.
  • Fig. 15 shows the blood neutrophil count 12 hours after injury
  • Fig. 16 shows typical HE-stained images and immunostained images 4 mm distal to the injury site
  • Fig. 17 shows the spatial distribution of neutrophils.
  • the neutrophil-administered group the number of blood neutrophils increased compared to the injury alone group and the PBS-administered group, and the number of neutrophils distal to the injury site also increased.
  • Fig. 18 shows the distribution of macrophages distal to the sciatic nerve injury 7 days after injury.
  • the number of macrophages distal to the injury site was lower in the neutrophil-administered group than in the injury alone group and the PBS-administered group.
  • FIG. 19 A typical ⁇ 3 tubulin immunostaining image 7 days after injury is shown in Fig. 19, and the axonal density is shown in Fig. 20.
  • the axonal density increased closer to the injury site, but the axonal density was generally lower in the neutrophil-administered group.
  • a typical MBP immunostaining image 7 days after injury is shown in Figure 21, and the MBP positive rate is shown in Figure 22.
  • the MBP positive rate was higher and the amount of myelin sheath debris increased compared to the injury alone group and the PBS-administered group.
  • Fig. 23 shows a conceptual diagram of the control of the axonal regeneration process by neutrophils, which is inferred from Test Examples 1 and 2 and Example 1.
  • Example 2 Evaluation of NETs formation in the epineurium of Wallerian degeneration and the effect of suppression of NETs formation on nerve regeneration process
  • the sciatic nerve was removed and longitudinal sections 20 mm distal to the injury site were prepared for immunohistochemical staining for CitH3, Ly-6G and CD68. The epineurium portion was observed, and the ratio of the area with CitH3 staining to the area of the entire observation field was calculated. In addition, the number of macrophages per unit area within the nerve parenchyma was quantified.
  • Fig. 25 shows representative CitH3 and Ly-6G immunostaining images and CitH3-positive areas
  • Fig. 26 shows representative CD68 immunostaining images and the number of macrophages.
  • a large amount of NETs were found in the epineurium in the control sheet group, but only a few NETs were detected in the Cl-amidine-containing sheet group and the DNase I-containing sheet group.
  • accumulation of more macrophages was observed in the nerve parenchyma compared to the control sheet group.
  • a representative ⁇ 3 tubulin immunostained image is shown in the upper part of FIG. 27, the axonal regeneration rate is shown in the lower part of FIG. 27, and the number of macrophages is shown in FIG.
  • the DNase I-containing sheet group showed a higher axonal regeneration rate over almost the entire evaluated area distal to the injured area, and more macrophages were accumulated in the nerve parenchyma.
  • Example 3 Evaluation of the effect of inhibition of MIF on nerve regeneration process
  • the sciatic nerve was removed, longitudinally sectioned and immunohistochemically stained for CitH3, Ly-6G and CD68. The epineurium portion was observed, and the ratio of the area with CitH3 staining to the area of the entire observation field was calculated. In addition, the number of macrophages per unit area within the nerve parenchyma was quantified.
  • Figure 30 shows the CD68 immunostaining image and macrophage count at 5 mm distal to the sciatic nerve injury site 12 hours after injury
  • Figure 31 shows the CD68 immunostaining image and macrophage count at 20 mm distal to the sciatic nerve injury site.
  • FIG. 32 shows CitH3 and Ly-6G immunostaining images and CitH3-positive areas in the 20 mm distal region. There was no difference in macrophage accumulation between the iso-1 containing sheet group and the control sheet group at 5 mm distal to the injury site, which was not treated with the sheet. On the other hand, more macrophages were accumulated in the nerve parenchyma in the iso-1 containing sheet group than in the control sheet group at 20 mm distal to the injury site treated with the sheet. In the iso-1 containing sheet group, only a few NETs were detected in the epineurium 20 mm distal to the injury site.
  • FIG. 33 A representative CD68 immunostained image and the number of macrophages are shown in FIG. 33, and a CD163 immunostained image and the number of M2 macrophages are shown in FIG. A greater accumulation of macrophages was observed in the nerve parenchyma in the iso-1-containing sheet group compared to the control sheet group throughout the evaluated lesion distal to the lesion.
  • FIG. 1 Representative ⁇ 3 tubulin immunostaining images and axonal regeneration rate are shown in FIG.
  • the iso-1-containing sheet group showed a higher rate of axonal regeneration than the control sheet group over almost the entire distal injury site evaluated.
  • FIG. 36 A typical ⁇ 3 tubulin immunostaining image is shown in FIG. 36, and the axon regeneration rate and longest axon length are shown in FIG.
  • the iso-1-containing sheet group and the CPSI-1306-containing sheet group showed a higher rate of axonal regeneration over almost the entire distal area of the injured site, and the longest axonal length was greater than that of the control sheet group.
  • Example 4 Evaluation of Effect of CXCR4 Inhibition on Nerve Regeneration Process (1) Distribution of CXCR4 Longitudinal sections of sciatic nerve isolated from untreated rats and sciatic nerves isolated from rats 12 hours after creation of crush injury , immunohistochemical staining for CXCR4 and Ly-6G. No expression of CXCR4 was confirmed in the normal sciatic nerve, but extraparenchymal expression of CXCR4 was observed in the sciatic nerve 12 hours after injury creation, and CXCR4 was double-stained with neutrophils (Fig. 38). This suggests that CXCR4 is produced by accumulated neutrophils outside the nerve parenchyma of the Wallerian degeneration site 12 hours after injury.
  • the sciatic nerve was removed and longitudinal sections 20 mm distal to the injury site were prepared for immunohistochemical staining for CitH3, Ly-6G and CD68. The epineurium portion was observed, and the ratio of the area with CitH3 staining to the area of the entire observation field was calculated. In addition, the number of macrophages per unit area within the nerve parenchyma was quantified.
  • Fig. 39 shows representative CitH3 and Ly-6G immunostaining images and CitH3-positive areas
  • Fig. 40 shows representative CD68 immunostaining images and macrophage counts.
  • AMD3100-containing sheet group only a few NETs were detected in the epineurium, and more macrophages were accumulated in the nerve parenchyma than in the control sheet group.
  • a representative ⁇ 3 tubulin immunostained image is shown in the upper part of FIG. 41, the axonal regeneration rate is shown in the lower part of FIG. 41, and the number of macrophages is shown in FIG.
  • the CXCR4-containing sheet group showed a higher rate of axonal regeneration over almost the entire area distal to the injured site, and more macrophages were accumulated in the nerve parenchyma.
  • FIG. 43 shows a conceptual diagram of the control of the axonal regeneration process by neutrophils, which is inferred from Test Examples 1 and 2 and Examples 1-4.

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Abstract

本発明は、損傷末梢神経の実質外における好中球細胞外トラップ（Neurophil Extracellular Traps; NETs）の形成を抑制する物質、例えば損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質、マクロファージ遊走阻止因子（Macrophage migration inhibitory factor; MIF）の発現を抑制する又は機能を阻害する物質等を含む、末梢神経損傷の治療のための医薬組成物を提供する。本発明はまた、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する活性、例えば損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する活性、MIFの発現を抑制する活性又は機能を阻害する活性等を指標とした被験物質の末梢神経再生促進活性を評価する方法を提供する。

Description

末梢神経損傷の治療のための医薬組成物
　本発明は、損傷末梢神経の実質外における好中球細胞外トラップ（Neurophil Extracellular Traps; NETs）の形成を抑制する物質を含む、末梢神経損傷の治療のための医薬組成物に関する。本発明はまた、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する活性を指標とした、被験物質の末梢神経再生促進活性を評価する方法に関する。
　外傷その他の原因によって末梢神経を損傷した場合、現在行われている治療は、経過観察、縫合、及び自家神経又は神経再生誘導チューブ（人工神経）を用いた再建である。自家神経移植は、末梢神経再建のゴールドスタンダードであるが、移植のために損傷部位以外の健常な自家神経の採取を要するという問題を伴うため、自家神経を犠牲にしない新規の末梢神経再生方法の開発が望まれている。
　末梢神経の再生は、中枢神経と比較すると旺盛ではあるものの、近位部損傷、重度損傷及び再建例における臨床成績は良好ではない。筋肉は神経支配喪失から3～6ヶ月を過ぎると神経再支配の感受性を失う傾向にあるため、末梢神経損傷の治療においてはできる限り早期に軸索を再生して筋肉に到達させて神経再支配を成立させることが重要となる。しかしながら、軸索再生速度は通常1～2 mm/日程度であることを考慮すると、一般に30 cm～90 cm程度の長距離の軸索再生が必要とされる近位部損傷では、再生軸索が筋肉に到達する頃には神経再支配の感受性は失われてしまう。また、重度損傷及び再建例においては、より多くの軸索を再生させる必要がある。
　末梢神経損傷から再生までの過程は次のとおりである。末梢神経が損傷して軸索が断裂すると、断裂部の遠位でワーラー変性を生じ、軸索や髄鞘（ミエリン）の断片化が起こる。断片化した軸索やミエリンはシュワン細胞及びマクロファージの食作用によって除去される。次いで活性化したシュワン細胞が断裂部遠位に整列して軸索再生の足場となることで、軸索の発芽及び伸長が促される。その後、軸索の再髄鞘化と標的器官とのシナプスが再形成されることで神経再生は完了する。
　末梢神経損傷の治療、特に臨床成績が良好でない近位部損傷、重度損傷及び再建例の治療においては、上記の神経再生過程の制御を通じて軸索再生の速度及び量を向上させることが求められる。損傷した末梢神経の再生を促進する手段は複数報告されているが（例えば、特許文献１及び２）、未だ臨床応用に至ったものは存在しない。
WO2018/056412 WO2005/074655
　本発明は、損傷した末梢神経の再生治療に利用可能な、軸索再生を促進するための新たな手段を提供する。
　本発明者らは、好中球がNETsを介して損傷末梢神経の再生過程を遅延していることを見出した。
　本開示は、以下を提供する。
項１．　損傷末梢神経の実質外における好中球細胞外トラップ（Neurophil Extracellular Traps; NETs）の形成を抑制する物質を含む、末梢神経損傷の治療のための医薬組成物。
項２．　損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質が、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質、好中球のNETs産生を阻害する物質、又はNETsを分解する物質である、項１に記載の医薬組成物。
項３．　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質が、好中球に対する抗体及びその抗原結合性断片、好中球に対するアプタマー、好中球遊走刺激因子に対する阻害剤、並びに好中球遊走阻害因子よりなる群から選択される、項２に記載の医薬組成物。
項４．　好中球のNETs産生を阻害する物質が、マクロファージ遊走阻止因子（Macrophage migration inhibitory factor; MIF）の発現を抑制する又は機能を阻害する物質、CXCモチーフ型ケモカイン受容体4（CXCR4）の発現を抑制する又は機能を阻害する物質、及びペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（Peptidylarginine deiminase; PAD4）の発現を抑制する又は機能を阻害する物質よりなる群から選択される、項２に記載の医薬組成物。
項５．　MIFの発現を抑制する又は機能を阻害する物質が、MIFの発現を抑制する核酸、MIFに対する抗体及びその抗原結合性断片、MIFに対するアプタマー、並びにMIF阻害剤よりなる群から選択される、項４に記載の医薬組成物。
項６．　MIF阻害剤がISO-1（(S,R)-3-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid）又は(±)-CPSI 1306（2-[3-(3-(2,4-Difluorophenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazolyl]-1-(4-morpholinyl)ethanone）である、項５に記載の医薬組成物。
項７．　CXCR4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質が、CXCR4の発現を抑制する核酸、CXCR4に対する抗体及びその抗原結合性断片、CXCR4に対するアプタマー、並びにCXCR4阻害剤よりなる群から選択される、項４に記載の医薬組成物。
項８．　CXCR4阻害剤がプレリキサホルである、項７に記載の医薬組成物。
項９．　PAD4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質が、PAD4の発現を抑制する核酸、PAD4に対する抗体及びその抗原結合性断片、PAD4に対するアプタマー、並びにPAD4阻害剤よりなる群から選択される、項４に記載の医薬組成物。
項１０．　PAD4阻害剤がCl-アミジンである、項９に記載の医薬組成物。
項１１．　NETsを分解する物質がDNase Iである、項２に記載の医薬組成物。
項１２．　末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置して用いるための、項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項１３．　損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する活性を指標とした、被験物質の末梢神経再生促進活性を評価する方法。
項１４．　損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する活性が、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する活性、好中球のNETs産生を阻害する活性、又はNETsを分解する活性である、項１３に記載の方法。
項１５．　好中球のNETs産生を阻害する活性が、MIFの発現を抑制する又は機能を阻害する活性、CXCR4の発現を抑制する又は機能を阻害する活性、及びPAD4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質よりなる群から選択される、項１４に記載の方法。
　本開示はまた、以下を提供する。
項１Ａ．　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質、又はMIFの発現を抑制する若しくは機能を阻害する物質を含む、末梢神経損傷の治療のための医薬組成物。
項２Ａ．　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質が、好中球に対する抗体及びその抗原結合性断片、好中球遊走刺激因子に対する阻害剤、並びに好中球遊走阻害因子よりなる群から選択される少なくとも1種の物質である、項１に記載の医薬組成物。
項３Ａ．　MIFの発現を抑制する又は機能を阻害する物質が、MIFの発現を抑制する核酸、MIFに対する抗体及びその抗原結合性断片、並びにMIF阻害剤よりなる群から選択される少なくとも1種の物質である、項１に記載の医薬組成物。
項４Ａ．　MIF阻害剤がISO-1（(S,R)-3-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid）又は(±)-CPSI 1306（2-[3-(3-(2,4-Difluorophenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazolyl]-1-(4-morpholinyl)ethanone）である、項３に記載の医薬組成物。
項５Ａ．　末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置して用いるための、項１～項４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項６Ａ．　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する活性を指標とした、被験物質の末梢神経再生促進活性を評価する方法。
項７Ａ．　MIFの発現を抑制する活性又は機能を阻害する活性を指標とした、被験物質の末梢神経再生促進活性を評価する方法。
　本開示によると、軸索再生の促進を通じて、効果的な末梢神経損傷の治療を実現することができる。
圧挫損傷作成12時間後のラット坐骨神経縦断切片の代表的なHE染色画像である。上段は弱拡大像、中段は神経上膜に相当する領域（弱拡大像の*の領域）の強拡大像、下段は神経実質に相当する領域（弱拡大像の**の領域）の強拡大像である。矢印は好中球を示す。 圧挫損傷作成12時間後のラット坐骨神経損傷部から20 mm遠位における縦断切片の代表的な免疫染色画像である。左側及び中央の３つの画像はいずれもLy-6G免疫染色、I型コラーゲン免疫染色及びDAPI染色の画像をマージしたものであり、左は弱拡大像、中央上は神経上膜に相当する領域（左画像の上側四角枠内）の強拡大像、中央下は神経実質に相当する領域（左画像の下側四角枠内）の強拡大像である。右側の２つの画像はいずれもNeutrophil elastase（NE）免疫染色及びDAPI染色の画像をマージしたものであり、右上は神経上膜に相当する領域の強拡大像、右下は神経実質に相当する領域の強拡大像である。画像内の破線は神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を、矢印は好中球を示す。 圧挫損傷作成12時間後のラット坐骨神経において検出された神経単位面積あたりの好中球数を、損傷部からの距離に対してプロットしたグラフである。 圧挫損傷作成後のラット坐骨神経において検出された神経単位面積あたりの好中球数を、損傷部からの距離及び損傷作成からの経過時間ごとに表したグラフである。 圧挫損傷作成7日後のラット坐骨神経縦断切片の代表的なCD68（マクロファージのマーカー）免疫染色画像である。画像内の破線は、神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を示す。 圧挫損傷作成後のラット坐骨神経において検出された神経実質単位面積あたりのマクロファージ数を、損傷部からの距離及び損傷作成からの経過時間ごとに表したグラフである。 圧挫損傷作成1時間後から7日後までのラット坐骨神経の、損傷部から20 mm遠位における縦断切片の代表的なCD68免疫染色画像である。画像内の破線は、神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を示す。 圧挫損傷作成直後に抗好中球抗体又はコントロール抗体を腹腔内投与したラット（図中、それぞれ、anti-PMN antibody及びCtrl antibody）及び圧挫損傷作成のみを行ったラット（図中、injury alone）における血中好中球数の経時変化を示すグラフである。 圧挫損傷作成直後に抗好中球抗体又はコントロール抗体を腹腔内投与したラット、及び圧挫損傷作成のみを行ったラットの、圧挫損傷作成12時間後の坐骨神経損傷部から5 mm遠位における縦断切片の代表的なHE染色画像である。 圧挫損傷作成直後に抗好中球抗体又はコントロール抗体を腹腔内投与したラット、及び圧挫損傷作成のみを行ったラットの、圧挫損傷作成12時間後の坐骨神経において検出された神経単位面積あたりの好中球数を、損傷部からの距離ごとに表したグラフである。 圧挫損傷作成直後に抗好中球抗体又はコントロール抗体を腹腔内投与したラット、及び圧挫損傷作成のみを行ったラットの、圧挫損傷作成12時間後（上段）及び7日後（下段）の坐骨神経において検出された神経実質単位面積あたりのマクロファージ数を、損傷部からの距離に対してプロットしたグラフである。 圧挫損傷作成直後に抗好中球抗体又はコントロール抗体を腹腔内投与したラット、及び圧挫損傷作成のみを行ったラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なβ3 tubulin免疫染色画像である。 圧挫損傷作成直後に抗好中球抗体又はコントロール抗体を腹腔内投与したラット、及び圧挫損傷作成のみを行ったラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経の軸索再生率を、損傷部からの距離に対してプロットしたグラフである。 圧挫損傷作成直後に抗好中球抗体又はコントロール抗体を腹腔内投与したラット、及び圧挫損傷作成のみを行ったラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なMBP (Myelin Basic Protein) 免疫染色画像（損傷部から25 mm遠位、上段）、及びMBP陽性率のグラフ（下段）である。 好中球又はPBSを静脈内投与したマウス（図中、それぞれ、Neutrophil infusion及びPBS infusion）、及び圧挫損傷作成のみを行ったマウス（図中、injury alone）における、圧挫損傷作成12時間後の血中好中球数を示すグラフである。 好中球又はPBSを静脈内投与したマウスの、圧挫損傷作成12時間後の坐骨神経損傷部から4 mm遠位における横断切片の代表的なHE染色画像及び免疫染色画像である。左側の２つは好中球投与マウスのHE染色画像、中央の２つは好中球投与マウスの免疫染色画像、右側の２つはPBS投与マウスの免疫染色画像である。いずれも下段は神経上膜に相当する領域（対応する上段画像の四角枠内）の強拡大像である。画像内の破線は神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を、破線で囲まれた領域は神経実質を表し、矢印は好中球を示す。 好中球又はPBSを静脈内投与したマウス、及び圧挫損傷作成のみを行ったマウスの、圧挫損傷作成12時間後の坐骨神経において検出された神経単位面積あたりの好中球数を、損傷部からの距離ごとに表したグラフである。 好中球又はPBSを静脈内投与したマウス、及び圧挫損傷作成のみを行ったマウスの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経において検出された神経実質単位面積あたりのマクロファージ数を、損傷部からの距離に対してプロットしたグラフである。 好中球又はPBSを静脈内投与したマウス、及び圧挫損傷作成のみを行ったマウスの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経横断切片の代表的なβ3 tubulin免疫染色画像である。 好中球又はPBSを静脈内投与したマウス、及び圧挫損傷作成のみを行ったマウスの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経の軸索密度を、損傷部からの距離に対してプロットしたグラフである。 好中球又はPBSを静脈内投与したマウス、及び圧挫損傷作成のみを行ったマウスの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なMBP免疫染色画像である。 好中球又はPBSを静脈内投与したマウス、及び圧挫損傷作成のみを行ったマウスの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経のMBP陽性率を、損傷部からの距離ごとに表したグラフである。 好中球による軸索再生過程制御の概念図である。 未処置の正常なラット坐骨神経縦断切片、及び圧挫損傷作成12時間後のラット坐骨神経の損傷部から20 mm遠位における縦断切片の代表的な免疫染色画像である。それぞれCitH3免疫染色、Ly6G免疫染色、CD68免疫染色、DAPI染色の画像又はこれらの複数をマージした画像である。中央上段及び右側上段の画像は弱拡大像（スケールバー100μm）で、それぞれの四角枠内の強拡大像が中央下段及び右側下段の各々３つの画像（スケールバー10μm）である。画像内の破線は神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を、矢印はNETsと好中球の共局在を示す。 PAD4阻害剤のCl-アミジンを含有するシート、DNase Iを含有するシート又は対照シートのいずれかを用いて損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成12時間後の、損傷部位から20 mm遠位における坐骨神経縦断切片の代表的なCitH3及びLy-6G免疫染色画像とCitH3陽性面積のグラフである。各群とも左側の画像は弱拡大像（スケールバー100μm）で、それぞれの四角枠内の強拡大像が右側の画像（スケールバー10μm）である。画像内の破線は神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を示す。 PAD4阻害剤のCl-アミジンを含有するシート、DNase Iを含有するシート又は対照シートのいずれかを用いて損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成12時間後の、損傷部位から20 mm遠位における坐骨神経縦断切片の代表的なCD68免疫染色画像（スケールバー50μm）と、神経実質単位面積あたりのマクロファージ数のグラフである。 DNase Iを含有するシートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なβ3 tubulin免疫染色画像（上段）、及び坐骨神経の軸索再生率を損傷部からの距離ごとに表したグラフ（下段）である。 DNase Iを含有するシートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経において検出された神経実質単位面積あたりのマクロファージ数を、損傷部からの距離に対してプロットしたグラフである。 未処置の正常なラット坐骨神経縦断切片（上段）、及び圧挫損傷作成12時間後のラット坐骨神経の損傷部から10 mm遠位における縦断切片（下段）の代表的なMIF免疫染色画像である。上段の２つ及び下段左側の画像は弱拡大像であり、下段右側３つの画像は、下段左画像内の四角枠で示される神経上膜に相当する領域の強拡大像である。また、右下の「Merge」の表示がある画像は、MIF免疫染色、Ly-6G免疫染色及びDAPI染色の画像をマージしたものである。画像内の破線は、神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を示す。 MIF阻害剤iso-1を含有するシート又は対照シートで損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成12時間後の坐骨神経損傷部から5 mm遠位における縦断切片の代表的なCD68免疫染色画像、及び神経実質単位面積あたりのマクロファージ数のグラフである。 iso-1を含有するシート又は対照シートで損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成12時間後の坐骨神経損傷部から20 mm遠位における縦断切片の代表的なCD68免疫染色画像、及び神経実質単位面積あたりのマクロファージ数のグラフである。 iso-1を含有するシート又は対照シートで損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成12時間後の損傷部から20 mm遠位における坐骨神経縦断切片の代表的な免疫染色画像とCitH3陽性面積のグラフである。各群とも左側の画像は弱拡大像（スケールバー100μm）で、それぞれの四角枠内の強拡大像が右側の画像（スケールバー10μm）である。画像内の破線は神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を示す。 iso-1を含有するシート又は対照シートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なCD68免疫染色画像、及び神経実質単位面積あたりのマクロファージ数のグラフである。 iso-1を含有するシート又は対照シートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なCD163免疫染色画像、及び神経実質単位面積あたりのM2マクロファージ数のグラフである。 iso-1を含有するシート又は対照シートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なβ3 tubulin免疫染色画像、及び坐骨神経の軸索再生率を損傷部からの距離に対してプロットしたグラフである。 iso-1を含有するシート、MIF阻害剤CPSI-1306を含有するシート又は対照シートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なβ3 tubulin免疫染色画像である。 iso-1を含有するシート、MIF阻害剤CPSI-1306を含有するシート又は対照シートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経の軸索再生率を損傷部からの距離に対してプロットしたグラフ（左図）、及び最長軸索長のグラフ（右図）である。 未処置の正常なラット坐骨神経縦断切片、及び圧挫損傷作成12時間後のラット坐骨神経の損傷部から20 mm遠位における縦断切片の代表的な免疫染色画像である。左から2番目の画像はCXCR4免疫染色、左から3番目の画像はLy-6G免疫染色、その他の画像はCitH3免疫染色、Ly-6G免疫染色及びDAPI染色の画像をマージしたものである。左側４つの画像は弱拡大像（スケールバー20μm）で、四角枠内の強拡大像が右側の画像（スケールバー10μm）である。画像内の破線は神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を、矢印はCXCR4と好中球の共局在を示す。 AMD3100を含有するシート又は対照シートで損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成12時間後の損傷部から20 mm遠位における坐骨神経縦断切片の代表的な免疫染色画像とCitH3陽性面積のグラフである。各群とも左側の画像は弱拡大像（スケールバー100μm）で、それぞれの四角枠内の強拡大像が右側の画像（スケールバー10μm）である。画像内の破線は、神経実質と神経実質外（神経上膜）の境界線を示す。 AMD3100を含有するシート又は対照シートで損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成12時間後の、損傷部位から20 mm遠位における坐骨神経縦断切片の代表的なCD68免疫染色画像（スケールバー50μm）と、神経実質単位面積あたりのマクロファージ数のグラフである。 AMD3100を含有するシートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経縦断切片の代表的なβ3 tubulin免疫染色画像（上段）、及び坐骨神経の軸索再生率を損傷部からの距離ごとに表したグラフ（下段）である。 AMD3100を含有するシートで損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を処理したラットの、圧挫損傷作成7日後の坐骨神経において検出された神経実質単位面積あたりのマクロファージ数を、損傷部からの距離に対してプロットしたグラフである。 好中球によるNETsを介した軸索再生過程制御の概念図である。
　以下に示す説明は、代表的な実施形態又は具体例に基づくことがあるが、本発明はそのような実施形態又は具体例に限定されるものではない。また、タンパク質及び遺伝子に関する説明は、特に断らない限り、ヒト由来のタンパク質及び遺伝子を例として行うが、本発明において利用されるタンパク質及び遺伝子はヒト由来のものに限定されず、また本発明の適用対象はヒトに限定されない。
　本明細書において示される各数値範囲の上限値及び下限値は、任意に組み合わせることができる。また、本明細書において「～」又は「-」を用いて表される数値範囲は、特に断りがない場合、その両端の数値を上限値及び下限値として含む範囲を意味する。
　本発明は、一態様において、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質を含む、末梢神経損傷の治療のための医薬組成物を提供する。
　好中球は、顆粒球の１種であり、骨髄で分化成熟した後、通常は骨髄（貯留プール）、末梢血（循環プール）、及び血管壁や組織等（辺縁プール）に貯蔵されている。組織損傷によって炎症が起こると、好中球は、炎症部位で産生される炎症性サイトカインやケモカイン等の好中球遊走刺激因子に反応して損傷部に集積し、組織の修復や再生に関与することが知られている。
　NETsは、好中球によって放出される、シトルリン化されたヒストンタンパク質を含むクロマチン及び細胞内抗菌タンパク質から構成される網目状の構造物である。NETsは、宿主防御や自己免疫疾患に関与することが知られている（Kely Campos Navegantes et al., Journal of Translational Medicine, 2017, vol. 15, no. 36, DOI 10.1186/s12967-017-1141-8）。
　本発明者らは、末梢神経損傷部の遠位では、最初に神経実質外に好中球が集積し、その後、好中球の消失と共に神経実質内にマクロファージが集積すること、好中球の集積を阻害するとマクロファージが早期かつ多量に神経実質内に集積し、軸索再生が促進され、ミエリンクリアランスも促進されること、逆に集積する好中球の数を増加させるとマクロファージの集積は抑制され、軸索再生及びミエリンクリアランスも抑制されることを見出した。
　本発明者らはさらに、末梢神経の損傷部遠位では、NETsが神経実質外に存在し、好中球と局在が重なること、神経実質外におけるNETsの形成を抑制するとマクロファージが早期かつ多量に神経実質内に集積し、軸索再生が促進されることを見出した。NETsの形成を抑制する物質は、末梢神経損傷の治療に有用である。
　末梢神経における神経の実質とは、神経上膜に囲まれた末梢神経の内部領域を意味し、実質には軸索が神経周膜に包まれて形成される神経束が含まれる。神経の実質外とは、神経上膜及びその周辺領域を意味し、特に神経上膜を意味する。損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質としては、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質、好中球のNETs産生を阻害する物質、及びNETsを分解する物質を挙げることができる。
損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質
　本開示において用いられる損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質は、好中球が損傷末梢神経に集積することを阻害する能力を有する任意の物質であり、好ましくは、好中球に対する抗体及びその抗原結合性断片、好中球に対するアプタマー、好中球遊走刺激因子に対する阻害剤、並びに好中球遊走阻害因子よりなる群から選択される少なくとも1種の物質である。
　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質の1つの例は、好中球に対する抗体又はその抗原結合性断片である。好中球に対する抗体は、好中球に、例えば、好中球の細胞表面に存在するタンパク質に結合して、好中球の数を減少させる、又は好中球の機能を阻害することができる抗体であればよく、好中球に対する特異抗体であることが好ましい。好中球に対する特異抗体としては、例えば、Ly-6ファミリーのGPIアンカー型タンパク質であるLy-6G（骨髄細胞分化抗原Gr-1とも呼ばれる）に対する抗体、抗PMN (polymorphonuclear neutrophil)抗体、抗RP3抗体などが挙げられる。
　本開示において、特異抗体は、非標的タンパク質よりも標的タンパク質に優先的に結合することができる抗体、又は標的タンパク質に高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。特異抗体は、非標的タンパク質との結合よりも少なくとも5倍強い、好ましくは少なくとも10倍強い、より好ましくは少なくとも100倍強い、最も好ましくは少なくとも1000倍強い親和性を有して標的タンパク質に結合する抗体であり得る。特異抗体はまた、10-7 M、好ましくは10-8 M、より好ましくは10-9 Mの解離定数を有して標的タンパク質に結合する抗体であってもよい。
　本開示において用いられる抗体は、例えばマウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを包含する任意の種を起源とすることができる。また抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例としてIgG、IgE、IgM、IgD又はIgA）及びサブクラスのものであることができるが、IgGであることが好ましい。
　本開示において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。
　本開示において、抗体の抗原結合性断片は、標的タンパク質と結合する能力を保持した、抗体の部分断片として定義される。抗体の抗原結合性断片は、好ましくは標的タンパク質と特異的に結合する能力を保持した、特異抗体の部分断片であり、例えばFab（fragment of antigen binding）、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（single chain Fv)、ジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv）及びCDRを含むペプチド等であり得るが、これらには限定されない。
　抗体及びその抗原結合性断片は、当業者に公知の方法を用いて作製することができる。例えば、標的タンパク質のアミノ酸配列又はこれをコードするDNAの塩基配列に基づいて遺伝子組み換え手法により標的タンパク質を作製し、これを抗原として適当な動物に免疫することで、さらに当該動物のB細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得ることで作製することができる。ハイブリドーマ法については、例えばMeyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Kaithamana et al. (1999) J.Immunol. 163:5157-5164等を参照されたい。抗体又はその抗原結合性断片は、さらに他の薬物と結合した抗体薬物複合体であってもよい。
　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質の別の例は、好中球に対するアプタマーである。好中球に対するアプタマーは、好中球に、例えば、好中球の細胞表面に存在するタンパク質に結合して、好中球の数を減少させる、又は好中球の機能を阻害することができる。好中球に対するアプタマーの例は、Ly-6Gに対するアプタマーである。
　アプタマーは、その立体構造によって標的物質と特異的に結合する能力を有する分子である。核酸から構成されるアプタマーは核酸アプタマーと、アミノ酸から構成されるアプタマーはペプチドアプタマーと呼ばれる。本開示においては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーのいずれも用いることができる。
　本開示において用いられる核酸アプタマーは、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、又はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの両方を構成単位として含むキメラ核酸であり得る。核酸アプタマーは、当業者に公知の方法、例えばSELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法により作製することができる。ペプチドアプタマーは、当業者に公知の方法、例えばファージディスプレイ法や細胞表層ディスプレイ法等により作製することができる。
　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質のまた別の例は、インターロイキン8（IL-8）、IL-17、Gro α（Growth-related gene products α）、NAP-2（Neutrophil Activating Protein-2）、MIP-2（Macrophage Inflammatory Protein-2）等のサイトカイン、ロイコトリエンB4等の脂質メディエーター、fMLP ( N-formyl-methionyl-leucyl-phenylanine )、C5a等の補体成分といった、好中球の遊走を促す因子（好中球遊走刺激因子、好中球遊走因子又は好中球遊走活性化因子とも呼ばれる）に対して阻害活性を示す物質であり、本明細書中では好中球遊走刺激因子に対する阻害剤と呼ぶ。このような阻害剤の例としては、好中球遊走刺激因子に対する抗体、好中球遊走刺激因子の受容体に対するアンタゴニスト等を挙げることができる。
　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質のさらなる別の例は、コルヒチン、レゾルビン、プロテクチン、17βエストラジオールといった好中球の遊走を阻害する因子（好中球遊走阻害因子とも呼ばれる）である。
好中球のNETs産生を阻害する物質
　NETsは、好中球核内でのペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（Protein Arginine Deiminase 4; PAD4）によるヒストンタンパク質のシトルリン化、クロマチンの脱凝集、核膜の破綻に伴う核内クロマチンの細胞質への流入、その後のクロマチンと顆粒中の抗菌タンパク質との結合によって細胞質内で形成され、好中球の細胞膜破綻に伴って細胞外に放出される。NETsを放出した好中球は、NETosisと呼ばれる細胞死に至る。
　本開示において用いられる好中球のNETs産生を阻害する物質は、MIFの発現を抑制する又は機能を阻害する物質、CXCR4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質、及びPAD4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質よりなる群から、すなわち、MIFの発現を抑制する物質、MIFの機能を阻害する物質、CXCR4の発現を抑制する物質、CXCR4の機能を阻害する物質、PAD4の発現を抑制する物質、及びPAD4の機能を阻害する物質よりなる群から選択することができる。
　MIF（Glycosylation-Inhibiting Factor; GIF、L-dopachrome isomerase、Phenylpyruvate tautomeraseとも呼ばれる）は、T細胞、単球、好中球、マクロファージ等の免疫細胞のほか、脳下垂体細胞、上皮細胞といった多くの細胞で発現する炎症誘発性サイトカインの一種であり、自然免疫及び獲得免疫の両方に関与し、炎症性分子の産生を誘導することが知られている。ヒトMIF遺伝子の塩基配列はNCBI Reference SequenceにNC_000022.11として、mRNAの塩基配列はNM_002415.2として、アミノ酸配列はNP_002406.1として登録されている（いずれも2021年7月19日検索）。
　本発明者らは、損傷12時間後の末梢神経損傷部遠位では、MIFは神経実質外にのみ存在し、好中球と局在が重なること、MIFを阻害すると損傷末梢神経の実質外における好中球のNETs産生が阻害されること、またMIFを阻害するとマクロファージが早期かつ多量に神経実質内に集積し、軸索再生が促進されることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて、一態様において、MIFの発現を抑制する又は機能を阻害する物質を、末梢神経損傷の治療のための医薬組成物に利用するものである。
　本開示において用いられるMIFの発現を抑制する又は機能を阻害する物質は、MIFの遺伝子又はタンパク質レベルでの発現を抑制する能力を有する、又はMIFの機能を阻害する能力を有する任意の物質であり、好ましくは、MIFの発現を抑制する核酸、MIFに対する抗体及びその抗原結合性断片、MIFに対するアプタマー、並びにMIF阻害剤よりなる群から選択される少なくとも1種の物質である。
　MIFの発現を抑制する物質の１つの例は、MIFの発現を抑制する核酸である。MIFの発現を抑制する核酸は、MIF遺伝子からのmRNA（MIF mRNA）の転写を抑制することができる核酸、MIF mRNAを分解することができる核酸、及びMIF mRNAからのタンパク質翻訳を抑制することができる核酸を包含し、これらの例としては、MIF遺伝子の塩基配列又はMIF mRNAの塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンス核酸、又はRNA干渉を引き起こす核酸、例えばsiRNA、shRNA若しくはmiRNAを挙げることができる。
　MIFの機能を阻害する物質の１つの例は、MIFに対する抗体、好ましくはMIFに対する特異抗体、又はMIFに対する抗体の抗原結合性断片である。MIFの機能を阻害する物質の別の例は、MIFに対するアプタマーである。抗体、特異抗体、抗原結合性断片及びアプタマーの定義その他の説明は、上で述べたとおりである。
　MIFの機能を阻害する物質の別の例は、MIF阻害剤である。MIF阻害剤は、MIFの機能を阻害する能力を有する任意の物質である。MIF阻害剤の例としては、ISO-1（CAS No.478336-92-4、(S,R)-3-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid）、(±)-CPSI 1306（CAS No.1309793-47-2、2-[3-(3-(2,4-Difluorophenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazolyl]-1-(4-morpholinyl)ethanone）、4-IPP（CAS No.41270-96-6、4-Iodo-6-phenylpyrimidine）、イブジラスト（Ibudilast、CAS No.50847-11-5、1-[2-(1-Methylethyl)pyrazolo[1,5-a]pyridin-3-yl]-2-methylpropan-1-one）、BTZO-1（CAS No.99420-15-2、2-Pyridin-2-yl-4H-1,3-benzothiazin-4-one）、Chicago Sky Blue 6B (CAS No.2610-05-1、6,6'-[(3,3-Dimethoxy[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl)bis(azo)]bis[4-amino-5-hydroxy-1,3-napthalenedisulphonic acid] tetrasodium salt )、p425 ( CAS No.259444、 Tetrasodium 6,6'-[(3,3'-dimethoxy[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl)bis(azo)]bis[4-amino-5-hydroxynaphthalene-1,3- disulphonate]）等を挙げることができる。
　好ましい実施形態において、MIFの発現を抑制する又は機能を阻害する物質はMIF阻害剤、特にISO-1又は(±)-CPSI 1306である。
　CXCR4は、CXCモチーフ型ケモカイン受容体ファミリーに属するGタンパク質共役型受容体であり、CXCモチーフ型ケモカインリガンド12（CXCL12）及び間質細胞由来因子1（SDF-1）をリガンドとし、免疫細胞の遊走を誘導することが知られている。ヒトCXCR4遺伝子の塩基配列はNCBI Reference SequenceにNC_000002.12として、mRNAの塩基配列はNM_001008540.2、NM_001348056.2、NM_001348059.2、NM_001348060.2、NM_003467.3として、アミノ酸配列はNP_001008540.1、NP_001334985.1、NP_001334988.1、NP_001334989.1、NP_003458.1として登録されている（いずれも2021年12月20日検索）。
　本発明者らは、末梢神経の損傷部遠位では、CXCR4が神経実質外に存在し、好中球と局在が重なること、CXCR4を阻害すると神経実質外における好中球のNETs産生が阻害されること、またCXCR4を阻害するとマクロファージが早期かつ多量に神経実質内に集積し、軸索再生が促進されることを見出した。CXCR4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質は、末梢神経損傷の治療に有用である。
　CXCR4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質は、CXCR4の遺伝子又はタンパク質レベルでの発現を抑制する能力を有する、又はCXCR4の機能を阻害する能力を有する任意の物質であり、好ましくは、CXCR4の発現を抑制する核酸、CXCR4に対する抗体及びその抗原結合性断片、CXCR4に対するアプタマー、並びにCXCR4阻害剤よりなる群から選択される少なくとも1種の物質である。
　CXCR4の発現を抑制する物質の１つの例は、CXCR4の発現を抑制する核酸である。CXCR4の発現を抑制する核酸は、CXCR4遺伝子からのmRNA（CXCR4 mRNA）の転写を抑制することができる核酸、CXCR4 mRNAを分解することができる核酸、及びCXCR4 mRNAからのタンパク質翻訳を抑制することができる核酸を包含し、これらの例としては、CXCR4遺伝子の塩基配列又はCXCR4 mRNAの塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンス核酸、又はRNA干渉を引き起こす核酸、例えばsiRNA、shRNA若しくはmiRNAを挙げることができる。
　CXCR4の機能を阻害する物質の１つの例は、CXCR4に対する抗体、好ましくはCXCR4に対する特異抗体、又はCXCR4に対する抗体の抗原結合性断片である。CXCR4の機能を阻害する物質の別の例は、CXCR4に対するアプタマーである。抗体、特異抗体、抗原結合性断片及びアプタマーの定義その他の説明は、上で述べたとおりである。
　CXCR4の機能を阻害する物質の別の例は、CXCR4阻害剤である。CXCR4阻害剤は、CXCR4の機能を阻害する能力を有する任意の物質である。CXCR4阻害剤の例としては、プレリキサホル（Plerixafor、AMD3100とも呼ばれる。一般式1,4-Bis[(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl]benzene）、WZ811（CAS No. 55778-02-4、一般式1,4-Benzenedimethanamine, N1,N4-di-2-pyridinyl-）、Motixafortide (BL-8040、CAS No.664334-36-5 、一般式L-Argininamide, N2-(4-fluorobenzoyl)-L-arginyl-L-arginyl-3-(2-naphthalenyl)-L-alanyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-N5-(aminocarbonyl)-L-ornithyl-L-lysyl-D-lysyl-L-prolyl-L-tyrosyl-L-arginyl-N5-(aminocarbonyl)-L-ornithyl-L-cysteinyl-, cyclic (4→13)-disulfide）等を挙げることができる。
　PAD4は、ヒストンタンパク質（H3、H4等）の特定のアルギニン残基をシトルリン残基に返還することでNETs形成を誘導する酵素である。ヒトPAD4遺伝子の塩基配列はNCBI Reference SequenceにNC_000001.11として、mRNAの塩基配列はNM_012387.3として、アミノ酸配列はNP_036519.2として登録されている（いずれも2021年12月20日検索）。
　本発明者らは、PAD4を阻害すると損傷末梢神経の実質外における好中球のNETs産生が阻害されること、またPAD4を阻害するとマクロファージが早期かつ多量に神経実質内に集積することを見出した。マクロファージの神経実質内への集積は、軸索再生の促進をもたらし得ることから、PAD4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質は、末梢神経損傷の治療に有用である。
　本開示において用いられるPAD4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質は、PAD4の遺伝子又はタンパク質レベルでの発現を抑制する能力を有する、又はPAD4の機能を阻害する能力を有する任意の物質であり、好ましくは、PAD4の発現を抑制する核酸、PAD4に対する抗体及びその抗原結合性断片、PAD4に対するアプタマー、並びにPAD4阻害剤よりなる群から選択される少なくとも1種の物質である。
　PAD4の発現を抑制する物質の１つの例は、PAD4の発現を抑制する核酸である。PAD4の発現を抑制する核酸は、PAD4遺伝子からのmRNA（PAD4 mRNA）の転写を抑制することができる核酸、PAD4 mRNAを分解することができる核酸、及びPAD4 mRNAからのタンパク質翻訳を抑制することができる核酸を包含し、これらの例としては、PAD4遺伝子の塩基配列又はPAD4 mRNAの塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンス核酸、又はRNA干渉を引き起こす核酸、例えばsiRNA、shRNA若しくはmiRNAを挙げることができる。
　PAD4の機能を阻害する物質の１つの例は、PAD4に対する抗体、好ましくはPAD4に対する特異抗体、又はPAD4に対する抗体の抗原結合性断片である。PAD4の機能を阻害する物質の別の例は、PAD4に対するアプタマーである。抗体、特異抗体、抗原結合性断片及びアプタマーの定義その他の説明は、上で述べたとおりである。
　PAD4の機能を阻害する物質の別の例は、PAD4阻害剤である。PAD4阻害剤は、PAD4の機能を阻害する能力を有する任意の物質である。PAD4阻害剤の例としては、Cl-アミジン（N2-Benzoyl-N5-(1-imino-2-chloroethyl)-L-ornithinamide・trifluoroacetic acid）、BMS-P5(一般名なし、Cas #, 1550371-22-6)、GSK121 trifluoroacetate（一般名なし、Cas #, 1652591-80-4）等を挙げることができる。
　また、適当な発現プロモーターの制御下に置かれることで上述のMIF、CXCR4及びPAD4のいずれかに対するアンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸を転写誘導することのできるDNA、及びこれらのアンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸を構成するヌクレオチド残基の一部が修飾された核酸も、アンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸と機能的に等価な核酸として、本開示にいう発現を抑制する核酸に包含される。ヌクレオチド残基の修飾としては、2'O-メチル化、2'-F化、4'-チオ化等を挙げることができる。
　さらに、発現を抑制するRNAのリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラRNAもまた、本開示にいう発現を抑制する核酸に包含される。ヌクレオチド類似体としては、例えば、5位修飾ウリジン又はシチジン、例えば5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン等；8位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン等；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ-アデノシン等；O-又はN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシン等を挙げることができる。修飾される又は置換される塩基の種類又は個数は、ターゲット分子の発現を抑制する能力を失わない限り、特に制限はない。
　発現を抑制する核酸は、遺伝子組み換え技術又は化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。遺伝子組み換え方法、核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法は、当業者に周知である。
　好中球のNETs産生を阻害する物質の他の例としては、WO2014/168253に記載のラクトフェリン；WO2018/131724に記載のトロンビン様酵素、例えばバトロキソビン、アンクロッド、クロタラーゼ等；WO2019/208805に記載のBtk阻害活性を有する化合物、例えばチラブルチニブ、イブルチニブ、スペブルチニブ、アカラブルチニブ、エヴォブルチニブ、ポセルチニブ、フェネブルチニブ、ヴェカブルチニブ、ザヌブルチニブ、PRN-1008、BMS-986142、免疫グロブリン大量療法（High dose immunoglobulin therapy）において用いられる用量の、例えばスルホ化人免疫グロブリンG等の免疫グロブリン（Uozumi et al., Modern Rheumatology, 2020, 30(3):544-550. doi: 10.1080/14397595.2019.1602292.）、PA-dPEG24(ペプチド：IALILEPICCQERAAのC末端に24merのPEG部分が付加されたPEG修飾ペプチド)（Hair et al.PLoS One. 2019, 14(12):e0226875. doi: 10.1371/journal.pone.0226875.）、Prostaglandin E2（inhibition of NETosis through cAMP-PKA）（Shishikura et al., British Journal of Pharmacology, 2016, 173(2):319-31. doi: 10.1111/bph.13373.）等を挙げることができる。
NETsを分解する物質
　本発明者らは、NETsを分解すると、マクロファージが早期かつ多量に損傷末梢神経実質内に集積し、軸索再生が促進されることを見出した。NETsを分解する物質は、末梢神経損傷の治療に有用である。
　NETsを分解する物質は、NETsを構成するクロマチン又は抗菌タンパク質を、とりわけクロマチンを分解する能力を有する任意の物質であり、その例としては、DNA分解酵素、例えばDNase I、Staphylokinase（Thammavongsa et al., Science. 2013. 342(6160): 863-866. doi: 10.1126/science.1242255）等を挙げることができる。
医薬組成物
　本開示において、医薬組成物は、末梢神経損傷の治療に有効な量の、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質を含む。医薬組成物は、一例として、末梢神経損傷の治療に有効な量の、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質又はMIFの発現を抑制する若しくは機能を阻害する物質を含む。ここで有効量は、用法、対象の年齢、性別、体重、末梢神経損傷の部位及び程度その他の要因に応じて適宜決定される。
　医薬組成物は、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質、MIFの発現を抑制する物質及びMIFの機能を阻害する物質よりなる群から選択される少なくとも1種の物質を含み得る。すなわち、医薬組成物は、1又は複数種の損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質を含んでもよく、1又は複数種のMIFの発現を抑制する物質を含んでもよく、1又は複数種のMIFの機能を阻害する物質を含んでもよい。
　同様に、医薬組成物は、1又は複数種のCXCR4の発現を抑制する物質を含んでもよく、1又は複数種のCXCR4の機能を阻害する物質を含んでもよく、1又は複数種のPAD4の発現を抑制する物質を含んでもよく、1又は複数種のPAD4の機能を阻害する物質を含んでもよく、1又は複数種のNETsを分解する物質を含んでもよい。
　医薬組成物は、末梢神経損傷の治療のための他の薬剤、又は薬学的に許容される添加剤、例えば緩衝剤、安定剤、保存剤、賦形剤等を含むことができる。薬学的に許容される添加剤は当業者に周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、適宜選択して使用することができる。
　本明細書において用いられる用語「治療」は、疾患又は状態の治癒、一時的寛解等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的介入を包含する。したがって、末梢神経損傷の治療とは、損傷した末梢神経の再生促進、末梢神経損傷による機能障害の改善、機能障害の進行の遅延又は停止、発症の予防等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　医薬組成物は、軸索断裂が生じた末梢神経損傷に対して用いることができ、特に、自然回復が見込めない重度の末梢神経損傷に対して好ましく用いられる。医薬組成物によって治療することができる末梢神経損傷の好ましい例は、外傷性末梢神経損傷（創傷、圧迫、牽引、切断、欠損、医原性等）である。 
　医薬組成物は、末梢神経損傷を有する対象、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物といった哺乳動物に適用される。好ましい対象はヒトである。
　医薬組成物は、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制することができるかぎり、例えば損傷末梢神経への好中球の集積を阻害することができるかぎり、又は損傷末梢神経におけるMIFの発現を抑制すること若しくは機能を阻害することができるかぎり、その剤形及び投与方法に制限はない。
　例えば、医薬組成物を溶液剤の形態に調製し、これを静脈内又は腹腔内に投与することによって用いることができる。あるいは、医薬組成物を溶液剤の形態に調製し、これをそのまま、あるいは生体適合性医療材料に含浸させた状態で、末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置することによって用いることもできる。ここで配置は、例えば、末梢神経の損傷部遠位側周辺への溶液剤の注射によって行われてもよく、溶液剤を生体適合性医療材料に含浸させ、これを末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置することによって行われてもよい。
　また、医薬組成物を、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質を保持した、例えば損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質又はMIFの発現を抑制する若しくは機能を阻害する物質を保持した生体適合性医療材料の形態に調製し、この生体適合性医療材料を末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置することによって用いることもできる。ここで前記物質の生体適合性医療材料への保持方法は任意であり、例えば、前記物質を生体適合性医療材料に直接固定してもよく、適当なリンカー分子又はアダプター分子を介して固定してもよく、またバインダー又はコーティング剤を用いて固定してもよい。前記物質は、非特異的吸着によって生体適合性医療材料に保持されてもよい。また、生体適合性医療材料が吸水性材料である場合、前記物質を含む液体を生体適合性医療材料に含浸させることによって、前記物質を生体適合性医療材料に保持させてもよい。さらに、生体適合性医療材料がゲル状材料である場合、ゲルの作製過程で原料溶液に前記物質を含ませることによって、前記物質を生体適合性医療材料に保持させてもよい。
　損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質を保持した生体適合性医療材料の形態に調製された、例えば損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質又はMIFの発現を抑制する若しくは機能を阻害する物質を保持した生体適合性医療材料の形態に調製された医薬組成物は、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質を保持した、例えば損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質又はMIFの発現を抑制する若しくは機能を阻害する物質を保持した、末梢神経損傷の治療のための医療材料と表すこともできる。
　生体適合性医療材料の例としては、ポリフッ化エチレン、ポリスチレン等のポリマー化合物、シリカ等の無機化合物、生分解性ポリマー等を挙げることができ、生分解性ポリマーが好ましい。生分解性ポリマーとしては、例えば合成高分子材料ではポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、その他乳酸－グリコール酸共重合体等の上記の共重合体；無機材料ではβ－りん酸三カルシウム、炭酸カルシウム等；天然高分子材料ではコラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、アガロース、キトサン、フィブリン、フィブロイン、キチン、セルロース、シルク等が挙げられる。
　生体適合性医療材料の形状は、末梢神経の損傷部遠位側周辺への配置に適した形状であればよく、例えばシート状又はゲル状である。シート状の医療材料は、末梢神経損傷部の遠位を被覆することで用いることができる。ゲル状の医療材料、例えばフィブリン糊、アルギン酸等は、末梢神経の損傷部遠位側周辺に噴霧又は塗布する、あるいは損傷部遠位側に留置することで用いることができる。
　後述の実施例に示されるように、医薬組成物は、末梢神経の損傷直後から損傷部遠位の神経実質外に好中球が集積してその後消失するまでの期間内のどこかで、比較的短時間、ワーラー変性を生じる末梢神経の損傷部遠位側周辺に作用させることで、軸索再生を促進することができる。したがって、医薬組成物は、損傷を有する末梢神経の全体に存在させる必要はなく、また末梢神経損傷の直後から軸索再生が完了するまでの期間の全体にわたって存在させる必要はない。好ましい実施形態において、医薬組成物は、末梢神経損傷後、損傷部遠位の神経実質外に好中球が集積している期間内のどこかで、例えば、末梢神経の損傷直後から損傷部遠位の神経実質外に好中球が集積してその後消失するまでの期間内のどこかで、比較的短い時間、例えば30分から7日間程度の長さの時間、末梢神経の損傷部遠位側周辺、特に損傷部遠位側近傍の周辺に配置して用いることができる。
　例えば、医薬組成物は、末梢神経損傷の直後、3時間後、6時間後又は9時間後を始期として、末梢神経損傷の12時間後、15時間後、18時間後、21時間後又は24時間後を終期とする期間内の、比較的短い時間、末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置して用いることができる。また、医薬組成物は、末梢神経損傷の直後から24時間後までの期間、3時間後から18時間後までの期間、6時間後から15時間後までの期間、又は9時間後から12時間後までの期間内の、比較的短い時間、末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置して用いることができる。
　また、末梢神経再建術、縫合術などを損傷後しばらく時間が経過した後に実施する場合、その手術侵襲によって、末梢神経損傷直後と同様に好中球が浸潤する可能性がある。このように末梢神経損傷から時間が経過していたとしても、損傷直後と同様に神経実質外への好中球の集積が認められる場合には医薬組成物による末梢神経損傷の治療は可能である。好ましい実施形態において、医薬組成物は、末梢神経損傷後、損傷部遠位の神経実質外に好中球が集積している期間内のどこかで、例えば手術侵襲の直後から損傷部遠位の神経実質外に好中球が集積してその後消失するまでの期間内のどこかで、比較的短い時間、例えば30分から7日間程度の長さの時間、末梢神経の損傷部遠位側周辺、特に損傷部遠位側近傍の周辺に配置して用いることができる。
　例えば、医薬組成物は、手術侵襲の直後、3時間後、6時間後又は9時間後を始期として、手術侵襲の12時間後、15時間後、18時間後、21時間後又は24時間後を終期とする期間内の、比較的短い時間、末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置して用いることができる。また、医薬組成物は、手術侵襲の直後から24時間後までの期間、3時間後から18時間後までの期間、6時間後から15時間後までの期間、又は9時間後から12時間後までの期間内の、比較的短い時間、末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置して用いることができる。
　医薬組成物を末梢神経損傷部遠位側周辺に配置する時間は、例えば、30分間以上、60分間以上、又は90分間以上であり得て、7日間以下、24時間以下、12時間以下、6時間以下、4時間以下、又は3時間以下であり得る。
　例示的な実施形態において、医薬組成物は、末梢神経損傷の9時間後から12時間後までの期間内に、30分間～3時間、末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置して用いられ得る。
　医薬組成物はこのように時間的及び空間的に限定された処置によっても効果を発揮し得ることから、例えば末梢神経損傷の症例において神経縫合術を行う際、末梢神経の損傷部遠位側近傍の周辺に医薬組成物を配置して神経縫合を行い、配置から数十分から数時間程度、例えば30分から3時間程度が経過した後に医薬組成物を取り除くこともできる。
　本発明は、一態様において、末梢神経損傷を有する対象に、有効量の損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質を含む医薬組成物を、例えば損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質又はMIFの発現を抑制する若しくは機能を阻害する物質を含む医薬組成物を適用することを含む、末梢神経損傷を治療する方法を提供する。ある実施形態において、適用は、好ましくは、末梢神経の損傷部遠位側周辺、特に損傷部遠位側近傍の周辺への医薬組成物の配置によって行われる。本発明はまた、一態様において、末梢神経損傷の治療における使用のための、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質を提供する。本発明はさらに、一態様において、医薬組成物の製造における、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質の使用を提供する。ここで各用語の定義その他の説明は、上で述べたとおりである。
評価方法
　本発明は、一態様において、損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する活性を指標とした、被験物質の末梢神経再生促進活性を評価する方法を提供する。損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する活性としては、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する活性；好中球のNETs産生を阻害する活性、例えばMIFの発現を抑制する又は機能を阻害する活性、CXCR4の発現を抑制する又は機能を阻害する活性、及びPAD4の発現を抑制する又は機能を阻害する活性；並びにNETsを分解する活性を挙げることができる。
　ある実施形態において、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する活性を指標とした評価方法は、in vitroで、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおける好中球の生存率又は遊走能を比較することで、被験物質の末梢神経再生促進活性を判定することを含む。この実施形態において、好中球の生存率又は遊走能を低下させた被験物質は、末梢神経再生促進活性を有すると判定することができる。
　別の実施形態において、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する活性を指標とした評価方法は、in vivoで、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおける血中好中球数又は末梢神経損傷部に集積した好中球数を比較することで、被験物質の末梢神経再生促進活性を判定することを含む。この実施形態において、血中好中球数又は末梢神経損傷部に集積した好中球数を減少させた被験物質は、末梢神経再生促進活性を有すると判定することができる。
　ある実施形態において、好中球のNETs産生を阻害する活性を指標とした評価方法は、in vitroで、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるMIF、CXCR4又はPAD4のいずれかの遺伝子（以下、指標遺伝子と呼ぶ）のプロモーター活性を比較することで、被験物質の末梢神経再生促進活性を判定することを含む。この実施形態において、評価方法は、例えば、被験物質を、指標遺伝子の発現を制御するプロモーター領域の制御下にマーカー遺伝子を有する核酸を含む細胞と共に、当該プロモーターによるマーカー遺伝子の発現が誘導される条件下でインキュベートするステップ；前記細胞におけるマーカー遺伝子由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたマーカー遺伝子由来シグナルの強度を、被験物質非存在下でのマーカー遺伝子由来シグナルの強度と比較するステップ；及びマーカー遺伝子由来シグナルの強度を減少させた被験物質を、末梢神経再生促進活性を有すると判定するステップを含み得る。
　マーカー遺伝子は、当該遺伝子の発現誘導を検出し得るものであれば特に制限はなく、例えばGFP等の蛍光タンパク質やルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質をコードする遺伝子、又は薬剤耐性遺伝子や細胞の栄養要求性を補完することができる遺伝子といった、細胞にフェノタイプ変化を与える遺伝子等を利用することができる。
　指標遺伝子のプロモーター領域の制御下にマーカー遺伝子を有する核酸を含む細胞は、例えば、元来、指標遺伝子を有する細胞中の指標遺伝子のオープンリーディングフレーム領域の塩基配列を、マーカー遺伝子をコードする塩基配列に組み換えることで作製することができる。また、ヒトゲノム塩基配列情報を元にして、ヒトの指標遺伝子のプロモーター領域とその制御下に組み換えたマーカー遺伝子とを含む発現ベクターを構築し、適当な細胞に当該発現ベクターを導入することで作製することもできる。
　インキュベーションは、適当な容器内の培地又は緩衝液中で、前記細胞と被験物質とを共存させることにより行うことができる。インキュベーションの温度、時間等の条件は、細胞がマーカー遺伝子を発現することができる条件であればよい。また、マーカー遺伝子由来シグナルの測定は、用いられるマーカー遺伝子に適した方法によって行うことができる。
　さらなる実施形態において、評価方法は、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおける指標遺伝子の発現又はMIF、CXCR4又はPAD4のいずれかのタンパク質（以下、指標タンパク質と呼ぶ）の発現を比較することで、被験物質の末梢神経再生促進活性を判定することを含む。この実施形態において、評価方法は、例えば、被験物質を、指標遺伝子又は指標タンパク質を発現することができる細胞と共にインキュベートするステップ；インキュベート後の前記細胞における指標遺伝子又は指標タンパク質由来シグナルの強度を測定するステップ；測定された指標遺伝子又は指標タンパク質由来シグナルの強度を被験物質非存在下での指標遺伝子又は指標タンパク質由来シグナルの強度と比較するステップ；及び指標遺伝子又は指標タンパク質由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、末梢神経再生促進活性を有すると判定するステップを含み得る。
　指標遺伝子又は指標タンパク質を発現することができる細胞は、ヒトの指標遺伝子又は指標タンパク質を発現することが好ましく、例えばヒト指標遺伝子、例としてヒトMIF遺伝子を組み込んだ培養細胞株を用いることができる。
　インキュベーションは、適当な容器内の培地又は緩衝液中で、前記細胞と被験物質とを共存させることにより行うことができる。インキュベーションの温度、時間等の条件は、細胞が指標遺伝子又は指標タンパク質を発現することができる条件であればよい。
　指標遺伝子由来シグナルの測定は、指標遺伝子の塩基配列情報を利用したハイブリダイゼーション、定量的PCR、RNA-Seqといった、特定の遺伝子発現を検出し定量することのできる一般的な方法によって行うことができる。また、指標タンパク質由来シグナルの測定は、指標タンパク質に対する特異抗体を用いたELISA、ウェスタンブロッティング等の免疫学的検出法といった、特定のタンパク質発現を検出し定量することができる一般的な方法によって行うことができる。
　指標遺伝子又は指標タンパク質の発現が誘導される条件下で、被験物質とインキュベートしていない細胞と比べて、被験物質とインキュベートした細胞において指標遺伝子又は指標タンパク質由来シグナルの強度を低減させた被験物質は、末梢神経再生促進活性を有すると判定することができる。
　また別の実施形態において、好中球のNETs産生を阻害する活性を指標とした評価方法は、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるMIFの機能、CXCR4の機能又はPAD4の機能を比較することで、被験物質の末梢神経再生促進活性を判定することを含む。例えば、好中球のNETs産生を阻害する活性を指標とした評価方法は、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるMIFのマクロファージ遊走阻止活性を比較することで、被験物質の末梢神経再生促進活性を判定することを含む。この実施形態において、MIFの機能を阻害する活性があると判定された被験物質は、末梢神経再生促進活性を有すると評価することができる。被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるMIFの活性比較は、公知のMIF阻害剤の阻害作用の評価又はスクリーニングにおいて採用されている方法を利用して行うことができる。
　さらに別の実施形態において、NETsを分解する活性を指標とした評価方法は、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるNETsの分解を比較することで、被験物質の末梢神経再生促進活性を判定することを含む。この実施形態において、評価方法は、例えば、被験物質を、好中球に産生させたNETsと共にインキュベートするステップ；インキュベート後のNETs由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたNETs由来シグナルの強度を被験物質非存在下でのNETs由来シグナルの強度と比較するステップ；及びNETs由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、末梢神経再生促進活性を有すると判定するステップを含み得る。NETs由来シグナルは、例えば、シトルリン化ヒストンH3等の公知のNETsマーカー分子に由来するシグナルであり、免疫学的検出法等の当該分子に適した方法で測定することができる。この実施形態において、NETsを分解する活性があると判定された被験物質は、末梢神経再生促進活性を有すると評価することができる。
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
材料と方法
（１）動物実験
　麻酔下のLewisラット（雄、12-16週齢）又はC57BL/6マウス（雄 8-10週齢）を腹臥位に置き、左臀部から左大腿遠位部まで縦方向の皮膚切開を行い、坐骨神経全体を露出させた。マイクロモスキート鉗子（Fine Science Tools, No.13010-12）で圧挫損傷を作成した。圧挫部の神経上膜に8-0Nylon糸をかけ、マーキングした後、閉創した。試験例２、実施例１～４では圧挫損傷作成後の動物に所定の処置を行った。
　圧挫損傷作成から所定時間が経過した後、麻酔下で動物の右心耳を切開して放血を行うとともに左心にPBS溶液を流して脱血を行った。4％パラホルムアルデヒド添加PBSを灌流して経心的に灌流固定を行った後、坐骨神経を摘出した。
（２）GFP標識好中球の調製
　試験例２で使用したGFP標識された好中球は、以下のようにして調製した。C57BL/6 GFPマウス( 8-10週齢 ) の大腿骨と下腿骨の骨髄細胞をPBSを用いて排出させて採取した。骨髄細胞に含有している赤血球をRBC lysis buffer (フナコシ)で溶解し骨髄細胞を精製させた。Neutrophil isolation kit, mouse ( Miltenyi Biotec )を用いて骨髄細胞から好中球を単離させた。
（３）免疫組織化学染色
　動物から摘出した坐骨神経は、4% PFA中に4℃で一晩固定した後、30% Sucrose/PB 溶液に移して24時間以上静置した。クライオスタットを用いて10μm厚の坐骨神経縦断切片を、又はマウスの場合は所定位置での横断切片を作成した。切片を5% Normal horse serum（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）及び0.25% Triton X-100（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を含有したTBS（pH 8.4）で1時間ブロッキングした後、一次抗体含有TBSに4℃で一晩、さらに二次抗体含有TBSに室温で1時間浸し染色を行った。TBSで洗浄後、DAPIで対比染色を行った。染色後、組織を、蛍光顕微鏡BZ-X710（KEYENCE）を用いて観察した。画像解析はImage J（Schneider et al., 2012）を用いて行った。
　使用した一次抗体
好中球マーカー：Ly-6G（rat 抗Ly6G抗体, Gentex Cat# GTX40913）、Neutrophil elastase（NE）（rabbit, 抗neutrophil elastase抗体, Abcam, Cat# ab68672）
マクロファージマーカー：CD68（mouse, 抗CD68抗体, Bio-rad, Cat# MCA341R）
髄鞘マーカー：MBP（chicken Anti-MBP抗体, Aves lab, Cat# AB_2313550）
軸索マーカー：β3 tubulin（rabbit, 抗 β3tubulin抗体, Covance, Cat# PRB-435P）
NETsマーカー：シトルリン化ヒストンH3（CitH3）（rabbit, 抗CitH3抗体, Abcam #ab5103）
I型コラーゲン（rabbit, 抗type1 collagen抗体, Southernbiotech, Cat# 1310-01）
MIF（rabbit, 抗MIF抗体, Thermo Scientific, Cat# PA527343）
CXCR4（rabbit, 抗CXCR4抗体, Novus #NB100-56437）
　二次抗体は、一次抗体の宿主動物種及び分子種に応じて、多重染色を考慮して適宜選択したものを使用した。
（４）軸索再生
　坐骨神経縦断切片のβ3 tubulin免疫染色画像において、損傷部遠位方向に5 mm間隔で垂直線を設定し、各々の線を横切る軸索数を当該線の長さで割って軸索密度を算出した。各位置における軸索密度を、損傷部から1.5 mm近位にある無損傷部位における軸索密度で割って、軸索再生率を算出した。また試験例２においては、坐骨神経横断切片のβ3 tubulin免疫染色画像に含まれる軸索数を、切片の面積で割ることで、軸索密度を算出した。
統計処理
　実験データは、平均値±標準誤差で表した。統計解析は統計解析ソフトJMP Pro 11.0（SAS Institute）を用いて行った。2群間の比較にはStudentのt検定を用いた。多群間の比較にはTukey検定を用いた。p値0.05未満を有意とした。
試験例１　末梢神経損傷部における好中球及びマクロファージの時空間的分布解析
（１）好中球
　ラットの坐骨神経に圧挫損傷を作成し、12時間後に坐骨神経を摘出し、縦断切片のHE染色及び免疫組織化学染色を行った。損傷部から5 mm近位（-5 mm）～25mm遠位までの代表的なHE染色画像を図１に、免疫染色画像を図２に示す。好中球は、損傷部及びその5 mm遠位では神経実質及び神経実質外（以下、「神経実質外」は「神経上膜」と同義で用いる）の両方で観察された一方、15 mm及び25 mm遠位のワーラー変性部では神経実質には存在せず、実質外にのみ存在していた。
　また、HE染色画像から神経内（実質及び実質外の両方を含む）の好中球数をカウントし、好中球の空間的分布を調べた（n＝3）。好中球は、損傷部遠位のワーラー変性を生じている部位に多く分布していることが確認された（図３）。
　さらに、好中球の時間的分布を調べるため、圧挫損傷を作成したラットから、損傷作成の1時間後、6時間後、12時間後、1日後、3日後又は7日後に坐骨神経を摘出し、上記と同様にして免疫組織化学染色を行い、神経内の好中球数をカウントした（n＝3）。損傷部遠位における好中球数の増加は、損傷から12時間後にピークとなり、3日後にはほぼ消失していた（図４）。
（２）マクロファージ
　圧挫損傷作成の7日後にラットから摘出した坐骨神経の縦断切片について、マクロファージマーカーであるCD68に対する免疫組織化学染色を行った。損傷部から5 mm～30 mm遠位までの代表的免疫染色画像を図５に示す。CD68陽性細胞は、ワーラー変性を生じた神経実質内に一様に分布していることが確認された。
　また、マクロファージの時間的分布を調べるため、圧挫損傷を作成したラットから、損傷作成の1時間後、6時間後、12時間後、1日後、3日後又は7日後に坐骨神経を摘出し、上記と同様にして坐骨神経の免疫組織化学染色を行い、神経実質内に存在するCD68陽性細胞をマクロファージとしてカウントした。損傷部遠位におけるマクロファージ数は、損傷3日後から増加し、7日後にピークとなった（図６）。マクロファージは、損傷12時間後には、好中球同様に神経上膜に集積していた（図７）。
実施例１　抗好中球抗体が神経再生過程に及ぼす影響の評価
　１ml/kgの抗Polymorphonuclear（PMN）抗体（rabbit 抗rat PMN抗体 , CEDARLANE, Cat AIAD51140）又はコントロール抗体を0.1 ml/ 100g体重の用量でラットに腹腔内投与し（n＝3）、3時間後、坐骨神経に圧挫損傷を作成した。また、圧挫損傷の作成のみを行った群を対照として用意した（n＝3）。腹腔内投与後、経時的に採血してギムザ染色を行い、染色された有核細胞の総数に対する多形核細胞の割合を血中好中球数（％）として算出した。また、損傷作成の12時間後又は7日後に坐骨神経を摘出し、縦断切片のHE染色及び免疫組織化学染色を行った。染色画像から神経内の好中球数及び神経実質内のマクロファージ数をカウントし、軸索再生率を算出した。また、MBP免疫染色画像中のMBP陽性領域の面積を全体の面積で割って、軸索デブリス量の指標となるMBP陽性率を算出した。
　血中好中球数の経時変化を図８に示す。injury alone群及びコントロール抗体投与群では、損傷12時間後をピークとして血中好中球数が増加しており、循環プールへの好中球の動員が認められた。一方、抗好中球抗体投与群では、損傷後も血中好中球数は大きく変動しなかった。
　損傷12時間後の損傷部から5 mm遠位の代表的なHE染色画像を図９に、損傷部遠位における好中球の分布を図１０に示す。抗好中球抗体投与群の損傷部遠位で観察された好中球数は、injury alone群及びコントロール抗体投与群と比較して少なかった。これらの結果から、抗好中球抗体は血中及びワーラー変性部のいずれにおいても好中球数を減少させることが確認された。
　損傷12時間後及び7日後の坐骨神経損傷部遠位におけるマクロファージの分布を図１１に示す。抗好中球抗体投与群では、injury alone群及びコントロール抗体投与群と比較して、より早い時期に多くのマクロファージの集積が認められた。
　損傷7日後の損傷部から5 mm～30 mm遠位までの代表的なβ3 tubulin免疫染色画像を図１２に、軸索再生率を図１３に示す。抗好中球抗体投与群では、injury alone群及びコントロール抗体投与群と比較して高い軸索再生率を示した。
　損傷7日後の代表的なMBP免疫染色画像及びMBP陽性率を図１４に示す。抗好中球抗体投与群では、injury alone群及びコントロール抗体投与群と比較してMBP陽性率が低く、髄鞘デブリスの量が減少していた。
　本実施例から、抗好中球抗体によってワーラー変性部に集積する好中球数を減少させることで、マクロファージの集積が増加し、軸索再生が促進され、ミエリンのクリアランスが促進されることが確認された。
試験例２　好中球数の増加が神経再生過程に及ぼす影響の評価
　マウスの坐骨神経に圧挫損傷を作成し、11時間後にPBSに懸濁したGFP標識好中球を1匹あたり2×106個、又は同容量のPBSのみを静脈内投与した（n＝3）。また、圧挫損傷の作成のみを行った群を対照として用意した（n＝3）。損傷作成の12時間後に採血し、ギムザ染色を行って血中好中球数を算出した。また、損傷作成の12時間後又は7日後に坐骨神経を摘出し、損傷部から4 mm、6 mm、8 mm及び10 mm遠位での横断切片のHE染色及び免疫組織化学染色を行って、神経内の好中球数及び神経実質内のマクロファージ数をカウントし、軸索密度及びMBP陽性率を算出した。
　損傷12時間後の血中好中球数を図１５に、損傷部から4mm遠位の代表的なHE染色画像及び免疫染色画像を図１６に、好中球の空間的分布を図１７に示す。好中球投与群ではinjury alone群及びPBS投与群と比較して血中好中球数が増加しており、損傷部遠位の好中球数も増加していた。また好中球は、静脈内投与されたGFP陽性好中球も含めて、損傷部遠位の神経実質外に集積していた。
　損傷7日後の坐骨神経損傷部遠位におけるマクロファージの分布を図１８に示す。好中球投与群では、injury alone群及びPBS投与群と比較して、損傷部遠位のマクロファージ数は少なかった。
　損傷7日後の代表的なβ3 tubulin免疫染色画像を図１９に、軸索密度を図２０に示す。injury alone群及びPBS投与群では損傷部に近いほど軸索密度が高くなったが、好中球投与群では全体的に軸索密度が低かった。
　損傷7日後の代表的なMBP免疫染色画像を図２１に、MBP陽性率を図２２に示す。好中球投与群では、injury alone群及びPBS投与群と比較して、MBP陽性率が高く、髄鞘デブリスの量が増加していた。
　本試験例から、好中球を投与するとワーラー変性部に集積する好中球数が増加し、それに伴ってマクロファージの集積、軸索再生、ミエリンクリアランスのいずれも抑制されることが確認された。
　試験例１及び２並びに実施例１から推測される、好中球による軸索再生過程制御の概念図を図２３に示す。
実施例２　ワーラー変性部の神経上膜におけるNETs形成と、NETs形成抑制が神経再生過程に及ぼす影響の評価
（１）NETsの分布
　未処置のラットから摘出した坐骨神経（正常坐骨神経）、及び圧挫損傷作成の12時間後にラットから摘出した坐骨神経（損傷神経）の損傷部位から20 mm遠位における縦断切片について、CitH3、Ly-6G及びCD68に対する免疫組織化学染色を行った。正常坐骨神経ではNETsは検出されなかった一方（図２４左）、損傷神経ワーラー変性部の神経上膜では多量のNETsが検出された（図２４中央及び右）。また、神経上膜のNETsは、好中球と共局在していた。このことから、ワーラー変性部の神経上膜に集積した好中球によってNETsが形成されたものと考えられた。
（２）NETs産生阻害剤又はNETs分解酵素を含有するシートを用いた神経損傷部遠位（15 mm～25 mm遠位）の被覆試験
　ラットの坐骨神経に圧挫損傷を作成した。損傷作成の10時間後、損傷部位から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を、0.3 mgのPAD4阻害剤Cl-アミジン（Cayman CHEMICAL #10599）を含む50μlのPBS、200 UのDNase I（ニッポンジーン #314-08071）を含む50μlのPBS、又は50μlのPBS（コントロール）のいずれかを含浸させたコラーゲン使用人工皮膚PELNAC（登録商標）（Smith & Nephew；以下、シート又はコラーゲンシートとも呼ぶ）で包み、シートを8-0ナイロンで縫合固定して2時間置いた（各群n＝3）。損傷作成の12時間後、坐骨神経を摘出し、損傷部位から20 mm遠位の縦断切片を作成して、CitH3、Ly-6G及びCD68に対する免疫組織化学染色を行った。神経上膜部分を観察し、観察視野全体の面積に占めるCitH3の染色性のある面積の割合を算出した。また、神経実質内のマクロファージ数の単位面積辺りの数を定量した。
　代表的なCitH3及びLy-6Gの免疫染色画像とCitH3陽性面積を図２５に、代表的なCD68免疫染色画像とマクロファージ数を図２６に示す。対照シート群では神経上膜に多量のNETsの存在が認められたが、Cl-アミジン含有シート群及びDNase I含有シート群ではNETsはわずかにしか検出されなかった。また、Cl-アミジン含有シート群及びDNase I含有シート群においては、対照シート群と比較して多くのマクロファージの集積が神経実質内に認められた。
（３）NETs分解酵素を含有するシートを用いた神経損傷部遠位（5 mm～25 mm遠位）の被覆試験
　ラットの坐骨神経に圧挫損傷を作成した。損傷作成の10時間後、損傷部位から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を、400 UのDNase I（ニッポンジーン #314-08071）を含む100μlのPBS、又は100μlのPBS（コントロール）のいずれかを含浸させたコラーゲンシートで包み、シートを8-0ナイロンで縫合固定して2時間置いた（各群n＝1）。損傷作成の7日後に坐骨神経を摘出し、縦断切片の免疫組織化学染色を行って神経実質内のマクロファージ数をカウントし、軸索再生率を算出した。
　代表的なβ3 tubulin免疫染色画像を図２７上段に、軸索再生率を図２７下段に、マクロファージ数を図２８に示す。DNase I含有シート群では、評価した損傷部遠位のほぼ全体にわたって、対照シート群と比較して高い軸索再生率を示し、また、より多くのマクロファージの集積が神経実質内に認められた。
　これらの結果から、損傷神経ワーラー変性部の神経上膜においてNETsの形成を抑制することで、軸索再生が促進されることが確認された。
実施例３　MIFの阻害が神経再生過程に及ぼす影響の評価
（１）MIFの分布
　未処置のラットから摘出した坐骨神経、及び圧挫損傷作成の12時間後にラットから摘出した坐骨神経の縦断切片について、MIF及びLy-6Gに対する免疫組織化学染色を行った。正常坐骨神経ではMIFの発現は確認されなかった一方（図２９上段）、損傷作成12時間後の坐骨神経では実質外でMIFの発現が観察され、またMIFは好中球と二重染色された（図２９下段）。このことから、損傷12時間後のワーラー変性部の神経実質外では、集積した好中球によってMIFが産生されているものと考えられた。
（２）MIF阻害剤含有シートを用いた神経損傷部遠位（15 mm～25 mm遠位）の被覆試験
　ラットの坐骨神経に圧挫損傷を作成した。損傷作成の10時間後、損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を、500μgのMIF阻害剤iso-1（Abcam, Cat ab142140）を含む1% DMSO 50μlを含浸させた又は1% DMSO 50μlを含浸させたコラーゲンシートで包み、シートを8-0ナイロンで縫合固定して2時間置いた（各群n＝3）。損傷作成の12時間後、坐骨神経を摘出し、縦断切片を作成して、CitH3、Ly-6G及びCD68に対する免疫組織化学染色を行った。神経上膜部分を観察し、観察視野全体の面積に占めるCitH3の染色性のある面積の割合を算出した。また、神経実質内のマクロファージ数の単位面積辺りの数を定量した。
　損傷12時間後の坐骨神経損傷部5 mm遠位におけるCD68免疫染色画像及びマクロファージ数を図３０に、坐骨神経損傷部20 mm遠位におけるCD68免疫染色画像及びマクロファージ数を図３１に、坐骨神経損傷部20 mm遠位におけるCitH3及びLy-6Gの免疫染色画像とCitH3陽性面積を図３２に示す。シート処理を受けていない損傷部5 mm遠位ではiso-1含有シート群と対照シート群とでマクロファージの集積に差は認められなかった。一方、シート処理を受けた損傷部20 mm遠位では、iso-1含有シート群において対照シート群と比較して多くのマクロファージの集積が神経実質内に認められた。また、iso-1含有シート群では、損傷部20 mm遠位の神経上膜にNETsはわずかにしか検出されなかった。
（３）MIF阻害剤含有シートを用いた神経損傷部遠位（5 mm～25 mm遠位）の被覆試験
　ラットの坐骨神経に圧挫損傷を作成した。損傷作成の10時間後、損傷部から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を、1000μgのiso-1を含む1% DMSO 100μlを含浸させた又は1% DMSO 100μlを含浸させたPELNAC（登録商標）で包み、シートを縫合固定して2時間置いた（各群n＝3）。損傷作成の12時間後にシートを外し、洗浄後に閉創した。損傷作成の7日後に坐骨神経を摘出し、縦断切片の免疫組織化学染色を行って神経実質内のマクロファージ数をカウントし、軸索再生率を算出した。
　代表的なCD68免疫染色画像及びマクロファージ数を図３３に、CD163免疫染色画像及びM2マクロファージ数を図３４に示す。評価した損傷部遠位の全体にわたって、iso-1含有シート群において対照シート群と比較して多くのマクロファージの集積が神経実質内に認められた。
　代表的なβ3 tubulin免疫染色画像及び軸索再生率を図３５に示す。iso-1含有シート群では、評価した損傷部遠位のほぼ全体にわたって、対照シート群と比較して高い軸索再生率を示した。
（４）MIF阻害剤含有シートを用いた神経損傷部遠位（5 mm～15 mm遠位）の被覆試験
　ラットの坐骨神経に圧挫損傷を作成した。損傷作成の10時間後、損傷部から5 mm～15 mm遠位の坐骨神経を、500μgのiso-1を含む1% DMSO 50μl、500μgのMIF阻害剤CPSI-1306（MCH, Cat# HY110095）を含む1% DMSO 50μl、又は1% DMSO 50μlを含浸させたPELNAC（登録商標）で包み、シートを縫合固定して2時間置いた（各群n＝1）。損傷作成の12時間後にシートを外し、洗浄後に閉創した。損傷作成の7日後に坐骨神経を摘出し、縦断切片の免疫組織化学染色を行って軸索再生率を算出した。
　代表的なβ3 tubulin免疫染色画像を図３６に、軸索再生率及び最長軸索長を図３７に示す。iso-1含有シート群及びCPSI-1306含有シート群では、評価した損傷部遠位のほぼ全体にわたって、対照シート群と比較して高い軸索再生率を示し、また最長軸索長も大きかった。
　これらの結果から、ワーラー変性部の神経実質外でMIFを阻害することで、軸索再生が促進されることが確認された。
実施例４　CXCR4の阻害が神経再生過程に及ぼす影響の評価
（１）CXCR4の分布
　未処置のラットから摘出した坐骨神経、及び圧挫損傷作成の12時間後にラットから摘出した坐骨神経の縦断切片について、CXCR4及びLy-6Gに対する免疫組織化学染色を行った。正常坐骨神経ではCXCR4の発現は確認されなかったが、損傷作成12時間後の坐骨神経では実質外でCXCR4の発現が観察され、またCXCR4は好中球と二重染色された（図３８）。このことから、損傷12時間後のワーラー変性部の神経実質外では、集積した好中球によってCXCR4が産生されているものと考えられた。
（２）CXCR4阻害剤含有シートを用いた神経損傷部遠位（15 mm～25 mm遠位）の被覆試験
　ラットの坐骨神経に圧挫損傷を作成した。損傷作成の10時間後、損傷部から15 mm～25 mm遠位の坐骨神経を、500μgのCXCR4阻害剤AMD3100（Abcam #10599）を含む50μlのPBSを含浸させた又は50μlのPBSを含浸させたコラーゲンシートで包み、シートを8-0ナイロンで縫合固定して2時間置いた（各群n＝3）。損傷作成の12時間後、坐骨神経を摘出し、損傷部位から20 mm遠位の縦断切片を作成して、CitH3、Ly-6G及びCD68に対する免疫組織化学染色を行った。神経上膜部分を観察し、観察視野全体の面積に占めるCitH3の染色性のある面積の割合を算出した。また、神経実質内のマクロファージ数の単位面積辺りの数を定量した。
　代表的なCitH3及びLy-6Gの免疫染色画像とCitH3陽性面積を図３９に、代表的なCD68免疫染色画像とマクロファージ数を図４０に示す。AMD3100含有シート群では、神経上膜にNETsはわずかにしか検出されず、また対照シート群と比較して多くのマクロファージの集積が神経実質内に認められた。
（３）CXCR4阻害剤含有シートを用いた神経損傷部遠位（5 mm～25 mm遠位）の被覆試験
　ラットの坐骨神経に圧挫損傷を作成した。損傷作成の10時間後、損傷部位から5 mm～25 mm遠位の坐骨神経を、1 mgのCXCR4阻害剤AMD3100（Abcam #10599）を含む100μlのPBSを含浸させた又は100μlのPBSを含浸させたコラーゲンシートで包み、シートを8-0ナイロンで縫合固定して2時間置いた（各群n＝1）。損傷作成の7日後に坐骨神経を摘出し、縦断切片の免疫組織化学染色を行って神経実質内のマクロファージ数をカウントし、軸索再生率を算出した。
　代表的なβ3 tubulin免疫染色画像を図４１上段に、軸索再生率を図４１下段に、マクロファージ数を図４２に示す。CXCR4含有シート群では、評価した損傷部遠位のほぼ全体にわたって、対照シート群と比較して高い軸索再生率を示し、また、より多くのマクロファージの集積が神経実質内に認められた。
　試験例１及び２並びに実施例１～４から推測される、好中球による軸索再生過程制御の概念図を図４３に示す。
配列番号１　PA-dPEG24のペプチド部分のアミノ酸配列

Claims (15)

  1. 　損傷末梢神経の実質外における好中球細胞外トラップ（Neurophil Extracellular Traps; NETs）の形成を抑制する物質を含む、末梢神経損傷の治療のための医薬組成物。
  2. 　損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する物質が、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質、好中球のNETs産生を阻害する物質、又はNETsを分解する物質である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する物質が、好中球に対する抗体及びその抗原結合性断片、好中球に対するアプタマー、好中球遊走刺激因子に対する阻害剤、並びに好中球遊走阻害因子よりなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 　好中球のNETs産生を阻害する物質が、マクロファージ遊走阻止因子（Macrophage migration inhibitory factor; MIF）の発現を抑制する又は機能を阻害する物質、CXCモチーフ型ケモカイン受容体4（CXCR4）の発現を抑制する又は機能を阻害する物質、及びペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（Peptidylarginine deiminase; PAD4）の発現を抑制する又は機能を阻害する物質よりなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
  5. 　MIFの発現を抑制する又は機能を阻害する物質が、MIFの発現を抑制する核酸、MIFに対する抗体及びその抗原結合性断片、MIFに対するアプタマー、並びにMIF阻害剤よりなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　MIF阻害剤がISO-1（(S,R)-3-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid）又は(±)-CPSI 1306（2-[3-(3-(2,4-Difluorophenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazolyl]-1-(4-morpholinyl)ethanone）である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　CXCR4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質が、CXCR4の発現を抑制する核酸、CXCR4に対する抗体及びその抗原結合性断片、CXCR4に対するアプタマー、並びにCXCR4阻害剤よりなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
  8. 　CXCR4阻害剤がプレリキサホルである、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　PAD4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質が、PAD4の発現を抑制する核酸、PAD4に対する抗体及びその抗原結合性断片、PAD4に対するアプタマー、並びにPAD4阻害剤よりなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
  10. 　PAD4阻害剤がCl-アミジンである、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 　NETsを分解する物質がDNase Iである、請求項２に記載の医薬組成物。
  12. 　末梢神経の損傷部遠位側周辺に配置して用いるための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 　損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する活性を指標とした、被験物質の末梢神経再生促進活性を評価する方法。
  14. 　損傷末梢神経の実質外におけるNETsの形成を抑制する活性が、損傷末梢神経への好中球の集積を阻害する活性、好中球のNETs産生を阻害する活性、又はNETsを分解する活性である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　好中球のNETs産生を阻害する活性が、MIFの発現を抑制する又は機能を阻害する活性、CXCR4の発現を抑制する又は機能を阻害する活性、及びPAD4の発現を抑制する又は機能を阻害する物質よりなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。

     
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