WO2023054659A1 - オルガノイドの製造方法、オルガノイド製造用培地、オルガノイド及び被験物質の評価方法 - Google Patents

オルガノイドの製造方法、オルガノイド製造用培地、オルガノイド及び被験物質の評価方法 Download PDF

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    • C12N2533/92—Amnion; Decellularised dermis or mucosa

Definitions

  • the present invention relates to an organoid production method, an organoid production medium, an organoid, and a test substance evaluation method.
  • TGF- ⁇ signaling is known to be involved in the growth inhibitory ability and extracellular matrix accumulation ability of many cells such as epithelial cells, endothelial cells, blood cells, and lymphocytes. Regulation of TGF- ⁇ signaling is required for organoid production, and in particular for cell proliferation, TGF- ⁇ signaling needs to be down-regulated.
  • Patent Document 1 As a method for downregulating TGF- ⁇ signaling, a TGF- ⁇ receptor antagonist that binds to and inhibits the TGF- ⁇ receptor, which is one of the receptors for TGF- ⁇ signaling, has been used (Patent Document 1). , see Non-Patent Document 1). However, when using antagonists such as A83-01, it has been reported that off-target (off-target, receptors other than TGF- ⁇ receptor) will also be inhibited, and there is concern about the effect (non- See Patent Document 2).
  • the purpose of the present invention is to provide an excellent method for producing organoids, a medium used for the production, organoids obtained by the production method, and a method for evaluating a test substance using organoids.
  • the present invention includes the following embodiments.
  • Human stem cells containing a cyclic peptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof (hereinafter also referred to as "cyclic peptide group”) A method of producing an organoid comprising culturing in a medium.
  • X 1 represents Tyr, W6N, W7N, or Nal1
  • X 2 represents Val, Lys, KCOp, or KCOm
  • X 3 represents Tyr, or 4Py
  • X 4 represents Asp, Phe, KCOp, Glu, or KCOm
  • X 5 represents Tyr, or 4Py
  • X 6 represents Val, Glu, KCOp, or KCOm
  • X 7 represents any amino acid residue
  • R is absent or represents a C-terminal modification group
  • n represents an integer of 0 or 1
  • PeG is N-(2-phenylethyl)-glycine
  • NaI1 is ⁇ -( 1-naphthyl)-L-alanine
  • W6N is (S)-2-amino-3-(1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-3-yl)propanoic acid
  • W7N is ( S)-2-amino-3-(1H-pyrrolo[2,3-
  • the medium further contains epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor (IGF) or hepatocyte growth factor (HGF), or a combination thereof
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • BMP bone morphogenetic protein
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the method for producing organoids according to any one of [1] to [9] wherein the medium further contains a Rho kinase (ROCK) signaling inhibitor.
  • ROCK Rho kinase
  • X 1 represents Tyr, W6N, W7N, or Nal1
  • X 2 represents Val, Lys, KCOp, or KCOm
  • X 3 represents Tyr, or 4Py
  • X 4 represents Asp, Phe, KCOp, Glu, or KCOm
  • X 5 represents Tyr, or 4Py
  • X 6 represents Val, Glu, KCOp, or KCOm
  • X 7 represents any amino acid residue
  • R is absent or represents a C-terminal modification group
  • n represents an integer of 0 or 1
  • PeG is N-(2-phenylethyl)-glycine
  • NaI1 is ⁇ -( 1-naphthyl)-L-alanine
  • W6N is (S)-2-amino-3-(1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-3-yl)propanoic acid
  • W7N is ( S)-2-amino-3-(1H-pyrrolo[2,3-
  • the present invention it is possible to provide a method for producing organoids with excellent proliferative properties, a medium used in the production method, organoids obtained by the production method, and a method for evaluating a test substance using organoids.
  • FIG. 1 is a microscope image showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Experimental Example 4.
  • FIG. 5 is a microscope image showing the results of Experimental Example 5.
  • FIG. 6 is a microscope image showing the results of Experimental Example 5.
  • FIG. 7 is a microscope image showing the results of Experimental Example 6.
  • A, B, a, and b represent arbitrary numerical values, and in the case of the relationship of A>B>a>b, in this specification, notation representing a numerical range such as “A to B” is “A or more, B or less” is synonymous.
  • notations representing numerical ranges such as “A to B, preferably a to b" are "A or more, B or less", “A or more, b or less", “a or more, B or less ”, and “a or more and b or less”.
  • medium containing substance X and “in the presence of substance X” refer to a medium supplemented with exogenous substance X, a medium containing exogenous substance X, or an exogenous means the presence of the substance X of That is, when cells or tissues present in the medium endogenously express, secrete, or produce the substance X, the endogenous substance X is distinguished from the exogenous substance X, and the exogenous substance A medium that does not contain X does not fall under the category of "medium containing substance X" even if it contains endogenous substance X.
  • the present invention comprises culturing human stem cells in a medium containing a cyclic peptide having an amino acid sequence represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, of organoids
  • a manufacturing method is provided.
  • human stem cells When human stem cells are cultured in the above medium, the human stem cells proliferate and form organoids containing both stem cells and differentiated cells.
  • amino acids include natural amino acids and non-natural amino acids.
  • a cyclic peptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be referred to as a "cyclic peptide group”.
  • X 1 represents Tyr, W6N, W7N, or Nal1
  • X 2 represents Val, Lys, KCOp, or KCOm
  • X 3 represents Tyr, or 4Py
  • X 4 represents , Asp, Phe, KCOp, Glu or KCOm
  • X5 is Tyr or 4Py
  • X6 is Val, Glu, KCOp or KCOm
  • X7 is any amino acid residue.
  • R is absent or represents a C-terminal modification group
  • n represents an integer of 0 or 1
  • PeG is N-(2-phenylethyl)-glycine
  • Nal1 is ⁇ -(1- naphthyl)-L-alanine
  • W6N is (S)-2-amino-3-(1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-3-yl)propanoic acid
  • W7N is (S) -2-amino-3-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)propanoic acid
  • KCOp is N6-(4-(carboxymethyl)piperazine-1-carbonyl)-L- is lysine
  • KCOm is N6-(methyl((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-)pentahydroxyhexyl)carbamoyl)-L-lysine
  • 4Py is 4 -pyr
  • human stem cells can be cultured without using a TGF- ⁇ receptor antagonist such as A83-01.
  • TGF- ⁇ receptor antagonist such as A83-01.
  • Many antagonists are known to act on multiple receptors. It is known to strongly act on FGF-R1.
  • the cyclic peptides act on the ligand of the TGF- ⁇ receptor, and thus can overcome the off-target effects of TGF- ⁇ receptor antagonists.
  • TGF- ⁇ receptor ligand refers to a ligand having an agonistic action.
  • the cyclic peptide group in the medium is lower than the required concentration of the TGF- ⁇ receptor antagonist. Cultivate human stem cells. can also
  • the cyclic peptide group is presumed to be capable of binding, preferably specifically binding, to exogenous or endogenous TGF- ⁇ receptor ligands.
  • a cyclic peptide group is used instead of a TGF- ⁇ receptor antagonist in cell culture that has been performed using a conventional TGF- ⁇ receptor antagonist such as A83-01. It is also possible to culture human stem cells at lower concentrations of TGF- ⁇ receptor antagonist than required.
  • human stem cells refer to human cells or human-derived cells that have self-renewal ability and differentiation ability.
  • Human stem cells include, for example, human epithelial stem cells, human mesenchymal stem cells, human vascular cells, human somatic stem cells such as human cancer cells; human induced pluripotent stem cells (hiPSC), human embryonic stem cells (hESC), etc. human pluripotent stem cells; human progenitor cells, which are cells in the middle of differentiating from human stem cells into specific somatic cells or germ cells, and have the potential to differentiate into specific tissues and organs;
  • a cell population containing human stem cells can be used as the human stem cells.
  • Dispersion refers to separating cells into a cell population of 100 or less, preferably 50 or less, more preferably single cells by dispersing treatment such as enzymatic treatment or physical treatment.
  • the dispersing treatment includes, for example, mechanical dispersing treatment; treatment using a cell dispersing solution such as trypsin, collagenase, papain, ethylenediaminetetraacetic acid; Prior to dispersion treatment, cells can be treated with cytoprotective agents such as heparin, ROCK inhibitors, insulin-like growth factors, etc. to prevent cell death.
  • the cyclic peptide is represented by seq. in the following formula (1-1) (SEQ ID NO: 1). 5-8 containing Asn-Val-Tyr-Asp (SEQ ID NO: 2), or Asn-Val-4Py-Asp, and seq. 11 to 14 contain Val-Nal1-Tyr-His or Val-Nal1-4Py-His. Peptides having these amino acid sequences have activity as ligands for the TGF- ⁇ receptor.
  • seq. 2, 4, 9, and 15 are each composed of residues selected from the group consisting of hydrophilic amino acids, hydrophobic amino acids, and aromatic amino acids, and the combination of these residues is adjusted as appropriate. , it is possible to control the solubility in the medium while maintaining the higher-order structure of the cyclic peptide.
  • X 7 is a linker at the C-terminus of the peptide, and can be any one or more amino acid residues. X7 is used for binding with puromycin, low-molecular-weight compounds, other peptides, proteins, etc. in the translational synthesis system. X7 includes those containing Gly and Gly-Lys. Moreover, n is 0 or 1.
  • R is not present or is a modification group of the C-terminal carboxyl group, the C-terminal carboxyl group and the modification group form a structure of -COOR, remove the negative charge of the carboxyl group and add a positive charge Modifying groups are preferred.
  • modifying groups include amino, amido, aminoethyl, pyrazolidine, piperidine, imidazolidine, and piperazine groups.
  • R can contain a polyethylene glycol chain.
  • the combination of X 1 to X 6 of the cyclic peptide is preferably any of the combinations shown in Table 1 above, where X 1 is Nal1, X 2 is Val, X 4 is Asp , X5 is Tyr and X6 is Val or KCOp.
  • the cyclic peptide can be produced by a known production method such as a chemical synthesis method such as a liquid phase method, a solid phase method, a hybrid method combining a liquid phase method and a solid phase method, or a genetic recombination method. can.
  • a cyclic peptide is synthesized by the following method.
  • the hydroxyl group of the resin having a hydroxyl group and the carboxyl group of the first amino acid (usually the C-terminal amino acid of the target peptide) whose ⁇ -amino group is protected with a protective group are subjected to an esterification reaction.
  • Known dehydration condensation agents such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) can be used as the esterification catalyst.
  • the protective group for the ⁇ -amino group of the first amino acid is eliminated, and a second amino acid having all functional groups other than the carboxy group of the main chain protected is added to activate the carboxy group. , joins the first and second amino acids. Furthermore, deprotecting the ⁇ -amino group of the second amino acid, adding a third amino acid in which all functional groups other than the carboxy group of the main chain are protected, activating the carboxy group, the second and A third amino acid is attached. After repeating this process and synthesizing a peptide of the desired length, all functional groups are deprotected.
  • Resins used in the solid phase method include Merrifield resin, MBHA resin, Cl-Trtre resin, SASRIN resin, Wang resin, Rink amide resin, HMFS resin, Amino-PEGA resin (Merck), HMPA-PEGA resin (Merck). ) and the like. These resins can be used after washing with a solvent (dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride, etc.).
  • a solvent dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride, etc.
  • ⁇ -amino-protecting groups examples include benzyloxycarbonyl (Cbz or Z) group, tert-butoxycarbonyl (Boc) group, fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, benzyl group, allyl group, allyloxycarbonyl (Alloc ) groups and the like.
  • Cbz groups can be deprotected by hydrofluoric acid, hydrogenation, etc.
  • Boc groups can be deprotected by trifluoroacetic acid (TFA)
  • Fmoc groups can be deprotected by treatment with piperidine.
  • methyl ester ethyl ester, benzyl ester, tert-butyl ester, cyclohexyl ester, etc.
  • methyl ester ethyl ester, benzyl ester, tert-butyl ester, cyclohexyl ester, etc.
  • hydroxy groups of serine and threonine can be protected with benzyl groups and tert-butyl groups, and hydroxy groups of tyrosine can be protected with 2-bromobenzyloxycarbonyl groups and tert-butyl groups.
  • Amino groups of lysine side chains and carboxy groups of glutamic acid and aspartic acid can be protected in the same manner as ⁇ -amino and ⁇ -carboxy groups.
  • Condensing agents include, for example, dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC or WSC), (1H-benzotriazol-1-yloxy)tris (dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate (BOP), 1-[bis(dimethylamino)methyl]-1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU) and the like.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCDI diisopropylcarbodiimide
  • EDC or WSC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
  • BOP 1-[bis(dimethylamino)methyl]-1H-benzotriazolium-3-oxide
  • Cleavage of the peptide chain from the resin can be performed by treatment with an acid such as TFA or hydrogen fluoride (HF).
  • an acid such as TFA or hydrogen fluoride (HF).
  • cyclic peptides by genetic recombination (translational synthesis system) can be performed using a nucleic acid that encodes the desired cyclic peptide.
  • Nucleic acids encoding cyclic peptides can be DNA or RNA.
  • a nucleic acid encoding a cyclic peptide can be prepared by a known method. For example, it can be synthesized by an automated synthesizer. In order to insert the obtained DNA into a vector, a restriction enzyme recognition site may be added, or a base sequence encoding an amino acid sequence for cutting out the synthesized peptide chain with an enzyme or the like may be incorporated.
  • nucleic acid encoding a peptide of interest and a peptide binding thereto is used as the nucleic acid.
  • an expression vector containing a nucleic acid encoding the peptide is prepared.
  • the nucleic acid encoding the peptide can be inserted downstream of the promoter of the expression vector as it is, or after digestion with a restriction enzyme, addition of a linker, or the like.
  • Vectors include Escherichia coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118, pBluescript II, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110, pTP5, pC1912, pTP4, pE194, pC194, etc.), yeast-derived plasmids ( pSH19, pSH15, YEp, YRp, YIp, YAC, etc.), bacteriophage (e phage, M13 phage, etc.), virus (retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus) , baculovirus, etc.), cosmids, and the like.
  • Escherichia coli-derived plasmids pBR322, pBR325, pUC12,
  • the promoter can be appropriately selected according to the type of host.
  • the host is animal cells, for example, SV40 (simian virus 40)-derived promoters and CMV (cytomegalovirus)-derived promoters can be used.
  • the host is E. coli, the trp promoter, T7 promoter, lac promoter and the like can be used.
  • the expression vector encodes a DNA replication origin (ori), selection marker (antibiotic resistance, auxotrophy, etc.), enhancer, splicing signal, poly A addition signal, tag (FLAG, HA, GST, GFP, etc.) It is also possible to incorporate a nucleic acid or the like that does.
  • an appropriate host cell is transformed with the above expression vector.
  • the host can be appropriately selected in relation to the vector, and for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus, yeast, insect organisms, insect cells, animal cells and the like are used.
  • Animal cells that can be used include, for example, HEK293T cells, CHO cells, COS cells, myeloma cells, HeLa cells, and Vero cells. Transformation can be performed by known methods such as the lipofection method, calcium phosphate method, electroporation method, microinjection method, and particle gun method, depending on the type of host.
  • the peptide of interest is expressed by culturing the transformant according to a conventional method.
  • Purification of a peptide from a transformant culture involves first collecting the cultured cells, suspending them in an appropriate buffer, disrupting the cells by sonication, freezing and thawing, followed by centrifugation or filtration. A crude extract is obtained by If the peptide is secreted into the culture medium, the supernatant is collected.
  • Peptides can be purified from crude extracts or culture supernatants by known methods or similar methods (e.g., salting out, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, ion exchange chromatography, affinity chromatography). lithography, reversed-phase high-performance liquid chromatography, etc.).
  • the resulting peptide can be converted from a free form to a salt or from a salt to a free form by a known method or a method analogous thereto.
  • the translation synthesis system includes a cell-free translation system.
  • Cell-free translation systems include, for example, ribosomal protein, aminoacyl-tRNA synthetase (ARS), ribosomal RNA, amino acid, rRNA, GTP, ATP, translation initiation factor (IF), elongation factor (EF), termination factor (RF), ribosome Contains Regeneration Factors (RRFs) and other factors required for translation.
  • Escherichia coli extract or wheat germ extract can be added to increase expression efficiency. Additionally, rabbit erythrocyte extract or insect cell extract can be added.
  • an mRNA display method can be performed, and in this case, puromycin, which is responsible for binding the template mRNA and the translated peptide, can be connected via a linker.
  • RNA polymerase By continuously supplying energy using dialysis to a system containing these, it is possible to produce peptides of several 100 ⁇ g to several mg/mL.
  • Systems containing RNA polymerase can be used to co-transcribe from genetic DNA.
  • Examples of commercially available cell-free translation systems derived from Escherichia coli include RTS-100 (registered trademark) from Roche Diagnostics, PURE SYSTEM (registered trademark) from PGI, and systems using wheat germ extract. As such, those manufactured by ZoiGene, Cellfree Science, etc. can be used.
  • a cell-free translation system can obtain an expression product in a highly pure form without purification.
  • an artificial aminoacyl-tRNA obtained by linking (acylating) a non-natural amino acid or hydroxy acid to a tRNA can be used instead of the aminoacyl-tRNA synthesized by a natural aminoacyl-tRNA synthetase.
  • Such aminoacyl-tRNAs can be synthesized using artificial ribozymes such as flexizymes.
  • a desired codon can be translated in association with the non-natural amino acid or hydroxy acid.
  • Table 2 shows the non-natural amino acids in the cyclic peptide.
  • Table 2 stereostructures of chemical formulas are omitted.
  • Cyclization of peptides is performed using seq. 16 Cys thiol group and, for example, seq.
  • the chloroacetyl group of Phe chloroacetylated in 1 (Cl—CH 2 —CO—NH—C(Bzl)—COO—) and Cl—R—CO—NH—C(Bzl)—COO— (where, R is an alkanediyl group) to form a thioether bond through a cyclization reaction.
  • the bond between Phe and Cys in the amino acid sequence shown in formula (1) above is a bond via a thioether bond.
  • a complex of chloroacetylated Phe and tRNA can be generated by flexizyme and used in a translation synthesis system.
  • the thioether bond formed between the chloroacetyl group and the thiol is not easily decomposed even under reducing conditions, so it has a long half-life.
  • the cyclic peptide has the ability to bind to the ligand of the TGF- ⁇ receptor.
  • the TGF- ⁇ receptor can be ALK5, ALK4 or ALK7 or a combination thereof.
  • the NCBI accession numbers for human ALK5 are NP_001124388.1, NP_001293139.1, NP_004603.1, and so on.
  • the NCBI accession numbers for human ALK4 are NP_004293.1, NP_064732.3, NP_064733.3, and the like.
  • the NCBI accession numbers for human ALK7 are NP_001104501.1, NP_001104502.1, NP_001104503.1, NP_660302.2, and the like.
  • TGF- ⁇ receptor ligands to which the above cyclic peptides bind include TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2 and TGF- ⁇ 3, with TGF- ⁇ 1 being preferred.
  • the NCBI accession number for human TGF- ⁇ 1 is NP — 000651.3 and the like.
  • the NCBI accession numbers for human TGF- ⁇ 2 are NP_001129071.1, NP_003229.1, and so on.
  • the NCBI accession numbers for human TGF- ⁇ 3 are NP_001316867.1, NP_001316868.1, NP_003230.1, and so on.
  • cyclic peptide may be a derivative.
  • Derivatives of cyclic peptides include, for example, one obtained by adding a polyethylene glycol chain or the like to any amino acid constituting the cyclic peptide; complexes in which low-molecular-weight compounds, other peptides, proteins, or the like are bound;
  • Pharmaceutically acceptable salts of cyclic peptides include, for example, sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, ammonium salts, salts with trimethylamine, salts with pyridine, salts with ethanolamine, and salts with tartaric acid. , salts with citric acid, salts with succinic acid, and salts with malic acid.
  • a pharmaceutically acceptable salt of a cyclic peptide can be produced by salt exchange of the cyclic peptide.
  • Pharmaceutically acceptable salts include biologically acceptable salts.
  • the concentration of the cyclic peptide contained in the medium is usually 0.1 nM to 10 ⁇ M, for example It is 0.1 nM to 1,000 ⁇ M, and is adjusted appropriately depending on the cell type.
  • the medium is usually prepared by adding a specific cyclic peptide to the basal medium.
  • various components shown below can be appropriately added to the medium.
  • the basal medium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Minimum Essential Medium (MEM), Knockout-DMEM (KO-DMEM), Glasgow Minimum Essential Medium (G-MEM), Eagle's Minimum Essential Medium (BME), DMEM/ F12, Advanced DMEM/F12, Iscove's modified Dulbecco's medium, Ham's F-10, Ham's F-12, 199 medium, and RPMI1640 medium.
  • a basal medium includes amino acids, antioxidants, minerals, carbon sources such as glucose, and optionally serum, fatty acids, and proteins such as insulin and transferrin, which are the minimum necessary for culture. Media containing components are shown.
  • the medium can contain a Wnt signal enhancer.
  • Wnt signal enhancers include Wnt family members, GSK inhibitors or Lgr5 agonists or combinations thereof.
  • Wnt family members include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, and the like.
  • Wnt family members also include complexes with the stabilizer afamin.
  • GSK inhibitors include GSK-3 ⁇ inhibitors, such as CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9), Kenpaullone (CAS number: 142273-20-9), and 6-Bromoindirubin-3'-oxime (BIO, CAS number: 667463-62-9).
  • Lgr5 agonists include the R-spondin family.
  • the R-spondin family includes, for example, R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R-spondin 4, etc. Among them, R-spondin 1 is preferred.
  • the concentration of CHIR99021 contained in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M, preferably 0.2 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • the concentration of Wnt3a contained in the medium is usually 0.1 ng/mL to 20 ng/mL, preferably 0.2 ng/mL to 10 ng/mL.
  • the medium can contain epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor (IGF) or hepatocyte growth factor (HGF), or a combination thereof.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the concentration of EGF contained in the medium is usually 5 ng/mL to 500 ng/mL, preferably 25 ng/mL to 300 ng/mL, more preferably 50 to 100 ng/mL.
  • FGFs include FGF2, FGF4, FGF7, and FGF10, among which FGF10 is preferred.
  • concentration of FGF contained in the medium is usually 20 ng/mL to 500 ng/mL, preferably 50 ng/mL to 500 ng/mL, more preferably 100 to 500 ng/mL.
  • IGF1 is preferable.
  • concentration of IGF contained in the medium is usually 5 ng/mL to 1,000 ng/mL, preferably 10 ng/mL to 1,000 ng/mL, more preferably 50 ng/mL to 1,000 ng/mL.
  • the concentration of HGF contained in the medium is usually 1 ng/mL to 100 ng/mL, preferably 10 ng/mL to 100 ng/mL, more preferably 20 ng/mL to 100 ng/mL, still more preferably 40 ng/mL to 100 ng/mL. mL.
  • the medium can contain a bone morphogenetic protein (BMP) inhibitor.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the BMP inhibitor is Noggin.
  • the concentration of the BMP inhibitor contained in the medium is usually 10-100 ng/mL, preferably 20-100 ng/mL, more preferably 50-100 ng/mL.
  • the medium can contain a ROCK signaling inhibitor.
  • ROCK signaling inhibitors include Y-27632 (CAS number: 146986-50-7), Fasudil (CAS number: 105628-07-7), Y39983 (CAS number: 203911-26-6), Wf -536 (CAS Number: 539857-64-2), SLx-2119 (CAS Number: 911417-87-3), Azabenzimidazole-aminofurazans (CAS Number: 850664-21-0), DE- 104, H-1152P (CAS number: 872543-07-6), and Blebbistatin (CAS number: 856925-71-8).
  • the concentration of the ROCK signaling inhibitor contained in the medium is usually 1 ⁇ M to 20 ⁇ M, preferably 5 ⁇ M to 15 ⁇ M.
  • the medium contains, in addition to the components mentioned above, for example, gastrin (or a suitable substitute such as Leu15-gastrin I); p38 inhibitors such as; antibacterial agents such as penicillin antibiotics, cephem antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics; interleukin-6 (IL-6), interleukin-11 (IL-11) , oncostatin M (OSM), leukemia inhibitory factor (LIF), cardiotropin-1 (CT-1), ciliary neurotrophic factor (CNTF), IL-6 family cytokines; retinoic acid; nicotinamide; Tumor cell growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ) such as choline; DAPT ( ⁇ -secretase inhibitor); dimethyl sulfoxide (DMSO); dexamethasone (Dex); fatty acids; combinations thereof;
  • gastrin or a suitable substitute such as Leu15-gastrin I
  • p38 inhibitors such as; antibacterial agents such as penicillin antibiotics, ce
  • the medium can contain supplements such as B27 supplements, glutamic acid-containing supplements such as the GlutaMax series, amino acid aqueous solutions such as MEM Non-Essential Amino Acids Solution, and N2 supplements sold by Thermo Fisher Scientific, etc. .
  • the medium preferably does not substantially contain any of the TGF- ⁇ receptor antagonists of ALK5, ALK4 or ALK7, or a combination thereof.
  • substantially free means not intentionally mixing as an active ingredient, or allowing unintentional mixing with negligible effects.
  • the concentration of the TGF- ⁇ receptor antagonist contained in the medium is 1 nM or less, preferably 0.1 nM or less, more preferably 0.01 nM or less.
  • TGF- ⁇ receptor antagonists include A83-01 (CAS number: 909910-43-6), SB-431542 (CAS number: 301836-41-9), SB-505124 (CAS number: 694433-59-5) , SB-525334 (CAS number: 356559-20-1), LY364947 (CAS number: 396129-53-6), SD208 (CAS number: 627536-09-8), SJN2511 (CAS number: 446859-33-2) etc.
  • TGF- ⁇ receptor ligands include TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3 and the like.
  • human stem cells are preferably cultured while being in contact with an extracellular matrix.
  • Methods of culturing human stem cells in contact with an extracellular matrix include a method of culturing by embedding human stem cells in an extracellular matrix (ECM), a method of culturing by mixing ECM with a medium, and culturing in a culture vessel. Examples include a method of coating the surface with ECM and culturing.
  • ECM includes, for example, components contained in basement membranes and glycoproteins present in intercellular spaces. Components contained in the basement membrane include, for example, type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
  • Glycoproteins present in intercellular spaces include collagen, laminin, entactin, fibronectin, heparin sulfate, and the like.
  • a commercially available product containing ECM can be used as the ECM.
  • Examples of commercially available products containing ECM include Matrigel (registered trademark, Corning), human laminin (Sigma), and the like.
  • the medium mixed with ECM has a volume of ECM that is usually 1 vol% or more, preferably 5 vol% or more and 100 vol% or less, more preferably 10 vol% or more with respect to the volume of components other than ECM in the medium. It can be prepared by mixing amounts that will be 90% by volume or less. Methods for mixing the ECM include pipetting methods on an ice bath. Admixed means that no ECM is visually observed in the medium.
  • the medium can be changed once every 1-5 days.
  • Culturing is usually carried out at a temperature of 30°C to 50°C, preferably 32°C to 48°C, more preferably 34°C to 46°C.
  • Cultivation is carried out in an atmosphere having a carbon dioxide content of generally 1% to 15% by volume, preferably 2% to 14% by volume, more preferably 3% to 13% by volume or less.
  • the present invention provides an organoid-producing medium containing a cyclic peptide having the amino acid sequence of formula (1) above, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the organoid production medium of the present embodiment can also be called an organoid culture medium.
  • Human stem cells can be favorably cultured and organoids can be produced using the medium of the present embodiment.
  • the medium is prepared by adding various components to the basal medium.
  • the basal medium and various components are the same as those described above.
  • the present invention provides an organoid obtained by the organoid production method described above.
  • organoids refer to self-organizing three-dimensional cell cultures formed in vitro and obtained by culturing stem cells. Cell cultures can also have structures that approximate organs.
  • the organoids of this embodiment can be cultured in the absence of a TGF- ⁇ receptor antagonist. For this reason, unlike organoids obtained using conventional TGF- ⁇ receptor antagonists, they are not affected by off-target inhibition by TGF- ⁇ receptor antagonists, and more reflect the state of cells in vivo. it seems to do.
  • the organoids of this embodiment include large intestine organoids, small intestine organoids, liver organoids, bile duct organoids, brain organoids, ovarian cancer organoids, retinal organoids, and the like.
  • the organoids of this embodiment have differences in gene expression profile and the like compared to organoids obtained by a production method other than the organoid production method of this embodiment.
  • differences are identified, and whether the organoid is an organoid obtained by a production method other than the organoid production method of the present embodiment or the organoid of the present embodiment is identified based on the difference in gene expression profile or the like. is very difficult and impractical. For this reason, it is realistic to specify by the manufacturing method.
  • the present invention includes a step of contacting a test substance with the organoid described above (hereinafter, also referred to as “step 1”), and a step of evaluating the effect of the test substance on the organoid (hereinafter, “step 2 Also referred to as "), to provide a method for evaluating the test substance.
  • test substances examples include natural compound libraries, synthetic compound libraries, existing drug libraries, and metabolite libraries. New drugs can also be used as test substances.
  • the organoids can be used to construct a cell-based assay system such as a transwell assay system or a biomimetic system such as Organ-on-a-Chip, and the test substance can be brought into contact with the organoids.
  • a cell-based assay system such as a transwell assay system or a biomimetic system such as Organ-on-a-Chip
  • step 2 the effect of the test substance on organoids can be evaluated by Western blotting, ELISA, immunostaining, etc.
  • each well was overlaid with the medium (300 ⁇ L/well) prepared in Experimental Example 1, and cultured at 37° C. in the presence of 5 vol % CO 2 for 7 days. Medium was changed every 2 or 3 days. Subsequently, the inside of the wells after culturing for 7 days was observed with an optical microscope. A bright field image is shown in FIG. In FIG. 1, "ND" indicates that no data has been acquired.
  • organoids can be formed with an efficiency equal to or higher than that obtained by adding A83-01. rice field.
  • 20,000 human liver cells were taken from this suspension, mixed with 50 ⁇ L of Matrigel®, BD Biosciences, and plated in 24-well tissue culture plates, allowing Matrigel® to fully polymerize. Incubate at 37°C for 10 minutes until . After polymerization, a medium (500 ⁇ L/well) prepared by adding each component to the concentration shown in Table 4 below was overlaid on the basal medium and cultured at 37° C. in the presence of 5 vol % CO 2 . Advanced DMEM/F12 was used as the basal medium. Medium was changed every 2 or 3 days.
  • Fig. 2 is a graph showing the results of measuring cell proliferation.
  • "PDi” indicates the results when 5 ⁇ M of #7401 peptide was added to the medium
  • "A+” indicates the results when 5 ⁇ M of A83-01 was added to the medium
  • “A-” indicates the results when # was added to the medium. Results are shown when neither 7401 peptide nor A83-01 was added.
  • Fig. 3 is a graph showing the results of measurement of cell proliferation when the #7401 peptide was used at a low concentration.
  • "5 ⁇ M PDi” indicates the results when 5 ⁇ M of #7401 peptide was added to the medium
  • 500 nM PDi indicates the results when 500 nM of #7401 peptide was added to the medium
  • “50 nM PDi” indicates the results of the medium.
  • A+ indicates the results when A83-01 was added to the medium at 5 ⁇ M
  • "A-” indicates the results when both #7401 peptide and A83-01 were added to the medium. The results are shown when there was no
  • a medium was prepared by adding each component to the basal medium (Advanced DMEM/F12) at the concentration shown in Table 5 below.
  • Human small intestinal epithelial cells (including human small intestinal stem cells) were dispersed in Matrigel (registered trademark, manufactured by BD Biosciences). The dispersion was then seeded into each well of a 48-well tissue culture plate and incubated at 37°C for 10 minutes to polymerize the Matrigel®.
  • FIG. 5 shows the results of culturing in a medium containing EGF (50 ng/mL), and FIG. 6 shows the results of culturing in a medium containing no EGF.
  • hiPSCs (PCHiPS771 strain, Lot. A01QM28, manufactured by Reprocell) were cultured feeder-free. Specifically, hiPSCs were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and dispersed into single cells using TrypLE Select (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the dispersed hiPSCs were seeded on a plastic culture dish coated with a human recombinant laminin fragment (product name “iMatrix-511”, manufactured by Nippi) containing only the active site of laminin-511, and Y27632 (ROCK inhibition agent, 10 ⁇ M), feeder-free culture was performed in StemFit AK02N medium (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.). When a 60 mm dish (manufactured by Iwaki Co., Ltd., for cell culture) was used as the plastic culture dish, the number of seeded hiPSCs dispersed into single cells was 3 ⁇ 10 4 cells/dish.
  • a human recombinant laminin fragment product name “iMatrix-511”, manufactured by Nippi
  • Y27632 ROCK inhibition agent, 10 ⁇ M
  • the medium was replaced with StemFit AK02N medium without Y27632. Thereafter, the medium was replaced with StemFit AK02N medium containing no Y27632 once every 1 to 2 days. The cells were then 80% confluent 6 days after seeding.
  • the expanded culture of hiPSCs was treated with a cell suspension using TrypLE Select (trade name of Thermo Fisher Scientific) and dispersed into single cells by pipetting.
  • the expanded culture of dispersed hiPSCs is added to the basal medium (“DMEM/F-12, HEPES”, product name of Thermo Fisher Scientific) to obtain the concentrations shown in Table 6 below.
  • the contents of the wells were transferred to 50 mL Falcon (registered trademark) conical tubes (manufactured by Corning) containing 10 mL of PBS. Subsequently, the mixture was inverted 5 times to mix, the supernatant was removed, and the cell aggregates were recovered. Each component was added to 30 collected cell aggregates and a basal medium ("DMEM/F-12, HEPES", product name of Thermo Fisher Scientific)) at concentrations shown in Table 8 below. The medium (30 ml/well) was added to a single-use bioreactor (ABLE, Inc.) and suspension culture was carried out while stirring. Medium was changed every 4 days.
  • a basal medium (“DMEM/F-12, HEPES", product name of Thermo Fisher Scientific)
  • FIG. 7 is an optical microscope image showing the state of cell aggregates in a 96-well culture plate after suspension culture for 12 weeks.
  • the lower part of FIG. 7 is an image of the entire well, and the upper part of FIG. 7 is an enlarged image.
  • Scale bar is 500 ⁇ m.
  • the present invention it is possible to provide a method for producing organoids with excellent proliferative properties, a medium used for producing said organoids, organoids obtained by said culture, and a method for evaluating a test substance using organoids.

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Abstract

ヒト幹細胞を、下記式（１）［式（１）中、Ｘ１～Ｘ６はそれぞれ特定の修飾アミノ酸を示し、Ｘ７は任意のアミノ酸残基を示し、Ｒは存在しないか又はＣ末端修飾基を示し、ｎは０又は１の整数を示し、ＰｅＧはＮ－（２－フェニルエチル）－グリシンを示し、Ｎａｌ１はβ－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニンを示す。］に記載のアミノ酸配列を有する環状ペプチド、又はその薬学的に許容可能な塩、を含有する培地中で培養することを含む、オルガノイドの製造方法。　［化１］

Description

オルガノイドの製造方法、オルガノイド製造用培地、オルガノイド及び被験物質の評価方法
　本発明は、オルガノイドの製造方法、オルガノイド製造用培地、オルガノイド及び被験物質の評価方法に関する。本願は、２０２１年９月３０日に、日本に出願された特願２０２１－１６０７５８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ＴＧＦ－βシグナルは、上皮細胞、内皮細胞、血球細胞、リンパ球等の多くの細胞の増殖抑制能、細胞外マトリックスの蓄積能に関与することが知られている。ＴＧＦ－βシグナルの制御は、オルガノイドを製造するために必要であり、特に、細胞を増殖させるために、ＴＧＦ－βシグナルを下方制御する必要がある。
　ＴＧＦ－βシグナルを下方制御する方法としては、ＴＧＦ－βシグナルに関する受容体の一つであるＴＧＦ－β受容体に結合し阻害する、ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストが用いられてきた（特許文献１、非特許文献１を参照）。しかしながら、Ａ８３－０１等のアンタゴニストを使用した場合、オフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ、ＴＧＦ－β受容体以外の受容体）も阻害してしまうことが報告されており、その影響が懸念される（非特許文献２を参照）。
米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２７号明細書
Sato T., et al., Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium, Gastroenterology, 141 (5), 1762-1772, 2011. Vogt J., et al., The specificities of small molecule inhibitors of the TGF-beta and BMP pathways, Cell Signal., 23 (11), 1831-1842, 2011.
　本発明は、優れたオルガノイドの製造方法、前記製造に用いる培地、前記製造方法によって得られたオルガノイド、及びオルガノイドを用いた被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
　本発明は以下の実施形態を含む。
［１］ヒト幹細胞を、下記式（１）に記載のアミノ酸配列（配列番号１）を有する環状ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩（以下、「環状ペプチド群」ともいう。）を含有する培地中で培養することを含む、オルガノイドの製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式（１）中、Ｘ１は、Ｔｙｒ、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ、又はＮａｌ１を示し、Ｘ２は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、Ｘ３は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、Ｘ４は、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＫＣＯｐ、Ｇｌｕ、又はＫＣＯｍを示し、Ｘ５は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、Ｘ７は、任意のアミノ酸残基を示し、Ｒは、存在しないか又はＣ末端修飾基を示し、ｎは、０又は１の整数を示し、ＰｅＧは、Ｎ－（２－フェニルエチル）－グリシンであり、Ｎａｌ１は、β－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニンであり、Ｗ６Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、Ｗ７Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、ＫＣＯｐは、Ｎ６－（４－（カルボキシメチル）ピペラジン－１－カルボニル）－Ｌ－リシンであり、ＫＣＯｍは、Ｎ６－（メチル（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２，３，４，５，６－）ペンタヒドロキシヘキシル）カルバモイル）－Ｌ－リシンであり、４Ｐｙは、４－ピリジル－Ｌ－アラニンである。］
［２］前記式（１）におけるＸ１～Ｘ７、Ｒ、ｎの組み合わせが、下記表１に示す組み合わせである、［１］に記載のオルガノイドの製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 ［３］前記式（１）に記載のアミノ酸配列におけるＸ１がＮａｌ１、Ｘ２がＶａｌ、Ｘ４がＡｓｐ、Ｘ５がＴｙｒである、［１］又は［２］に記載のオルガノイドの製造方法。
［４］前記式（１）に示すアミノ酸配列におけるＰｈｅとＣｙｓとの結合が、チオエーテル結合を介した結合である、［１］～［３］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［５］前記式（１）に示すアミノ酸配列のＸ７がＧｌｙを含む、［１］～［４］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［６］前記培地に含まれる、前記環状ペプチド及びその薬学的に許容可能な塩の合計の濃度が、０．１ｎＭ～１０μＭである、［１］～［５］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［７］前記培地が、Ｗｎｔシグナル増強剤を更に含有する、［１］～［６］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［８］前記培地が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）若しくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）又はこれらの組み合わせを更に含有する、［１］～［７］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［９］前記培地が、骨形成因子（ＢＭＰ）阻害剤を更に含有する、［１］～［８］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［１０］前記培地が、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達阻害剤を更に含有する、［１］～［９］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［１１］前記培地が、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４若しくはＡＬＫ７又はこれらの組み合わせの、アンタゴニストを実質的に含有しない、［１］～［１０］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［１２］前記ヒト幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させながら培養する、［１］～［１１］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法。
［１３］下記式（１）に記載のアミノ酸配列（配列番号１）を有する環状ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含有する、オルガノイド製造用培地。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式（１）中、Ｘ１は、Ｔｙｒ、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ、又はＮａｌ１を示し、Ｘ２は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、Ｘ３は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、Ｘ４は、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＫＣＯｐ、Ｇｌｕ、又はＫＣＯｍを示し、Ｘ５は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、Ｘ７は、任意のアミノ酸残基を示し、Ｒは、存在しないか又はＣ末端修飾基を示し、ｎは、０又は１の整数を示し、ＰｅＧは、Ｎ－（２－フェニルエチル）－グリシンであり、Ｎａｌ１は、β－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニンであり、Ｗ６Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、Ｗ７Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、ＫＣＯｐは、Ｎ６－（４－（カルボキシメチル）ピペラジン－１－カルボニル）－Ｌ－リシンであり、ＫＣＯｍは、Ｎ６－（メチル（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２，３，４，５，６－）ペンタヒドロキシヘキシル）カルバモイル）－Ｌ－リシンであり、４Ｐｙは、４－ピリジル－Ｌ－アラニンである。］
［１４］［１］～［１２］のいずれかに記載のオルガノイドの製造方法によって得られた、オルガノイド。
［１５］［１４］に記載のオルガノイドに被験物質を接触させる工程、及び前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程、を含む、前記被験物質の評価方法。
　本発明によれば、増殖性に優れたオルガノイドの製造方法、前記製造方法に用いる培地、前記製造方法によって得られたオルガノイド、及びオルガノイドを用いた被験物質の評価方法を提供することができる。
図１は、実験例２の結果を示す顕微鏡画像である。 図２は、実験例３の結果を示すグラフである。 図３は、実験例３の結果を示すグラフである。 図４は、実験例４の結果を示すグラフである。 図５は、実験例５の結果を示す顕微鏡画像である。 図６は、実験例５の結果を示す顕微鏡画像である。 図７は、実験例６の結果を示す顕微鏡画像である。
　以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
　本明細書で例示する各成分、例えば、培地中に含まれる成分は、特に言及しない限り、それぞれ１種を単独で用いることができ、または２種以上を併用して用いることができる。
　Ａ、Ｂ、ａ、及びｂは任意の数値を示し、Ａ＞Ｂ＞ａ＞ｂの関係の場合、本明細書で、「Ａ～Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義である。また、本明細書で、「Ａ～Ｂ、好ましくはａ～ｂ」等との数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」、「Ａ以上、ｂ以下」、「ａ以上、Ｂ以下」、及び「ａ以上、ｂ以下」と同義である。
　本明細書において、「物質Ｘを含有する培地」、「物質Ｘの存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地、外来性の物質Ｘを含む培地、又は外来性の物質Ｘの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生する場合、内在的な物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は内在的な物質Ｘを含んでいても「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないものとする。
［オルガノイドの製造方法］
　一実施形態において、本発明は、ヒト幹細胞を、下記式（１）に記載のアミノ酸配列を有する環状ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含有する培地中で培養することを含む、オルガノイドの製造方法を提供する。
　ヒト幹細胞を上記の培地中で培養すると、前記ヒト幹細胞が増殖し、幹細胞及び分化した細胞の双方を含むオルガノイドが形成される。
　本明細書において、アミノ酸は、天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸を含む。以下、「下記式（１）に記載のアミノ酸配列（配列番号１）を有する環状ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩」を「環状ペプチド群」という場合がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式（１）中、Ｘ１は、Ｔｙｒ、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ、又はＮａｌ１を示し、Ｘ２は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、Ｘ３は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、Ｘ４は、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＫＣＯｐ、Ｇｌｕ又はＫＣＯｍを示し、Ｘ５は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、Ｘ７は、任意のアミノ酸残基を示し、Ｒは、存在しないか又はＣ末端修飾基を示し、ｎは、０又は１の整数を示し、ＰｅＧは、Ｎ－（２－フェニルエチル）－グリシンであり、Ｎａｌ１は、β－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニンであり、Ｗ６Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、Ｗ７Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、ＫＣＯｐは、Ｎ６－（４－（カルボキシメチル）ピペラジン－１－カルボニル）－Ｌ－リシンであり、ＫＣＯｍは、Ｎ６－（メチル（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２，３，４，５，６－）ペンタヒドロキシヘキシル）カルバモイル）－Ｌ－リシンであり、４Ｐｙは、４－ピリジル－Ｌ－アラニンである。
　実施例において後述するように、本実施形態のオルガノイドの製造方法によれば、Ａ８３－０１等のＴＧＦ－β受容体アンタゴニストを使用することなく、ヒト幹細胞を培養することができる。多くのアンタゴニストは、複数の受容体に作用することが知られており、例えば、Ａ８３－０１の場合、ＴＧＦ－β受容体であるＡＬＫ５だけでなく、ＶＥＧＦＲ、ＲＩＰＫ２、ＭＩＮＫ１、ｐ３８α　ＭＡＰＫ、ＰＫＤ１及びＦＧＦ－Ｒ１に強く作用することが知られている。一方、環状ペプチド群は、ＴＧＦ－β受容体のリガンドに作用することから、ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストによるオフターゲットの影響を解消することができる。ここで、ＴＧＦ－β受容体のリガンドとは、アゴニスト作用を有するリガンドを示す。また、環状ペプチド群はオフターゲットへの作用が実質的にないと推定されることから、培地中の環状ペプチド群は、ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストの必要濃度よりも低濃度でヒト幹細胞を培養することもできる。
　環状ペプチド群は、外来性又は内在性のＴＧＦ－β受容体のリガンドに結合、好ましくは特異的に結合することができるものと推定される。
　本実施形態のオルガノイドの製造方法は、従来のＡ８３－０１等のＴＧＦ－β受容体アンタゴニストを用いて行われていた細胞培養において、ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストの代わりに、環状ペプチド群を用いることで、ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストの必要濃度よりも低濃度でヒト幹細胞を培養することもできる。
　本実施形態のオルガノイドの製造方法において、ヒト幹細胞とは、ヒト細胞又はヒト由来の細胞であって、自己複製能と分化能を持つ細胞を意味する。ヒト幹細胞としては、例えば、ヒト上皮幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト血管細胞、ヒトがん細胞等のヒト体性幹細胞；ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）等のヒト多能性幹細胞；ヒト幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞であり、特定の組織・臓器への分化能を持つヒト前駆細胞；が挙げられる。本実施形態の培養方法において、ヒト幹細胞としては、ヒト幹細胞を含む細胞集団を用いることができる。
　本実施形態のオルガノイドの製造方法において、ヒト幹細胞が細胞凝集塊を形成している場合、通常、分散処理を行う。分散とは、細胞を酵素処理や物理処理等の分散処理により、１００個以下の細胞集団、好ましくは５０個以下の細胞集団、より好ましくは単一細胞に分離させることをいう。分散処理としては、例えば、機械的分散処理；トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、エチレンジアミン四酢酸等の細胞分散液を用いた処理；が挙げられる。分散処理を行う前に、細胞死を防ぐために、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、インスリン様成長因子等の細胞保護剤で処理することができる。
　環状ペプチドは、下記式（１－１）（配列番号１）におけるｓｅｑ．５～８に、Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ（配列番号２）、又はＡｓｎ－Ｖａｌ－４Ｐｙ－Ａｓｐを含むこと、並びにｓｅｑ．１１～１４に、Ｖａｌ－Ｎａｌ１－Ｔｙｒ－Ｈｉｓ、又はＶａｌ－Ｎａｌ１－４Ｐｙ－Ｈｉｓを含むことを特徴とする。これらのアミノ酸配列を有するペプチドがＴＧＦ－β受容体のリガンドに活性を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　ｓｅｑ．２、４、９、及び１５は、それぞれ、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸からなる群より選択される残基によって構成されており、これらの残基の組み合わせを適宜調整することで、環状ペプチドの高次構造を維持しながら、培地への溶解性を制御することができる。
　上記式（１）又は上記式（１－１）中、Ｘ７は、ペプチドのＣ末端にあるリンカーであり、１個又は複数個の任意のアミノ酸残基であることができる。Ｘ７は、翻訳合成系において、ピューロマイシン、低分子化合物、他のペプチド、及びタンパク質等との結合に用いられる。Ｘ７としては、Ｇｌｙ、及びＧｌｙ－Ｌｙｓを含むものが挙げられる。また、ｎは０又は１である。
　また、Ｒは、存在しないか又はＣ末端のカルボキシル基の修飾基であり、Ｃ末端のカルボキシル基と修飾基で、－ＣＯＯＲの構造を形成し、カルボキシル基の負電荷を除去し陽電荷を加える修飾基が好ましい。このような修飾基としては、アミノ基、アミド基、アミノエチル基、ピラゾリジン基、ピペリジン基、イミダゾリジン基、及びピペラジン基が挙げられる。また、Ｒはポリエチレングリコール鎖を含むことができる。
　環状ペプチドの最適なアミノ酸配列として、環状ペプチドのＸ１～Ｘ６の組み合わせが、上記表１に示す組み合わせのいずれかであることが好ましく、Ｘ１がＮａｌ１、Ｘ２がＶａｌ、Ｘ４がＡｓｐ、Ｘ５がＴｙｒ、Ｘ６がＶａｌ又はＫＣＯｐの組み合わせがより好ましい。
　本明細書において、環状ペプチドは、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法、遺伝子組換え法等、公知の製造方法によって製造することができる。
　固相法では、例えば、以下の方法により環状ペプチドを合成する。まず、水酸基を有するレジンの水酸基と、α－アミノ基が保護基で保護された第一のアミノ酸（通常、目的とするペプチドのＣ末端アミノ酸）のカルボキシ基をエステル化反応させる。エステル化触媒としては、１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。
　次に、第一アミノ酸のα－アミノ基の保護基を脱離させるとともに、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第二のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第一及び第二のアミノ酸を結合させる。さらに、第二のアミノ酸のα－アミノ基を脱保護し、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第三のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第二及び第三のアミノ酸を結合させる。これを繰り返して、目的とする長さのペプチドが合成されたら、すべての官能基を脱保護する。
　固相法に使用するレジンとしては、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　ｒｅｓｉｎ、ＭＢＨＡ　ｒｅｓｉｎ、Ｃｌ－Ｔｒｔ　ｒｅｓｉｎ、ＳＡＳＲＩＮ　ｒｅｓｉｎ、Ｗａｎｇ　ｒｅｓｉｎ、Ｒｉｎｋ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ、ＨＭＦＳ　ｒｅｓｉｎ、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社）、ＨＭＰＡ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社）等が挙げられる。これらのレジンは、溶剤（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、塩化メチレン等）で洗浄してから用いることができる。
　α－アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ又はＺ）基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等が挙げられる。Ｃｂｚ基はフッ化水素酸、水素化等によって脱保護でき、Ｂｏｃ基はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により脱保護でき、Ｆｍｏｃ基はピペリジンによる処理で脱保護できる。
　α－カルボキシ基の保護は、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル、シクロヘキシルエステル等を用いることができる。
　アミノ酸のその他の官能基として、セリンやトレオニンのヒドロキシ基はベンジル基やｔｅｒｔ－ブチル基で保護することができ、チロシンのヒドロキシ基は２－ブロモベンジルオキシカルボニル基やｔｅｒｔ－ブチル基で保護することができる。リジン側鎖のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシ基は、α－アミノ基、α－カルボキシ基と同様に保護することができる。
　カルボキシ基の活性化は、縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ又はＷＳＣ）、（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチル］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム－３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。
　レジンからのペプチド鎖の切断は、ＴＦＡ、フッ化水素（ＨＦ）等の酸で処理することにより行うことができる。
　遺伝子組換え法（翻訳合成系）による環状ペプチドの製造は、目的の環状ペプチドをコードする核酸を用いて行うことができる。環状ペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。
　環状ペプチドをコードする核酸は、公知の方法により調製することができる。例えば、自動合成装置によって合成することができる。得られたＤＮＡをベクターに挿入するために制限酵素認識部位を加えたり、合成後のペプチド鎖を酵素等で切り出すためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んでもよい。
　宿主由来のプロテアーゼによる分解を抑制するため、目的のペプチドを他のペプチドとのキメラペプチドとして発現させるキメラタンパク質発現法を用いることもできる。この場合、上記核酸としては、目的とするペプチドと、これに結合するペプチドとをコードする核酸が用いられる。
　続いて、ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを調製する。ペプチドをコードする核酸は、そのままで、又は、制限酵素で消化した後若しくはリンカーを付加する等した後に、発現ベクターのプロモータの下流に挿入することができる。ベクターとしては、大腸菌由来プラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ等）、枯草菌由来プラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９１２、ｐＴＰ４、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４等）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＩｐ、ＹＡＣ等）、バクテリオファージ（ｅファージ、Ｍ１３ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられる。
　プロモータは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合には、例えば、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０）由来プロモータ、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由来プロモータを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ等を用いることができる。
　発現ベクターには、ＤＮＡ複製開始点（ｏｒｉ）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、タグ（ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＧＳＴ、ＧＦＰ等）をコードする核酸等を組み込むこともできる。
　次に、上記発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する。宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌、酵母、昆虫生体、昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞を用いることができる。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法により行うことができる。形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするペプチドが発現する。
　形質転換体の培養物からのペプチドの精製では、まず、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから、超音波処理、凍結融解等の方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
　粗抽出液又は培養上清からのペプチドの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）により行うことができる。
　得られたペプチドは、公知の方法又はそれに準ずる方法で、遊離体から塩に、又は、塩から遊離体に変換することができる。
　翻訳合成系は、無細胞翻訳系が挙げられる。無細胞翻訳系は、例えば、リボソームタンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、リボソームＲＮＡ、アミノ酸、ｒＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子（ＩＦ）、伸長因子（ＥＦ）、終結因子（ＲＦ）、リボソーム再生因子（ＲＲＦ）、及び、翻訳に必要なその他の因子を含む。発現効率を高くするために大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液加えることができる。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を加えることができる。無細胞翻訳系では、例えば、ｍＲＮＡディスプレイ法を行うことができ、この場合、鋳型ｍＲＮＡと翻訳されたペプチドとの結合を担うピューロマイシンを、リンカーを介してつなげることができる。
　これらを含む系に、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、数１００μｇから数ｍｇ／ｍＬのペプチドを生産することができる。遺伝子ＤＮＡからの転写を併せて行うためにＲＮＡポリメラーゼを含む系を用いることができる。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のＲＴＳ－１００（登録商標）、ＰＧＩ社のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用することができる。無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。
　無細胞翻訳系においては、天然のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に合成されるアミノアシルｔＲＮＡに代えて、非天然のアミノ酸又はヒドロキシ酸をｔＲＮＡに連結（アシル化）した人工のアミノアシルｔＲＮＡを用いることができる。このようなアミノアシルｔＲＮＡは、フレキシザイム（ｆｌｅｘｉｚｙｍｅ）等の人工のリボザイムを用いて合成することができる。
　非天然のアミノ酸又はヒドロキシ酸が連結されたｔＲＮＡを用いることにより、所望のコドンを、非天然のアミノ酸又はヒドロキシ酸と関連付けて翻訳することができる。
　環状ペプチド中の非天然のアミノ酸を下記表２に示す。表２中、化学式の立体構造は省略する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ペプチドの環状化は、ｓｅｑ．１６のＣｙｓのチオール基と、例えば、ｓｅｑ．１のクロロアセチル化したＰｈｅのクロロアセチル基（Ｃｌ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（Ｂｚｌ）－ＣＯＯ－）や、Ｃｌ－Ｒ－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（Ｂｚｌ）－ＣＯＯ－（ここで、Ｒはアルカンジイル基）との環化反応によりチオエーテル結合を形成することで行う。この場合、上記式（１）に示すアミノ酸配列におけるＰｈｅとＣｙｓとの結合は、チオエーテル結合を介した結合である。環状化のために、クロロアセチル化したＰｈｅとｔＲＮＡとの複合体をフレキシザイムによって生成して翻訳合成系に用いることができる。
　クロロアセチル基とチオールとの間に形成されるチオエーテル結合は還元条件下でも分解を受けにくいため、半減期が長い。
　環状ペプチドは、ＴＧＦ－β受容体のリガンドへの結合能を有する。上記のＴＧＦ－β受容体は、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４若しくはＡＬＫ７又はこれらの組み合わせであることができる。ヒトＡＬＫ５のＮＣＢＩアクセション番号は、ＮＰ＿００１１２４３８８．１、ＮＰ＿００１２９３１３９．１、ＮＰ＿００４６０３．１等である。また、ヒトＡＬＫ４のＮＣＢＩアクセション番号は、ＮＰ＿００４２９３．１、ＮＰ＿０６４７３２．３、ＮＰ＿０６４７３３．３等である。また、ヒトＡＬＫ７のＮＣＢＩアクセション番号は、ＮＰ＿００１１０４５０１．１、ＮＰ＿００１１０４５０２．１、ＮＰ＿００１１０４５０３．１、ＮＰ＿６６０３０２．２等である。
　上記の環状ペプチドが結合するＴＧＦ－β受容体のリガンドとしては、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３が挙げられ、ＴＧＦ－β１が好ましい。ヒトＴＧＦ－β１のＮＣＢＩアクセション番号は、ＮＰ＿０００６５１．３等である。ヒトＴＧＦ－β２のＮＣＢＩアクセション番号は、ＮＰ＿００１１２９０７１．１、ＮＰ＿００３２２９．１等である。ヒトＴＧＦ－β３のＮＣＢＩアクセション番号は、ＮＰ＿００１３１６８６７．１、ＮＰ＿００１３１６８６８．１、ＮＰ＿００３２３０．１等である。
　上記の環状ペプチドは誘導体であってもよい。環状ペプチドの誘導体としては、例えば、環状ペプチドを構成するいずれかのアミノ酸にポリエチレングリコール鎖等を付加したもの；環状ペプチドを構成するいずれかのアミノ酸をＤ体に変換したもの；リンカーを介して、低分子化合物、他のペプチド、又はタンパク質等が結合した複合体；が挙げられる。
　環状ペプチドの薬学的に許容可能な塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、トリメチルアミンとの塩、ピリジンとの塩、エタノールアミンとの塩、酒石酸との塩、クエン酸との塩、コハク酸との塩、及びリンゴ酸との塩が挙げられる。環状ペプチドの薬学的に許容可能な塩は、環状ペプチドを塩交換することにより製造することができる。薬学的に許容可能な塩とは、生物学的に許容可能な塩を含む。
　本実施形態のオルガノイドの製造方法において、培地に含まれる環状ペプチドの濃度（環状ペプチド及びその誘導体、並びにこれらの薬学的に許容可能な塩の合計の濃度）は、通常０．１ｎＭ～１０μＭ、例えば０．１ｎＭ～１，０００μＭであり、細胞種により適宜調整する。
　本実施形態のオルガノイドの製造方法において、培地は、通常、基礎培地に、特定環状ペプチドを添加して調製する。また、培地には、更に下記に示す各種成分を適宜添加することがきる。基礎培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地（ＭＥＭ）、ノックアウト－ＤＭＥＭ（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、グラスゴー最少必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イーグル最少必須培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハムＦ－１０、ハムＦ－１２、１９９培地、及びＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。本明細書において、基礎培地とは、アミノ酸、抗酸化剤、ミネラル、及びグルコース等の炭素源を含み、更に任意で、血清、脂肪酸、及びインスリンやトランスフェリン等のタンパク質等、最低限培養に必要な成分を含む培地を示す。
　培地は、Ｗｎｔシグナル増強剤を含有することができる。Ｗｎｔシグナル増強剤としては、Ｗｎｔファミリーメンバー、ＧＳＫ阻害剤若しくはＬｇｒ５アゴニスト又はこれらの組み合わせが挙げられる。
　Ｗｎｔファミリーメンバーとしては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。Ｗｎｔファミリーメンバーとしては、その安定化物質であるアファミンとの複合体も挙げられる。
　ＧＳＫ阻害剤としては、ＧＳＫ－３β阻害剤が挙げられ、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ番号：１４２２７３－２０－９）、及び６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ、ＣＡＳ番号：６６７４６３－６２－９）が挙げられる。
　Ｌｇｒ５アゴニストとしては、例えば、Ｒ－スポンジンファミリーが挙げられる。Ｒ－スポンジンファミリーとしては、例えば、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４等が挙げられ、中でも、Ｒ－スポンジン１が好ましい。
　Ｗｎｔシグナル増強剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、培地中に含まれるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、通常、０．１μＭ～３０μＭ、好ましくは０．２μＭ～２０μＭである。
　Ｗｎｔシグナル増強剤としてＷｎｔ３ａを用いる場合、培地中に含まれるＷｎｔ３ａの濃度は、通常、０．１ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬである。
　培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）若しくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）又はこれらの組み合わせを含有することができる。
　培地中に含まれるＥＧＦの濃度は、通常、５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０～１００ｎｇ／ｍＬである。
　ＦＧＦとしては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、及びＦＧＦ１０が挙げられ、これらの中でもＦＧＦ１０が好ましい。培地中に含まれるＦＧＦの濃度は、通常、２０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００～５００ｎｇ／ｍＬである。
　ＩＧＦとしては、ＩＧＦ１が好ましい。培地中に含まれるＩＧＦの濃度は、通常、５ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬである。
　培地中に含まれるＨＧＦの濃度は、通常、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬである。
　培地は、骨形成因子（ＢＭＰ）阻害剤を含有することができる。ＢＭＰ阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎであることが好ましい。培地中に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、通常、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０～１００ｎｇ／ｍＬである。
　培地は、ＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤を含有することができる。ＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤としては、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１４６９８６－５０－７）、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（ＣＡＳ番号：１０５６２８－０７－７）、Ｙ３９９８３（ＣＡＳ番号：２０３９１１－２６－６）、Ｗｆ－５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７－６４－２）、ＳＬｘ－２１１９（ＣＡＳ番号：９１１４１７－８７－３）、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン（Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ）（ＣＡＳ番号：８５０６６４－２１－０）、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ（ＣＡＳ番号：８７２５４３－０７－６）、及びＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ（ＣＡＳ番号：８５６９２５－７１－８）等が挙げられる。
　培地中に含まれるＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤の濃度は、通常、１μＭ～２０μＭであり、好ましくは５μＭ～１５μＭである。
　培地は、上述した成分以外に、例えば、ガストリン（又はＬｅｕ１５－ガストリンＩ等の適切な代替物）；ＳＢ２０２１９０（ＣＡＳ番号：１５２１２１－３０－７）、およびＤｏｒａｍａｐｉｍｏｄ（ＣＡＳ番号：２８５９８３－４８－４）等のｐ３８阻害剤；ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質等の抗菌剤；インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロピン－１（ＣＴ－１)、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）等のＩＬ－６ファミリーサイトカイン；レチノイン酸；ニコチンアミド；フォルスコリン等の腫瘍細胞増殖因子－α（ＴＧＦ－α）；ＤＡＰＴ（γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；デキサメタゾン（Ｄｅｘ）；ラウリン酸、ミリスチン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸等の脂肪酸；これらの組み合わせ；を含有することができる。
　培地は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社等が販売している、Ｂ２７サプリメント、ＧｌｕｔａＭａｘシリーズ等のグルタミン酸含有サプリメント、ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ等のアミノ酸水溶液、Ｎ２サプリメント等のサプリメントを含有することができる。
　本実施形態のオルガノイドの製造方法において、培地は、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４若しくはＡＬＫ７又はこれらの組み合わせのいずれかのＴＧＦ－β受容体のアンタゴニストを実質的に含有しないことが好ましい。ここで、「実質的に含有しない」とは、有効成分として意図的に混入しないこと、又は、影響を無視可能できる程度の意図しない混入を許容することを意味する。具体的には、培地中に含まれるＴＧＦ－β受容体アンタゴニストの濃度は、１ｎＭ以下、好ましくは０．１ｎＭ以下、より好ましくは０．０１ｎＭ以下である。
　ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストとしては、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＳＢ－５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３－５９－５）、ＳＢ－５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９－２０－１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９－５３－６）、ＳＤ２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－８）、ＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）等が挙げられる。ＴＧＦ－β受容体リガンドとしては、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３等が挙げられる。
　本実施形態のオルガノイドの製造方法において、ヒト幹細胞は、細胞外マトリックスと接触させながら培養することが好ましい。
　ヒト幹細胞を細胞外マトリックスと接触させながら培養する方法としては、ヒト幹細胞を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に包埋して培養する方法、培地にＥＣＭを混和させて培養する方法、培養容器の培養面にＥＣＭをコートして培養する方法等が挙げられる。ＥＣＭとしては、例えば、基底膜に含まれる成分、細胞間隙に存在する糖タンパク質が挙げられる。基底膜に含まれる成分としては、例えば、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等が挙げられる。細胞間隙に存在する糖タンパク質としては、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸塩等が挙げられる。ＥＣＭとして、ＥＣＭを含む市販品を用いることができる。ＥＣＭを含む市販品としては、例えば、マトリゲル（登録商標、コーニング社）、ヒト型ラミニン（シグマ社）等が挙げられる。
　ＥＣＭが混和した培地は、培地中のＥＣＭ以外の成分の体積に対して、ＥＣＭの体積が、通常、１体積％以上、好ましくは５体積％以上１００体積％以下、より好ましくは１０体積％以上９０体積％以下となる量を混ぜ合わせて調製することができる。ＥＣＭを混和させる方法としては、氷浴上でピペッティング方法が挙げられる。混和とは、目視で培地中にＥＣＭが観察されない状態を意味する。
　培地は１～５日に１回程度交換することができる。培養は、通常、３０℃～５０℃、好ましくは３２℃～４８℃、より好ましくは３４℃～４６℃の温度条件下で行われる。培養は、二酸化炭素含有割合が、通常、１体積％～１５体積％、好ましくは２体積％～１４体積％、より好ましくは３体積％～１３体積％以下の雰囲気下で行われる。
［オルガノイド製造用培地］
　一実施形態において、本発明は、上記式（１）に記載のアミノ酸配列を有する環状ペプチド、又はその薬学的に許容可能な塩、を含有するオルガノイド製造用培地を提供する。
　本実施形態のオルガノイド製造用培地は、オルガノイド培養用培地ということもできる。本実施形態の培地により、ヒト幹細胞を良好に培養しオルガノイドを製造することができる。
　培地は、基礎培地に各種成分を添加して調製する。基礎培地、各種成分については上述したものと同様である。
［オルガノイド］
　一実施形態において、本発明は、上述したオルガノイドの製造方法によって得られた、オルガノイドを提供する。本明細書において、オルガノイドとは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで形成され、幹細胞を培養して得られる自己組織化３次元細胞培養物を意味する。細胞培養物は、臓器に近い構造を有することもできる。本実施形態のオルガノイドは、ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストの非存在下で培養することができる。このため、従来のＴＧＦ－β受容体アンタゴニストを用いて得られたオルガノイドとは異なり、ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストによるオフターゲットの阻害の影響を受けておらず、より生体内の細胞の状態を反映していると考えられる。
　本実施形態のオルガノイドとしては、大腸オルガノイド、小腸オルガノイド、肝オルガノイド、胆管オルガノイド、脳オルガノイド、卵巣癌オルガノイド、網膜オルガノイド等が挙げられる。
　本実施形態のオルガノイドは、本実施形態のオルガノイドの製造方法以外の製造方法で得られたオルガノイドと比較して、遺伝子発現プロファイル等に相違が存在するものと考えられる。しかしながら、そのような相違を特定し、遺伝子発現プロファイルの相違等により、本実施形態のオルガノイドの製造方法以外の製造方法で得られたオルガノイドであるか、本実施形態のオルガノイドであるかを特定することは非常に困難であり、実際的ではない。このため、製造方法により特定することが現実的である。
［被験物質の評価方法］
　一実施形態において、本発明は、上述したオルガノイドに被験物質を接触させる工程（以下、「工程１」ともいう）、及び前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程（以下、「工程２」ともいう）、を含む前記被験物質の評価方法を提供する。
　被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリが挙げられる。また、被験物質として、新薬も用いることができる。
　工程１において、オルガノイドを用いて、トランスウェル型アッセイ系等のセルベースアッセイ系、又はＯｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－Ｃｈｉｐ等の生体模倣システムを構築して、オルガノイドに被験物質を接触させることができる。
　工程２において、被験物質がオルガノイドに及ぼす影響は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等により評価することができる。
　以下、実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に何ら限定されるものではない。以下の実験例において、全ての実験には減菌処理済みの器具を用いた。
［実験例１］
（大腸上皮幹細胞培養用培地の調製）
　基礎培地に、下記表３に示す濃度となるよう各成分を加え、培地を調製した。表３中、「ＣＭ」はコンディションドメディウムを意味する。基礎培地には、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いた。ペプチドとしては、ペプチド名＃７４０１及び＃２３９２を使用した（以下、それぞれ「＃７４０１ペプチド」、「＃２３９２ペプチド」という場合がある。）。＃７４０１ペプチドについて、式（２－１）に化学式を、式（２－２）にアミノ酸配列（配列番号３）を示す。また、＃２３９２ペプチドについて、式（３－１）に化学式を、式（３－２）にアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［実験例２］
（ヒト大腸上皮細胞の培養）
　ヒト大腸上皮細胞（ヒト大腸幹細胞を含む）を、マトリゲル（登録商標、ＢＤバイオサイエンス社製）に分散させた。続いて、分散物を、４８ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種し、３７℃で１０分間インキュベートし、マトリゲル（登録商標）を重合させた。
　続いて、各ウェルに、実験例１で調製した培地（３００μＬ／ウェル）を重層して、３７℃、５体積％ＣＯ２存在下で７日間培養した。培地は、２日又は３日おきに交換した。続いて、７日間培養後のウェル内を光学顕微鏡で観察した。明視野画像を図１に示す。図１中、「ＮＤ」はデータを取得していないことを示す。
　その結果、＃２３９２ペプチド、＃７４０１ペプチドを添加した培地を用いてヒト大腸幹細胞を培養することにより、Ａ８３－０１を添加した場合と同等以上の効率でオルガノイドを形成させることができることが明らかとなった。
［実験例３］
（ヒト肝臓細胞の培養）
　ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ社製、ＨＥＰ１８７－Ｓ）を３７℃のウォーターバスで融解し、無血清培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＨＥＰＥＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ、ＰＥＮＩＣＩＬＩＮ／ＳＴＥＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮを加えた培地）を加えた５０ｍＬチューブに懸濁して遠心した。遠心後、上清を除き、その後、無血清培地で懸濁し、ヒト肝臓細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から２０，０００個のヒト肝臓細胞を採り、５０μＬのマトリゲル（登録商標、ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲル（登録商標）が完全に重合するまで３７℃で１０分間インキュベートした。重合した後に、基礎培地に、下記表４に示す濃度となるよう各成分を加えて調製した培地（５００μＬ／ウェル）を重層して、３７℃、５体積％ＣＯ２存在下で培養した。基礎培地には、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いた。培地は、２日又は３日おきに交換した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　図２は、細胞の増殖を測定した結果を示すグラフである。図２中、「ＰＤｉ」は培地に＃７４０１ペプチドを５μＭ添加した場合の結果を示し、「Ａ＋」は培地にＡ８３－０１を５μＭ添加した場合の結果を示し、「Ａ－」は培地に＃７４０１ペプチドもＡ８３－０１も添加しなかった場合の結果を示す。
　図２の結果から、培地にＡ８３－０１を５μＭ添加した場合、３５日間以降は細胞の増殖が認められないことが分かる。この結果から、Ａ８３－０１が、肝細胞による代謝の影響を受けた可能性が示唆された。
　図３は、＃７４０１ペプチドを低濃度にした場合の細胞の増殖を測定した結果を示すグラフである。図３中、「５μＭ　ＰＤｉ」は培地に＃７４０１ペプチドを５μＭ添加した場合の結果を示し、「５００ｎＭ　ＰＤｉ」は培地に＃７４０１ペプチドを５００ｎＭ添加した場合の結果を示し、「５０ｎＭ　ＰＤｉ」は培地に＃７４０１ペプチドを５０ｎＭ添加した場合の結果を示し、「Ａ＋」は培地にＡ８３－０１を５μＭ添加した場合の結果を示し、「Ａ－」は培地に＃７４０１ペプチドもＡ８３－０１も添加しなかった場合の結果を示す。
　図３の結果から、培地中の＃７４０１ペプチドの濃度が５０ｎＭであっても、細胞が十分増殖できることが明らかとなった。
［実験例４］
（ＳＭＡＤ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＢＥ）レポーターアッセイによる＃７４０１ペプチドの特異性評価）
　０．５ｎＭの各種ＴＧＦ－β（ＴＧＦ－β１～ＴＧＦ－β３）と、図４に示す濃度のＡ８３－０１又は＃７４０１ペプチドで、レポーター細胞（ＴＧＦ／ＳＭＡＤ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｐａｔｈｗａｙ　ＳＢＥ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ，ＨＥＫ２９３　Ｒｅｃｏｍｂｉｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ、ＢＰＳ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．社製）を刺激し、２０時間後にＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを用いてシグナルを検出した。本アッセイ系では、ＴＧＦ－βシグナルが核に伝達されると、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼが発現し、シグナルが検出される。結果を図４に示す。
［実験例５］
（ＥＧＦＲシグナル及びｐ３８　ＭＡＰＫシグナルの検討）
　ＥＧＦＲシグナルの上方制御は、細胞増殖を誘導することが知られている。そこで、ＥＧＦＲシグナルが無い状態での細胞増殖性について検討した。また、Ａ８３－０１はｐ３８　ＭＡＰＫシグナル伝達を阻害することが報告されており（非特許文献２）、更に、ｐ３８　ＭＡＰＫシグナルの下方制御は、腸の長期培養に有効であることが知られている（非特許文献１）。そこで、ｐ３８　ＭＡＰＫシグナルの有無における培養について検討した。
　基礎培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に、下記表５に示す濃度となるよう各成分を加え、培地を調製した。ヒト小腸上皮細胞（ヒト小腸幹細胞を含む）を、マトリゲル（登録商標、ＢＤバイオサイエンス社製）に分散させた。続いて、分散物を、４８ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種し、３７℃で１０分間インキュベートし、マトリゲル（登録商標）を重合させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　続いて、３００μＬ／ウェルの培地を重層して、３７℃、５体積％ＣＯ２存在下で１０日間培養した。培地は、２日又は３日おきに交換した。ＥＧＦを含む培地では１０日間培養し、ＥＧＦを含まない培地では１４日間培養した。その後、ウェル内の光学顕微鏡での明視野観察及びＬｇｒ５－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターアッセイを行った。図５は、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地での培養結果を示し、図６はＥＧＦを含まない培地での培養結果を示す。を示す。図５、図６中、「＃３－ａ＿Ａ５００Ｓ」はＡ８３－０１を５００ｎＭ及びＳＢ２０２１９０を１０μＭ含む培地での培養結果であることを示し、「＃７＿Ａ５００」はＡ８３－０１を５００ｎＭ含み、ＳＢ２０２１９０を含まない培地での培養結果であることを示し、「＃８＿Ａ５０００」はＡ８３－０１を５０００ｎＭ含み、ＳＢ２０２１９０を含まない培地での培養結果であることを示し、「＃９＿Ｐ５０」は＃７４０１ペプチドを５０ｎＭ含み、ＳＢ２０２１９０を含まない培地での培養結果であることを示し、「＃１０＿Ｐ５００」は＃７４０１ペプチドを５００ｎＭ含み、ＳＢ２０２１９０を含まない培地での培養結果であることを示す。
　図５の「＃３－ａ＿Ａ５００Ｓ」は、ｐ３８　ＭＡＰＫシグナルの下方制御による細胞増殖性及びコロニー形成性の阻害を示す結果である。また、図５の「＃７＿Ａ５００」及び「＃８＿Ａ５０００」の結果は、「＃３－ａ＿Ａ５００Ｓ」の結果と同様にＡ８３－０１を用いることにより、濃度依存的に、細胞増殖性及びコロニー形成性が阻害されたことを示している。したがって、これらの結果は、Ａ８３－０１によるｐ３８　ＭＡＰＫシグナル伝達阻害の可能性を示している。
　図６の「＃３－ａ＿Ａ５００Ｓ」の結果は、ｐ３８　ＭＡＰＫシグナルの下方制御が、腸の長期培養に有効であることを示す非特許文献１の結果を支持するものである。図６の「＃７＿Ａ５００」及び「＃８＿Ａ５０００」において、「＃９＿Ｐ５０」や「＃１０＿Ｐ５００」よりも幹細胞性が高く、さらに、「＃８＿Ａ５０００」が「＃７＿Ａ５００」よりも幹細胞性が高いことから、Ａ８３－０１によるｐ３８　ＭＡＰＫシグナル伝達阻害の可能性を示している。
［実験例６］
（大脳皮質オルガノイドの形成）
　ｈｉＰＳＣｓ（ＰＣｈｉＰＳ７７１株、Ｌｏｔ．Ａ０１ＱＭ２８、リプロセル社製）を、フィーダーフリー培養した。具体的には、ｈｉＰＳＣｓをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて単一細胞に分散した。続いて、分散したｈｉＰＳＣｓを、ラミニン－５１１の活性部位のみを含むヒト組換え型ラミニンフラグメント（製品名「ｉＭａｔｒｉｘ－５１１」、ニッピ社製）をコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地（味の素社製）にてフィーダーフリー培養した。上記のプラスチック培養ディッシュとして、６０ｍｍディッシュ（イワキ社製、細胞培養用）を用いた場合、単一細胞へ分散されたｈｉＰＳＣｓの播種細胞数は３×１０４個／ディッシュとした。
　細胞を播種してから１日後に、培地を、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地に交換した。以降、１～２日に１回、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地に培地交換した。その後、細胞を播種してから６日後に８０％コンフルエントになった。
　続いて、ｈｉＰＳＣｓの拡大培養物を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名）を用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作により単一細胞に分散した。分散されたｈｉＰＳＣｓの拡大培養物を、基礎培地（「ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＨＥＰＥＳ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名）に下記表６に示す濃度となるよう各成分を加えて調製した培地（１００μＬ／ウェル）中、９６ウェル培養プレート（製品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６Ｖ底プレート」、住友ベークライト社製）に、１×１０４個／ウェルの細胞密度となるように播種し、インキュベーター内（３７℃、１気圧、ＣＯ２濃度５ｖ／ｖ％）で７日間浮遊培養し、ｈｉＰＳＣｓの凝集塊を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　続いて、ウェルから培地を２３０μＬ／ウェル取り除いた。続いて、基礎培地（「ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＨＥＰＥＳ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名））に下記表７示す濃度となるよう各成分を加えて調製した培地を１５０μＬ／ウェル添加し、インキュベーター内（３７℃、１気圧、ＣＯ２濃度５ｖ／ｖ％）で７日間攪拌しながら浮遊培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　続いて、ウェルの内容物を１０ｍＬのＰＢＳが入ったＦａｌｃｏｎ（登録商標）コニカルチューブ５０ｍＬ（コーニング社製）に移した。続いて、５回転倒混和し、上清を除去し、細胞凝集塊を回収した。回収した細胞凝集塊を３０個、及び基礎培地（「ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＨＥＰＥＳ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名））に下記表８に示す濃度となるよう各成分を加えて調製した培地（３０ｍｌ／ウェル）を、シングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）に加えて、攪拌しながら浮遊培養した。培地は４日おきに交換した。浮遊培養開始から１２週間目に、シングルユースバイオリアクター内の細胞凝集塊（大脳皮質オルガノイド）を回収し、９６ウェル培養プレートに移した。図７は、１２週間浮遊培養した後の、９６ウェル培養プレート内の細胞凝集塊の状態を示す光学顕微鏡画像である。図７下段はウェル全体を撮影した画像であり、図７上段は拡大画像である。スケールバーは５００μｍである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　本発明によれば、増殖性に優れたオルガノイドの製造方法、前記オルガノイドの製造に用いる培地、前記培養によって得られたオルガノイド、オルガノイドを用いた被験物質の評価方法を提供することができる。

Claims (15)

  1. 　ヒト幹細胞を、下記式（１）に記載のアミノ酸配列を有する環状ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含有する培地中で培養することを含む、オルガノイドの製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、
    　Ｘ１は、Ｔｙｒ、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ、又はＮａｌ１を示し、
    　Ｘ２は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、
    　Ｘ３は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、
    　Ｘ４は、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＫＣＯｐ、Ｇｌｕ、又はＫＣＯｍを示し、
    　Ｘ５は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、
    　Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、
    　Ｘ７は、任意のアミノ酸残基を示し、
    　Ｒは、存在しないか又はＣ末端修飾基を示し、
    　ｎは、０又は１の整数を示し、
    　ＰｅＧは、Ｎ－（２－フェニルエチル）－グリシンであり、
    　Ｎａｌ１は、β－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニンであり、
    　Ｗ６Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、
    　Ｗ７Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、
    　ＫＣＯｐは、Ｎ６－（４－（カルボキシメチル）ピペラジン－１－カルボニル）－Ｌ－リシンであり、
    　ＫＣＯｍは、Ｎ６－（メチル（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２，３，４，５，６－）ペンタヒドロキシヘキシル）カルバモイル）－Ｌ－リシンであり、
    　４Ｐｙは、４－ピリジル－Ｌ－アラニンである。］
  2. 　前記式（１）におけるＸ１～Ｘ７、Ｒ、ｎの組み合わせが、下記表１に示す組み合わせである、請求項１に記載のオルガノイドの製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  3. 　前記式（１）に記載のアミノ酸配列におけるＸ１がＮａｌ１、Ｘ２がＶａｌ、Ｘ４がＡｓｐ、Ｘ５がＴｙｒである、請求項１又は請求項２に記載のオルガノイドの製造方法。
  4. 　前記式（１）に示すアミノ酸配列におけるＰｈｅとＣｙｓとの結合が、チオエーテル結合を介した結合である、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  5. 　前記式（１）に示すアミノ酸配列のＸ７がＧｌｙを含む、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  6. 　前記培地に含まれる、前記環状ペプチド及びその薬学的に許容可能な塩の合計の濃度が、０．１ｎＭ～１０μＭである、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  7. 　前記培地が、Ｗｎｔシグナル増強剤を更に含有する、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  8. 　前記培地が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）若しくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）又はこれらの組み合わせを更に含有する、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  9. 　前記培地が、骨形成因子（ＢＭＰ）阻害剤を更に含有する、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  10. 　前記培地が、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達阻害剤を更に含有する、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  11. 　前記培地が、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４若しくはＡＬＫ７又はこれらの組み合わせの、アンタゴニストを実質的に含有しない、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  12. 　前記ヒト幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させながら培養する、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法。
  13. 　下記式（１）に記載のアミノ酸配列を有する環状ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含有する、オルガノイド製造用培地。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式（１）中、
    　Ｘ１は、Ｔｙｒ、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ、又はＮａｌ１を示し、
    　Ｘ２は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、
    　Ｘ３は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、
    　Ｘ４は、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＫＣＯｐ、Ｇｌｕ、又はＫＣＯｍを示し、
    　Ｘ５は、Ｔｙｒ、又は４Ｐｙを示し、
    　Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＫＣＯｐ、又はＫＣＯｍを示し、
    　Ｘ７は、任意のアミノ酸残基を示し、
    　Ｒは、存在しないか又はＣ末端修飾基を示し、
    　ｎは、０又は１の整数を示し、
    　ＰｅＧは、Ｎ－（２－フェニルエチル）－グリシンであり、
    　Ｎａｌ１は、β－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニンであり、
    　Ｗ６Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、
    　Ｗ７Ｎは、（Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）プロパン酸であり、
    　ＫＣＯｐは、Ｎ６－（４－（カルボキシメチル）ピペラジン－１－カルボニル）－Ｌ－リシンであり、
    　ＫＣＯｍは、Ｎ６－（メチル（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２，３，４，５，６－）ペンタヒドロキシヘキシル）カルバモイル）－Ｌ－リシンであり、
    　４Ｐｙは、４－ピリジル－Ｌ－アラニンである。］
  14. 　請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載のオルガノイドの製造方法によって得られた、オルガノイド。
  15. 　請求項１４に記載のオルガノイドに被験物質を接触させる工程、及び前記被験物質が前記オルガノイドに及ぼす影響を評価する工程、を含む、前記被験物質の評価方法。
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