WO2023042876A1 - ２'－修飾ヌクレオシドを含むヘテロ核酸 - Google Patents

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    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Definitions

  • the present invention relates to a double-stranded nucleic acid complex containing a 2'-modified nucleoside, and a pharmaceutical composition containing it as an active ingredient.
  • oligonucleotides In recent years, in the ongoing development of medicines called nucleic acid medicines, attention has been focused on oligonucleotides. is being actively developed.
  • a partial sequence of mRNA or miRNA transcribed from the target gene is used as the target sense strand, and a complementary oligonucleotide (antisense oligonucleotide: in this specification, often referred to as "ASO (Antisense Oligonucleotide)").
  • ASO Antisense Oligonucleotide
  • the present inventors have proposed a double-stranded nucleic acid complex (heteroduplex oligonucleotide, HDO) in which an antisense oligonucleotide and its complementary strand are annealed. developed (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the double-stranded nucleic acid complex has a high antisense effect, and is an epoch-making technology that enables control of the central nervous system across the blood-brain barrier.
  • mice intracerebroventricularly administered with single-stranded gapmer-type antisense nucleic acids hypoactivity and motor dysfunction due to central nervous system toxicity are observed within several hours after administration.
  • the present inventors conducted intensive research in search of a new technique that can reduce the central nervous system toxicity of nucleic acid drugs, and introduced 2'-modified nucleosides into double-stranded nucleic acid complexes. As a result, they found that introduction of 2'-modified nucleosides can dramatically reduce or eliminate central nervous system toxicity of double-stranded nucleic acid complexes. This toxicity-suppressing effect is a surprising effect that greatly exceeds conventional expectations.
  • the present invention is based on the above findings, and provides the following.
  • a double-stranded nucleic acid complex comprising a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand is capable of hybridizing to at least a portion of a target gene or transcript thereof; having an antisense effect on the target gene or its transcript, the second nucleic acid strand comprising a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, and containing one or more 2'-modified nucleosides; The double-stranded nucleic acid complex.
  • the second nucleic acid strand has 1 or 2 to 10 consecutive 2'-modified nucleosides located at the 5' end and/or 1 or 2 to 10 consecutive 2'-modified nucleosides located at the 3' end
  • the two strands according to any one of (1) to (6), wherein the second nucleic acid strand contains 1 to 7 2'-modified nucleosides at positions other than the 5' and 3' ends. Stranded nucleic acid complex.
  • the first nucleic acid strand is (1) a central region comprising at least 4 consecutive deoxyribonucleosides; (2) a 5' wing region containing a non-natural nucleoside located at the 5' end of the central region; and (3) a 3' wing region containing a non-natural nucleoside located at the 3' end of the central region.
  • the second nucleic acid strand contains a 2'-modified nucleoside in a region consisting of a nucleotide sequence complementary to the 5' wing region and/or the 3' wing region of the first nucleic acid strand; double-stranded nucleic acid complex of. (10)
  • all nucleosides in a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand are 2'-modified nucleosides, ( The double-stranded nucleic acid complex according to 9).
  • nucleosides in a region consisting of a base sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand are (a) deoxyribonucleosides, (b) deoxyribonucleosides and ribonucleosides; (c) deoxyribonucleosides and 2'-modified nucleosides,
  • the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (8) to (10), which is (d) a ribonucleoside and a 2'-modified nucleoside, or (e) a deoxyribonucleoside, a ribonucleoside, and a 2'-modified nucleoside.
  • nucleosides in a region consisting of base sequences complementary to the 5' wing region and the 3' wing region of the first nucleic acid strand are 2'-modified nucleosides
  • the double-stranded nucleic acid complex according to (14), wherein all nucleosides in the region consisting of a nucleotide sequence complementary to the central region of one nucleic acid strand are deoxyribonucleosides.
  • said second nucleic acid strand comprises at least 4 contiguous ribonucleosides complementary to at least 4 contiguous deoxyribonucleosides in said central region of said first nucleic acid strand, (8)-(10) ), the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (17) (i) at least one guanosine nucleoside in said first nucleic acid strand; (ii) a nucleoside adjacent to the 5' end of the guanosine nucleoside; (iii) a nucleoside adjacent to the 3'-terminal side of the guanosine nucleoside, or (iv) a nucleoside in the second nucleic acid strand that is complementary to any combination of (i) to (iii) is a 2'-modified nucleoside
  • Stranded nucleic acid complex (20) The double-stranded nucleic acid complex according to any one of (1) to (19), wherein at least one nucleoside containing a pyrimidine base in the second nucleic acid strand is a 2'-modified nucleoside and/or a deoxyribonucleoside. body. (21) The double-stranded nucleic acid complex according to any one of (1) to (20), wherein the second nucleic acid strand does not contain a natural ribonucleoside containing a pyrimidine base.
  • (22) The double-stranded nucleic acid complex according to (21), wherein all nucleosides containing pyrimidine bases in the second nucleic acid strand are 2'-modified nucleosides and/or deoxyribonucleosides.
  • (23) The double-stranded nucleic acid complex according to any one of (1) to (22), wherein 20% or more of the nucleosides in the second nucleic acid strand are 2'-modified nucleosides.
  • (24) The double-stranded nucleic acid complex according to any one of (1) to (23), wherein all nucleosides other than 2'-modified nucleosides in the second nucleic acid strand are deoxyribonucleosides.
  • the second nucleic acid strand according to any one of (1) to (24), wherein all nucleosides in a region consisting of a base sequence complementary to the first nucleic acid strand are 2'-modified nucleosides. Stranded nucleic acid complex.
  • the 2'-modified nucleoside is a 2'-O-methoxyethyl modified nucleoside and/or a 2'-O-methyl modified nucleoside.
  • the double-stranded nucleic acid complex according to 1.
  • the non-complementary bases of the second nucleic acid strand form a bulge structure, or the deletion position of the second nucleic acid strand consists of a base sequence that is non-complementary to the first nucleic acid strand.
  • the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (30) to (33), which contains a bulge structure.
  • (35) The double-stranded nucleic acid complex according to (29) or (34), wherein the bulge structure contains sugar-unmodified nucleosides, or all nucleosides in the bulge structure are sugar-unmodified nucleosides.
  • the second nucleic acid strand comprises at least one overhang region located on the 5'-terminal side and/or 3'-terminal side of a region consisting of a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, (1 ) to the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (39).
  • (41) The double-stranded nucleic acid complex according to (40), wherein the overhang region has a length of 1 to 20 bases.
  • the linker connects the 5' end of the first nucleic acid strand and the 3' end of the second nucleic acid strand, and/or the 3' end of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand.
  • a pharmaceutical composition comprising the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (1) to (54) as an active ingredient.
  • a double-stranded nucleic acid complex with reduced central nervous system toxicity is provided.
  • FIG. 1 shows the structures of various crosslinked nucleic acids.
  • Figure 2 shows the structures of various natural or non-natural nucleotides.
  • FIG. 3 shows a scoring system for evaluating central neurotoxicity in mice after administration of nucleic acid agents.
  • 4 shows the structure of the nucleic acid used in Example 1.
  • FIG. 4A shows the structure of ASO targeting the Mapt gene.
  • FIG. 4B shows the structure of HDO (all RNA).
  • FIG. 4C shows the structure of HDO (all DNA).
  • FIG. 4D shows the structure of HDO (6MOE wing).
  • FIG. 4E shows the structure of HDO (all MOE).
  • FIG. 5 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 6 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • Figure 6A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 6B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 7 shows Mapt mRNA expression levels in the hippocampus of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered. Error bars indicate standard error.
  • 8 shows the structure of the nucleic acid used in Example 2.
  • FIG. FIG. 8A shows the structure of ASO targeting the BACE1 gene.
  • Figure 8B shows the structure of HDO (all RNA).
  • FIG. 8C shows the structure of HDO (all DNA).
  • FIG. 8D shows the structure of HDO (5MOE wing).
  • FIG. 9 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 10 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • FIG. 10A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 10B shows maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • 11 shows the structure of the nucleic acid used in Example 3.
  • FIG. 11A shows the structure of ASO targeting the Malat1 gene.
  • Figure 11B shows the structure of HDO (all RNA).
  • FIG. 11C shows the structure of HDO (all DNA).
  • FIG. 11D shows the structure of HDO (10 MOE wing).
  • FIG. 12 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 13 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • Figure 13A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 13B shows maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • 14 shows the structure of the nucleic acid used in Example 4.
  • FIG. 14A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • FIG. 14B shows the structure of HDO (RNA 6MOE wing).
  • FIG. 14C shows the structure of HDO (6MOE wing).
  • FIG. 14D shows the structure of HDO (6OMe wing).
  • FIG. 14A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • FIG. 14B shows the structure of HDO (RNA 6MOE wing).
  • FIG. 14E shows the structure of HDO (6F wing).
  • FIG. 15 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 16 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration. Figure 16A shows the total distance traveled for 5 minutes. FIG. 16B shows maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 17 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 3 hours after administration. Figure 17A shows the total distance traveled for 5 minutes. FIG. 17B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error. 18 shows the structure of the nucleic acid used in Example 5.
  • FIG. 15 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 16 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various
  • FIG. 18A shows the structure of an ASO targeting the Mapt gene.
  • FIG. 18B shows the structure of HDO (6MOE wing).
  • FIG. 18C shows the structure of HDO (G MOE ).
  • FIG. 18D shows the structure of HDO (G RNA ).
  • Figure 18E shows the structure of HDO (inosine).
  • FIG. 19 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • 20 shows the structure of the nucleic acid used in Example 6.
  • FIG. 20A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • FIG. 20B shows the structure of HDO (6MOE-5'&3').
  • FIG. 20C shows the structure of HDO (6MOE-5').
  • Figure 20D shows the structure of HDO (6MOE-3').
  • Figure 20E shows the structure of HDO (10MOE-5').
  • FIG. 20F shows the structure of HDO(10MOE-3′).
  • FIG. 21 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 22 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • Figure 22A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 22B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 23 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 3 hours after administration.
  • FIG. 23A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 23B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 24 shows Mapt mRNA expression levels in the hippocampus of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered. Error bars indicate standard error.
  • 25 shows the structure of the nucleic acid used in Example 7.
  • FIG. 25A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the BACE1 gene.
  • Figure 25B shows the structure of HDO (5MOE-5').
  • Figure 25C shows the structure of HDO (5MOE-3').
  • Figure 25D shows the structure of HDO (8MOE-5').
  • Figure 25E shows the structure of HDO (8MOE-3').
  • Figure 25F shows the structure of HDO (10MOE-5').
  • FIG. 25G shows the structure of HDO (10MOE-3').
  • FIG. 26 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 27 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • Figure 27A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 27B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • 28 shows the structure of the nucleic acid used in Example 8.
  • FIG. 28A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • FIG. 28B shows the structure of HDO (6MOE wing).
  • FIG. 28C shows the structure of HDO (9MOE wing).
  • FIG. 28D shows the structure of HDO (11MOE wing).
  • FIG. 28E shows the structure of HDO (13MOE wing).
  • FIG. 28F shows the structure of HDO (15 MOE wing).
  • FIG. 29 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 30 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • Figure 27A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 27B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • 31 shows the structure of the nucleic acid used in Example 9.
  • FIG. 31A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • FIG. 31B shows the structure of HDO (A MOE ).
  • FIG. 31C shows the structure of HDO (G MOE ).
  • FIG. 31D shows the structure of HDO ( CMOE ).
  • FIG. 31E shows the structure of HDO( TMOE ).
  • FIG. 32 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 33 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • Figure 33A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 33B shows maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • 34 shows the structure of the nucleic acid used in Example 10.
  • FIG. 34A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • FIG. 34B shows the structure of HDO ( CMOE ).
  • Figure 34C shows the structure of HDO (2C MOE -5).
  • FIG. 34D shows the structure of HDO (2C MOE -3).
  • FIG. 34E shows the structure of HDO (3C MOE ).
  • FIG. 35 shows acute tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 36 shows the motor function of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • Figure 36A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 36B shows maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • Figure 37 shows the stability of various nucleic acid agents in human cerebrospinal fluid.
  • 37A and B show the structure of the nucleic acid used in Example 11.
  • FIG. Figure 37A shows the structure of an ASO targeting the Mapt gene.
  • Figure 37B shows the structure of HDO (ASO/cRNA).
  • FIG. 37C shows the results of examining stability by electrophoresis after mixing various nucleic acid agents with human cerebrospinal fluid (Human CSF; hCSF) for 10 minutes or 6 hours.
  • FIG. 37D shows the results of quantification of band intensity of HDO duplex in HDO (ASO/cRNA).
  • FIG. 38 shows the stability of various nucleic acid agents in human and rat cerebrospinal fluid.
  • FIG. 38A and 38B show the structure of the nucleic acid used in Example 11.
  • FIG. Figure 38A shows the structure of an HDO containing an ASO targeting the Mapt gene (ASO/cRNA).
  • Figure 38B shows the structure of HDO (ASO/cDNA).
  • FIG. 38C shows the results of examining stability by electrophoresis after mixing various nucleic acid agents with human or rat cerebrospinal fluid for 6 hours.
  • FIG. 38D shows the stability of the second nucleic acid strand (cRNA and cDNA) in HDO (ASO/cRNA) and HDO (ASO/cDNA) in human and rat cerebrospinal fluid.
  • Figure 39 shows the stability of various nucleic acid agents in mouse, rat, monkey, and human cerebrospinal fluid.
  • FIG. 39A and 39B show the structure of the nucleic acid used in Example 12.
  • FIG. 39A shows the structure of HDO (all RNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • Figure 39B shows the structure of HDO (all DNA).
  • FIG. 39C shows the results of examining the stability by electrophoresis after mixing various nucleic acid agents with mouse, rat, monkey, and human cerebrospinal fluid for 6 hours.
  • FIG. 40 shows the stability of various nucleic acid agents in mouse, rat, monkey, and human cerebrospinal fluid.
  • 40A and 40B show the structures of the nucleic acids used in Example 12.
  • FIG. 40A shows the structure of HDO (cRNA 6MOE wing) containing an ASO targeting the Mapt gene.
  • FIG. 40B shows the structure of HDO (cDNA 6MOE wing).
  • FIG. 40C shows the results of mixing various nucleic acid agents with cerebrospinal fluid of mice, rats, monkeys and humans for 6 hours and then examining the stability by electrophoresis.
  • 41 shows the structure of the nucleic acid used in Example 13.
  • FIG. 41A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • FIG. 41B shows the structure of HDO(A RNA ).
  • Figure 41C shows the structure of HDO (G RNA ).
  • FIG. 41D shows the structure of HDO(C RNA ).
  • FIG. 41E shows the structure of HDO(U RNA ).
  • FIG. 42 shows the results of examining stability by electrophoresis after mixing various nucleic acid agents with human cerebrospinal fluid for 6 hours.
  • 43 shows the structure of the nucleic acid used in Example 14.
  • FIG. Figure 43A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Mapt gene.
  • FIG. 43B shows the structure of HDO (GA RNA ).
  • FIG. 43C shows the structure of HDO (CU RNA ).
  • FIG. 43D shows the structure of HDO(C RNA ).
  • FIG. 43E shows the structure of HDO(U RNA ).
  • FIG. 44 shows the results of examining stability by electrophoresis after mixing various nucleic acid agents with human cerebrospinal fluid for 1 hour or 6 hours.
  • 45 shows the structure of the nucleic acid used in Example 15.
  • FIG. FIG. 45A shows the structure of HDO (all DNA) containing ASOs targeting the Malat1 gene.
  • FIG. 45B shows the structure of HDO(A RNA ).
  • Figure 45C shows the structure of HDO (G RNA ).
  • FIG. 45D shows the structure of HDO(C RNA ).
  • Figure 45E shows the structure of HDO (U RNA ).
  • FIG. 46 shows the results of examining stability by electrophoresis after mixing various nucleic acid agents with human cerebrospinal fluid for 6 hours.
  • FIG. 47 shows the results of evaluating the central nervous system toxicity of nucleic acid agents in monkeys.
  • 47A-C show the structures of the nucleic acids used in Example 16.
  • FIG. Figure 47A shows the structure of an ASO targeting the Mapt gene.
  • FIG. 47B shows the structure of HDO (RNA-MOE).
  • Figure 47C shows the structure of HDO (DNA-MOE).
  • FIG. 47D shows the procedure for evaluating central nervous system toxicity in monkeys in Example 16.
  • FIG. 47E shows the results of evaluating central nervous system toxicity of various nucleic acid agents in monkeys.
  • 48 shows the structure of the nucleic acid used in Example 17.
  • FIG. Figure 48A shows the structure of HDO (all DNA).
  • FIG. 48B shows the structure of HDO (all MOE).
  • FIG. 48C shows the structure of HDO (bulge1).
  • FIG. 48D shows the structure of HDO (bulge2).
  • FIG. 49 shows Mapt mRNA expression levels and LDH activity in human neuroblastoma-derived cells transfected with various nucleic acid agents.
  • FIG. 49A shows relative Mapt mRNA levels.
  • Figure 49B shows relative LDH release levels in the supernatant. Error bars indicate standard error.
  • 50 shows the structure of the nucleic acid used in Example 18.
  • FIG. 50A shows the structure of HDO(bulge).
  • FIG. 50B shows the structure of HDO (ssHDO).
  • FIG. 50C shows the structure of PEG linker ssHDO.
  • FIG. 50D shows the structure of Bulge plus ssHDO.
  • FIG. 51 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • FIG. 51A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 51B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 51A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 51B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 51A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 52 shows the expression levels of Malat1 RNA in the brains of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • FIG. 52A shows results for the left frontal cortex.
  • FIG. 52B shows results for the right frontal cortex. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 53 shows the results of incubating various nucleic acid agents in brain tissue homogenate for 7 days and evaluating the efficiency of dissociation of double strands by electrophoresis.
  • FIG. 54 shows acute phase tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 55 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • FIG. 55A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 55B shows maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 56 shows acute phase tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 57 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • Figure 57A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • Figure 57B shows the maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 58 shows the results of measuring the body weight of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered. Error bars indicate standard error. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 59 shows the results of evaluation of motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered one day after administration.
  • FIG. 60 shows the expression level of Mapt mRNA in the right frontal lobe of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 61 shows the results of incubating various nucleic acid agents in a brain tissue homogenate for 7 days and evaluating the efficiency of dissociation of double strands by electrophoresis.
  • FIG. 62 shows acute phase tolerability scores 30 minutes to 4 hours after administration of mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 63 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • Figure 63A shows the total distance traveled for 5 minutes.
  • FIG. 63B shows maximum movement speed. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 64 shows LDH activity and Bace1 mRNA expression levels in mouse neuroblastoma-derived cells (Neuro2a cell line) introduced with various nucleic acid agents.
  • Figure 64A shows relative LDH release levels in the supernatant.
  • Figure 64B shows relative Bace1 mRNA levels. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 65 shows a modified FOB score evaluation method.
  • FIG. 66 shows the results of evaluation of modified FOB scores in monkeys intrathecally administered with various nucleic acid agents.
  • FIG. 67 shows the results of measurement of spontaneous movement time and number of jumps by 3-minute video animation in monkeys to which various nucleic acid agents were intrathecally administered.
  • Double-stranded nucleic acid complex 1-1 A first aspect of the present invention is a double-stranded nucleic acid complex.
  • a double-stranded nucleic acid complex of the present invention comprises a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand, and comprises one or more 2'-modified nucleosides.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention is stable in the cerebrospinal fluid of primates including humans, and has reduced toxicity such as central nervous system toxicity.
  • a "transcript" of a target gene refers to any RNA that is directly targeted by the nucleic acid complex of the present invention and synthesized by RNA polymerase. Specifically, mRNA transcribed from target genes (including mature mRNA, pre-mRNA, and mRNA that has not undergone base modification), non-coding RNA such as miRNA (non-coding RNA, ncRNA), long non-coding RNA RNA (lncRNA), which may include natural antisense RNA.
  • target genes including mature mRNA, pre-mRNA, and mRNA that has not undergone base modification
  • non-coding RNA such as miRNA (non-coding RNA, ncRNA), long non-coding RNA RNA (lncRNA), which may include natural antisense RNA.
  • target gene refers to the function of a transcription product or translation product whose expression level can be suppressed or enhanced by the antisense effect of the double-stranded nucleic acid complex of the present invention. can be inhibited, or steric blocking, splicing switch, RNA editing, exon skipping or exon inclusion can be induced.
  • the type of target gene is not particularly limited as long as it is expressed in vivo.
  • genes derived from organisms into which the double-stranded nucleic acid complex of the present invention is introduced such as genes whose expression is increased in various diseases. is mentioned.
  • scavenger receptor B1 (herein often referred to as "SR-B1”) gene
  • metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (herein often referred to as abbreviated as "Malat1”) gene
  • microtubule-associated protein tau in this specification, often abbreviated as "Mapt” gene
  • ⁇ -secretase 1 (beta-secretase 1: in this specification , often referred to as "BACE1” gene
  • DMPK dystrophia myotonica-protein kinase
  • target transcript refers to any RNA that is directly targeted by the nucleic acid complex of the present invention and synthesized by RNA polymerase.
  • transcription products of target genes correspond. Specifically, mRNA transcribed from target genes (including mature mRNA, pre-mRNA, and mRNA that has not undergone base modification), non-coding RNA such as miRNA (non-coding RNA, ncRNA), long non-coding RNA RNA (lncRNA), which may include natural antisense RNA.
  • target gene transcripts examples include SR-B1 mRNA, which is the transcript of the SR-B1 gene, Mapt mRNA, which is the transcript of the Mapt gene, BACE1 mRNA, which is the transcript of the BACE1 gene, and transcript of the Malat1 gene.
  • Mapt mRNA which is the transcript of the Mapt gene
  • BACE1 mRNA which is the transcript of the BACE1 gene
  • Malat1 non-coding RNA Malat1 non-coding RNA
  • DMPK mRNA which is a transcription product of the DMPK gene
  • dystrophin mRNA which is a transcription product of the dystrophin gene, or its precursor (pre-mRNA).
  • target transcripts include the exon 23/intron 23 boundary region of Dystrophin pre-mRNA (GenBank Accession Number: NC_000086.7), such as positions 83803482 to 83803566, such as positions 83803512 to 83803536.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of mouse DMPK mRNA
  • SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of human DMPK mRNA. In each of SEQ ID NOs: 7 to 8, the base sequence of mRNA is replaced with the base sequence of DNA.
  • the nucleotide sequence information of these genes and transcripts can be obtained from known databases such as the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database.
  • antisense oligonucleotides or “antisense nucleic acids” are capable of hybridizing (i.e., complementary a) refers to a single-stranded oligonucleotide containing a base sequence and capable of producing an antisense effect on a target transcript.
  • the first nucleic acid strand functions as an ASO, and its target region is 3'UTR, 5'UTR, exon, intron, coding region, translation initiation region, translation termination region, or Any other nucleic acid region may be included.
  • the target region of the target transcript is at least 8 bases long, e.g. It can be 16-22 bases long, or 16-20 bases long.
  • Antisense effect refers to the effect of regulating the expression or editing of a target transcript (eg, RNA sense strand) by hybridizing the ASO to the target transcript.
  • “Modulating the expression or editing of a target transcript” refers to the expression of a target gene or the expression level of a target transcript (herein, “target transcript expression level” is often referred to as “target transcript level”). expression), inhibition of translation, RNA editing, splicing function modification effects (eg, splicing switch, exon inclusion, exon skipping, etc.), or degradation of transcripts.
  • RNA oligonucleotide when introduced into a cell as an ASO, the ASO forms a partial duplex by annealing with mRNA, the transcript of the target gene. This partial double strand serves as a cover to prevent translation by the ribosome, thereby inhibiting the expression of the target protein encoded by the target gene at the translational level (steric blocking).
  • oligonucleotides containing DNA as ASO are introduced into cells, partial DNA-RNA heteroduplexes are formed. Recognition of this heteroduplex structure by RNase H results in degradation of target gene mRNA and inhibition of expression of the protein encoded by the target gene at the expression level.
  • antisense effects can also be produced by targeting introns in pre-mRNAs.
  • antisense effects can also be produced by targeting miRNAs.
  • the functional inhibition of the miRNA can increase the expression of genes whose expression is normally controlled by the miRNA.
  • modulating expression of the target transcript may be reduction in target transcript abundance.
  • the antisense effect is measured, for example, by administering a test nucleic acid compound to a subject (eg, a mouse), and, for example, several days later (eg, 2 to 7 days later), the expression is regulated by the antisense effect provided by the test nucleic acid compound. It can be carried out by measuring the expression level of the target gene or the level (amount) of the target transcript (for example, the amount of mRNA or RNA such as microRNA, the amount of cDNA, the amount of protein, etc.).
  • the measured target gene expression level or target transcript level is at least 10%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, or at least 40% compared to a negative control (e.g., vehicle administration) If so, it indicates that the test nucleic acid compound is capable of producing an antisense effect (eg, reduction in target transcript abundance).
  • a negative control e.g., vehicle administration
  • the number, type and position of non-natural nucleotides in the nucleic acid chain can affect the antisense effect provided by the nucleic acid complex.
  • the selection of modification may differ depending on the sequence of the target gene, etc., but a person skilled in the art should refer to the literature related to the antisense method (for example, WO 2007/143315, WO 2008/043753, and WO 2008/049085).
  • the preferred embodiment can be determined by reference.
  • the measured value thus obtained is not significantly lower than the measured value of the nucleic acid complex before modification (e.g., When the measured value obtained after modification is 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the measured value of the nucleic acid complex before modification), the relevant modification can be evaluated.
  • target gene translation product refers to any polypeptide or protein synthesized by translation of the target transcript or target gene transcript that is the direct target of the nucleic acid complex of the present invention. say.
  • aptamer refers to a nucleic acid molecule that specifically binds to a specific target molecule intracellularly, on the cell membrane, or extracellularly, for example, on the cell membrane or extracellularly. Aptamers can be produced by methods known in the art, for example, in vitro selection using the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method.
  • the term “decoy” refers to a nucleic acid having a binding site sequence of a transcription factor (for example, NF-kB) or a similar sequence.
  • a transcription factor for example, NF-kB
  • a substance that suppresses the action represses transcription if it is a transcription activator, or promotes transcription if it is a transcription repressor.
  • a decoy nucleic acid can be easily designed based on the information of the binding sequence of the target transcription factor.
  • bait refers to a nucleic acid molecule that specifically binds to a specific target molecule in cells and modifies the function of the target molecule.
  • a target that interacts with a bait is also called a "prey”.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” may refer to a monomeric nucleotide or nucleoside, or may refer to an oligonucleotide composed of more than one monomer, or if a polymer means a polynucleotide.
  • Natural nucleic acid refers to a nucleic acid that occurs in nature. Natural nucleic acids include natural nucleosides, natural nucleotides, and the like, which will be described later.
  • Non-natural nucleic acid or “artificial nucleic acid” refers to any nucleic acid other than a naturally occurring nucleic acid. Non-natural nucleic acids or artificial nucleic acids include non-natural nucleosides, non-natural nucleotides, and the like, which will be described later.
  • nucleic acid strand or simply “strand” means two or more nucleosides linked by internucleoside linkages, and may be, for example, oligonucleotides or polynucleotides. Nucleic acid strands can be produced full length or partial strands by chemical synthetic methods, for example, using automated synthesizers, or by enzymatic processes using polymerases, ligases, or restriction reactions. A nucleic acid strand may comprise naturally occurring and/or non-naturally occurring nucleotides.
  • Nucleoside generally refers to a molecule consisting of a combination of a base and a sugar.
  • the sugar moiety of a nucleoside is usually, but not limited to, composed of pentofuranosyl sugars, specific examples of which include ribose and deoxyribose.
  • the base portion (nucleobase) of a nucleoside is usually a heterocyclic base portion. Non-limiting examples include adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil, as well as other modified nucleobases (modified bases).
  • Nucleotide refers to a molecule in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the nucleoside. Nucleotides containing a pentofuranosyl sugar typically have a phosphate group attached to the hydroxyl group at the 2', 3', or 5' position of the sugar.
  • Oligonucleotide refers to a linear oligomer formed by covalently linking several to several tens of hydroxyl groups and phosphate groups of sugar moieties between adjacent nucleotides.
  • polynucleotide refers to a linear polymer formed by linking several tens or more, preferably several hundred or more nucleotides by covalent bonds, which is larger than that of oligonucleotides.
  • phosphate groups are commonly considered to form internucleoside linkages.
  • Natural nucleoside refers to a nucleoside that exists in nature. Examples thereof include ribonucleosides composed of ribose and a base such as adenine, cytosine, guanine, or uracil, and deoxyribonucleosides composed of deoxyribose and a base such as adenine, cytosine, guanine, or thymine.
  • ribonucleosides found in RNA and deoxyribonucleosides found in DNA are often referred to as "DNA nucleosides" and "RNA nucleosides", respectively.
  • naturally occurring nucleotide refers to a naturally occurring nucleotide in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the natural nucleoside.
  • ribonucleotides known as structural units of RNA, in which a phosphate group is bound to a ribonucleoside
  • deoxyribonucleotides known as a structural unit of DNA, in which a phosphate group is bound to a deoxyribonucleoside.
  • non-natural nucleotide refers to any nucleotide other than natural nucleotides, including modified nucleotides and nucleotide mimetics.
  • modified nucleotide means a nucleotide having any one or more of modified sugar moieties, modified internucleoside linkages, and modified nucleobases.
  • nucleotide mimetics include structures that are used to replace nucleosides and linkages at one or more positions of an oligomeric compound.
  • Peptide Nucleic Acid is a nucleotide mimetic with a backbone of N-(2-aminoethyl)glycine instead of sugar linked by amide bonds.
  • Nucleic acid strands comprising unnatural oligonucleotides, as used herein, are often characterized by, for example, enhanced cellular uptake, enhanced affinity for nucleic acid targets, increased stability in the presence of nucleases, or increased inhibitory activity. has the desired properties of Therefore, it is preferred over natural nucleotides.
  • non-natural nucleoside refers to any nucleoside other than natural nucleosides. Examples include modified nucleosides and nucleoside mimetics. As used herein, “modified nucleoside” means a nucleoside having a modified sugar moiety and/or modified nucleobase.
  • mimetics refers to functional groups that replace sugars, nucleobases, and/or internucleoside linkages. In general, mimetics are used in place of the sugar or sugar-internucleoside linkage combination so that the nucleobase is maintained for hybridization to a target of choice.
  • nucleoside mimetic refers to substitution of a sugar at one or more positions of an oligomeric compound, substitution of a sugar and a base, or binding between monomer subunits constituting an oligomeric compound. Contains the structure used to replace.
  • oligomeric compound is meant a polymer of linked monomeric subunits capable of hybridizing to at least a region of a nucleic acid molecule.
  • Nucleoside mimetics include, for example, morpholino, cyclohexenyl, cyclohexyl, tetrahydropyranyl, bicyclic or tricyclic sugar mimetics, eg, nucleoside mimetics having non-furanose sugar units.
  • Modified sugar refers to a sugar that has a substitution and/or any change from the natural sugar moiety (i.e., sugar moieties found in DNA (2'-H) or RNA (2'-OH));
  • a “sugar modification” refers to a substitution and/or any change from a naturally occurring sugar moiety.
  • Nucleic acid strands may optionally contain one or more modified nucleosides, including modified sugars.
  • a “sugar modified nucleoside” refers to a nucleoside having a modified sugar moiety. Such sugar-modified nucleosides may confer enhanced nuclease stability, increased binding affinity, or some other beneficial biological property to nucleic acid chains.
  • nucleosides include chemically modified ribofuranose ring moieties.
  • chemically modified ribofuranose rings include, but are not limited to, addition of substituents (including 5' and 2' substituents), bridging of non-geminal ring atoms to form bicyclic nucleic acids (bridged nucleic acids, BNA ), S, N(R), or C(R1)(R2) of the ribosyl ring oxygen atom (R, R1 and R2 are each independently H, C1 - C12 alkyl, or a protecting group ), and combinations thereof.
  • sugar modified nucleosides include, but are not limited to, 5'-vinyl, 5'-methyl (R or S), 5'-allyl (R or S), 4'-S, 2'-F ( 2'-fluoro group), 2'- OCH3 (2'-O-Me group or 2'-O-methyl group), 2'-O-[2-(N-methylcarbamoyl)ethyl] (2'- O-MCE group), and nucleosides containing 2'-O-methoxyethyl (2'-O- MOE or 2-O( CH2 ) 2OCH3 ) substituents.
  • a "2'-modified sugar” means a furanosyl sugar modified at the 2' position. Nucleosides containing 2'-modified sugars are sometimes referred to as "2'-modified nucleosides" or "2'-sugar modified nucleosides.”
  • Bicyclic nucleoside refers to a modified nucleoside containing a bicyclic sugar moiety. Nucleic acids containing bicyclic sugar moieties are commonly referred to as bridged nucleic acid (BNA). Nucleosides containing a bicyclic sugar moiety are sometimes referred to as “bridged nucleosides,” “bridged non-natural nucleosides,” or “BNA nucleosides.” Some examples of crosslinked nucleic acids are shown in FIG.
  • a bicyclic sugar may be a sugar in which the 2' and 4' carbon atoms are bridged by two or more atoms. Examples of bicyclic sugars are known to those of skill in the art.
  • One subgroup of bicyclic sugar containing nucleic acids (BNA) or BNA nucleosides are 4'-( CH2 ) p -O-2', 4'-( CH2 ) p - CH2-2 ', 4 '-( CH2 ) p -S-2', 4'-( CH2 ) p -OCO-2', 4'-( CH2 ) n -N( R3 )-O-( CH2 ) m- 2' [wherein p, m and n represent an integer of 1 to 4, an integer of 0 to 2, and an integer of 1 to 3, respectively; and R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, a cyclo Represents an alkyl group, an aryl group,
  • R 1 and R 2 are typically is a hydrogen atom, which may be the same or different, and is also a hydroxyl group-protecting group for nucleic acid synthesis, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, an acyl a sulfonyl group, a silyl group, a phosphate group, a phosphate group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, or P(R 4 )R 5 [wherein R 4 and R 5 are a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a mercapto group, a mercapto group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, an amino group, 1
  • Non-limiting examples of such BNA nucleosides include methyleneoxy(4'- CH2 -O-2') BNA nucleosides (LNA nucleosides, also known as 2',4'-BNA nucleosides) (e.g.
  • amine BNA nucleosides as 2'-Amino-LNA nucleosides
  • 2'-O,4'-C-spirocyclopropylene bridged nucleosides also known as scpBNA nucleosides
  • other BNA nucleosides known to those skilled in the art.
  • a "cationic nucleoside” refers to, at a certain pH (e.g., human physiological pH (about 7.4), pH of a delivery site (e.g., organelle, cell, tissue, organ, organism, etc.)) A modified nucleoside that exists as a cationic form as compared to a neutral form (such as the neutral form of a ribonucleoside).
  • Cationic nucleosides may contain one or more cationic modifying groups at any position of the nucleoside.
  • the cationic nucleosides are 2'-Amino-LNA nucleosides (e.g.
  • Bicyclic nucleosides with a methyleneoxy (4'- CH2 -O-2') bridge are sometimes referred to as LNA nucleosides.
  • modified internucleoside linkage refers to an internucleoside linkage that has a substitution or any change from a naturally occurring internucleoside linkage (ie, a phosphodiester linkage).
  • Modified internucleoside linkages include internucleoside linkages containing a phosphorus atom and internucleoside linkages without a phosphorus atom.
  • Representative phosphorus-containing internucleoside linkages include phosphodiester linkages, phosphorothioate linkages, phosphorodithioate linkages, phosphotriester linkages (methylphosphotriester and ethylphosphotriester linkages described in US Pat. No.
  • alkyl Phosphonate linkages e.g., methylphosphonate linkages described in U.S. Pat. Nos. 5,264,423 and 5,286,717, methoxypropylphosphonate linkages described in WO 2015/168172
  • alkylthiophosphonate linkages e.g., methylthiophosphonate linkages, boranophosphate linkages, cyclic guanidine moieties
  • Internucleoside linkages containing e.g., the substructure represented by the following formula (I):
  • an internucleoside linkage comprising a guanidine moiety substituted with 1 to 4 C 1-6 alkyl groups e.g., a tetramethylguanidine (TMG) moiety
  • TMG tetramethylguanidine
  • a phosphorothioate linkage refers to an internucleoside linkage in which a sulfur atom replaces the non-bridging oxygen atom of a phosphodiester linkage.
  • Methods for preparing phosphorus-containing and non-phosphorus-containing linkages are well known.
  • Modified internucleoside linkages are preferably linkages that are more resistant to nucleases than naturally occurring internucleoside linkages.
  • the internucleoside linkage When the internucleoside linkage has a chiral center, the internucleoside linkage may be chirally controlled. "Chirally controlled” is intended to exist in a single diastereomer about a chiral center, eg, a chiral bound phosphorus. Chirally controlled internucleoside linkages can be completely chirally pure or highly chiral pure, e.g. It may have a chiral purity of %de, 99.9% de, or higher.
  • chiral purity refers to the proportion of one diastereomer in a mixture of diastereomers, expressed as diastereomeric excess (% de), (diastereomer of interest minus other diastereomer defined as (stereomers)/(total diastereomers) ⁇ 100 (%).
  • internucleoside linkages may be phosphorothioate linkages chiral controlled to the Rp or Sp configuration, guanidine moieties substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups (e.g., tetramethylguanidine (TMG) moieties; e.g. Alexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811) and/or an internucleoside linkage comprising a cyclic guanidine moiety.
  • TMG tetramethylguanidine
  • nucleobase or “base” used herein is a base component (heterocyclic moiety) that constitutes a nucleic acid, and adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil are mainly known.
  • nucleobase or “base” includes both modified and unmodified nucleobases (bases) unless otherwise specified.
  • the purine base can be either modified or unmodified purine base.
  • the pyrimidine base may be a modified or unmodified pyrimidine base.
  • Modified nucleobase or “modified base” means any nucleobase other than adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil.
  • Unmodified nucleobases or “unmodified bases” (natural nucleobases) include the purine bases adenine (A) and guanine (G), and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C), and means uracil (U).
  • modified nucleobases include hypoxanthine, 5-methylcytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5-iodocytosine or N4-methylcytosine; N6-methyladenine or 8-bromoadenine; thymine; and N2-methylguanine or 8-bromoguanine, but are not limited to these.
  • the modified nucleobase is preferably 5-methylcytosine.
  • the term “complementary” means that the nucleobases can form so-called Watson-Crick base pairs (natural base pairs) or non-Watson-Crick base pairs (Hoogsteen bases) through hydrogen bonding. It means a relationship that can form an equality).
  • the antisense oligonucleotide region in the first nucleic acid strand does not necessarily have to be completely complementary to at least part of the target transcript (for example, the transcript of the target gene). Complementarity of at least 70%, preferably at least 80%, even more preferably at least 90% (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more) is acceptable.
  • the antisense oligonucleotide region in the first nucleic acid strand is complementary in base sequence (typically when the base sequence is complementary to the base sequence of at least a portion of the target transcript), It can hybridize to a target transcript.
  • the region of complementarity in the second nucleic acid strand need not necessarily be completely complementary to at least a portion of the first nucleic acid strand, but has a base sequence of at least 70%, preferably at least 80%, and even More preferably, at least 90% (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more) complementarity is acceptable.
  • the complementary regions in the second nucleic acid strand can anneal when they are complementary in base sequence to at least a portion of the first nucleic acid strand.
  • Complementarity of base sequences can be determined by using the BLAST program or the like.
  • a person skilled in the art can easily determine the conditions (temperature, salt concentration, etc.) under which two strands can anneal or hybridize, taking into consideration the degree of complementarity between the strands.
  • a person skilled in the art can easily design an antisense nucleic acid complementary to the target transcript, for example, based on information on the base sequence of the target gene.
  • Hybridization conditions may be various stringent conditions such as low stringent conditions and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions may be relatively low temperature and high salt conditions, eg, 30° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • Highly stringent conditions may be relatively high temperature and low salt conditions, eg, 65° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • Hybridization stringency can be adjusted by varying conditions such as temperature and salt concentration.
  • 1 ⁇ SSC contains 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate.
  • toxicity includes, for example, death, pain, tremor, convulsion, movement disorder, cognitive impairment, consciousness disturbance, general malaise, fatigue, nausea, vomiting, dizziness, numbness, lightheadedness, etc. An action that causes unfavorable objective or subjective symptoms or functional abnormalities in a specimen. Toxicity can be toxicity in any organ. The toxicity may be neurotoxic.
  • neurotoxicity refers to an action that causes damage to nerve tissue, including central nerve tissue and peripheral nerve tissue, and interferes with normal activity of the nervous system.
  • Neurotoxicity includes death, respiratory abnormalities, cardiovascular abnormalities, headache, nausea or vomiting, unresponsiveness or hyporesponsiveness, altered consciousness, psychiatric disturbances, personality changes, hallucinations, delusions, cognitive impairment, postural abnormalities, involuntary movements, and tremors. , convulsions, hyperactive motor dysfunction, paralysis, sensory disturbances or autonomic dysfunction.
  • the neurotoxicity may be acute neurotoxicity.
  • Acute neurotoxicity can be neurotoxicity that occurs within 1, 3, 6, 9, 12, 24 or 48 hours of administration. Toxicity can be evaluated, for example, by acute phase tolerability score, adverse event rate, mortality rate, etc., as described in the Examples below.
  • central neurotoxicity refers to an action that causes damage to at least the central nervous system among nerve tissues and interferes with normal activity of the nervous system.
  • the term "subject” refers to a subject to which the double-stranded nucleic acid complex or pharmaceutical composition of the present invention is applied.
  • Subjects include organs, tissues, and cells as well as individuals.
  • any animal including humans can be applicable.
  • various livestock, poultry, pets, experimental animals, and the like can be mentioned.
  • a subject may be an individual in need of decreased expression of a target transcript or an individual in need of treatment or prevention of a disease.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention comprises a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand. Specific configurations of each nucleic acid strand are shown below.
  • the first nucleic acid strand can hybridize to at least a portion of the target gene or its transcript and has an antisense effect on the target gene or its transcript.
  • the second nucleic acid strand comprises a base sequence complementary to the first nucleic acid strand and contains one or more 2′-modified nucleosides.
  • the number of 2'-modified nucleosides contained in the second nucleic acid strand is at least one, and is equal to or less than the number of all nucleosides constituting the second nucleic acid strand (that is, the base length of the second nucleic acid strand).
  • the specific number of 2′-modified nucleosides contained in the second nucleic acid strand is, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 30 or less, 25 or less, 20 or less, 15 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 It may be 1 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less.
  • the number of 2'-modified nucleosides in the second nucleic acid strand is 1 to 30, 1 to 25, 1 to 24, 1 to 23, 1 to 22, 1 to 21, 1 to 20. , 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10 , 1-9, 1-8, 1-7, or 1-6.
  • it may be 1, 2, 3, 4, 5, or 6.
  • 1% or more, 2% or more, 3% or more, 4% or more, 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% of the nucleosides in the second nucleic acid strand % or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more , 95% or more, or 99% or more, and/or 100% or less, 95% or less, 90% or less, 85% or less, 80% or less, 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less, 55 % or less, 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, or 5% or less are 2'-modified nucleosides be. For example, 10%-90%, 20%-80%, 30%-70%,
  • the nucleosides other than the 2'-modified nucleosides contained in the second nucleic acid strand may be natural nucleosides, non-natural nucleosides such as crosslinked nucleosides, or any combination thereof.
  • the number of nucleosides other than the 2'-modified nucleosides contained in the second nucleic acid strand is not limited, but is, for example, 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 1 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more, for example 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 12, 1 to 10 1, 1 to 8, or 1 to 6, such as 1 to 5, such as 1, 2, 3, 4, or 5.
  • the second nucleic acid strand contains one 2'-modified nucleoside. In another embodiment, all of the nucleosides making up the second nucleic acid strand are 2'-modified nucleosides. For example, in the second nucleic acid strand, all nucleosides in the region consisting of a base sequence complementary to the first nucleic acid strand may be 2'-modified nucleosides. In a further embodiment, the second nucleic acid strand comprises one or more but less than all 2'-modified nucleosides.
  • the second nucleic acid strand "containing less than all" of 2'-modified nucleosides means that the second nucleic acid strand contains at least one arbitrary nucleoside other than a 2'-modified nucleoside.
  • the second nucleic acid strand comprises one or more contiguous 2'-modified nucleosides located at the 5' terminus.
  • “comprising multiple consecutive 2'-modified nucleosides” means comprising multiple 2'-modified nucleosides linked by any internucleoside linkage.
  • the second nucleic acid strand has one located at the 5' end, or consecutive 2 to 12, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4, Alternatively, it may contain 2-3, eg, 2, 3, or 4, 2'-modified nucleosides.
  • the second nucleic acid strand comprises one or more consecutive 2'-modified nucleosides located at the 3' terminus.
  • the second nucleic acid strand has one located at the 3′ end, or consecutive 2 to 12, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4, Alternatively, it may contain 2-3, eg, 2, 3, or 4, 2'-modified nucleosides.
  • the second nucleic acid strand comprises one or more contiguous 2'-modified nucleosides located at the 5' terminus and one or more contiguous 2'-modified nucleosides located at the 3' terminus.
  • the second nucleic acid strand contains 2'-modified nucleosides at positions other than the 5' and 3' ends.
  • the second nucleic acid strand "containing a 2'-modified nucleoside at a position other than the 5' end and the 3' end" means that one or more consecutive 2' -modified nucleosides and 2'-modified nucleosides at positions other than one or more consecutive 2'-modified nucleosides located at the 3'-end.
  • the second nucleic acid strand has 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 12, 1 to 10, 1 9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, or 1-3, such as 1 or 2, 2'-modified nucleosides.
  • the second nucleic acid strand contains one or more nucleosides other than 2'-modified nucleosides. In a further embodiment, all of the nucleosides other than 2'-modified nucleosides in the second nucleic acid strand (eg, in the region consisting of the base sequence complementary to the first nucleic acid strand) can be deoxyribonucleosides.
  • the 2'-modified nucleosides are 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides and/or 2'-O-methyl modified nucleosides.
  • the 2'-O-methoxyethyl modified nucleoside has the following formula (III): is indicated by 2'-O-methyl modified nucleosides may also be represented by the following formula (IV): is indicated by
  • the 2'-modified nucleosides are 2'-O-methyl modified nucleosides.
  • the 2'-modified nucleoside is a 2'-O-methoxyethyl modified nucleoside.
  • all of the nucleosides in the first nucleic acid strand may be non-natural nucleosides or modified nucleosides.
  • all of the nucleosides in the first nucleic acid strand may be 2'-modified nucleosides.
  • all of the nucleosides may be 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides.
  • the first nucleic acid strand can contain at least 4, at least 5, at least 6, or at least 7 contiguous nucleosides that are recognized by RNase H when hybridized to the target transcript. Generally, any region containing consecutive nucleosides of 4 to 20 bases, 5 to 16 bases, or 6 to 12 bases may be used. As a nucleoside recognized by RNase H, for example, natural deoxyribonucleoside can be used. Suitable nucleosides containing modified deoxyribonucleosides and other bases are well known in the art. It is also known that nucleosides having a hydroxy group at the 2'-position, such as ribonucleosides, are unsuitable as the nucleosides.
  • the suitability of nucleosides for use in this region containing "at least 4 contiguous nucleosides" can readily be determined.
  • the first nucleic acid strand may comprise at least 4 contiguous deoxyribonucleosides.
  • the nucleosides of the first nucleic acid strand comprise or consist of deoxyribonucleosides, e.g., 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more of the nucleosides of the first nucleic acid strand are deoxyribonucleosides. be.
  • the first nucleic acid strand may be a gapmer.
  • the term "gapmer” basically refers to a central region (DNA gap region) and wing regions located directly at its 5' and 3' ends (5' wing region and 3' wing region, respectively). It refers to a single-stranded nucleic acid consisting of The length of the DNA gap region is 13 to 22 bases, 16 to 22 bases, or 16 to 20 bases, or 4 to 20 bases, 5 to 18 bases, 6 to 16 bases, or 7 to 14 bases. long, or 8-12 bases long.
  • the central region in the gapmer contains at least 3 or at least 4 contiguous deoxyribonucleosides and the wing regions contain at least one non-natural nucleoside.
  • non-natural nucleosides contained in the wing regions usually have higher binding strength to RNA than natural nucleosides and have high resistance to nucleolytic enzymes (nucleases and the like).
  • the non-naturally occurring nucleosides making up the wing regions comprise or consist of bridging nucleosides
  • said gapmers are specifically referred to as "BNA/DNA gapmers”.
  • the number of bridging nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region is at least 1, and may be, for example, 2 or 3.
  • the bridging nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region may be present continuously or non-contiguously within the 5' wing region and the 3' wing region.
  • Bridging nucleosides can further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • modified nucleobases eg, 5-methylcytosine
  • the bridging nucleosides are LNA nucleosides
  • said gapmers are referred to as "LNA/DNA gapmers”.
  • the non-natural nucleosides making up the 5' and 3' wing regions comprise or consist of peptide nucleic acids
  • said gapmers are specifically referred to as "peptide nucleic acid gapmers”.
  • the unnatural nucleosides making up the 5' and 3' wing regions comprise or consist of morpholino nucleic acids
  • said gapmers are specifically referred to as "morpholino nucleic acid gapmers”.
  • the base lengths of the 5' wing region and the 3' wing region may each independently be at least 2 bases long, for example, 2 to 10 bases long, 2 to 7 bases long, or 3 to 5 bases long.
  • the 5′ wing region and/or the 3′ wing region may contain at least one non-natural nucleoside, and may further contain natural nucleosides.
  • the 5' and 3' wing regions are, for example, non-natural nucleosides linked by modified internucleoside linkages such as phosphorothioate linkages, bridged nucleosides such as LNA nucleosides, and 2' -It may be a modified nucleoside.
  • the central region contains at least 3 or at least 4 consecutive deoxyribonucleosides, and the wing regions (5' wing region and 3' wing region) contain at least one unnatural nucleoside.
  • the central region can be functionally defined as the region that can be recognized by RNase H1.
  • RNase H1 means that when the gapmer binds to the target RNA, the sequence in the target RNA paired with the gapmer can be cleaved by RNase H1.
  • the boundary positions can be determined with the region that can be recognized by RNase H1 in the gapmer as the central region and the region that is not recognized by RNase H1 as the wing regions (5' wing region and 3' wing region).
  • nucleosides adjacent to the central region in the 5' wing region and 3' wing region are defined as non-natural nucleosides
  • nucleosides adjacent to the 5' wing region or 3' wing region in the central region are defined as natural nucleosides. .
  • the first nucleic acid strand constituting the gapmer is, in order from the 5′ end, a bridging nucleoside of 2 to 7 bases or 3 to 5 bases (for example, 2 or 3 bases), 4 to 15 bases or 8 to 12 bases. It may be composed of ribonucleosides or deoxyribonucleosides having a base length (eg, 8 or 10 base lengths) and bridging nucleosides having a length of 2 to 7 bases or 3 to 5 bases (eg, 2 or 3 base lengths).
  • a nucleic acid strand having a wing region only on either the 5'-end side or the 3'-end side is called a "hemigapmer" in the art. shall be included.
  • the second nucleic acid strand contains 2'-modified nucleosides in a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand may have 2'-modified nucleosides for all nucleosides in a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or the 3' wing region of the first nucleic acid strand.
  • 2'-modified nucleosides may be, for example, 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides or 2'-O-methyl modified nucleosides.
  • the nucleoside containing a purine base in the region consisting of the base sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand may be a ribonucleoside.
  • all nucleosides containing purine bases can be ribonucleosides in the region consisting of the nucleotide sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand.
  • the nucleosides containing pyrimidine bases in the region consisting of the base sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand may be deoxyribonucleosides.
  • all nucleosides containing pyrimidine bases in the region consisting of the nucleotide sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand can be deoxyribonucleosides.
  • all nucleosides containing purine bases are ribonucleosides and all nucleosides containing pyrimidine bases in the region consisting of a nucleotide sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand has 2′-modified nucleosides (e.g., 2′- O-methoxyethyl-modified nucleoside or 2'-O-methyl-modified nucleoside), and in the second nucleic acid strand, all the purine bases in the region consisting of the base sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand.
  • the nucleosides are ribonucleosides and all nucleosides containing a pyrimidine base can be deoxyribonucleosides.
  • nucleoside in the first nucleic acid strand may be a 2'-modified nucleoside.
  • nucleosides in the first nucleic acid strand may be 2'-modified nucleosides.
  • At least one guanosine nucleoside in the 3' wing region and/or 5' wing region of the first nucleic acid strand is a 2'-modified nucleoside.
  • nucleosides in the 3' wing region and/or 5' wing region of the first nucleic acid strand may be a further embodiment, (i) all guanosine nucleosides in the 3' wing region and/or 5' wing region of the first nucleic acid strand, (ii) the nucleosides 5' adjacent to said guanosine nucleosides, (iii) said Even if the nucleoside adjacent to the 3'-terminal side of the guanosine nucleoside or (iv) the nucleoside in the second nucleic acid strand that is complementary to any combination of (i) to (iii) above is a 2'-modified nucleoside good.
  • nucleosides in the region consisting of a base sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand are (a) deoxyribonucleosides, (b) deoxyribonucleosides and ribonucleosides, (c ) deoxyribonucleosides and 2'-modified nucleosides, or (d) ribonucleosides and 2'-modified nucleosides, or (e) deoxyribonucleosides, ribonucleosides, and 2'-modified nucleosides.
  • nucleosides in a region consisting of base sequences complementary to the 5' wing region and 3' wing region of the first nucleic acid strand are 2'-modified nucleosides, and All nucleosides in the region consisting of complementary nucleotide sequences can be deoxyribonucleosides.
  • At least one of the nucleosides containing a pyrimidine base in the second nucleic acid strand may be a 2'-modified nucleoside and/or deoxyribonucleoside.
  • the second nucleic acid strand does not contain natural ribonucleosides containing pyrimidine bases, for example all of the nucleosides containing pyrimidine bases in the second nucleic acid strand may be 2'-modified nucleosides and/or deoxyribonucleosides. .
  • the second nucleic acid strand may contain modified nucleosides other than 2'-modified nucleosides in addition to 2'-modified nucleosides.
  • R represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • the crosslinked non-natural nucleoside represented by formula (V) above is a 2'-O,4'-C-spirocyclopropylene crosslinked nucleic acid, and is mainly referred to as "scpBNA" in this specification.
  • R may be either a hydrogen atom or a methyl group.
  • R may be either a hydrogen atom or a methyl group.
  • a methyl group can also be written as AmNA[N-Me].
  • the first nucleic acid strand may be a mixmer.
  • the term "mixmer” refers to a nucleic acid chain that contains alternating natural and unnatural nucleosides of periodic or random segment length and is free of four or more contiguous deoxyribonucleosides and ribonucleosides. .
  • Mixmers in which the unnatural nucleoside is a bridged nucleoside and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "BNA/DNA mixmers".
  • the bridged nucleoside may be a bridged non-natural nucleoside represented by formula (V) or formula (VI) above.
  • Mixmers in which the non-natural nucleoside is a peptide nucleic acid and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "peptide nucleic acid/DNA mixmers".
  • Mixmers in which the unnatural nucleoside is a morpholinonucleic acid and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "morpholinonucleic acid/DNA mixmers”.
  • Mixmers are not limited to containing only two nucleosides.
  • Mixmers can include any number of types of nucleosides, whether natural or modified nucleosides or nucleoside mimetics.
  • bridging nucleoside e.g., LNA nucleoside or a bridging non-natural nucleoside represented by formula (V) or formula (VI) above.
  • Bridging nucleosides may further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • the second nucleic acid strand comprises at least 4 contiguous ribonucleosides complementary to the at least 4 contiguous nucleosides (e.g., deoxyribonucleosides) in the central region of the first nucleic acid strand. good too. This is so that the second nucleic acid strand forms a partial DNA-RNA heteroduplex with the first nucleic acid strand and is recognized and cleaved by RNaseH. At least four consecutive ribonucleosides in the second nucleic acid strand are preferably linked by naturally occurring internucleoside linkages, ie phosphodiester linkages.
  • the second nucleic acid strand may further comprise at least 2 consecutive deoxyribonucleosides in addition to the at least 4 consecutive ribonucleosides described above.
  • the at least two contiguous deoxyribonucleosides are complementary to the first nucleic acid strand and may be included in a region complementary to the central region of the first nucleic acid strand.
  • the at least two consecutive deoxyribonucleosides may be positioned on either the 5' side or the 3' side of the at least four consecutive ribonucleosides, and may be positioned on both the 5' and 3' sides.
  • the at least two consecutive deoxyribonucleosides may be 2, 3, 4, 5, 6 or more consecutive deoxyribonucleosides.
  • Modified nucleosides may include modified sugars and/or modified nucleobases.
  • Modified sugars may be 2'-modified sugars (eg, sugars containing a 2'-O-methyl group).
  • a modified nucleobase can also be 5-methylcytosine.
  • the second nucleic acid strand is, in order from the 5' end, a modified nucleoside (e.g., a modified nucleoside containing a 2'-modified sugar) having a length of 2 to 7 bases or a length of 3 to 5 bases (for example, 2 or 3 bases), 4 to ribonucleosides or deoxyribonucleosides (optionally linked by modified internucleoside linkages) 15 bases long or 8-12 bases long (eg 8 or 10 bases long) and 2-7 bases long or 3-5 bases long ( (eg, 2 or 3 bases long) modified nucleosides (eg, modified nucleosides containing 2'-modified sugars).
  • the first nucleic acid strand may be a gapmer.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand may contain nucleoside mimics or nucleotide mimics in whole or in part.
  • Nucleotide mimetics may be peptide nucleic acids and/or morpholino nucleic acids.
  • the second nucleic acid strand may contain non-complementary bases and/or insertions and/or deletions of one or more bases relative to the first nucleic acid strand.
  • the number of non-complementary bases in the second nucleic acid strand is not limited, but for example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to It may be 4, 1-3, 1-2, or 1 or 2.
  • a sequence consisting of non-complementary bases may form a bulge structure, which will be described later.
  • the number of bases in the insertion sequence in the second nucleic acid strand is not limited, but is, for example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to It may be 4, 1-3, 1-2, or 1 or 2.
  • the insertion sequence may be a sequence that forms a bulge structure as described below.
  • the length of consecutive bases to be deleted in the second nucleic acid strand is not limited, but for example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 It may be ⁇ 4, 1-3, 1-2, or 1 or 2.
  • the second nucleic acid strand may contain a bulge structure described later at the deletion position.
  • the base lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are not particularly limited, but are at least 8 bases long, at least 9 bases long, at least 10 bases long, at least 11 bases long, at least 12 bases long, at least 13 bases long, at least It may be 14 bases long, or at least 15 bases long.
  • the base lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are 35 base lengths or less, 30 base lengths or less, 25 base lengths or less, 24 base lengths or less, 23 base lengths or less, 22 base lengths or less, and 21 base lengths or less. , 20 bases or less, 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, or 16 bases or less.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may have the same length or different lengths (eg, one may be 1 to 3 bases shorter or longer).
  • the length of the second nucleic acid strand is shorter than the length of the first nucleic acid strand.
  • the position at which the second nucleic acid strand can bind to the first nucleic acid strand does not matter. For example, it may bind to any of the 5'-side region, the central region, or the 3'-side region in the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand may be at least 8 bases long.
  • the double-stranded structure formed by the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may contain a bulge.
  • the choice of length can be determined by the balance between the strength of the antisense effect and the specificity of the nucleic acid strand for its target, among other factors such as cost, synthetic yield, and the like.
  • the second nucleic acid strand may contain at least one overhang region located on one or both of its 5' and 3' ends.
  • the "overhang region” is a region adjacent to a region complementary to the first nucleic acid strand in the second nucleic acid strand, and when the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand anneal to form a double-stranded structure, the 5' end of the second nucleic acid strand extends beyond the 3' end of the first nucleic acid strand and/or the 3' end of the second nucleic acid strand extends beyond the 5' end of the first nucleic acid strand, i.e.
  • the overhang region in the second nucleic acid strand may be located on the 5'-terminal side or the 3'-terminal side of the complementary region.
  • the overhang regions in the second nucleic acid strand may be located on the 5'-end side and the 3'-end side of the complementary region.
  • the length of the overhang region is not limited, but may be 1 to 20 bases long, for example, 2 to 15 bases long, 2 to 12 bases long, 2 to 10 bases long, 2 to 8 bases long, 2 to It may be 6 bases long, 2-5 bases long, 2-4 bases long, or 2-3 bases long.
  • the type of nucleosides constituting the overhang region is not limited. For example, it may be composed of natural nucleosides (eg deoxyribonucleosides) or non-natural nucleosides (eg bridged nucleosides such as LNA nucleosides). Also, all or part of the internucleoside linkages in the overhang region may be modified internucleoside linkages.
  • Modified internucleoside linkages may be, for example, phosphorothioate linkages.
  • the overhang regions are preferably protein-binding, lipophilic and/or nuclease-resistant and may be composed of, for example, deoxyribonucleosides or LNA nucleosides linked by phosphorothioate linkages.
  • the nucleotide sequence of the overhang region may be a sequence unrelated to the nucleotide sequence of the target gene.
  • At least 1, at least 2 (eg, 2), at least 3, or at least 4 nucleosides from the end (5' end, 3' end, or both ends) of the second nucleic acid strand are non-natural nucleosides (modified nucleoside).
  • Modified nucleosides may include modified sugars and/or modified nucleobases.
  • Modified sugars may be 2'-modified sugars (eg, sugars containing a 2'-O-methyl group).
  • a modified nucleobase can also be 5-methylcytosine.
  • the second nucleic acid strand is 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 ⁇ 5, 1-4, or 1-3 (e.g., 1-2, or 1) non-complementary bases, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5 1 to 4, or 1 to 3 (eg, 1 to 2, or 1) deleted bases, and/or 1 to 20 (eg, 1 to 15, 1 to 12, 1 ⁇ 10, 1-8, 1-6, 1-4, 1-3, or 1) inserted bases.
  • a sequence region consisting of inserted bases may form a bulge structure.
  • the two nucleic acid strands contain at least one bulge structure consisting of a non-complementary base sequence to the first nucleic acid strand.
  • the term “bulge structure” refers to a portion of a double-stranded nucleic acid in which part of the nucleic acid of any one of the nucleic acid strands constituting the double strand protrudes from the double-stranded structure without base pairing.
  • the base length of the bulge structure is not limited. For example, it is 1 to 50 bases long, 1 to 40 bases long, 1 to 30 bases long, 1 to 20 bases long, 1 to 15 bases long, preferably 1 to 10 bases long.
  • the bulge structure comprises sugar-unmodified nucleosides. In a further embodiment, all nucleosides in the bulge structure are sugar unmodified nucleosides.
  • all nucleosides other than the bulge structure may be 2'-modified nucleosides.
  • the internucleoside linkages in the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may be naturally occurring internucleoside linkages and/or modified internucleoside linkages. At least 1, at least 2, or at least 3 internucleoside linkages from the end (5′ end, 3′ end, or both ends) of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand are modified internucleoside linkages, but are not limited to A bond is preferred.
  • two internucleoside bonds from the end of a nucleic acid chain mean the internucleoside bond closest to the end of the nucleic acid chain and the internucleoside bond adjacent thereto and located on the opposite side of the end. Modified internucleoside linkages in terminal regions of nucleic acid strands are preferred because they can reduce or inhibit unwanted degradation of the nucleic acid strand.
  • all or part of the internucleoside linkages of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand may be modified internucleoside linkages.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 modified internucleoside linkages. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, It may contain 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 or more.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 93%, at least 95%, at least 98%, or 100%.
  • the modified internucleoside linkage may be a phosphorothioate linkage or a boranophosphate linkage.
  • all or part of the internucleoside linkages in the first nucleic acid strand may be phosphorothioate linkages.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 chirally controlled internucleoside linkages. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, It may contain 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 or more.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50% chirally controlled internucleoside linkages. %, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or more.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have 1, 2, 3, 4 non-negatively charged internucleoside linkages (preferably neutral internucleoside linkages), 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 or more.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50% non-negatively charged internucleoside linkages. , at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or more.
  • At least 1, at least 2, or at least 3 internucleoside linkages from the 5' end of the second nucleic acid strand may be modified internucleoside linkages. At least 1, at least 2, or at least 3 internucleoside linkages from the 3′ end of the second nucleic acid strand are replaced with modified internucleoside linkages, such as phosphorothioate linkages, 1-4 C 1-6 alkyl groups may be an internucleoside linkage comprising a modified guanidine moiety (eg, a TMG moiety) and/or an internucleoside linkage comprising a cyclic guanidine moiety. Modified internucleoside linkages may be chirally controlled to the Rp or Sp configuration.
  • At least one (eg, three) internucleoside linkage from the 3' end of the second nucleic acid strand may be a modified internucleoside linkage such as a highly RNase-resistant phosphorothioate linkage.
  • the double-stranded nucleic acid complex has an improved gene suppressing activity, which is preferable.
  • the modified internucleoside linkages of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand are controlled at a pH (e.g., human physiological pH (about 7.4), a delivery site (e.g., an organelle, cell, tissue, organ).
  • a pH e.g., human physiological pH (about 7.4)
  • a delivery site e.g., an organelle, cell, tissue, organ.
  • the modified internucleoside linkage is in an anionic form (e.g., -OP(O)(O - )-O- (anionic form of natural phosphate linkage), -OP(O) (S ⁇ )—O— (anionic form of phosphorothioate linkages, etc.)), including non-negatively charged (neutral or cationic, respectively) internucleoside linkages that exist as neutral or cationic forms.
  • the modified internucleoside linkages of the first and/or second nucleic acid strand comprise neutral internucleoside linkages.
  • the modified internucleoside linkages of the first and/or second nucleic acid strand comprise cationic internucleoside linkages.
  • a non-negatively charged internucleoside linkage e.g., a neutral internucleoside linkage
  • the non-negatively charged internucleoside linkage is, for example, a methylphosphonate linkage as described in U.S. Patent Nos.
  • the non-negatively charged internucleoside linkage comprises a triazole or alkyne moiety.
  • the non-negatively charged internucleoside linkage comprises a cyclic guanidine moiety and/or a guanidine moiety (preferably a TMG moiety) substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups.
  • a modified internucleoside linkage comprising a cyclic guanidine moiety has a substructure represented by Formula (I).
  • the guanidine moiety substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups has a substructure represented by Formula (II).
  • neutral internucleoside linkages comprising cyclic guanidine moieties and/or guanidine moieties substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups are chirally controlled.
  • the disclosure relates to a composition
  • a composition comprising an oligonucleotide comprising at least one neutral internucleoside linkage and at least one phosphorothioate internucleoside linkage.
  • neutral internucleotide linkages have properties compared to equivalent nucleic acids that do not contain neutral internucleotide linkages. and/or have improved activity, e.g., improved delivery, improved resistance to exonucleases and endonucleases, improved cellular uptake, improved endosomal escape, and/or improved nuclear uptake, etc.
  • the second nucleic acid strand may be bound to a ligand (also referred to herein as a binder).
  • Ligands include small molecules (small molecule ligands), medium molecules (medium molecule ligands), macromolecules (macromolecular ligands), peptides (peptide ligands), lipids (lipid ligands), and aptamers (e.g., nucleic acid aptamers).
  • peptide refers to an amino acid polymer having one or more peptide bonds.
  • a “peptide” is not limited by the number of amino acid residues it contains.
  • peptide includes oligopeptides containing a few amino acid residues, such as dipeptides and tripeptides, to polypeptides (proteins) containing many amino acid residues.
  • Peptides can be linear, branched or cyclic peptides.
  • Peptide ligands may bind to molecules present on the cell surface or inside cells, or in body fluids.
  • the peptide may be an antibody or active fragment thereof.
  • antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies, Fab, F(ab') 2 , Fab', VHH and the like.
  • active fragments of antibodies include scFv (single chain fragment of variable region: single chain antibody), diabody, triabody, tetrabody and the like.
  • Lipids include tocopherols, cholesterol, fatty acids, phospholipids and their analogues; folic acid, vitamin C, vitamin B1, vitamin B2; estradiol, androstane and their analogues; steroids and their analogues; SRBI or LRP1/2 ligands; FK-506, and cyclosporin; lipids described in PCT/JP2019/012077, PCT/JP2019/010392 and PCT/JP2020/035117, but are not limited thereto.
  • Lipids also include tocopherol or analogues thereof and/or cholesterol or analogues thereof , substituted or unsubstituted C 1-30 alkyl groups, substituted or unsubstituted C 2-30 It may be a 30 alkenyl group or a substituted or unsubstituted C 1-30 alkoxy group.
  • tocopherol is a methylated derivative of tocorol, a fat-soluble vitamin (vitamin E) with a cyclic structure called chroman. Tocorol has a strong antioxidant action, and therefore, in vivo, as an antioxidant substance, it has the function of quenching free radicals generated by metabolism and protecting cells from injury.
  • tocopherol Several different forms of tocopherol are known, consisting of ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, and ⁇ -tocopherol, based on the position of the methyl group that binds to the chroman.
  • a tocopherol herein can be any tocopherol.
  • Analogues of tocopherol include various unsaturated analogues of tocopherol, such as ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol and ⁇ -tocotrienol.
  • the tocopherol is ⁇ -tocopherol.
  • cholesterol is a type of sterol, also known as steroidal alcohol, and is particularly abundant in animals. Cholesterol plays an important role in metabolic processes in vivo, and in animal cells, it is also a major constituent of the cell membrane system together with phospholipids. Analogs of cholesterol also refer to various cholesterol metabolites and analogs, which are alcohols having a sterol backbone, including, but not limited to, cholestanol, lanosterol, cerebrosterol, dehydrocholesterol, and coprostanol. etc.
  • analog refers to compounds having the same or similar basic skeleton and having similar structures and properties. Analogs include, for example, biosynthetic intermediates, metabolites, compounds with substituents, and the like. A person skilled in the art can determine whether a compound is an analog of another compound based on common general technical knowledge.
  • Cholesterol analogs refer to various cholesterol metabolites and analogs, etc., which are alcohols with a sterol backbone, including, but not limited to, cholestanol, lanosterol, cerebrosterol, dehydrocholesterol, and coprostanol. include.
  • the second nucleic acid strand may be bound with tocopherol or cholesterol or analogs thereof.
  • the second nucleic acid strand bound to cholesterol or its analogue may have a group represented by the following general formula (VII).
  • R c represents an optionally substituted alkylene group having 4 to 18 carbon atoms, preferably 5 to 16 carbon atoms (wherein the substituent is a halogen atom or a hydroxy an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms which may be substituted with a group such as a hydroxymethyl group, and non-adjacent carbon atoms of the alkylene group may be substituted with oxygen atoms).
  • Rc is, but is not limited to, -( CH2 ) 3 -O-( CH2 ) 2 -O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- , -( CH2 ) 3 -O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O- CH2 -CH( CH2OH )- or -( CH2 ) 6- may be
  • the group represented by the above general formula (VII) can be bound to the 5' end or 3' end of the second nucleic acid strand via a phosphate ester bond.
  • a ligand such as cholesterol or an analogue thereof may be bound to the 5' end, 3' end, or both ends of the second nucleic acid strand.
  • a ligand such as cholesterol or an analogue thereof may also be attached to an internal nucleotide of the second nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand contains multiple cholesterols or analogues thereof, they may be the same or different. For example, this applies to the case where the second nucleic acid strand has one cholesterol bound to the 5′ end and one other cholesterol analogue bound to the 3′ end. With respect to the binding position, the cholesterol or analogue thereof may be bound at multiple positions and/or at one position as a group on the second nucleic acid strand. Cholesterol or analogs thereof may be linked to the 5' end and the 3' end of the second nucleic acid strand, respectively.
  • the binding between the second nucleic acid strand and the ligand may be direct binding or indirect binding mediated by another substance.
  • the second nucleic acid strand When the second nucleic acid strand directly binds to the ligand, it may be bound to the second nucleic acid strand via, for example, covalent bond, ionic bond, hydrogen bond, or the like.
  • a covalent bond is preferred in view of the fact that a more stable bond can be obtained.
  • the second nucleic acid strand is not bound to a ligand.
  • "not bound to a ligand” means that a ligand such as tocopherol or cholesterol is not bound.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the invention is unliganded, ie neither the first nor the second nucleic acid strand is bound with a ligand.
  • linker When the second nucleic acid strand and the ligand are indirectly bound, they may be bound via a linking group (herein often referred to as "linker").
  • a linker can be either a cleavable linker or an uncleavable linker.
  • “Cleavable linker” means a linker that can be cleaved under physiological conditions, for example, intracellularly or in an animal body (eg, human body). Cleavable linkers are selectively cleaved by endogenous enzymes such as nucleases. Cleavable linkers include, but are not limited to, amides, esters, phosphodiester esters or both, phosphate esters, carbamates, and disulfide bonds, as well as natural DNA linkers. As an example, cholesterol or an analogue thereof may be linked via a disulfide bond.
  • Non-cleavable linker is meant a linker that is not cleaved under physiological conditions, eg, in cells or in animals (eg, in humans).
  • Non-cleavable linkers include, but are not limited to, phosphorothioate linkages, and linkers composed of modified or unmodified deoxyribonucleosides or modified or unmodified ribonucleosides linked by phosphorothioate linkages.
  • the linker is a nucleic acid such as DNA or an oligonucleotide
  • the chain length is not particularly limited, but usually it may be 2 to 20 bases, 3 to 10 bases, or 4 to 6 bases.
  • a specific example of the linker is a linker represented by formula (VIII) below.
  • L 2 is a substituted or unsubstituted C 1 -C 12 alkylene group (e.g., propylene, hexylene, dodecylene), a substituted or unsubstituted C 3 -C 8 cycloalkylene group, (e.g., cyclohexylene), -( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 3- , -( CH2 ) 2- O-(CH 2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-(CH2) 3- or CH(CH2 - OH )-CH2 - O-( CH2 ) 2- O -( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 3- , L3 represents -NH- or a bond, L4 is substituted or unsubstituted C1 - C12 alkylene groups (e.g.
  • C3-8 cycloalkylene groups e.g. cyclohexylene
  • the linker represented by formula (VIII) is such that L 2 is an unsubstituted C 3 -C 6 alkylene group (eg, propylene, hexylene), —(CH 2 ) 2 —O—( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 3- or -( CH2 ) 2- O-(CH2) 2- O-( CH2 ) 2- O- (CH 2 ) 2 -O-( CH2 ) 3- , L3 is -NH-, and L4 and L5 are a bond.
  • C 3 -C 6 alkylene group eg, propylene, hexylene
  • L3 is -NH-
  • L4 and L5 are a bond.
  • linker is a linker represented by the following general formula (IX).
  • n 0 or 1;
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand may further contain at least one functional moiety bound to the polynucleotides constituting the nucleic acid strand.
  • a “functional portion” refers to a portion that imparts a desired function to a double-stranded nucleic acid complex and/or a nucleic acid strand to which the functional portion is bound. Desired functions include, for example, labeling functions, purification functions, and the like. Examples of moieties that provide a labeling function include compounds such as fluorescent proteins and luciferase.
  • moieties that impart a purification function include compounds such as biotin, avidin, His-tag peptides, GST-tag peptides and FLAG-tag peptides.
  • a functional moiety is added to the second nucleic acid strand.
  • a molecule having an activity of delivering a double-stranded nucleic acid complex in certain embodiments to a target site is bound.
  • moieties that provide targeted delivery functions include lipids, antibodies, aptamers, ligands for specific receptors, and the like.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand (preferably the second nucleic acid strand) is associated with a functional moiety.
  • the binding between the second nucleic acid strand and the functional moiety may be direct binding or indirect binding via another substance. It is preferable that the second nucleic acid strand and the functional moiety are directly bonded by, for example, a hydrogen bond, and a covalent bond is more preferable from the viewpoint of obtaining a more stable bond.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may be linked via a linker.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand can be linked via a linker to form a single strand.
  • the double-stranded nucleic acid complex in this case can be called hinge nucleic acid, single-stranded HDO, ssHDO, or the like.
  • the functional region has the same configuration as that of the double-stranded nucleic acid complex even in that case, such a single-stranded nucleic acid is also included in the present specification as an embodiment of the double-stranded nucleic acid complex of the present invention. do.
  • the linker joins the 5' end of the first nucleic acid strand and the 3' end of the second nucleic acid strand. In another embodiment, a linker joins the 3' end of the first nucleic acid strand and the 5' end of said second nucleic acid strand. In a further embodiment, the linker joins the 5' end of the first nucleic acid strand and the 3' end of the second nucleic acid strand, and connects the 3' end of the first nucleic acid strand and the 5' end of said second nucleic acid strand. Join. In this case, the double-stranded nucleic acid complex has a circular structure.
  • the linker can be any polymer.
  • linkers that connect the second nucleic acid strand and the ligand as described above can also be used.
  • it can be composed of, for example, natural nucleotides and nucleosides such as DNA and RNA, or non-natural nucleotides and nucleosides such as peptide nucleic acids and morpholino nucleic acids.
  • it may be composed of a polyether such as polyethylene glycol.
  • the chain length of the linker is at least 1 base, such as 2 to 50 bases, 2 to 40 bases, 2 to 30 bases, 2 to 20 bases, 2 to 15 bases, 2 to 12 bases, 3 to It can have a chain length of 10 bases or 4-6 bases. A chain length of 4 bases is preferred.
  • the position of the linker can be either on the 5' side or the 3' side of the first nucleic acid strand. , the 5′ end of the first nucleic acid strand and the 3′ end of the second nucleic acid strand are linked via the linker.
  • Linkers may be either cleavable or uncleavable.
  • first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are linked via a linker, and the second nucleic acid strand has at least a bulge structure consisting of a non-complementary base sequence to the first nucleic acid strand.
  • the antisense effect of the first nucleic acid strand on the target transcript can be measured by a method known in the art. For example, after introducing a double-stranded nucleic acid complex into a cell or the like, measurement may be performed using a known technique such as Northern blotting, quantitative PCR, or Western blotting. By measuring the expression level of target genes or the level of target transcripts (e.g., the amount of mRNA or RNA such as microRNA, the amount of cDNA, the amount of protein, etc.) in specific tissues, double-stranded nucleic acid complexes can be detected at those sites. It can be determined whether target gene expression is repressed by the body. For exon skipping, for example, the effect can be determined by comparing the product produced by exon skipping with the product produced without exon skipping.
  • a known technique such as Northern blotting, quantitative PCR, or Western blotting.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention is not limited to the above exemplary embodiments.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention can be produced by a person skilled in the art by appropriately selecting a known method. Although not limited, it usually starts with designing and manufacturing each of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand that constitute the double-stranded nucleic acid complex.
  • the first nucleic acid strand is designed based on information on the nucleotide sequence of the target transcript (for example, the nucleotide sequence of the target gene), and the second nucleic acid strand is designed as its complementary strand.
  • each nucleic acid chain may be synthesized using, for example, a commercially available automatic nucleic acid synthesizer from GE Healthcare, Thermo Fisher Scientific, Beckman Coulter, and the like. After that, the obtained oligonucleotide can be purified using a reverse phase column or the like.
  • the first nucleic acid strand may be produced according to the above method.
  • the functional moiety-bound second nucleic acid strand can be produced by performing the above-described synthesis and purification using a nucleic acid species to which a functional moiety has been bound in advance.
  • a nucleic acid species with pre-bound cholesterol or an analog thereof may be used to produce a second nucleic acid strand by performing the synthesis and purification described above.
  • cholesterol or an analogue thereof may be bound to the second nucleic acid strand produced by carrying out the synthesis and purification described above by a known method.
  • the first and second nucleic acid strands are annealed to produce a double-stranded nucleic acid complex to which the desired functional moiety is bound.
  • the nucleic acids are mixed in a suitable buffer solution, denatured at about 90° C.-98° C. for several minutes (eg, 5 minutes), and then the nucleic acids are annealed at about 30° C.-70° C. for about 1-8 hours. to produce one of the double-stranded nucleic acid complexes of the present invention.
  • Methods for linking functional moieties to nucleic acids are well known in the art. Nucleic acid chains can also be obtained by ordering from various manufacturers (eg, Gene Design Co., Ltd.) specifying the nucleotide sequence, modification site and type.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention has at least one of the following effects: an effect of suppressing or enhancing the expression level of a transcription product or translation product of a target gene, a target Those intended for the action of inhibiting the function of gene transcription or translation products, the action of regulating RNA splicing, and the action of inhibiting the binding of target genes to proteins, such as exon skipping good.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention may have at least one of the following actions: exon skipping, exon inclusion, steric blocking, and RNA expression enhancement.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention exerts the above action in specific tissues such as brain, spinal cord, kidney, liver, lung, intestinal tract, spleen, adrenal gland, eye, retina, skin, peripheral nerves such as brain.
  • the brain may be any of the cerebrum, diencephalon, brainstem, and cerebellum, and may be, for example, any one or more of the cerebrum (cerebral cortex, etc.), brainstem, cerebellum, hippocampus, and striatum.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention may be one for exerting the above-mentioned action on muscle tissue including cardiac muscle and skeletal muscle.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention is for disease or prevention.
  • the disease may be skeletal muscle dysfunction or cardiac dysfunction.
  • diseases include muscular dystrophy (Duchenne muscular dystrophy, myotonic dystrophy type 1 (DM1), Fukuyama muscular dystrophy, facioscapulohumeral muscular dystrophy, limb girdle muscular dystrophy, etc.), congenital myopathy, primary age-related Tauopathy (PART), Alzheimer's disease (AD), progressive supranuclear palsy (PSP), corticobasal degeneration/corticobasal ganglia syndrome (CBD), Pick's disease, frontotemporal dementia, neuronal inclusions disease, spinal muscular atrophy (SMA), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Parkinson's disease, Huntington's disease, hereditary spinocerebellar ataxia (SCA), multiple system atrophy, hereditary spastic paraplegia, multiple Severe sclerosis, cerebral infarction,
  • toxicity such as central nervous system toxicity of the double-stranded nucleic acid complex can be reduced or eliminated without impairing the efficacy of the double-stranded nucleic acid complex. That is, compared with conventional double-stranded nucleic acid complexes, the central nervous system toxicity is reduced without impairing the antisense effect on the target gene.
  • a second aspect of the present invention is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the double-stranded nucleic acid complex of the first aspect as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has reduced central nervous system toxicity and can be administered intrathecally or intracerebroventricularly without side effects.
  • Each component that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention is specifically described below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes at least the double-stranded nucleic acid complex according to the first aspect as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain two or more types of double-stranded nucleic acid complexes.
  • the amount (content) of the double-stranded nucleic acid complex contained in the pharmaceutical composition depends on the type of the double-stranded nucleic acid complex, the delivery site, the dosage form of the pharmaceutical composition, the dosage of the pharmaceutical composition, and the carrier described later. depends on the type of Therefore, it is sufficient to determine them as appropriate in consideration of each condition.
  • a single dose of the pharmaceutical composition is adjusted to include an effective amount of the double-stranded nucleic acid complex.
  • Effective amount means an amount necessary for the double-stranded nucleic acid complex to exhibit its function as an active ingredient, and an amount that imparts little or no harmful side effects to the living body to which it is applied. Say.
  • Subject information is various individual information of a living body to which the pharmaceutical composition is applied. For example, if the subject is a human, the information includes age, weight, sex, dietary habits, health condition, disease progression and severity, drug sensitivity, presence or absence of concomitant drugs, and the like.
  • Carrier A pharmaceutical composition of the present invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to additives commonly used in the field of formulation technology. For example, solvents, vegetable oils, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, pH adjusters, stabilizers, flavorants, fragrances, excipients, vehicles, preservatives, binders, diluents, Tonicity agents, soothing agents, bulking agents, disintegrating agents, buffering agents, coating agents, lubricants, coloring agents, sweetening agents, thickening agents, flavoring agents, solubilizing agents, and other additives.
  • the solvent may be, for example, water or other pharmaceutically acceptable aqueous solution, or a pharmaceutically acceptable organic solvent.
  • Aqueous solutions include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, phosphate buffers, and sodium acetate buffers.
  • auxiliary agents include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low-concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • the carrier is used to avoid or suppress in vivo degradation of the double-stranded nucleic acid complex, which is an active ingredient, by enzymes, etc., facilitate formulation and administration methods, and maintain the dosage form and efficacy. and can be used as needed.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is such that the active ingredient, the double-stranded nucleic acid complex according to the first aspect, is delivered to the target site without being inactivated by degradation or the like, and is effective in vivo.
  • the form can exhibit the pharmacological effect of the component (antisense effect on target gene expression).
  • Specific dosage forms differ depending on the administration method and/or prescription conditions. Since administration methods can be broadly classified into parenteral administration and oral administration, dosage forms suitable for each administration method may be used.
  • the preferred dosage form is a liquid formulation that can be administered directly to the target site or systemically administered via the circulatory system.
  • liquid formulations include injections. Injections are appropriately combined with the aforementioned excipients, elixirs, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, pH adjusters, etc., and mixed in a unit dosage form generally accepted for pharmaceutical practice. It can be formulated by Other formulations include ointments, plasters, cataplasms, transdermal formulations, lotions, inhalants, aerosols, eye drops, and suppositories.
  • preferred dosage forms may be solids or liquids, such as tablets, capsules, drops, lozenges, pills, granules, powders, powders, and liquids for internal use. , emulsions, syrups, pellets, sublingual agents, peptizers, buccal preparations, pastes, suspensions, elixirs, coatings, ointments, plasters, cataplasms, oral Skins, lotions, inhalants, aerosols, eye drops, injections, and suppositories.
  • a solid formulation it is optionally made into a dosage form with a coating known in the art, such as a sugar-coated tablet, a gelatin-coated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, and a multilayer tablet. be able to.
  • a coating known in the art, such as a sugar-coated tablet, a gelatin-coated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, and a multilayer tablet.
  • each dosage form described above are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art for each dosage form.
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention it may be formulated according to a conventional method in the technical field.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention has excellent solubility in water, Japanese Pharmacopoeia Dissolution Test 2nd Fluid, or Japanese Pharmacopoeia Disintegration Test 2nd Fluid, drug half-life, brain penetration, metabolic stability, CYP inhibition) and low toxicity (e.g., acute toxicity, chronic toxicity, genotoxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, drug interaction, carcinogenicity, phototoxicity) It is superior as a drug in terms of, etc.) and has excellent properties as a drug, such as less side effects (for example, suppression of sedation and avoidance of lamellar necrosis).
  • parenteral administration there is no particular limitation herein on the preferred dosage form of the pharmaceutical composition.
  • oral administration or parenteral administration may be used.
  • specific examples of parenteral administration include intramuscular administration, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration (including continuous subcutaneous implanted administration), intradermal administration, tracheal/bronchial administration, rectal administration, and by blood transfusion.
  • Intrathecal administration may be, for example, an occipital fovea puncture or a lumbar puncture.
  • the dosage or ingestion is, for example, 0.00001 mg/kg/day to 10000 mg/kg/day, or 0.001 mg/kg/day of the included double-stranded nucleic acid complex. It should be between 100mg/kg/day.
  • the pharmaceutical composition may be single-dose or multi-dose. In the case of multiple administrations, it can be administered daily or at appropriate time intervals (eg, at intervals of 1 day, 2 days, 3 days, 1 week, 2 weeks, 1 month), for example, 2 to 20 doses.
  • a single dose of the double-stranded nucleic acid complex is, for example, 0.001 mg/kg or more, 0.005 mg/kg or more, 0.01 mg/kg or more, 0.25 mg/kg or more, 0.5 mg/kg or more, 1 mg/kg or more, kg or more, 2.5 mg/kg or more, 0.5 mg/kg or more, 1.0 mg/kg or more, 2.0 mg/kg or more, 3.0 mg/kg or more, 4.0 mg/kg or more, 5 mg/kg or more, 10 mg/kg or more, 20 mg /kg or more, 30mg/kg or more, 40mg/kg or more, 50mg/kg or more, 75mg/kg or more, 100mg/kg or more, 150mg/kg or more, 200mg/kg or more, 300mg/kg or more, 400mg/kg or more, or 500 mg/kg or more, for example, any amount within the range of 0.001 mg/kg to 500 mg/kg (e.g., 0.001 mg/kg,
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention may be administered at a dose of 0.01 to 10 mg/kg (eg, about 6.25 mg/kg) twice a week for 4 times.
  • the double-stranded nucleic acid complex is administered at a dose of 0.05 to 30 mg/kg (eg, about 25 mg/kg) at a frequency of 1 to 2 times a week, 2 to 4 times, for example, twice a week. good too.
  • Employment of such a dosing regimen can reduce toxicity (eg, avoid platelet depletion) and reduce burden on the subject compared to single administration of higher doses.
  • the pharmaceutical composition has an additive inhibitory effect in cells even after repeated administration.
  • the pharmaceutical composition of this aspect is administered intracerebroventricularly or intrathecally.
  • 0.01 mg or more, 0.1 mg or more, or 1 mg or more, for example, 2 mg or more, 3 mg or more, 4 mg or more, or 5 mg or more is administered to monkeys or humans.
  • 1 mg to 20 mg may be administered, and in the case of mice, 1 ⁇ g or more may be administered.
  • the pharmaceutical composition of this aspect is administered intravenously or subcutaneously.
  • the diseases to which the pharmaceutical composition is applied are not limited.
  • the antisense effect of the double-stranded nucleic acid complex of the present invention can suppress or enhance the expression level of the transcription product or translation product, inhibit the function of the transcription product or translation product, or steric blocking or splicing switch. , RNA editing, exon skipping or exon inclusion-inducible genes may be of interest. Specific examples of diseases conform to the description in “1-5. Use of double-stranded nucleic acid complex”.
  • the pharmaceutical composition of this aspect can be used to treat central nervous system disease in a subject.
  • the central nervous system disease to which the pharmaceutical composition of this aspect is applied is not particularly limited, but examples thereof include brain tumor, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, Huntington's disease, and the like. be done.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has reduced central nervous system toxicity. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can achieve preventive or therapeutic effects without side effects by intracerebroventricular or intrathecal administration.
  • treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease requires administration of high doses of nucleic acid agents, and there is a risk of side effects.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can significantly reduce such side effects. becomes possible.
  • a method for treating and/or preventing a disease such as a central nervous system disease comprises administering the double-stranded nucleic acid complex or pharmaceutical composition described above to a subject.
  • double-stranded nucleic acid complex of the present invention in the manufacture of a medicament for treating and/or preventing diseases.
  • Example 1 MOE modification of HDO targeting Mapt gene>
  • a heteroduplex oligonucleotide comprising a first nucleic acid strand consisting of an antisense nucleic acid (hereinafter referred to as "ASO”) targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand (hereinafter referred to as "HDO”) is administered intracerebroventricularly, and the toxicity-reducing effect based on MOE modification is verified by in vivo experiments.
  • ASO antisense nucleic acid
  • HDO second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand
  • ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets mouse microtubule-associated protein tau (Mapt) mRNA, and has a base sequence complementary to a portion of Mapt mRNA. , 3 LNA nucleosides at the 5' end, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (all RNA), HDO (all DNA), HDO (6MOE wing), and HDO (all MOE) used in this example all contain the above ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand It has a sequence complementary to one nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all RNA)) of HDO(all RNA) has a structure in which RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO(6MOE wing) (c(6MOE wing)) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and three 2'-O-MOE- It has a structure in which RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(all MOE)) of HDO(all MOE) has a structure in which 2'-O-MOE-RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the 2'-O-MOE-RNA nucleoside used in the examples of the present specification has the following formula (III): is a non-natural nucleoside represented by
  • the first and second nucleic acid strands were mixed in equimolar amounts and the solution was heated to 95°C for 5 minutes and then to 37°C. The mixture was cooled and held for 1 hour to anneal the nucleic acid strands and prepare a double-stranded nucleic acid complex. Annealed nucleic acids were stored at 4°C or on ice. All oligonucleotides were custom synthesized by Gene Design (Osaka, Japan).
  • Each category contains two behavioral endpoints.
  • Each behavioral evaluation item is evaluated on a 5-point scale of 0 to 5 (Fig. 3, score 0 to 5), with 0 for normal and higher scores for higher toxicity.
  • score 0 to 5 For each category, the score for the higher of the two behavioral measures is taken as the score for that category.
  • the acute phase tolerability score (0-20 points) is the sum of the five category scores.
  • Quantitative RT-PCR was performed using the resulting cDNA as a template to measure the expression levels of Mapt mRNA and Actb mRNA (internal standard genes). Quantitative RT-PCR was performed by TaqMan (Roche Applied Science). Primers used in quantitative RT-PCR were products designed and manufactured by Thermo Fisher Scientific (formerly Life Technologies Corp). Amplification conditions (temperature and time) were as follows: 95° C. for 15 seconds, 60° C. for 30 seconds, and 72° C. for 1 second (1 cycle) repeated for 40 cycles.
  • the ratio of the expression level of Mapt mRNA to the expression level of Actb mRNA was calculated, and the value normalized to the value of the PBS administration group was taken as the relative Mapt mRNA level.
  • FIG. 5 shows the results of evaluation of central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered. At 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, and 4 hours after administration of the nucleic acid agent, ASO, Compared to the HDO(all RNA) and HDO(all DNA) administration groups, the acute tolerability score was remarkably decreased. These results indicated that HDO containing 2'-O-MOE-RNA nucleosides significantly reduced central nervous system toxicity.
  • Figure 6 shows the results of evaluating motor function in mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • total movement distance Fig. 6A
  • maximum movement velocity Figure 6B
  • Fig. 7 shows Mapt mRNA expression levels in the hippocampus 7 days after intracerebroventricular administration of various nucleic acid agents.
  • the gene suppression effect was lower than in the ASO, HDO (all RNA), and HDO (all DNA) administration groups.
  • the HDO (6MOE wing) administration group showed gene suppression effects equivalent to those of the ASO, HDO (all RNA), and HDO (all DNA) administration groups.
  • Example 2 MOE modification of HDO targeting BACE1 gene> (the purpose) MOE modification for central neurotoxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the BACE1 gene and a second nucleic acid strand having a nucleotide sequence complementary to the first nucleic acid strand To verify the toxicity reduction effect based on the in vivo experiment.
  • Table 2 and FIG. 8 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands constituting the ASO and HDO used in this example.
  • ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets mouse ⁇ -secretase 1 (BACE1) mRNA, and has a base complementary to a part of BACE1 mRNA. It has a structure in which 2 LNA nucleosides at the 5' end, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 8 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (all RNA), HDO (all DNA), and HDO (5MOE wing) used in this example all contain the above ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand is complementary to the first nucleic acid strand. array.
  • the second nucleic acid strand (c(all RNA)) of HDO(all RNA) has a structure in which RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(5MOE wing)) of HDO(5MOE wing) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and two 2'-O-MOE- It has a structure in which RNA nucleosides and eight DNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • HDO all RNA
  • HDO all DNA
  • HDO all DNA
  • HDO all DNA
  • HDO 5MOE wing
  • FIG. 9 shows the results of evaluation of central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered. At 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, and 4 hours after administration of the nucleic acid agent, in the HDO (5MOE wing) administration group, ASO, HDO (all RNA), and The acute tolerability score was significantly decreased compared to the HDO (all DNA) administration group. These results indicated that HDO containing 2'-O-MOE-RNA nucleosides significantly reduced central nervous system toxicity.
  • Fig. 10 shows the results of evaluating motor function in mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour after administration.
  • the HDO(5MOE wing) administration group significantly improved the total moving distance (Fig. 10A) and the maximum moving speed (Fig. 10B) compared to the ASO, HDO(all RNA), and HDO(all DNA) administration groups.
  • Fig. 10A the total moving distance
  • Fig. 10B maximum moving speed
  • HDO containing 2'-O-MOE-RNA nucleosides had a very small inhibitory effect on motor function and a very low toxicity.
  • Example 3 MOE modification of HDO targeting Malat1 gene> (the purpose) MOE modification for central neurotoxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Malat1 gene and a second nucleic acid strand having a nucleotide sequence complementary to the first nucleic acid strand To verify the toxicity reduction effect based on the in vivo experiment.
  • Table 3 and FIG. 11 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands that constitute the ASO and HDO used in this example.
  • the ASO used in this example is a 2'-O-MOE-RNA/DNA gapmer-type anti-RNA that targets metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (Malat1) non-coding RNA in mice. It is a sense nucleic acid, has a base sequence complementary to a part of Malat1 ncRNA, has five 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and five 2'-O-MOE at the 3' end - RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides between them linked by phosphorothioate bonds.
  • Malat1 metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1
  • HDO (all RNA), HDO (all DNA), and HDO (10MOE wing) used in this example all contain the above ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand is complementary to the first nucleic acid strand. array.
  • the second nucleic acid strand (c(all RNA)) of HDO(all RNA) has a structure in which RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(10MOE wing)) of HDO(10MOE wing) consists of five 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and five 2'-O-MOE- It has a structure in which RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • HDO all RNA
  • HDO all DNA
  • HDO (10MOE wing) listed in Table 3 the same methods as in Example 1 were used to prepare nucleic acids, perform in vivo experiments, and evaluate central nervous system toxicity. Motor function evaluation was performed. However, in this example, the dose of the nucleic acid agent per mouse was 13.86 nmol/mouse.
  • FIG. 12 shows the results of evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • ASO and HDO all DNA
  • the acute phase tolerability score decreased significantly compared to the group.
  • the HDO (5MOE wing) administration group had a higher acute phase tolerability score than the HDO (all RNA) administration group. was low.
  • Fig. 13 shows the results of evaluating the motor function of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • the HDO (10 MOE wing) administration group significantly improved the total moving distance (Fig. 13A) and the maximum moving speed (Fig. 13B) compared to the ASO, HDO (all RNA), and HDO (all DNA) administration groups. .
  • Example 4 Comparison of MOE modification, 2'OMe modification, and 2'F modification> (the purpose) MOE modification for central neurotoxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand , 2'OMe modification, and 2'F modification are compared by in vivo experiments.
  • Table 4 and FIG. 14 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands that constitute the ASO and HDO used in this example.
  • the ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(RNA 6MOE wing)) of HDO (RNA 6MOE wing) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and three 2'-O- It has a structure in which MOE-RNA nucleosides and 10 RNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO(6MOE wing) (c(6MOE wing)) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and three 2'-O-MOE- It has a structure in which RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(6OMe wing)) of HDO(6OMe wing) consists of three 2'-O-Me-RNA nucleosides at the 5' end and three 2'-O-Me- It has a structure in which RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(6F wing)) of HDO(6F wing) consists of three 2'F-RNA nucleosides at the 5' end, three 2'F-RNA nucleosides at the 3' end, and their It has a structure in which 10 DNA nucleosides in between are linked by phosphodiester bonds.
  • RNA 6MOE wing RNA 6MOE wing
  • HDO (6MOE wing) HDO (6OMe wing)
  • HDO (6F wing HDO (6F wing) listed in Table 4, preparation of nucleic acids, in vivo experiments, and Central nervous system toxicity evaluation and motor function evaluation were performed. However, in this example, the dose of the nucleic acid agent per mouse was 19 nmol/mouse.
  • FIG. 15 shows the results of evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • HDO RNA 6MOE wing
  • HDO (6MOE wing) RNA 6MOE wing
  • 6MOE wing HDO Acute phase tolerability scores were significantly reduced compared to the (all DNA), HDO (6OMe wing), and HDO (6F wing) administration groups.
  • the HDO (6MOE wing) administration group showed a lower acute tolerability score than the HDO (RNA 6MOE wing) administration group. From these results, HDOs containing 2'-O-MOE-RNA nucleosides can achieve lower CNS toxicity than HDOs containing 2'-O-Me-RNA and 2'F-RNA nucleosides. was shown.
  • Figures 16 and 17 show the results of evaluating motor function in mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour and 3 hours after administration.
  • the total distance traveled Fig. 16A, Fig. 17A
  • maximum movement speed Fig. 16B, Fig. 17B
  • HDOs containing 2'-O-MOE-RNA nucleosides are more effective in suppressing motor function than HDOs containing 2'-O-Me-RNA and 2'F-RNA nucleosides. It was shown to be extremely small and of extremely low toxicity.
  • Example 5 Substitution of guanosine nucleoside> (the purpose) Regarding central nervous toxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, the second To investigate the toxicity-reducing effect of guanosine nucleoside substitution in nucleic acid chains by in vivo experiments.
  • Table 5 and FIG. 18 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands that constitute the ASO and HDO used in this example.
  • ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (6MOE wing), HDO (G MOE ), HDO (G RNA ), and HDO (inosine) used in this example all contain the above ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand is the first It has a sequence complementary to a nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(6MOE wing)) of HDO(6MOE wing) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and three 2' It has a structure in which -O-MOE-RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphodiester bonds.
  • a DNA nucleoside containing a guanine base is replaced with a 2′-O-MOE-RNA nucleoside in c(6MOE wing).
  • a DNA nucleoside containing a guanine base is replaced with an RNA nucleoside in c(6MOE wing).
  • guanine bases contained in DNA nucleosides are substituted with inosine bases in c(6MOE wing).
  • HDO 6MOE wing
  • HDO G MOE
  • HDO G RNA
  • HDO inosine
  • FIG. 19 shows the results of evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered. At 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, and 4 hours after administration of the nucleic acid agent, the HDO (G MOE ) and HDO (G RNA ) administration groups 6MOE wing) showed an acute phase tolerability score equivalent to or lower than the administration group.
  • Example 6 Various MOE modifications in HDO targeting the Mapt gene> (the purpose) Various studies have been conducted on the central nervous system toxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a nucleotide sequence complementary to the first nucleic acid strand. We will verify the toxicity-reducing effect based on MOE modification by in vivo experiments.
  • Table 6 and FIG. 20 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands constituting the HDO used in this example.
  • the ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (all DNA), HDO (6MOE-5'&3'), HDO (6MOE-5'), HDO (6MOE-3'), HDO (10MOE-5'), and HDO (10MOE) used in this example -3') all contain the above ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO(6MOE-5'&3') (c(6MOE-5'&3')) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end, three 2'-O-MOE-RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides between them linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO(6MOE-5') (c(6MOE-5')) consists of 6 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and 10 DNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(6MOE-3')) of HDO(6MOE-3') consists of 10 DNA nucleosides at the 5' end and 6 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(10MOE-5')) of HDO(10MOE-5') consists of 10 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and 6 DNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(10MOE-3')) of HDO(10MOE-3') consists of 6 DNA nucleosides at the 5' end and 10 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • HDO(all DNA), HDO(6MOE-5'&3'), HDO(6MOE-5'), HDO(6MOE-3'), HDO(10MOE-5'), and HDO(10MOE) listed in Table 6 -3′) was subjected to nucleic acid preparation, in vivo experiments, central nervous system toxicity evaluation, motor function evaluation, and gene suppression effect evaluation in the same manner as in Example 1.
  • the dose of the nucleic acid agent per mouse was 18.86 nmol/mouse.
  • FIG. 21 shows the results of evaluation of central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • HDO(6MOE-5'&3'), HDO(6MOE-5'), HDO(6MOE-3'), HDO(10MOE-5'), and HDO(10MOE-3') significantly reduced acute tolerability scores compared to HDO(all DNA) bottom.
  • the acute tolerability score in the HDO (10MOE-5') and HDO (10MOE-3') administration groups was the lowest in the HDO administration group.
  • Figures 22 and 23 show the results of evaluating motor function in mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents 1 hour and 3 hours after administration.
  • HDO(all DNA) significantly improved the total moving distance (Figs. 22A and 23A) and the maximum moving speed (Figs. 22B and 23B) compared to the administration group.
  • the improvement effect in the HDO (10MOE-5') and HDO (10MOE-3') administration groups was greatest in the HDO administration group.
  • Three hours after administration the improvement effect in the HDO (6MOE-5'&3') administration group was the greatest in the HDO administration group.
  • Fig. 24 shows Mapt mRNA expression levels in the hippocampus 7 days after intracerebroventricular administration of various nucleic acid agents.
  • Administration of HDO(all DNA), HDO(6MOE-5'&3'), HDO(6MOE-5'), HDO(6MOE-3'), HDO(10MOE-5'), and HDO(10MOE-3') The group showed a significant reduction in Mapt mRNA expression levels compared to negative controls that received PBS alone.
  • Example 7 Various MOE modifications in HDO targeting the BACE1 gene> (the purpose) Various studies have been conducted on the central nervous system toxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the BACE1 gene and a second nucleic acid strand having a nucleotide sequence complementary to the first nucleic acid strand. We will verify the toxicity-reducing effect based on MOE modification by in vivo experiments.
  • Table 7 and FIG. 25 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands that constitute the HDO used in this example.
  • ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets BACE1 mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of BACE1 mRNA, and has two LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 8 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (all DNA), HDO (5MOE-5'), HDO (5MOE-3'), HDO (8MOE-5'), HDO (8MOE-3'), HDO (10MOE-5') used in this example ), and HDO(10MOE-3′) both contain the above ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(5MOE-5')) of HDO(5MOE-5') consists of five 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and eight DNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(5MOE-3')) of HDO(5MOE-3') consists of 8 DNA nucleosides at the 5' end and 5 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(8MOE-5')) of HDO(8MOE-5') consists of 8 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and 5 DNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(8MOE-3')) of HDO(8MOE-3') consists of 5 DNA nucleosides at the 5' end and 8 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(10MOE-5')) of HDO(10MOE-5') consists of 10 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and 3 DNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(10MOE-3')) of HDO(10MOE-3') consists of 3 DNA nucleosides at the 5' end and 10 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end. have a structure in which are linked by phosphodiester bonds.
  • FIG. 26 shows the results of evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • HDO(5MOE-5'), HDO(5MOE-3'), HDO( 8MOE-5'), HDO(8MOE-3'), HDO(10MOE-5'), and HDO(10MOE-3') showed better acute phase tolerance than HDO(all DNA). Tolerability score decreased significantly.
  • Fig. 27 shows the results of evaluating the motor function of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • HDO(5MOE-5'), HDO(5MOE-3'), HDO(8MOE-5'), HDO(8MOE-3'), HDO(10MOE-5'), and HDO(10MOE-3') Compared with the HDO(all DNA) administration group, the total distance traveled (Fig. 27A) and the maximum movement speed (Fig. 27B) were significantly improved in the administration group.
  • Example 8 Various MOE modifications in HDO targeting the Mapt gene> (the purpose) Various studies have been conducted on the central nervous system toxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a nucleotide sequence complementary to the first nucleic acid strand. We will verify the toxicity-reducing effect based on MOE modification by in vivo experiments.
  • Table 8 and FIG. 28 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands that constitute the HDO used in this example.
  • the ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO(6MOE wing) (c(6MOE wing)) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and three 2'-O-MOE- It has a structure in which RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(9MOE wing)) of HDO(9MOE wing) consists of five 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and four 2'-O-MOE- It has a structure in which RNA nucleosides and seven DNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(11MOE wing)) of HDO(11MOE wing) consists of six 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and five 2'-O-MOE- It has a structure in which RNA nucleosides and five DNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(13MOE wing)) of HDO(13MOE wing) consists of seven 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and six 2'-O-MOE- It has a structure in which an RNA nucleoside and three DNA nucleosides therebetween are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(15MOE wing)) of HDO(15MOE wing) consists of eight 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and seven 2'-O-MOE- It has a structure in which RNA nucleosides and one DNA nucleoside between them are linked by phosphodiester bonds.
  • HDO all DNA
  • HDO (6 MOE wing) HDO (9 MOE wing)
  • HDO 11 MOE wing
  • HDO 13 MOE wing
  • HDO 15 MOE wing
  • the same Preparation of nucleic acids, in vivo experiments, evaluation of central nervous system toxicity and motor function, and evaluation of gene suppression effects were carried out according to the method.
  • the dose of the nucleic acid agent per mouse was 18.86 nmol/mouse.
  • FIG. 29 shows the results of evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • HDO (6MOE wing), HDO (9MOE wing), HDO (11MOE wing), HDO (11MOE wing), In the HDO (13MOE wing) and HDO (15MOE wing) administration groups, the acute phase tolerability score significantly decreased compared to the HDO (all DNA) administration group.
  • Fig. 30 shows the results of evaluating the motor function of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • HDO (6 MOE wing), HDO (9 MOE wing), HDO (11 MOE wing), HDO (13 MOE wing), and HDO (15 MOE wing) treatment groups compared with HDO (all DNA) treatment group Distance (Fig. 30A) and maximum movement speed (Fig. 30B) improved significantly.
  • Example 9 Comparison of base species in MOE modification> (the purpose) Regarding central nervous toxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, the second In vivo experiments are used to compare the toxicity-reducing effects of different types of nucleosides (nucleosides containing an adenine base, a guanine base, a cytosine base, or a thymine base) into which MOE modifications are introduced in the nucleic acid chain.
  • nucleosides nucleosides containing an adenine base, a guanine base, a cytosine base, or a thymine base
  • Table 9 and FIG. 31 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands that constitute the ASO and HDO used in this example.
  • ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (all DNA), HDO (A MOE ), HDO (G MOE ), HDO (C MOE ), and HDO (T MOE ) used in this example all contain the ASO as the first nucleic acid strand
  • the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (a(A MOE )) of HDO(A MOE ) has a structure in which all DNA nucleosides containing adenine bases are replaced with 2′-O-MOE-RNA nucleosides.
  • HDO( CMOE ) have guanine bases
  • HDO( CMOE ) have cytosine bases
  • HDO( TMOE ) have structures in which DNA nucleosides containing thymine bases are all substituted with 2′-O-MOE-RNA nucleosides.
  • FIG. 32 shows the results of evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • HDO A MOE
  • HDO C MOE
  • HDO T MOE
  • the acute phase tolerability score decreased significantly compared to the HDO (all DNA ) administration group
  • Tolerability score decreased slightly.
  • FIG. 33 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour and 3 hours after administration.
  • the total distance traveled ( Figure 33A) and the maximum travel speed ( Figure 33B) was markedly improved, and the HDO(G MOE )-administered group had slightly improved total moving distance (FIG. 33A) and maximum moving speed (FIG. 33B) compared to the HDO(all DNA)-administered group.
  • Example 10 Comparison of adjacent nucleic acids in MOE modification> (the purpose) Regarding central nervous toxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, the second Toxicity-reducing effects by introducing MOE modifications to nucleosides containing cytosine bases and nucleosides adjacent to the 5' and/or 3' sides thereof in nucleic acid chains are compared by in vivo experiments.
  • Table 10 and FIG. 34 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands constituting the ASO and HDO used in this example.
  • ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO(all DNA), HDO(C MOE ), HDO(2C MOE ⁇ 5), HDO(2C MOE ⁇ 3) and HDO(3C MOE ) used in this example are all and the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c( CMOE )) of HDO( CMOE ) has a structure in which all DNA nucleosides containing cytosine bases are replaced with 2'-O-MOE-RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(2C MOE -5)) of HDO(2C MOE -5) converts a DNA nucleoside containing a cytosine base and its 5'-adjacent DNA nucleoside into 2'-O-MOE-RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(2C MOE -3)) of HDO(2C MOE -3) replaces all DNA nucleosides containing cytosine bases and its 3' adjacent DNA nucleosides with 2'-O-MOE-RNA nucleosides. It has a structure that The second nucleic acid strand (c(3C MOE )) of HDO(3C MOE ) converts a DNA nucleoside containing a cytosine base and its 5′ and 3′ flanking DNA nucleosides into 2′-O-MOE-RNA nucleosides. It has a permuted structure.
  • HDO (all DNA), HDO (C MOE ), HDO (2C MOE -5), HDO (2C MOE -3) and HDO (3C MOE ) listed in Table 10 were subjected to nucleic acid preparation in the same manner as in Example 1. preparation, in vivo experiments, central nervous system toxicity evaluation and motor function evaluation. However, in this example, the dose of the nucleic acid agent per mouse was 19 nmol/mouse.
  • FIG. 35 shows the results of evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • FIG. 36 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour and 3 hours after administration.
  • the total distance traveled (Fig. 36A) and maximum locomotion velocity (Fig. 36B) were significantly improved.
  • Fig. 36A the total distance traveled
  • Fig. 36B maximum locomotion velocity
  • HDO stability in cerebrospinal fluid (the purpose) HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand was incubated in human or rat cerebrospinal fluid, and its stability was evaluated. think about.
  • the ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • Both HDO (ASO/cRNA) and HDO (ASO/cDNA) used in this example contain the above ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (cRNA) of HDO has three phosphorothioate bonds from the 5' end, three phosphorothioate bonds from the 3' end, and three phosphorothioate bonds between them. It has a structure linked by nine phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (cDNA) of HDO (ASO/cDNA) consists of three phosphorothioate bonds from the 5' end, three phosphorothioate bonds from the 3' end, and nine phosphodiester bonds between them. It has a bond-linked structure.
  • a 16% acrylamide gel (1 x TBE) was prepared and produced. 6 ⁇ L of the above sample was loaded onto the gel and run at 100 V for 80 minutes. As a control, ASO alone and cRNA alone were electrophoresed simultaneously. After that, a solution was prepared by diluting GelRed ( ⁇ 10000) aqueous solution (Biotium) with 1 ⁇ TBE to a concentration of 1/10000. The gel was permeated with the solution for 10 minutes. Gels were then imaged with a ChemiDoc Touch imaging system (BioRad).
  • FIG. 37C shows electrophoresis results after incubating HDO (ASO/cRNA) in human cerebrospinal fluid (Human CSF) for 10 minutes and 6 hours.
  • FIG. 37D shows the results of quantifying the band intensity of the HDO double-stranded band in the electrophoresis results of FIG. 37C.
  • HDO(ASO/cRNA) was mostly degraded after 10 minutes of incubation in human cerebrospinal fluid and completely degraded after 6 hours.
  • FIG. 38C shows the results of electrophoresis after incubating HDO (ASO/cRNA) or HDO (ASO/cDNA) in human cerebrospinal fluid or rat cerebrospinal fluid for 6 hours.
  • HDO ASO/cRNA
  • HDO ASO/cDNA
  • Example 12 HDO stability in cerebrospinal fluid> (the purpose) An HDO comprising a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand was incubated in mouse, rat, monkey, or human cerebrospinal fluid. , to consider its stability.
  • the ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (all RNA), HDO (all DNA), HDO (cRNA 6MOE wing), and HDO (cDNA 6MOE wing) used in this example all contain the above ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (cRNA) of HDO (all RNA) has a structure in which RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (cDNA) of HDO (all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO(cRNA 6MOE wing) (cRNA(6MOE wing)) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and three 2'-O-MOE at the 3' end. - RNA nucleosides and 10 RNA nucleosides between them are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO (cDNA 6MOE wing) (cDNA (6MOE wing)) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end and three 2'-O-MOE at the 3' end. - RNA nucleosides and 10 DNA nucleosides between them linked by phosphodiester bonds.
  • HDO all RNA
  • HDO all DNA
  • HDO cRNA 6MOE wing
  • HDO cDNA 6MOE wing
  • FIG. 39C shows electrophoresis results after incubation of HDO(all RNA) and HDO(all DNA) in mouse, rat, monkey and human cerebrospinal fluid for 6 hours.
  • HDO (all RNA) was stable and not degraded in mouse and rat cerebrospinal fluids, while it was degraded and unstable in monkey and human cerebrospinal fluids.
  • HDO(all DNA) was stable without degradation in the cerebrospinal fluids of mice, rats, monkeys and humans.
  • FIG. 40C shows the results of electrophoresis after incubating HDO (cRNA 6MOE wing) and HDO (cDNA 6MOE wing) in mouse, rat, monkey, and human cerebrospinal fluid for 6 hours.
  • HDO cRNA 6MOE wing
  • HDO cDNA 6MOE wing
  • FIG. 40C shows the results of electrophoresis after incubating HDO (cRNA 6MOE wing) and HDO (cDNA 6MOE wing) in mouse, rat, monkey, and human cerebrospinal fluid for 6 hours.
  • HDO cRNA 6MOE wing
  • HDO cDNA 6MOE wing
  • HDO stability in cerebrospinal fluid (the purpose) In an HDO comprising a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, part of the DNA nucleosides in the second nucleic acid strand are replaced with RNA nucleosides.
  • ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO(all DNA), HDO(A RNA ), HDO(G RNA ), HDO(C RNA ), and HDO(U RNA ) used in this example all contain the above ASO as the first nucleic acid strand
  • the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(A RNA )) of HDO(A RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing adenine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(G RNA )) of HDO(G RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing guanine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(C RNA )) of HDO(C RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing cytosine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(U RNA )) of HDO(U RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing thymine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides containing uracil bases.
  • HDO all DNA
  • HDO A RNA
  • HDO G RNA
  • HDO C RNA
  • HDO U RNA
  • Figure 42 shows the results of electrophoresis after incubating HDO (all DNA), HDO (A RNA ), HDO (G RNA ), HDO (C RNA ), and HDO (U RNA ) in human cerebrospinal fluid for 6 hours. show. HDO(all DNA), HDO(A RNA ), and HDO(G RNA ) were stable and not degraded in human cerebrospinal fluid. On the other hand, HDO(C RNA ) and HDO(U RNA ) were degraded and unstable in human cerebrospinal fluid.
  • Example 14 HDO stability in cerebrospinal fluid> (the purpose) In an HDO comprising a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, part of the DNA nucleosides in the second nucleic acid strand are replaced with RNA nucleosides. The stability in cerebrospinal fluid when replaced with
  • ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (all DNA), HDO (GA RNA ), HDO (CU RNA ), HDO (C RNA ), and HDO (U RNA ) used in this example all contain the ASO as the first nucleic acid strand
  • the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(GA RNA )) of HDO(GA RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing guanine bases and DNA nucleosides containing adenine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides.
  • all DNA nucleosides containing cytosine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides, and all DNA nucleosides containing thymine bases are replaced with uracil bases. It has a structure in which RNA nucleosides containing are substituted.
  • the second nucleic acid strand (c(C RNA )) of HDO(C RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing cytosine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(U RNA )) of HDO(U RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing thymine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides containing uracil bases.
  • HDO all DNA
  • HDO GA RNA
  • CU RNA HDO
  • C RNA HDO
  • U RNA U RNA
  • Figure 44 shows the electrical activity of HDO(all DNA), HDO(GA RNA ), HDO(CU RNA ), HDO(C RNA ), and HDO(U RNA ) after incubation in human cerebrospinal fluid for 1 hour and 6 hours. The results of electrophoresis are shown. HDO(all DNA) and HDO(GA RNA ) were stable and not degraded in human cerebrospinal fluid. On the other hand, HDO(CU RNA ), HDO(C RNA ), and HDO(U RNA ) were degraded and unstable in human cerebrospinal fluid.
  • Example 15 HDO stability in cerebrospinal fluid> (the purpose) In an HDO comprising a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Malat1 gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, part of the DNA nucleosides in the second nucleic acid strand are replaced with RNA nucleosides. The stability in cerebrospinal fluid when replaced with
  • the ASO used in this example is a 2'-O-MOE-RNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid targeting Malat1 ncRNA, and has a base sequence complementary to a part of Malat1 ncRNA.
  • the 5 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 'end, the 5 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end, and the 10 DNA nucleosides in between were linked with phosphorothioate linkages. have a structure.
  • HDO(all DNA), HDO(A RNA ), HDO(G RNA ), HDO(C RNA ), and HDO(U RNA ) used in this example all contain the above ASO as the first nucleic acid strand
  • the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(A RNA )) of HDO(A RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing adenine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(G RNA )) of HDO(G RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing guanine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(C RNA )) of HDO(C RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing cytosine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand (c(U RNA )) of HDO(U RNA ) has a structure in which all DNA nucleosides containing thymine bases in c(all DNA) are replaced with RNA nucleosides containing uracil bases.
  • HDO all DNA
  • HDO A RNA
  • HDO G RNA
  • HDO C RNA
  • HDO U RNA
  • Figure 46 shows the results of electrophoresis after incubating HDO (all DNA), HDO (A RNA ), HDO (G RNA ), HDO (C RNA ), and HDO (U RNA ) in human cerebrospinal fluid for 6 hours. show. HDO(all DNA), HDO(A RNA ), and HDO(G RNA ) were stable and not degraded in human cerebrospinal fluid. On the other hand, HDO(C RNA ) and HDO(U RNA ) were degraded and unstable in human cerebrospinal fluid.
  • Nucleic acids were prepared in the same manner as in Example 1 for ASO, HDO (RNA-MOE), and HDO (DNA-MOE) listed in Table 16.
  • HDO having a bulge structure> (the purpose) An HDO comprising a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand is introduced into a neuronal cell line. To verify the toxicity-reducing effect and gene-suppressing effect by introducing a bulge structure into the second nucleic acid strand by in vitro experiments.
  • the ASO used in this example is an LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid that targets Mapt mRNA, has a nucleotide sequence complementary to a part of Mapt mRNA, and has three LNAs at the 5' end. It has a structure in which a nucleoside, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • HDO (all DNA), HDO (all MOE), HDO (bulge1), and HDO (bulge2) used in this example all contain the ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand is the first nucleic acid. It contains a sequence complementary to the strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(all MOE)) of HDO(all MOE) has a structure in which 2'-O-MOE-RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand (c(bulge1)) of HDO(bulge1) contains a complementary region consisting of a base sequence complementary to the entire length of the first nucleic acid strand, and a bulge structure located in the center of the complementary region.
  • the complementary region has a structure in which 2'-O-MOE-RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • a bulge structure has a structure in which two DNA nucleosides are linked by a phosphodiester bond.
  • the second nucleic acid strand (c(bulge2)) of HDO(bulge2) includes a complementary region consisting of a base sequence complementary to the first nucleic acid strand and a bulge structure located in the center of the complementary region.
  • the region has a single base deletion relative to the first nucleic acid strand, and a bulge structure is located at the site of the deletion.
  • the complementary region has a structure in which 2'-O-MOE-RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the bulge structure has a structure in which three DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • Nucleic acids were prepared in the same manner as in Example 1 for HDO (all DNA), HDO (all MOE), HDO (bulge1), and HDO (bulge2) listed in Table 17.
  • the ratio of the Mapt mRNA expression level to the Actb mRNA (internal standard gene) expression level was calculated, and the value normalized to the value of the PBS administration group was taken as the relative Mapt mRNA level.
  • LDH activity in the cell supernatant was measured as evaluation of neuronal cytotoxicity.
  • LDH activity was measured using Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories) according to the attached protocol.
  • a value normalized to the LDH activity in the PBS-administered group was defined as the relative LDH release level.
  • FIG. 49A shows the results of evaluation of target gene inhibitory effects of various nucleic acid agents in human neuroblastoma-derived cells (BE(2)-M17 cell line).
  • the suppressive effect was significantly attenuated compared to HDO (all DNA).
  • the HDO(bulge1) and HDO(bulge2) administration groups exhibited a strong gene-silencing effect equivalent to that of HDO(all DNA).
  • Fig. 49B shows the results of evaluating the LDH activity in the supernatant as cytotoxicity when various nucleic acid agents were introduced into cells.
  • the HDO (all DNA) administration group showed an increase in LDH activity
  • the HDO (all MOE), HDO (bulge1), and HDO (bulge2) groups showed LDH activity equal to or lower than that of the PBS administration group, resulting in cytotoxicity. decreased significantly.
  • HDO body1
  • HDO body2
  • Example 18 Single-stranded HDO> (the purpose) Regarding central nervous toxicity observed when intracerebroventricularly administered HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a second nucleic acid strand having a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, the second Introduction of a bulge structure into the nucleic acid strand, linking the first and second nucleic acid strands with a linker, and toxicity-reducing effects and gene-suppressing effects of both are verified by in vivo experiments.
  • HDO (bulge), ssHDO, PEG linker ssHDO, and bulge plus ssHDO used in this example all contain a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand.
  • the first nucleic acid strands of HDO(bulge), ssHDO, PEG linker ssHDO, and Bulge plus ssHDO are all LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acids, having a base sequence complementary to a portion of Mapt mRNA, It has a structure in which 3 LNA nucleosides at the 5' end, 3 LNA nucleosides at the 3' end, and 10 DNA nucleosides therebetween are linked by phosphorothioate bonds.
  • the first and second nucleic acid strands of HDO are not linked by a linker, but in ssHDO, PEG linker ssHDO, and Bulge plus ssHDO, the 3' end of the second nucleic acid strand is 5 ' is bound to the end via a linker.
  • the second nucleic acid strand (c(bulge)) of HDO(bulge) includes a complementary region consisting of a base sequence complementary to the first nucleic acid strand and a bulge structure.
  • the complementary region has a structure in which 2'-O-MOE-RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the bulge structure has a structure in which three DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of ssHDO has a sequence complementary to the first nucleic acid strand and contains three 2'-O-MOE-RNA nucleosides, ten DNA nucleosides, and three 2'-O-MOE -Have a structure in which RNA nucleosides are sequentially linked by phosphodiester bonds from the 5' end.
  • the linker that connects the first and second nucleic acid strands in ssHDO consists of three DNA nucleosides linked by phosphodiester bonds.
  • the configuration of the second nucleic acid strand of PEG linker ssHDO is the same as that of the second nucleic acid strand of ssHDO described above.
  • the linker that connects the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand consists of PEG (polyethylene glycol).
  • the second nucleic acid strand of Bulge plus ssHDO includes a complementary region consisting of a base sequence complementary to the first nucleic acid strand and two bulge structures.
  • the complementary region has a structure in which 2'-O-MOE-RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • Each of the two bulge structures has a structure in which three DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the linker connecting the first and second nucleic acid strands in Bulge plus ssHDO consists of three DNA nucleosides linked by phosphodiester bonds.
  • HDO(bulge) ssHDO, PEG linker ssHDO, and Bulge plus ssHDO were intracerebroventricularly administered to mice, and compared with HDO(all DNA)-administered mice used in Example 1, 30 minutes to 4 minutes after administration. There is a marked decrease in post-hour acute tolerability scores.
  • mice intracerebroventricularly administered HDO(bulge), ssHDO, PEG linker ssHDO, and Bulge plus ssHDO compared with mice etc. administered with HDO (all DNA) used in Example 1, 1 hour after administration Subsequent motor functions, such as total distance traveled and maximum speed of travel, are significantly improved.
  • ⁇ Example 19 Examination of nucleic acid species to be introduced into the gap region of the second nucleic acid strand> (the purpose) Regarding the central nervous system toxicity observed when HDO targeting the Malat1 gene is intracerebroventricularly administered, a region consisting of a nucleotide sequence complementary to the central region (gap region) of the first nucleic acid strand in the second nucleic acid strand (hereinafter referred to as the second nucleic acid strand) The influence of the type of nucleic acid to be introduced into the "gap region” (also referred to as a "gap region" in two nucleic acid strands) is examined.
  • HDO in which all nucleosides are RNA nucleosides HDO in which all nucleosides are DNA nucleosides, and RNA nucleosides are arranged at the positions of adenine base and guanine base, and cytosine
  • the toxicity of HDOs with DNA nucleosides placed at base and thymine base positions is compared by in vivo experiments.
  • Table 19 shows the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands constituting the ASOs and HDOs used in this example.
  • HDO (all DNA), HDO (cRNA 10MOE), HDO (cDNA 10MOE), and HDO (agRNA 10MOE) used in this example contain the common ASO as the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand It has a sequence complementary to a nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand c (RNA 10MOE) of HDO has two regions consisting of base sequences complementary to the wing regions of the first nucleic acid strand (hereinafter also referred to as "wing regions" in the second nucleic acid strand).
  • the second nucleic acid strand c (DNA 10MOE) of HDO (cDNA 10MOE) is composed of '-O-MOE-RNA nucleosides and the gap region is composed of RNA nucleosides;
  • the second nucleic acid strand c (agRNA 10MOE) of HDO (agRNA 10MOE) is composed of RNA nucleosides, and the gap region is composed of DNA nucleosides;
  • the wing region is composed of 2'-O-MOE-RNA nucleosides.
  • nucleosides with adenine and guanine bases are RNA nucleosides
  • nucleosides with cytosine and thymine bases are DNA nucleosides.
  • nucleic acid molecules shown in Table 19 preparation of nucleic acids, in vivo experiments, evaluation of central nervous system toxicity, and evaluation of motor function were performed in the same manner as in Example 1. However, in this example, the dose of the nucleic acid agent per mouse was 14 nmol/mouse.
  • FIG. 51 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • HDO all DNA
  • HDO cRNA 10MOE
  • HDO cDNA 10MOE
  • HDO agRNA 10MOE
  • the total distance traveled Fig. 51A
  • the average speed of movement Fig. 51B
  • the total moving distance and average moving speed were improved compared to the HDO (all DNA) administration group.
  • FIG. 52 shows Malat1 RNA expression levels in the right and left frontal lobes 7 days after intracerebroventricular administration of various nucleic acid agents.
  • the HDO (agRNA 10MOE)-administered group showed a marked effect of suppressing the Malat1 RNA expression level compared to the ASO-administered group and other HDO-administered groups. From this result, HDO containing the second nucleic acid strand in which the positions of the adenine base and the guanine base in the gap region are RNA nucleosides, and the positions of the cytosine base and the thymine base are DNA nucleosides, all nucleosides in the gap region are DNA nucleosides. It was shown that an excellent gene expression-suppressing effect can be achieved compared to HDO containing a second nucleic acid strand that is an RNA nucleoside or an RNA nucleoside.
  • Example 20 Evaluation of double strand dissociation efficiency in brain tissue> (the purpose)
  • the first nucleic acid strand is dissociated from the second nucleic acid strand in the target tissue and can exert an antisense effect on the target gene or its transcript. Therefore, HDOs containing the first and second nucleic acid strands are incubated in mouse brain tissue homogenate to examine the efficiency of duplex dissociation.
  • a solution was prepared by diluting GelRed ( ⁇ 10000) aqueous solution (Biotium) with 1 ⁇ TBE to a concentration of 1/10000. The gel was permeated with the solution for 10 minutes. The gel was then imaged with a ChemiDoc Touch imaging system (BioRad).
  • Figure 53 shows electrophoresis results after incubation of ASO, HDO (cRNA 10MOE), HDO (cDNA 10MOE) and HDO (agRNA 10MOE) in mouse brain tissue homogenate for 7 days.
  • HDO agRNA 10MOE
  • An HDO comprising a second nucleic acid strand in which the positions of adenine and guanine bases in the gap region are RNA nucleosides and the positions of cytosine and thymine bases are DNA nucleosides, all nucleosides in the gap region are either DNA nucleosides or RNA nucleosides.
  • the double-strand dissociation efficiency was extremely high in brain tissue, which strongly supported the result of marked suppression of target gene expression in Example 19 above.
  • Example 21 Examination of nucleic acid modification to be introduced into the wing region of the second nucleic acid strand> (the purpose) Regarding the central neurotoxicity observed when HDO targeting the Malat1 gene is administered intracerebroventricularly, the effect of introduction of MOE modified nucleic acid or natural nucleic acid (RNA or DNA) in the wing region and gap region of the second nucleic acid strand is investigated in vivo. Compare by experiment.
  • Table 20 shows the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands constituting the HDO used in this example.
  • the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand of HDO (all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the wing region is composed of 2'-O-MOE-RNA nucleosides;
  • the gap region is composed of RNA nucleoside structures;
  • the second nucleic acid strand of HDO (gapMOE RNA) , the region corresponding to the wing region is composed of RNA nucleosides, and the region corresponding to the gap region is composed of 2'-O-MOE-RNA nucleoside structures;
  • the wing region is composed of 2'-O-MOE-RNA nucleosides, and the gap structure is composed of DNA nucleoside structures;
  • the gap region is composed of 2'-O-MOE-RNA nucleoside structures;
  • the second nucleic acid strand of HDO (agRNA 10MOE) is composed of 2'-O-MOE-RNA nucleosides in the wing region
  • nucleosides with adenine and guanine bases are RNA nucleosides, and nucleosides with adenine and gu
  • nucleic acid molecules shown in Table 21 preparation of nucleic acids, in vivo experiments, evaluation of central nervous system toxicity, and evaluation of motor function were performed in the same manner as in Example 1. However, in this example, the dose of the nucleic acid agent per mouse was 28 nmol/mouse.
  • FIG. 54 shows the results of evaluation of central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • the HDO (cRNA MOEwing), HDO (gapMOE RNA), HDO (cDNA MOEwing), HDO (gapDNA MOE) and HDO (agRNA 10MOE) administration groups had better acute phase tolerance than the HDO (all DNA) administration group. Tolerability score decreased significantly.
  • the HDO (gapMOE RNA), HDO (cDNA MOEwing), HDO (gapDNA MOE), and HDO (agRNA 10MOE) administration groups had higher acute phase tolerability scores than the HDO (cDNA MOEwing) administration group. decreased further.
  • FIG. 55 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration.
  • the total distance traveled was (Fig. 55A) and mean locomotion speed (Fig. 55B) were significantly improved.
  • the HDO (gapMOE RNA), HDO (cDNA MOEwing), HDO (gapDNA MOE) and HDO (agRNA 10MOE) administration groups compared with the HDO (cDNA MOEwing) administration group, total moving distance and average moving speed improved.
  • Example 22 Examination of nucleic acid species to be introduced into the gap region of the second nucleic acid strand: comparison of acute/delayed neurotoxicity> (the purpose) After intracerebroventricular administration of HDO containing a first nucleic acid strand consisting of an ASO targeting the Mapt gene and a MOE wing-modified second nucleic acid strand having a nucleotide sequence complementary to the first nucleic acid strand Acute neurotoxicity within 1 day and delayed neurotoxicity after 1 day after administration will be compared by in vivo experiments.
  • Table 21 shows the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands constituting the ASOs and HDOs used in this example.
  • HDO (all DNA), HDO (cRNA 6MOE), HDO (cDNA 6MOE), and HDO (agRNA 6MOE) used in this example contain the ASO as a common first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand It has a sequence complementary to one nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand (c(all DNA)) of HDO(all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO (cRNA 6MOE) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end, three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end, and has a structure in which 10 RNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO (cDNA 6MOE) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end, three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end, and has a structure in which 10 DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO (agRNA 6MOE) consists of three 2'-O-Me-RNA nucleosides at the 5' end, three 2'-O-Me-RNA nucleosides at the 3' end, and In the gap region, nucleosides having adenine and guanine bases are RNA nucleosides, and nucleosides having cytosine and thymine bases are DNA nucleosides.
  • HDO all DNA
  • HDO cRNA 6MOE
  • HDO cDNA 6MOE
  • HDO agRNA 6MOE
  • preparation of nucleic acids in vivo experiments, and In addition, central nervous system toxicity evaluation and motor function evaluation were performed.
  • the dose of the nucleic acid agent per mouse was 28 nmol/mouse.
  • FIG. 56 shows the results of evaluating acute central nervous system toxicity within 1 day of administration in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • HDO cRNA 6MOE
  • HDO cDNA 6MOE
  • HDO agRNA 6MOE
  • the acute phase tolerability score was significantly decreased in the ASO and HDO (all DNA) administration groups.
  • the HDO (agRNA 6MOE) administration group showed a lower acute phase tolerability score than the HDO (cRNA 6MOE) and HDO (cDNA 6MOE) administration groups.
  • FIG. 57 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration. Total distance traveled (Fig. 57A) and maximum speed Figure 57B) improved.
  • HDO agRNA 6MOE
  • cDNA 6MOE a nucleoside having adenine base and a guanine base
  • a nucleoside having a cytosine base and a thymine base is a DNA nucleoside in the gap region of the second nucleic acid strand.
  • FIG. 58 shows the results of evaluation of body weight loss in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered as delayed central nervous system toxicity after 1 day after administration. Body weight was measured on days 0, 7, 14, and 21 after administration.
  • HDO (cRNA 6MOE), HDO (cDNA 6MOE), and HDO (agRNA 6MOE) administration groups showed reduced weight loss effects compared to ASO and HDO (all DNA) administration groups.
  • FIG. 59 shows the results of evaluation of motor function in mice intracerebroventricularly administered with various nucleic acid agents as delayed central nervous system toxicity after one day of administration.
  • HDO (cRNA 6MOE), HDO (cDNA 6MOE), and HDO (agRNA 6MOE) groups were compared with ASO and HDO (all DNA) groups at any time point 7, 14, or 21 days after administration. As a result, the reduction effect on maximum movement speed has been reduced.
  • FIG. 60 shows Mapt mRNA expression levels in the right frontal lobe 21 days after intracerebroventricular administration of various nucleic acid agents.
  • the HDO (agRNA 6MOE)-administered group showed a marked effect of suppressing the Mapt mRNA expression level compared to the HDO (cRNA 6MOE) and HDO (cDNA 6MOE)-administered groups.
  • the nucleoside having an adenine base and a guanine base in the gap region of the second nucleic acid strand is an RNA nucleoside
  • the nucleoside having a cytosine base and a thymine base is a DNA nucleoside
  • the second nucleic acid strand is a DNA nucleoside or It was shown that a superior effect of suppressing gene expression can be achieved compared to HDOs composed of RNA nucleosides.
  • FIG. 61 shows HDO (cRNA 6MOE), HDO (cDNA 6MOE), and HDO (agRNA 6MOE) using methods similar to Example 20 for evaluating the duplex dissociation efficiency of nucleic acid agents in brain tissue homogenates. shows the results of electrophoresis after incubation for 7 days in mouse brain tissue. HDO (agRNA 6MOE) showed higher duplex dissociation efficiency in brain tissue homogenates compared to HDO (cRNA 6MOE) and HDO (cDNA 6MOE).
  • the second nucleic acid strand is a DNA nucleoside or Compared to HDO consisting of RNA nucleosides, the double-strand dissociation efficiency was extremely high in the brain tissue, which strongly supported the result that the expression of the target gene was remarkably suppressed in the above result 3.
  • Example 23 Introduction of MOE modification into second nucleic acid strand of HDO containing all MOE-modified ASOs> (the purpose)
  • an HDO comprising, as the first nucleic acid strand, an ASO in which all nucleosides are MOE-modified nucleosides (hereinafter referred to as "all-MOE-modified ASO") capable of regulating splicing by targeting the Mecp2 gene. target.
  • all-MOE-modified ASO capable of regulating splicing by targeting the Mecp2 gene.
  • Table 22 shows the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands constituting the ASOs and HDOs used in this example.
  • ASO used in this example is a non-gapmer type antisense nucleic acid that targets MeCP2 (methyl-CpG binding protein 2) pre-mRNA, and has a base sequence complementary to a part of MECP2 pre-mRNA. and all nucleosides are 2'-O-MOE-RNA nucleosides linked by phosphorothioate linkages.
  • HDO (all DNA) and HDO (cRDNA MOE) used in this example contain the above ASO as a common first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand has a sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand of HDO (all DNA) has a structure in which DNA nucleosides are linked by phosphodiester bonds.
  • the second nucleic acid strand of HDO (cRDNA MOE) consists of three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 5' end, three 2'-O-MOE-RNA nucleosides at the 3' end, and In the gap region, nucleosides having adenine and guanine bases are RNA nucleosides, and nucleosides having cytosine and thymine bases are DNA nucleosides.
  • ASO, HDO (all DNA), and HDO (cRDNA MOE) listed in Table 22 were subjected to nucleic acid preparation, in vivo experiments, central nervous system toxicity evaluation, and motor function evaluation in the same manner as in Example 1. .
  • the dose of the nucleic acid agent per mouse was 28 nmol/mouse.
  • FIG. 62 shows the results of evaluating acute central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • ASO administration in the HDO (all DNA) and HDO (cRDNA MOE) administration groups The acute phase tolerability score decreased significantly compared to the group.
  • the HDO(cRDNA MOE)-administered group showed a lower acute-phase tolerability score than the HDO(all DNA)-administered group.
  • the wing region of the second nucleic acid strand is composed of 2'-O-MOE-RNA nucleosides, and in the gap region, nucleosides having adenine bases and guanine bases are RNA nucleosides, and have cytosine bases and thymine bases. It was shown that HDOs in which the nucleoside is a DNA nucleoside can achieve lower central nervous system toxicity than other HDOs.
  • FIG. 63 shows the results of evaluating motor function in mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered 1 hour after administration. In the HDO (all DNA) and HDO (cRDNA MOE) administration groups, the total moving distance (Fig. 63A) and the maximum moving speed (Fig.
  • the wing region of the second nucleic acid strand is composed of 2'-O-MOE-RNA nucleosides, and in the gap region, nucleosides having adenine bases and guanine bases are RNA nucleosides, and have cytosine bases and thymine bases. It was shown that HDO, in which the nucleoside is a DNA nucleoside, has a very small effect of suppressing motor function and a very low toxicity compared with other HDOs.
  • Example 24 Single-chain HDO> (the purpose) The neurocytotoxicity of single-stranded HDO (ssHDO), in which the first nucleic acid strand consisting of ASO targeting the Bace1 gene and the second nucleic acid strand having a complementary base sequence to the first nucleic acid strand are linked by a linker, was investigated in It is verified by in vitro experiments.
  • ssHDO single-stranded HDO
  • HDO prepared in (1) was introduced into human neuroblastoma-derived cells (Neuro2a cell line) using the lipofection method (lipofectamine2000). 48 hours after introduction of HDO, RNA was extracted from the cells using the IsogenI kit (Genedesign Inc.). cDNA was synthesized using Transcriptor Universal cDNA Master, DNase (Roche Diagnostics) according to the protocol. Next, quantitative RT-PCR was performed using the resulting cDNA as a template to measure the expression levels of Bace1 mRNA and Actb mRNA (internal standard genes). Quantitative RT-PCR was performed by TaqMan (Roche Applied Science).
  • Primers used in quantitative RT-PCR were products designed and manufactured by Thermo Fisher Scientific (formerly Life Technologies Corp). Amplification was performed by repeating 40 cycles of 95°C for 15 seconds, 60°C for 30 seconds, and 72°C for 1 second (one cycle). The ratio of the Bace1 mRNA expression level to the Actb mRNA (internal standard gene) expression level was calculated, and the value normalized to the value of the PBS-administered group was defined as the relative Bace1 mRNA level.
  • LDH activity in the cell supernatant was measured as evaluation of neuronal cytotoxicity.
  • LDH activity was measured using Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories) according to the attached protocol.
  • a value normalized to the LDH activity in the PBS-administered group was defined as the relative LDH release level.
  • FIG. 64B shows the results of evaluating target gene inhibitory effects of various nucleic acid agents in mouse neuroblastoma-derived cells (Neuro2a cell line).
  • ssHDO-administered group a strong gene-silencing effect equivalent to that of HDO (all DNA) was obtained.
  • FIG. 64A shows the results of evaluating LDH activity in the supernatant as cytotoxicity when various nucleic acid agents were introduced into cells.
  • Cells treated with ssHDO at 5 nM and 25 nM exhibited a suppressed increase in LDH activity and markedly decreased cytotoxicity compared to cells treated with HDO (all DNA) at 5 nM and 25 nM, respectively.
  • ssHDO containing 2'-O-MOE-RNA nucleosides significantly reduced cytotoxicity.
  • Example 25 Evaluation of central nervous system toxicity in monkeys> (the purpose) HDO containing MOE modification is administered intrathecally to monkeys to assess central neurotoxicity.
  • HDO all DNA
  • HDO DNA MOE
  • HDO RNA MOE
  • HDO DNA RNA MOE
  • FIG. 66 shows the results of evaluating acute central nervous system toxicity in monkeys intrathecally administered with various nucleic acid agents.
  • Administration of HDO (all DNA), HDO (DNA MOE), HDO (RNA MOE), and HDO (DNA RNA MOE) at any of 1 hour, 2 hours, and 3 hours after administration of the nucleic acid agent The modified FOB score significantly decreased in the group compared with the ASO-treated group.
  • the modified FOB score decreased in the HDO (DNA MOE) and HDO (DNA RNA MOE) administration groups compared to the HDO (all DNA) administration group.
  • FIG. 67 shows the results of measuring the spontaneous exercise time and the number of jumps using a 3-minute video animation.
  • HDO (all DNA), HDO (DNA MOE), HDO (RNA MOE), and HDO (DNA RNA MOE) administration groups suppressed the effect of reducing the spontaneous exercise time or the number of jumps compared to the ASO administration group. was done. Furthermore, in the HDO (DNA MOE) and HDO (DNA RNA MOE) administration groups, compared with the HDO (all DNA) administration group, the effect of reducing spontaneous exercise time or the number of jumps was suppressed. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

中枢神経毒性が軽減した二本鎖核酸複合体を提供することを課題とする。　第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む二本鎖核酸複合体であって、前記第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、前記標的遺伝子又はその転写産物に対してアンチセンス効果を有し、前記第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ2'-修飾ヌクレオシドを１個以上含む、前記二本鎖核酸複合体を提供する。

Description

２’－修飾ヌクレオシドを含むヘテロ核酸
　本発明は、2'-修飾ヌクレオシドを含む二本鎖核酸複合体、及びそれを有効成分として含む医薬組成物等に関する。
　近年、核酸医薬と呼ばれる医薬品の現在進行中の開発において、オリゴヌクレオチドが関心を集めており、また特に、標的遺伝子の高い選択性及び低毒性の点から考えて、アンチセンス法を利用する核酸医薬の開発が積極的に進められている。アンチセンス法とは、標的遺伝子より転写されたmRNAやmiRNAの部分配列を標的センス鎖として、それに相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド：本明細書ではしばしば「ASO（Antisense Oligonucleotide）」と表記する）を細胞に導入することによって、標的遺伝子によってコードされたタンパク質の発現やmiRNAの活性を選択的に改変又は阻害することを含む方法である。
　アンチセンス法を利用した核酸として、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれに対する相補鎖とをアニーリングさせた二本鎖核酸複合体(ヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド(heteroduplex oligonucleotide、HDO))を開発した(特許文献１、非特許文献１及び２)。二本鎖核酸複合体は高いアンチセンス効果を有し、血液脳関門を超えて中枢神経系の制御を可能とした画期的な技術である。
　一方、近年では核酸医薬の臨床開発が進み、前臨床試験の結果が蓄積されてきた。その結果、ASO等の核酸医薬では毒性や有害事象が問題になる場合が少なくないことが明らかになった。例えば、2013～2016年における核酸医薬品の開発中止原因では、毒性や有害事象が半数近くを占めた（非特許文献３）。それ故、核酸医薬の毒性を回避する技術が必要とされている。
国際公開第2013/089283号 国際公開第2014/192310号
Nishina K, et. al., "DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing", Nature Communication, 2015, 6:7969. Asami Y, et al., "Drug delivery system of therapeutic oligonucleotides", Drug Discoveries & Therapeutics. 2016; 10(5):256-262. Harrison R.K., "Phase II and phase III failures: 2013-2015", Nature Reviews Drug Discovery, 2016; 15:817-818.
　中枢神経毒性が軽減した二本鎖核酸複合体を提供することである。
　一本鎖のギャップマー型アンチセンス核酸を脳室内に投与したマウスでは、投与から数時間以内に中枢神経毒性に基づく活動低下や運動機能障害が観察される。本発明者らは、核酸医薬の中枢神経毒性を軽減し得る新たな技術を求めて鋭意研究を行い、2'-修飾ヌクレオシドを二本鎖核酸複合体に導入した。その結果、2'-修飾ヌクレオシドの導入により、二本鎖核酸複合体の中枢神経毒性を劇的に軽減又は消失させることができることを見出した。この毒性抑制効果は、従来の予想を大きく超える、驚くべき効果である。本発明は上記知見に基づくものであって、以下を提供する。
（１）第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む二本鎖核酸複合体であって、前記第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、前記標的遺伝子又はその転写産物に対してアンチセンス効果を有し、前記第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ2'-修飾ヌクレオシドを1個以上含む、前記二本鎖核酸複合体。
（２）前記第1核酸鎖がギャップマーである、（１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３）前記第1核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが修飾ヌクレオシドである、（１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（４）前記第1核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'-修飾ヌクレオシドである、（３）に記載の二本鎖核酸複合体。
（５）前記第1核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドである、（４）に記載の二本鎖核酸複合体。
（６）前記第2核酸鎖が、5’末端に位置する1個又は連続する2～10個の2'-修飾ヌクレオシド、及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2～10個の2'-修飾ヌクレオシドを含む、（１）～（５）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（７）前記第2核酸鎖が、5’末端及び3’末端以外の位置に、1～7個の2'-修飾ヌクレオシドを含む、（１）～（６）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（８）前記第1核酸鎖が、
　(1)少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、
　(2)前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び
　(3)前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、（２）に記載の二本鎖核酸複合体。
（９）前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に2'-修飾ヌクレオシドを含む、（８）に記載の二本鎖核酸複合体。
（１０）前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドである、（９）に記載の二本鎖核酸複合体。
（１１）前記第2核酸鎖における前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、プリン塩基を含む全てのヌクレオシドがリボヌクレオシドである、（１０）に記載の二本鎖核酸複合体。
（１２）前記第2核酸鎖における前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、ピリミジン塩基を含む全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである、（１１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（１３）前記第2核酸鎖において、前記2'-修飾ヌクレオシドが、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド又は2'-O-メチル修飾ヌクレオシドである、（１２）に記載の二本鎖核酸複合体。
（１４）前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが、
　(a)デオキシリボヌクレオシド、
　(b)デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシド、
　(c)デオキシリボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、
　(d)リボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、又は
　(e)デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、及び2'-修飾ヌクレオシド
である、（８）～（１０）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１５）前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドであり、かつ前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである、（１４）に記載の二本鎖核酸複合体。
（１６）前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖の前記中央領域における少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含む、（８）～（１０）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１７）(i)前記第1核酸鎖における少なくとも1個のグアノシンヌクレオシド、
　(ii)前記グアノシンヌクレオシドの5'末端側に隣接するヌクレオシド、
　(iii)前記グアノシンヌクレオシドの3'末端側に隣接するヌクレオシド、又は
　(iv) (i)～(iii)の任意の組み合わせ
に相補的である前記第2核酸鎖におけるヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドである、（１）～（１６）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１８）(i)前記第1核酸鎖の5'ウイング領域における少なくとも1個のグアノシンヌクレオシド、
　(ii)前記グアノシンヌクレオシドの5'末端側に隣接するヌクレオシド、
　(iii)前記グアノシンヌクレオシドの3'末端側に隣接するヌクレオシド、又は
　(iv) (i)～(iii)の任意の組み合わせ
に相補的である前記第2核酸鎖におけるヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドである、（１）～（１７）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１９）前記第2核酸鎖において、アデニン塩基又はピリミジン塩基を含むヌクレオシドの少なくとも1個が2'-修飾ヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドである、（１）～（１８）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２０）前記第2核酸鎖においてピリミジン塩基を含むヌクレオシドの少なくとも1個が2'-修飾ヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドである、（１）～（１９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２１）前記第2核酸鎖が、ピリミジン塩基を含む天然リボヌクレオシドを含まない、（１）～（２０）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２２）前記第2核酸鎖においてピリミジン塩基を含むヌクレオシドの全てが2'-修飾ヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドである、（２１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（２３）前記第2核酸鎖において、ヌクレオシドの20％以上が、2'-修飾ヌクレオシドである、（１）～（２２）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２４）前記第2核酸鎖において、2'-修飾ヌクレオシド以外の全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである、（１）～（２３）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２５）前記第2核酸鎖において、第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドである、（１）～（２４）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２６）前記第2核酸鎖において、前記2'-修飾ヌクレオシドが、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド及び／又は2'-O-メチル修飾ヌクレオシドである、（１）～（２５）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２７）前記第2核酸鎖が、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、scpBNAヌクレオシド、AmNAヌクレオシド、又はBNA-NCを少なくとも1個含む、（１）～（２６）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２８）前記第1核酸鎖がミックスマーである、（１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（２９）前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に対して非相補的な塩基配列からなるバルジ構造を少なくとも1つ含む、（１）～（２８）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３０）前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に対して、非相補的塩基、及び／又は1塩基以上の、挿入配列及び／又は欠失を含む、（１）～（２９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３１）前記第2核酸鎖が、前記非相補的塩基を1～3個含む、（３０）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３２）前記挿入配列が1～8塩基からなる、（３０）又は（３１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３３）前記欠失が連続する1～4塩基からなる、（３０）～（３２）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３４）前記第2核酸鎖の前記非相補的塩基がバルジ構造を形成する、又は前記第2核酸鎖の前記欠失位置に、前記第1核酸鎖に対して非相補的な塩基配列からなるバルジ構造を含む、（３０）～（３３）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３５）前記バルジ構造が糖非修飾ヌクレオシドを含む、又は前記バルジ構造において全てのヌクレオシドが糖非修飾ヌクレオシドである、（２９）又は（３４）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３６）前記バルジ構造が1～10塩基長である、（２９）、（３４）、又は（３５）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３７）前記第2核酸鎖において、前記バルジ構造以外の全てのヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドである、（２９）及び（３４）～（３６）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３８）前記第2核酸鎖が少なくとも8塩基長である、（１）～（３７）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３９）前記第2核酸鎖の塩基長が第1核酸鎖の塩基長よりも短い、（１）～（３８）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（４０）前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる領域の5'末端側及び／又は3'末端側に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域を含む、（１）～（３９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（４１）前記オーバーハング領域が1～20塩基長である、（４０）に記載の二本鎖核酸複合体。
（４２）前記オーバーハング領域が、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオシド及び／又は非天然ヌクレオシドを含む、（４０）又は（４１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（４３）前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖とがリンカーを介して結合している、（１）～（４２）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（４４）前記リンカーが、前記第1核酸鎖の5'末端と前記第2核酸鎖の3'末端とを結合する、及び／又は前記第1核酸鎖の3'末端と前記第2核酸鎖の5'末端とを結合する、（４３）に記載の二本鎖核酸複合体。
（４５）前記リンカーが切断性（cleavable）又は非切断（uncleavable）リンカーである、（４３）又は（４４）に記載の二本鎖核酸複合体。
（４６）前記リンカーが、天然ヌクレオシド及び／若しくは非天然ヌクレオシドを含む核酸、又はポリエチレングリコールからなる、（４３）～（４５）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（４７）前記核酸からなるリンカーが2～10塩基長である、（４６）に記載の二本鎖核酸複合体。
（４８）前記第2核酸鎖がリガンドに結合している、（１）～（４７）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（４９）前記リガンドが、低分子、ペプチド、脂質、及び核酸アプタマーからなる群から選択されるいずれか1以上である、（４８）に記載の二本鎖核酸複合体。
（５０）前記脂質がコレステロール若しくはその類縁体、又はトコフェロール若しくはその類縁体である、（４９）に記載の二本鎖核酸複合体。
（５１）前記リガンドが前記第2核酸鎖の5’末端及び／又は3’末端に結合している、（４８）～（５０）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（５２）リガンドと結合していない、（１）～（４７）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（５３）前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、（１）～（５２）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（５４）前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、（５３）に記載の二本鎖核酸複合体。
（５５）（１）～（５４）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体を有効成分として含む医薬組成物。
（５６）被検体の中枢神経系疾患を治療するための、（５５）に記載の医薬組成物。
（５７）脳室内投与又は髄腔内投与される、（５５）又は（５６）に記載の医薬組成物。
（５８）前記髄腔内投与が後頭窩穿刺又は腰椎穿刺である、（５７）に記載の医薬組成物。
（５９）前記二本鎖核酸複合体が0.1mg～200mg投与される、（５７）又は（５８）に記載の医薬組成物。
（６０）静脈内投与又は皮下投与される、（５５）又は（５６）に記載の医薬組成物。
（６１）前記二本鎖核酸複合体が0.1mg/kg～100mg/kg投与される、（６０）に記載の医薬組成物。
（６２）中枢神経毒性が低減されている、（５５）～（６１）のいずれかに記載の医薬組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-150310号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、中枢神経毒性が軽減した二本鎖核酸複合体が提供される。
図1は、様々な架橋核酸の構造を示す。 図2は、様々な天然ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの構造を示す。 図3は、核酸剤投与後のマウスにおいて中枢神経毒性を評価するためのスコアリングシステムを示す。 図4は、実施例1で用いた核酸の構造を示す。図4Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOの構造を示す。図4Bは、HDO(all RNA)の構造を示す。図4Cは、HDO(all DNA)の構造を示す。図4Dは、HDO(6MOE wing)の構造を示す。図4Eは、HDO(all MOE)の構造を示す。 図5は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図6は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図6Aは5分間の総移動距離を示す。図6Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図7は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの海馬におけるMapt mRNA発現レベルを示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図8は、実施例2で用いた核酸の構造を示す。図8Aは、BACE1遺伝子を標的とするASOの構造を示す。図8Bは、HDO(all RNA)の構造を示す。図8Cは、HDO(all DNA)の構造を示す。図8Dは、HDO(5MOE wing)の構造を示す。 図9は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図10は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図10Aは5分間の総移動距離を示す。図10Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図11は、実施例3で用いた核酸の構造を示す。図11Aは、Malat1遺伝子を標的とするASOの構造を示す。図11Bは、HDO(all RNA)の構造を示す。図11Cは、HDO(all DNA)の構造を示す。図11Dは、HDO(10MOE wing)の構造を示す。 図12は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図13は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図13Aは5分間の総移動距離を示す。図13Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図14は、実施例4で用いた核酸の構造を示す。図14Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図14Bは、HDO(RNA 6MOE wing)の構造を示す。図14Cは、HDO(6MOE wing)の構造を示す。図14Dは、HDO(6OMe wing)の構造を示す。図14Eは、HDO(6F wing)の構造を示す。 図15は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図16は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図16Aは5分間の総移動距離を示す。図16Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図17は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後3時間における運動機能を示す。図17Aは5分間の総移動距離を示す。図17Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図18は、実施例5で用いた核酸の構造を示す。図18Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOの構造を示す。図18Bは、HDO(6MOE wing)の構造を示す。図18Cは、HDO(GMOE)の構造を示す。図18Dは、HDO(GRNA)の構造を示す。図18Eは、HDO(inosine)の構造を示す。 図19は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図20は、実施例6で用いた核酸の構造を示す。図20Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図20Bは、HDO(6MOE-5'&3')の構造を示す。図20Cは、HDO(6MOE-5')の構造を示す。図20Dは、HDO(6MOE-3')の構造を示す。図20Eは、HDO(10MOE-5')の構造を示す。図20Fは、HDO(10MOE-3')の構造を示す。 図21は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図22は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図22Aは5分間の総移動距離を示す。図22Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図23は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後3時間における運動機能を示す。図23Aは5分間の総移動距離を示す。図23Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図24は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの海馬におけるMapt mRNA発現レベルを示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図25は、実施例7で用いた核酸の構造を示す。図25Aは、BACE1遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図25Bは、HDO(5MOE-5')の構造を示す。図25Cは、HDO(5MOE-3')の構造を示す。図25Dは、HDO(8MOE-5')の構造を示す。図25Eは、HDO(8MOE-3')の構造を示す。図25Fは、HDO(10MOE-5')の構造を示す。図25Gは、HDO(10MOE-3')の構造を示す。 図26は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図27は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図27Aは5分間の総移動距離を示す。図27Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図28は、実施例8で用いた核酸の構造を示す。図28Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図28Bは、HDO(6MOE wing)の構造を示す。図28Cは、HDO(9MOE wing)の構造を示す。図28Dは、HDO(11MOE wing)の構造を示す。図28Eは、HDO(13MOE wing)の構造を示す。図28Fは、HDO(15MOE wing)の構造を示す。 図29は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図30は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図27Aは5分間の総移動距離を示す。図27Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図31は、実施例9で用いた核酸の構造を示す。図31Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図31Bは、HDO(AMOE)の構造を示す。図31Cは、HDO(GMOE)の構造を示す。図31Dは、HDO(CMOE)の構造を示す。図31Eは、HDO(TMOE)の構造を示す。 図32は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図33は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図33Aは5分間の総移動距離を示す。図33Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図34は、実施例10で用いた核酸の構造を示す。図34Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図34Bは、HDO(CMOE)の構造を示す。図34Cは、HDO(2CMOE-5)の構造を示す。図34Dは、HDO(2CMOE-3)の構造を示す。図34Eは、HDO(3CMOE)の構造を示す。 図35は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図36は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後1時間における運動機能を示す。図36Aは5分間の総移動距離を示す。図36Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図37は、各種核酸剤のヒト髄液中における安定性を示す。図37A,Bは、実施例11で用いた核酸の構造を示す。図37Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOの構造を示す。図37Bは、HDO(ASO/cRNA)の構造を示す。図37Cは、各種核酸剤をヒト髄液（Human CSF; hCSF）と10分又は6時間混合した後、電気泳動により安定性を検討した結果を示す。図37Dは、HDO(ASO/cRNA)におけるHDO 2本鎖のバンド強度を定量した結果を示す。 図38は、各種核酸剤のヒト及びラットの髄液中における安定性を示す。図38A,Bは、実施例11で用いた核酸の構造を示す。図38Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(ASO/cRNA)の構造を示す。図38Bは、HDO(ASO/cDNA)の構造を示す。図38Cは、各種核酸剤をヒト又はラットの髄液と6時間混合した後、電気泳動により安定性を検討した結果を示す。図38Dは、HDO(ASO/cRNA)及びHDO(ASO/cDNA)における第2核酸鎖（cRNA及びcDNA）のヒト及びラットの髄液中における安定性を示す。 図39は、各種核酸剤のマウス、ラット、サル、及びヒトの髄液中における安定性を示す。図39A,Bは、実施例12で用いた核酸の構造を示す。図39Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all RNA)の構造を示す。図39Bは、HDO(all DNA)の構造を示す。図39Cは、各種核酸剤をマウス、ラット、サル、及びヒトの髄液と6時間混合した後、電気泳動により安定性を検討した結果を示す。 図40は、各種核酸剤のマウス、ラット、サル、及びヒトの髄液中における安定性を示す。図40A,Bは、実施例12で用いた核酸の構造を示す。図40Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(cRNA 6MOE wing)の構造を示す。図40Bは、HDO(cDNA 6MOE wing)の構造を示す。図40Cは、各種核酸剤をマウス、ラット、サル、及びヒトの髄液と6時間混合した後、電気泳動により安定性を検討した結果を示す。 図41は、実施例13で用いた核酸の構造を示す。図41Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図41Bは、HDO(ARNA)の構造を示す。図41Cは、HDO(GRNA)の構造を示す。図41Dは、HDO(CRNA)の構造を示す。図41Eは、HDO(URNA)の構造を示す。 図42は、各種核酸剤をヒト髄液と6時間混合した後、電気泳動により安定性を検討した結果を示す。 図43は、実施例14で用いた核酸の構造を示す。図43Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図43Bは、HDO(GARNA)の構造を示す。図43Cは、HDO(CURNA)の構造を示す。図43Dは、HDO(CRNA)の構造を示す。図43Eは、HDO(URNA)の構造を示す。 図44は、各種核酸剤をヒト髄液と1時間又は6時間混合した後、電気泳動により安定性を検討した結果を示す。 図45は、実施例15で用いた核酸の構造を示す。図45Aは、Malat1遺伝子を標的とするASOを含むHDO(all DNA)の構造を示す。図45Bは、HDO(ARNA)の構造を示す。図45Cは、HDO(GRNA)の構造を示す。図45Dは、HDO(CRNA)の構造を示す。図45Eは、HDO(URNA)の構造を示す。 図46は、各種核酸剤をヒト髄液と6時間混合した後、電気泳動により安定性を検討した結果を示す。 図47は、サルにおいて核酸剤の中枢神経毒性を評価した結果を示す。図47A-Cは、実施例16で用いた核酸の構造を示す。図47Aは、Mapt遺伝子を標的とするASOの構造を示す。図47Bは、HDO(RNA-MOE)の構造を示す。図47Cは、HDO(DNA-MOE)の構造を示す。図47Dは、実施例16においてサルに対する中枢神経毒性を評価した手順を示す。図47Eは、サルにおいて各種核酸剤の中枢神経系毒性を評価した結果を示す。 図48は、実施例17で用いる核酸の構造を示す。図48Aは、HDO(all DNA)の構造を示す。図48Bは、HDO(all MOE)の構造を示す。図48Cは、HDO(bulge1)の構造を示す。図48Dは、HDO(bulge2)の構造を示す。 図49は、各種核酸剤を導入したヒト神経芽細胞腫由来細胞におけるMapt mRNA発現レベル及びLDH活性を示す。図49Aは、相対的Mapt mRNAレベルを示す。図49Bは、上清における相対的LDH放出レベルを示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図50は、実施例18で用いる核酸の構造を示す。図50Aは、HDO(bulge)の構造を示す。図50Bは、HDO(ssHDO)の構造を示す。図50Cは、PEG linker ssHDOの構造を示す。図50Dは、Bulge plus ssHDOの構造を示す。 図51は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。図51Aは5分間の総移動距離を示す。図51Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図52は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの脳におけるMalat1 RNAの発現レベルを示す。図52Aは、左前頭皮質の結果を示す。図52Bは、右前頭皮質の結果を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図53は、脳組織ホモジネート中で各種核酸剤を7日間インキュベートした後、電気泳動により二本鎖の解離効率を評価した結果を示す。 図54は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコアを示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図55は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。図55Aは5分間の総移動距離を示す。図55Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図56は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコアを示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図57は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。図57Aは5分間の総移動距離を示す。図57Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図58は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスの体重を測定した結果を示す。エラーバーは標準誤差を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図59は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与1日後以降に運動機能を評価した結果を示す。 図60は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの右前頭葉におけるMapt mRNAの発現レベルを示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図61は、脳組織ホモジネート中で各種核酸剤を7日間インキュベートした後、電気泳動により二本鎖の解離効率を評価した結果を示す。 図62は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの投与後30分～4時間における急性期忍容性スコアを示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図63は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。図63Aは5分間の総移動距離を示す。図63Bは最大移動速度を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図64は、各種核酸剤を導入したマウス神経芽細胞腫由来細胞（Neuro2a細胞株）におけるLDH活性及びBace1 mRNA発現レベルを示す。図64Aは、上清における相対的LDH放出レベルを示す。図64Bは、相対的Bace1 mRNAレベルを示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図65は、修正FOBスコアの評価方法を示す。 図66は、各種核酸剤を髄腔内投与したサルを対象として修正FOBスコアを評価した結果を示す。 図67は、各種核酸剤を髄腔内投与したサルを対象として3分間のビデオ動画によって自発的運動時間及びジャンプ回数を測定した結果を示す。
１．二本鎖核酸複合体
１－１．概要
　本発明の第１態様は二本鎖核酸複合体である。本発明の二本鎖核酸複合体は第1核酸鎖及び第2核酸鎖を含み、2'-修飾ヌクレオシドを１個以上含む。本発明の二本鎖核酸複合体は、ヒトを含む霊長類の髄液中で安定であり、中枢神経毒性等の毒性が低減されている。
１－２．用語の定義
　本明細書において、標的遺伝子の「転写産物」とは、本発明の核酸複合体の直接的な標的となり、かつRNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAをいう。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNA（成熟mRNA、mRNA前駆体、塩基修飾を受けていないmRNA等を含む）、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)、ロングノンコーディングRNA（lncRNA）、ナチュラルアンチセンスRNAを含み得る。
　本明細書において「標的遺伝子」とは、本発明の二本鎖核酸複合体のアンチセンス効果により、その転写産物又は翻訳産物の発現量が抑制若しくは亢進され得る、その転写産物又は翻訳産物の機能が阻害され得る、又はステリックブロッキング、スプライシングスイッチ、RNA編集、エクソンスキッピング若しくはエクソンインクルージョンが誘導され得る遺伝子である。標的遺伝子の種類は、生体内で発現する限り特に限定されないが、例えば、本発明に係る二本鎖核酸複合体を導入する生物由来の遺伝子、例えば、様々な疾患において、その発現が増加する遺伝子が挙げられる。例えば、スカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1：本明細書では、しばしば「SR-B1」と表記する）遺伝子、転移関連肺腺癌転写産物1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1：本明細書では、しばしば「Malat1」と表記する）遺伝子、微小管結合タンパク質タウ（microtubule-associated protein tau：本明細書では、しばしば「Mapt」と表記する）遺伝子、β-セクレターゼ1(beta-secretase 1：本明細書では、しばしば「BACE1」と表記する)遺伝子、DMPK(dystrophia myotonica-protein kinase)遺伝子、及びジストロフィン遺伝子等が挙げられる。
　本明細書において「標的転写産物」とは、本発明の核酸複合体の直接的な標的となり、かつRNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAをいう。一般的には「標的遺伝子の転写産物」が該当する。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNA（成熟mRNA、mRNA前駆体、塩基修飾を受けていないmRNA等を含む）、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)、ロングノンコーディングRNA（lncRNA）、ナチュラルアンチセンスRNAを含み得る。標的遺伝子の転写産物として、例えば、SR-B1遺伝子の転写産物であるSR-B1 mRNA、Mapt遺伝子の転写産物であるMapt mRNA、BACE1遺伝子の転写産物であるBACE1 mRNA、Malat1遺伝子の転写産物であるMalat1ノンコーディングRNA、DMPK遺伝子の転写産物であるDMPK mRNA、及びジストロフィン遺伝子の転写産物であるジストロフィン mRNA又はその前駆体（pre-mRNA）が挙げられる。
　標的転写産物の具体例として、Dystrophin pre-mRNA(GenBankアクセッション番号:NC_000086.7)のエクソン23/イントロン23境界領域、例えば83803482位～83803566位、例えば83803512位～83803536位が挙げられる。標的転写産物の別の具体例として、配列番号7にマウスDMPK mRNAの塩基配列を、配列番号8にヒトDMPK mRNAの塩基配列を示す。なお、配列番号7～8は、いずれもmRNAの塩基配列をDNAの塩基配列に置き換えている。これらの遺伝子及び転写産物の塩基配列情報は、例えばNCBI(米国国立生物工学情報センター)データベース等の公知のデータベースから入手できる。
　本明細書において「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）」又は「アンチセンス核酸」とは、標的転写産物(主として標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な(すなわち、相補的な)塩基配列を含み、標的転写産物にアンチセンス効果をもたらすことができる、一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。本発明の二本鎖核酸複合体では、第1核酸鎖がASOとして機能し、その標的領域は、3'UTR、5'UTR、エクソン、イントロン、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、又は他のいずれの核酸領域を含んでいてもよい。標的転写産物の標的領域は、少なくとも8塩基長、例えば、10～35塩基長、12～25塩基長、13～20塩基長、14～19塩基長、若しくは15～18塩基長、又は13～22塩基長、16～22塩基長、若しくは16～20塩基長とすることができる。
　「アンチセンス効果」とは、ASOが標的転写産物（例えばRNAセンス鎖）にハイブリダイズすることによって、その標的転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。「標的転写産物の発現又は編集を調節する」とは、標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、翻訳の阻害、RNA編集、スプライシング機能改変効果（例えばスプライシングスイッチ、エクソンインクルージョン、エクソンスキッピング等）、又は転写産物の分解をいう。例えば、標的遺伝子の転写後阻害では、ASOとしてRNAオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、ASOは標的遺伝子の転写産物であるmRNAとアニーリングによって部分的二本鎖を形成する。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされた標的タンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される（ステリックブロッキング）。一方、ASOとしてDNAを含むオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がRNase Hによって認識される結果、標的遺伝子のmRNAが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される。さらに、アンチセンス効果は、mRNA前駆体におけるイントロンを標的としてももたらされ得る。さらに、アンチセンス効果は、miRNAを標的としてももたらされ得る。この場合、そのmiRNAの機能阻害により、当該miRNAが通常発現を制御している遺伝子の発現が増加し得る。一実施形態で、標的転写産物の発現調節は、標的転写産物量の低下であってもよい。
　アンチセンス効果の測定は、例えば、被験核酸化合物を被検体(例えばマウス)に投与し、例えば数日後(例えば2～7日後)に、被験核酸化合物によって提供されるアンチセンス効果により発現が調節される標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(量)(例えば、mRNA量若しくはマイクロRNA等のRNA量、cDNA量、タンパク質量等)を測定することによって、実施することができる。
　例えば、測定された標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベルが、陰性対照(例えばビヒクル投与)と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、又は少なくとも40％減少している場合に、被験核酸化合物がアンチセンス効果(例えば、標的転写産物量の低下)をもたらし得ることが示される。
　核酸鎖における非天然ヌクレオチドの数、種類及び位置は、核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果等に影響を及ぼし得る。修飾の選択は、標的遺伝子等の配列によって異なり得るが、当業者であれば、アンチセンス法に関連する文献(例えば、WO 2007/143315、WO 2008/043753、及びWO 2008/049085)の説明を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。さらに、修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果が測定される場合、このようにして得られた測定値が修飾前の核酸複合体の測定値と比較して有意に低くない場合(例えば、修飾後に得られた測定値が、修飾前の核酸複合体の測定値の70％以上、80％以上又は90％以上である場合)、関連修飾を評価することができる。
　本明細書において「標的遺伝子の翻訳産物」とは、本発明の核酸複合体の直接的な標的となる前記標的転写産物又は標的遺伝子の転写産物の翻訳によって合成される任意のポリペプチド又はタンパク質をいう。
　本明細書において、「アプタマー」とは、細胞内、細胞膜上、又は細胞外、例えば細胞膜上又は細胞外の特定の標的分子と特異的に結合する核酸分子をいう。アプタマーは、当該分野で公知の方法、例えば、SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法を用いた試験管内選別法により作製することができる。
　本明細書において、「デコイ」とは、転写因子（例えばNF-kB）の結合部位の配列又は類似の配列を有する核酸を指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制（転写活性化因子であれば転写を抑制、転写抑制因子であれば転写を促進）するものをいう。デコイ核酸は、標的となる転写因子の結合配列の情報に基づいて容易に設計することができる。
　本明細書において、「bait(ベイト)」とは、細胞内で特定の標的分子と特異的に結合する核酸分子であって、標的分子の機能を修飾するものをいう。baitと相互作用する標的を、「prey(プレイ)」ともいう。
　本明細書中で使用される用語「核酸」又は「核酸分子」は、モノマーのヌクレオチド又はヌクレオシドを指してもよいし、複数のモノマーからなるオリゴヌクレオチドを意味してもよく、またポリマーであればポリヌクレオチドを意味する。「天然核酸」とは、自然界に存在する核酸をいう。天然核酸には後述の天然ヌクレオシドや天然ヌクレオチド等が含まれる。「非天然核酸」又は「人工核酸」とは、天然核酸以外の任意の核酸を指す。非天然核酸又は人工核酸には、後述の非天然ヌクレオシドや非天然ヌクレオチド等が含まれる。
　本明細書において「核酸鎖」又は単なる「鎖」とは、ヌクレオシド間結合によって連結された2以上のヌクレオシドを意味し、例えばオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであってもよい。核酸鎖は、例えば自動合成装置を使用した化学的合成法により、又はポリメラーゼ、リガーゼ、又は制限反応による酵素的工程により全長鎖又は部分鎖を作製することができる。核酸鎖は、天然ヌクレオチド及び／又は非天然ヌクレオチドを含み得る。
　「ヌクレオシド」とは、一般に塩基及び糖の組み合わせからなる分子をいう。ヌクレオシドの糖部分は、限定はしないが、通常、ペントフラノシル糖で構成され、その具体例としてリボースやデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオシドの塩基部分（核酸塩基）は、通常は、複素環式塩基部分である。限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルや、それ以外の修飾核酸塩基（修飾塩基）が挙げられる。
　「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、通常、糖の2'位、3'位、又は5'位のヒドロキシル基にリン酸基が連結されている。
　「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個～数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。また「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドよりも多数のヌクレオチドが前記共有結合によって数十個以上、好ましくは数百個以上連結することによって形成される直鎖状のポリマーをいう。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般にヌクレオシド間結合を形成するとみなされる。
　本明細書において「天然ヌクレオシド」とは、自然界に存在するヌクレオシドをいう。例えば、リボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はウラシル等の塩基からなるリボヌクレオシドや、デオキシリボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はチミン等の塩基からなるデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。なお、RNA中に見られるリボヌクレオシド、及びDNA中に見られるデオキシリボヌクレオシドを、本明細書では、しばしば、それぞれ「DNAヌクレオシド」及び「RNAヌクレオシド」と称する。
　本明細書において「天然ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドで、前記天然ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。例えば、リボヌクレオシドにリン酸基が結合した、RNAの構成単位として知られるリボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合した、DNAの構成単位として知られるデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
　本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドを指し、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、及び修飾核酸塩基のいずれか1つ以上を有するヌクレオチドを意味する。ここでいう「ヌクレオチド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において、ヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造体を含む。ヌクレオチド模倣体としては、例えば、ペプチド核酸又はモルホリノ核酸(-N(H)-C(=O)-O-又は他の非ホスホジエステル結合によって結合されるモルホリノ)が挙げられる。ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid、PNA）は、糖の代わりにN-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合した主鎖を有するヌクレオチド模倣体である。本明細書において非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の望ましい特性を有する。したがって、天然ヌクレオチドよりも好ましい。
　本明細書において「非天然ヌクレオシド」とは、天然ヌクレオシド以外の任意のヌクレオシドをいう。例えば、修飾ヌクレオシド及びヌクレオシド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
　本明細書において「模倣体」とは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間結合を置換する官能基を指す。一般に、模倣体は、糖又は糖－ヌクレオシド間結合の組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選択される標的に対するハイブリダイゼーションのために維持される。ここでいう「ヌクレオシド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において糖を置換するために、又は糖及び塩基を置換するために、又はオリゴマー化合物を構成するモノマーサブユニット間の結合等を置換するために使用される構造体を含む。「オリゴマー化合物」とは、核酸分子のある領域に少なくともハイブリダイズ可能な連結したモノマーサブユニットのポリマーを意味する。ヌクレオシド模倣体としては、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環式又は三環式糖模倣体、例えば、非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣体が挙げられる。
　「修飾糖」とは、天然糖部分(すなわち、DNA(2'-H)又はRNA(2'-OH)中に認められる糖部分)からの置換及び／又は任意の変化を有する糖を指し、「糖修飾」とは、天然糖部分からの置換及び／又は任意の変化をいう。核酸鎖は、場合により、修飾糖を含む1つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。「糖修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分を有するヌクレオシドをいう。かかる糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合親和性の増加、又は他の何らかの有益な生物学的特性を核酸鎖に付与し得る。特定の実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定するものではないが、置換基(5'及び2'置換基を含む)の付加、非ジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸(架橋核酸、BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、又はC(R1)(R2)(R、R1及びR2は、それぞれ独立して、H、C1-C12アルキル、又は保護基を表す)での置換、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
　糖修飾ヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、5'-ビニル、5'-メチル(R又はS)、5'-アリル(R又はS)、4'-S、2'-F(2'-フルオロ基)、2'-OCH3(2'-O-Me基若しくは2'-O-メチル基)、2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]（2'-O-MCE基）、及び2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE若しくは2-O(CH2)2OCH3）置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。2'位の置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、-O-アリル、-O-C1-C10アルキル、-OCF3、-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、及びO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)から選択することができ、各Rm及びRnは、独立して、H又は置換若しくは非置換C1-C10アルキルである。「2'-修飾糖」は、2'位で修飾されたフラノシル糖を意味する。2'-修飾糖を含むヌクレオシドを「2'-修飾ヌクレオシド」又は「2'-糖修飾ヌクレオシド」と称することもある。
　「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式糖部分を含む核酸は、一般に架橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)と称される。二環式糖部分を含むヌクレオシドは、「架橋ヌクレオシド」、「架橋型の非天然ヌクレオシド」、又は「BNAヌクレオシド」と称することもある。図1に架橋核酸を一部例示する。
　二環式糖は、2'位の炭素原子及び4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている糖であってよい。二環式糖の例は当業者に公知である。二環式糖を含む核酸(BNA)又はBNAヌクレオシドの1つのサブグループは、4'-(CH2)p-O-2'、4'-(CH2)p-CH2-2'、4'-(CH2)p-S-2'、4'-(CH2)p-OCO-2'、4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'[式中、p、m及びnは、それぞれ1～4の整数、0～2の整数、及び1～3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基(蛍光若しくは化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内又は核内局在化シグナルペプチド等)を表す]により架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有すると説明することができる。さらに、特定の実施形態によるBNA又はBNAヌクレオシドに関し、3'位の炭素原子上のOR2置換基及び5'位の炭素原子上のOR1置換基において、R1及びR2は、典型的には水素原子であるが、互いに同一であっても異なっていてもよく、さらにまた、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、又はP(R4)R5[ここで、R4及びR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1～5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1～5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1～6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、又は1～5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す]であってもよい。このようなBNAの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA(LNA(Locked Nucleic Acid(登録商標)、2',4'-BNAとしても知られている)（例えば、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA若しくはβ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA）、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNA(ENAとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNA(2',4'-BNANCとしても知られている；R=Hは2',4'-BNANC[N-H]、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me])、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(cEt BNAとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA(cMOE BNAとしても知られている)、アミドBNA（アミド架橋型核酸）若しくは(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)(AmNAとしても知られている；図1のR=HはAmNA[N-H]、R=MeはAmNA[N-Me]))、グアニジンBNA(GuNA（例、図1のR=HはGuNA[N-H]、R=MeはGuNA[N-Me]）としても知られる)、アミンBNA(2'-Amino-LNAとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換体)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸(scpBNAとしても知られている)及び当業者に公知の他のBNAが挙げられる。このようなBNAヌクレオシドの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド(LNAヌクレオシド、2',4'-BNAヌクレオシドとしても知られている)（例、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド、β-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド)、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNAヌクレオシド(ENAヌクレオシドとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNAヌクレオシド、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNAヌクレオシド、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNAヌクレオシド(2',4'-BNANCヌクレオシドとしても知られている；R=Hは2',4'-BNANC[N-H]ヌクレオシド、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me]ヌクレオシド)、2',4'-BNAcocヌクレオシド、3'-アミノ-2',4'-BNAヌクレオシド、5'-メチルBNAヌクレオシド、(4'-CH(CH3)-O-2')BNAヌクレオシド(cEtヌクレオシドとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNAヌクレオシド(cMOEヌクレオシドとしても知られている)、アミドBNAヌクレオシド若しくは(4'-C(O)-N(R)-2')BNAヌクレオシド(R=H、Me)(AmNAヌクレオシドとしても知られている；図1のR=HはAmNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはAmNA[N-Me]ヌクレオシド))、グアニジンBNAヌクレオシド(GuNAヌクレオシド（例、図1のR=HはGuNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはGuNA[N-Me]ヌクレオシド）としても知られる)、アミンBNAヌクレオシド(2'-Amino-LNAヌクレオシドとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換ヌクレオシド)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋ヌクレオシド(scpBNAヌクレオシドとしても知られている)及び当業者に公知の他のBNAヌクレオシドが挙げられる。
　本明細書において、「カチオン性ヌクレオシド」は、あるpH（例えば、ヒトの生理学的pH（約7.4）、送達部位（例えば、オルガネラ、細胞、組織、臓器、生物体等）のpH等）において、中性形態（リボヌクレオシドの中性形態等）と比較して、カチオン形態として存在する修飾ヌクレオシドである。カチオン性ヌクレオシドはヌクレオシドの任意の位置に１つ以上のカチオン性修飾基を含んでもよい。一実施形態では、カチオン性ヌクレオシドは、2'-Amino-LNAヌクレオシド(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換ヌクレオシド)、アミノアルキル修飾ヌクレオシド（例、2'-O-メチル及び4'-CH2CH2CH2NH2置換ヌクレオシド)、GuNAヌクレオシド(例、図3のR=HはGuNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはGuNA[N-Me]ヌクレオシド)等である。メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する二環式ヌクレオシドを、LNAヌクレオシドと称することもある。
　本明細書において「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわち、ホスホジエステル結合)からの置換又は任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指す。修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むヌクレオシド間結合、及びリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合(米国特許登録番号5,955,599記載のメチルホスホトリエステル結合、エチルホスホトリエステル結合)、アルキルホスホネート結合(例、米国特許登録番号5,264,423及び5,286,717記載のメチルホスホネート結合、国際公開第2015/168172号記載のメトキシプロピルホスホネート結合)、アルキルチオホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合（例、以下の式(I)で表される部分構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ）、１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、テトラメチルグアニジン（TMG）部分）を含むヌクレオシド間結合（例、以下の式(II)で表される部分構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ）、国際公開第2016/081600号記載の自己中和核酸(ZON)に用いられるヌクレオシド間結合及びホスホロアミデート結合が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子を硫黄原子に置換したヌクレオシド間結合を指す。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は周知である。修飾ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性が天然に存在するヌクレオシド間結合よりも高い結合であることが好ましい。
　ヌクレオシド間結合がキラル中心を有する場合、ヌクレオシド間結合はキラル制御されたものであってもよい。「キラル制御された」とは、キラル中心、例えばキラル結合リンに関して単一のジアステレオマーで存在することを意図する。キラル制御されたヌクレオシド間結合は、完全にキラル純粋なものであってもよいし、キラル純度が高いもの、例えば90％de、95％de、98％de、99％de、99.5％de、99.8％de、99.9％de、又はそれ以上のキラル純度を有するものであってよい。本明細書において「キラル純度」は、ジアステレオマーの混合物中の1つのジアステレオマーの割合を指し、ジアステレオマー過剰率(％de)として表され、(対象のジアステレオマー－その他のジアステレオマー)／(総ジアステレオマー)×100(％)として定義される。
　例えば、ヌクレオシド間結合は、Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合、１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、テトラメチルグアニジン（TMG）部分；例えばAlexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811を参照のこと）を含むヌクレオシド間結合、及び／又は環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合であってよい。キラル制御されたヌクレオシド間結合の調製方法は公知であり、例えばRp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Naoki Iwamoto et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48(3), 496-9、Natsuhisa Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307-8317、Natsuhisa Oka et al.,J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2016, 81, 2753-2762、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2012, 77, 7913-7922に記載の方法に従って合成することができる。Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合も公知であり、例えばNaoki Iwamoto et al., Nat. Biotechnol,. 2017, 35(9), 845-851、Anastasia Khvorova et al., Nat. Biotechnol., 2017, 35(3), 238-248に記載されるような効果を奏することが知られている。例えば、一実施形態において、Sp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Rp配置のものよりも安定であり、及び／又はSp配置にキラル制御されたASOは、RNase H1による標的RNA切断を促進し、生体内でより持続的な応答をもたらす。１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、TMG部分）を含むヌクレオシド間結合の調製方法は公知であり、例えばAlexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811に記載の方法に従って合成することができる。
　本明細書中で使用される用語「核酸塩基」又は「塩基」とは、核酸を構成する塩基成分(複素環部分)であって、主としてアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルが知られる。本明細書において「核酸塩基」又は「塩基」は、特に断りのない場合、修飾又は非修飾の核酸塩基（塩基）のいずれをも包含する。したがって、特に断りのない場合、プリン塩基は修飾又は非修飾のプリン塩基のいずれであってもよい。また、特に断りのない場合、ピリミジン塩基は修飾又は非修飾のピリミジン塩基のいずれであってもよい。
　「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル以外のあらゆる核酸塩基を意味する。「非修飾核酸塩基」又は「非修飾塩基」(天然核酸塩基)とは、プリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を意味する。修飾核酸塩基の例としては、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン又はN4-メチルシトシン；N6-メチルアデニン又は8-ブロモアデニン；2-チオ-チミン；並びにN2-メチルグアニン又は8-ブロモグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。修飾核酸塩基は、好ましくは、5-メチルシトシンである。
　本明細書中で使用される用語「相補的」とは、核酸塩基が水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対(天然型塩基対)又は非ワトソン-クリック塩基対(フーグスティーン型塩基対等)を形成し得る関係を意味する。本発明において、第1核酸鎖中のアンチセンスオリゴヌクレオチド領域は、標的転写産物(例えば、標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。第1核酸鎖中のアンチセンスオリゴヌクレオチド領域は、塩基配列が相補的である場合に(典型的には、塩基配列が標的転写産物の少なくとも一部の塩基配列に相補的である場合に)、標的転写産物にハイブリダイズすることができる。同様に、第2核酸鎖中の相補的領域は、第1核酸鎖の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。第2核酸鎖中の相補的領域は、第1核酸鎖の少なくとも一部と塩基配列が相補的である場合に、アニールすることができる。塩基配列の相補性は、BLASTプログラム等を使用することによって決定することができる。当業者であれば、鎖間の相補度を考慮して、2本の鎖がアニール又はハイブリダイズし得る条件(温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。またさらに、当業者であれば、例えば標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
　ハイブリダイゼーション条件は、例えば、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件等の様々なストリンジェントな条件であってもよい。低ストリンジェントな条件は、比較的低温で、かつ高塩濃度の条件、例えば、30℃、2×SSC、0.1％SDSであってよい。高ストリンジェントな条件は、比較的高温で、かつ低塩濃度の条件、例えば、65℃、0.1×SSC、0.1％SDSであってよい。温度及び塩濃度等の条件を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調整できる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含む。
　本明細書において「毒性」とは、例えば、死、痛み、振戦、けいれん、運動障害、認知機能障害、意識障害、全身倦怠感、疲労感、嘔気、嘔吐、めまい、しびれ、ふらつきなど、被検体に好ましくない他覚的若しくは自覚的症状又は機能異常を引き起こす作用をいう。毒性は、いずれかの臓器での毒性であってもよい。毒性は、神経毒性であってもよい。
　本明細書において「神経毒性」とは、中枢神経組織及び末梢神経組織を含む神経組織に損傷を引き起こし、神経系の正常な活動を妨げる作用を指す。神経毒性は、死亡、呼吸異常、心血管異常、頭痛、嘔気もしくは嘔吐、無反応もしくは低反応、意識障害、精神障害、性格変化、幻覚、妄想、認知機能障害、姿勢異常、不随意運動、震え、けいれん、活動過剰運動機能障害、麻痺、感覚障害または自律神経機能障害から選択される症状を引き起こし得る。神経毒性は、急性神経毒性であってもよい。急性神経毒性は、投与から1、3、6、9、12、24または48時間以内に生じる神経毒性であり得る。毒性は、例えば、後述の実施例に記載するように、急性期忍容性スコア、副作用イベント率または死亡率などによって評価することができる。
　本明細書において「中枢神経毒性」とは、神経組織のうち少なくとも中枢神経組織に損傷を引き起こし、神経系の正常な活動を妨げる作用をいう。
　本明細書で「被検体」とは、本発明の二本鎖核酸複合体又は医薬組成物を適用する対象をいう。被検体は、個体の他、器官、組織、及び細胞を含む。被検体が個体の場合、ヒトを含むあらゆる動物が該当し得る。例えば、ヒト以外では、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等が挙げられる。限定はしないが、被検体は、標的転写産物の発現量を減少させる必要がある個体や、疾患の治療又は予防が必要な個体であってもよい。
１－３．構成
　本発明の二本鎖核酸複合体は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む。各核酸鎖の具体的な構成を以下に示す。
　本発明の二本鎖核酸複合体において、第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、標的遺伝子又はその転写産物に対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、2'-修飾ヌクレオシドを1個以上含む。
　第2核酸鎖に含まれる、2'-修飾ヌクレオシドの数は少なくとも1個であり、第2核酸鎖を構成する全てのヌクレオシドの数（すなわち、第2核酸鎖の塩基長）以下である。第2核酸鎖に含まれる、2'-修飾ヌクレオシドの具体的な数は、例えば2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、又は10個以上であってもよく、30個以下、25個以下、20個以下、15個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、又は2個以下であってもよい。例えば、第2核酸鎖において2'-修飾ヌクレオシドの数は、1～30個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、又は1～6個であってもよい。例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個であってもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖中のヌクレオシドの1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、若しくは99％以上、かつ／又は100％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、若しくは5％以下が2'-修飾ヌクレオシドである。例えば、10％～90％、20％～80％、30％～70％、又は40％～60％が2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。
　第2核酸鎖に含まれる2'-修飾ヌクレオシド以外のヌクレオシドは、天然ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド等の非天然ヌクレオシド、又はその任意の組合せであってもよい。第2核酸鎖に含まれる2'-修飾ヌクレオシド以外のヌクレオシドの数は、限定しないが、例えば、1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、又は10個以上であってもよく、例えば1～40個、1～30個、1～20個、1～15個、1～12個、1～10個、1～8個、又は1～6個であり、例えば1～5個、例えば1個、2個、3個、4個、又は5個であってもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、2'-修飾ヌクレオシドを1個含む。別の実施形態では、第2核酸鎖を構成するヌクレオシドの全てが2'-修飾ヌクレオシドである。例えば、第2核酸鎖において、第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。さらなる実施形態において、第2核酸鎖は、2'-修飾ヌクレオシドを1個以上全部未満含む。本明細書において、第2核酸鎖が2'-修飾ヌクレオシドを「全部未満含む」とは、第2核酸鎖が2'-修飾ヌクレオシド以外の任意のヌクレオシドを少なくとも1個含むことをいう。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、5’末端に位置する1個又は連続する複数の2'-修飾ヌクレオシドを含む。本明細書において「連続する複数の2'-修飾ヌクレオシドを含む」とは、任意のヌクレオシド間結合で連結された複数の2'-修飾ヌクレオシドを含むことを意味する。例えば、第2核酸鎖は、5’末端に位置する１個、又は連続する2～12個、2～10個、2～8個、2～6個、2～5個、2～4個、若しくは2～3個、例えば2個、3個、若しくは4個の2'-修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、3’末端に位置する1個又は連続する複数の2'-修飾ヌクレオシドを含む。例えば、第2核酸鎖は、3’末端に位置する１個、又は連続する2～12個、2～10個、2～8個、2～6個、2～5個、2～4個、若しくは2～3個、例えば2個、3個、若しくは4個の2'-修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　さらなる実施形態では、第2核酸鎖は、5’末端に位置する1個又は連続する複数の2'-修飾ヌクレオシド、及び3’末端に位置する1個又は連続する複数の2'-修飾ヌクレオシドを含む。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、5’末端及び3’末端以外の位置に2'-修飾ヌクレオシドを含む。本明細書において、第2核酸鎖が「5’末端及び3’末端以外の位置に2'-修飾ヌクレオシドを含む」とは、上述の5’末端に位置する1個又は連続する複数の2'-修飾ヌクレオシド、及び3’末端に位置する1個又は連続する複数の2'-修飾ヌクレオシド以外の位置に2'-修飾ヌクレオシドを含むことを意味する。例えば、第2核酸鎖は、5’末端及び3’末端以外の位置に1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～12個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、又は1～3個、例えば1個又は2個の2'-修飾ヌクレオシドを含む。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、2'-修飾ヌクレオシド以外のヌクレオシドを1個以上含む。さらなる実施形態では、第2核酸鎖において（例えば、第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる領域において）2'-修飾ヌクレオシド以外のヌクレオシドの全てがデオキシリボヌクレオシドであり得る。
　一実施形態において、2'-修飾ヌクレオシドは、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド及び／又は2'-O-メチル修飾ヌクレオシドである。2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドは、以下の式（III）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で示される。また、2'-O-メチル修飾ヌクレオシドは、以下の式（IV）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で示される。一実施形態において、2'-修飾ヌクレオシドは、2'-O-メチル修飾ヌクレオシドである。より好ましい実施形態では、2'-修飾ヌクレオシドは、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドである。
　一実施形態において、第1核酸鎖では、ヌクレオシドの全てが非天然ヌクレオシド又は修飾ヌクレオシドであってもよい。さらなる実施形態において、第1核酸鎖では、ヌクレオシドの全てが2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。なおさらなる実施形態では、第1核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドであってもよい。
　第1核酸鎖は、標的転写産物にハイブリダイズしている場合に、RNase Hによって認識される少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、又は少なくとも7個の連続するヌクレオシドを含むことができる。通常、4～20塩基、5～16塩基、又は6～12塩基の連続するヌクレオシドを含む領域であればよい。RNase Hによって認識されるヌクレオシドとして、例えば天然型デオキシリボヌクレオシドを用いることができる。修飾されたデオキシリボヌクレオシド、及び他の塩基を含む好適なヌクレオシドは、当該分野において周知である。また、リボヌクレオシド等の、2'位にヒドロキシ基を有するヌクレオシドが、前記ヌクレオシドとして不適当であることも知られている。「少なくとも4個の連続するヌクレオシド」を含むこの領域への利用に関し、ヌクレオシドの適合性を容易に決定することができる。一実施形態で、第1核酸鎖は、少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み得る。
　一実施形態において、第1核酸鎖のヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含むか又はこれからなり、例えば第1核酸鎖のヌクレオシドの70%以上、80%以上、90%以上、又は95%以上がデオキシリボヌクレオシドである。
　一実施形態において、第1核酸鎖はギャップマー（gapmer)であってもよい。本明細書において「ギャップマー」とは、原則として、中央領域（DNAギャップ領域）と、その5'末端及び3'末端に直接配置されたウイング領域（それぞれ、5'ウイング領域及び3'ウイング領域と称する）からなる一本鎖核酸をいう。DNAギャップ領域の長さは、13～22塩基長、16～22塩基長、若しくは16～20塩基長、又は4～20塩基長、5～18塩基長、6～16塩基長、7～14塩基長、若しくは8～12塩基長であってもよい。ギャップマーにおける前記中央領域は少なくとも3個又は少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み、前記ウイング領域は少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含む。限定はしないが、ウイング領域に含まれる非天然ヌクレオシドは、通常、天然ヌクレオシドよりもRNAとの結合力が高く、核酸分解酵素(ヌクレアーゼ等)に対する耐性の高い性質を有する。ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「BNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドの数は、少なくとも1個であり、例えば、2又は3個であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドは、5'ウイング領域及び3'ウイング領域内に連続又は非連続に存在していてもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン）をさらに含むことができる。架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである場合、前記ギャップマーを「LNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがペプチド核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「ペプチド核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「モルホリノ核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域の塩基長は、それぞれ独立して、少なくとも2塩基長、例えば、2～10塩基長、2～7塩基長、又は3～5塩基長であればよい。一実施形態において、5'ウイング領域及び／又は3'ウイング領域は、非天然ヌクレオシドを少なくとも1種含んでいればよく、天然ヌクレオシドをさらに含んでいてもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域は、例えば、ホスホロチオエート結合等の修飾ヌクレオシド間結合で連結された非天然ヌクレオシド、例えばLNAヌクレオシド等の架橋ヌクレオシドや、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド等の2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。
　ギャップマーにおいて中央領域（DNAギャップ領域）は、少なくとも3個又は少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み、ウイング領域（5'ウイング領域及び3'ウイング領域）は少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含む。ギャップマーにおいて中央領域（DNAギャップ領域）とウイング領域との境界位置は、当業者であればヌクレオシドの配列から容易に判定することができる。例えば中央領域は、RNase H1によって認識され得る領域として機能的に定義することができる。ここで「RNase H1によって認識され得る」とは、ギャップマーが標的RNAと結合した場合に、ギャップマーと対合した標的RNA中の配列がRNase H1によって切断され得ることをいう。したがって、ギャップマーにおいてRNase H1によって認識され得る領域を中央領域、RNase H1によって認識されない領域をウイング領域（5'ウイング領域及び3'ウイング領域）として、境界位置を決定することができる。なお、本明細書において、5'ウイング領域及び3'ウイング領域において中央領域と隣接したヌクレオシドは非天然ヌクレオシドとし、中央領域において5'ウイング領域又は3'ウイング領域と隣接したヌクレオシドは天然ヌクレオシドとする。
　前記ギャップマーを構成する第1核酸鎖は、5'末端から順に、2～7塩基長若しくは3～5塩基長（例えば2又は3塩基長）の架橋ヌクレオシド、4～15塩基長若しくは8～12塩基長（例えば8又は10塩基長）のリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、及び2～7塩基長若しくは3～5塩基長（例えば2又は3塩基長）の架橋ヌクレオシドから構成されていてもよい。
　なお、ウイング領域を5'末端側又は3'末端側のいずれか一方にのみ有する核酸鎖は、当該分野では「ヘミギャップマー」と呼ばれるが、本明細書においては、ヘミギャップマーもギャップマーに包含されるものとする。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に2'-修飾ヌクレオシドを含む。さらなる実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドであり得る。2'-修飾ヌクレオシドは、例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド又は2'-O-メチル修飾ヌクレオシドであってもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖では、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、プリン塩基を含むヌクレオシドはリボヌクレオシドであってもよい。例えば、第2核酸鎖では、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、プリン塩基を含む全てのヌクレオシドがリボヌクレオシドであり得る。
　一実施形態において、第2核酸鎖では、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、ピリミジン塩基を含むヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドであってもよい。例えば、第2核酸鎖では、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、ピリミジン塩基を含む全てのヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドであり得る。
　さらなる実施形態において、第2核酸鎖では、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、プリン塩基を含む全てのヌクレオシドがリボヌクレオシドであり、かつピリミジン塩基を含む全てのヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドであり得る。
　好ましい実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド又は2'-O-メチル修飾ヌクレオシド）であり、さらに第2核酸鎖では、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、プリン塩基を含む全てのヌクレオシドがリボヌクレオシドであり、かつピリミジン塩基を含む全てのヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドであり得る。
　一実施形態において、(i)第1核酸鎖における少なくとも1個のグアノシンヌクレオシド、(ii)当該グアノシンヌクレオシドの5'末端側に隣接するヌクレオシド、(iii)当該グアノシンヌクレオシドの3'末端側に隣接するヌクレオシド、又は(iv)上記(i)～(iii)の任意の組合せに相補的である第2核酸鎖におけるヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。さらなる実施形態では、(i)第1核酸鎖における全てのグアノシンヌクレオシド、(ii)当該グアノシンヌクレオシドの5'末端側に隣接するヌクレオシド、(iii)当該グアノシンヌクレオシドの3'末端側に隣接するヌクレオシド、又は(iv)上記(i)～(iii)の任意の組合せに相補的である第2核酸鎖におけるヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。
　一実施形態では、(i)第1核酸鎖の3’ウイング領域及び／又は5'ウイング領域における少なくとも1個のグアノシンヌクレオシド、(ii)当該グアノシンヌクレオシドの5'末端側に隣接するヌクレオシド、(iii)当該グアノシンヌクレオシドの3'末端側に隣接するヌクレオシド、又は(iv)上記(i)～(iii)の任意の組合せに相補的である第2核酸鎖におけるヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。さらなる実施形態では、(i)第1核酸鎖の3’ウイング領域及び／又は5'ウイング領域における全てのグアノシンヌクレオシド、(ii)当該グアノシンヌクレオシドの5'末端側に隣接するヌクレオシド、(iii)当該グアノシンヌクレオシドの3'末端側に隣接するヌクレオシド、又は(iv)上記(i)～(iii)の任意の組合せに相補的である第2核酸鎖におけるヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖において、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドは、(a)デオキシリボヌクレオシド、(b)デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシド、(c)デオキシリボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、又は(d)リボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、又は(e)デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、及び2'-修飾ヌクレオシドである。
　一実施形態では、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドであり、かつ第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであり得る。
　一実施形態では、第2核酸鎖においてピリミジン塩基を含むヌクレオシドの少なくとも1個が2'-修飾ヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドであってもよい。さらなる実施形態では、第2核酸鎖はピリミジン塩基を含む天然リボヌクレオシドを含まず、例えば第2核酸鎖においてピリミジン塩基を含むヌクレオシドの全てが2'-修飾ヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドであってもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖は、2'-修飾ヌクレオシドに加えて、2'-修飾ヌクレオシド以外の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、第2核酸鎖は、上述の式(IV)で示される2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、以下の式（V）で示されるscpBNAヌクレオシド、以下の式（VI）で示されるAmNAヌクレオシド、又はオキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNAヌクレオシド(2',4'-BNANCヌクレオシドとしても知られている；R=Hは2',4'-BNANC[N-H]ヌクレオシド、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me]ヌクレオシド)を少なくとも１個含んでもよい。
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 　（式中、Ｒは水素原子又はメチル基を示す。）
　上記式（V）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドは、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸であり、本明細書では主として「scpBNA」と表記する。また、上記式（VI）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドは、アミドBNA（アミド架橋型核酸）であり、(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)と表記することもできるが、本明細書では主として「AmNA」と表記する。上記式（VI）中、Ｒは水素原子又はメチル基のいずれであってもよい。本明細書において、特に断りのない場合、Ｒは水素原子又はメチル基のいずれであってもよいが、両者を区別する場合には、Ｒが水素原子の場合にはAmNA[N-H]、Ｒがメチル基の場合にはAmNA[N-Me]と表記することもできる。
　本発明の二本鎖核酸複合体において第1核酸鎖は、ミックスマー（mixmer）であってもよい。本明細書において「ミックスマー」とは、周期的又は無作為セグメント長の交互型の天然ヌクレオシド及び非天然ヌクレオシドを含み、かつ4個以上の連続するデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドを含まない核酸鎖をいう。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドであり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「BNA／DNAミックスマー」と称する。前記架橋ヌクレオシドは、上記式（V）又は式（VI）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドであってもよい。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがペプチド核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「ペプチド核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「モルホリノ核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーは、2種のヌクレオシドのみを含むようには制限されない。ミックスマーは、天然若しくは修飾のヌクレオシド又はヌクレオシド模倣体であるか否かに関わらず、任意の数の種類のヌクレオシドを含むことができる。例えば、架橋ヌクレオシド(例えば、LNAヌクレオシドや上記式（V）又は式（VI）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド)により分離された1又は2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを有してもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)をさらに含んでもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の中央領域における上記の少なくとも4個の連続するヌクレオシド(例えばデオキシリボヌクレオシド）に相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含んでいてもよい。第2核酸鎖が、第1核酸鎖と部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖を形成し、RNaseHによって認識され切断されるようにするためである。第2核酸鎖中の少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドは、好ましくは、天然に存在するヌクレオシド間結合、すなわちホスホジエステル結合によって連結される。
　さらなる実施形態では、第2核酸鎖は、上記の少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドに加えて、少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドをさらに含んでもよい。当該少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドは、第1核酸鎖に相補的であり、第1核酸鎖の中央領域に相補的な領域に含まれてもよい。当該少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドは、上記の少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドの5'側又は3'側のいずれに位置してもよく、5'側及び3'側の両方に位置してもよい。また、当該少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドは、2個、3個、4個、5個、又は6個以上の連続するデオキシリボヌクレオシドであってもよい。
　第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端、又は両末端）から少なくとも1個、少なくとも2個（例えば2個）、少なくとも3個、又は少なくとも4個のヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドであってもよい。修飾ヌクレオシドは、修飾糖及び／又は修飾核酸塩基を含んでいてもよい。修飾糖は、2'-修飾糖（例えば、2'-O-メチル基を含む糖）であってよい。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンとすることもできる。
　第2核酸鎖は、5'末端から順に、2～7塩基長若しくは3～5塩基長（例えば2又は3塩基長）の修飾ヌクレオシド（例えば、2'-修飾糖を含む修飾ヌクレオシド）、4～15塩基長若しくは8～12塩基長（例えば8又は10塩基長）の(場合により、修飾ヌクレオシド間結合で連結された)リボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、及び2～7塩基長若しくは3～5塩基長（例えば2又は3塩基長）の修飾ヌクレオシド（例えば、2'-修飾糖を含む修飾ヌクレオシド)から構成されていてもよい。この場合、第1核酸鎖は、ギャップマーであってもよい。
　第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、全部又は一部にヌクレオシド模倣体又はヌクレオチド模倣体を含んでもよい。ヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸及び／又はモルホリノ核酸であってもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に対して、非相補的塩基、及び／又は1塩基以上の、挿入配列及び／又は欠失を含み得る。第2核酸鎖における非相補的塩基の数は、限定しないが、例えば1～10個、１～9個、１～8個、１～7個、１～6個、１～5個、１～4個、１～3個、１～2個、又は1個又は2個であってもよい。非相補的塩基からなる配列は後述のバルジ構造を形成していてもよい。第2核酸鎖における挿入配列の塩基長数は、限定しないが、例えば1～10個、１～9個、１～8個、１～7個、１～6個、１～5個、１～4個、１～3個、１～2個、又は1個又は2個であってもよい。挿入配列は後述のバルジ構造を形成する配列であってもよい。第2核酸鎖における欠失の連続する塩基長は、限定しないが、例えば1～10個、１～9個、１～8個、１～7個、１～6個、１～5個、１～4個、１～3個、１～2個、又は1個又は2個であってもよい。第2核酸鎖は、欠失位置に後述のバルジ構造を含んでもよい。
　第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、特に限定されないが、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であってもよい。また、第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、同じ長さであっても、異なる長さ（例えば、いずれか一方が1～3塩基短い又は長い長さ）であってもよい。一実施形態において、第2核酸鎖の長さは第1核酸鎖より短い。この場合、第2核酸鎖が第1核酸鎖と結合し得る位置は問わない。例えば、第1核酸鎖中の5'側の領域、中央の領域、又は3'側の領域のいずれと結合し得るものであってもよい。一実施形態において、第2核酸鎖が少なくとも8塩基長であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖が形成する二本鎖構造は、バルジを含んでいてもよい。長さの選択は、例えば費用、合成収率等の他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決定することができる。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、その5'末端側及び3'末端側の一方又は両方に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域を含み得る。「オーバーハング領域」とは、第2核酸鎖において第1核酸鎖に相補的な領域に隣接する領域で、第1核酸鎖と第2核酸鎖がアニールして二本鎖構造を形成した場合、第2核酸鎖の5'末端が第1核酸鎖の3'末端を越えて伸長する、及び／又は第2核酸鎖の3'末端が第1核酸鎖の5'末端を越えて伸長する、つまり、二本鎖構造から突出した第2核酸鎖中のヌクレオチド領域を指す。第2核酸鎖中のオーバーハング領域は、相補的領域の5'末端側に位置してもよく、3'末端側に位置してもよい。第2核酸鎖中のオーバーハング領域は、相補的領域の5'末端側及び3'末端側に位置してもよい。
　オーバーハング領域の長さは、限定しないが、1～20塩基長であってもよく、例えば2～15塩基長、2～12塩基長、2～10塩基長、2～8塩基長、2～6塩基長、2～5塩基長、2～4塩基長、又は2～3塩基長であってもよい。また、オーバーハング領域を構成するヌクレオシドの種類は限定しない。例えば、天然ヌクレオシド（例えばデオキシリボヌクレオシド）又は非天然ヌクレオシド（例えばLNAヌクレオシド等の架橋ヌクレオシド）で構成されていてもよい。また、オーバーハング領域のヌクレオシド間結合の全部又は一部は修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、例えばホスホロチオエート結合であってもよい。オーバーハング領域は、タンパク質結合性、脂溶性、及び／又はヌクレアーゼ耐性を有することが好ましく、例えばホスホロチオエート結合により連結されたデオキシリボヌクレオシド又はLNAヌクレオシドで構成されていてもよい。なお、オーバーハング領域の塩基配列は標的遺伝子の塩基配列と関係しない配列であってもよい。
　第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端、又は両末端）から少なくとも1個、少なくとも2個（例えば2個）、少なくとも3個、又は少なくとも4個のヌクレオシドは、非天然ヌクレオシド（修飾ヌクレオシド）であってもよい。修飾ヌクレオシドは、修飾糖及び／又は修飾核酸塩基を含んでいてもよい。修飾糖は、2'-修飾糖（例えば、2'-O-メチル基を含む糖）であってよい。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンとすることもできる。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、第1核酸鎖との二本鎖形成が可能である限り、第1核酸鎖に対して1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、又は1～3個（例えば、1～2個、又は1個）の非相補的塩基、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、又は1～3個（例えば、1～2個、又は1個）の欠失塩基、及び／又は1～20個（例えば、1～15個、1～12個、1～10個、1～8個、1～6個、1～4個、1～3個、又は1個）の挿入塩基を有していてもよい。挿入塩基からなる配列領域はバルジ構造を形成してもよい。
　一実施形態において、2核酸鎖は、第1核酸鎖に対して非相補的な塩基配列からなるバルジ構造を少なくとも1つ含む。本明細書において「バルジ構造」とは、二本鎖核酸において、二本鎖を構成するいずれかの核酸鎖の一部の核酸が塩基対合せずに二本鎖構造から突き出した部分をいう。バルジ構造の塩基長は、限定しない。例えば、1～50塩基長、1～40塩基長、1～30塩基長、1～20塩基長、1～15塩基長、好ましくは1～10塩基長である。
　一実施形態において、バルジ構造は糖非修飾ヌクレオシドを含む。さらなる実施形態において、バルジ構造の全てのヌクレオシドが糖非修飾ヌクレオシドである。
　一実施形態において、第2核酸鎖がバルジ構造を含む場合、バルジ構造以外のヌクレオシドの全ては、2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。
　第1核酸鎖及び第2核酸鎖におけるヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシド間結合であってよい。限定はしないが、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端若しくは両端）から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが好ましい。ここで、例えば核酸鎖の末端から2つのヌクレオシド間結合とは、核酸鎖の末端に最も近接するヌクレオシド間結合と、それに隣接し、かつ末端とは反対側に位置するヌクレオシド間結合を意味する。核酸鎖の末端領域における修飾ヌクレオシド間結合は、核酸鎖の望ましくない分解を抑制又は阻害できるため好ましい。
　一実施形態で、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の全部又は一部のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、修飾ヌクレオシド間結合を1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、修飾ヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも93％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は100％含んでいてもよい。一実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合又はボラノホスフェート結合であってよい。一実施形態において第1核酸鎖中の核酸がモルホリノ核酸からなる場合、第1核酸鎖中の全部又は一部のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であってもよい。
　一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、キラル制御されたヌクレオシド間結合を1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、キラル制御されたヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又はそれ以上含んでいてもよい。
　一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、非負荷電ヌクレオシド間結合（好ましくは、中性のヌクレオシド間結合）を1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、非負荷電ヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又はそれ以上含んでいてもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖の5'末端から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。第2核酸鎖の3'末端から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエート結合、1～4個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、TMG部分）を含むヌクレオシド間結合及び／又は環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合であってもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、Rp配置又はSp配置にキラル制御されていてもよい。
　第2核酸鎖の3'末端から少なくとも1個（例えば3個）のヌクレオシド間結合は、RNase耐性の高いホスホロチオエート結合のような修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。第2核酸鎖の3'末端にホスホロチオエート修飾等の修飾ヌクレオシド間結合を含む場合、二本鎖核酸複合体の遺伝子抑制活性が向上するので好ましい。
　一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、あるpH（例えば、ヒトの生理学的pH（約7.4）、送達部位（例えば、オルガネラ、細胞、組織、臓器、生物体等）のpH等）において、当該修飾ヌクレオシド間結合が、アニオン形態（例えば、-O-P(O)(O-)-O-（天然リン酸結合のアニオン形態）、-O-P(O)(S-)-O-（ホスホロチオエート結合のアニオン形態）等）と比較して、中性形態又はカチオン形態として存在する非負荷電（それぞれ中性又はカチオン性の）ヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、中性のヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、カチオン性のヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合（例えば、中性のヌクレオシド間結合）は、その中性形態をとるとき、pKaが8未満、9未満、10未満、11未満、12未満、13未満、又は14未満の部分を有さない。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、例えば、米国特許登録番号5,264,423及び5,286,717記載のメチルホスホネート結合、米国特許登録番号5,955,599記載のメチルホスホトリエステル結合、エチルホスホトリエステル結合、国際公開第2015/168172号記載のメトキシプロピルホスホネート結合、国際公開第2016/081600号記載の自己中和核酸(ZON)に用いられるヌクレオシド間結合等である。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、トリアゾール部分又はアルキン部分を含む。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、環状グアニジン部分及び/又は１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（好ましくは、TMG部分）を含む。一実施形態では、環状グアニジン部分を含む修飾ヌクレオシド間結合は、式(I)で表される部分構造を有する。一実施形態では、1～4個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分は、式(II)で表される部分構造を有する。一実施形態では、環状グアニジン部分及び/又は1～4個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分を含む中性のヌクレオシド間結合は、キラル制御される。一実施形態では、本開示は、少なくとも１つの中性のヌクレオシド間結合及び少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、少なくともいくつかの場合では、中性のヌクレオチド間結合は、中性のヌクレオチド間結合を含まない同等の核酸と比較して特性及び／又は活性を改善することができ、例えば、送達を改善し、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対する耐性を改善し、細胞取り込みを改善し、エンドソーム脱出を改善し、及び／又は核取り込みを改善等する。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、リガンド（本明細書においてバインダーと称する場合もある）と結合していてもよい。リガンドとしては、低分子（低分子リガンド）、中分子（中分子リガンド）、高分子（高分子リガンド）、ペプチド（ペプチドリガンド）、脂質（脂質リガンド）、及びアプタマー（例えば核酸アプタマー）が挙げられる。
　本明細書において「ペプチド」とは、1つ以上のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーをいう。「ペプチド」は、ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。したがって、「ペプチド」には、ジペプチドやトリペプチド等の数個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドから、多数のアミノ酸残基を含むポリペプチド（タンパク質）までが包含される。ペプチドは直鎖状、分岐状又は環状のペプチドでありうる。
　ペプチドリガンドは、細胞表面上若しくは細胞内、又は体液中に存在する分子に結合するものであってもよい。
　一実施形態において、ペプチドは、抗体又はその活性断片であってもよい。抗体の例として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体やヒト化抗体等の組換え抗体、Fab、F(ab')2、Fab',VHH等が挙げられる。抗体の活性断片の例として、scFv（single chain Fragment of variable region：単鎖抗体）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。
　脂質（脂質リガンド）は、トコフェロール、コレステロール、脂肪酸、リン脂質及びそれらの類縁体；葉酸、ビタミンC、ビタミンB1、ビタミンB2；エストラジオール、アンドロスタン及びそれらの類縁体；ステロイド及びその類縁体；LDLR、SRBI又はLRP1/2のリガンド；FK-506、及びシクロスポリン；PCT/JP2019/012077、PCT/JP2019/010392及びPCT/JP2020/035117記載の脂質等が挙げられるが、これらに限定されない。また、脂質（脂質リガンド）は、トコフェロール又はその類縁体及び/又はコレステロール又はその類縁体、置換された若しくは置換されていないＣ１～３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２～３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１～３０のアルコキシ基であってもよい。
　本明細書において「トコフェロール」は、トコロールのメチル化誘導体で、クロマンと呼ばれる環状構造を有する脂溶性ビタミン（ビタミンE）である。トコロールは、強い抗酸化作用を有しており、それ故に、生体内では、抗酸化物質として、代謝によって生じるフリーラジカルを消失させ、細胞を傷害から保護する機能を有する。
　トコフェロールは、クロマンに結合するメチル基の位置に基づき、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、及びδ-トコフェロールからなる複数の異なる型が知られている。本明細書におけるトコフェロールは、いずれのトコフェロールであってもよい。また、トコフェロールの類縁体としては、トコフェロールの種々の不飽和類縁体、例えば、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノール等が挙げられる。好ましくは、トコフェロールは、α-トコフェロールである。
　本明細書において「コレステロール」とは、ステロイドアルコールとも呼ばれるステロールの1種であり、特に動物において多く存在する。コレステロールは、生体内における代謝過程で重要な機能を果たしている他、動物細胞では、リン脂質と共に細胞の膜系を構成する主要な構成成分でもある。また、コレステロールの類縁体は、ステロール骨格を有するアルコールである、種々のコレステロール代謝産物及び類縁体等を指し、限定されるものではないが、コレスタノール、ラノステロール、セレブロステロール、デヒドロコレステロール、及びコプロスタノール等を含む。
　本明細書において「類縁体(analog)」とは、同一又は類似の基本骨格を有する類似した構造及び性質を有する化合物を指す。類縁体は、例えば、生合成中間体、代謝産物、置換基を有する化合物等を含む。ある化合物が他の化合物の類縁体であるか否かは、当業者であれば技術常識に基づき判定できる。
　コレステロールの類縁体は、ステロール骨格を有するアルコールである、種々のコレステロール代謝産物及び類縁体等を指し、限定されるものではないが、コレスタノール、ラノステロール、セレブロステロール、デヒドロコレステロール、及びコプロスタノール等を含む。
　一実施形態において、第2核酸鎖はトコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体と結合していてもよい。コレステロール又はその類縁体と結合した第2核酸鎖は、以下の一般式(VII)で示される基を有してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　［式中、Rcは、置換基を有していてもよい炭素数4～18個、好ましくは炭素数5～16個のアルキレン基を表す(ここで、該置換基はハロゲン原子、又はヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数1～3個のアルキル基、例えばヒドロキシメチル基であり、該アルキレン基は相隣接しない炭素原子が酸素原子で置換されていてもよい)。］
　Rcは、限定されないが、-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(CH2OH)-、又は-(CH2)6-であってもよい。
　上記一般式(VII)で示される基は、第2核酸鎖の5'末端又は3'末端にリン酸エステル結合を介して結合することができる。
　コレステロール又はその類縁体等のリガンドは、第2核酸鎖の5'末端、又は3'末端、或いは両端のいずれに結合していてもよい。また、コレステロール又はその類縁体等のリガンドは、第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに結合していてもよい。
　第2核酸鎖が、コレステロール又はその類縁体を複数含む場合、それらは同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、第2核酸鎖の5'末端にコレステロールが、3'末端に他のコレステロール類縁体がそれぞれ1つずつ結合している場合が該当する。結合位置に関して、コレステロール又はその類縁体は、第2核酸鎖の複数の位置に結合していてもよく、及び/又は1つの位置に一群として結合していてもよい。コレステロール又はその類縁体が、第2核酸鎖の5'末端と3'末端にそれぞれ1つずつ連結されていてもよい。
　第2核酸鎖とリガンドとの結合は、直接結合であってもよいし、他の物質によって介在される間接結合であってもよい。
　第2核酸鎖とリガンドが直接結合をする場合、例えば、共有結合、イオン性結合、水素結合等を介して第2核酸鎖に結合されていればよい。より安定した結合を得ることができるという点を鑑みれば、共有結合が好ましい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、リガンドと結合していない。本明細書において「リガンドと結合していない」とは、トコフェロールやコレステロール等のリガンドが結合していないことをいう。さらなる実施形態では、本発明の二本鎖核酸複合体はリガンドと結合していない、すなわち第1核酸鎖及び第2核酸鎖のいずれもリガンドと結合していない。
　第2核酸鎖とリガンドが間接結合をする場合、連結基（本明細書では、しばしば「リンカー」と表記する）を介して結合していてもよい。リンカーは切断可能な（cleavable）リンカー又は非切断(uncleavable)リンカーにいずれであってもよい。
　「切断可能なリンカー」とは、生理学的条件下、例えば、細胞内又は動物体内(例えば、ヒト体内)で切断され得るリンカーを意味する。切断可能なリンカーは、ヌクレアーゼ等の内在性酵素によって選択的に切断される。切断可能なリンカーは、限定はしないが、アミド、エステル、ホスホジエステルの一方若しくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、及びジスルフィド結合、並びに天然DNAリンカーが挙げられる。一例として、コレステロール又はその類縁体がジスルフィド結合を介して連結されていてもよい。
　「非切断性リンカー」とは、生理学的条件下、例えば、細胞内又は動物体内(例えば、ヒト体内)で切断されないリンカーを意味する。非切断性リンカーは、限定はしないが、ホスホロチオエート結合、及びホスホロチオエート結合で連結された修飾若しくは非修飾のデオキシリボヌクレオシド又は修飾若しくは非修飾のリボヌクレオシドからなるリンカー等が挙げられる。リンカーがDNA等の核酸又はオリゴヌクレオチドの場合、鎖長は、特に限定はされないが、通常は2～20塩基長、3～10塩基長又は4～6塩基長であればよい。
　リンカーの一具体例として、以下の式(VIII)で表されるリンカーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　［式中、L2は、置換された若しくは置換されていないC1～C12のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン、ドデシレン）、置換された若しくは置換されていないC3～C8シクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又はCH(CH2-OH)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-を表し、L3は、-NH-又は結合を表し、L4は、置換された若しくは置換されていないC1～C12のアルキレン基（例、エチレン、ペンチレン、へプチレン、アンデシレン）、置換された若しくは置換されていないC3～8のシクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、-(CH2)2-[O-(CH2)2]m-、又は結合を表し、ここで、mは1～25の整数を表し、L5は、-NH-(C=O)-、-(C=O)-、又は結合を表す(ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子によりなされる）。］
　一実施形態において、式(VIII)で表されるリンカーは、L2が、置換されていないC3～C6のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又は-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-であり、L3が、-NH-であり、L4及びL5が、結合である。
　また、リンカーの別の具体例として、以下の一般式(IX)で表わされるリンカーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　［式中、ｎは０又は１を表す。］
　第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖（好ましくは第2核酸鎖）は、核酸鎖を構成するポリヌクレオチドに結合した少なくとも1つの機能性部分をさらに含んでいてもよい。「機能性部分」とは、二本鎖核酸複合体及び/又は当該機能性部分が結合している核酸鎖に所望の機能を付与する部分をいう。所望の機能には、例えば、標識機能、又は精製機能等が挙げられる。標識機能を与える部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。また、精製機能を与える部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチド等の化合物が挙げられる。一実施形態において、第1核酸鎖を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、第2核酸鎖に機能性部分として、ある実施形態における二重鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。標的への送達機能を与える部分の例としては、脂質、抗体、アプタマー、特定のレセプターに対するリガンド等が挙げられる。一実施形態において、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖（好ましくは第2核酸鎖）は、機能性部分と結合している。第2核酸鎖と機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等で第2核酸鎖と機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。
　第1核酸鎖と第2核酸鎖は、リンカーを介して結合していてもよい。この場合、第1核酸鎖と第2核酸鎖は、リンカーを介して連結され、一本鎖を形成しうる。この場合の二本鎖核酸複合体は、ヒンジ核酸、一本鎖HDO、又はssHDO等と呼ぶことができる。しかし、その場合も機能領域は二本鎖核酸複合体と同じ構成であることから、本明細書では、このような一本鎖核酸も本発明の二本鎖核酸複合体の一実施形態として包含する。
　一実施形態において、リンカーは第1核酸鎖の5'末端と第2核酸鎖の3'末端とを結合する。別の実施形態において、リンカーは第1核酸鎖の3'末端と前記第2核酸鎖の5'末端とを結合する。さらなる実施形態において、リンカーは第1核酸鎖の5'末端と第2核酸鎖の3'末端とを結合し、かつ第1核酸鎖の3'末端と前記第2核酸鎖の5'末端とを結合する。この場合、二本鎖核酸複合体は環状構造となる。
　リンカーは、任意のポリマーでありうる。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アルキレン等に加えて、上述のように第2核酸鎖とリガンドとを連結するリンカーを用いることもできる。具体的には、例えば、DNA、RNAといった天然のヌクレオチドやヌクレオシド、又はペプチド核酸、モルホリノ核酸といった非天然のヌクレオチドやヌクレオシドから構成されうる。また、ポリエチレングリコール等のポリエーテルから構成されていてもよい。リンカーが核酸からなる場合、リンカーの鎖長は少なくとも1塩基、例えば、2～50塩基、2～40塩基、2～30塩基、2～20塩基、2～15塩基、2～12塩基、3～10塩基又は4～6塩基の鎖長をとりうる。好ましくは4塩基の鎖長である。リンカーの位置は、第1核酸鎖の5’側でも3’側のいずれでも可能であるが、例えば、第2核酸鎖の5’側にコレステロール又はその類縁体を結合させた構成の場合には、第1核酸鎖の5’末端と第2核酸鎖の3’末端とがリンカーを介して連結されることになる。リンカーは切断性（cleavable）又は非切断性(uncleavable)のいずれであってもよい。
　さらなる実施形態では、第1核酸鎖と第2核酸鎖はリンカーを介して結合していており、かつ第2核酸鎖は第1核酸鎖に対して非相補的な塩基配列からなるバルジ構造を少なくとも1つ含むことができる。
　本発明の二本鎖核酸複合体において、第1核酸鎖が有する標的転写産物に対するアンチセンス効果は、当該分野で公知の方法で測定できる。例えば、二本鎖核酸複合体を細胞等に導入した後、ノーザンブロッティング、定量PCR、又はウェスタンブロッティング等の公知技術を使用することにより測定すればよい。特定の組織における標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(例えば、mRNA量若しくはマイクロRNA等のRNA量、cDNA量、タンパク質量等)を測定することで、それらの部位において二本鎖核酸複合体によって標的遺伝子発現が抑制されるか否かを判定できる。また例えばエクソンスキッピングであれば、エクソンスキッピングで生じる産物と、エクソンスキッピングがない場合の産物を比較することにより、その効果を判定できる。
　上記のように、本発明の二本鎖核酸複合体の例示的実施形態について説明したが、本発明の二本鎖核酸複合体は上記の例示的実施形態に限定されない。
１－４．二本鎖核酸複合体の製造方法
　本発明の二本鎖核酸複合体は、当業者であれば、公知の方法を適切に選択することによって製造することができる。限定はしないが、通常は、まず二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖のそれぞれを設計し、製造するところから始まる。例えば、標的転写産物の塩基配列（例えば、標的遺伝子の塩基配列）情報に基づいて第1核酸鎖を設計し、その相補鎖として第2核酸鎖を設計する。続いて、設計した塩基配列情報に基づいて、それぞれの核酸鎖を、例えば、GE Healthcare社、Thermo Fisher Scientific社、Beckman Coulter社等の市販の自動核酸合成装置を使用して合成すればよい。その後は、得られたオリゴヌクレオチドに逆相カラム等を使用して精製するもできる。
　また、機能性部分が結合した二本鎖核酸複合体の場合には、第1核酸鎖は上記方法に準じて製造すればよい。一方、機能性部分が結合した第2核酸鎖は、機能性部分が予め結合した核酸種を用いて、上記の合成、及び精製を行い、製造することができる。例えば、コレステロール又はその類縁体が予め結合された核酸種を用いて、上記の合成及び精製を実施することによって第2核酸鎖を製造してもよい。或いは、上記の合成及び精製を実施することによって製造された第2核酸鎖に、公知の方法によりコレステロール又はその類縁体を結合させてもよい。各核酸鎖を製造後、第1核酸鎖と第2核酸鎖に対して、アニーリングを実施することによって目的とする機能性部分が結合した二本鎖核酸複合体製造することができる。具体的には、核酸を適切な緩衝溶液中で混合し、約90℃～98℃で数分間（例えば5分間）変性させ、その後核酸を約30℃～70℃で約1～8時間アニールして、本発明の二本鎖核酸複合体の1つを製造することができる。機能性部分を核酸に連結する方法は当該技術分野において周知である。また、核酸鎖は、塩基配列並びに修飾部位及び種類を指定して、各種メーカー(例えば、株式会社ジーンデザイン)に注文し、入手することもできる。
１－５．二本鎖核酸複合体の用途
　一実施形態において、本発明の二本鎖核酸複合体は、以下の少なくとも一つの作用：標的遺伝子の転写産物又は翻訳産物の発現量を抑制若しくは亢進する作用、標的遺伝子の転写産物又は翻訳産物の機能を阻害する作用、RNAスプライシングを制御する作用、及び標的遺伝子のタンパク質への結合を阻害する作用を用途とするもの、例えばエクソンスキッピングのためのものであってもよい。例えば、本発明の二本鎖核酸複合体は、以下の少なくとも一つの作用：エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、ステリックブロッキング、及びRNA発現亢進のためのものであってもよい。本発明の二本鎖核酸複合体は、特定の組織、例えば脳、脊髄、腎臓、肝臓、肺、腸管、脾臓、副腎、眼、網膜、皮膚、末梢神経、例えば脳において上記作用を発揮するためのものであってもよい。脳は大脳、間脳、脳幹、小脳のいずれであってもよく、例えば、大脳（大脳皮質等）、脳幹、小脳、海馬、及び線状体のいずれか一つ以上であってもよい。また、本発明の二本鎖核酸複合体は、心筋及び骨格筋を含む筋組織において上記作用を発揮するためのものであってもよい。
　一実施形態において、本発明の二本鎖核酸複合体は、疾患又は予防するためのものである。疾患は骨格筋機能障害又は心機能障害であってもよい。疾患の例としては、例えば、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィータイプ1（DM1）、福山型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー等）、先天性ミオパチー、原発性年齢関連タウオパチー（PART）、アルツハイマー病（AD）、進行性核上性麻痺（PSP）、大脳皮質基底核変性症/大脳皮質基底核症候群（CBD）、ピック病、前頭側頭型認知症、神経封入体病、脊髄性筋萎縮症（SMA）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性脊髄小脳変性症（SCA）、多系統萎縮症、遺伝性痙性対麻痺、多発性硬化症、脳梗塞、脳腫瘍、てんかん及び脳炎が挙げられる。
１－６．効果
　本発明の二本鎖核酸複合体によれば、二本鎖核酸複合体の有効性が損なうことなく、二本鎖核酸複合体の中枢神経毒性等の毒性を軽減又は消失することができる。すなわち、従来の二本鎖核酸複合体と比較して、標的遺伝子に対するアンチセンス効果を損なうことなく、中枢神経毒性が低減されている。
２．医薬組成物
２－１．概要
　本発明の第２態様は医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、前記第１態様の二本鎖核酸複合体を有効成分として含む。本発明の医薬組成物は、中枢神経毒性が軽減されており、副作用を伴うことなく髄腔内投与又は脳室内投与することができる。
　以下、本発明の医薬組成物が包含し得る各成分について具体的に説明をする。
２－２．構成
２－２－１．有効成分
　本発明の医薬組成物は、有効成分として少なくとも第１態様に記載の二本鎖核酸複合体を包含する。本発明の医薬組成物は、二本鎖核酸複合体を二種以上含んでもよい。
　医薬組成物に含まれる二本鎖核酸複合体の量（含有量）は、二本鎖核酸複合体の種類、送達部位、医薬組成物の剤形、医薬組成物の投与量、並びに後述する担体の種類によって異なる。したがって、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。通常は、単回投与量の医薬組成物に有効量の二本鎖核酸複合体が包含されるように調整する。「有効量」とは、二本鎖核酸複合体が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被検体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。最終的には医師、獣医師又は薬剤師等の判断によって決定される。「被検体の情報」とは、医薬組成物を適用する生体の様々な個体情報である。例えば、被検体がヒトであれば、年齢、体重、性別、食生活、健康状態、疾患の進行度や重症度、薬剤感受性、併用薬物の有無等を含む。
２－２－２．担体
　本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、植物性油、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、香味料、香料、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、溶解助剤、及び他の添加剤が挙げられる。
　溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　上記担体は、有効成分である二本鎖核酸複合体の生体内での酵素等による分解を回避又は抑制する他、製剤化や投与方法を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
２－２－３．剤形
　本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分である第１態様に記載の二本鎖核酸複合体を分解等により不活化させることなく、標的部位まで送達し、生体内でその有効成分の薬理効果（標的遺伝子の発現に対するアンチセンス効果）を発揮し得る形態であれば特に限定しない。
　具体的な剤形は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。投与方法は、非経口投与と経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
　投与方法が非経口投与であれば、好ましい剤形は、対象部位への直接投与又は循環系を介した全身投与が可能な液剤である。液剤の例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、前記賦形剤、エリキシル剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。その他、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、及び坐剤であってもよい。
　投与方法が経口投与であれば、好ましい剤形は、固形剤や液剤であってもよく、例えば、錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤、丸剤、顆粒剤、粉剤、散剤、内用水剤、乳剤、シロップ剤、ペレット剤、舌下剤、解膠剤(peptizer)、バッカル剤、ペースト剤、懸濁剤、エリキシル剤、コーティング剤、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、注射剤、及び坐剤が挙げられる。固形剤であれば、必要に応じて、当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。本発明の医薬組成物の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。
　特定の実施形態において、本発明の二本鎖核酸複合体は、水、日本薬局方溶出試験第２液、又は日本薬局方崩壊試験第２液に対する溶解性に優れ、体内動態（例、血中薬物半減期、脳内移行性、代謝安定性、CYP阻害）に優れ、毒性が低く（例えば、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、薬物相互作用、癌原性、光毒性等の点から医薬として、より優れている）、かつ副作用も少ない（例えば、過沈静（sedation）の抑制、層状壊死の回避）等の医薬品として優れた性質も有する。
２－３．投与形態及び投与量
　本明細書において、医薬組成物の好ましい投与形態には特定の限定はない。例えば、経口投与又は非経口投与であればよい。非経口投与の具体例として、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与（埋め込み型持続皮下投与を含む）、皮内投与、気管／気管支投与、直腸投与、輸血による投与、脳室内投与、髄腔内投与、経鼻投与、及び筋肉内投与が挙げられる。髄腔内投与は、例えば後頭窩穿刺又は腰椎穿刺であってもよい。
　医薬組成物が投与又は摂取により適用される場合、投与量又は摂取量は、例えば、包含する二本鎖核酸複合体が0.00001mg/kg/日～10000mg/kg/日、又は0.001mg/kg/日～100mg/kg/日となるようにすればよい。医薬組成物は、単回投与でも、複数回投与であってもよい。複数回投与の場合、毎日若しくは適当な時間間隔で（例えば1日、2日、3日、1週間、2週間、1ヶ月の間隔で）、例えば2～20回等投与することもできる。上記の二本鎖核酸複合体の1回の投与量は、例えば、0.001mg/kg以上、0.005mg/kg以上、0.01mg/kg以上、0.25mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2.5mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1.0mg/kg以上、2.0mg/kg以上、3.0mg/kg以上、4.0mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、若しくは500mg/kg以上とすることができ、例えば、0.001mg/kg～500mg/kgの範囲に含まれる任意の量（例えば、0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、若しくは200mg/kg）を適宜選択することができる。
　本発明の二本鎖核酸複合体は、0.01～10mg/kg（例えば約6.25mg/kg）の用量で週2回の頻度で4回投与してもよい。また、二本鎖核酸複合体は、0.05～30mg/kg（例えば約25mg/kg）の用量で週1～2回の頻度で2～4回、例えば週2回の頻度で2回投与してもよい。このような投与レジメン（分割投与）の採用により、より高用量の単回投与に比べて、毒性（例えば血小板の減少を回避する）を下げ、被検体への負荷を低減することができる。
　医薬組成物は反復投与でも細胞内において抑制効果が相加的に働く。また、反復投与する場合、ある程度の投与間隔（例えば、半日以上）をおいた方が有効性を向上させることができる。
　一実施形態において、本態様の医薬組成物は脳室内投与又は髄腔内投与される。本態様の医薬組成物を脳室内投与又は髄腔内投与する場合、サルやヒトの場合には0.01mg以上、0.1mg以上、又は1mg以上、例えば、2mg以上、3mg以上、4mg以上、5mg以上、10mg以上、20mg以上、30mg以上、40mg以上、50mg以上、75mg以上、100mg以上、200mg以上、300mg以上、400mg以上、又は500mg以上投与してもよく、0.01mg～1000mg、0.1mg～200mg、又は1mg～20mg投与してもよく、マウスの場合には1μg以上投与してもよい。
　一実施形態において、本態様の医薬組成物は静脈内投与又は皮下投与される。本態様の医薬組成物を静脈内投与又は皮下投与する場合、0.01mg/kg以上、0.1mg/kg以上、又は1mg/kg以上、例えば、2mg/kg以上、3mg/kg以上、4mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、又は500mg/kg以上投与してもよく、0.01mg/kg～1000mg/kg、0.1mg/kg～100mg/kg、又は1mg/kg～10mg/kg投与してもよい。
２－４．適用対象疾患
　医薬組成物の適用対象となる疾患は、限定しない。本発明の二本鎖核酸複合体のアンチセンス効果により、その転写産物又は翻訳産物の発現量が抑制若しくは亢進され得る、その転写産物又は翻訳産物の機能が阻害され得る、又はステリックブロッキング、スプライシングスイッチ、RNA編集、エクソンスキッピング若しくはエクソンインクルージョンが誘導され得る遺伝子が関係し得る疾患を対象とすることができる。疾患の具体例は「１－５．二本鎖核酸複合体の用途」の記載に準じる。
　一実施形態において、本態様の医薬組成物は被検体の中枢神経系疾患を治療するために用いることができる。本態様の医薬組成物の適用対象となる中枢神経系疾患として、特に限定されないが、例えば、脳腫瘍、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病等が挙げられる。
２－５．効果
　本発明の医薬組成物は、中枢神経毒性が軽減されている。それ故、本発明の医薬組成物は、脳室内投与や髄腔内投与により副作用を伴うことなく予防効果又は治療効果を達成することができる。
　特に、アルツハイマー病等の神経疾患の治療には高用量の核酸剤の投与が必要となり、副作用を伴うリスクがあるが、本発明の医薬組成物によればそのような副作用を大幅に低減することが可能となる。
　上記の二本鎖核酸複合体又は医薬組成物を被検体に投与することを含む、中枢神経系疾患等の疾患の治療及び／又は予防方法もまた提供される。
　また、疾患を治療及び／又は予防するための医薬の製造における、本発明の二本鎖核酸複合体の使用もまた提供される。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例1：Mapt遺伝子を標的とするHDOのMOE修飾＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするアンチセンス核酸（以下、「ASO」と称する）からなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（以下、「HDO」と称する）を脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、MOE修飾に基づく毒性軽減効果をin vivo実験により検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表1及び図4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本実施例で用いたASOは、マウスのmicrotubule-associated protein tau (Mapt) mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all RNA)、HDO(all DNA)、HDO(6MOE wing)、及びHDO(all MOE)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all RNA)の第2核酸鎖（c(all RNA)）はRNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(6MOE wing)の第2核酸鎖（c(6MOE wing)）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(all MOE)の第2核酸鎖（c(all MOE)）は2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　なお、本明細書の実施例で使用した2'-O-MOE-RNAヌクレオシドは、以下の式（III）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で示される非天然ヌクレオシドである。
　表1に記載される二本鎖核酸複合体を調製するために、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして二本鎖核酸複合体を調製した。アニールした核酸を4℃又は氷上で保存した。全てのオリゴヌクレオチドは株式会社ジーンデザイン(Gene Design)(大阪、日本)によって委託合成された。
（２）in vivo実験
　7週齢雌のICRマウスを、2.5～4％イソフルレン麻酔下にて脳定位固定装置に固定した。その後、耳間に前後2～3cmで皮膚を切開し、ブレグマ(bregma)の1mm左方かつ0.2mm後方に1mm径ドリルで穿孔した。ハミルトン(Hamilton)シリンジ内に核酸剤を充填した。穿孔部より針を3mm程度刺入し、2～3μl/分の速度で、マウス1匹当たり19nmol/匹の用量で核酸剤を左側脳室内投与し(n=4～7)、ナイロン糸で皮膚縫合した。また、陰性対照群としてPBSのみを投与したマウスも作製した。
（３）核酸剤投与後の中枢神経毒性評価及び運動機能評価
　各種核酸剤投与後のマウスにおいて、中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。
　中枢神経毒性評価として、核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後に、図3に示すスコアリングシステムを用いて行動評価を行った。
　図3に示すスコアリングシステムでは、5つのカテゴリーに属する行動が評価対象となる（図3、カテゴリー1～5）。各カテゴリーには各々2つの行動評価項目が含まれている。各行動評価項目は0～5点（図3、スコア0～5）の5段階で評価され、正常であれば0点となり、高毒性になるほどスコアが高くなる。各カテゴリーでは、2つの行動評価項目のうち高い方のスコアをそのカテゴリーのスコアとして採用する。5つのカテゴリーのスコアを合計した値を急性期忍容性スコア（0～20点）とする。
　また、運動機能評価として、各種核酸剤投与後の各時点でオープンフィールドテストを行った。具体的には、マウスをケージ（幅50cm×直径50cm×高さ40cm）の中央に配置し、マウスの軌跡を5分間記録した。記録データに基づく総移動距離(m)及び最大移動速度(m/s)をビデオトラッキングソフト（ANY-maze）により計測した。各投与群の間の統計学的有意差はボンフェローニ検定によって評価した。
（４）遺伝子抑制効果の評価
　各種核酸剤投与から7日後のマウスから海馬を摘出した。IsogenIキット(株式会社ジーンデザイン)を使用して、摘出した左海馬からRNAを抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master, DNase (ロシュ・ダイアグノスティックス社(Roche Diagnostics))を使用してプロトコルに従って合成した。
　次に、得られたcDNAを鋳型として定量RT-PCRを行うことにより、Mapt mRNA及びActb mRNA (内部標準遺伝子)の発現量を測定した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドサイエンス社(Roche Applied Science))により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計及び製造された製品であった。増幅条件(温度及び時間)は以下の通りであった：95℃で15秒、60℃で30秒、及び72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。
　Actb mRNA(内部標準遺伝子)の発現量に対するMapt mRNAの発現量の比率を計算し、PBS投与群の値に対して標準化した値を相対的Mapt mRNAレベルとした。
（結果）
　図5は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(6MOE wing)及びHDO(all MOE)の投与群では、ASO、HDO(all RNA)、及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、急性期忍容性スコア（acute tolerability score）が著しく減少した。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOでは中枢神経毒性が顕著に低下することが示された。
　図6は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(6MOE wing)及びHDO(all MOE)の投与群では、ASO、HDO(all RNA)、及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、総移動距離（図6A）及び最大移動速度（図6B）が著しく改善した。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOでは、運動機能を抑制する効果が極めて小さく、毒性が極めて低いことが示された。
　図7は、各種核酸剤の脳室内投与から7日後において海馬におけるMapt mRNA発現レベルを示す。HDO(all MOE)投与群では、ASO、HDO(all RNA)、及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、遺伝子抑制効果が低下していた。一方、HDO(6MOE wing)投与群は、ASO、HDO(all RNA)、及びHDO(all DNA)の投与群と同等な遺伝子抑制効果を示した。以上の結果から、HDO(6MOE wing)によって、実質的に中枢神経毒性を伴うことなく、高い遺伝子抑制効果が得られることが示された。
＜実施例2：BACE1遺伝子を標的とするHDOのMOE修飾＞
（目的）
　BACE1遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、MOE修飾に基づく毒性軽減効果をin vivo実験により検証する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表2及び図8に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本実施例で用いたASOは、マウスのβ-セクレターゼ1(beta-secretase 1、BACE1) mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、BACE1 mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の2個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の8個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all RNA)、HDO(all DNA)、及びHDO(5MOE wing)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all RNA)の第2核酸鎖（c(all RNA)）はRNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(5MOE wing)の第2核酸鎖（c(5MOE wing)）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の2個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の8個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表2に記載されるASO、HDO(all RNA)、HDO(all DNA)、及びHDO(5MOE wing)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、11.5nmol/匹とした。
（結果）
　図9は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(5MOE wing)投与群では、ASO、HDO(all RNA)、及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOでは中枢神経毒性が顕著に低下することが示された。
　図10は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(5MOE wing)投与群では、ASO、HDO(all RNA)、及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、総移動距離（図10A）及び最大移動速度（図10B）が著しく改善した。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOでは、運動機能を抑制する効果が極めて小さく、毒性が極めて低いことが示された。
＜実施例3：Malat1遺伝子を標的とするHDOのMOE修飾＞
（目的）
　Malat1遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、MOE修飾に基づく毒性軽減効果をin vivo実験により検証する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表3及び図11に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本実施例で用いたASOは、マウスの転移関連肺腺癌転写産物1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1、Malat1)ノンコーディングRNAを標的とする2'-O-MOE-RNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Malat1 ncRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all RNA)、HDO(all DNA)、及びHDO(10MOE wing)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all RNA)の第2核酸鎖（c(all RNA)）はRNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(10MOE wing)の第2核酸鎖（c(10MOE wing)）は、5’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表3に記載されるASO、HDO(all RNA)、HDO(all DNA)、及びHDO(10MOE wing)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、13.86nmol/匹とした。
（結果）
　図12は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(5MOE wing)投与群では、ASO及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。また、核酸剤の投与から30分後、1時間後、及び2時間後の時点において、HDO(5MOE wing)投与群では、HDO(all RNA)投与群と比較して、急性期忍容性スコアが低かった。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOでは中枢神経毒性が顕著に低下することが示された。
　図13は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(10MOE wing)投与群では、ASO、HDO(all RNA)、及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、総移動距離（図13A）及び最大移動速度（図13B）が著しく改善した。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOでは、運動機能を抑制する効果が極めて小さく、毒性が極めて低いことが示された。
＜実施例4：MOE修飾、2'OMe修飾、及び2'F修飾の比較＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、MOE修飾、2'OMe修飾、及び2'F修飾による毒性軽減効果をin vivo実験により比較する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表4及び図14に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(RNA 6MOE wing)、HDO(6MOE wing)、HDO(6OMe wing)、及びHDO(6F wing)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(RNA 6MOE wing)の第2核酸鎖（c(RNA 6MOE wing)）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のRNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(6MOE wing)の第2核酸鎖（c(6MOE wing)）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(6OMe wing)の第2核酸鎖（c(6OMe wing)）は、5’末端の3個の2'-O-Me-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-Me-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(6F wing)の第2核酸鎖（c(6F wing)）は、5’末端の3個の2'F-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'F-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表4に記載されるHDO(RNA 6MOE wing)、HDO(6MOE wing)、HDO(6OMe wing)、及びHDO(6F wing)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、19nmol/匹とした。
（結果）
　図15は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(RNA 6MOE wing)及びHDO(6MOE wing)の投与群では、HDO(all DNA)、HDO(6OMe wing)、及びHDO(6F wing)の投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。さらに、HDO(6MOE wing)投与群は、HDO(RNA 6MOE wing)投与群と比較して低い急性期忍容性スコアを示した。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOは、2'-O-Me-RNAや2'F-RNAヌクレオシドヌクレオシドを含むHDOと比較しても低い中枢神経毒性を達成し得ることが示された。
　図16～17は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後及び3時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(RNA 6MOE wing)及びHDO(6MOE wing)の投与群では、HDO(all DNA)、HDO(6OMe wing)、及びHDO(6F wing)の投与群と比較して、総移動距離（図16A、図17A）及び最大移動速度（図16B、図17B）が著しく改善した。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOは、2'-O-Me-RNAや2'F-RNAヌクレオシドヌクレオシドを含むHDOと比較しても、運動機能を抑制する効果が極めて小さく、毒性が極めて低いことが示された。
＜実施例5：グアノシンヌクレオシドの置換＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、第2核酸鎖におけるグアノシンヌクレオシドの置換による毒性軽減効果をin vivo実験により検討する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表5及び図18に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(6MOE wing)、HDO(GMOE)、HDO(GRNA)、及びHDO(inosine)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(6MOE wing)の第2核酸鎖（c(6MOE wing)）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(GMOE)の第2核酸鎖（c(GMOE)）は、c(6MOE wing)においてグアニン塩基を含むDNAヌクレオシドが2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換されている。HDO(GRNA)の第2核酸鎖（c(GRNA)）は、c(6MOE wing)においてグアニン塩基を含むDNAヌクレオシドがRNAヌクレオシドに置換されている。HDO(inosine)の第2核酸鎖（c(inosine)）は、c(6MOE wing)においてDNAヌクレオシドに含まれるグアニン塩基がイノシン塩基に置換されている。
　表5に記載されるASO、HDO(6MOE wing)、HDO(GMOE)、HDO(GRNA)、及びHDO(inosine)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、18.86nmol/匹とした。
（結果）
　図19は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(GMOE)及びHDO(GRNA)の投与群は、HDO(6MOE wing)投与群に対して同等かそれより低い急性期忍容性スコアを示した。
＜実施例6：Mapt遺伝子を標的とするHDOにおける様々なMOE修飾＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、様々なMOE修飾に基づく毒性軽減効果をin vivo実験により検証する。
（方法）
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表6及び図20に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(6MOE-5'&3')、HDO(6MOE-5')、HDO(6MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(6MOE-5'&3')の第2核酸鎖（c(6MOE-5'&3')）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(6MOE-5')の第2核酸鎖（c(6MOE-5')）は、5’末端の6個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及び3’末端の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(6MOE-3')の第2核酸鎖（c(6MOE-3')）は、5’末端の10個のDNAヌクレオシド、及び3’末端の6個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(10MOE-5')の第2核酸鎖（c(10MOE-5')）は、5’末端の10個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及び3’末端の6個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(10MOE-3')の第2核酸鎖（c(10MOE-3')）は、5’末端の6個のDNAヌクレオシド、及び3’末端の10個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表6に記載されるHDO(all DNA)、HDO(6MOE-5'&3')、HDO(6MOE-5')、HDO(6MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、中枢神経毒性評価及び運動機能評価、並びに遺伝子抑制効果の評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、18.86nmol/匹とした。
（結果）
　図21は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(6MOE-5'&3')、HDO(6MOE-5')、HDO(6MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。特にHDO(10MOE-5')及びHDO(10MOE-3')の投与群における急性期忍容性スコアがHDO投与群で最小となった。
　図22～23は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後及び3時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(6MOE-5'&3')、HDO(6MOE-5')、HDO(6MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、総移動距離（図22A、図23A）及び最大移動速度（図22B、図23B）が著しく改善した。投与後1時間の時点では、HDO(10MOE-5')及びHDO(10MOE-3')の投与群における改善効果がHDO投与群で最大となった。投与後3時間の時点では、HDO(6MOE-5'&3')投与群における改善効果がHDO投与群で最大となった。
　図24は、各種核酸剤の脳室内投与から7日後において海馬におけるMapt mRNA発現レベルを示す。HDO(all DNA)、HDO(6MOE-5'&3')、HDO(6MOE-5')、HDO(6MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')の投与群は、PBSのみを投与した陰性対照と比較して、Mapt mRNA発現レベルの有意な低下を示した。
＜実施例7：BACE1遺伝子を標的とするHDOにおける様々なMOE修飾＞
（目的）
　BACE1遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、様々なMOE修飾に基づく毒性軽減効果をin vivo実験により検証する。
（方法）
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表7及び図25に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　本実施例で用いたASOは、BACE1 mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、BACE1 mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の2個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の8個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(5MOE-5')、HDO(5MOE-3')、HDO(8MOE-5')、HDO(8MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(5MOE-5')の第2核酸鎖（c(5MOE-5')）は、5’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及び3’末端の8個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(5MOE-3')の第2核酸鎖（c(5MOE-3')）は、5’末端の8個のDNAヌクレオシド、及び3’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(8MOE-5')の第2核酸鎖（c(8MOE-5')）は、5’末端の8個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及び3’末端の5個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(8MOE-3')の第2核酸鎖（c(8MOE-3')）は、5’末端の5個のDNAヌクレオシド、及び3’末端の8個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(10MOE-5')の第2核酸鎖（c(10MOE-5')）は、5’末端の10個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及び3’末端の3個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(10MOE-3')の第2核酸鎖（c(10MOE-3')）は、5’末端の3個のDNAヌクレオシド、及び3’末端の10個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表7に記載されるHDO(all DNA)、HDO(5MOE-5')、HDO(5MOE-3')、HDO(8MOE-5')、HDO(8MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、11.5nmol/匹とした。
（結果）
　図26は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(5MOE-5')、HDO(5MOE-3')、HDO(8MOE-5')、HDO(8MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。
　図27は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。、HDO(5MOE-5')、HDO(5MOE-3')、HDO(8MOE-5')、HDO(8MOE-3')、HDO(10MOE-5')、及びHDO(10MOE-3')の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、総移動距離（図27A）及び最大移動速度（図27B）が著しく改善した。
＜実施例8：Mapt遺伝子を標的とするHDOにおける様々なMOE修飾＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、様々なMOE修飾に基づく毒性軽減効果をin vivo実験により検証する。
（方法）
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表8及び図28に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(6MOE wing)、HDO(9MOE wing)、HDO(11MOE wing)、HDO(13MOE wing)、及びHDO(15MOE wing)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(6MOE wing)の第2核酸鎖（c(6MOE wing)）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(9MOE wing)の第2核酸鎖（c(9MOE wing)）は、5’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の4個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の7個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(11MOE wing)の第2核酸鎖（c(11MOE wing)）は、5’末端の6個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の5個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(13MOE wing)の第2核酸鎖（c(13MOE wing)）は、5’末端の7個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の6個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の3個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(15MOE wing)の第2核酸鎖（c(15MOE wing)）は、5’末端の8個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の7個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の1個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表8に記載されるHDO(all DNA)、HDO(6MOE wing)、HDO(9MOE wing)、HDO(11MOE wing)、HDO(13MOE wing)、及びHDO(15MOE wing)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、中枢神経毒性評価及び運動機能評価、並びに遺伝子抑制効果の評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、18.86nmol/匹とした。
（結果）
　図29は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(6MOE wing)、HDO(9MOE wing)、HDO(11MOE wing)、HDO(13MOE wing)、及びHDO(15MOE wing)の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。
　図30は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。、HDO(6MOE wing)、HDO(9MOE wing)、HDO(11MOE wing)、HDO(13MOE wing)、及びHDO(15MOE wing)の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、総移動距離（図30A）及び最大移動速度（図30B）が著しく改善した。
＜実施例9：MOE修飾における塩基種の比較＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、第2核酸鎖においてMOE修飾を導入するヌクレオシドの種類（アデニン塩基、グアニン塩基、シトシン塩基、又はチミン塩基を含むヌクレオシド）による毒性軽減効果の違いについてin vivo実験により比較する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表9及び図31に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(AMOE)、HDO(GMOE)、HDO(CMOE)、及びHDO(TMOE)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(AMOE)の第2核酸鎖（a(AMOE)）は、アデニン塩基を含むDNAヌクレオシドを全て2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換した構造を有し、同様にHDO(GMOE)はグアニン塩基を、HDO(CMOE)はシトシン塩基を、HDO(TMOE)はチミン塩基を含むDNAヌクレオシドをそれぞれ全て2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換した構造を有する。
　表9に記載されるHDO(all DNA)、HDO(AMOE)、HDO(GMOE)、HDO(CMOE)、及びHDO(TMOE)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、19nmol/匹とした。
（結果）
　図32は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(AMOE)、HDO(CMOE)、及びHDO(TMOE)の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少し、HDO(GMOE)投与群は、HDO(all DNA)投与群と比較して急性期忍容性スコアがわずかに減少した。この結果から、第2核酸鎖においてアデニン塩基、シトシン塩基、又はチミン塩基を含むヌクレオシドを2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換したHDOは、第2核酸鎖がDNAヌクレオシドのみからなるHDOと比較して中枢神経毒性を軽減し得ることが示された。
　図33は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後及び3時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(AMOE)、HDO(CMOE)、及びHDO(TMOE)の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、総移動距離（図33A）及び最大移動速度（図33B）が著しく改善し、HDO(GMOE)投与群は、HDO(all DNA)の投与群と比較して総移動距離（図33A）及び最大移動速度（図33B）がわずかに改善した。この結果から、第2核酸鎖においてアデニン塩基、シトシン塩基、又はチミン塩基を含むヌクレオシドを2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換したHDOは、第2核酸鎖がDNAヌクレオシドのみからなるHDOと比較して中枢神経毒性を軽減し得ることが示された。
＜実施例10：MOE修飾における隣接核酸の比較＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、第2核酸鎖においてシトシン塩基を含むヌクレオシド並びにその5'側及び／又は3'側に隣接するヌクレオシドへのMOE修飾の導入による毒性軽減効果をin vivo実験により比較する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表10及び図34に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(CMOE)、HDO(2CMOE-5)、HDO(2CMOE-3)及びHDO(3CMOE)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(CMOE)の第2核酸鎖（c(CMOE)）はシトシン塩基を含むDNAヌクレオシドを全て2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(2CMOE-5)の第2核酸鎖（c(2CMOE-5)）はシトシン塩基を含むDNAヌクレオシド及びその5'側に隣接するDNAヌクレオシドを全て2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(2CMOE-3)の第2核酸鎖（c(2CMOE-3)）はシトシン塩基を含むDNAヌクレオシド及びその3'に隣接するDNAヌクレオシドを全て2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(3CMOE)の第2核酸鎖（c(3CMOE)）はシトシン塩基を含むDNAヌクレオシド及びその5'側及び3'側に隣接するDNAヌクレオシドを全て2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換した構造を有する。
　表10に記載されるHDO(all DNA)、HDO(CMOE)、HDO(2CMOE-5)、HDO(2CMOE-3)及びHDO(3CMOE)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、19nmol/匹とした。
（結果）
　図35は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(2CMOE-5)、HDO(2CMOE-3)及びHDO(3CMOE)の投与群では、HDO(all DNA)及びHDO(CMOE)の投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。この結果から、第2核酸鎖においてシトシン塩基を含むヌクレオシド及びその隣接するヌクレオシドを2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換したHDOは、第2核酸鎖がDNAヌクレオシドからなるHDOと比較して中枢神経毒性が軽減されることが示された。
　図36は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後及び3時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(2CMOE-5)、HDO(2CMOE-3)及びHDO(3CMOE)の投与群では、HDO(all DNA)及びHDO(CMOE)の投与群と比較して、総移動距離（図36A）及び最大移動速度（図36B）が著しく改善した。この結果から、第2核酸鎖においてシトシン塩基を含むヌクレオシド及びその隣接するヌクレオシドを2'-O-MOE-RNAヌクレオシドに置換したHDOは、第2核酸鎖がDNAヌクレオシドからなるHDOと比較して、中枢神経毒性が軽減され得ることが示された。
＜実施例11：髄液中におけるHDOの安定性＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOをヒト又はラットの髄液中でインキュベートし、その安定性を検討する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表11、図37A、図37B、図38A、及び図38Bに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(ASO/cRNA)及びHDO(ASO/cDNA)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(ASO/cRNA)の第2核酸鎖（cRNA）は、RNAヌクレオシドが、5'末端から3個のホスホロチオエート結合、3'末端から3個のホスホロチオエート結合、及びそれらの間の9個のホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(ASO/cDNA)の第2核酸鎖（cDNA）は、DNAヌクレオシドが、5'末端から3個のホスホロチオエート結合、3'末端から3個のホスホロチオエート結合、及びそれらの間の9個のホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表11に記載されるHDO(ASO/cRNA)及びHDO(ASO/cDNA)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製を行った。
（２）髄液中における核酸剤の安定性評価
　10μMのHDO(ASO/cRNA)及びHDO(ASO/cDNA)各4μLを用意した。HDO 4μLに対して、ヒト髄液又はラット髄液を16μL混合し、37℃ incubatorでインキュベートした。10分後、1時間後、及び6時間後の各時点で、液体窒素に投入して反応を停止させた。
　16％アクリルアミドゲル(1×TBE)を準備、作製した。上記サンプル6μLをゲルにロードし、100V 80分で泳動した。対照としてASO単独及びcRNA単独を同時に泳動した。その後、1×TBEでGelRed(×10000)水溶液(Biotium)を1/10000の濃度に希釈した溶液を作製した。ゲルを10分間その溶液で浸透した。その後、ChemiDoc Touchイメージングシステム(BioRad社)でゲルを撮影した。
（結果）
　図37Cは、HDO(ASO/cRNA)をヒト髄液（Human CSF）中で10分間及び6時間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。図37Dは、図37Cの泳動結果におけるHDO 2本鎖バンドのバンド強度を定量した結果を示す。HDO(ASO/cRNA)は、ヒト髄液中での10分間のインキュベートで大部分が分解され、6時間で全部が分解された。
　図38Cは、HDO(ASO/cRNA)又はHDO(ASO/cDNA)をヒト髄液又はラット髄液中で6時間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。ヒト髄液中では、HDO(ASO/cRNA)は分解されて不安定であった一方、HDO(ASO/cDNA)は分解されずに安定であった。ラット髄液中では、HDO(ASO/cRNA)及びHDO(ASO/cDNA)のいずれも分解されず、安定であった（図38D）。
＜実施例12：髄液中におけるHDOの安定性＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOをマウス、ラット、サル、又はヒトの髄液中でインキュベートし、その安定性を検討する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表12、図39A、図39B、図40A、及び図40Bに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all RNA)、HDO(all DNA)、HDO(cRNA 6MOE wing)、及びHDO(cDNA 6MOE wing)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all RNA)の第2核酸鎖（cRNA）はRNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(all DNA)の第2核酸鎖（cDNA）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(cRNA 6MOE wing)の第2核酸鎖（cRNA(6MOE wing)）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のRNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(cDNA 6MOE wing)の第2核酸鎖（cDNA(6MOE wing)）は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表12に記載されるHDO(all RNA)、HDO(all DNA)、HDO(cRNA 6MOE wing)、及びHDO(cDNA 6MOE wing)について、実施例11と同様の方法により核酸の調製及び髄液中の安定性評価を行った。
（結果）
　図39Cは、HDO(all RNA)及びHDO(all DNA)をマウス、ラット、サル、及びヒトの髄液中で6時間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。HDO(all RNA)は、マウス及びラットの髄液中では分解されず安定であった一方、サル及びヒトの髄液中では分解され、不安定であった。これに対して、HDO(all DNA)は、マウス、ラット、サル、及びヒトのいずれの髄液中でも分解されず安定であった。
　図40Cは、HDO(cRNA 6MOE wing)及びHDO(cDNA 6MOE wing)をマウス、ラット、サル、及びヒトの髄液中で6時間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。HDO(cRNA 6MOE wing)は、マウス及びラットの髄液中では分解されず安定であった一方、サル及びヒトの髄液中では分解され、不安定であった。これに対してHDO(cDNA 6MOE wing)は、マウス、ラット、サル、及びヒトのいずれの髄液中でも分解されず安定であった。
＜実施例13：髄液中におけるHDOの安定性＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOにおいて、第2核酸鎖中の一部のDNAヌクレオシドをRNAヌクレオシドに置換した場合の髄液中での安定性を検討する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表13及び図41に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(ARNA)、HDO(GRNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(ARNA)の第2核酸鎖（c(ARNA)）は、c(all DNA)においてアデニン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(GRNA)の第2核酸鎖（c(GRNA)）は、c(all DNA)においてグアニン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(CRNA)の第2核酸鎖（c(CRNA)）は、c(all DNA)においてシトシン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(URNA)の第2核酸鎖（c(URNA)）は、c(all DNA)においてチミン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてウラシル塩基を含むRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。
　表13に記載されるHDO(all DNA)、HDO(ARNA)、HDO(GRNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)について、実施例11と同様の方法により核酸の調製及び髄液中の安定性評価を行った。
（結果）
　図42は、HDO(all DNA)、HDO(ARNA)、HDO(GRNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)をヒト髄液中で6時間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。HDO(all DNA)、HDO(ARNA)、及びHDO(GRNA)は、ヒト髄液中で分解されず安定であった。一方、HDO(CRNA)及びHDO(URNA)は、ヒト髄液中で分解され、不安定であった。
＜実施例14：髄液中におけるHDOの安定性＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOにおいて、第2核酸鎖中の一部のDNAヌクレオシドをRNAヌクレオシドに置換した場合の髄液中での安定性を検討する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表14及び図43に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(GARNA)、HDO(CURNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(GARNA)の第2核酸鎖（c(GARNA)）は、c(all DNA)においてグアニン塩基を含むDNAヌクレオシド及びアデニン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(CURNA)の第2核酸鎖（c(CURNA)）は、c(all DNA)においてシトシン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換し、チミン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてウラシル塩基を含むRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(CRNA)の第2核酸鎖（c(CRNA)）は、c(all DNA)においてシトシン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(URNA)の第2核酸鎖（c(URNA)）は、c(all DNA)においてチミン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてウラシル塩基を含むRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。
　表14に記載されるHDO(all DNA)、HDO(GARNA)、HDO(CURNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)について、実施例11と同様の方法により核酸の調製及び髄液中の安定性評価を行った。
（結果）
　図44は、HDO(all DNA)、HDO(GARNA)、HDO(CURNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)をヒト髄液中で1時間及び6時間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。HDO(all DNA)及びHDO(GARNA)は、ヒト髄液中で分解されず安定であった。一方、HDO(CURNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)は、ヒト髄液中で分解され、不安定であった。
＜実施例15：髄液中におけるHDOの安定性＞
（目的）
　Malat1遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOにおいて、第2核酸鎖中の一部のDNAヌクレオシドをRNAヌクレオシドに置換した場合の髄液中での安定性を検討する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表15及び図45に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　本実施例で用いたASOは、Malat1 ncRNAを標的とする2'-O-MOE-RNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Malat1 ncRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(ARNA)、HDO(GRNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(ARNA)の第2核酸鎖（c(ARNA)）は、c(all DNA)においてアデニン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(GRNA)の第2核酸鎖（c(GRNA)）は、c(all DNA)においてグアニン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(CRNA)の第2核酸鎖（c(CRNA)）は、c(all DNA)においてシトシン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。HDO(URNA)の第2核酸鎖（c(URNA)）は、c(all DNA)においてチミン塩基を含むDNAヌクレオシドをすべてウラシル塩基を含むRNAヌクレオシドに置換した構造を有する。
　表15に記載されるHDO(all DNA)、HDO(ARNA)、HDO(GRNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)について、実施例11と同様の方法により核酸の調製及び髄液中の安定性評価を行った。
（結果）
　図46は、HDO(all DNA)、HDO(ARNA)、HDO(GRNA)、HDO(CRNA)、及びHDO(URNA)をヒト髄液中で6時間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。HDO(all DNA)、HDO(ARNA)、及びHDO(GRNA)は、ヒト髄液中で分解されず安定であった。一方、HDO(CRNA)及びHDO(URNA)は、ヒト髄液中で分解され、不安定であった。
＜実施例16：サルにおける中枢神経毒性評価＞
（目的）
　MOE修飾を含むHDOをサルに髄腔内投与して、中枢神経毒性を評価する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表16及び図47A-Cに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　表16に記載されるASO、HDO(RNA-MOE)、及びHDO(DNA-MOE)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製を行った。
（２）サルにおける中枢神経毒性の評価
　雄のカニクイザル（3歳齢、2kg）を対象として、ASO、HDO(RNA-MOE)、及びHDO(DNA-MOE)を投与した。投与方法としては、ASO 5mg又はHDO 0.94μmolを髄腔内投与した。
　髄腔内投与から2時間後のサルについて、行動観察を行った（図47D）。
（結果）
　結果を図47Eに示す。ASOを髄腔内投与したサルは重篤な四肢麻痺を示し、強い中枢神経毒性を示した。HDO(RNA-MOE）を髄腔内投与したサルは、下肢に中程度の麻痺を示したもの、ASOの髄腔内投与と比較して中枢神経系毒性は軽減していた。HDO(DNA-MOE)を髄腔内投与したサルは、麻痺を示さず、正常な意識状態及び運動機能を示した。
＜実施例17：バルジ構造を有するHDO＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを神経細胞株に導入する。第2核酸鎖へのバルジ構造の導入による毒性軽減効果及び遺伝子抑制効果をin vitro実験により検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いるHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表17及び図48に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　本実施例で用いたASOは、Mapt mRNAを標的とするLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(all MOE)、HDO(bulge1)、及びHDO(bulge2)は、いずれも上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を含む。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(all MOE)の第2核酸鎖（c(all MOE)）は2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　HDO(bulge1)の第2核酸鎖（c(bulge1)）は、第1核酸鎖の全長に対して相補的な塩基配列からなる相補領域、及び相補領域の中央に配置されたバルジ構造を含む。相補領域は2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。バルジ構造は2個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　HDO(bulge2)の第2核酸鎖（c(bulge2)）は、第1核酸鎖に対して相補的な塩基配列からなる相補領域、及び相補領域の中央に配置されたバルジ構造を含むが、相補領域は第1核酸鎖に対して1塩基の欠失を有し、この欠失位置にバルジ構造が配置されている。相補領域は2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。バルジ構造は3個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　表17に記載されるHDO(all DNA)、HDO(all MOE)、HDO(bulge1)、及びHDO(bulge2)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製を行った。
（２）遺伝子抑制効果の評価
　（１）で調製したHDOをヒト神経芽細胞腫由来細胞（BE(2)-M17細胞株）にリポフェクション法(lipofectamine2000)を用いて導入した。
　HDO導入から48時間後にIsogenIキット(株式会社ジーンデザイン)を使用して、細胞からRNAを抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master, DNase（ロシュ・ダイアグノスティックス社(Roche Diagnostics)）を使用してプロトコルに従って合成した。次に、得られたcDNAを鋳型として定量RT-PCRを行うことにより、Mapt mRNA及びActb mRNA (内部標準遺伝子)の発現量を測定した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドサイエンス社(Roche Applied Science))により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーとして、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計及び製造された製品を用いた。増幅は、95℃15秒、60℃30秒、及び72℃1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返すことにより行った。
　Actb mRNA(内部標準遺伝子)発現量に対するMapt mRNA発現量の比率を計算し、PBS投与群の値に対して標準化した値を相対的Mapt mRNAレベルとした。
（３）細胞毒性の評価
　導入48時間後に神経細胞毒性の評価として、細胞上清中の乳酸脱水素酵素（LDH）活性を測定した。LDH活性測定は、Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（同仁化学研究所）を使用して、添付プロトコルに従って実施した。PBS投与群のLDH活性に対して標準化した値を相対的LDH放出レベルとした。
（結果）
　図49Aは、ヒト神経芽細胞腫由来細胞（BE(2)-M17細胞株）において各種核酸剤による標的遺伝子抑制効果を評価した結果を示す。HDO(all MOE)の投与群ではHDO(all DNA)に比して抑制効果が著しく減弱した。これに対して、HDO(bulge1)及びHDO(bulge2)の投与群ではHDO(all DNA)と同等の強い遺伝子抑制効果が得られた。
　図49Bは、各種核酸剤を細胞内に導入した際の細胞毒性として、上清中のLDH活性を評価した結果を示す。HDO(all DNA)投与群はLDH活性の上昇を示したのに対して、HDO(all MOE)、HDO(bulge1)、及びHDO(bulge2)ではLDH活性がPBS投与群と同等以下となり、細胞毒性が著しく減少した。この結果から、2‘-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOでは細胞毒性が顕著に低下することが示された。
　以上の結果から、HDO(bulge1)及びHDO(bulge2)によって、神経細胞毒性を伴うことなく、強い遺伝子抑制効果が得られることが示された。
＜実施例18：一本鎖HDO＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、第2核酸鎖へのバルジ構造の導入、第1核酸鎖と第2核酸鎖とのリンカーによる連結、及びその両方による毒性軽減効果及び遺伝子抑制効果をin vivo実験により検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたHDOの塩基配列と化学修飾を表18及び図50に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　本実施例に用いるHDO(bulge)、ssHDO、PEG linker ssHDO、及びBulge plus ssHDOはいずれも第1核酸鎖及び第2核酸鎖を含む。HDO(bulge)、ssHDO、PEG linker ssHDO、及びBulge plus ssHDOの第1核酸鎖はいずれもLNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、5’末端の3個のLNAヌクレオシド、3’末端の3個のLNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。HDO(bulge)の第1核酸鎖と第2核酸鎖はリンカーによって連結されていないが、ssHDO、PEG linker ssHDO、及びBulge plus ssHDOでは、第2核酸鎖の3'末端が第1核酸鎖の5'末端にリンカーを介して結合している。
　HDO(bulge)の第2核酸鎖（c(bulge)）は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる相補領域、及びバルジ構造を含む。相補領域は2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。バルジ構造は3個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。
　ssHDOの第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な配列を有し、3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、10個のDNAヌクレオシド、及び3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドが5’末端から順にホスホジエステル結合で連結された構造を有する。ssHDOにおいて第1核酸鎖と第2核酸鎖を連結するリンカーは、ホスホジエステル結合により連結された3個のDNAヌクレオシドからなる。
　PEG linker ssHDOの第2核酸鎖の構成は、上記ssHDOの第2核酸鎖と同一である。PEG linker ssHDOにおいて第1核酸鎖と第2核酸鎖を連結するリンカーはPEG（ポリエチレングリコール）からなる。
　Bulge plus ssHDOの第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる相補領域、及び2個のバルジ構造を含む。相補領域は2'-O-MOE-RNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。2個のバルジ構造の各々は、3個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。Bulge plus ssHDOにおいて第1核酸鎖と第2核酸鎖を連結するリンカーは、ホスホジエステル結合により連結された3個のDNAヌクレオシドからなる。
　表18に記載のssHDO、PEG linker ssHDO、及びBulge plus ssHDOについて、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、中枢神経毒性評価及び運動機能評価、並びに遺伝子抑制効果の評価を行う。
（結果）
　HDO(bulge)、ssHDO、PEG linker ssHDO、及びBulge plus ssHDOを脳室内投与したマウスでは、実施例1で用いたHDO(all DNA)を投与したマウス等と比較して、投与から30分～4時間後の急性期忍容性スコアが著しく減少する。また、HDO(bulge)、ssHDO、PEG linker ssHDO、及びBulge plus ssHDOを脳室内投与したマウスでは、実施例1で用いたHDO(all DNA)を投与したマウス等と比較して、投与から1時間後の運動機能、例えば総移動距離や最大移動速度が著しく改善する。さらに、HDO(bulge)、ssHDO、PEG linker ssHDO、及びBulge plus ssHDOを脳室内投与したマウスでは、実施例1で用いたHDO(all MOE)を投与したマウス等と比較して、投与から7日後の海馬においてMapt mRNA発現レベルが低下し、標的遺伝子抑制効果の向上が判明する。以上の結果から、第2核酸鎖にバルジ構造を導入すること、及びHDOの第1核酸鎖と第2核酸鎖をリンカーで連結することにより、中枢神経毒性の軽減と優れた遺伝子抑制効果の両方を達成できるすることが示される。また、HDOにバルジ構造とリンカーの両方を導入することにより、中枢神経毒性の軽減と優れた遺伝子抑制効果の両方を達成できるすることが示される。
＜実施例19：第2核酸鎖のギャップ領域に導入すべき核酸種の検討＞
（目的）
　Malat1遺伝子を標的とするHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、第2核酸鎖において第1核酸鎖の中央領域（ギャップ領域）に相補的な塩基配列からなる領域（以下、第2核酸鎖においても「ギャップ領域」という）に導入する核酸種の影響を検討する。具体的には、第2核酸鎖のギャップ領域において、全てのヌクレオシドがRNAヌクレオシドであるHDO、全てのヌクレオシドがDNAヌクレオシドであるHDO、並びにアデニン塩基及びグアニン塩基の位置にRNAヌクレオシドを配置し、シトシン塩基及びチミン塩基の位置にDNAヌクレオシドを配置したHDOについて、毒性をin vivo実験により比較する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表19に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(cRNA 10MOE)、HDO(cDNA 10MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)は、共通の上記ASOを第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(cRNA 10MOE)の第2核酸鎖c(RNA 10MOE)は、第1核酸鎖のウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域（以下、第2核酸鎖においても「ウイング領域」という）が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成され、ギャップ領域がRNAヌクレオシドで構成されており；HDO(cDNA 10MOE)の第2核酸鎖c(DNA 10MOE)は、ウイング領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成され、ギャップ領域がDNAヌクレオシド構造で構成されており；HDO(agRNA 10MOE)の第2核酸鎖c(agRNA 10MOE)は、ウイング領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成され、ギャップ領域においてはアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドである。
　表19に記載される核酸分子について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、14nmol/匹とした。
（結果）
　図51は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(all DNA)、HDO(cRNA 10MOE)、HDO(cDNA 10MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)の投与群では、ASO投与群と比較して、総移動距離（図51A）及び平均移動速度（図51B）を著しく改善させた。また、HDO(cRNA 10MOE)、HDO(cDNA 10MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)の投与群では、総移動距離及び平均移動速度がHDO(all DNA)の投与群と比較して改善した。更にHDO(agRNA 10MOE)の投与群では、総移動距離及び平均移動速度がHDO(cRNA 10MOE)及びHDO(cDNA 10MOE)の投与群と比較して改善した。この結果から、第2核酸鎖のギャップ領域においてアデニン塩基及びグアニン塩基の位置がRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基の位置がDNAヌクレオシドであるHDOは、1本鎖ASO及び他のHDOと比較して中枢神経毒性を顕著に軽減し得ることが示された。
　図52は、各種核酸剤の脳室内投与から7日後において右左の前頭葉におけるMalat1 RNA発現レベルを示す。HDO(agRNA 10MOE)投与群はASO投与群及び他のHDO投与群と比較して、Malat1 RNA発現レベルを顕著に抑制する効果を示した。この結果から、ギャップ領域においてアデニン塩基及びグアニン塩基の位置がRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基の位置がDNAヌクレオシドである第2核酸鎖を含むHDOが、ギャップ領域において全てのヌクレオシドがDNAヌクレオシド又はRNAヌクレオシドである第2核酸鎖を含むHDOと比較して、優れた遺伝子発現抑制効果を達成し得ることが示された。
＜実施例20：脳組織における2本鎖解離効率の評価＞
（目的）
　標的組織において第1核酸鎖は第2核酸鎖から解離し、標的遺伝子やその転写産物に対するアンチセンス効果を発揮し得る。そのため、第1核酸鎖及び第2核酸鎖を含むHDOをマウスの脳組織ホモジネート中でインキュベートし、その2本鎖解離効率を検討する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例では、実施例19と同一のASO、HDO(cRNA 10MOE)、HDO(cDNA 10MOE)、及びHDO(agRNA 10MOE)を使用した。ASO及びHDOは、実施例19と同様の方法により調製した。
（２）脳組織ホモジネート中における2本鎖解離効率の評価
　25μMのHDO(ASO/cRNA)及びHDO(ASO/cDNA)各5.2μLに対して、マウス脳ホモジネート溶液を16.7μL及びPBSを28.1μL混合し、37℃ incubatorでインキュベートした。インキュベーション後、プロテインキナーゼKとの混合により反応を停止させた。
　16％アクリルアミドゲル(1×TBE)を準備、作製した。上記サンプル9.6μLをゲルにロードし、100V 120分で泳動した。対照としてASO単独を同時に泳動した。その後、1×TBEでGelRed(×10000)水溶液(Biotium)を1/10000の濃度に希釈した溶液を作製した。ゲルを10分間その溶液で浸透した。その後、ChemiDoc Touchイメージングシステム(BioRad社)でゲルを撮影した。
（結果）
　図53は、ASO、HDO(cRNA 10MOE)、HDO(cDNA 10MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)をマウス脳組織ホモジネート中で7日間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。HDO(agRNA 10MOE)は、HDO(cRNA 10MOE)及びHDO(cDNA 10MOE)と比較して、7日間インキュベート後の2本鎖核酸（図53、矢印）が著しく減少し、脳組織内で極めて優れた2本鎖分離能力を有することが明らかになった。ギャップ領域においてアデニン塩基及びグアニン塩基の位置がRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基の位置がDNAヌクレオシドである第2核酸鎖を含むHDOは、ギャップ領域において全てのヌクレオシドがDNAヌクレオシド又はRNAヌクレオシドである第2核酸鎖を含むHDOと比較して脳組織内において2本鎖解離効率が極めて高く、上記の実施例19において標的遺伝子の発現を顕著に抑制した結果を強く裏付けた。
＜実施例21：第2核酸鎖のウイング領域に導入すべき核酸修飾の検討＞
（目的）
　Malat1遺伝子を標的とするHDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、第2核酸鎖のウイング領域及びギャップ領域におけるMOE修飾核酸又は天然核酸（RNA又はDNA）の導入による影響をin vivo実験により比較する。
（方法）
　本実施例で用いたHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表20に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(cRNA MOEwing)、HDO(gapMOE RNA)、HDO(cDNA MOEwing)、HDO(gapDNA MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)は、いずれも上記ASOを共通の第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖は、DNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(cRNA MOEwing)の第2核酸鎖は、ウイング領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成され；ギャップ領域がRNAヌクレオシド構造で構成されており；HDO(gapMOE RNA)の第2核酸鎖は、ウイング領域に相当する領域がRNAヌクレオシドで構成され、ギャップ領域に相当する領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシド構造で構成されており；HDO(cDNA MOEwing)の第2核酸鎖は、ウイング領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成され、ギャップ遼言う気がDNAヌクレオシド構造で構成されており；HDO(gapMOE DNA)の第2核酸鎖は、ウイング領域に相当する領域がDNAヌクレオシドで構成され、ギャップ領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシド構造で構成されており；HDO(agRNA 10MOE)の第2核酸鎖は、ウイング領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成され、ギャップ領域においてはアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドである。
　表21に記載される核酸分子について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、28nmol/匹とした。
（結果）
　図54は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。HDO(cRNA MOEwing)、HDO(gapMOE RNA)、HDO(cDNA MOEwing)、HDO(gapDNA MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)の投与群では、HDO(all DNA)の投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。また、HDO(gapMOE RNA)、HDO(cDNA MOEwing)、HDO(gapDNA MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)の投与群では、HDO(cDNA MOEwing)の投与群と比較して、急性期忍容性スコアが更に減少した。
　図55は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(cRNA MOEwing)、HDO(gapMOE RNA)、HDO(cDNA MOEwing)、HDO(gapDNA MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)の投与群では、HDO(all DNA)の投与群と比較して、総移動距離（図55A）及び平均移動速度（図55B）を著しく改善させた。また、HDO(gapMOE RNA)、HDO(cDNA MOEwing)、HDO(gapDNA MOE)及びHDO(agRNA 10MOE)の投与群では、HDO(cDNA MOEwing)の投与群と比較して、総移動距離及び平均移動速度を改善させた。
　この結果から、第2核酸鎖においてMOE修飾をウイング領域又はギャップ領域に含むHDOは、第2核酸鎖がDNAヌクレオシドからなるHDOと比較して、中枢神経毒性の軽減を達成し得ることが示された。
＜実施例22：第2核酸鎖のギャップ領域に導入すべき核酸種の検討：急性／遅発性神経毒性の比較＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有するMOE wing修飾型第2核酸鎖を含むHDOを脳室内投与する場合に見られる、投与後1日以内の急性神経毒性、及び投与1日後以降の遅発性神経毒性について、毒性軽減効果をin vivo実験により比較する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表21に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
 　本実施例で用いたHDO(all DNA)、HDO(cRNA 6MOE)、HDO(cDNA 6MOE)、及びHDO(agRNA 6MOE)は、上記ASOを共通の第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖（c(all DNA)）はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(cRNA 6MOE)の第2核酸鎖は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のRNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(cDNA 6MOE)の第2核酸鎖は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(agRNA 6MOE)の第2核酸鎖は、5’末端の3個の2'-O-Me-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-Me-RNAヌクレオシド、及びそれらの間のギャップ領域から構成され、ギャップ領域においてはアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドである。
　表21に記載されるASO、HDO(all DNA)、HDO(cRNA 6MOE)、HDO(cDNA 6MOE)、及びHDO(agRNA 6MOE)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、28nmol/匹とした。
（結果１：急性神経毒性）
　図56は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として投与1日以内の急性の中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(cRNA 6MOE)、HDO(cDNA 6MOE)、及びHDO(agRNA 6MOE)の投与群では、ASO及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。さらに、HDO(agRNA 6MOE)投与群は、HDO(cRNA 6MOE)及びHDO(cDNA 6MOE)の投与群と比較して低い急性期忍容性スコアを示した。この結果から、第2核酸鎖のギャップ領域においてはアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドであるHDOは、その他のHDOと比較しても中枢神経毒性を顕著に軽減する効果を達成し得ることが示された。
　図57は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(cRNA 6MOE)、HDO(cDNA 6MOE)、及びHDO(agRNA 6MOE)の投与群では、ASO及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、総移動距離（図57A）及び最大移動速度（図57B）が改善した。更にHDO(agRNA 6MOE)投与群では、HDO(cRNA 6MOE)及びHDO(cDNA 6MOE)投与群と比較して運動機能が著しく改善した。この結果から、第2核酸鎖のギャップ領域においてはアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドであるHDOは、その他のHDOと比較しても、運動機能に与える影響が極めて小さく、毒性が極めて低いことが示された。
（結果２：遅発性神経毒性）
　図58は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として投与1日後以降の遅発性の中枢神経毒性としてマウスの体重減少を評価した結果を示す。投与0、7、14、及び21日後に体重を測定したところ、投与7、14、及び21日のいずれの時点においてもASO及びHDO(all DNA)の投与群はPBS投与群と比較して体重減少を示し、HDO(cRNA 6MOE)、HDO(cDNA 6MOE)、及びHDO(agRNA 6MOE)の投与群では、ASO及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、体重減少効果の軽減を示した。
　図59は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として投与1日後以降の遅発性の中枢神経毒性としてマウスの運動機能を評価した結果を示す。投与から7、14、21日後のいずれの時点においててもHDO(cRNA 6MOE)、HDO(cDNA 6MOE)、及びHDO(agRNA 6MOE)の投与群では、ASO及びHDO(all DNA)の投与群と比較して、最大移動速度に対する減少効果が軽減された。
（結果３：標的遺伝子抑制効果）
　図60は、各種核酸剤の脳室内投与から21日後において右前頭葉におけるMapt mRNA発現レベルを示す。HDO(agRNA 6MOE)投与群は、HDO(cRNA 6MOE)及びHDO(cDNA 6MOE)の投与群と比較して、Mapt mRNA発現レベルを顕著に抑制する効果を示した。この結果から、第2核酸鎖のギャップ領域においてアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドであるHDOが、第2核酸鎖がDNAヌクレオシド又はRNAヌクレオシドからなるHDOと比較して優れた遺伝子発現抑制効果を達成し得ることが示された。
（結果４：脳組織ホモジネート中における2本鎖解離効率の評価）
　図61は、脳組織ホモジネート中における核酸剤の2本鎖解離効率評価のために実施例20と同様の方法を用いて、HDO(cRNA 6MOE)、HDO(cDNA 6MOE)、及びHDO(agRNA 6MOE)をマウス脳組織中で7日間インキュベートした後の電気泳動結果を示す。HDO(agRNA 6MOE)は、HDO(cRNA 6MOE)及びHDO(cDNA 6MOE)と比較して脳組織ホモジネート中で高い2本鎖解離効率を示した。この結果から、第2核酸鎖のギャップ領域においてアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドであるHDOが、第2核酸鎖がDNAヌクレオシド又はRNAヌクレオシドからなるHDOと比較して脳組織内において2本鎖解離効率が極めて高く、上記の結果３において標的遺伝子の発現を顕著に抑制した結果を強く裏付けた。
＜実施例23：全MOE修飾型ASOを含むHDOの第2核酸鎖へのMOE修飾の導入＞
（目的）
　本実施例では、Mecp2遺伝子を標的としてスプライシングを制御することができる、全てのヌクレオシドがMOE修飾ヌクレオシドで構成されるASO（以下、「全MOE修飾型ASO」という）を第1核酸鎖として含むHDOを対象とする。当該HDOを脳室内投与する場合に見られる中枢神経毒性について、第2核酸鎖にMOE修飾を導入することによって毒性が軽減され得ることをin vivo実験により検証する。
（方法）
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表22に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　本実施例で用いたASOは、MeCP2 (methyl-CpG binding protein 2) pre-mRNAを標的とする非ギャップマー型のアンチセンス核酸であり、MECP2 pre-mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、全てのヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された2'-O-MOE-RNAヌクレオシドである。
　本実施例で用いたHDO(all DNA)及びHDO(cRDNA MOE)は、上記ASOを共通の第1核酸鎖として含み、第2核酸鎖は第1核酸鎖に相補的な配列を有する。具体的には、HDO(all DNA)の第2核酸鎖はDNAヌクレオシドがホスホジエステル結合で連結された構造を有する。HDO(cRDNA MOE)の第2核酸鎖は、5’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、3’末端の3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、及びそれらの間のギャップ領域から構成され、ギャップ領域においてはアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドである。
　表22に記載されるASO、HDO(all DNA)、及びHDO(cRDNA MOE)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、並びに中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、28nmol/匹とした。
（結果）
　図62は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として急性の中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、HDO(all DNA)及びHDO(cRDNA MOE)の投与群では、ASO投与群と比較して、急性期忍容性スコアが著しく減少した。さらに、HDO(cRDNA MOE)投与群は、HDO(all DNA)投与群と比較して低い急性期忍容性スコアを示した。この結果から、第2核酸鎖のウイング領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成され、ギャップ領域においてはアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドであるHDOは、その他のHDOと比較しても低い中枢神経毒性を達成し得ることが示された。
　図63は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。HDO(all DNA)及びHDO(cRDNA MOE)の投与群では、ASO投与群と比較して、総移動距離（図63A）及び最大移動速度（図63B）が改善した。更にHDO(cRDNA MOE)投与群は、HDO(all DNA)投与群と比較して総移動距離及び最大移動速度を改善した。この結果から、第2核酸鎖のウイング領域が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成され、ギャップ領域においてはアデニン塩基及びグアニン塩基を有するヌクレオシドがRNAヌクレオシドであり、シトシン塩基及びチミン塩基を有するヌクレオシドがDNAヌクレオシドであるHDOは、その他のHDOと比較しても、運動機能を抑制する効果が極めて小さく、毒性が極めて低いことが示された。
＜実施例24：一本鎖HDO＞
（目的）
　Bace1遺伝子を標的とするASOからなる第1核酸鎖と第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有する第2核酸鎖とをリンカーにより連結した一本鎖HDO（ssHDO）の神経細胞毒性について、in vitro実験により検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたHDO及びssHDOの塩基配列と化学修飾を表23に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
（２）遺伝子抑制効果の評価
　（１）で調製したHDOをヒト神経芽細胞腫由来細胞（Neuro2a細胞株）にリポフェクション法(lipofectamine2000)を用いて導入した。
　HDO導入から48時間後にIsogenIキット(株式会社ジーンデザイン)を使用して、細胞からRNAを抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master, DNase（ロシュ・ダイアグノスティックス社(Roche Diagnostics)）を使用してプロトコルに従って合成した。次に、得られたcDNAを鋳型として定量RT-PCRを行うことにより、Bace1 mRNA及びActb mRNA (内部標準遺伝子)の発現量を測定した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドサイエンス社(Roche Applied Science))により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーとして、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Sceientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計及び製造された製品を用いた。増幅は、95℃15秒、60℃30秒、及び72℃1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返すことにより行った。
　Actb mRNA(内部標準遺伝子)発現量に対するBace1 mRNA発現量の比率を計算し、PBS投与群の値に対して標準化した値を相対的Bace1 mRNAレベルとした。
（３）細胞毒性の評価
　導入48時間後に神経細胞毒性の評価として、細胞上清中の乳酸脱水素酵素（LDH）活性を測定した。LDH活性測定は、Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（同仁化学研究所）を使用して、添付プロトコルに従って実施した。PBS投与群のLDH活性に対して標準化した値を相対的LDH放出レベルとした。
（結果）
　図64Bは、マウス神経芽細胞腫由来細胞（Neuro2a細胞株）において各種核酸剤による標的遺伝子抑制効果を評価した結果を示す。ssHDOの投与群ではHDO(all DNA)と同等の強い遺伝子抑制効果が得られた。
　図64Aは、各種核酸剤を細胞内に導入した際の細胞毒性として、上清中のLDH活性を評価した結果を示す。ssHDOを5nM及び25nMで投与した細胞では、それぞれHDO(all DNA)を5nM及び25nMで投与した細胞と比較して、LDH活性の上昇が抑制されており、細胞毒性が著しく減少した。この結果から、2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むssHDOでは細胞毒性が顕著に低下することが示された。
　以上の結果から、ssHDOによって、神経細胞毒性の軽減と強力な遺伝子抑制効果の両方が達成されることが示された。
＜実施例25：サルにおける中枢神経毒性評価＞
（目的）
　MOE修飾を含むHDOをサルに髄腔内投与して、中枢神経毒性を評価する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたASO、並びにHDOを構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表24に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　表24に記載されるASO、HDO(all DNA)、及びHDO(DNA MOE)，HDO(RNA MOE) HDO(DNARNA MOE)をについて、実施例1と同様の方法により核酸の調製を行った。
（２）サルにおける中枢神経毒性の評価
　雄のカニクイザル（3歳齢、2kg）2頭を対象として、ASO、HDO(all DNA)、HDO(DNA MOE)、HDO(RNA MOE)、及びHDO(DNARNA MOE)を投与した。投与方法としては、ASO又はHDO を0.94μmolを腰椎穿刺のうえ髄腔内投与した。
　髄腔内投与から1、2、及び3時間後のサルについて、中枢神経毒性を評価するために図65に示す修正FOBスコア及び3分間のビデオ動画による自発的運動時間またはジャンプ回数の測定を、それぞれ盲検化された評価者による行動評価を行った。
（結果）
　図66は、各種核酸剤を髄腔内投与したサルを対象として急性の中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から1時間後、2時間後、及び3時間後のいずれの時点においても、HDO(all DNA)、HDO(DNA MOE)、HDO(RNA MOE)、及びHDO(DNARNA MOE)の投与群では、ASO投与群と比較して、修正FOBスコアが著しく減少した。更に、HDO(DNA MOE)及びHDO(DNARNA MOE)の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、修正FOBスコアが減少した。
　また、3分間のビデオ動画による自発的運動時間及びジャンプ回数を測定した結果を図67に示す。HDO(all DNA)、HDO(DNA MOE)、HDO(RNA MOE)、及びHDO(DNARNA MOE)の投与群では、ASO投与群と比較して、自発的運動時間又はジャンプ回数が減少する効果が抑制された。更に、HDO(DNA MOE)及びHDO(DNARNA MOE)の投与群では、HDO(all DNA)投与群と比較して、自発的運動時間又はジャンプ回数が減少する効果が抑制された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (62)

  1. 　第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む二本鎖核酸複合体であって、
    　前記第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、前記標的遺伝子又はその転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
    　前記第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ2'-修飾ヌクレオシドを1個以上含む、前記二本鎖核酸複合体。
  2. 　前記第1核酸鎖がギャップマーである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  3. 　前記第1核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが修飾ヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  4. 　前記第1核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'-修飾ヌクレオシドである、請求項３に記載の二本鎖核酸複合体。
  5. 　前記第1核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドである、請求項４に記載の二本鎖核酸複合体。
  6. 　前記第2核酸鎖が、5’末端に位置する1個又は連続する2～10個の2'-修飾ヌクレオシド、及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2～10個の2'-修飾ヌクレオシドを含む、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  7. 　前記第2核酸鎖が、5’末端及び3’末端以外の位置に、1～7個の2'-修飾ヌクレオシドを含む、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  8. 　前記第1核酸鎖が、
    　(1)少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、
    　(2)前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び
    　(3)前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、請求項２に記載の二本鎖核酸複合体。
  9. 　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に2'-修飾ヌクレオシドを含む、請求項８に記載の二本鎖核酸複合体。
  10. 　前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドである、請求項９に記載の二本鎖核酸複合体。
  11. 　前記第2核酸鎖における前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、プリン塩基を含む全てのヌクレオシドがリボヌクレオシドである、請求項１０に記載の二本鎖核酸複合体。
  12. 　前記第2核酸鎖における前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域において、ピリミジン塩基を含む全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである、請求項１１に記載の二本鎖核酸複合体。
  13. 　前記第2核酸鎖において、前記2'-修飾ヌクレオシドが、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド又は2'-O-メチル修飾ヌクレオシドである、請求項１２に記載の二本鎖核酸複合体。
  14. 　前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが、
    　(a)デオキシリボヌクレオシド、
    　(b)デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシド、
    　(c)デオキシリボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、
    　(d)リボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、又は
    　(e)デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、及び2'-修飾ヌクレオシド
    である、請求項８に記載の二本鎖核酸複合体。
  15. 　前記第2核酸鎖において、
    　前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドであり、かつ
    　前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである、請求項１４に記載の二本鎖核酸複合体。
  16. 　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖の前記中央領域における少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含む、請求項８に記載の二本鎖核酸複合体。
  17. 　(i)前記第1核酸鎖における少なくとも1個のグアノシンヌクレオシド、
    　(ii)前記グアノシンヌクレオシドの5'末端側に隣接するヌクレオシド、
    　(iii)前記グアノシンヌクレオシドの3'末端側に隣接するヌクレオシド、又は
    　(iv) (i)～(iii)の任意の組み合わせ
    に相補的である前記第2核酸鎖におけるヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  18. 　(i)前記第1核酸鎖の5'ウイング領域における少なくとも1個のグアノシンヌクレオシド、
    　(ii)前記グアノシンヌクレオシドの5'末端側に隣接するヌクレオシド、
    　(iii)前記グアノシンヌクレオシドの3'末端側に隣接するヌクレオシド、又は
    　(iv) (i)～(iii)の任意の組み合わせ
    に相補的である前記第2核酸鎖におけるヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  19. 　前記第2核酸鎖において、アデニン塩基又はピリミジン塩基を含むヌクレオシドの少なくとも1個が2'-修飾ヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  20. 　前記第2核酸鎖においてピリミジン塩基を含むヌクレオシドの少なくとも1個が2'-修飾ヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  21. 　前記第2核酸鎖が、ピリミジン塩基を含む天然リボヌクレオシドを含まない、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  22. 　前記第2核酸鎖においてピリミジン塩基を含むヌクレオシドの全てが2'-修飾ヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドである、請求項１８に記載の二本鎖核酸複合体。
  23. 　前記第2核酸鎖において、ヌクレオシドの20％以上が、2'-修飾ヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  24. 　前記第2核酸鎖において、2'-修飾ヌクレオシド以外の全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  25. 　前記第2核酸鎖において、第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが2'-修飾ヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  26. 　前記第2核酸鎖において、前記2'-修飾ヌクレオシドが、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド及び／又は2'-O-メチル修飾ヌクレオシドである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  27. 　前記第2核酸鎖が、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、scpBNAヌクレオシド、AmNAヌクレオシド、又はBNA-NCを少なくとも1個含む、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  28. 　前記第1核酸鎖がミックスマーである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  29. 　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に対して非相補的な塩基配列からなるバルジ構造を少なくとも1つ含む、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  30. 　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に対して、非相補的塩基、及び／又は1塩基以上の、挿入配列及び／又は欠失を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  31. 　前記第2核酸鎖が、前記非相補的塩基を1～3個含む、請求項２７に記載の二本鎖核酸複合体。
  32. 　前記挿入配列が1～8塩基からなる、請求項３０に記載の二本鎖核酸複合体。
  33. 　前記欠失が連続する1～4塩基からなる、請求項３０に記載の二本鎖核酸複合体。
  34. 　前記第2核酸鎖の前記非相補的塩基がバルジ構造を形成する、又は
    　前記第2核酸鎖の前記欠失位置に、前記第1核酸鎖に対して非相補的な塩基配列からなるバルジ構造を含む、請求項３０に記載の二本鎖核酸複合体。
  35. 　前記バルジ構造が糖非修飾ヌクレオシドを含む、又は前記バルジ構造において全てのヌクレオシドが糖非修飾ヌクレオシドである、請求項２９に記載の二本鎖核酸複合体。
  36. 　前記バルジ構造が1～10塩基長である、請求項２９に記載の二本鎖核酸複合体。
  37. 　前記第2核酸鎖において、前記バルジ構造以外の全てのヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドである、請求項２９に記載の二本鎖核酸複合体。
  38. 　前記第2核酸鎖が少なくとも8塩基長である、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  39. 　前記第2核酸鎖の塩基長が第1核酸鎖の塩基長よりも短い、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  40. 　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる領域の5'末端側及び／又は3'末端側に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  41. 　前記オーバーハング領域が1～20塩基長である、請求項４０に記載の二本鎖核酸複合体。
  42. 　前記オーバーハング領域が、少なくとも1個のデオキシリボヌクレオシド及び／又は非天然ヌクレオシドを含む、請求項４０に記載の二本鎖核酸複合体。
  43. 　前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖とがリンカーを介して結合している、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  44. 　前記リンカーが、
    　前記第1核酸鎖の5'末端と前記第2核酸鎖の3'末端とを結合する、及び／又は
    　前記第1核酸鎖の3'末端と前記第2核酸鎖の5'末端とを結合する、請求項４３に記載の二本鎖核酸複合体。
  45. 　前記リンカーが切断性（cleavable）又は非切断（uncleavable）リンカーである、請求項４３に記載の二本鎖核酸複合体。
  46. 　前記リンカーが、天然ヌクレオシド及び／若しくは非天然ヌクレオシドを含む核酸、又はポリエチレングリコールからなる、請求項４３に記載の二本鎖核酸複合体。
  47. 　前記核酸からなるリンカーが2～10塩基長である、請求項４６に記載の二本鎖核酸複合体。
  48. 　前記第2核酸鎖がリガンドに結合している、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  49. 　前記リガンドが、低分子、ペプチド、脂質、及び核酸アプタマーからなる群から選択されるいずれか1以上である、請求項４８に記載の二本鎖核酸複合体。
  50. 　前記脂質がコレステロール若しくはその類縁体、又はトコフェロール若しくはその類縁体である、請求項４９に記載の二本鎖核酸複合体。
  51. 　前記リガンドが前記第2核酸鎖の5’末端及び／又は3’末端に結合している、請求項４５に記載の二本鎖核酸複合体。
  52. 　リガンドと結合していない、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  53. 　前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  54. 　前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項５３に記載の二本鎖核酸複合体。
  55. 　請求項１～５４のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体を有効成分として含む医薬組成物。
  56. 　被検体の中枢神経系疾患を治療するための、請求項５５に記載の医薬組成物。
  57. 　脳室内投与又は髄腔内投与される、請求項５５に記載の医薬組成物。
  58. 　前記髄腔内投与が後頭窩穿刺又は腰椎穿刺である、請求項５７に記載の医薬組成物。
  59. 　前記二本鎖核酸複合体が0.1mg～200mg投与される、請求項５７に記載の医薬組成物。
  60. 　静脈内投与又は皮下投与される、請求項５５に記載の医薬組成物。
  61. 　前記二本鎖核酸複合体が0.1mg/kg～100mg/kg投与される、請求項６０に記載の医薬組成物。
  62. 　中枢神経毒性が低減されている、請求項５５に記載の医薬組成物。
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