WO2023033481A1 - 항암 활성을 가지는 adp-리보오스 결합 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

항암 활성을 가지는 adp-리보오스 결합 펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to an ADP (adenosine diphosphate)-ribose-binding peptide having anticancer activity, and specifically, an ADP-ribose-binding peptide having a specific amino acid sequence and a modification thereof, and pharmaceuticals for preventing or treating cancer containing the same as an active ingredient. It relates to an anti-cancer composition, and a pharmaceutical composition for adjuvant anti-cancer.
  • ADP adenosine diphosphate
  • PARylation is one of the post-translation modification processes, in which ADP-ribose polymer (poly(adenosine diphosphate-ribose)) is covalently attached to a protein by PAR polymerase. .
  • a high-molecular ADP-ribose chain is produced through PARylation, which is a unique intracellular biochemical action that does not show a form such as ubiquitination or SUMOylation and is not a modification at the small molecular level such as acetylation or methylation.
  • PARylation is involved in the development of systemic diseases including cancer, viral infection and neurodegeneration.
  • PARylation is derived from the activation of PARP-1
  • inhibition of PARP-1 activity can be used to treat ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, and cancer.
  • Anticancer efficacy targeting other cancers is already well known (J Mateo et al., Ann Oncol., 2019, 30(9): 1437).
  • NAD + can impair cellular metabolism, especially oxidative phosphorylation processes that occur in a cellular energy crisis (ATP depletion). It has been suggested that PARylation activation induced by extensive DNA damage consumes NAD + and the subsequent effects of this action may result in cell death.
  • PAR polymers released from the nucleus after DNA repair can liberate apoptosis-inducing factors bound to the mitochondrial membrane in the cytoplasm and activate pathways that recruit apoptosis-inducing factors into the nucleus.
  • apoptotic factors translocate to the nucleus, they induce cell death by mediating massive DNA fragmentation.
  • PARylation-induced energy depletion and apoptosis-inducing factors are known to be related to PAR signaling that controls protein kinase-phosphatase pathways such as the PI3K-Akt pathway or the MAP kinase pathway, and these PAR-dependent cell death processes To a significant extent, it contributes to the complexity of death mechanisms.
  • activating PARylation or inhibiting the degradation of PAR polymers can also be a strategy for discovering effective anticancer therapies.
  • activation of PARylation or inhibition of PAR polymer degradation is a very promising target in a cancer cell-specific region that undergoes a metabolic process different from that of normal cells.
  • the peptides having the novel amino acid sequence of the present invention bind to ADP-ribose and ultimately release ADP-ribose or PAR from the action of various degrading enzymes or signaling proteins in cells.
  • the present invention was completed by confirming that PARylation can be overactivated and the decomposition process of PAR polymerase can be disturbed by preventing the polymer from being used, and as a result of this disturbance, cancer cell death can be induced to produce a breakthrough anticancer effect. .
  • One object of the present invention is to provide an adenosine diphosphate (ADP)-ribose binding peptide having any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14.
  • ADP adenosine diphosphate
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the above peptide.
  • Another object of the present invention is to provide vectors and transformants containing the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and a pharmaceutical supplement for anticancer that enhances the reactivity to a second anticancer agent. It is to provide a pharmaceutical composition for adjuvant anti-cancer to enhance the responsiveness to the red composition and radiation anti-cancer treatment.
  • Another object of the present invention is to use the peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the prevention or treatment of cancer, and to administer the peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof. It is to provide a method for preventing or treating cancer, including.
  • the ADP-ribose binding peptide of the present invention accumulates ADP-ribose in cancer cells, destroys the balance of cells, leads to death of cancer cells, but has excellent anti-cancer effect without being toxic to normal cells, and is not suitable for administration of other anti-cancer drugs or radiation anti-cancer. When administered in combination during treatment, it has a very good effect as an anticancer adjuvant by enhancing the responsiveness to anticancer drugs and radiation therapy.
  • Figure 1 shows the level of intracellular poly ADP-ribose after treatment with the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 4 to different concentrations of cancer cells.
  • Figure 2 shows the level of intracellular poly ADP-ribose after treatment with the peptides of SEQ ID NOs: 5 to 8 to different concentrations of cancer cells.
  • Figure 3 shows the level of intracellular poly ADP-ribose after treatment with the peptides of SEQ ID NOs: 9 to 12 to different concentrations of cancer cells.
  • Figure 4 shows the level of intracellular poly ADP-ribose after treatment with the peptides of SEQ ID NOs: 13 and 14 to different concentrations of cancer cells.
  • Figure 5 shows the results of confirming the cell viability after treating different cancer cells with the peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 16.
  • the upper figure shows a cell photograph, and the lower graph shows the cell viability.
  • FIG. 6 shows the result of confirming the cell viability after treating different cancer cells with the peptides of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 18.
  • the upper figure shows a cell photograph, and the lower graph shows the cell viability.
  • FIG. 7 shows the result of confirming the cell viability after treating different cancer cells with the peptides of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 20.
  • the upper figure shows a cell photograph, and the lower graph shows the cell viability.
  • Figure 8 shows the result of confirming the cell viability after treating different cancer cells with the peptides of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 22.
  • the upper figure shows a cell photograph, and the lower graph shows the cell viability.
  • FIG. 9 shows the result of confirming cell viability after treating different cancer cells with the peptides of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 24.
  • the upper figure shows a cell photograph, and the lower graph shows the cell viability.
  • FIG. 10 shows the result of confirming the cell viability after treating different cancer cells with the peptides of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 26.
  • the upper figure shows a cell photograph, and the lower graph shows the cell viability.
  • FIG 11 shows the result of confirming the cell viability after treating different cancer cells with the peptides of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 28.
  • the upper figure shows a cell photograph, and the lower graph shows the cell viability.
  • Figure 13 shows the cell viability after treatment with bevacizumab (left) or osimertinib (right) alone or in combination with the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 14 to different cancer cells.
  • Figure 15 shows the cell viability after treatment with 2 Gy of radiation alone or in combination with the peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14 to different cancer cells.
  • FIG. 16 shows the cell viability after treatment with 2 Gy of radiation alone or in combination with the peptides of SEQ ID NOs: 15 to 28 to different cancer cells.
  • 17 shows changes in tumor volume over time after subcutaneous administration of the peptides of SEQ ID NOs: 15 to 28 in a tumor implantation animal model.
  • 18 is a photograph of tumor tissue confirmed after subcutaneously administering the peptides of SEQ ID NOs: 15 to 28 in a tumor transplantation animal model.
  • 20 is a photograph of tumor tissue confirmed after orally administering the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 14 in a tumor transplantation animal model.
  • 21 is a representative result of evaluating the toxicity of the peptide of SEQ ID NO: 7 to normal cells (CCD-18Co).
  • ADP adenosine diphosphate
  • ADP-ribose is used as a concept including both isolated ADP-ribose itself and ADP-ribose polymer (poly ADP-ribose), and "ADP-ribose binding peptide” refers to ADP-ribose or ADP-ribose. It refers to any peptide having an activity to inhibit degradation by binding to a ribose polymer.
  • the peptide is not simply formed by peptide bonds between the amino acids constituting it, but also any form of peptide analog, derivative, etc. having a partially modified form to improve properties such as stability and efficacy from the viewpoint of protein drugs. Also includes variants of
  • the inventors of the present invention can expect anticancer effects through activation of PARylation or inhibition of degradation of PAR polymers, in a completely different aspect from many reports of anticancer efficacy in terms of inhibition of PARylation (poly ADP-ribosylation) by conventional PARP-1 inhibitors. It was noted that there is In particular, cancer cells continue to divide at a faster rate than normal cells and actively metabolize, so by overactivating PARylation or inhibiting the degradation of PAR polymer, it is possible to specifically target cancer cells without affecting normal cells that do not overactivate PARylation. It was hoped that it could be annihilated.
  • the WE domain is a globular domain conserved in many proteins, including deltex, Trip12, and poly-ADP-ribose polymerase homologs, named after the most conserved residue in the domain (L. Aravind , TRENDS in Biochemical Sciences, 2001, 26(5): 273). It is known that in some proteins having a WE domain, there is an ADP-ribose binding motif in the domain.
  • the fragments were synthesized from WE domains present in various types of proteins and their anticancer activity was investigated.
  • the level of ADP-ribose in cancer cells significantly increased when the ADP-ribose binding peptides (SEQ ID NOs: 1 to 14) of Examples 1 to 14 were treated with various types of cancer cells (FIG. 1). to Figure 4).
  • the balance of intracellular ADP-ribose was disturbed due to the treatment of the peptides, and the growth of cancer cells was inhibited and most of them died (FIGS.
  • tumor transplantation animal model Also, when the ADP-ribose-binding peptides of Examples 1 to 14 were subcutaneously or orally administered, it was confirmed that the growth of tumor tissue in vivo was rapidly reduced (FIG. 19 and FIG. 20).
  • the peptide of SEQ ID NO: 7 was treated with normal cells to evaluate cytotoxicity against normal cells. As a result, it was confirmed that no toxicity was shown to normal cells (FIGS. 21 and 22).
  • the ADP-ribose binding peptides of SEQ ID NOs: 1 to 14 of the present invention have excellent anticancer effects regardless of cancer types and show no cytotoxicity to normal cells, so they can be usefully used as compositions for preventing or treating cancer. there is.
  • the ADP-ribose binding peptides are all peptides having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 14, as well as sequences in which one or more amino acids are added, substituted, or deleted from these sequences, provided they fall within the same range. belong to the category
  • it has at least 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more homology with a peptide having any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 14 of the present invention, and the sequence If it is a peptide exhibiting efficacy corresponding to that of the peptide consisting of any one of amino acid sequences of Nos. 1 to 14, that is, ADP-ribose binding activity and anticancer activity, some sequences are added, substituted or deleted from the amino acid sequences of SEQ ID Nos. 1 to 14. Even if it has an amino acid sequence, it is obvious that it is included within the scope of the present invention.
  • the term "homology” means the degree of matching with a given amino acid sequence or nucleotide sequence and can be expressed as a percentage.
  • a homologous sequence having the same or similar activity as a given amino acid sequence or nucleotide sequence is expressed as "% homology”.
  • BLAST 2.0 which calculates parameters such as score, identity and similarity, or by Southern hybridization experiments under defined stringent conditions, sequence It can be confirmed by comparing, and appropriate hybridization conditions defined are within the scope of the art and are well known to those skilled in the art (e.g., J.
  • the peptides of the present invention may include modifications such as chemical derivatization at one or more amino acids constituting the peptides to further improve desired properties, as long as they have equivalent anticancer activity to those of the peptides of the present invention despite such modifications. It is apparent to those skilled in the art that all fall within the scope of the present invention.
  • the derivatization may include, but is not limited to, acetylation, hydroxylation, methylation, amidation, pegylation, and addition of carbohydrate or lipid components, cofactors, and the like.
  • the peptide may be additionally used in a fused form with a cell-penetrating peptide to increase cell permeability. That is, the ADP-ribose binding peptide may further include cell penetrating peptides at the N-terminus, C-terminus, or both ends. At this time, a linker may be additionally included between the ADP-ribose binding peptide and the cell penetrating peptide, which can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • the term "cell-penetrating peptide” refers to a peptide having characteristics capable of promoting uptake/absorption of various materials such as nanoparticles, compounds, DNA, and proteins into cells.
  • the cell-penetrating peptides include TAT, maurocalcine, penetratin, poly-arginine-derived peptides, Antennapedia, Transportan, VP22, It may be Hph-1, Poly-arginine, R11(R9), Pep-1, HP4, LAH4, Vetofusing-1, a peptide based on a signal sequence, or an amphipathic peptide, but is limited thereto
  • those skilled in the art can be appropriately selected as long as they can promote intracellular movement of the ADP-ribose-binding peptide of the present invention.
  • TAT a cell penetrating peptide
  • SEQ ID NOs: 15 to 24, Table 2 the ADP-ribose binding peptides of SEQ ID NOs: 1 to 14 of the present invention to evaluate their anticancer activity.
  • SEQ ID NOs: 15 to 24, Table 2 the ADP-ribose-binding peptide had more excellent anticancer activity than when used alone (FIGS. 5 to 12, 17 and 18). Therefore, not only the ADP-ribose binding peptides of SEQ ID NOs: 1 to 14 of the present invention, but also the peptides fused with cell penetrating proteins can be very useful as compositions for preventing or treating cancer.
  • ADP-ribose-binding peptide of the present invention can appropriately modify and use to apply it according to the type of cell-penetrating peptide used. That is, even when the ADP-ribose binding peptide of the present invention is fused to a cell penetrating peptide and used, it is not limited to the amino acid sequence presented in the present invention, and the application of the cell penetrating peptide within the range apparent to those skilled in the art, that is, the equivalent range. It can be used by adding/substituting/removing an amino acid sequence in an appropriate form.
  • the ADP-ribose binding peptide of the present invention can be used together with reagents known in the art that can deliver proteins into cells or improve delivery efficiency in order to increase cell permeability.
  • reagents include, for example, Chariot TM (Active motif, Cat. 30025), Xflect TM (Takara, Cat. 631324), Pierce TM (ThermoFisher Scientific, Cat. 89850), ProteoJuice TM (Merck, Cat.
  • Another aspect of the present invention is a polynucleotide encoding the ADP-ribose-binding peptide.
  • Another aspect of the present invention is a vector containing the polynucleotide.
  • Another aspect of the present invention is a transformant comprising the polynucleotide.
  • ADP-ribose binding peptides are as described above.
  • the polynucleotide has a nucleotide sequence encoding the ADP-ribose binding peptide of the present invention, or a nucleotide sequence having at least 80%, 90%, 95%, 97%, or 99% homology thereto. If the polypeptide translated therefrom exhibits an efficacy corresponding to that of the ADP-ribose-binding peptide of the present invention, the addition of meaningless sequences to the 5'- and/or 3'-ends of the nucleotide sequence, or deletion of some sequences, Any modification or substitution may be included in the scope of the present invention.
  • the polynucleotide may be used in the form of an expression cassette operably linked to a known promoter sequence or a vector containing the polynucleotide, and the polynucleotide, expression cassette or vector may be prepared appropriately by a method known to those skilled in the art. can do.
  • the type of promoter and vector is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • a transformant may be prepared and used by transforming the polynucleotide, expression cassette, or vector into a host cell, and methods known to those skilled in the art may also be used without limitation.
  • the transformant is a target to express the ADP-ribose-binding peptide of the present invention, and may be a microorganism, plant or animal, but may be other than human, but is not limited thereto.
  • a person skilled in the art can prepare and use a polynucleotide encoding the ADP-ribose binding peptide, a vector containing the same, or a transformant containing the vector in order to apply/produce the ADP-ribose binding peptide for various purposes.
  • the polynucleotide or the vector can be used directly for treatment of cancer, and the peptide can be produced or used for treatment using a transformant expressing the ADP-ribose binding peptide.
  • Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the ADP-ribose-binding peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention is the use of the peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the prevention or treatment of cancer, and the step of administering the peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof It is a method for preventing or treating cancer, including
  • the ADP-ribose-binding peptide of the present invention has an excellent effect in preventing and/or treating cancer.
  • the term "cancer” refers to a disease related to the regulation of cell death, and refers to a disease caused by excessive proliferation of cells when the normal balance of cell death is broken.
  • the cancer includes both malignant tumor and benign tumor, and includes, for example, brain cancer, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymoma, esophageal cancer, colorectal cancer, liver cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, and biliary tract.
  • the types of cancer of the present invention are not limited by the above examples.
  • the composition for preventing or treating cancer of the present invention has a therapeutic effect on all cancers in which cell death may occur due to the accumulation of intracellular ADP-ribose.
  • the cancer may be solid cancer such as brain cancer, lung cancer, pancreatic cancer, liver cancer, breast cancer, colon cancer, kidney cancer, stomach cancer, or ovarian cancer, but is not limited thereto.
  • the term "treatment” refers to intervening to alter the natural process of a diseased individual or cell, which may be performed during the course of a pathological condition or to prevent it. Desired therapeutic effects include preventing occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, reducing any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, and alleviating the disease state. or providing temporary relief, remission or improving prognosis.
  • the present invention includes all activities that improve the course of cancer by administering a composition containing an ADP-ribose binding peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • prevention refers to any activity that inhibits or delays the onset of cancer by administering the composition.
  • the weight % of the ADP-ribose-conjugated peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof included in the pharmaceutical composition is not particularly limited thereto, but is 0.0001 to 90% by weight, specifically 0.001 to 50% by weight, based on the total weight of the final composition. More specifically, it may be included in an amount of 0.01 to 20% by weight.
  • the pharmaceutical composition may be prepared by further including appropriate carriers, excipients or diluents commonly used in the manufacture of pharmaceuticals.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral patches, external preparations, external patches, suppositories and sterile injections according to conventional methods. It may be formulated and used in the form of a solution.
  • the pharmaceutical composition When used for oral administration, it may be prepared as a sustained-release preparation through appropriate encapsulation, enteric coating, and polymer formulation.
  • the sustained-release formulation may be prepared as a long-acting formulation.
  • a long-acting formulation may be mixed with a polymer and a lipid in an appropriate ratio.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a subject who has or is at risk of developing cancer.
  • the term "individual" means all animals including humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject in a pharmaceutically effective amount.
  • administration refers to introducing the pharmaceutical composition of the present invention into a target subject by any suitable method, and the route of administration may be administered through various oral or parenteral routes as long as it can reach the target tissue. there is. Examples of routes of administration include oral, intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous, intraperitoneal, pulmonary, and nasal, including but not limited to subcutaneous or oral administration.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to prevent and/or treat cancer with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical use.
  • An appropriate dosage and frequency of administration may be selected according to a method known in the art, and the amount and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention actually administered depend on the type of symptom to be treated, route of administration, gender, health condition, It can be appropriately determined by various factors such as diet, age, weight, and severity of the disease of the subject.
  • pharmaceutically acceptable salts refer to salts commonly used in the pharmaceutical industry, for example, salts of inorganic ions including sodium, potassium, calcium, magnesium, lithium, copper, manganese, zinc, iron, etc.
  • inorganic acids such as perchloric acid, phosphoric acid, and sulfuric acid, as well as salts of ascorbic acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, maleic acid, malonic acid, fumaric acid, glycolic acid, succinic acid, propionic acid, acetic acid, orotate acid, and acetylsalicylic acid.
  • organic acids and amino acid salts such as lysine, arginine, and guanidine.
  • organic ion salts such as tetramethyl ammonium, tetraethyl ammonium, tetrapropyl ammonium, tetrabutyl ammonium, benzyl trimethyl ammonium, and benzethonium that can be used in pharmaceutical reactions, purification and separation processes.
  • organic ion salts such as tetramethyl ammonium, tetraethyl ammonium, tetrapropyl ammonium, tetrabutyl ammonium, benzyl trimethyl ammonium, and benzethonium that can be used in pharmaceutical reactions, purification and separation processes.
  • the types of salts meant in the present invention are not limited by these listed salts.
  • the ADP-ribose-binding peptide of the present invention has excellent anticancer activity, it can be prepared not only as a pharmaceutical composition but also as a functional food composition.
  • the food composition may include additional ingredients that are commonly used in food and can improve odor, taste, and vision.
  • additional ingredients that are commonly used in food and can improve odor, taste, and vision.
  • food additives may be added. The additive is selected according to the type of food and used in an appropriate amount.
  • the food composition can be prepared as a health functional food, where functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and in addition to nutritional supply, bioregulatory functions are efficiently displayed. It refers to processed medicine and food with high medical effect.
  • the health functional food may be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills in order to obtain useful effects for cancer improvement.
  • Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for adjuvant anticancer that enhances reactivity to a second anticancer agent, comprising the ADP-ribose-binding peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention is a pharmaceutical preparation for preventing or treating cancer, comprising (i) the ADP-ribose binding peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and (ii) a second anticancer agent as active ingredients.
  • a composition for preventing or treating cancer, comprising (i) the ADP-ribose binding peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and (ii) a second anticancer agent as active ingredients. is a composition
  • ADP-ribose-binding peptides and pharmaceutically acceptable salts thereof are as described above.
  • the ADP-ribose-conjugated peptide of the present invention goes beyond having an anticancer effect alone and also has a very excellent effect as an anticancer auxiliary pharmaceutical composition for the purpose of enhancing reactivity to a second anticancer agent. Therefore, it can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer by using the second anticancer agent as an active ingredient together with the ADP-ribose binding peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the term "second anticancer agent” refers to any drug having anticancer activity except for the ADP-ribose binding peptide of the present invention.
  • the scope of the second anticancer agent is not particularly limited, and those skilled in the art can select and use an appropriate type according to the purpose of cure, control, symptom relief, etc. of cancer depending on the type and progress of cancer.
  • the second anticancer agent may be, for example, a cytotoxic anticancer agent, a targeted anticancer agent, an immune anticancer agent, or a metabolic anticancer agent, but is not limited thereto.
  • the cytotoxic anticancer agent is a drug that exhibits an anticancer effect by attacking cancer cells that divide indiscriminately at a faster rate than normal cells, meaning the same as commonly used in the art to which the present invention belongs.
  • the cytotoxic anticancer agents include alkylating agents, antimetabolites, and natural anticancer agents.
  • the alkylating agent is nitrogen mustard (e.g., cyclophosphamide, chlormethine, uramustine, melphalan, chlorambucil, ifosfamide, bendamustine, etc.), alkyl sulfonates (e.g., busulfan, procarbazine, etc.) ), nitrosoureas (e.g., carmustine, lomustine, streptozocin, etc.), platinum-based alkylating agents (e.g., cisplatin, carboplatin, dicycloplatin, eptaplatin, lobaplatin, myriplatin, yes daplatin, oxaliplatin, picoplatin, satraplatin, triplatin tetranitrate, etc.), but are not limited thereto. Alkylating agents can cause destruction of cancer cells by binding to DNA in cancer cells and damaging the DNA structure.
  • nitrogen mustard e.g., cyclophosphamide, chlormethin
  • the antimetabolites include pyrimidine derivatives (eg, 5-fluorouracil, capecitabine, cystarabine, gemcitabine, fludarabine, etc.), folate derivatives (eg, methotrexate, pemetrexed, etc.), purine derivatives (eg, methotrexate, pemetrexed, etc.) , mercaptopurine, etc.), but are not limited thereto.
  • Antimetabolites can induce cancer cell death by inhibiting DNA replication and metabolism necessary for cell survival.
  • the natural anticancer agents include topoisomerase inhibitors (e.g., camptothecin, epipodophyllotoxin, taxane-based drugs (dositaxel, paclitaxel)), antibiotics (e.g., dactinomycin, doxorubicin, daunorubicin, mitomycin) , pleomycin, idarubicin, mitoxantrone HCl, etc.), but are not limited thereto.
  • topoisomerase inhibitors e.g., camptothecin, epipodophyllotoxin, taxane-based drugs (dositaxel, paclitaxel)
  • antibiotics e.g., dactinomycin, doxorubicin, daunorubicin, mitomycin
  • pleomycin e.g., idarubicin, mitoxantrone HCl, etc.
  • the target anticancer agent is an anticancer agent that induces the death of cancer cells by inhibiting a target protein (receptor or enzyme) involved in cancer growth, the meaning of which is as commonly used in the art to which the present invention belongs.
  • the cytotoxic anti-cancer agent includes target protein (tyrosine kinase, etc.) inhibitory low-molecular-weight compounds and monoclonal antibodies.
  • the targeted anticancer agent may be a receptor tyrosine kinase inhibitor targeting one or more targets selected from the group consisting of VEGF-A and EGFR.
  • the targeted anti-cancer agent that can be co-administered with the ADP-ribose binding peptide is a VEGF-A inhibitor.
  • VEGF-A inhibitors include monoclonal antibodies such as bevacizumab, ranibizumab, aflibercept, and ramucirumab, sunitinib, and pazopa. and low molecular weight compounds such as pazopanib, sorafenib, and axitinib, but are not limited thereto.
  • the targeted anti-cancer agent that can be co-administered with the ADP-ribose binding peptide is an EGFR inhibitor.
  • the EGFR inhibitor is osimertinib, gefitinib, erlotinib, afatinib, brigatinib, icotinib, vandetanib ( vandetanib) and monoclonal antibodies such as cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, and matuzumab. Not limited to this.
  • target anticancer agent of the present invention also includes HER2 targeting anticancer agents such as lapatinib, neratinib, and afatinib, imatinib, dasatinib, and nilotyi.
  • HER2 targeting anticancer agents such as lapatinib, neratinib, and afatinib, imatinib, dasatinib, and nilotyi.
  • Bcr-Abl targeted anti-cancer drugs such as nilotinib; Src target anti-cancer agents such as bosutinib; JAK target anti-cancer drugs such as lestaurtinib, ruxolitinib, pacritinib; MAP2 Kinase target anticancer drugs such as cobimethinib, selumetinib, trametinib, and binimetinib; It includes MEL4-ALK target anticancer drugs such as ceritibin and crizotinib, and is not particularly limited thereto.
  • the second anticancer agent of the present invention may be a combination of one or more cytotoxic anticancer agents and/or target anticancer agents, which may be administered simultaneously or at different times.
  • immuno-anticancer agents refer to drugs that activate the body's immune system to fight cancer cells.
  • immuno-anticancer agents include immune checkpoint inhibitors, immune cell therapy agents, anti-cancer vaccines, and antibody-drug conjugates, and appropriate types can be selected for complete cure, control, and symptom relief of cancer depending on the type and progress of cancer. .
  • the immuno-anticancer agent can be an immune checkpoint inhibitor, a PD-1 antibody, a PD-L1 antibody, a CTLA-4 antibody, a CD28 antibody, a KIR antibody, a TCR antibody, a LAG-3 antibody, a TIM-3 antibody, It may be one or more selected from the group consisting of TIGIT antibody, A2aR antibody, ICOS antibody, OX40 antibody, 4-1BB antibody, and GITR antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 antibody such as nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, pidilizumab, toripalimab; PD-L1 antibodies such as atezolizumab, avelumab, duralumab; It may be a CTLA-4 antibody such as ipilimumab and tremelimumab, but is not limited thereto.
  • the immuno-anticancer agent may be an immune cell therapy agent, and may be a CAR-T agent such as tisagenlecleucel or axicabtagene ciloleucel, or a CAR-NK agent, but is not limited thereto. It is not.
  • cancer metabolism agents refer to drugs that are involved in the growth and survival of cancer cells, such as supplying nutrients to cancer cells, or are involved in various essential metabolic reactions to kill cancer cells.
  • the anti-metabolism agents include, for example, IM-156, 3-bromopyruvic acid (3BP), NYH817100, WZB117, GNE-140, AZ93, AZD3965, CPI-613, MKT-077, CB-839, CB-1158, CPI-444, TVB-2640, NDI-010976, TCD-717, ADI-PEG20, Epacadostat, Indoximod, PX478, CPI-0610, RTA402, APO866, GMX1778, AG-221 or AG-120 etc., but is not limited thereto.
  • the ADP-ribose binding peptide of the present invention can be used as an anti-cancer adjuvant because it has the effect of enhancing reactivity to a second anti-cancer agent by disrupting the balance of ADP-ribose in cancer cells, so the type of second anti-cancer agent used or the type of cancer Not particularly limited.
  • the cancer may be solid cancer such as brain cancer, lung cancer, pancreatic cancer, liver cancer, breast cancer, colon cancer, kidney cancer, stomach cancer, or ovarian cancer, but is not limited thereto.
  • the ADP-ribose binding peptide of the present invention can not only be co-administered in a form that exists independently of the second anticancer agent, but also forms a physical/chemical bond with the second anticancer agent by any known method depending on the purpose can be administered.
  • the ADP-ribose-binding peptide may be used in a state of being directly coupled to the second anti-cancer agent, or may be used in a state of being connected to the second anti-cancer agent through a known linker, and the ADP-ribose-binding peptide of the present invention may be used in combination with the second anti-cancer agent.
  • the method of application is not particularly limited as long as it works together to exhibit an increased anticancer effect.
  • the ADP-ribose binding peptide of the present invention can enhance the response of the second anticancer agent, so it can be used very usefully as an anticancer supplement, and has excellent anticancer activity even when the second anticancer agent is treated at a low concentration, Possible side effects can be minimized.
  • Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for adjuvant anti-cancer treatment, comprising the ADP-ribose-binding peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, enhancing responsiveness to radiation anti-cancer treatment.
  • ADP-ribose-binding peptides and pharmaceutically acceptable salts thereof are as described above.
  • radiation anti-cancer treatment refers to a therapeutic action of irradiating cancer cells or tumor tissue with radiation for the purpose of killing cancer cells.
  • standard treatment for controlling inoperable or inoperable tumors, or tumor metastasis is based on the principle that radiation delivered to a target site causes the death of reproductive cells.
  • Radiation anticancer treatment in the present invention may be ionizing radiation therapy, electromagnetic radiation therapy, brachytherapy or external beam radiation therapy, but is not limited thereto.
  • the composition containing the ADP-ribose binding peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention exhibits a synergistic anticancer effect when used in combination with radiation therapy, it is used as an anticancer adjuvant for radiation therapy or a radiation sensitizer that improves radiation sensitivity.
  • the type of applicable cancer is not particularly limited.
  • the cancer may be solid cancer such as brain cancer, lung cancer, pancreatic cancer, liver cancer, breast cancer, colon cancer, kidney cancer, stomach cancer, and ovarian cancer, but is not limited thereto.
  • the solid cancer may be resistant to radiation therapy. Since the anticancer effect of radiation therapy is manifested by the formation of DNA breaks, resistance to radiation therapy is generally determined by mechanisms capable of repairing DNA damage induced by radiation therapy. As a method of increasing the anticancer efficacy of radiation therapy, many attempts have been made to inhibit DNA repair mechanisms, and when repair of damaged DNA strands is blocked, the sensitivity of radiation therapy can be increased.
  • the two main types of DNA damage are single strand breaks (SSB) and double strand breaks (DSB). Therefore, it can be described as two categories of recovery paths targeting SSB and DSB.
  • Base Excision Repair (BER) is one of several pathways involved in the repair of selected types of DNA SSBs.
  • PARP1 plays an important role in the BER of DNA SSBs through a process known as ADP-ribosylation.
  • PARP1 senses damage to SSB DNA and recruits the DNA repair complex through ADP-ribosylation to the SSB site for repair. Since the overaccumulation of poly-ADP-ribose synthesized through ADP-ribosylation by PARP-1 activity ultimately leads to cell death, cancer cells use proteasomes such as PARG or ARH3 to prevent this phenomenon. It activates the degradation of poly-ADP-ribose through the activation of survival signaling activity.
  • ADP-ribose or ADP-ribose polymer in cancer cells can act as a medium that can disrupt these biochemical survival mechanisms of cancer cells, and can be used as an important anti-cancer adjuvant to overcome resistance to radiation therapy. conceived.
  • the ADP-ribose-binding peptide of the present invention when the ADP-ribose-binding peptide of the present invention was treated in combination with low-dose radiation in different cancer types, it was confirmed that the responsiveness to radiation treatment was enhanced in all cancer types (Fig. 15 and FIG. 16). Therefore, the ADP-ribose-binding peptide of the present invention can enhance the response to radiation therapy, so it can be used very usefully as an adjuvant anti-cancer application. Since it has excellent anti-cancer activity even when irradiated with radiation at a tolerable dose, side effects that may occur due to radiation can be minimized.
  • Embodiments of the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below.
  • embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
  • "include” a certain component throughout the specification means that other components may be further included without excluding other components unless otherwise stated.
  • the ADP-ribose binding peptides of Examples 1 to 14 were synthesized from WE domains present in various types of proteins, and were used in experiments. Specific information of the peptides used are shown in Table 1 below.
  • Example Sequence information (SEQ ID NO) derived protein One VPYIIDLQSMHQFRQDTGTMRPVRR (SEQ ID NO: 1) DTX1 2 APYIIDLQSMNQFRQDTGTLRPVRR (SEQ ID NO: 2) DTX4 3 APYIIDLPSWTQFRQDTGTMRAVRR (SEQ ID NO: 3) DTX2 4 RVYTIDFNSMQQINEDTGTARAIQR (SEQ ID NO: 4) TRIP12 5 FCYLIYFNSMSQMNRQTRRRRRRLRR (SEQ ID NO: 5) PARP7 6 FSYVIDFNTMGQINRQTQRQRRVRR (SEQ ID NO: 6) PARP12 7 FSYKIDFAEMKQMNLTTGKQRLIKR (SEQ ID NO: 7) PARP11 8 YNYTVNYTTHTQTNKTSSFCRSVRR (SEQ ID NO: 8) PIK3C2G 9 RRYTVQFTTM
  • Examples 15 to 28 were prepared by binding a cell-penetrating peptide to the N-terminus of the peptides of Examples 1 to 14. Peptide sequences of Examples 15 to 28 are shown in Table 2.
  • the peptides of Examples 1 to 28 of the present invention are designed to inhibit the action of poly ADP-ribose degrading enzyme.
  • Experimental Example 1 it was confirmed whether degradation of poly ADP-ribose was inhibited by each of the peptides and accumulated in cancer cells through cell experiments.
  • 5 ⁇ 10 5 H1975 cells were treated with RPMI-1640 medium containing 10% FBS, 100 units/ml penicillin and 100 ⁇ g/ml streptomycin at 37 °C and 5% CO 2 conditions, and the group not treated with the example peptide 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, 32 ⁇ M of the peptide of Example 2 (SEQ ID NO: 2) was divided into groups treated and cultured for 24 hours.
  • the medium of the cultured cells was removed and treated with RIPA buffer and 1% SDS.
  • the prepared supernatant was used for ELISA analysis to detect and analyze ADP-ribose.
  • the upper right of Figure 1 and the upper left of Figure 3 show the increase in ADP-ribose compared to the control group according to the peptide treatment of Example 2 or Example 9 in H1975 cells as fold change, compared to the untreated group. It shows that the amount of ADP-ribose significantly increased in a concentration-dependent manner (** p ⁇ 0.001).
  • the bottom left of Figure 1 and the top right of Figure 3 show the increase in ADP-ribose as fold change compared to the control group according to the treatment with the peptide of Example 3 or Example 10 in Aspc-1 cells, compared to the untreated group. It shows that the amount of ADP-ribose significantly increased in a concentration-dependent manner of the prepared peptide (** p ⁇ 0.001).
  • Hep G2 cells were treated with EMEM medium containing 10% FBS, 100 units/ml penicillin and 100 ⁇ g/ml streptomycin at 37°C, 5% CO 2 conditions, and the group not treated with the example peptide and 0.2 , 1, 2, 4, 8, 16, 32 ⁇ M of the peptide of Example 4 (SEQ ID NO: 4) was divided into groups treated and cultured for 24 hours.
  • the medium of the cultured cells was removed and treated with RIPA buffer and 1% SDS.
  • the prepared supernatant was used for ELISA analysis to detect and analyze ADP-ribose.
  • the bottom right of Figure 1 and the bottom left of Figure 3 show the increase in ADP-ribose compared to the control group according to the peptide treatment of Example 4 or Example 11 in Hep G2 cells as fold change, compared to the untreated group. It shows that the amount of ADP-ribose significantly increased in a concentration-dependent manner of the peptide (** p ⁇ 0.001).
  • 5 ⁇ 10 5 MDA-MB-231 cells were cultured in Leibovitz's L-15 medium containing 10% FBS, 100 units/ml penicillin, and 100 ⁇ g/ml streptomycin at 37 °C and 5% CO 2 conditions, and the example peptides Divided into groups untreated and groups treated with 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, and 32 ⁇ M of the peptide of Example 5 (SEQ ID NO: 5), and cultured for 24 hours.
  • the medium of the cultured cells was removed and treated with RIPA buffer and 1% SDS.
  • the prepared supernatant was used for ELISA analysis to detect and analyze ADP-ribose.
  • FIG. 2 and the lower right side of FIG. 3 show the increase in ADP-ribose as fold change compared to the control group according to the treatment with the peptide of Example 5 or Example 12 in MDA-MB-231 cells, compared to the untreated group. It shows that the amount of ADP-ribose significantly increased in a concentration-dependent manner compared to the treated peptide (** p ⁇ 0.001).
  • FIG. 5 and the top right of FIG. 8 are representative photomicrographs of groups treated with and without the peptides of Examples 1, 15, 8, and 22 in U-87MG cells, respectively.
  • the group not treated with the peptide it was observed that U-87MG cells rapidly grew, whereas in the group treated with the peptide of the present invention, the growth of U-87MG cells was inhibited and died. shape can be observed.
  • cancer cells were completely killed in the groups treated with the cell-penetrating peptide (CPP)-attached peptides of Examples 15 and 22.
  • CPP cell-penetrating peptide
  • FIG. 5 and the upper left of FIG. 9 are representative photomicrographs of H1975 cells treated with and without the peptides of Examples 2, 16, 9, and 23, respectively.
  • rapid growth of H1975 cells could be observed, whereas in the group treated with the peptide of the present invention, the growth of H1975 cells was inhibited and apoptosis was observed. can do.
  • cancer cells were completely killed in the groups treated with the peptides of Examples 16 and 23 to which CPP was attached.
  • FIG. 6 and the top right of FIG. 9 are representative photomicrographs of Aspc-1 cells treated with the peptides of Examples 3, 17, 10, and 24, respectively, and groups not treated.
  • the group not treated with the peptide rapid growth of Aspc-1 cells could be observed, whereas in the group treated with the peptide of the present invention, the growth of Aspc-1 cells was inhibited and died. shape can be observed.
  • cancer cells were completely killed in the group treated with the peptides of Examples 17 and 24 to which the cell penetrating peptide CPP was attached.
  • FIG. 6 and the upper left of FIG. 10 are representative photomicrographs of Hep G2 cells treated with and without the peptides of Examples 4, 18, 11, and 25, respectively.
  • the group not treated with the peptide it was observed that Hep G2 cells rapidly grew, whereas in the group treated with the peptide of the present invention, the growth of Hep G2 cells was inhibited and they died. can be observed.
  • cancer cells were completely killed in the group treated with the peptides of Examples 18 and 25 to which the cell penetrating peptide CPP was attached.
  • FIG. 7 and the upper right of FIG. 10 are representative photomicrographs of the groups treated with and without the peptides of Examples 5, 19, 12, and 26 in MDA-MB-231 cells, respectively.
  • the group not treated with the peptide rapid growth of MDA-MB-231 cells could be observed, whereas in the group treated with the peptide of the present invention, the growth of MDA-MB-231 cells A suppressed and dying form can be observed.
  • cancer cells were completely killed in the group treated with the peptides of Examples 19 and 26 to which CPP was attached.
  • FIG. 7 and the upper left of FIG. 11 are representative photomicrographs of HCT116 cells treated with and without the peptides of Examples 6, 20, 13, and 27, respectively.
  • rapid growth of HCT116 cells was observed in the group not treated with the peptide, whereas growth of HCT116 cells was inhibited and death was observed in the group treated with the peptide of the present invention. can do.
  • cancer cells were completely killed in the group treated with the peptides of Examples 20 and 27 to which the cell penetrating peptide CPP was attached.
  • FIG. 8 and the upper right of FIG. 11 are representative photomicrographs of groups treated with and without the peptides of Examples 7, 21, 14, and 28 in Caki-1 cells, respectively.
  • a rapid growth of Caki-1 cells could be observed, whereas in the group treated with the peptide of the embodiment of the present invention, the growth of Caki-1 cells was inhibited and died. shape can be observed.
  • cancer cells were completely killed in the groups treated with the peptides of Examples 21 and 28 to which CPP was attached.
  • the anticancer effect represented by the reduction of cancer cell survival by existing anticancer drugs
  • the existing anticancer drugs are treated and the accumulation of ADP-ribose is induced, the existing anticancer drugs are delivered to cancer cells at the required concentration. Even if treated below, it was expected to exhibit an increased anticancer effect.
  • the Example peptides of the present invention significantly increase the amount of ADP-ribose in cancer cells. I wanted to make sure it showed up.
  • Figure 18 shows representative tumor photographs obtained after autopsy in all groups, and it was observed that the growth of tumor tissue was significantly inhibited in all groups subcutaneously injected with the peptides of the examples of the present invention when compared to the control group.
  • Figure 20 shows representative tumor photographs obtained after autopsy in all groups. When compared with the control group, it was observed that the growth of tumor tissue was significantly inhibited in all groups orally administered with the peptides of the examples of the present invention.
  • peptides of the present invention show cytotoxicity even in normal cells.
  • human colon fibroblasts, CCD-18Co, and human dermal papilla cells, HDPC were used as normal cells, and the peptide of SEQ ID NO: 7 was used as an exemplary peptide of the present invention.

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Abstract

본 발명은 항암 활성을 갖는 ADP (adenosine diphosphate)-리보오스 결합 펩티드에 관한 것으로, 구체적으로 특정 아미노산 서열의 ADP-리보오스 결합 펩티드 및 이의 변형물, 그리고 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 항암 보조용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 암 세포 내 ADP-리보오스를 축적시킴으로써 세포의 균형을 망가뜨려 암 세포를 사멸에 이르게 하면서도 정상 세포에는 독성을 나타내지 않는 우수한 항암 효과를 가지며, 다른 항암제의 투여나 방사선 항암 치료시 병용 투여될 경우 항암제 및 방사선 치료에 대한 반응성을 증진시켜 항암 보조제로서도 매우 우수한 효과를 가진다.

Description

항암 활성을 가지는 ADP-리보오스 결합 펩티드 및 이의 용도
본 발명은 항암 활성을 갖는 ADP (adenosine diphosphate)-리보오스 결합 펩티드에 관한 것으로, 구체적으로 특정 아미노산 서열의 ADP-리보오스 결합 펩티드 및 이의 변형물, 그리고 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 항암 보조용 약학적 조성물에 관한 것이다.
PARylation (poly ADP-ribosylation)은 번역 후 변형 (post-translation modification) 과정의 하나로, PAR 중합효소에 의해 ADP-리보오스 폴리머 (poly(adenosine diphosphate-ribose))가 단백질에 공유 결합으로 부착되는 과정을 말한다. PARylation을 통해 고분자 ADP-리보오스 체인을 생성하게 되는데, 아세틸화 또는 메틸화와 같은 작은 분자적 차원의 변형이 아니고 유비퀴틴화 (ubiquitination) 또는 수모화 (SUMOylation)와 같은 형태를 나타내지 않는 독특한 세포 내 생화학적 작용을 유도할 수 있다. PARylation의 균형은 DNA 손상 복구, 전사의 조절, 염색질 구조 변경, 산화/환원 항상성, 세포내 다양한 신호 전달, 비-막 (non-membrane) 구조 형성, 숙주-병원체 상호 작용 및 RNA 대사 조절에 중요한 부분을 담당하고 있다 (Juan et al., Cancers, 2020, 12(3): 739).
PARylation은 암, 바이러스 감염 및 신경 퇴행을 포함한 전신 질환의 발병에 연루되어있으며, 특히 PARylation은 PARP-1의 활성화로부터 유래되기 때문에 PARP-1의 활성을 억제하는 방법으로 난소암, 전립선암, 유방암 및 기타 암을 표적으로 하는 항암 효능은 이미 잘 알려져 있다 (J Mateo et al., Ann Oncol., 2019, 30(9): 1437).
PARylation 매개 세포 사멸과 관련한 생화학적 기전 정보는 비교적 최근에 알려지게 되었으며 PARylation의 활성화는 대표적으로 세 가지 주요 경로를 통해 세포의 사멸을 유발할 수 있다. (Rebecca Gupte et al., Genes Dev. 2017, 31(2): 101).
NAD+의 고갈은 세포 에너지 위기 (ATP 고갈)에서 발생하는 세포 대사, 특히 산화적 인산화 과정을 손상시킬 수 있다. 광범위한 DNA 손상에 의해 유도된 PARylation 활성화가 NAD+를 소비하며 이 작용의 후속 효과로 인해 세포를 사멸시킬 수 있다고 제안되었다.
또한, DNA 복구 후 핵에서 방출된 PAR 폴리머가 세포질 내 미토콘드리아 막에 묶여 있는 세포 사멸 유도 인자를 해방시켜 핵 내부로 세포 사멸 유도 인자를 동원시키는 경로를 활성화시킬 수 있다. 세포 사멸 인자가 핵으로 이동하면 대규모 DNA 단편화를 매개시켜 세포의 사멸을 유도한다. PARylation에 의한 에너지 고갈 및 세포 사멸 유도 인자는 PI3K-Akt 경로 또는 MAP 키나아제 경로와 같은 단백질 키나아제-포스파타아제 경로를 제어하는 PAR의 신호 전달과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 PAR 의존성 세포 사멸 과정은 상당한 수준으로 사멸 기전의 복잡성에 기여하고 있다.
그리고 아직 명확한 생화학적 기전이 밝혀지지 않았지만 PARP-1의 autoPARylation을 통해 PARP-1 자체를 분해시키고 세포 사멸을 유도할 수 있는 것으로 보고되어 있다. 하지만 암은 이 사멸 과정을 막기 위해 여러 단백질 분해 효소를 활성화하여 암의 생존에 필요한 다양한 생화학적 작용에 관여했던 잉여의 PAR 폴리머를 분해하는 것으로 이 사멸작용을 영리하게 회피할 수 있다.
따라서, 기존의 PARP-1 억제제와 같은 PARylation 억제를 위한 시도와는 반대로 PARylation을 활성화시키거나 PAR 폴리머의 분해를 억제하는 것 역시 효과적인 항암 치료법 발굴을 위한 하나의 전략이 될 수 있다. 특히, PARylation 활성화 또는 PAR 폴리머의 분해 억제는 정상 세포와는 다른 방식의 대사 과정을 거치는 암 세포 특이적인 영역에서 매우 유망한 표적이라고 볼 수 있다.
본 발명자들은 신규 항암제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 본 발명의 신규 아미노산 서열을 갖는 펩티드들이 ADP-리보오스와의 결합을 통해 궁극적으로 세포 내 다양한 분해 효소나 신호전달 단백질들의 작용으로부터 ADP-리보오스 또는 PAR 폴리머를 활용하지 못하게 하여 PARylation을 과활성화하고 PAR 중합효소의 분해 과정을 교란시킬 수 있으며, 이 교란의 결과로 암 세포의 사멸을 유도하여 획기적인 항암 효능을 낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, ADP (adenosine diphosphate)-리보오스 결합 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 제2항암제에 대한 반응성을 증진시키는 항암 보조용 약학적 조성물 및 방사선 항암 치료에 대한 반응성을 증진시키는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 암의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도, 및 상기 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 암 세포 내 ADP-리보오스를 축적시킴으로써 세포의 균형을 망가뜨려 암 세포를 사멸에 이르게 하면서도 정상 세포에는 독성을 나타내지 않는 우수한 항암 효과를 가지며, 다른 항암제의 투여나 방사선 항암 치료 시 병용 투여될 경우 항암제 및 방사선 치료에 대한 반응성을 증진시켜 항암 보조제로서도 매우 우수한 효과를 가진다.
도 1은 서열번호 1 내지 4의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 농도별로 처리한 뒤 세포 내 폴리 ADP-리보오스의 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호 5 내지 8의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 농도별로 처리한 뒤 세포 내 폴리 ADP-리보오스의 수준을 나타낸 것이다.
도 3은 서열번호 9 내지 12의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 농도별로 처리한 뒤 세포 내 폴리 ADP-리보오스의 수준을 나타낸 것이다.
도 4는 서열번호 13 및 14의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 농도별로 처리한 뒤 세포 내 폴리 ADP-리보오스의 수준을 나타낸 것이다.
도 5는 서열번호 1, 서열번호 15, 서열번호 2 및 서열번호 16의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 처리한 뒤 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 상단 도면은 세포 사진을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 6은 서열번호 3, 서열번호 17, 서열번호 4 및 서열번호 18의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 처리한 뒤 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 상단 도면은 세포 사진을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 7은 서열번호 5, 서열번호 19, 서열번호 6 및 서열번호 20의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 처리한 뒤 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 상단 도면은 세포 사진을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 8은 서열번호 7, 서열번호 21, 서열번호 8 및 서열번호 22의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 처리한 뒤 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 상단 도면은 세포 사진을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 9는 서열번호 9, 서열번호 23, 서열번호 10 및 서열번호 24의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 처리한 뒤 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 상단 도면은 세포 사진을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 10은 서열번호 11, 서열번호 25, 서열번호 12 및 서열번호 26의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 처리한 뒤 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 상단 도면은 세포 사진을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 11은 서열번호 13, 서열번호 27, 서열번호 14 및 서열번호 28의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 처리한 뒤 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 상단 도면은 세포 사진을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 12는 서열번호 15 내지 서열번호 28의 펩티드를 각기 다른 암 세포에 처리한 뒤 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 서로 다른 암 세포에 베바시주맙 (bevacizumab, 좌측) 또는 오시메르티닙 (Osimertinib, 우측) 단독, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 14의 펩티드와 병용 처리한 뒤 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 14는 서로 다른 암 세포에 젬시타빈 (gemcitabine, 좌측) 또는 도시탁셀 (docetaxel, 우측) 단독, 또는 서열번호 15 내지 서열번호 28의 펩티드와 병용 처리한 뒤 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 15는 서로 다른 암 세포에 2 Gy의 방사선 조사 단독, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 14의 펩티드와 병용 처리한 뒤 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 16은 서로 다른 암 세포에 2 Gy의 방사선 조사 단독, 또는 서열번호 15 내지 서열번호 28의 펩티드와 병용 처리한 뒤 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 17은 종양 이식 동물 모델에서 서열번호 15 내지 서열번호 28의 펩티드를 피하에 투여한 뒤 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 것이다.
도 18은 종양 이식 동물 모델에서 서열번호 15 내지 서열번호 28의 펩티드를 피하에 투여한 뒤 확인한 종양 조직의 사진이다.
도 19는 종양 이식 동물 모델에서 서열번호 1 내지 서열번호 14의 펩티드를 경구로 투여한 뒤 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 것이다.
도 20은 종양 이식 동물 모델에서 서열번호 1 내지 서열번호 14의 펩티드를 경구로 투여한 뒤 확인한 종양 조직의 사진이다.
도 21은 대표적으로 서열번호 7의 펩티드의 정상세포 (CCD-18Co)에 대한 독성을 평가한 결과이다.
도 22는 대표적으로 서열번호 7의 펩티드의 정상세포 (HDPC)에 대한 독성을 평가한 결과이다.
도 23은 서열번호 7의 펩티드의 구조를 나타낸 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, ADP (adenosine diphosphate)-리보오스 결합 펩티드다.
본 발명에서 용어 "ADP-리보오스"는 분리된 ADP-리보오스 자체 및 ADP-리보오스 중합체 (poly ADP-ribose)를 모두 포함하는 개념으로 사용되었으며, "ADP-리보오스 결합 펩티드"는 ADP-리보오스 또는 ADP-리보오스 중합체에 결합하여 분해를 억제하는 활성을 갖는 모든 펩티드를 의미한다. 본 발명에서 상기 펩티드는 단순히 이를 구성하는 아미노산 간의 펩티드 결합에 의해 형성된 것뿐만 아니라, 단백질 의약품의 관점에서 안정성, 효능 등의 특성을 개선시키기 위해 일부 변형된 형태를 갖는 모든 형태의 펩티드 유사체, 유도체 등의 변형물도 포함한다.
본 발명자들은 종래 PARP-1 억제제에 의해 PARylation (poly ADP-ribosylation)이 억제되는 측면에서 항암 효능이 다수 보고된 것과는 전혀 다른 측면에서, PARylation의 활성화 또는 PAR 폴리머의 분해 억제를 통해서도 항암 효과를 기대할 수 있다는 점에 주목하였다. 특히, 암 세포는 정상 세포에 비해 빠른 속도로 계속 분열하고 활발히 대사 활동을 하므로, PARylation을 과활성화시키거나 PAR 폴리머의 분해를 억제함으로써 PARylation을 과활성화 하지 않는 정상 세포에는 특별한 영향 없이 암 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있을 것으로 기대하였다.
본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 14 (표 1)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 ADP (adenosine diphosphate)-리보오스 결합 펩티드들은 모두 WWE 도메인으로부터 유래되었다. WWE 도메인은 deltex, Trip12, 폴리-ADP-리보오스 중합효소 동족체 (homolog) 등 다수의 단백질에서 보존된 구형 도메인 (globular domain)으로, 도메인 내 가장 많이 보존된 잔기의 이름을 따서 명명되었다 (L. Aravind, TRENDS in Biochemical Sciences, 2001, 26(5): 273). WWE 도메인을 갖는 일부 단백질들에서 상기 도메인 내 ADP-리보오스 결합 모티프가 존재하는 것으로 알려진 바 있다. 세포 내 효소들의 WWE 도메인은 주로 ADP-리보오스에 결합하여 분해를 유도하는 것으로 보고되었다. 즉, WWE 도메인을 통해 특정 효소가 PAR 또는 ADPR에 결합하는 것은 암 세포 생존을 위한 목적이 크다고 볼 수 있다 (PNAS　August 23, 2011　108　(34)　14103-14108).
그러나 본 발명에서와 같이 WWE 도메인의 일 부분을 분리된 펩티드로 제조하여 세포에 처리하였을 때 반대로 ADP-리보오스 분해가 억제되고, 세포 내 ADP-리보오스가 축적되며, 결과적으로 우수한 항암 효과를 가진다는 것은 전혀 보고된 바 없다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 여러 종류의 단백질 내에 존재하는 WWE 도메인들로부터 그 단편들을 합성하고 이들의 항암 활성을 조사하였다. 그 결과, 실시예 1 내지 14의 ADP-리보오스 결합 펩티드들 (서열번호 1 내지 14)을 다양한 종류의 암 세포에 처리했을 때 암 세포 내 ADP-리보오스의 수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였다 (도 1 내지 도 4). 나아가 상기 펩티드들의 처리로 인해 세포 내 ADP-리보오스의 균형이 망가져 암 세포의 성장이 억제되고 대부분 사멸하는 것을 시험관 내 (in vitro) 실험을 통해 확인하였으며 (도 5 내지 도 11), 종양 이식 동물 모델에서도 실시예 1 내지 14의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 피하 또는 경구로 투여했을 때 생체 내 (in vivo) 종양 조직의 성장이 급격히 감소하는 것을 확인하였다 (도 19 및 도 20).
또한, 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 대표적으로 서열번호 7의 펩티드를 정상 세포에 처리하여 정상 세포에 대한 세포 독성을 평가하였다. 그 결과, 정상 세포에는 아무런 독성도 나타내지 않은 것을 확인하였다 (도 21 및 도 22).
따라서 본 발명의 서열번호 1 내지 14의 ADP-리보오스 결합 펩티드들은 암 종에 관계없이 매우 우수한 항암 효과를 가지고, 정상 세포에는 세포 독성을 전혀 나타내지 않으므로, 암의 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 ADP-리보오스 결합 펩티드는 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드들뿐만 아니라 이들 서열로부터 하나 이상의 아미노산이 부가, 치환 또는 결실된 서열도 균등 범위에 해당하는 경우라면 모두 본 발명의 범주에 속한다.
예를 들어, 본 발명의 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 적어도 80 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 97 % 이상, 또는 99 % 이상 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 상응하는 효능, 즉 ADP-리보오스 결합 활성 및 항암 활성을 나타내는 펩티드라면, 서열번호 1 내지 14의 아미노산 서열로부터 일부 서열이 부가, 치환 또는 결실된 아미노산 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 상응하는 활성을 가지는 경우라면 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열은 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수 (score), 동일성 (identity) 및 유사도 (similarity) 등의 매개 변수 (parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건 하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 추가적으로 원하는 특성을 개선시키기 위해 펩티드를 구성하는 하나 이상의 아미노산에서 화학적 유도체화 등의 변형을 포함할 수 있으며, 이러한 변형에도 불구하고 본 발명의 펩티드와 동등한 항암 활성을 갖는 한 모두 본 발명의 범주에 해당됨은 당업자에게 자명한 것이다. 상기 유도체화는 아세틸화, 하이드록실화, 메틸화, 아미드화, 페길화, 및 탄수화물 또는 지질 성분, 보인자 등의 부가를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 하나의 양태로서, 상기 펩티드는 세포 투과성을 높이기 위하여 추가적으로 세포 투과성 펩티드 (cell-penetrating peptide)와 융합한 형태로 이용될 수 있다. 즉, 상기 ADP-리보오스 결합 펩티드는 N-말단, C-말단 또는 양 말단에 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, ADP-리보오스 결합 펩티드 및 세포 투과성 펩티드 사이에 링커를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 적절히 수행될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "세포 투과성 펩티드"는 나노입자, 화합물, DNA, 단백질 등 다양한 물질들의 세포 내 섭취/흡수를 촉진시킬 수 있는 특성을 가진 펩티드를 말한다. 구체적으로, 상기 세포 투과성 펩티드는 TAT, 마우로칼신 (maurocalcine), 페네트라틴 (penetratin), 폴리-알지닌 (Poly-arginine) 유래 펩티드, 안테나페디아 (Antennapedia), 트랜스포탄 (Transportan), VP22, Hph-1, 폴리-알지닌 (Poly-arginine), R11(R9), Pep-1, HP4, LAH4, Vetofusing-1, 시그널 서열 기반 펩티드, 또는 양친매성 (Amphipathic) 펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드의 세포 내 이동을 촉진시킬 수 있는 것이라면 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 서열번호 1 내지 14의 ADP-리보오스 결합 펩티드의 N-말단에 세포 투과성 펩티드인 TAT를 융합하여 그 항암 활성을 평가하였다 (서열번호 15 내지 서열번호 24, 표 2). 그 결과, ADP-리보오스 결합 펩티드 단독으로 사용한 경우 보다도 더 뛰어난 항암 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다 (도 5 내지 도 12, 도 17 및 도 18). 따라서 본 발명의 서열번호 1 내지 14의 ADP-리보오스 결합 펩티드뿐만 아니라 상기 펩티드에 세포 투과성 단백질이 융합된 형태 역시 암의 예방 또는 치료용 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 당업자는 사용되는 세포 투과성 펩티드의 종류에 따라서 이를 적용하기 위해 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 이를 세포 투과성 펩티드에 융합하여 사용할 경우에도 본 발명에서 제시하는 아미노산 서열에만 한정되는 것이 아니며, 당업자에게 자명한 범위, 즉 균등 범위 내에서 세포 투과성 펩티드의 적용에 적절한 형태로 아미노산 서열을 부가/치환/제거하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 세포 투과성을 높이기 위해, 세포에 단백질을 전달시키거나 전달 효율을 증진시킬 수 있는 당업계에 공지된 시약과 함께 사용될 수 있다. 상기 시약은 예컨대, ChariotTM (Active motif, Cat. 30025), XflectTM (Takara, Cat. 631324), PierceTM (ThermoFisher Scientific, Cat. 89850), ProteoJuiceTM (Merck, Cat. 71281), PULSinTM (Poylplus transfection) 등의 상업적으로 판매되는 시약뿐만 아니라 기타 비상업적 시약을 모두 포함하며, 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 세포에 전달시킬 수 있는 한 상기 예에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 ADP-리보오스 결합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환체이다.
ADP-리보오스 결합 펩티드는 상기 설명한 바와 같다.
상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 80 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 97 % 이상, 또는 99 % 이상 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있으며, 이로부터 번역된 폴리펩티드가 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드와 상응하는 효능을 나타내는 것이라면, 뉴클레오티드 서열의 5'- 및/또는 3'- 말단에 무의미한 서열의 부가, 혹은 일부 서열의 결실, 변형, 치환된 경우 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 공지된 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결된 발현 카세트, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 형태로 사용될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터의 제조는 당업자가 공지된 방법을 통해 적절히 수행할 수 있다. 프로모터 및 벡터의 종류는 특별히 제한되지 않고 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터를 숙주 세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하여 사용할 수 있으며, 이 때의 형질전환 방법 역시 당업자가 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 형질전환체는 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 발현시키고자 하는 대상체로서, 미생물, 식물 또는 동물일 수 있고, 인간을 제외한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
당업자는 다양한 목적으로 상기 ADP-리보오스 결합 펩티드를 적용/생산하기 위하여 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 혹은 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제조하여 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드 혹은 상기 벡터를 이용하여 직접적으로 암에 대한 치료 용도로 사용할 수 있고, 이를 포함하여 ADP-리보오스 결합 펩티드를 발현하는 형질전환체를 이용하여 상기 펩티드를 생산하거나 치료 목적으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 암의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도, 및 상기 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법이다.
본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드가 암의 예방 및/또는 치료에 우수한 효과를 가진다는 것은 상술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 말한다. 본 발명에서 상기 암은 악성 종양 (malignant tumor) 및 양성 종양 (benign tumor)을 모두 포함하며, 예를 들어 뇌암, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 또는 피부암일 수 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물은 세포 내 ADP-리보오스가 축적됨으로써 세포 사멸이 일어날 수 있는 모든 암에 치료 효과를 가진다.
일례로, 상기 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암, 위암 또는 난소암과 같은 고형암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "치료"는 질병을 갖는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 개입하는 것을 지칭하고, 이는 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 특히, 본 발명에서는 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
상기 약학적 조성물에 포함되는 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 중량%는 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 90 중량%, 구체적으로 0.001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하여 제조될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경구패치 등의 경구형 제형, 외용제, 외용패치제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물이 경구 투여용으로 사용될 경우, 적절한 캡슐화(encapsulation), 장용 코팅(enteric coating), 폴리머의 배합 등을 통해 서방성 제제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서 상기 서방성 제제는 장기 작용성(long acting) 제제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 장기 작용성 제제에는 폴리머와 지질이 적절한 비율로 혼합될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암이 발병했거나 발병할 위험을 가지는 개체에 투여될 수 있다. 본 발명에서 용어, "개체"는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 대상 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 근육, 정맥, 동맥, 피하, 복강, 폐, 및 비강이 포함되며, 예컨대 피하 또는 경구로 투여되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 암을 예방 및/또는 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령, 체중 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 제약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 리튬, 구리, 망간, 아연, 철 등을 비롯한 무기이온의 염과 염산, 인산, 황산과 같은 무기산의 염이 있으며, 그 외에 아스코르브산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 글리콜산, 숙신산, 프로피온산, 아세트산, 오로테이트산, 아세틸살리실산과 같은 유기산의 염 등과 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염이 있다. 또한 약학적인 반응, 정제 및 분리과정에서 사용될 수 있는 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 테트라프로필 암모늄, 테트라부틸 암모늄, 벤질 트리메틸 암모늄, 벤제토늄 등의 유기이온의 염이 있다. 다만, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 우수한 항암 활성을 가지므로 약학적 조성물 뿐만 아니라 기능성을 가진 식품 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물의 형태로 제조될 경우, 상기 식품 조성물은 식품에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품으로 제조될 수 있으며, 여기서 건강기능성 식품(functional food)이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 상기 건강기능성 식품은 암의 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 제2항암제에 대한 반응성을 증진시키는 항암 보조용 약학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (i) 상기 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 (ii) 제2항암제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
ADP-리보오스 결합 펩티드 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 단독으로 항암 효과를 가지는 것에서 더 나아가, 제2항암제에 대한 반응성을 증진시키기 위한 목적으로 항암 보조용 약학적 조성물로서도 매우 우수한 효과를 갖는다. 따라서 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 함께 제2항암제를 유효성분으로 하여 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "제2항암제"는 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 제외한 임의의 항암 활성을 갖는 약물을 말한다. 본 발명에서 상기 제2항암제의 범위는 특별히 제한되지 않고, 암의 종류와 진행 정도에 따라 암의 완치, 조절, 증상 완화 등의 목적에 따라 당업자가 적절한 종류를 선택하여 사용할 수 있다. 제2항암제는 예컨대 세포독성 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제 또는 대사 항암제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 세포독성 항암제는 정상 세포에 비해 빠른 속도로 무분별하게 분열하는 암 세포를 공격하여 항암 효과를 나타내는 약물로, 그 의미는 본 발명이 속한 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같다. 상기 세포독성 항암제는 알킬화제, 항대사제 (antimetabolite), 천연물 항암제를 포함한다.
상기 알킬화제는 질소 머스타드 (예컨대, 시클로포스파미드, 클로르메틴, 우라머스틴, 멜팔란, 클로람부실, 이포스파미드, 벤다머스틴 등), 알킬 설포네이트 (예컨대, 부설판, 프로카바진 등), 니트로소우레아 (예컨대, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신 등), 백금 기반 알킬화제 (예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 디시클로플라틴, 엡타플라틴, 로바플라틴, 미리플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 피코플라틴, 사트라플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트 등)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 알킬화제는 암 세포 내 DNA에 결합하여 DNA 구조를 손상시킴으로써 암 세포의 파괴를 유발할 수 있다.
상기 항대사제는 피리미딘 유도체 (예컨대, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 시스타라빈, 젬시타빈, 플루다라빈 등), 폴레이트 유도체 (예컨대, 메토트렉세이트, 페메트렉시드 등), 퓨린 유도체 (예컨대, 머캅토퓨린 등)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항대사제는 DNA 복제 및 세포 생존에 필요한 대사를 억제함으로써 암 세포 사멸을 유도할 수 있다.
상기 천연물 항암제로는 토포이소머라제 억제제 (예컨대, 캄프토테신, 에피포도필로톡신, 탁산 계열 약물 (도시탁셀, 파클리탁셀)), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 마이토마이신, 플레오마이신, 이다루비신, 미톡산트론 HCl 등)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 표적 항암제는 암의 성장에 관여하는 타겟 단백질 (수용체 또는 효소)을 억제함으로써 암 세포의 사멸을 유도하는 항암제로, 그 의미는 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같다. 상기 세포독성 항암제는 표적 단백질 (티로신 키나아제 등) 억제 저분자 화합물 및 단클론항체를 포함한다.
일례로, 상기 표적 항암제는 VEGF-A 및 EGFR로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 타겟을 표적하는 수용체 티로신 키나아제 억제제일 수 있다.
일 실시양태에서, ADP-리보오스 결합 펩티드와 병용 투여될 수 있는 표적 항암제는 VEGF-A 억제제이다. 본 발명에서, VEGF-A 억제제는 베바시주맙 (bevacizumab), 라니비주맙 (ranibizumab), 아플리베르셉트 (aflibercept), 라무시루맙 (ramucirumab)과 같은 단클론 항체, 수니티닙 (sunitinib), 파조파닙 (pazopanib), 소라페닙 (sorafenib), 악시티닙 (axitinib)과 같은 저분자 화합물을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시양태에서, ADP-리보오스 결합 펩티드와 병용 투여될 수 있는 표적 항암제는 EGFR 억제제이다. 본 발명에서, EGFR 억제제는 오시메르티닙 (osimertinib), 제피티닙 (gefitinib), 엘로티닙 (erlotinib), 아파티닙 (afatinib), 브리가티닙 (brigatinib), 이코티닙 (icotinib), 반데타닙 (vandetanib)과 같은 저분자 화합물과 함께 세툭시맙 (cetuximab), 파니투무맙 (panitumumab), 잘루투무맙 (zalutumumab), 니모투주맙 (nimotuzumab), 마투주맙 (matuzumab)과 같은 단클론 항체를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이외에도 본 발명의 표적 항암제는 또한, 라파니팁 (lapatinib), 네라티닙 (neratinib), 아파티닙 (afatinib)과 같은 HER2 표적 항암제, 이매티닙 (imatinib), 다사티닙 (dasatinib), 닐로티닙 (nilotinib)과 같은 Bcr-Abl 표적 항암제; 보수티닙 (bosutinib)과 같은 Src 표적 항암제; 레스타우르티닙 (lestaurtinib), 룩소리티닙 (ruxolitinib), 파크리티닙 (pacritinib)과 같은 JAK 표적 항암제; 코비메티닙 (cobimethinib), 셀루메티닙 (selumetinib), 트라메티닙 (trametinib), 비니메티닙 (binimetinib)과 같은 MAP2 Kinase 표적 항암제; 세리티빈 (ceritibin), 크리조티닙 (crizotinib)과 같은 MEL4-ALK 표적 항암제 등을 포함하며, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 제2항암제는 하나 이상의 세포 독성 항암제 및/또는 표적 항암제의 조합일 수 있으며, 이들은 동시에 또는 이시에 투여될 수 있다.
본 발명에서, 면역항암제는 인체의 면역체계를 활성화시켜 암 세포와 싸우게 하는 약물을 말한다. 본 발명에서 면역항암제는 면역체크포인트 억제제, 면역세포치료제, 항암백신, 항체-약물접합체를 포함하며, 암의 종류와 진행 정도에 따라 암의 완치, 조절, 증상 완화를 위해 적절한 종류를 선택할 수 있다.
일 실시양태에서, 면역항암제는 면역체크포인트 억제제일 수 있으며, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, CD28 항체, KIR 항체, TCR 항체, LAG-3 항체, TIM-3 항체, TIGIT 항체, A2aR 항체, ICOS 항체, OX40 항체, 4-1BB 항체 및 GITR 항체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 면역체크포인트 억제제는 니볼루맙 (nivolumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 세미플리맙 (cemiplimab), 피딜리주맙 (pidilizumab), 토리팔리맙 (toripalimab)과 같은 PD-1 항체; 아테졸리주맙 (atezolizumab), 아벨루맙 (avelumab), 두랄루맙 (duralumab)과 같은 PD-L1 항체; 이필리무맙 (ipilimumab), 트레멜리무맙 (tremelimumab)과 같은 CTLA-4 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시양태에서, 면역항암제는 면역세포치료제일 수 있으며, 티사젠레클류셀 (tisagenlecleucel), 악시캅타젠 실로류셀 (axicabtagene ciloleucel)과 같은 CAR-T 치료제, 또는 CAR-NK 치료제일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 대사항암제는 암 세포에 영양을 공급하는 등 암 세포의 성장 및 생존에 관여하거나 필수적인 여러 대사작용에 관여하여 암 세포를 사멸시키는 약물을 말한다. 상기 대사항암제는 예컨대 IM-156, 3-브로모피루브산 (3BP), NYH817100, WZB117, GNE-140, AZ93, AZD3965, CPI-613, MKT-077, CB-839, CB-1158, CPI-444, TVB-2640, NDI-010976, TCD-717, ADI-PEG20, 에파카도스탯 (Epacadostat), 인독시모드 (Indoximod), PX478, CPI-0610, RTA402, APO866, GMX1778, AG-221 또는 AG-120 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 암 세포 내 ADP-리보오스의 균형을 망가뜨려 제2항암제에 대한 반응성을 증진시키는 효과를 가져 항암 보조제로서 사용될 수 있으므로, 사용되는 제2항암제의 종류나 암의 종류가 특별히 제한되지 않는다. 일례로, 상기 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암, 위암 또는 난소암과 같은 고형암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 제2항암제와 독립적으로 존재하는 형태로 병용투여될 수 있을 뿐만 아니라, 목적에 따라 공지된 임의의 방법으로 제2항암제와 물리/화학적인 결합을 형성한 상태에서 투여될 수 있다. 예컨대, ADP-리보오스 결합 펩티드는 제2항암제와 직접 결합된 상태로 사용되거나, 또는 공지의 링커를 통해 제2항암제와 연결된 상태로 사용될 수 있으며, 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드가 제2항암제와 함께 작용하여 상승된 항암 효과를 나타내는 한 그 적용 방법에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 저농도의 베바시주맙, 오시메르티닙, 젬시타빈, 도시탁셀과 함께 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 각기 다른 암 종에 처리한 경우, 모든 암 세포에서 항암제에 대한 반응성이 증진되는 것을 확인하였다 (도 13 및 도 14). 따라서 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 제2항암제의 반응을 증진시킬 수 있어 항암 보조 용도로서 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 제2항암제를 저농도로 처리하더라도 우수한 항암 활성을 가지므로 제2항암제로 인해 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 방사선 항암 치료에 대한 반응성을 증진시키는 항암 보조용 약학적 조성물이다.
ADP-리보오스 결합 펩티드 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 상술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "방사선 항암 치료"는 암 세포를 사멸시키기 위한 목적으로 암 세포 또는 종양 조직에 방사선을 조사하는 치료 행위를 말한다. 일반적으로 절개 불가능하거나 수술 불가능한 종양, 또는 종양 전이를 제어하기 위한 표준 치료법으로서 표적 부위로 전달된 방사선이 재생성 세포 (reproductive cell)의 사멸을 초래한다는 원리에 기초한다. 본 발명에서 방사선 항암 치료는 이온화 방사선 요법 (ionizing radiation therapy), 전자기 방사선 요법 (electromagnetic radiation), 근접 방사선 요법 (brachytherapy) 또는 외부 방사선 요법 (external beam radiation therapy)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 방사선 요법과 병용될 경우 상승적 항암 효과를 나타내므로 방사선 요법에 대한 항암 보조제 또는 방사선 민감도를 향상시키는 방사선 민감화제로 유용하게 활용될 수 있으며, 적용 가능한 암의 종류가 특별히 제한되지 않는다. 일례로, 상기 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암, 위암 및 난소암과 같은 고형암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시 양태로서, 상기 고형암은 방사선 요법에 대해 내성을 나타내는 것일 수 있다. 방사선 치료의 항암 효과는 DNA 절단의 형성으로 나타나기 때문에 방사선 치료에 대한 내성은 일반적으로 방사선 치료에 의해 유도되는 DNA 손상을 복구할 수 있는 기전에 의해 결정된다. 방사선 치료의 항암 효능을 상승시키는 방법으로 DNA 복구 기전 억제를 위한 많은 시도가 있어 왔으며 파괴된 DNA 가닥의 수리가 차단되면 방사선 치료의 감도가 높아질 수 있다. DNA 손상의 두 가지 주요 형태는 SSB (Single Strand Breaks)와 DSB (Double Strand Breaks)다. 따라서, SSB 및 DSB를 대상으로 하는 두 가지 복구 경로의 범주로 설명할 수 있다. BER (Base Excision Repair)은 선택된 유형의 DNA SSB의 복구에 관여하는 여러 경로 중 하나다.
PARP1은 ADP-리보실화 (ribosylation)로 알려진 공정을 통해 DNA SSB의 BER에서 중요한 역할을 수행한다. 핵에서 PARP1은 SSB DNA의 손상을 감지하고 수리를 위해 SSB 부위에 ADP-리보실화를 통해 DNA 복구 복합체를 모집한다. PARP-1 활성에 의한 ADP-리보실화를 통해 합성된 폴리-ADP-리보오스의 과축적은 최종적으로 세포의 사멸로 이어지기 때문에, 암 세포는 이 현상을 막기 위해 PARG나 ARH3 등과 같은 프로테아좀을 통해 폴리-ADP-리보오스의 분해를 활성화하여 생존 신호전달 활동을 활성화한다. 본 발명자들은 암 세포 내 ADP-리보오스나 ADP-리보오스 중합체의 축적이 암 세포의 이러한 생화학적 생존 기전을 교란시킬 수 있는 매개체로 작용할 수 있어 방사선 치료 내성을 극복하는 중요한 항암 보조제로 활용될 수 있음에 착안하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 각기 다른 암 종에서 저선량의 방사선 조사와 함께 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 병용 처리한 경우, 모든 암 종에서 방사선 치료에 대한 반응성이 증진되는 것을 확인하였다 (도 15 및 도 16). 따라서 본 발명의 ADP-리보오스 결합 펩티드는 방사선 치료의 반응을 증진시킬 수 있어 항암 보조 용도로서 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 방사선을 내성 선량으로 조사하더라도 우수한 항암 활성을 가지므로 방사선으로 인해 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있다.
본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1-14. ADP (adenosine diphosphate)-리보오스 결합 펩티드의 제조
여러 종류의 단백질 내에 존재하는 WWE 도메인들로부터 실시예 1 내지 실시예 14의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 합성하고, 이를 실험에 사용하였다. 사용된 펩티드의 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 서열정보 (서열번호) 유래 단백질
1 VPYIIDLQSMHQFRQDTGTMRPVRR (서열번호 1) DTX1
2 APYIIDLQSMNQFRQDTGTLRPVRR (서열번호 2) DTX4
3 APYIIDLPSWTQFRQDTGTMRAVRR (서열번호 3) DTX2
4 RVYTIDFNSMQQINEDTGTARAIQR (서열번호 4) TRIP12
5 FCYLIYFNSMSQMNRQTRRRRRLRR (서열번호 5) PARP7
6 FSYVIDFNTMGQINRQTQRQRRVRR (서열번호 6) PARP12
7 FSYKIDFAEMKQMNLTTGKQRLIKR (서열번호 7) PARP11
8 YNYTVNYTTHTQTNKTSSFCRSVRR (서열번호 8) PIK3C2G
9 RRYTVQFTTMVQVNEETGNRRPVM (서열번호 9) HUWE1
10 WIWYWKNESGTWIQYGEEKDKRKN (서열번호 10) ZC3HAV1
11 FLYVADLENMVQYRRNEHGRRRKIKR (서열번호 11) RNF146
12 RHYTVNLNTYTATDTKGHSLSVQR (서열번호 12) PARP14
13 GRYDVHLGERMRYAVYWDELASEVRR (서열번호 13) DDHD2
14 TAYEASVCDYLEQQVARGN (서열번호 14) HNRNPA2B1
또한, 상기 실시예 1 내지 14의 펩티드들의 N-말단에 세포 투과성 펩티드 (cell-penetrating peptide)를 결합하여 실시예 15 내지 28의 펩티드들을 제조하였다. 실시예 15 내지 28의 펩티드 서열을 표 2에 나타내었다.
실시예 서열정보 (서열번호)
15 GRKKRRQRRRPQVPYIIDLQSMHQFRQDTGTMRPVRR (서열번호 15)
16 GRKKRRQRRRPQAPYIIDLQSMNQFRQDTGTLRPVRR (서열번호 16)
17 GRKKRRQRRRPQAPYIIDLPSWTQFRQDTGTMRAVRR (서열번호 17)
18 GRKKRRQRRRPQRVYTIDFNSMQQINEDTGTARAIQR (서열번호 18)
19 GRKKRRQRRRPQFCYLIYFNSMSQMNRQTRRRRRLRR (서열번호 19)
20 GRKKRRQRRRPQFSYVIDFNTMGQINRQTQRQRRVRR (서열번호 20)
21 GRKKRRQRRRPQFSYKIDFAEMKQMNLTTGKQRLIKR (서열번호 21)
22 GRKKRRQRRRPQYNYTVNYTTHTQTNKTSSFCRSVRR (서열번호 22)
23 GRKKRRQRRRPQRRYTVQFTTMVQVNEETGNRRPVM (서열번호 23)
24 GRKKRRQRRRPQWIWYWKNESGTWIQYGEEKDKRKN (서열번호 24)
25 GRKKRRQRRRPQFLYVADLENMVQYRRNEHGRRRKIKR (서열번호 25)
26 GRKKRRQRRRPQRHYTVNLNTYTATDTKGHSLSVQR (서열번호 26)
27 GRKKRRQRRRPQGRYDVHLGERMRYAVYWDELASEVRR (서열번호 27)
28 GRKKRRQRRRPQTAYEASVCDYLEQQVARGN (서열번호 28)
실험예 1: 암 세포 내 ADP (adenosine diphosphate)-리보오스 수준 변화 확인
본 발명의 실시예 1 내지 28의 펩티드들은 폴리 ADP-리보오스의 분해 효소 작용을 억제할 수 있도록 설계된 것이다. 실험예 1에서는 세포 실험을 통해 각 펩티드들에 의해 폴리 ADP-리보오스의 분해가 억제되어 암 세포 내 축적되는지를 확인하였다.
1-1. U-87MG 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5 Х 105 개의 U-87MG 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) 배지로 실시예 펩티드를 처리하지 않은 그룹 및 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, 32 μM의 실시예 1 (서열번호 1) 또는 실시예 8 (서열번호 8)의 펩티드를 처리한 그룹으로 나누어 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1 % SDS를 처리하였다. 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
도 1의 좌측 상단 및 도 2의 우측 하단은 U-87MG 세포에서 실시예 1 또는 8의 펩티드 처리에 따라 대조군 그룹 대비 ADP-리보오스 증가량을 배수 변화로 나타낸 것으로, 처리하지 않은 그룹에 비해 처리된 펩티드 2 종 모두 농도 의존적으로 ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하고 있음을 보여주고 있다 (** p < 0.001).
1-2. H1975 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5 Х 105 개의 H1975 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지로 실시예 펩티드를 처리하지 않은 그룹 및 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, 32 μM의 실시예 2의 펩티드 (서열번호 2)를 처리한 그룹으로 나누어 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1 % SDS를 처리하였다. 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
도 1의 우측 상단 및 도 3의 좌측 상단은 H1975 세포에서 실시예 2 또는 실시예 9의 펩티드 처리에 따라 대조군 그룹 대비 ADP-리보오스 증가량을 배수 변화로 나타낸 것으로, 처리하지 않은 그룹에 비해 처리된 펩티드의 농도 의존적으로 ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하고 있음을 보여주고 있다 (** p < 0.001).
1-3. Aspc-1 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5 Х 105 개의 Aspc-1 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지로 실시예 펩티드를 처리하지 않은 그룹 및 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, 32 μM의 실시예 3의 펩티드 (서열번호 3)를 처리한 그룹으로 나누어 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1 % SDS를 처리하였다. 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
도 1의 좌측 하단 및 도 3의 우측 상단은 Aspc-1 세포에서 실시예 3 또는 실시예 10의 펩티드 처리에 따라 대조군 그룹 대비 ADP-리보오스 증가량을 배수 변화로 나타낸 것으로, 처리하지 않은 그룹에 비해 처리된 펩티드의 농도 의존적으로 ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하고 있음을 보여주고 있다 (** p < 0.001).
1-4. Hep G2 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5 Х 105 개의 Hep G2 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 EMEM 배지로 실시예 펩티드를 처리하지 않은 그룹 및 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, 32 μM의 실시예 4의 펩티드 (서열번호 4)를 처리한 그룹으로 나누어 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1 % SDS를 처리하였다. 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
도 1의 우측 하단 및 도 3의 좌측 하단은 Hep G2 세포에서 실시예 4 또는 실시예 11의 펩티드 처리에 따라 대조군 그룹 대비 ADP-리보오스 증가량을 배수 변화로 나타낸 것으로, 처리하지 않은 그룹에 비해 처리된 펩티드의 농도 의존적으로 ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하고 있음을 보여주고 있다 (** p < 0.001).
1-5. MDA-MB-231 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5 Х 105 개의 MDA-MB-231 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 Leibovitz's L-15 배지로 실시예 펩티드를 처리하지 않은 그룹 및 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, 32 μM의 실시예 5의 펩티드 (서열번호 5)를 처리한 그룹으로 나누어 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1 % SDS를 처리하였다. 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
도 2의 좌측 상단 및 도 3의 우측 하단은 MDA-MB-231 세포에서 실시예 5 또는 실시예 12의 펩티드 처리에 따라 대조군 그룹 대비 ADP-리보오스 증가량을 배수 변화로 나타낸 것으로, 처리하지 않은 그룹에 비해 처리된 펩티드의 농도 의존적으로 ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하고 있음을 보여주고 있다 (** p < 0.001).
1-6. HCT116 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5 Х 105 개의 HCT116 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 McCoy's 5A 배지로 실시예 펩티드를 처리하지 않은 그룹 및 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, 32 μM의 실시예 6의 펩티드 (서열번호 6)를 처리한 그룹으로 나누어 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1 % SDS를 처리하였다. 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
도 2의 우측 상단 및 도 4의 좌측은 HCT116 세포에서 실시예 6 또는 실시예 13의 펩티드 처리에 따라 대조군 그룹 대비 ADP-리보오스 증가량을 배수 변화로 나타낸 것으로, 처리하지 않은 그룹에 비해 처리된 펩티드의 농도 의존적으로 ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하고 있음을 보여주고 있다 (** p < 0.001).
1-7. Caki-1 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5 Х 105 개의 Caki-1 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 McCoy's 5A 배지로 실시예 펩티드를 처리하지 않은 그룹 및 0.2, 1, 2, 4, 8, 16, 32 μM의 실시예 7의 펩티드 (서열번호 7)를 처리한 그룹으로 나누어 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1 % SDS를 처리하였다. 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
도 2의 좌측 하단 및 도 4의 우측은 Caki-1 세포에서 실시예 7 또는 실시예 14의 펩티드 처리에 따라 대조군 그룹 대비 ADP-리보오스 증가량을 배수 변화로 나타낸 것으로, 처리하지 않은 그룹에 비해 처리된 펩티드의 농도 의존적으로 ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하고 있음을 보여주고 있다 (** p < 0.001).
실험예 2: 실시예의 펩티드 처리에 따른 암 세포 생존율의 변화
세포는 생화학적 항상성을 유지하면서 ADP-리보오스의 생성 및 분해의 균형을 맞추고 있는데, 암 세포는 지속적으로 분열하며 급격히 성장하기 때문에 이와 같은 균형이 망가질 경우 정상 세포에 비해 생존에 크게 영향을 받을 수 있다.
상기 실험예 1의 결과에 따를 때, 본 발명의 실시예 펩티드들을 암 세포에 처리할 경우 세포 내 ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하므로, 이를 통해 암 세포의 항상성 균형이 망가질 수 있다. 이에, 실험예 2에서는 실시예 1 내지 28의 펩티드 처리에 따른 암 세포의 생존율을 측정하였다.
2-1 . U-87MG 세포에서 ADP-리보오스 결합 펩티드 처리에 따른 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 U-87MG 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 아무것도 처리하지 않거나 16 μM 농도의 실시예 1 내지 28의 펩티드를 각각 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
도 5의 좌측 상단 및 도 8의 우측 상단은 U-87MG 세포에 실시예 1, 15, 8 및 22의 펩티드를 각각 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 대표적인 현미경 사진이다. 공통적으로 펩티드를 처리하지 않은 그룹에서는 U-87MG 세포가 급격하게 성장하고 있는 형태를 관찰할 수 있는 반면에, 본 발명의 실시예 펩티드를 처리한 그룹에서는 U-87MG 세포의 성장이 억제되고 사멸하고 있는 형태를 관찰할 수 있다. 특히, 세포 투과성 펩티드 (cell-penetrating peptide, CPP)가 부착된 실시예 15 및 22의 펩티드들을 처리한 그룹에서는 암 세포가 완전히 사멸한 것을 확인하였다.
2-2. H1975 세포에서 ADP-리보오스 결합 펩티드 처리에 따른 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 H1975 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 아무것도 처리하지 않거나 16 μM 농도의 실시예 1 내지 28의 펩티드를 각각 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
도 5의 우측 상단 및 도 9의 좌측 상단은 H1975 세포에 실시예 2, 16, 9, 23의 펩티드를 각각 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 대표적인 현미경 사진이다. 공통적으로 펩티드를 처리하지 않은 그룹에서는 H1975 세포가 급격하게 성장하고 있는 형태를 관찰할 수 있는 반면에, 본 발명의 실시예 펩티드를 처리한 그룹에서는 H1975 세포의 성장이 억제되고 사멸하고 있는 형태를 관찰할 수 있다. 특히, CPP가 부착된 실시예 16 및 23의 펩티드들을 처리한 그룹에서는 암 세포가 완전히 사멸한 것을 확인하였다.
2-3. Aspc-1 세포에서 ADP-리보오스 결합 펩티드 처리에 따른 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 Aspc-1 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 아무것도 처리하지 않거나 16 μM 농도의 실시예 1 내지 28의 펩티드를 각각 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
도 6의 좌측 상단 및 도 9의 우측 상단은 Aspc-1 세포에 실시예 3, 17, 10, 24의 펩티드를 각각 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 대표적인 현미경 사진이다. 공통적으로 펩티드를 처리하지 않은 그룹에서는 Aspc-1 세포가 급격하게 성장하고 있는 형태를 관찰할 수 있는 반면에, 본 발명의 실시예 펩티드를 처리한 그룹에서는 Aspc-1 세포의 성장이 억제되고 사멸하고 있는 형태를 관찰할 수 있다. 특히, 세포 투과성 펩티드 CPP가 부착된 실시예 17 및 24의 펩티드들을 처리한 그룹에서는 암 세포가 완전히 사멸한 것을 확인하였다.
2-4. Hep G2 세포에서 ADP-리보오스 결합 펩티드 처리에 따른 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 Hep G2 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 아무것도 처리하지 않거나 16 μM 농도의 실시예 1 내지 28의 펩타이드를 각각 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
도 6의 우측 상단 및 도 10의 좌측 상단은 Hep G2 세포에 실시예 4, 18, 11, 25의 펩티드를 각각 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 대표적인 현미경 사진이다. 공통적으로 펩티드를 처리하지 않은 그룹에서는 Hep G2 세포가 급격하게 성장하고 있는 형태를 관찰할 수 있는 반면에, 본 발명의 실시예 펩타이드를 처리한 그룹에서는 Hep G2 세포의 성장이 억제되고 사멸하고 있는 형태를 관찰할 수 있다. 특히, 세포 투과성 펩티드 CPP가 부착된 실시예 18 및 25의 펩티드들을 처리한 그룹에서는 암 세포가 완전히 사멸한 것을 확인하였다.
2-5. MDA-MB-231 세포에서 ADP-리보오스 결합 펩티드 처리에 따른 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 MDA-MB-231 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양 후, 아무것도 처리하지 않거나 16 μM 농도의 실시예 1 내지 28의 펩티드를 각각 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
도 7의 좌측 상단 및 도 10의 우측 상단은 MDA-MB-231 세포에 실시예 5, 19, 12, 26의 펩티드를 각각 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 대표적인 현미경 사진이다. 공통적으로 펩티드를 처리하지 않은 그룹에서는 MDA-MB-231 세포가 급격하게 성장하고 있는 형태를 관찰할 수 있는 반면에, 본 발명의 실시예 펩티드를 처리한 그룹에서는 MDA-MB-231 세포의 성장이 억제되고 사멸하고 있는 형태를 관찰할 수 있다. 특히, CPP가 부착된 실시예 19 및 26의 펩티드들을 처리한 그룹에서는 암 세포가 완전히 사멸한 것을 확인하였다.
2-6. HCT116 세포에서 ADP-리보오스 결합 펩티드 처리에 따른 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 HCT116 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 아무것도 처리하지 않거나 16 μM 농도의 실시예 1 내지 28의 펩티드를 각각 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
도 7의 우측 상단 및 도 11의 좌측 상단은 HCT116 세포에 실시예 6, 20, 13, 27의 펩티드를 각각 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 대표적인 현미경 사진이다. 공통적으로 펩티드를 처리하지 않은 그룹에서는 HCT116 세포가 급격하게 성장하고 있는 형태를 관찰할 수 있는 반면에, 본 발명의 실시예 펩티드를 처리한 그룹에서는 HCT116 세포의 성장이 억제되고 사멸하고 있는 형태를 관찰할 수 있다. 특히, 세포 투과성 펩티드 CPP가 부착된 실시예 20 및 27의 펩티드들을 처리한 그룹에서는 암 세포가 완전히 사멸한 것을 확인하였다.
2-7. Caki-1 세포에서 ADP-리보오스 결합 펩티드 처리에 따른 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 Caki-1 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 아무것도 처리하지 않거나 16 μM 농도의 실시예 1 내지 28의 펩티드를 각각 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
도 8의 좌측 상단 및 도 11의 우측 상단은 Caki-1 세포에 실시예 7, 21, 14, 28의 펩티드를 각각 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 대표적인 현미경 사진이다. 공통적으로 펩티드를 처리하지 않은 그룹에서는 Caki-1 세포가 급격하게 성장하고 있는 형태를 관찰할 수 있는 반면에, 본 발명의 실시예 펩티드를 처리한 그룹에서는 Caki-1 세포의 성장이 억제되고 사멸하고 있는 형태를 관찰할 수 있다. 특히, CPP가 부착된 실시예 21 및 28의 펩티드들을 처리한 그룹에서는 암 세포가 완전히 사멸한 것을 확인하였다.
2-8 . SNU-1 세포 및 OVCAR-3 세포에서 ADP-리보오스 결합 펩티드 처리에 따른 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 SNU-1 세포 또는 OVCAR-3 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 아무것도 처리하지 않거나 16 μM 농도의 실시예 15 내지 28의 펩티드를 각각 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 96 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, 실시예 15 내지 28의 펩티드를 각각 처리한 그룹은 SNU-1 세포 및 OVCAR-3 세포 모두에서 암 세포를 거의 대부분 사멸시키는 것을 확인하였다 (도 12).
실험예 3: 실시예의 펩티드 및 저농도의 항암제 병용 처리에 의한 암 세포 생존율의 변화
기존 항암제에 의한 암 세포 생존의 감소 등으로 대표되는 항암 효과는 ADP-리보오스의 신호에 의해 상승될 수 있으므로, 기존 항암제를 처리하며 ADP-리보오스의 축적을 유도하여 주면 암 세포에 기존 항암제를 필요 농도 이하로 처리하더라도 상승된 항암 효과를 나타낼 것으로 기대하였다. 상기 실험예 1에서 확인한 바와 같이 본발명의 실시예 펩티드들은 암 세포 내에서 ADP-리보오스의 양을 현저히 증가시키므로, 실험예 3에서는 실시예 펩티드와 저농도의 항암제를 병용 처리하였을 때 상승된 항암 효과가 나타나는지를 확인하고자 하였다.
3-1. U-87MG 세포에서 실시예 펩티드와 저농도 베바시주맙 (bevacizumab)의 병용 처리에 의한 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 U-87MG 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 18 mM의 베바시주맙 단독, 또는 0.2, 1 또는 8 μM 농도의 실시예 1 내지 14의 펩티드와 병용 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, U-87MG 세포에 베바시주맙을 단독으로 처리하였을 때 전체 암 세포의 약 49 %가 생존하고 있었으나, 실시예 펩티드와 병용 처리한 모든 경우에 저농도의 베바시주맙으로도 암 세포의 생존율이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다 (* p < 0.05, ** p < 0.001, *** p < 0.001; 도 13의 좌측).
3-2. H1975 세포에서 실시예 펩티드와 저농도 오시메르티닙 (osimertinib)의 병용 처리에 의한 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 H1975 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 1 nM의 오시메르티닙 단독, 또는 0.2, 1 또는 8 μM 농도의 실시예 1 내지 14의 펩티드와 병용 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, H1975 세포에 1 nM의 오시메르티닙을 단독으로 처리하였을 때 전체 암 세포의 약 49 %가 생존하고 있었으나, 실시예 펩티드와 병용 처리한 모든 경우에 저농도의 오시메르티닙으로도 암 세포의 생존율이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다 (* p < 0.05, ** p < 0.001, *** p < 0.001; 도 13의 우측).
3-3. Aspc-1 세포에서 실시예 펩티드와 저농도 젬시타빈 (gemcitabine)의 병용 처리에 의한 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 aspc-1 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 1 μM의 젬시타빈 단독, 또는 0.2, 1 또는 8 μM 농도의 실시예 15 내지 28의 펩티드와 병용 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, aspc-1 세포에 젬시타빈을 단독으로 처리하였을 때 전체 암 세포의 약 50 %가 생존하고 있었으나, 실시예 펩티드와 병용 처리한 모든 경우에 저농도의 젬시타빈으로도 암 세포의 생존율이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다 (* p < 0.05, ** p < 0.001, *** p < 0.001; 도 14의 좌측).
3-4. MDA-MB-231 세포에서 실시예 펩티드와 저농도 도시탁셀 (docetaxel)의 병용 처리에 의한 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 MDA-MB-231 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 50 μM의 도시탁셀 단독, 또는 0.2, 1 또는 8 μM 농도의 실시예 15 내지 28의 펩티드와 병용 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후, 200 μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, MDA-MB-231 세포에 도시탁셀을 단독으로 처리하였을 때 전체 암 세포의 약 52 %가 생존하고 있었으나, 실시예 펩티드와 병용처리한 모든 경우에 저농도의 도시탁셀로도 암 세포의 생존율이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다 (*p < 0.05, ** p < 0.001, *** p < 0.001; 도 14의 우측).
실험예 4: 실시예의 펩티드 및 방사선 병용 처리에 의한 암 세포 생존율의 변화
방사선 치료는 유전 물질의 손상에 의한 사멸 작용을 통해 항암 효과를 기대할 수 있으나, 암 세포는 이를 극복하기 위해 ADP-리보실화 (ribosylation)로 알려진 공정을 통해 DNA의 가닥을 지속적으로 복구한다. 그러나 방사선 조사에 의한 복구 작용으로 일시적으로만 증가하는 ADP-리보오스를 지속적으로 축적 되도록 보조하여 주면 내성 선량의 방사선을 조사하더라도 상승된 항암 효과가 있을 것으로 기대하였다. 상기 실험예 1에서 확인한 바와 같이 본 발명의 실시예 펩티드들은 암 세포 내에서 ADP-리보오스의 양을 현저히 증가시키므로, 실험예 4에서는 실시예 펩티드와 내성 선량의 방사선 조사를 병용하였을 때 상승된 항암 효과가 나타나는지를 확인하고자 하였다.
4-1. H1975 세포에서 실시예 펩티드와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 H1975 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 2 Gy 선량의 방사선 단독, 또는 1.6 또는 3.2 μM의 서열번호 1 내지 14의 펩티드와 병용 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200 μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, H1975 세포에 2 Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹 대비 암 세포의 약 76 %가 생존하는 내성을 보이고 있었으나, 실시예 펩티드와 병용 처리한 모든 경우에 내성 선량의 방사선 조사로도 암 세포의 생존율이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다 (** p < 0.001, *** p < 0.001; 도 15의 좌측).
4-2. Aspc-1 세포에서 실시예 펩티드와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 Aspc-1 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 2 Gy 선량의 방사선 단독, 또는 1.6 또는 3.2 μM의 서열번호 1 내지 14의 펩티드와 병용 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200 μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, Aspc-1 세포에 2 Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹 대비 암 세포의 약 86 %가 생존하는 내성을 보이고 있었으나, 실시예 펩티드와 병용 처리한 모든 경우에 내성 선량의 방사선 조사로도 암 세포의 생존율이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다 (** p < 0.001, *** p < 0.001; 도 15의 우측).
4-3. MDA-MB-231 세포에서 실시예 펩티드와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 MDA-MB-231 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 2 Gy 선량의 방사선 단독, 또는 1.6 또는 3.2 μM의 서열번호 15 내지 28의 펩티드와 병용 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200 μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, MDA-MB-231 세포에 2 Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹 대비 암 세포의 약 86 %가 생존하는 내성을 보이고 있었으나, 실시예 펩티드와 병용 처리한 모든 경우에 내성 선량의 방사선 조사로도 암 세포의 생존율이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다 (** p < 0.001, *** p < 0.001; 도 16의 좌측).
4-4. Caki-1 세포에서 실시예 펩티드와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존율의 변화
96-웰 플레이트에 3 Х 103 개의 Caki-1 세포를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한 후, 2 Gy 선량의 방사선 단독, 또는 1.6 또는 3.2 μM의 서열번호 15 내지 28의 펩티드와 병용 처리하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 다시 24 시간 동안 배양한 후, 10 μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200 μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, Caki-1 세포에 2 Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹 대비 암 세포의 약 96 %가 생존하는 내성을 보이고 있으나, 실시예 펩티드와 병용 처리한 모든 경우에 내성 선량의 방사선 조사로도 암 세포의 생존율이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다 (** p < 0.001, *** p < 0.001; 도 16의 우측).
실험예 5: 동물모델을 이용한 실시예 펩티드의 투여 경로에 따른 항암 효능효과 비교 및 검증
5-1. 실시예 펩티드를 피하 경로로 주사한 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 balb/c 누드 마우스에 aspc-1 세포 (1 Х 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종하고 무처리 대조군 (control)과 실시예 15 내지 28의 펩티드를 각각 피하 경로로 주사하는 15 가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150 mm3까지 성장 했을 때, 각 실시예 펩티드를 주 3 회 20 mg/kg의 용량으로 피하 주사했다. 디지털 캘리퍼로 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
그 결과, 최종 투약 후 대조군 종양의 최종 부피는 약 3136 mm3로 크게 성장하였으나, 실시예 15 내지 28의 펩티드를 각각 피하 경로로 주사한 모든 군에서는 종양의 성장이 현저히 억제되는 것을 확인하였다 (** p < 0.001; 도 17).
도 18은 모든 군에서 부검 후 획득한 대표적인 종양사진을 나타낸 것으로, 대조군과 대비하였을 때 본 발명의 실시예 펩티드를 피하 주사한 모든 군에서 종양 조직의 성장이 현저히 억제된 것이 관찰되었다.
5-2. 실시예 펩티드를 구강 투여 경로로 주사한 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 balb/c 누드 마우스에 aspc-1 세포 (1 Х 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 무처리 대조군 (Control)과 실시예 1 내지 14의 펩티드를 각각 구강 투여하는 15 가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150 mm3까지 성장 했을 때, 각 실시예 펩티드를 주 5 회 20 mg/kg의 용량으로 구강 투여했다. 디지털 캘리퍼로 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
그 결과, 최종 투약 후 대조군 종양의 최종 부피는 약 3517 mm3로 크게 성장하였으나, 실시예 1 내지 14의 펩티드를 각각 구강 투여한 모든 군에서는 종양의 성장이 현저히 억제되는 것을 확인하였다 (** p < 0.001; 도 19).
도 20은 모든 군에서 부검 후 획득한 대표적인 종양사진을 나타낸 것으로, 대조군과 대비하였을 때 본 발명의 실시예 펩티드를 구강 투여한 모든 군에서 종양 조직의 성장이 현저히 억제된 것이 관찰되었다.
실험예 6: 실시예 펩티드의 정상 세포에서의 세포 독성 확인
다음으로, 본 발명의 펩티드들이 정상 세포에서도 세포 독성을 보이는지 여부를 추가적으로 확인하였다. 시험을 위하여 정상 세포로서 인간 대장 섬유아세포 (colon fibroblast)인 CCD-18Co 및 인간 피부 유두 세포 (dermal papilla cell)인 HDPC를 사용하였으며, 본 발명의 실시예 펩티드로서 대표적으로 서열번호 7의 펩티드를 사용하였다.
먼저, 96-웰 플레이트에 5 x 103 개의 각 정상 세포를 접종한 뒤 DMEM 배지에서 37 ℃, 5 % CO2 조건으로 24 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 펩티드를 처리하지 않은 그룹 (untreated) 및 서열번호 7의 펩티드를 처리한 그룹 (각각 25, 50 및 100 μM)으로 구분하여 실험을 수행하였다.
실험 결과, 펩티드를 처리한 모든 그룹 (처리 후 24 시간, 48 시간 또는 72 시간)에서 미처리 대조군과 유의적인 차이를 전혀 발견할 수 없었다 (도 21 및 도 22). 따라서 본 발명의 실시예의 펩티드는 암 세포에서는 강력한 항암 활성을 보이는 반면에, 정상 세포에서는 전혀 세포 독성을 나타내지 않아 항암 용도로서 매우 우수한 효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, ADP (adenosine diphosphate)-리보오스 결합 펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 N-말단, C-말단 또는 양 말단에 세포 투과성 펩티드 (cell-penetrating peptide)를 추가로 포함하는 것인, ADP-리보오스 결합 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩티드는 TAT, 마우로칼신 (maurocalcine), 페네트라틴 (penetratin), 폴리-알지닌 (Poly-arginine) 유래 펩티드, 안테나페디아 (Antennapedia), 트랜스포탄 (Transportan), VP22, Hph-1, 폴리-알지닌 (Poly-arginine), R11(R9), Pep-1, HP4, LAH4, Vetofusing-1, 시그널 서열 기반 펩티드, 및 양친매성 (Amphipathic) 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, ADP-리보오스 결합 펩티드.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 펩티드는 서열번호 15 내지 24로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인, ADP-리보오스 결합 펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 ADP-리보오스 결합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  7. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환체.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암, 위암 및 난소암으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고형암인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 피하 또는 경구로 투여되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 제2항암제에 대한 반응성을 증진시키는 항암 보조용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항암제는 세포 독성 항암제, 표적 항암제 또는 이들의 조합인 것인, 항암 보조용 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 제2항암제가 표적으로 하는 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암, 위암 및 난소암으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고형암인 것인, 항암 보조용 약학적 조성물.
  14. (i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및
    (ii) 제2항암제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 ADP-리보오스 결합 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 방사선 항암 치료에 대한 반응성을 증진시키는 항암 보조용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 방사선 항암 치료가 표적으로 하는 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암, 위암 및 난소암으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고형암인 것인, 항암 보조용 약학적 조성물.
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