WO2023121177A1 - 면역 회피성 항종양 아데노바이러스 - Google Patents

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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention relates to an anti-tumor adenovirus capable of evading the immune system in vivo.
  • Cancer is one of the diseases that cause the most deaths worldwide, and the development of innovative cancer treatments can reduce medical costs and create high added value at the same time. Also, according to statistics in 2008, molecular therapies that can overcome resistance to existing anticancer drugs accounted for $17.5 billion in 7 major countries (US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK), and in 2018 In the case of 2008, it is expected to account for a market size of about $45 billion, showing a growth rate of 9.5% compared to 2008. Cancer treatment is divided into surgery, radiation therapy, chemotherapy, and biological therapy. Among them, chemotherapy is a treatment that suppresses or kills the proliferation of cancer cells with chemical substances.
  • Oncorine modified by the E1B-55KD deletion enabling conditional replication in P53-deficient cancer cells.
  • Oncorine is administered by intratumoral injection for head and neck cancer.
  • Adenoviruses have been widely used as gene transfer vectors for gene therapy as well as oncolytic agents for cancer treatment. Adenoviruses exhibit several characteristics that make them suitable for this use.
  • adenovirus in terms of safety, does not cause life-threatening diseases in humans, and its viral genome is non-integrative, preventing insertional mutations. Clinical trials using adenovirus-based vectors report that these viruses have good toxicity and safety profiles, although the need for improved efficacy remains for systemic administration.
  • systemic administration i.e., intravenous or intraarterial injection into the bloodstream
  • systemic administration is essential to treat disseminated tumors in an advanced or metastatic state.
  • adenovirus shows significant limitations in reducing the therapeutic effect when injected into the bloodstream.
  • Adenovirus type 5 (Ad5) undergoes several neutralizing interactions that dramatically reduce the bioavailability of the virus in the bloodstream.
  • liver sequestration since >90% of the injected dose resides in the liver, mainly hepatic macrophages, also called Kupffer cells, but also liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and liver cells.
  • LSECs liver sinusoidal endothelial cells
  • Direct interaction with blood cells and proteins is also a major obstacle.
  • Ad5 directly binds to blood cells such as red blood cells through CAR receptors and can bind to platelets through integrins.
  • Antibodies not only neutralize viruses directly, but can also trigger an innate immune response by complement activation and docking of viral particles to Fc receptors on monocytes and neutrophils.
  • viral re-administration increases the concentration of anti-Ad neutralizing antibody (NAb), thus enhancing viral neutralization.
  • NAb anti-Ad neutralizing antibody
  • Opsonization of adenovirus by antibodies and complement can also enhance clearance by Kupffer cells. Overall, these interactions result in a significant shortening of the half-life of Ad in the blood to about minutes in mice and humans. Considerable efforts have been made to avoid neutralization by antibodies and immune cells during systemic administration of adenovirus, but it has been reported that systemic spread is still limited, transient and usually ineffective (Ferguson et al. 2012).
  • An object of the present invention is to provide an anti-tumor adenovirus.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • an object of the present invention is to provide a use for preventing or treating tumors of the adenovirus.
  • an object of the present invention is to provide a method for treating cancer by administering the adenovirus to a subject suffering from cancer.
  • the present invention provides an adenovirus comprising a nucleic acid encoding a transferrin binding moiety.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the anti-tumor adenovirus.
  • the present invention provides a use for preventing or treating tumors of the adenovirus.
  • the present invention provides a method for treating cancer, wherein the adenovirus is administered to a subject suffering from cancer.
  • the adenovirus containing the nucleic acid encoding the transferrin binding domain of the present invention significantly increased the effect of infecting and killing tumor cells, and increased the plasma half-life by avoiding the immune response in the body due to the increased binding with transferrin. And, because it is specifically delivered to cancer cells, it has a systemic therapeutic effect, local delivery is possible, and excellent selectivity shows remarkable anti-tumor efficacy, so it can be usefully used as an anti-cancer composition or an anti-cancer adjuvant for various cancer types. there is.
  • 1 is a diagram showing the antibody avoidance mechanism of the anti-tumor adenovirus comprising the transferrin-binding domain of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the production process of the anti-tumor adenovirus containing the transferrin-binding domain (moiety) of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a vector map of pAd1128, an adenovirus envelope-associated plasmid containing the transferrin-binding domain of the present invention at the HVR1 position of hexon.
  • FIG. 4 is a diagram showing a vector map of adenovirus including an albumin binding domain (ABD) (CA10G-A)
  • FIG. 5 is a diagram showing a vector map of an adenovirus including transferrin-binding moiety Tbp29aa in hexon of the adenovirus vector of the present invention (HVR1-Tbp29aa).
  • FIG. 6 is a diagram showing a vector map of an adenovirus comprising a fusion protein comprising a linker at the N-terminus and C-terminus of the transferrin binding moiety Tbp 55aa in hexon of the adenovirus vector of the present invention ( HVR1-Tbp (G 4 S 1 ) 3 55 aa).
  • FIG. 7 and 8 are diagrams showing the immune evasion ability of adenovirus containing a transferrin-binding domain:
  • CA10G control adenovirus
  • CA10G-A (CA10G-a): adenovirus containing an albumin binding domain;
  • HVR1-Tbp29aa (Tbp-29aa): an adenovirus comprising the transferrin binding moiety Tbp29aa in the hexon of an adenoviral vector;
  • HVR1-Tbp(G4S1)3 55aa An adenovirus comprising the transferrin binding moiety Tbp55aa and a linker in the hexon of an adenoviral vector.
  • Figure 9 is a diagram showing immune evasion ability according to the insertion site of the transferrin-binding moiety into adenovirus:
  • CA10G control adenovirus
  • CA10GT HVR1-(G 4 S 1 ) 3 -Tbp 55aa adenovirus with transferrin binding moiety inserted at HVR1 position of hexon;
  • HVR2 29aa HVR2-Tbp 29aa adenovirus with a transferrin binding moiety inserted at the HVR2 position of hexon;
  • HVR2 L3 55aa HVR2-(G 4 S 1 ) 3 -Tbp 55aa adenovirus.
  • nucleic acids are written in the 5′ ⁇ 3′ direction from left to right.
  • Numerical ranges recited within the specification are inclusive of the numbers defining the range and include each integer or any non-integer fraction within the defined range.
  • the present invention relates to an adenovirus comprising a nucleic acid encoding a transferrin binding moiety in the coding region of a hypervariable region (HVR) of a hexon protein.
  • HVR hypervariable region
  • the adenovirus may include a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the adenovirus may include a nucleic acid sequence of hexon containing a transferrin-binding moiety, and the nucleic acid sequence of hexon containing a transferrin-binding moiety is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 or the base sequence of SEQ ID NO: 10
  • the hexon comprising the transferrin binding moiety may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or 11.
  • the hypervariable region of the adenovirus hexon protein may be HVR1
  • the HVR1 may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • the nucleic acid sequence encoding the HVR1 includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 can do.
  • the nucleic acid encoding the transferrin-binding moiety may be included between the codons expressing the 154th and 155th amino acids of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 6) encoding the hexon of adenovirus.
  • the transferrin-binding moiety may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, and the nucleic acid sequence encoding the transferrin-binding moiety may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the N-terminus, the C-terminus, or the N-terminus and the C-terminus of the transferrin binding moiety may be connected to the hexon protein through a linker, and the linker may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 .
  • the transferrin binding moiety can be directly attached to the hexon protein, ie the N-terminus and C-terminus of the transferrin-binding moiety are directly linked to the hexon protein.
  • the transferrin-binding moiety can also be linked to the hexon protein via a linker sequence.
  • the N-terminus and/or C-terminus of the transferrin-binding moiety is linked to the hexon protein via a linker sequence.
  • the transferrin binding moiety may be located on the outer surface of the hexon protein.
  • the adenovirus of the present invention can be coated with a transferrin-binding domain by including a transferrin-binding moiety on the outer surface of the hexon protein, thereby protecting itself from neutralizing antibodies present in the bloodstream.
  • the adenovirus may be a human adenovirus, may be selected from the group consisting of human adenovirus serotypes 1 to 57, may be human adenovirus serotype 5 (GenBank: AY339865.1), It may be a chimeric adenovirus of human adenovirus serotype 5/3.
  • the adenovirus may further include a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter, and the promoter may be operably linked to an endogenous gene of the adenovirus.
  • the promoter may be selected from the group consisting of E2F promoter, telomerase hTERT promoter, tyrosinase promoter, prostate-specific antigen promoter, alpha-fetoprotein promoter and COX-2 promoter.
  • the telomerase hTERT promoter may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and may be operably linked to E1A and E1B of the endogenous adenovirus gene.
  • the endogenous gene of the adenovirus has a structure of 5'-ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3-'ITR;
  • C1 includes E1A, E1B or E1A-E1B;
  • C2 includes E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;
  • C3 does not include E3 or includes E3; said C4 includes L5; and
  • C5 may not include E4 or may include E4.
  • an IRES sequence may be further included between E1A and E1B of the endogenous gene of the adenovirus.
  • the E1A may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the E1B may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
  • the IRES may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the promoter can be operably linked to E1A and E1B of the endogenous gene of adenovirus.
  • the adenovirus may include the hTERT promoter-E1A-IRES-EIB including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the adenovirus may further include an expression cassette expressing a foreign gene, and the expression cassette may be included in the E3 region of the endogenous gene of the adenovirus.
  • the adenovirus of the present invention may further include a CMV promoter and a foreign gene, and the CMV promoter and a foreign gene operably linked thereto may be included in the E3 region of the endogenous gene of the adenovirus.
  • the adenovirus may be an oncolytic adenovirus, an anti-tumor adenovirus.
  • the adenovirus of the present invention may have higher oncolytic activity than wild-type adenovirus and may be an oncolytic adenovirus.
  • the adenovirus of the invention is a replication competent adenovirus, anti-tumor or oncolytic adenovirus.
  • the adenovirus is a replication deficient adenovirus or a replication-deficient adenovirus.
  • Replication-deficient or replication-defective adenoviruses are viruses that are unable to replicate in target cells, used in gene therapy as gene carriers to target cells because they aim to express therapeutic genes in cells and not to degrade the cells. It is an adenovirus.
  • the adenovirus may further include a capsid modification to increase the infectivity of the adenovirus or to target it to a receptor present in tumor cells.
  • the modification of the capsid may be to insert the RGD motif in the H1 loop of the adenoviral fiber protein.
  • the modification of the capsid may be to form a chimeric adenovirus by substituting a fiber gene or a part thereof with a homologous part derived from an adenovirus of another serotype, and a fiber gene or a part thereof derived from a serotype 3 adenovirus.
  • a portion including a capsid substituted with a portion thereof and a portion excluding the fiber gene may be constructed to include a gene derived from serotype 5 adenovirus.
  • the adenovirus may include one or more non-adenoviral genes, the non-adenoviral genes may be genes used in cancer gene therapy, and the genes used in cancer gene therapy It may be selected from the group consisting of tumor-suppressor genes, genes encoding anti-tumor interfering RNAs, and immunostimulatory genes.
  • the adenovirus of the present invention can be selectively dispersed in certain tissues in vivo, thereby avoiding or significantly reducing expression in non-target or non-tumor tissues.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention can be used for cancer gene therapy.
  • transferrin is a glycoprotein that binds very strongly and reversibly to iron. Although only about 0.1% of the iron present in the body is bound to transferrin, it plays a very important role in regulating the amount of iron in the body. Transferrin exists in the blood and plays a role in absorbing iron. In the present invention, transferrin in the blood binds to the transferrin-binding moiety of the present invention, thereby enabling adenovirus to avoid antibodies in vivo, thereby increasing the blood half-life during systemic administration of adenovirus.
  • the term "transferrin-binding moiety” refers to any amino acid sequence capable of binding to transferrin, that is, having binding affinity. Preferably, it can bind serum transferrin, more preferably human serum transferrin.
  • the term "transferrin-binding moiety” includes natural transferrin-binding domains (eg, transferrin present in bacterial proteins) and transferrin-binding sequences derived from synthetic peptides. In a preferred embodiment, the transferrin-binding moiety is selected from transferrin binding domains from Neisseria Meningitidis , functionally equivalent variants thereof.
  • transferrin binding domain refers to any region derived from a native protein that is capable of binding transferrin with sufficient specificity to ensure protection from neutralizing antibodies, and may be used herein in the same language as transferrin binding moiety.
  • transferrin binding / binding moiety, transferrin binding domain and transferrin binding peptide / protein / protein are used interchangeably, but transferrin binding / binding moiety includes both transferrin binding domain and transferrin binding peptide / protein / protein , more preferably a transferrin binding/binding moiety may refer to a synthetic peptide comprising a partial amino acid sequence of a transferrin binding domain of a transferrin binding/binding peptide/protein/protein.
  • the present invention includes functionally equivalent variants of the aforementioned transferrin-binding moieties.
  • the term "functionally equivalent variant” refers to any derivative derived from the transferrin-binding moiety by insertion, deletion or substitution of one or more residues, which substantially retains the ability to interact with transferrin as determined above. refers to a polypeptide. In a preferred embodiment, the polypeptide has at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or A polypeptide is considered to be a functionally equivalent variant of the transferrin binding moiety if it exhibits 100% transferrin binding capacity.
  • the polypeptide is at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% efficient with the transferrin binding domain of SEQ ID NO: 2 or 4. can neutralize the antibody, the polypeptide is considered a functionally equivalent variant of the transferrin binding moiety.
  • the level of identity between the two polypeptides is determined using computer algorithms and methods well known to those skilled in the art. do. Identity between two amino acid sequences is preferably determined by the BLASTP algorithm [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)], but other similar algorithms may also be used. BLAST and BLAST 2.0 are used applying the parameters mentioned herein to determine percent sequence identity. Software for performing BLAST analyzes is publicly available through the National Center for Biotechnology Information.
  • the type of transferrin-binding moiety includes, but is not limited to, various peptides, antibodies, etc. in addition to the moiety described in the Examples of the present invention.
  • the transferrin binding moiety is US5912336, US7582730, US6437096, US6090576, US7258989, US6004562, US6391316, US10149900, US6610506, US20030186848A1, US20200030428A1, US Transferrin binding proteins (Tbp1, Tbp2) from various bacteria described in 20080206260A1, US6015688 and US20040258695A1 , TbpA, TbpB, etc.), iron-regulated proteins, iron-regulated outer membrane proteins, transferrin receptor proteins, Moraxella catarrhalis outer membrane protein B1, transferrin binding A chimeric fusion protein comprising a peptide, a recombinant transferrin-binding peptide, a fragment or analog thereof of the peptide or protein,
  • the antibodies include whole antibody forms as well as functional fragments of antibody molecules.
  • a full antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having an antigen-binding function, and examples of antibody fragments include (i) a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) and a light chain constant region (CL) and a Fab fragment consisting of the first constant region of the heavy chain (CH1); (ii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iii) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single antibody; (iv) a dAb fragment consisting of a VH domain (Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) an isolated CDR region; (vi) a bivalent fragment comprising two
  • F(ab')2 fragments (vii) single-chain Fv molecules (scFv) joined by a peptide linker that links the VH and VL domains to form an antigen-binding site; (viii) bispecific single-chain Fv dimers. (PCT/US92/09965) and (ix) a multivalent or multispecific fragment produced by gene fusion (diabody WO94/13804).
  • the term "linker sequence” acts as a hinge between the hexon protein and the transferrin-binding moiety to provide a space between the two factors, so that the secondary structure of the hexon protein affects the presence of the transferrin-binding moiety refers to an amino acid sequence that does not accept and vice versa.
  • the linker sequence may have any length that allows the two elements to move independently of each other while maintaining the tertiary structure of the individual elements.
  • the linker sequence is a flexible linker peptide less than 31 amino acids in length. More preferably, the linker sequence comprises less than 10, less than 5, less than 4 or less than 2 amino acids.
  • the linker sequence comprises two or more amino acids selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine.
  • the linker is a polyglycine linker. In the case of a linker sequence, it can be represented by SEQ ID NO: 5 in the present invention.
  • Other linkers may alternatively be used (Reddy Chichili, VP., Kumar, V., and Sivaraman, J. (2013). Linkers in the structural biology of protein-protein interactions. Protein Science 22(2):153- 67).
  • operably linked refers to a functional linkage between a gene expression control sequence (eg, a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulatory factor binding sites) and another gene sequence, whereby Regulatory sequences will control the transcription and/or translation of said other gene sequences.
  • a gene expression control sequence eg, a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulatory factor binding sites
  • promoter refers to an untranslated nucleic acid upstream of a coding region that includes a binding site for RNA polymerase and has an activity of initiating transcription of a gene downstream of the promoter into mRNA. say sequence.
  • the promoter may be any promoter capable of initiating shRNA expression.
  • a promoter that constantly induces the expression of the target gene at all times or a promoter that induces the expression of the target gene at a specific location and time (inducible promoter)
  • examples include the U6 promoter, the H1 promoter, the cytomegalovirus (CMV) promoter, the SV40 promoter, the CAG promoter (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), the CaMV 35S promoter (Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985), Rsyn7 promoter (U.S. Patent Application No.
  • the promoter of the present invention may be a U6 promoter, HI promoter, or CMV promoter, and according to a preferred embodiment of the present invention, a CMV promoter may be used.
  • tissue-specific is intended to mean that a promoter operably linked to a gene essential for replication functions in a tissue-specific manner to proceed with replication in a tissue. This may occur because positive transcription factors that activate the promoter are present in that tissue and not in non-target tissues. It may also occur due to the absence of transcriptional inhibitors, which are normally formed in non-target tissues and prevent transcription as a result of the promoter. Thus, when transcribed, it is directed towards genes essential for replication, such that replication of the vector and its attendant function in the target tissue takes place.
  • Tissue specificity relates specifically to targeting the abnormal counterpart of a particular tissue while avoiding its normal counterpart, or treating abnormal tissue while avoiding other types of surrounding tissue other than the abnormal tissue.
  • a promoter is "tumor-specific", meaning that the promoter functions specifically in tumor tissue.
  • the recombinant adenovirus of the present invention is useful for treating metastases to the liver.
  • a specific example is colorectal cancer, which often metastasizes to the liver. When colorectal cancer metastasizes to the liver, it has been shown that the CEA promoter is active in metastatic cells but not in normal liver cells.
  • a normal adult human liver will not be able to support replication of a virus that has viral genes essential for replication linked to the colorectal cancer CEA-specific promoter. Replication must occur in the primary cancer cell.
  • the alphafetoprotein promoter which is active only in hepatocellular carcinoma.
  • the tyrosinase promoter which is active only in melanoma and not in normal skin. In each case, replication is expected in abnormal cells and not in normal cells.
  • tissue-specific promoters include, but are not limited to, alphafetoprotein promoter, DE3 promoter, tyrosinase promoter, carcinoembryonic antigen (CEA) promoter, surfactant protein promoter, E2F promoter, telomerase hTERT promoter, prostate-specific antigen promoter, COX-2 promoter, albumin gene promoter, core promoter of hepatitis virus, promoter of globulin-binding protein that binds to thyroxine and ErbB2 promoter.
  • alphafetoprotein promoter DE3 promoter
  • tyrosinase promoter carcinoembryonic antigen (CEA) promoter
  • surfactant protein promoter E2F promoter
  • telomerase hTERT promoter telomerase hTERT promoter
  • prostate-specific antigen promoter COX-2 promoter
  • albumin gene promoter core promoter of hepatitis virus
  • adenovirus refers to any virus that can be classified as an adenovirus, that is, an adenoviridae characterized as a non-enveloped virus having an icosahedral nucleocapsid containing a double-stranded DNA genome.
  • Adoviridae refers to any virus belonging to the family. This term includes any adenovirus capable of infecting humans or animals, including all groups, subgroups and serotypes that utilize the CAR as a receptor to infect target cells.
  • Adenoviruses of the present invention include, but are not limited to, avian, canine, equine, bovine, ovine, porcine, human or frog adenoviruses.
  • the adenovirus of the present invention is a human adenovirus, ie an adenovirus capable of infecting humans.
  • a "serotype" is each immunologically different type of adenovirus. In the case of human adenovirus, there are at least 57 serotypes classified into several subgroups (A to G).
  • the adenovirus of the present invention is a recombinant adenovirus.
  • the term "recombinant” refers to an adenovirus that is not naturally produced.
  • These recombinant adenoviruses contain one or more modifications compared to subtypes. Such modifications include, but are not limited to, modifications to the adenovirus genome that is packed into particles to make an infectious virus.
  • replication-deficient viruses ie, non-reproducible viruses
  • modifications include those known in the art, such as deletion of one or more of the E1a, E1b, E2a, E2b, E3 or E4 coding regions.
  • Adenovirus particles consist of a capsid that encloses viral DNA.
  • capsid is a viral protein shell formed by subunits called capsomers, which may be pentagonal or hexagonal.
  • capsomers which may be pentagonal or hexagonal.
  • Adenoviral capsid takes the form of an icosahedron with 20 equilateral triangles. Capsid Most of them are formed by hexon protein, and each vertex is a complex formed by fenton base and fiber protein.
  • the adenovirus of the present invention may have modifications in its genome sequence that confer selective replication in cells.
  • the adenovirus of the present invention may contain a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter.
  • the adenovirus further comprises a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter.
  • the term "recombinant” also includes replication-conditional adenoviruses that replicate preferentially in certain types of cells or tissues, but with little or no replication in other types. do.
  • adenoviruses replicate in abnormally proliferating tissues such as solid tumors and other neoplasms.
  • viruses are sometimes referred to as “cytolytic” or “cytopathic” viruses (or vectors), and “oncolytic” viruses (or vectors) when they have such an effect on neoplastic cells.
  • adenovirus hexon protein or "hexon protein” (conventionally referred to as “protein II”) is a protein in adenoviruses that self-assembles to form trimers each having a hexagonal shape. Refers to the major structural protein found in capsid. 240 hexon trimers assemble to form an adenovirus capsid. The hexon protein is essential for viral capsid assembly, icosahedral symmetry determination of the capsid and capsid integrity. Although major structural features of the hexon protein are common among adenovirus serotypes, the size and immunological properties of the hexon protein differ between serotypes.
  • hexon protein is a non-limiting example, corresponding to the hexon protein of human adenovirus C serotype 5, registered on February 19, 2014 Accession No. P04133 to the sequence of the UniProt database protein defined; A protein defined by the sequence of the UniProt database with accession number P03277 registered on February 19, 2014, corresponding to the hexon protein of human adenovirus C serotype 2; A protein defined by the sequence of the UniProt database of accession number P42671 registered on February 19, 2014, corresponding to the hexon protein of avian adenovirus gal1 (strain Phelps); and the protein defined by the sequence of the UniProt database with accession number P11819 registered on February 19, 2014, corresponding to the hexon protein of human adenovirus F serotype 40. .
  • This expression covers all natural variants of the hexon protein that occur naturally in different subgroups or serotypes.
  • the expression "outer surface of hexon protein” refers to a region exposed on the surface of the capsid of hexon protein.
  • Loop 1 (L1) and Loop 2 (L2) of the hexon protein are reported to be exposed on the outer surface of the viral capsomere structure.
  • L1 includes six hypervariable regions (HVRs), that is, HVR1 to HVR6, and L2 includes a seventh hypervariable region (HVR7).
  • HVRs hypervariable regions
  • HVR7 hypervariable region
  • hypervariable region refers to a region in which there is a difference between the length and sequence determining the serotype of adenovirus in surface exposed loops.
  • the names used for HVRs are as mentioned in Crawford-Miksza and Schnurr (Crawford-Miksza and Schnurr. 1996. Virology, 224(2):357-367).
  • the HVR is but not limited to HVR1.
  • the sequence encoding the transfection binding moiety is, according to the numbering of the hexon protein of GenBank accession number BAG48782.1 dated June 14, 2008, which corresponds to the hexon protein from human adenovirus serotype 5, in which the fusion protein produced is hexon
  • the D154 amino acid of the protein is inserted to contain the transferrin binding moiety.
  • the adenovirus is an oncolytic adenovirus, and preferably the adenovirus genome has a mutation in one or more genes selected from the group consisting of E1a, E1b, E4 and VA-RNA to achieve selective replication in tumors. further comprising, adenovirus.
  • the adenovirus genome further comprises capsid modifications to increase adenovirus infectivity or target it to receptors present on tumor cells.
  • the modification of the capsid is to insert the RGD motif into the H1 loop of the adenoviral fibroprotein.
  • the adenovirus genome is a chimeric adenovirus genome derived from one given serotype, comprising fragments or regions of the genome that have been replaced with homologous regions of the genome from another serotype.
  • such chimeric adenovirus is a human derived from serotype 5, comprising a portion of the fiber gene replaced with a homologous region derived from another serotype, preferably human adenovirus 3 or human adenovirus 35. It is an adenovirus.
  • modification of the capsid is by substituting a portion of the fiber gene with a homologous portion derived from another adenovirus serotype to form a chimeric adenovirus.
  • the type 5/3 adenovirus includes a part of the fiber gene derived from type 3 adenovirus, and the other genome means a virus derived from type 5 adenovirus.
  • the adenovirus genome comprises additional genes inserted into its genome.
  • the gene is used for gene therapy or vaccine immunization.
  • the gene is a gene used for cancer gene therapy, more preferably a group consisting of at least a prodrug-activating gene, a tumor-suppressor gene, a gene encoding an anti-tumor interfering RNA, and an immunostimulatory gene. It is a gene selected from.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the adenovirus of the present invention as an active ingredient.
  • the adenovirus of the present invention is an oncolytic adenovirus.
  • oncolytic adenovirus refers to any adenovirus that is replication-competent or capable of replicating in tumors, even without selectivity.
  • the therapeutic action of oncolytic adenoviruses is based on their ability to cytolyze tumor cells to replicate and eradicate.
  • Apoptosis of tumor cells can be assessed by measuring the number of viable cells, cytopathic effect, apoptosis of tumor cells, by PCR in tumor cells (e.g., metabolic markers, Western blot of viral proteins or reverse transcription of viral genes required for replication). It can be detected by any state-of-the-art method, such as protein synthesis or tumor size reduction.
  • composition of the present invention can be administered systemically.
  • composition of the present invention may be for intravenous administration.
  • the composition of the present invention may further include an anti-cancer agent, for example, acibacin, aclarubicin, acodazole, acronisin, adozelesin, alanosin, aldesleukin, allo Purinol Sodium, Altretamine, Aminoglutethimide, Amonafide, Amplogen, Amsacrine, Androgens, Anguidin, Aphidicolin Glycinate, Asaray, Asparaginase, 5-Azacytidine , Azathioprine, Bacillus Calmete-Guerin (BCG), Baker's Antipol, Beta-2-deoxythioguanosine, Bisantrene HCl, Bleomycin Sulfate, Bulseppan, Butionine Sulfoximin, BWA 773U82 , BW 502U83/HCl, BW 7U85 mesylate, cerasemide, carbetimer, carboplatin, car
  • cisplatin paclitaxel, 5-fluorouracil (5-FU), methotrexate, doxorubicin, daunorubicin, cytosine arabinoside, etoposide, melparan, chlorambucil, cyclophosphamide, vindesine, mycobacteria Tomycin, bleomycin, tamoxifen and taxol, more preferably cisplatin, paclitaxel or 5-fluorouracil (5-FU), but combined treatment with the composition of the present invention to achieve the purpose of showing a synergistic effect on anticancer effect To do so, it is not limited thereto.
  • the cancer is colorectal cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer , esophageal cancer, small intestine cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer, head cancer, Cervical cancer, cutaneous melanoma, intraocular melanoma, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, It may be any one selected from the group consisting of
  • composition of the present invention may further include an adjuvant.
  • adjuvant any one may be used without limitation, but, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase the effect.
  • composition according to the present invention may be prepared in the form of incorporating the active ingredient into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition of the present invention may be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories or sterile injection solutions according to conventional methods.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations contain at least one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and gelatin in addition to active ingredients. It can be prepared by mixing etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • compositions for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • a base for suppositories witepsol, tween 61, cacao paper, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the holy substance according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection, but intravenous administration is most preferred.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, and physical condition of the subject. It is obvious that the concentration of the single domain antibody included in the pharmaceutical composition can be variously selected depending on the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 to 5,000 ⁇ g/ml. If the concentration is less than 0.01 ⁇ g/ml, pharmacological activity may not appear, and if the concentration exceeds 5,000 ⁇ g/ml, toxicity to the human body may be exhibited.
  • composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of cancer and its complications, and can also be used as an anticancer adjuvant.
  • composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is dependent on the type and severity of the subject, age, sex, activity of the drug, and drug. sensitivity, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitantly used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the present invention relates to the use of an adenovirus comprising a nucleic acid encoding the transferrin-binding moiety of the present invention in the coding region of a hypervariable region (HVR) of a hexon protein for preventing or treating tumors.
  • HVR hypervariable region
  • the present invention relates to a method for treating cancer, wherein an adenovirus containing a nucleic acid encoding the transferrin-binding moiety of the present invention in the coding region of a hypervariable region (HVR) of a hexon protein is administered to a subject suffering from cancer.
  • HVR hypervariable region
  • Tbp29aa SEQ ID NO: 2
  • Tbp55aa SEQ ID NO: 4
  • Tbp29aa SEQ ID NO: 2
  • Tbp55aa SEQ ID NO: 4
  • Bio Basic Inc. was commissioned to synthesize a nucleotide sequence encoding a fusion protein including a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) and a linker (SEQ ID NO: 5) at the N-terminus and C-terminus of Tbp55aa (SEQ ID NO: 4).
  • the target sequence is amplified by PCR, and then the HVR1 position of the base sequence (SEQ ID NO: 14) encoding hexon of the pAd1128 (OD260, adenoviral plasmid) plasmid (154th amino acid of the base sequence encoding hexon) (gaa, E) and between the codons expressing the 155th amino acid (gac, D)), respectively, and transformed into E. coli DH10B. Thereafter, clones in which insertion of each transferrin-binding moiety was confirmed through colony PCR were mini-prepped, and then sequencing was requested to macrogen to confirm the nucleotide sequence again.
  • adenovirus genome (comid) to be used as a material for producing adenovirus
  • the pAd1128-tbp including each transferrin binding moiety coding sequence
  • pAd1127 including E and PIX sites
  • pAd1129 E3
  • Sfil restriction enzyme
  • FIG. 6 The vector structure of an adenovirus containing Tbp55aa containing a linker at the terminal and C-terminus is shown in FIG. 6 (adenovirus containing SEQ ID NO: 10; HVR1-(G 4 S 1 ) 3 -TBP 55aa).
  • type 5/3 adenovirus CA10G-A (adenovirus comprising the sequence of SEQ ID NO: 12) containing an albumin binding domain (ABD) in the HVR1 region to be used as a positive control is shown in FIG. 4 .
  • Example 2 It was confirmed whether the adenovirus containing the transferrin-binding domain prepared in Example 1 binds to transferrin in vivo to avoid antibody attack and kills cancer cells. Specifically, 100 ul of the lung cancer cell line A549 was dispensed in a 96-well plate so that 1 x 10 4 cells per well. The positive control, CA10G-A (type 5/3 adenovirus containing an albumin-binding moiety in the HVR1 region: adenovirus containing the sequence of SEQ ID NO: 12), contained 10 mg/ml of albumin before cell treatment for antibody avoidance. A binding reaction was performed at 4° C.
  • HVR1-TBP 29aa of the present invention type 5/3 adenovirus containing the transferrin-binding moiety of SEQ ID NO: 1 in the HVR1 region
  • HVR1-(G 4 S 1 ) 3 -TBP 55aa type 5/3 adenovirus comprising the transferrin-binding moiety and linker of SEQ ID NO: 3 in the HVR1 region
  • the virus reacted with albumin or transferrin and the control virus (CA10G: type 5/3 adenovirus) (infectious units, IFU) were treated at 0, 5, 10, 20, 50 and 100 times the cell number, respectively, Adenovirus type 5 antibody (Abcam, ab6982) was treated with the culture medium at a concentration of 0.1 ng/ml.
  • Adenovirus type 5 antibody (Abcam, ab6982) was treated with the culture medium at a concentration of 0.1 ng/ml.
  • Sigma's cell division kit (XTT assay kit) was used to quantitatively evaluate the apoptotic ability by the virus, and to visualize the apoptotic ability by the virus, a 96-well plate was prepared using crystal violet reagent. was stained.
  • Example 3 Construction of a virus containing a transferrin-binding domain at the HVR2 site
  • Adenoviruses HVR2-Tbp 29aa and HVR2-(G4S1)3-Tbp 55aa containing transferrin binding moieties were constructed by inserting the nucleotide sequence encoding the protein into the HVR2 region of Hexon of the adenoviral vector, respectively. did
  • the neutralizing antibody evasion ability of adenovirus HVR2-Tbp 29aa and HVR2-(G4S1)3-Tbp 55aa containing a transferrin-binding moiety in the HVR2 region of hexon of the adenoviral vector constructed in Example 3 above was measured in HVR1-(G 4 S 1 ) 3 -Tbp 55aa.
  • 100 ul of the lung cancer cell line A549 was dispensed in a 96-well plate so that 1 x 10 4 cells per well.
  • CA10GT HVR1-(G4S1)3-Tbp 55aa
  • HVR2-Tbp 29aa type 5/3 adenovirus comprising the transferrin binding moiety of SEQ ID NO: 1 in the HVR2 region
  • HVR2-(G4S1)3-Tbp 55aa Type 5/3 adenovirus comprising the transferrin-binding moiety of SEQ ID NO: 3 and a linker in the HVR2 region

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Abstract

본 발명은 생체 내 면역 체계를 회피할 수 있는 항종양 아데노바이러스에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 본 발명의 트랜스페린 바인딩 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스는 종양 세포 감염 및 사멸 효과가 현저히 증가하였으며, 트랜스페린과의 결합 증가로 인해, 체내 면역 반응을 회피하여 혈장 반감기가 증가하고, 암세포에 특이적으로 전달되어 전신 치료 효과가 있으며, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어나 항-종양 효능이 현저한 효과를 나타내므로, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역 회피성 항종양 아데노바이러스
본 발명은 생체 내 면역 체계를 회피할 수 있는 항종양 아데노바이러스에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로, 혁신적인 암 치료제의 개발은 이에 대한 치료시 발생되는 의료비를 절감할 수 있음과 동시에 고부가가치를 창출할 수 있다. 또한, 2008년의 통계에 따르면, 기존항암제 내성을 극복 할 수 있는 분자 치료제는 주요 7개국 (US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK)에서 $17.5 빌리언(billion)을 차지했고, 2018년의 경우 약 $45 빌리언정도의 시장 크기(market size)를 차지하여, 2008년 대비 9.5%의 성장률을 보일 것이라 예측되고 있다. 암의 치료는 수술, 방사선치료, 화학요법, 생물학적 치료로 구분되는데, 이 중에 화학요법은 화학물질로서 암 세포의 증식을 억제하거나 죽이는 치료법으로 항암제에 의하여 나타나는 독성은 상당부분 정상세포에서도 나타나기 때문에 일정 정도의 독성을 나타내며, 항암제가 효과를 나타내다가도 일정 기간의 사용 후에는 효과가 상실되는 내성이 발생하기 때문에 암세포에 선택적으로 작용하고 내성이 생기지 않는 항암제의 개발이 절실하다. 최근 암에 대한 분자유전정보의 확보를 통해 암의 분자적 특성을 표적으로 한 새로운 항암제의 개발이 진행되고 있으며, 암세포만이 가지고 있는 특징적인 분자적 표적(molecular target)을 겨냥하는 항암제들도 약제 내성이 생긴다는 보고도 있다. 따라서, 새로운 개념의 항암제 개발이 필요하다.
한편, 자연 바이러스 감염 또는 바이러스 예방접종 후의 일시적인 암 차도의 입증되지 않은 보고로 인해, 암 치료를 위해 바이러스를 사용한 실험들이 있다. 최초 보고는 광견병을 위해 백신접종된 환자에서의 자궁경부암의 감소에 기인한 1912년으로, 유사한 결과가 천연두 예방접종 또는 천연 바이러스 감염 예컨대 볼거리 또는 홍역이 뒤따르는 암 환자에게서 나타났다. 이들 보고 및 동물 데이터에 기초한 암 치료를 위해 환자에 생 바이러스를 접종한 것은 1940년대 후반 및 1950년대 초반 경의 일이다. 그러나, 때때로 일시적 종양 감소 이후, 종양이 재성장하고 환자가 사망하는 문제들이 발생했다. 이들 접종은 장기-지속적인 차도가 나타나지 않았다. 1957년에, 생경구 소아마비 백신을 개발한 Albert B. Sabin, M.D.는 종양용해성 바이러스가 종양을 사멸시키는 경우에도 바이러스에 대한 개인의 면역 반응이 너무 빨라 그 효과가 급속하게 소진되는 문제가 가장 큰 것으로 언급하였다.
현 시점에서, 수많은 종양용해성 아데노바이러스가 확인되었으나 현재까지 세상 어디에서도 임상 사용을 위해 승인된 유일한 바이러스는 P53-결핍된 암세포에서 조건적 복제를 가능하게 하는 E1B-55KD 결실에 의해 개질된 Oncorine (H101) 하위그룹 C 아데노바이러스이다 (H101은 1996년에 Bischoff 등에 의해 기재된 ONYX015의 밀접한 유사체임). Oncorine은 두경부암에 대한 종양 내 주사에 의해 투여된다. 아데노바이러스는 유전자 테라피를 위한 유전자 전달 벡터로서 뿐 아니라 암 치료를 위한 종양분해제(oncolytic agent)로서 널리 사용되어 왔다. 아데노바이러스는 이러한 용도에 적합한 몇가지 특징들을 나타낸다. 즉, 아데노바이러스의 구조와 생물학적 특성은 널리 연구되어 있어, 이들의 게놈을 용이하게 변형시킬 수 있으며, 이들 바이러스는 복제성 세포 및 복제불가 세포 모두를 감염시킬 수 있으며, 임상적으로 사용하기에 높은 역가 (titer)로 쉽게 생산될 수 있다. 아데노바이러스는, 안전성 측면에서, 인간에게서 생명을 위협하는 질병을 유발하지 않으며, 그 바이러스 게놈은 삽입 돌연변이가 방지되는 비-삽입형 (non-integrative)이다. 아데노바이러스계 벡터를 이용한 임상 실험들은, 이 바이러스가, 전신 투여의 경우에는 효능 개선의 필요성이 아직 남아있긴 하지만, 양호한 독성 및 안전성 프로파일을 가진 것으로 보고되고 있다.
이와 같이, 유전자 테라피 분야에서, 전신 투여, 즉 정맥내 또는 동맥내 혈류로의 주입은, 다수 장기들과 파종성 세포(disseminated cell)들에 도달하기 위해 필요할 수도 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 및 종양분해성 아데노바이러스를 이용한 암 테라피에서, 진행된 상태이거나 전이성 상태의 파종성 종양들을 치료하기 위해서는 전신 투여가 필수적이다. 그러나, 아데노바이러스는 혈류로의 주입시 테라피 효과를 떨어뜨리는 상당한 한계를 보인다. 아데노바이러스 타입 5 (Ad5)는 혈류에서 바이러스의 생체이용성을 급격하게 떨어뜨리는 여러가지 중화성 상호작용(neutralizing interaction)을 겪게 된다. 주입된 투여량의 >90%가 간, 주로 쿠퍼 세포로 지칭되는 간 대식세포와, 또한 간의 LSEC (liver sinusoidal endothelial cell) 및 간 세포에 체류하기 때문에, 이 테라피의 가장 큰 문제점은 간 격리이다. 혈액 세포 및 단백질과의 직접적인 상호작용 역시 주요한 장애가 된다. Ad5는 CAR 수용체를 통해 적혈구 등의 혈액 세포에 직접 결합하며, 인테그린을 통해 혈소판에 결합할 수 있다. 항체는 바이러스를 직접 중화시킬 뿐만 아니라 보체 활성화 및 단핵세포와 호중구의 Fc 수용체에 바이러스 입자를 도킹(docking)시킴으로써 선천적인 면역 반응을 촉발시킬 수도 있다. 또한, 바이러스 재-투여는 항-Ad 중화 항체(NAb)의 농도를 증가시키며, 따라서, 바이러스 중화도 강화된다. 항체 및 보체에 의한 아데노바이러스의 옵소닌 작용(opsonization) 역시 쿠퍼 세포에 의한 제거(clearance)를 강화할 수 있다. 전체적으로, 이들 상호작용은 마우스 및 인간에서 혈중 Ad의 반감기를 약 수분으로 크게 단축시키는 결과를 발생시킨다. 아데노바이러스의 전신 투여시 항체 및 면역 세포에 의한 중화를 회피하기 위한 상당한 노력들이 행해져왔으나, 아직도 전신 전파에 한계가 있으며, 일시적인 것이면서 대개 비효과적인 것으로 보고되었다 (Ferguson 등 2012).
따라서, 전신 투여에 적합하며 중화 항체를 회피할 수 있는 암 치료제로서의 아데노바이러스에 대한 연구가 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 항종양 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 아데노바이러스의 종양 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 상기 아데노바이러스를 암에 걸린 개체에 투여하는, 암 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항종양 아데노바이러스를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아데노바이러스의 종양 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 아데노바이러스를 암에 걸린 개체에 투여하는, 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 트랜스페린 바인딩 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스는 종양 세포 감염 및 사멸 효과가 현저히 증가하였으며, 트랜스페린과의 결합 증가로 인해, 체내 면역 반응을 회피하여 혈장 반감기가 증가하고, 암세포에 특이적으로 전달되어 전신 치료 효과가 있으며, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어나 항-종양 효능이 현저한 효과를 나타내므로, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 항종양 아데노바이러스의 항체 회피 기작을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 트랜스페린 결합 도메인(모이어티)을 포함하는 항종양 아데노바이러스의 제조 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 트랜스페린 결합 도메인을 헥손의 HVR1 위치에 포함하는 아데노바이러스의 외피 관련 플라스미드 pAd1128의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 4는 알부민 바인딩 도메인(albumin binding domain, ABD)을 포함하는 아데노바이러스의 벡터맵을 나타낸 도이다 (CA10G-A)
도 5는 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 트랜스페린 결합 모이어티 Tbp29aa를 포함하는 아데노바이러스의 벡터맵을 나태낸 도이다 (HVR1-Tbp29aa).
도 6은 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 트랜스페린 결합 모이어티 Tbp 55aa의 N-말단 및 C-말단에 링커를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 아데노바이러스의 벡터맵을 나태낸 도이다 (HVR1-Tbp(G4S1)3 55aa).
도 7 및 도 8은 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 면역회피능을 나타낸 도이다:
CA10G: 대조군 아데노바이러스;
CA10G-A (CA10G-a): 알부민 바인딩 도메인을 포함하는 아데노바이러스;
HVR1-Tbp29aa (Tbp-29aa): 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 트랜스페린 결합 모이어티 Tbp29aa를 포함하는 아데노바이러스; 및
HVR1-Tbp(G4S1)3 55aa (Tbp-(G4S1)3-55aa): 아데노바이러스 벡터의 헥손에 트랜스페린 결합 모이어티 Tbp55aa과 링커를 포함하는 아데노바이러스.
도 9는 트랜스페린 결합 모이어티의 아데노바이러스로의 삽입 위치에 따른 면역 회피능을 나타낸 도이다:
CA10G: 대조군 아데노바이러스;
CA10GT: 트랜스페린 결합 모이어티가 헥손의 HVR1 위치에 삽입된 HVR1-(G4S1)3-Tbp 55aa 아데노바이러스;
HVR2 29aa: 트랜스페린 결합 모이어티가 헥손의 HVR2 위치에 삽입된 HVR2-Tbp 29aa 아데노바이러스; 및
HVR2 L3 55aa: HVR2-(G4S1)3-Tbp 55aa 아데노 바이러스.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 방향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
일 측면에서, 본 발명은 트랜스페린(transferrin) 결합 모이어티(moiety)를 코딩하는 핵산을 헥손(hexon) 단백질의 과가변부(HVR)의 코딩 영역에 포함하는, 아데노바이러스에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 서열번호 1 또는 3의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 헥손의 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 헥손의 핵산 서열은 서열번호 8의 염기서열 또는 서열번호 10의 염기서열을 포함할 수 있고, 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 헥손은 서열번호 9 또는 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 아데노바이러스의 헥손 단백질의 과가변부는 HVR1일 수 있으며, 상기 HVR1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HVR1을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산을 아데노바이러스의 헥손을 코딩하는 염기서열 (서열번호 6)의 154번째 아미노산과 155번째 아미노산을 발현하는 코돈의 사이에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 트랜스페린 결합 모이어티는 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1 또는 3의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 트랜스페린 결합 모이어티의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단이 링커를 통해 헥손 단백질과 연결될 수 있으며, 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 트랜스페린 결합 모이어티는 헥손 단백질에 직접 부착될 수 있으며, 즉, 트랜스페린-결합 모이어티의 N-말단 및 C-말단이 헥손 단백질에 직접 연결된다. 그러나, 트랜스페린-결합 모이어티는 링커 서열을 통한 헥손 단백질과의 연결도 가능하다. 따라서, 다른 구현예에서, 트랜스페린-결합 모이어티의 N-말단 및/또는 C-말단은 링커 서열을 통해 헥손 단백질과 연결된다.
일 구현예에서, 아데노바이러스의 헥손 단백질이 캡시드로 조립될 때, 트랜스페린 결합 모이어티가 헥손 단백질의 외표면 상에 위치할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스는 헥손 단백질의 외표면 상에 트랜스페린 결합 모이어티를 포함함으로써 트랜스페린 결합 도메인으로 피복될 수 있어, 자신을 혈류에 존재하는 중화 항체로부터 보호할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스일 수 있으며, 인간 아데노바이러스 혈청형 1 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 인간 아데노바이러스 혈청형 5 (GenBank: AY339865.1)일 수 있으며, 인간 아데노바이러스 혈청형 5/3의 키메라 아데노바이러스일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 아데노바이러스의 내재적 유전자와 작동 가능하게 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 프로모터는 E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, alpha-페토프로테인 프로모터 및 COX-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 텔로머라제 hTERT 프로모터는 서열번호 17의 염기서열을 포함할 수 있으며, 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스의 내재적 유전자는 5'-ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3-'ITR의 구조를 가지며; 상기 C1은 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고; 상기 C2는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며; 상기 C3는 E3가 포함하지 않거나 E3를 포함하고; 상기 C4는 L5를 포함하며; 및 상기 C5는 E4를 포함하지 않거나 E4를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열이 추가로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 E1A는 서열번호 18의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 E1B는 서열번호 19의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 IRES는 서열번호 20의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 프로모터가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 hTERT 프로모터-E1A-IRES-EIB를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 외래 유전자를 발현하는 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있으며, 발현 카세트를 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 CMV 프로모터 및 외래유전자를 추가로 포함할 수 있으며 CMV 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 외래유전자를 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스 (oncolytic adenovirus)인 항종양 아데노바이러스일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 야생형 아데노바이러스에 비해 종양살상능이 높을 수 있으며, 종양분해성 아데노바이러스일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 복제가능 아데노바이러스, 항종양 또는 종양분해성 아데노바이러스이다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스는 복제불가 아데노바이러스 또는 복제-결핍 아데노바이러스이다. 복제-결핍 아데노바이러스 또는 복제불가 아데노바이러스는, 세포 안에서 치료 유전자를 발현하고 세포는 분해시키지 않는 것을 목적으로 하기 때문에, 표겟 세포로의 유전자 캐리어로서 유전자 테라피에서 사용되는, 표적 세포에서 복제할 수 없는 아데노바이러스이다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 아데노바이러스의 감염성을 높이거나 또는 이를 종양 세포에 존재하는 수용체로 표적화하기 위한 캡시드 변형을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 캡시드의 변형은 아데노바이러스 섬유 단백질의 H1 루프내 RGD 모티프를 삽입하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 캡시드의 변형은 섬유 유전자 또는 이의 일부를 다른 혈청형의 아데노바이러스로부터 유래된 상동적인 부분으로 치환하여 키메라 아데노바이러스를 형성하는 것일 수 있으며, 혈청형 3형 아데노바이러스 유래 섬유 유전자 또는 이의 일부로 치환한 캡시드를 포함하고 섬유 유전자를 제외한 부분은 혈청형 5형 아데노바이러스 유래 유전자를 포함하도록 제작될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 하나 이상의 비-아데노바이러스성 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 비-아데노바이러스성 유전자는 암 유전자 치료에 사용되는 유전자일 수 있고, 암 유전자 치료에 사용되는 유전자는 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스는 생체내에서 소정의 조직에 선택적으로 분산될 수 있어, 비-표적 또는 비-종양 조직에서의 발현을 회피하거나 또는 현저하게 줄일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 암 유전자 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "트랜스페린"은 철에 매우 강하게, 그리고 가역적으로 결합하는 당단백질이다. 체내에 존재한 철의 약 0.1% 정도만 트랜스페린에 결합되어 있지만, 체내 철분 양 을 조절하는데, 매우 중요한 역할을 한다.트랜스페린은 혈중에 존재하고, 철을 흡수하는 역활을 담당한다. 본 발명에서는 혈중 트랜스페린이 본 발명의 트랜스페린 결합 모이어티에 결합하여, 아데노바이러스가 생체 내 항체를 회피할 수 있게하여 아데노바이러스의 전신투여시 혈중 반감기를 높일 수 있는 역활을 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "트랜스페린 결합 모이어티"는, 트랜스페린에 결합할 수 있는, 즉, 결합 친화성을 가진 임의의 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 혈청 트랜스페린, 더 바람직하게는 인간 혈청 트랜스페린에 결합할 수 있다. 용어 "트랜스페린-결합 모이어티"로는, 천연 트랜스페린-결합 도메인 (예, 박테리아 단백질에 존재하는 트랜스페린) 및 합성 펩타이드 유래 트랜스페린-결합 서열이 있다. 바람직한 구현예에서, 트랜스페린-결합 모이어티는 Neisseria Meningitidis 유래의 트랜스페린 결합 도메인, 이들의 기능적 등가 변이체로부터 선택된다. 용어 "트랜스페린 결합 도메인"은 중화 항체로부터의 보호를 보장하기 위해 충분한 특이성으로 트랜스페린에 결합할 수 있는 천연 단백질로부터 유래되는 임의 영역을 지칭하는데, 본 발명에서는 트랜스페린 결합 모이어티와 동일한 언어로 사용될 수 있다. 본 발명에서는 트랜스페린 결합/바인딩 모이어티, 트랜스페린 결합 도메인 및 트랜스페린 결합 펩타이드/단백질/프로테인을 혼용하여 사용하고 있으나, 트랜스페린 결합/바인딩 모이어티는 트랜스페린 결합 도메인 및 트랜스페린 결합 펩타이드/단백질/프로테인을 모두 포함하며, 더욱 바람직하게는 트랜스페린 결합/바인딩 모이어티는 트랜스페린 결합/바인딩 펩타이드/단백질/프로테인의 트랜스페린 결합 도메인의 일부 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩타이드를 지칭할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 트랜스페린 결합 모이어티의 기능적인 등가 변이체를 포함한다. 본원에서, 용어 "기능적으로 등가 변이체"는 하나 이상의 잔기의 삽입, 결손 또는 치환에 의해 트랜스페린 결합 모이어티로부터 파생되며, 상기와 같이 결정된 바와 같이 트랜스페린과 상호작용하는 능력을 실질적으로 유지하는, 임의의 폴펩트를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드가, 서열번호 2 또는 4의 트랜스페린 결합 도메인의 트랜스페린 결합력의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 트랜스페린 결합력을 보인다면, 이 폴리펩타이드는 트랜스페린 결합 모이어티의 기능적인 등가 변이체로 간주된다. 바람직하게는, 폴리펩타이드가, 서열번호 2 또는 4의 트랜스페린 결합 도메인과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 효율로 항체를 중화할 수 있다면, 이 폴리펩타이드는 트랜스페린 결합 모이어티의 기능적인 등가 변이체로 간주된다.2가지 폴리펩타이드 간의 동일성 수준은 통상의 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 이용해 결정된다. 2개의 아미노산 서열 간의 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘 [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]을 이용해 결정되지만, 다른 유사한 알고리즘도 사용될 수 있다. BLAST 및 BLAST 2.0을 본원에 언급된 파라미터를 적용해 이용하여, 서열 동일성 %를 결정한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다.
본 발명에서는 트랜스페린 결합 모이어티의 종류는 본 발명의 실시예에 기재된 모이어티 외에 다양한 펩타이드, 항체등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 트랜스페린 결합 모이어티는 US5912336, US7582730, US6437096, US6090576, US7258989, US6004562, US6391316, US10149900, US6610506, US20030186848A1, US20200030428A1, US20080206260A1, US6015688 및 US20040258695A1에 기재된 다양한 박테리아 유래 트랜스페린 결합 펩타이드(transferrin binding protein) (Tbp1, Tbp2, TbpA, TbpB 등), 철-조절 단백질(Iron-regulated proteins), 철-조절 외막 단백질(Iron-regulated outer membrane proteins), 트랜스페린 수용체 단백질(transferrin receptor proteins), Moraxella catarrhalis의 외막 단백질 B1, 트랜스페린 결합 펩타이드를 포함하는 키메라 융합 단백질, 재조합 트랜스페린 결합 펩타이드, 상기 펩타이드 또는 단백질의 단편 또는 이의 유사체, 트랜스페린 결합 분자, 또는 항-트랜스페린 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편들을 포함하며, 아데노바이러스에 결합된 트렌스페린 결합 모이어티가 혈액 내 트랜스페린과 결합하여 체내 면역 반응을 회피할 수 있는 모이어티라면 본 발명에 적용이 가능하다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "링커 서열"은 헥손 단백질과 트랜스페린 결합 모이어티 사이에 힌지부로서 작용하여 2개의 인자 사이에 스페이스를 제공하여, 헥손 단백질의 2차 구조가 트랜스페린 결합 모이어티의 존재에 영향을 받지 않으며 그 반대도 가능한, 아미노산 서열을 지칭한다. 링커 서열은, 개개 인자들의 3차 구조 형태를 유지하면서 2개의 인자가 서로 독립적으로 움직일 수 있는 임의의 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 길이 31개 미만인 유연한 링커 펩타이드이다. 더 바람직하게는, 링커 서열은 아미노산을 10개 미만으로, 5개 미만, 4개 미만 또는 2개 미만으로 포함한다. 일 구현예에서, 링커 서열은 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 2개 이상 포함한다. 다른 구현예에서, 링커는 폴리글리신 링커이다. 링커 서열의 경우, 본 발명에서는 서열번호 5로 표시될 수 있다. 이외 링커도 대안적으로 사용될 수 있다 (Reddy Chichili, VP., Kumar, V., and Sivaraman, J. (2013). Linkers in the structural biology of protein-protein interactions. Protein Science 22(2):153-67).
본 발명에 있어서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 유전자 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 유전자 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서, 용어, "프로모터"란, RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 다운스트림 (downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 발현 카세트에 있어서, 상기 프로모터는 shRNA의 발현을 개시할 수 있는 어떤 프로모터도 가능하다. 구체적으로, 본 발명의 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터 (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), CaMV 35S 프로모터 (Odell et al.,Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터 (미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴 (rice actin) 프로모터 (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터 (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터 등 당업자에게 자명한 공지의 모든 프로모터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 U6 프로모터, HI 프로모터, CMV 프로모터일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면 CMV 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "조직-특이"는, 복제에 필수적인 유전자가 작동가능하게 연결된 프로모터가 조직 특이적으로 기능하여 조직에서 복제를 진행한다는 의미로 의도된다. 이는 프로모터를 활성화하는 파지티브 전사 인자가 그 조직에 존재하고 비-표적 조직에는 존재하지 않음으로써, 발생할 수 있다. 또한, 이는 비-표적 조직에서 정상적으로 형성되어 프로모터의 결과로서 전사를 방지하는, 전사 저해 인자의 부재로 인해 발생할 수 있다. 따라서, 전사가 이루어질 때, 표적 조직에서 벡터의 복제 및 이의 수반 기능이 이루어지도록, 복제에 필수적인 유전자 쪽으로 향하게 된다.
조직 특이성은 특히 조직의 정상적인 대응체 (counterpart)는 회피하면서 특정 조직의 비정상적인 대응체를 표적화하거나, 또는 비정상 조직을 치료하면서 비정상 조직 이외의 다른 타입의 주변 조직을 회피하는 것과 관련 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 "종양-특이적"이며, 이는 프로모터가 종양 조직에서 특이적으로 기능한다는 의미이다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 간으로의 전이를 치료하는데 유용하다. 구체적인 일 예는 간으로 종종 전이되는 대장암이다. 대장암이 간으로 전이되는 경우, CEA 프로모터는 전이 세포에서는 활성이지만, 정상적인 간 세포에서는 그렇지 않은 것으로 확인된 바 있다. 그에 따라, 정상적인 인간 성체의 간은 대장암 CEA-특이적 프로모터에 연결된 복제에 필수적인 바이러스 유전자를 가진 바이러스의 복제를 지원하지 못할 것이다. 복제는 원발성 암 세포에서 이루어져야 한다. 다른 예는 간세포암에서만 활성을 가지는 알파페토프로테인 프로모터이다. 다른 예는 흑색종에서만 활성을 나타내고 정상 피부에서는 활성을 나타내지 않는 티로시나제 프로모터이다. 각 경우에, 복제는 비정상 세포에서는 예상되며, 정상에서는 그렇지 않다.
조직-특이적 프로모터의 예로는, 비제한적으로, 알파페토프로테인 프로모터, DE3 프로모터, 티로시나제 프로모터, 암태아성 항원 (CEA) 프로모터, 계면활성제 단백질 프로모터, E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, COX-2 프로모터, 알부민 유전자 프로모터, 간염 바이러스의 코어 프로모터, 티록신 및 ErbB2 프로모터에 결합하는 글로불린-결합 단백질의 프로모터가 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "아데노바이러스"는 아데노바이러스로 분류될 수 있는 임의의 바이러스, 즉 이중 가닥 DNA 게놈을 함유한 정20면체 뉴클레오캡시드를 가진 비-외막형 바이러스로 특정되는 아데노비리대 (Adenoviridae) 과에 속하는 임의의 바이러스를 지칭한다. 이 용어는, 표적 세포를 감염시키기 위한 수용체로서 CAR을 이용하는 모든 그룹, 서브그룹 및 혈청형을 비롯해, 인간 또는 동물을 감염시킬 수 있는 임의의 아데노바이러스를 포함한다. 본 발명의 아데노바이러스는, 비제한적인 예로, 조류, 개, 말, 소, 양, 돼지, 인간 또는 개구리 아데노바이러스를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스, 즉, 인간을 감염시킬 수 있는 아데노바이러스이다. 본 발명에 따르면, "혈청형"은 아데노바이러스의 면역학적으로 서로 다른 각각의 타입이다. 인간 아데노바이러스의 경우 몇가지 서브그룹 (A에서 G)으로 분류되는 혈청형은 적어도 57종이다.
본 발명의 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스이다. 본 발명에 있어서, 용어, "재조합"은 천연적으로는 생성되지 않는 아데노바이러스를 지칭한다. 이러한 재조합 아데노바이러스는 아생형과 비교해 하나 이상의 변형을 포함한다. 이러한 변형으로는, 비제한적으로, 감염성 바이러스를 만들기 위해 입자 안에 패킹되는 아데노바이러스 게놈에 대한 변형을 포함한다. 그외 변형들로, 복제에 중요한 유전자를 바이러스 게놈에서 제거함으로써 복제-결핍 바이러스 (즉, 재생산할 수 없는 바이러스)를 수득할 수 있다. 변형의 예로는, E1a, E1b, E2a, E2b, E3 또는 E4 코딩 영역들 중 하나 이상의 결손 등의 통상의 기술 분야에 공지된 결손을 포함한다. 그외 변형으로는 아데노바이러스 게놈의 코딩 영역 전체의 결손을 포함한다. 이런 아데노바이러스를 "gutless" 아데노바이러스라고 한다. 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 인자들을 조합하여 제조된 키메라 아데노바이러스도 포함된다. 아데노바이러스 입자는 바이러스 DNA를 봉입하는 캡시드로 구성된다. 본원에서, 용어 "캡시드는 5각형 또는 6각형일 수 있는 캡소머로 지칭되는 서브유닛들에 의해 형성된 바이러스 단백질 셸이다. 아데노바이러스 캡시드는 20개의 등변 삼각면을 가진 정 20면체 형태를 취한다. 캡시드 대부분은 헥손 단백질에 의해 형성되고, 각 꼭지점은 펜톤 베이스와 섬유 단백질로 형성된 복합체이다.
본 발명의 아데노바이러스는 세포에 선택적인 복제를 부여하는 변형을 게놈 서열에 가질 수 있다. 아데노바이러스의 발현이 필요한 조직 또는 치료할 종양 조직에 아데노바이러스의 발현을 인가하기 위해, 본 발명의 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 일구현예에서, 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 더 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어, "재조합"은 또한 특정 타입의 세포 또는 조직에서 선호적으로 복제하지만, 다른 타입들에서도 약간 복제하거나 또는 전혀 복제하지 않는, 복제-조건부 (replication-conditional) 아데노바이러스를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 제시된 아데노바이러스들 중, 고형 종양 및 그외 신생물 등과 같이 비정상적으로 증식하는 조직에서 복제하는 아데노바이러스이다. 이러한 것으로는 미국 특허 5,998,205 및 미국 특허 5,801,029에 언급된 바이러스를 포함한다. 이러한 바이러스는 때때로 "세포용해성" 또는 "세포변성 (cytopathic)" 바이러스 (또는 벡터)라 지칭되며, 이것이 신생물 세포에 그러한 효과를 가지는 경우 "종양분해성" 바이러스 (또는 벡터)라 한다.
본 발명에 있어서, 용어, "아데노바이러스 헥손 단백질" 또는 "헥손 단백질 "(종래에는 "단백질 II"로 지칭됨)은, 자가-조립하여, 각각이 6각형 형상인 트리머를 형성하는, 아데노바이러스에서 발견되는 캡시드 주요 구조 단백질을 지칭하다. 240개의 헥손 트리머가 조립하여, 아데노바이러스 캡시드가 된다. 헥손 단백질은 바이러스 캡시드 조립, 캡시드의 20면체 대칭 결정 및 캡시드의 완전성에 필수적이다. 헥손 단백질의 주요한 구조적 특징들은 아데노바이러스 혈청형들 간에 공통되지만, 헥손 단백질의 크기와 면역학적 특성은 혈청형들 간에 차이가 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "헥손 단백질"은 비제한적인 예로, 인간 아데노바이러스 C 혈청형 5의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P04133의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 인간 아데노바이러스 C 혈청형 2의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P03277의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 조류 아데노바이러스 gal1 (strain Phelps)의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P42671의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 및 인간 아데노바이러스 F 혈청형 40의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P11819의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질 등의, 임의의 아데노바이러스의 헥손 단백질을 포괄한다. 이 표현은 다른 서브그룹 또는 혈청형에서 천연적으로 발생하는 헥손 단백질의 모든 천연 변이체들을 포괄한다.
본 발명에서, "헥손 단백질의 외표면"이라는 표현은, 헥손 단백질의 캡시드의 표면 상에 노출되는 영역을 지칭한다. 본 발명의 트랜스페린 결합 모이어티가 아데노바이러스 헥손 단백질의 내부 파트 또는 외표면으로 도입되었는지를 확인하기 위해서는, 인간 혈청 트랜스페린과의 결합성을 검출하는 분석을 본 특허 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같이 (예, ELISA 분석) 또는 시험관내 중화 분석으로 수행할 수 있다. 인간 혈청 트랜스페린이 아데노바이러스에 결합할 수 있다면, 트랜스페린 결합 모이어티는 아데노바이러스 헥손 단백질의 외표면에 도입된 것이다.
헥손 단백질의 Loop 1 (L1) 및 Loop 2 (L2)는 바이러스 캡소미어 구조의 외면 상에 노출되는 것으로 보고되어 있다. L1은 과가변부 (HVR) 6개, 즉 HVR1에서 HVR6를 포함하며, L2는 7번째 과가변부 (HVR7)를 포함한다. 본원에서, "과가변부" 또는 "HVR"이라는 용어는, 표면 노출된 루프들에서 아데노바이러스의 혈청형을 결정하는 길이 및 서열 간에 차이가 있는 영역을 지칭한다. 트리머의 각각 서브유닛에는 아데노바이러스 헥손의 과가변부 7개가 존재한다. 본 발명에서, HVR에 사용되는 명칭은 Crawford-Miksza 및 Schnurr (Crawford-Miksza and Schnurr. 1996. Virology, 224(2):357-367)에 언급된 바와 같다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, HVR은 HVR1이나 이에 제한되지 않는다. 트랜스페 결합 모이어티를 코딩하는 서열은, 제조되는 융합 단백질이, 인간 아데노바이러스 혈청형 5 유래 헥손 단백질에 해당되는 2008년 6월 14일자 GenBank 수탁 번호 BAG48782.1의 헥손 단백질의 넘버링에 따라, 헥손 단백질의 D154 아미노산 다음에 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하도록, 삽입된다.
본 발명에서 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스이며, 바람직하게는 아데노바이러스 게놈이 종양에서의 선택적인 복제를 달성하기 위해 E1a, E1b, E4 및 VA-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 더 포함하는, 아데노바이러스이다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은, 아데노바이러스 감염성을 높이거나 또는 이를 종양 세포에 존재하는 수용체로 표적화하기 위해 캡시드 변형을 더 포함한다. 바람직하게는, 캡시드의 변형은 아데노바이러스 섬유단백질의 H1 루프에 RGD 모티프를 삽입하는 것이다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은, 다른 혈청형 유래 게놈의 상동적인 영역으로 치환된 게놈의 단편 또는 영역을 포함하는, 하나의 소정의 혈청형으로부터 유래되는 키메라 아데노바이러스 게놈이다. 바람직하게는, 이러한 키메라 아데노바이러스는, 다른 혈청형, 바람직하게는 인간 아데노바이러스 3 또는 인간 아데노바이러스 35로부터 유래되는 상동적인 영역으로 치환된 섬유 유전자의 일부를 포함하는, 혈청형 5로부터 파생되는 인간 아데노바이러스이다. 바람직한 구현예에서, 캡시드의 변형은, 섬유 유전자의 일부를 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 상동적인 부분으로 치환하여, 키메라 아데노바이러스를 형성하는 것이다. 본 발명에서 5/3형 아데노바이러스는 3형 아데노바이러스 유래의 섬유 유전자 일부를 포함하고, 이외 다른 게놈은 5형 아데노바이러스 유래의 바이러스를 의미한다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은 그 게놈에 삽입되는 추가의 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 유전자는 유전자 테라피 또는 백신면역화에 사용된다. 바람직하게는, 상기 유전자는 암 유전자 테라피에 사용되는 유전자이며, 더 바람직하게는 적어도 프로드럭-활성화 유전자, 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스이다. 본원에서, 용어 "종양분해성 아데노바이러스"는, 심지어 선택성 없이, 종양에서 복제-가능 (replication competent)하거나 또는 복제할 수 있는 임의의 아데노바이러스를 지칭한다. 종양분해성 아데노바이러스의 치료작용은 복제하여 소거할 종양 세포를 세포 분해하는 능력에 기초한다. 종양 세포의 사멸은 생존 세포의 수 측정, 세포변성 효과, 종양 세포의 세포자살, 종양 세포에서의 (예, 대사 표지, 바이러스 단백질의 웨스턴 블롯 또는 복제에 필요한 바이러스 유전자의 역 전사를 이용한 PCR) 바이러스 단백질 합성 또는 종양 크기 축소등의, 임의의 최신 방법에 의해 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전신으로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정맥 투여용일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁솔 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 시스플라틴, 파클리탁셀, 5-FU(5-fluorouracil), 메토트렉세이트, 독소루비신, 다우노루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 빈데신, 마이토마이신, 블레오마이신, 타목시펜 및 탁솔이고, 더욱 바람직하게는, 시스플라틴, 파클리탁셀 또는 5-FU(5-fluorouracil)이나, 본 발명의 조성물과 병용 처리하여 항암 효과에 시너지 효과를 나타낼 수 있는 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 정맥 투여되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 단일 도메인 항체 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 조성물은 암 및 이의 합병증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 항암보조제로도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료적 유효량 또는 약학으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산을 헥손 단백질의 과가변부(HVR)의 코딩 영역에 포함하는 아데노바이러스의 종양 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산을 헥손 단백질의 과가변부(HVR)의 코딩 영역에 포함하는 아데노바이러스를 암에 걸린 개체에 투여하는, 암 치료 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 항암(항종양) 바이러스 제작
Neisseria Meningitidis strain K454, S3131 및 B16B6 유래 트랜스페린 결합 단백질(Transferrin binding protein, TBP)의 트랜스페린 결합 도메인(Transferrin binding domain, TBD)로부터 두 종류의 트랜스페린 결합 모이어티 Tbp29aa (서열번호 2) 및 Tbp55aa (서열번호 4)를 각각 코딩하는 염기서열 (서열번호 1 및 서열번호 3)을 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)의 HVR1 영역 내에 삽입하여 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 항종양 아데노바이러스를 제작하였다. 구체적으로, Neisseria Meningitidis strain K454, S3131 및 B16B6의 TbpA의 아미노산들을 참고하여 트랜스페린 결합 도메인에서 2종류의 트랜스페린 결합 모이어티 Tbp29aa (서열번호 2) 및 Tbp55aa (서열번호 4)를 설계한 뒤, Tbp29aa를 코딩하는 염기서열 (서열번호 1), 및 Tbp55aa (서열번호 4)의 N-말단 및 C-말단에 링커 (서열번호 5)를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 Bio Basic Inc.에 합성 의뢰하였다. 합성 후, 각각 PCR 방법으로 타겟 서열을 증폭한 다음 pAd1128 (OD260, adenoviral plasmid) 플라스미드의 헥손(Hexon)을 코딩하는 염기서열 (서열번호 14)의 HVR1 위치 (헥손을 코딩하는 염기서열의 154번째 아미노산 (gaa, E)과 155번째 아미노산 (gac, D)을 발현하는 코돈의 사이)에 각각 삽입하여 E.Coli DH10B에 형질전환하였다. 이 후, 콜로니 PCR을 통해 각 트랜스페린 결합 모이어티의 삽입이 확인된 클론을 미니프렙(mini prep)한 후, macrogen에 서열분석을 의뢰하여 염기서열을 재차 확인하였다. 이 후, 아데노바이러스를 생산하기 위한 재료로 쓰일 아데노바이러스 게놈(comid)를 제작하기 위하여, 상기 pAd1128-tbp (각 트랜스페린 결합 모이어티 코딩 서열 포함), pAd1127 (E 및 PIX 부위 포함), pAd1129 (E3 및, Fiber 포함)-GFP 및 pAd1130 (E4 포함)의 네가지 플라스미드를 제한효소 (Sfil)로 처리한 후, 라이게이션하여 코스미드를 제조하였다 (도 2). 이 후, 코스미드를 람다파지에 패키징한 후, E.coli (OD101)에 감염시켜 형질도입하였다. 몇 개의 클론을 액체배양하여 미니프렙 후, 제한효소를 처리하여 DNA 단편의 크기를 예상되는 패턴과 비교하여 예상 패턴과 같은 클론을 취하였다. 이 후, 확인된 클론을 미니프렙하고, 복제원점, 항생제 내성 유전자등을 제거하기 위해 제한효소를 처리하여 선형 아데노바이러스 게놈을 만든 후, 7ug을 HE293 세포주에 형질도입하여 씨드 바이러스(seed virus)를 제조하여, 이를 이 후 실험에 사용하였다. 상기 씨드 바이러스 외피의 벡터 모식도는 도 3에 나타내었으며, 상기 트랜스페린 결합 모이어티 Tbp29aa를 포함하는 아데노바이러스의 벡터 구조를 도 5 (서열번호 8을 포함하는 아데노바이러스; HVR1-TBP 29aa), 및 N-말단 및 C-말단에 링커를 포함하는 Tbp55aa를 포함하는 아데노바이러스의 벡터 구조를 도 6 (서열번호 10을 포함하는 아데노바이러스; HVR1-(G4S1)3-TBP 55aa)에 나타내었다. 아울러, 양성 대조군으로 사용할 알부민 바인딩 도메인(ABD)을 HVR1 영역에 포함하는 5/3형 아데노바이러스 CA10G-A (서열번호 12의 서열을 포함하는 아데노바이러스)의 벡터 구조를 도 4에 나타내었다.
실시예 2. 항종양 바이러스의 중화 항체 회피능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 트랜스페린 바인딩 도메인을 포함하는 아데노바이러스가 생체 내에서 트랜스페린과 결합함으로써 항체 공격을 피해 암세포를 사멸시키는지 확인하였다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 폐암 세포주 A549를 웰당 1 x 104 cells이 되도록 100ul 씩 분주하였다. 양성 대조군인 CA10G-A (알부민 바인딩 모이어티를 HVR1 영역에 포함하는 5/3형 아데노바이러스: 서열번호 12의 서열을 포함하는 아데노바이러스)는 항체 회피를 위하여 세포 처리전 알부민 10mg/ml을 포함하는 배양액에서 4시간 동안 4℃에서 결합반응을 시키고, 본 발명의 HVR1-TBP 29aa (HVR1 영역에 서열번호 1의 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 5/3형 아데노바이러스) 및 HVR1-(G4S1)3-TBP 55aa (HVR1 영역에 서열번호 3의 트랜스페린 결합 모이어티 및 링커를 포함하는 5/3형 아데노바이러스)의 경우, 세포 처리전에 트랜스페린 1mg/ml을 포함하는 배양액에서 4시간 동안 4℃에서 결합반응시켰다. 이 후, 알부민 또는 트랜스페린과 반응시킨 바이러스와 대조군 바이러스 (CA10G: 5/3형 아데노바이러스) (infectious units, IFU)를 세포수 대비 0, 5, 10, 20, 50 및 100배 로 각각 처리하였으며, 아데노바이러스 타입 5 항체 (Abcam, ab6982)를 0.1ng/ml의 농도로 배양액에 처리하였다. 바이러스 처리 72시간 후에 시그마사의 세포 분열키트(XTT assay kit)를 사용하여 바이러스에 의한 세포사멸능을 정량 평가하고, 바이러스의 의한 세포사멸능을 시각화하기 위하여, 크리스탈바이올렛 시약을 사용하여 96-웰 플레이트를 염색하였다.
그 결과, 50 MOI(Multiplicity of infection)에서 HVR1-Tbp(G4S1)3 55aa (Tbp-(G4S1)3-55aa) 바이러스가 양성 대조군인 CA10G-A보다 항체 회피능이 우수한 것을 확인하였다 (도 7 및 도 8).
실시예 3. 트랜스페린 결합 도메인을 HVR2 위치에 포함하는 바이러스 제작
상기 실시예 1의 방법으로 Tbp29aa (서열번호 2)을 코딩하는 염기서열 (서열번호 1), 및 Tbp55aa (서열번호 4)의 N-말단 및 C-말단에 링커 (서열번호 5)를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 각각 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)의 HVR2 영역 내에 삽입하여 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 아데노바이러스들 (HVR2-Tbp 29aa 및 HVR2-(G4S1)3-Tbp 55aa)을 제작하였다.
실시예 4. 트랜스페린 결합 도메인을 HVR2 위치에 포함하는 항종양 바이러스의 중화 항체 회피능 확인
상기 실시예 3에서 제작한 아데노바이러스 벡터의 헥손의 HVR2 영역에 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 아데노바이러스 HVR2-Tbp 29aa 및 HVR2-(G4S1)3-Tbp 55aa의 중화 항체 회피능을 HVR1-(G4S1)3-Tbp 55aa와 비교하였다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 폐암 세포주 A549를 웰당 1 x 104 cells이 되도록 100ul 씩 분주하였다. CA10GT (HVR1-(G4S1)3-Tbp 55aa), HVR2-Tbp 29aa (HVR2 영역에 서열번호 1의 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 5/3형 아데노바이러스) 및 HVR2-(G4S1)3-Tbp 55aa (HVR2 영역에 서열번호 3의 트랜스페린 결합 모이어티 및 링커를 포함하는 5/3형 아데노바이러스)를 트랜스페린 2mg/ml을 포함하는 배양액에서 6시간 동안 4℃에서 결합반응시키고, 상기 분주된 세포에 세포수 대비 0, 5, 10, 20, 50 및 100배로 각각 처리한 뒤 (CA10G: 3.38x1010ifu/ml; CA10GT: 8.03x109ifu/ml; HVR2-29aa: 6.94x1010ifu/ml; 및 HVR2-(G4S1)3-55aa: 1.29x1010ifu/ml), 아데노바이러스 타입 5 항체 (Abcam, ab6982)를 0.1ng/ml의 농도로 처리하였다. 바이러스 처리 72시간 후에 시그마사의 세포 분열키트(XTT assay kit)를 사용하여 바이러스에 의한 세포사멸능을 정량 평가하였다.
그 결과, 트랜스페린 결합 모이어티가 아데노바이러스 벡터의 헥손의 HVR1 영역 내에 삽입된 CA10GT만이 생체 내에서 트랜스페린과 결합함으로써 항체 공격을 피해 암세포를 사멸시키는 것으로 나타났으며, 트랜스페린 결합 모이어티가 아데노바이러스 벡터의 헥손의 HVR2 영역 내에 삽입된 바이러스들은 항체 회피능이 거의 없는 것으로 나타났다 (도 9).

Claims (34)

  1. 트랜스페린(transferrin) 결합 모이어티(moiety)를 코딩하는 핵산을 헥손(hexon) 단백질의 과가변부(HVR)의 코딩 영역에 포함하는, 아데노바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 1, 3, 8 또는 10의 핵산 서열을 포함하는, 아데노바이러스.
  3. 제 1항에 있어서, 트랜스페린 결합 모이어티는 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는, 아데노바이러스.
  4. 제 1항에 있어서, 트랜스페린 결합 모이어티의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단이 링커를 통해 헥손 단백질과 연결되는, 아데노바이러스.
  5. 제 4항에 있어서, 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 아데노바이러스.
  6. 제 1항에 있어서, 헥손 단백질의 과가변부는 HVR1인, 아데노바이러스.
  7. 제 6항에 있어서, 헥손 단백질의 HVR1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 아데노바이러스.
  8. 제 1항에 있어서, 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산을 헥손을 코딩하는 염기서열의 154번째 아미노산과 155번째 아미노산을 발현하는 코돈의 사이에 포함하는, 아데노바이러스.
  9. 제 1항에 있어서, 헥손 단백질이 아데노바이러스의 캡시드로 조립될 때, 트랜스페린 결합 모이어티가 헥손 단백질의 외표면 상에 위치하게 되는, 아데노바이러스.
  10. 제 1항에 있어서, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스인, 아데노바이러스.
  11. 제 10항에 있어서, 인간 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 1 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아데노바이러스.
  12. 제 10항에 있어서, 인간 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5인, 아데노바이러스.
  13. 제 10항에 있어서, 인간 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5/3인, 아데노바이러스.
  14. 제 1항에 있어서, 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 추가로 포함하는, 아데노바이러스.
  15. 제 14항에 있어서, 프로모터는 아데노바이러스의 내재적 유전자와 작동 가능하게 연결된, 아데노바이러스.
  16. 제 14항에 있어서, 프로모터는 E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, alpha-페토프로테인 프로모터 및 COX-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아데노바이러스.
  17. 제 15항에 있어서, 아데노바이러스의 내재적 유전자는 5'-ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3-'ITR의 구조를 가지며;
    상기 C1은 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;
    상기 C2는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며;
    상기 C3는 E3가 포함하지 않거나 E3를 포함하고;
    상기 C4는 L5를 포함하며; 및
    상기 C5는 E4를 포함하지 않거나 E4를 포함하는, 아데노바이러스.
  18. 제 17항에 있어서, E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열이 추가로 포함된, 아데노바이러스.
  19. 제 17항에 있어서, 프로모터가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결된, 아데노바이러스.
  20. 제 1항에 있어서, 외래 유전자를 발현하는 발현 카세트를 추가로 포함하는, 아데노바이러스.
  21. 제 20항에 있어서, 발현 카세트를 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함하는, 아데노바이러스.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 항종양 아데노바이러스인, 아데노바이러스.
  23. 제 1항에 있어서, 종양분해성 아데노바이러스 (oncolytic adenovirus)인, 아데노바이러스.
  24. 제 1항에 있어서, 아데노바이러스의 감염성을 높이거나 또는 이를 종양 세포에 존재하는 수용체로 표적화하기 위한 캡시드 변형을 추가로 포함하는, 아데노바이러스.
  25. 제 24항에 있어서, 캡시드의 변형은 아데노바이러스 섬유 단백질의 H1 루프내 RGD 모티프를 삽입하는 것인, 아데노바이러스.
  26. 제 24항에 있어서, 캡시드의 변형은 섬유 유전자 또는 이의 일부를 다른 혈청형의 아데노바이러스로부터 유래된 상동적인 부분으로 치환하여 키메라 아데노바이러스를 형성하는 것인, 아데노바이러스.
  27. 제 26항에 있어서, 혈청형 3형 아데노바이러스 유래 섬유 유전자 또는 이의 일부로 치환한 캡시드를 포함하며, 섬유 유전자를 제외한 부분은 혈청형 5형 아데노바이러스 유래 유전자를 포함하는, 아데노바이러스.
  28. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 비-아데노바이러스성 유전자를 포함하는, 아데노바이러스.
  29. 제 28항에 있어서, 비-아데노바이러스성 유전자는 암 유전자 치료에 사용되는 유전자인, 아데노바이러스.
  30. 제 29항에 있어서, 암 유전자 치료에 사용되는 유전자는 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아데노바이러스.
  31. 제 1항의 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  32. 제 31항에 있어서, 전신으로 투여되는, 암 치료용 약학적 조성물.
  33. 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산을 헥손 단백질의 과가변부(HVR)의 코딩 영역에 포함하는 아데노바이러스의 종양 예방 또는 치료 용도.
  34. 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산을 헥손 단백질의 과가변부(HVR)의 코딩 영역에 포함하는 아데노바이러스를 암에 걸린 개체에 투여하는, 암 치료 방법.
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