ES2231281T3 - Vectores competentes de replicacion anticancerosos. - Google Patents

Abstract

Un adenovirus recombinante que sobreexpresa una proteína proapoptótica de adenovirus y que es competente de replicación en células neoplásicas, comprendiendo dicha proteína proapoptótica de adenovirus una secuencia seleccionada de una secuencia como se indica en la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 7, la SEC ID Nº 8, la SEC ID Nº 9, la SEC ID Nº 10, la SEC ID Nº 11 o la SEC ID Nº 12, o una variante sustituida conservativamente de la misma.

Description

Vectores competentes de replicación anticancerosos.

Referencia a subvención gubernamental

Esta invención se realizó con apoyo del gobierno mediante una subvención de los "National Institutes of Health", número de subvención RO1 CA71704 y CA81829. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la invención (1) Campo de la invención

Esta invención se refiere en general al tratamiento del cáncer y más particularmente a vectores que se replican en células neoplásicas y que sobreexpresan una proteína proapoptótica de adenovirus (ADP) y al uso de estos vectores en el tratamiento del cáncer humano.

(2) Descripción de la técnica relacionada

El cáncer es una causa importante de muerte en los Estados Unidos y en el resto del mundo. Dependiendo del tipo de cáncer, se trata típicamente con cirugía, quimioterapia y/o radiación. Estos tratamientos a menudo fracasan: la cirugía puede no extirpar todo el cáncer; algunos cánceres son resistentes a la quimioterapia y a la terapia de radiación; y frecuentemente se desarrollan tumores resistentes a la quimioterapia. Son necesarias nuevas terapias para utilizar solas o en combinación con técnicas clásicas.

Una terapia potencial bajo investigación activa es tratar tumores con vectores víricos recombinantes que expresan proteínas terapéuticas anticancerosas. Los vectores basados en adenovirus contienen diversas características que los hacen conceptualmente atractivos para uso en el tratamiento del cáncer, así como para terapia de trastornos genéticos. Los adenovirus (utilizado de aquí en adelante intercambiablemente con "Ad") pueden hacerse crecer fácilmente en cultivo en soluciones madre de alta titulación que son estables. Tienen un amplio intervalo de hospedadores, replicándose en la mayoría de los tipos celulares de cáncer humano. Su genoma puede manipularse mediante mutación dirigida a sitio e inserción de genes extraños expresados a partir de promotores extraños.

El adenovirión consiste en un núcleo de ADN-proteína dentro de una cápsida de proteína (revisado por Stewart et al., "Adenovirus structure by x-ray crystallography and electron microscopy" en: "The Molecular Repertoire of Adenoviruses", Doerfler, W. et al., (ed.), Springer-Verlag, Heidelberg, Alemania, pág. 25-38). Los viriones se unen a un receptor celular específico, se someten a endocitosis, y se extrusiona el genoma a partir de los endosomas y se transporta al núcleo. El genoma es un ADN dúplex lineal de aproximadamente 36 kpb, que codifica aproximadamente 36 genes (Fig. 1A). En el núcleo, las proteínas de E1A "tempranas inmediatas" se expresan inicialmente, y estas proteínas inducen la expresión de las proteínas "tempranas retardadas" codificadas por las unidades de transcripción E1B, E2, E3 y E4 (revisado por Shenk, T. "Adenoviridae: the viruses and their replication" en: "Fields Virology", Field, B.N. et al., Lippencott-Raven, Filadelfia, pág. 2111-2148). Las proteínas de E1A inducen o reprimen también genes celulares, dando como resultado la estimulación del ciclo celular. Aproximadamente 23 proteínas tempranas funcionan para usurpar la célula e iniciar la replicación de ADN vírico. El ADN vírico se replica aproximadamente a las 7 h postinfección (p.i.), después se expresan los genes tardíos de la unidad de transcripción "tardía principal". Los ARNm tardíos principales se sintetizan a partir del "promotor tardío principal" común mediante procesamiento pre-ARNm alternativo. Cada ARNm tardío contiene una "secuencia líder tripartita" común en su terminación 5' (exones 1, 2 y 3 en la Fig. 1), que permite una traducción eficaz de los ARNm tardíos de Ad. La síntesis de proteína celular se detiene, y la célula se convierte en una fábrica de preparación de proteínas víricas. Los viriones se ensamblan en el núcleo aproximadamente 1 día p.i., y después de 2-3 días la célula se lisa y libera los virus progenie. La lisis celular está mediada por la proteína 11,6K de E3, que se ha renombrado como "proteína proapoptótica de adenovirus" (ADP) (Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1996; Tollefson et al., Virol. 220: 152-162, 1996). El término ADP como se utiliza en la presente memoria en un sentido genérico designa colectivamente ADP de adenovirus tales como, por ejemplo, Ad de tipo 1 (Ad1), Ad de tipo 2 (Ad2), Ad de tipo 5 (Ad5) o Ad de tipo 6 (Ad6), todos los cuales expresan ADP homólogas con un alto grado de similitud de secuencia.

El adenovirus humano de tipo 5 (Ad5) es particularmente útil para terapia génica del cáncer. Causa principalmente infecciones respiratorias asintomáticas o moderadas en niños pequeños, seguido de inmunidad eficaz a largo plazo. Los fallecimientos son extremadamente raros excepto cuando el paciente está inmunocomprometido (Horwitz, M.S., "Adenoviruses", pág. 2149-2171 en B.N. Fields, D.M. Knipe y P.M. Howley (eds.), "Fields Virology", Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, PA, 1996). El Ad5 se comprende muy bien, puede hacerse crecer en cultivo en soluciones madre de alta titulación que son estables y puede replicarse en la mayoría de los tipos celulares de cáncer humano (Shenk, T., "Adenoviridae: the viruses and their replication", pág. 2111-2148, en B.N. Fields, D.M. Knipe P.M. Howley (eds)., "Fields Virology", Lippincott-Raven, Filadelfia, 1996). Su genoma puede manipularse mediante mutagénesis dirigida a sitio e inserción de secuencias extrañas.

Los vectores de Ad que se están investigando para uso en terapia anticancerosa y génica están basados en Ad recombinantes que son defectuosos de replicación o competentes de replicación. Los vectores de Ad defectuosos de replicación típicos carecen de los genes E1A y E1B (colectivamente conocidos como E1) y contienen en su lugar un módulo de expresión que consiste en un promotor y señales de procesamiento pre-ARNm que conducen la expresión de un gen extraño. Las proteínas de E1A inducen la transcripción de otros genes de Ad, y en células no transformadas desrregulan el ciclo celular, inducen o reprimen una variedad de genes celulares y fuerzan a las células de G_{0} a la fase S 48 (White, E., Semin. Virol. 8: 505-513, 1998; Wold et al., pág. 200-232 en A.J. Cann (ed.), "DNA Virus Replication: Frontiers in Molecular Biology", Oxford University Press, Oxford). Las proteínas de E1B inhiben la apoptosis celular. Id. Estos vectores son incapaces de replicarse porque carecen de los genes E1A necesarios para inducir la expresión génica y la replicación de ADN de Ad. Además, los genes E3 se eliminan habitualmente porque no son esenciales para la replicación vírica en células cultivadas.

Una serie de investigadores han construido vectores de Ad defectuosos de replicación que expresan proteínas terapéuticas anticancerosas. Habitualmente, estos vectores se han ensayado mediante inyección directa en tumores humanos en crecimiento en modelos de ratón. Lo más habitualmente, estos vectores expresan el gen de timidina quinasa de herpesvirus simplex y los ratones se tratan con ganciclovir para destruir las células transducidas por el vector (véase, por ejemplo, Felzmann et al., Gene Ther. 4: 1322-1329, 1997). Otro enfoque de terapia génica suicida implica inyectar tumores con un vector de Ad defectuoso de replicación que expresa la citosina desaminasa, seguido de la administración de 5-fluorocitosina (Topf et al., Gene Ther. 5: 507-513, 1998). Los investigadores han preparado y ensayado también vectores de Ad defectuosos de replicación que expresan una citocina tal como IL-2, IL-12, IL-6, factor de necrosis tumoral (TNF), interferones de tipo I o la molécula coestimuladora B7-1 anticipando que la citocina expresada por Ad estimulará una respuesta inmune, incluyendo linfocitos T citotóxicos (CTL), contra el tumor (Felzmann et al., supra; Putzer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10899-10894, 1997). Otros vectores expresan antígenos tumorales (por ejemplo MART1 de melanoma), proteínas que desrregulan el ciclo celular e inducen la apoptosis (p53, pRB, p21^{Kip1/WAF1}, p16^{CDKN2} e incluso E1A de AD) y ribozimas. Un vector de Ad que expresa FasL induce la apoptosis y regresión tumoral de un tumor de ratón (Arai et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 13862-13867, 1997).

A pesar de estos informes generalmente positivos, se reconoce en la técnica que los vectores de Ad defectuosos de replicación tienen diversas características que los hacen subóptimos para uso en terapia. Por ejemplo, la producción de vectores defectuosos de replicación requiere que crezcan en una estirpe celular complementaria que proporcione la proteína de E1A en trans. Dichas estirpes celulares son delicadas, y la generación de soluciones madre víricas consume tiempo y es cara. Además, aunque se han expresado muchas proteínas extrañas a partir de estos vectores, el nivel de expresión es bajo comparado con las proteínas tardías de Ad.

Para enfrentarse a estos problemas, diversos grupos han propuesto utilizar vectores de Ad competentes de replicación para uso terapéutico. Los vectores competentes de replicación retienen los genes de Ad esenciales para la replicación y por tanto no requieren estirpes celulares complementarias para replicarse. Los vectores de Ad competentes de replicación lisan células como parte natural del ciclo celular del vector. Otra ventaja de los vectores de Ad competentes de replicación aparece cuando el vector se modifica por ingeniería genética para codificar y expresar una proteína extraña. Se esperaría que dichos vectores amplificaran en gran medida la síntesis de la proteína codificada in vivo a medida que el vector se replica. Sin embargo, para evitar que los vectores CR dañen los tejidos normales y causen viremia diseminada, es importante que tengan ciertos rasgos que limiten su replicación a células cancerosas.

Wyeth Laboratories desarrollaron vectores de Ad competentes de replicación con fines de vacunación utilizando cepas de vacuna de los serotipos 4, 7 y 5 de Ad (Lubeck et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: 1443-1449, 1994). Se insertaron genes extraños en la región E3 (con los genes E3 eliminados) o en un sitio en el extremo derecho del genoma. Dos genes extraños utilizados fueron el antígeno de superficie de hepatitis B y la proteína de cubierta de VIH. Obtuvieron una buena expresión en cultivo, y pudieron producir antisueros en modelos animales. Los ensayos humanos de fase I fueron ambiguos, y el proyecto se abandonó en su mayor parte.

Onyx Pharmaceuticals reseñaron recientemente vectores anticancerosos basados en adenovirus que son deficientes de replicación en células no neoplásicas, pero que exhiben un fenotipo de replicación en células neoplásicas que carecen de las proteínas p53 y/o supresora de tumor de retinoblastoma (pRB) funcionales (patente de EE.UU. nº 5.677.178; Heise et al., Nature Med. 6: 639-645, 1997; Bischoff et al., Science 274: 373-376, 1996). Se ha reseñado que este fenotipo se consigue utilizando adenovirus recombinantes que contienen una mutación en la región E1B que hace a la proteína 55K de E1B codificada incapaz de unirse a p53 y/o una mutación(es) en la región E1A que hace a la proteína de E1A codificada (p289R o p243R) incapaz de unirse a pRB y/o el polipéptido celular de 300 kDa y/o el polipéptido de 107 kDa. 55K de E1B tiene al menos dos funciones independientes: se une a e inactiva la proteína p53 supresora de tumores, y es necesaria para un transporte eficaz de ARNm de Ad desde el núcleo. Debido a que estas proteínas víricas E1B y E1A están implicadas en forzar las células a la fase S, lo que es necesario para la replicación de ADN de adenovirus, y debido a que las proteínas p53 y pRB bloquean la progresión del ciclo celular, los vectores de adenovirus recombinantes descritos por Onyx deberían replicarse en células defectuosas de p53 y/o pRB, que es el caso de muchas células cancerosas, pero no en células con p53 y/o pRB de tipo silvestre. Onyx ha reseñado que la replicación de un adenovirus que carece de 55K de E1B, que se denomina ONYX-015, estaba limitada a estirpes celulares cancerosas p53- (Bischoff et al., supra) y que ONYX-015 retardaba el crecimiento o causaba la regresión de un tumor humano p53- en crecimiento en ratones desnudos (Heise et al., supra). Otros han objetado el informe de Onyx reivindicando que la replicación de ONYX-015 es independiente del genotipo de g53 y ocurre eficazmente en algunas células humanas cultivadas primarias (Harada y Berk, J. Virol. 73: 5333-5344, 1999). Es ahora conocido que ONYX-15 puede replicarse en células con p53 de tipo silvestre (Goodrum et al., J. Virol. 72: 9479-9480, 1998; Harada et al., J. Virol. 73: 5333-5344, 1999; Hay et al., Hum. Gene Ther. 10: 579-590, 1999; Rothmann et al., J. Virol. 72: 9470-9478, 1998; Turnell, et al., J. Virol. 73: 2074-2083, 1999). ONYX-15 no se replica tan bien como el adenovirus de tipo silvestre porque 55K de E1B no está disponible para facilitar el transporte de ARNm vírico desde el núcleo. Además, ONYX-15 expresa menos ADP que el virus de tipo silvestre (véase el ejemplo 1 siguiente).

Como extensión del concepto de ONYX-15, se diseñó un adenovirus competente de replicación que tiene el gen de 55K de E1B reemplazado por el gen de timidina quinasa de herpesvirus simplex (Wilder, et al., Gene Therapy 6: 57-62, 1999). El grupo que construyó este vector reseñó que la combinación del vector más ganciclovir mostró un efecto terapéutico sobre un cáncer de colon humano en un modelo de ratón desnudo (Wilder et al., Cancer Res. 59: 410-413), 1999). Sin embargo, este vector carece del gen de ADP, y en consecuencia, el vector lisará células y se propagará de célula a célula menos eficazmente que un vector equivalente que exprese ADP. El gen de ADP está también ausente en otro vector de adenovirus competente de replicación que se ha descrito, en el que se insertó un potenciador/promotor mínimo del antígeno específico de próstata humana en el potenciador/promotor E1A de adenovirus (Rodríguez et al., Cancer Res. 57: 2559-2563, 1997). Otra estrategia para la mejora del vector competente de replicación es disponer la replicación bajo el control de promotores específicos de tejido. Un grupo reemplazó el promotor E1A basal por un promotor modificado de \alpha-fetoproteína (AFP) (Hallenbeck et al., Hum. Gene Ther. 10: 1721-1733, 1999). La AFP se expresa en el hígado durante el desarrollo, pero no se expresa en adultos. Sin embargo, se expresa en un 70-80% de los pacientes con carcinoma hepatocelular. El crecimiento de este vector estaba limitado a células que expresan AFP, y el vector mostró cierta supresión de xenotransplantes. Id. Calydon Inc. desarrolló también vectores adenovíricos que sobreexpresan ADP en células que expresan el gen AFP específico de hígado o genes específicos de próstata, tales como el antígeno específico de próstata (PSA) y probasina (PB). En los vectores de Calydon, el promotor E1A o E1B está reemplazado por el promotor AFP, el promotor PSA o el promotor PB, posibilitando así que el adenovirus que expresa ADP se replique en tejido hepático y carcinomas hepatocelulares o tejido de próstata y tejido de cáncer de próstata, respectivamente ("Adenovirus Vectors Specific for Cells Expressing Alpha-Fetoprotein and Methods of Use Thereof", documento WO 98/39465; "Adenovirus Vectors Specific for Cells Expressing Androgen Receptor and Methods of Use Thereof", patente de EE.UU. nº 6.197.293).

Se han desarrollado también una serie de vectores CR que tienen expresión de los genes E1A y E1B dependiente de promotores/potenciadores de antígeno específico de próstata (PSA) y de calicreína específicos de tumor de próstata (Rodríguez et al., Cancer Res. 60: 1196, 1997; Yu et al., Cancer Res. 59: 4200-4203, 2000; Yu et al., Cancer Res. 59: 1498-1504, 1999).

Por tanto, existe la necesidad continua de vectores que se repliquen y propaguen eficazmente en tumores, pero que puedan modificarse de tal modo que se repliquen mal o nada en absoluto en tejido normal.

Sumario de la invención

Por lo tanto, brevemente, la presente invención se dirige a nuevos vectores que son competentes de replicación en células neoplásicas y que sobreexpresan una proteína proapoptótica de adenovirus (ADP). El trabajo reseñado en la presente memoria demuestra el descubrimiento de que la sobreexpresión de ADP mediante un adenovirus recombinante permite la construcción de un adenovirus competente de replicación que destruye células neoplásicas y se propaga de célula a célula a una velocidad similar o más rápida que la exhibida por adenovirus que expresan niveles de tipo silvestre de ADP, incluso cuando el adenovirus recombinante contiene una mutación que de otro modo reduciría su velocidad de replicación en células no neoplásicas. Este descubrimiento fue inesperado porque no podría haberse predicho, a partir de lo sabido sobre biología de adenovirus, que los vectores de Ad que sobreexpresan ADP permanecen viables y que las células infectadas no se destruyen por las mayores cantidades de ADP antes de que el vector Ad produzca nuevas partículas víricas que puedan propagarse a otras células tumorales. Es más, Los adenovirus de origen natural expresan ADP en bajas cantidades a partir del promotor E3 en etapas tempranas de la infección, y empiezan a preparar ADP en grandes cantidades sólo a las 24-30 h p.i., una vez los viriones se han ensamblado en el núcleo celular. Se cree que pueden utilizarse otros vectores no adenovíricos para suministrar la actividad destructora celular de la ADP a células neoplásicas, incluyendo otros vectores víricos y plásmidos vectores de expresión.

Por tanto, en una realización preferida, el vector que expresa ADP comprende un adenovirus recombinante que carece de la expresión de al menos una proteína de E3 seleccionada del grupo consistente en: gp19K, RID\alpha (también conocida como 10,4K), RID\beta (también conocida como 14,5K) y 14,7K. Debido a que estas proteínas de E3 inhiben la inflamación mediada por sistema inmune y/o la apoptosis de células infectadas con Ad, se cree que un adenovirus recombinante que carezca de una o más de estas proteínas de E3 estimulará la infiltración de células inflamatorias e inmunes en un tumor tratado con el adenovirus y que esta respuesta inmune del hospedador ayudará a la destrucción del tumor así como de tumores que se han metastatizado. La ADP expresada por realizaciones preferidas comprende una secuencia aminoacídica de origen natural de un adenovirus humano del subgrupo C, a saber Ad1, Ad2, Ad5 y Ad6.

En otra realización, la replicación del vector está limitada a células neoplásicas. Dichos vectores limitados de replicación son útiles en el tratamiento de pacientes con cáncer en los que es deseable eliminar o reducir el daño a células y tejidos normales que podría causarse por el vector, particularmente vectores víricos que destruyen la célula hospedadora como parte de su ciclo vital. En realizaciones preferidas, un adenovirus recombinante tiene un fenotipo limitado de replicación debido a que el adenovirus recombinante es incapaz de expresar una proteína vírica E1A que se une a las proteínas pRB y p300/CBP, o debido que el promotor E4 se ha sustituido por un promotor que se activa sólo en células neoplásicas y/o células de un tejido específico.

En aún otra realización, la invención proporciona un vector que sobreexpresa ADP y cuya replicación está bajo el control de un promotor específico de tejido, promotor específico de tumor o promotor inducible. En realizaciones preferidas, el vector comprende un adenovirus recombinante en el que un promotor específico de tejido o promotor inducible sustituye al promotor E4. Dichos vectores son útiles para limitar la replicación del vector y su destrucción celular mediada por ADP de células de un tipo particular o de células expuestas a un agente exógeno que activa el promotor. Un vector específico de tejido o inducible preferido expresa también un fenotipo que limita su replicación a células neoplásicas.

En aún otra realización, la invención proporciona un vector que sobreexpresa ADP pero que no está limitado a tumores por una modificación genética específica. Dicho vector es incluso más destructivo para células neoplásicas que los Ad de origen natural del subgrupo C. En realizaciones preferidas, este vector podría utilizarse para pacientes con cáncer terminal no tratable mediante otro método, y que tienen anticuerpos neutralizantes preexistentes frente a Ad o a los que pueden administrarse anticuerpos neutralizantes.

En aún otra realización, la invención proporciona una composición que comprende un primer virus recombinante que es competente de replicación en una célula neoplásica y que sobreexpresa la proteína proapoptótica de adenovirus. En una realización, el virus recombinante está contenido en un vehículo de suministro que comprende un resto director que limita el suministro del virus a células de un cierto tipo. Con esta realización, el vector competente de replicación puede tener cualquiera de las configuraciones que sobreexpresan ADP descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, la composición comprende también un segundo virus recombinante que es defectuoso de replicación y que expresa un producto génico anticanceroso. En algunas realizaciones, el vector defectuoso de replicación puede modificarse por ingeniería genética para sobreexpresar ADP cuando la replicación de este vector está complementada por un vector competente de replicación. El virus recombinante complementa la propagación del virus defectuoso de replicación, así como su producto anticanceroso codificado, a lo largo de un tumor. En realizaciones preferidas, el primer virus recombinante es un adenovirus recombinante cuya replicación está limitada a células neoplásicas y/o que carece de la expresión de una o más de las proteínas gp19K, RID\alpha, RID\beta y 14,7K de E3.

En realizaciones adicionales, la invención proporciona vectores competentes de replicación que sobreexpresan una ADP y que expresan también un producto anticanceroso. Como con las realizaciones previas, el vector puede tener cualquiera de las configuraciones que sobreexpresan ADP proporcionadas en la presente memoria. Preferiblemente, la replicación del virus se modifica por ingeniería genética para (a) estar limitada a células neoplásicas, por ejemplo reemplazando el promotor E4 por un promotor específico de tejido o específico de tumor y/o (b) carecer de la expresión de una o más de las proteínas gp19K, RID\alpha, RID\beta y 14,7K de E3. En algunas realizaciones, el producto anticanceroso se inserta en la región E3.

Los vectores y composiciones de la invención que expresan ADP son útiles en un método para promover la muerte de una célula neoplásica. El método comprende poner en contacto la célula neoplásica con un vector que es competente de replicación en la célula neoplásica y que sobreexpresa ADP. Cuando la célula neoplásica comprende un tumor en un paciente, el vector se administra directamente al tumor o, en otras realizaciones, el vector se administra al paciente sistémicamente o en un vehículo de suministro que contiene un resto director que dirige el suministro del vector al tumor. En realizaciones en las que el vector es un virus recombinante, el método puede comprender también inmunizar pasivamente al paciente frente al virus.

En aún otra realización de la invención, el vector puede utilizarse en combinación con terapia de radiación. La terapia de radiación puede ser cualquier forma de terapia de radiación utilizada en la técnica, tal como por ejemplo radiación con rayos externos tal como tratamiento con rayos X, radiación suministrada mediante la inserción de materiales radiactivos en el cuerpo cerca de o en el sitio tumoral tal como tratamiento con radionucleidos emisores de rayos gamma, terapia de rayos de partículas que utiliza neutrones o partículas cargadas y similares. Además, esta realización comprende el uso de más de uno de los vectores de la presente invención en un cóctel en combinación con terapia de radiación.

Otra realización de la invención implica el uso del vector recombinante en combinación con quimioterapia como se ha dado a conocer para otros vectores de adenovirus (patente de EE.UU. nº 5.846.945). Los agentes quimioterapéuticos son conocidos en la técnica e incluyen antimetabolitos, incluyendo antimetabolitos análogos de pirimidina y análogos de purina, alcaloides de plantas, antibióticos antitumorales, agentes de alquilación y similares. El uso de más de uno de los vectores de la presente invención con un agente o agentes quimioterapéuticos está también contemplado en esta realización.

Entre las diversas ventajas que se han encontrado que consigue la presente invención, pueden observarse por lo tanto la provisión de vectores competentes de replicación, particularmente virus, que destruyen rápidamente células cancerosas y se propagan de célula a célula en un tumor; la provisión de aquellos vectores cuya replicación puede inducirse o que está limitada a tumores y/o a células de un cierto tipo de tejido; y la provisión de composiciones y métodos para terapia anticancerosa que causan pocos o ningún efecto secundario en tejidos normales.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema de la expresión génica en Ad5 (Fig. 1A) y KD3, una realización preferida de la invención (Fig. 1B), en el que los genomas respectivos están representados por las barras punteadas y las unidades de transcripción están representadas por flechas encima y debajo de las barras, enumerándose las proteínas de E3 encima de las flechas para la unidad de transcripción E3 e indicándose las familias L1 a L5 de ARNm tardíos.

La Figura 2 ilustra la sobreexpresión de ADP por KD1, KD3, GZ1 y GZ3 mostrando una inmunotransferencia de proteínas aisladas de células A549 humanas infectadas con los virus indicados y ensayadas con un anticuerpo anti-ADP, indicando ADP las formas de ADP diferentemente glicosiladas y procesadas proteolíticamente.

La Figura 3 ilustra que la mutación dl1101/1107 de E1A, designada en la figura y a continuación en la presente memoria como dl01/07, retarda la expresión de proteínas tardías, mostrando una inmunotransferencia de proteínas de E1A y proteínas tardías en células A549 infectadas con los virus indicados en ausencia (Fig. 3A y 3B) y presencia (Fig. 3C y 3D) de dl327, que tiene una región E1A de tipo silvestre y tiene una deleción de todos los genes E3 excepto el gen que codifica la proteína 12,5K (Fig. 3C y 3D). Se utilizó un antisuero específico de las proteínas de E1A para las Fig. 3A y 3C. Se utilizó un antisuero creado frente a viriones de Ad5 para las Fig. 3B y 3D.

La Figura 4 ilustra que KD1 y KD3 destruyen células más eficazmente que virus control que expresan menos o ningún ADP, mostrando una gráfica del porcentaje de células A549 infectadas los virus indicados que fueron viables los días indicados p.i., determinado mediante exclusión con azul de tripano.

La Figura 5 es un ensayo de propagación celular que ilustra que la sobreexpresión de ADP potencia la propagación del virus de célula a célula, mostrando monocapas infectadas con los virus indicados a las UFP/célula indicadas, que se trataron a los 7 días p.i. con violeta cristal que tiñe células vivas pero no células muertas.

La Figura 6 ilustra que KD1 y KD3 se replican bien en células en crecimiento, pero no en células de crecimiento detenido, mostrando la titulación vírica extraída de células HEL-229 en crecimiento o de crecimiento detenido a diversos momentos después de la infección con 100 UFP/ml de los siguiente virus: dl309 (Fig. 6A), dl01/07 (Fig. 6B), KD1 (Fig. 6C) y KD3 (Fig. 6D).

La Figura 7 ilustra que KD1 y KD3 son defectuosos para destruir células epiteliales bronquiales humanas primarias, mostrando estas monocapas celulares infectadas a un 30% de confluencia con 10 UFP/ml de los virus indicados y teñidas a los 5 días p.i. con rojo neutro.

La Figura 8 ilustra que KD1 y KD3 reducen la velocidad de crecimiento de tumores de células A549 humanas en crecimiento en ratones desnudos, mostrando la Fig. 8A una gráfica del aumento medio en veces del tamaño del tumor representado frente al número de semanas después de la infección del tumor con tampón o con 5 x 10^{7} UFP a intervalos semanales de los virus indicados, y mostrando la Fig. 8B una gráfica similar de tumores inyectados una vez con 5 x 10^{8} UFP de KD3 o GZ3.

La Figura 9 ilustra que KD1 y KD3 reducen la velocidad de crecimiento de tumores de células Hep 3B humanas en crecimiento en ratones desnudos, mostrando una gráfica del aumento medio en veces del tamaño del tumor representado frente al número de semanas después de la inyección del tumor con tampón o con 5 x 10^{7} UFP de dl309, KD1 o KD3 a intervalos de dos veces por semana de los virus indicados.

La Figura 10 ilustra que KD1 y KD3 complementan la replicación y propagación de Ad-\beta-gal, un vector defectuoso de replicación que expresa \beta-galactosidasa, utilizando un ensayo de centro infeccioso que muestra en la Fig. 10A una foto de monocapas de células A549 sembradas con células A549 infectadas con Ad-\beta-gal solo o con los virus indicados, mostrando las Fig. 10B y 10C vistas de cerca de dos de las monocapas de la Fig. 10A.

La Figura 11 es una gráfica de barras que ilustra que KD1 y KD3 aumentan la expresión de luciferasa en tumores de células Hep 3B humanas en crecimiento en ratones desnudos, utilizando un ensayo en el que los tumores se inyectaron con las combinaciones indicadas de virus, después se extrajeron 2 semanas p.i. y se ensayó la actividad luciferasa. Los números entre paréntesis indicaban el aumento de actividad luciferasa en veces comparada con la del vector Adluc más tampón.

La Figura 12 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de desarrollo de placa estándar para KD1 y KD1-SPB en células A549 modificadas por ingeniería genética para expresar el factor de transcripción TTF1 (A549/TTF1) y las células 549 originales, en la que los datos se representan como el número de placas observadas en un día particular dividido entre el número final de placas observadas para ese virus multiplicado por 100.

La Figura 13 es un ensayo de propagación celular para KD1 y KD1-SPB en células H441 y células Hep 3B, en el que las células se infectaron con las cantidades indicadas de KD1 o KD1-SPB y las células H441 y Hep 3B se tiñeron con violeta cristal a los 5 días p.i. y los 8 días p.i., respectivamente.

La Figura 14 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de desarrollo de placa estándar para dl309 y dos realizaciones preferidas de la invención, GZ1 y GZ3, en la que los datos se representan como el número de placas observadas en un día particular en el ensayo dividido entre el número final de placas observadas para ese virus multiplicado por 100.

La Figura 15 es un ensayo de propagación celular que ilustra que la combinación de KD1, KD3, GZ1 o GZ3 con radiación de rayos X es más eficaz para destruir monocapas celulares A549 que el vector vírico solo o la radiación sola, en el que se infectan las células con las cantidades indicadas de los virus indicados, irradiándose con 600 centigreys (cGy) de radiación X (panel inferior) o no irradiándose (panel superior), y tiñendo después con violeta cristal a los 6 días p.i.

La Figura 16 es una gráfica de un ensayo de propagación celular que ilustra que 10^{-3} UFP de KD1, KD3, GZ1 o GZ3 utilizados en combinación con 150, 300 ó 600 centigreys de radiación es más eficaz para destruir monocapas celulares A549 que el vector vírico solo o la radiación sola. La viabilidad celular se basa en la cantidad de violeta cristal extraída de los pocillos de cultivo, utilizando el pocillo no irradiado infectado ficticiamente como 100% de viabilidad.

La Figura 17 ilustra que la combinación de KD3 o GZ3 más radiación X es más eficaz en la reducción del crecimiento de tumores en células A549 en crecimiento en ratones desnudos que KD3 solo o GZ3 solo.

La Figura 18 ilustra un análisis de estructura-función de la ADP, mostrando la Fig. 18A la secuencia aminoacídica de la proteína proapoptótica de adenovirus codificada por Ad2, con los diversos supuestos dominios y sitios de glicosilación marcados, y mostrando la Fig. 18B un esquema del gen de ADP en rec700 y en los mutantes de deleción indicados, resumiendo la columna derecha el fenotipo promotor de muerte celular de los diversos mutantes como un porcentaje del fenotipo de tipo silvestre.

Las Figuras 19A y 19B ilustran un ensayo de viabilidad celular de los mutantes de ADP indicados mostrando una gráfica de viabilidad determinada mediante exclusión con azul de tripano representada frente a las horas (Fig. 19A) o días (Fig. 19B) postinfección.

La Figura 20 describe la secuencia aminoacídica, mostrada en código de una letra, de las proteínas ADP de Ad1, Ad2, Ad5 y Ad6 (SEC ID Nº 5-8), de los mutantes dl716, dl715, dl714 y dl737 de ADP de Ad2 (SEC ID Nº 9-12), y del supuesto dominio luminal (SEC ID Nº 17), el dominio transmembrana (SEC ID Nº 18), el dominio citosólico básico de prolina (SEC ID Nº 19) y el resto del dominio citosólico (SEC ID Nº 20) de la proteína ADP de Ad2.

La Figura 21 presenta la secuencia nucleotídica completa del genoma de Ad5.

La Figura 22 presenta la secuencia nucleotídica completa del genoma de KD1 (SEC ID Nº 1).

La Figura 23 presenta la secuencia nucleotídica completa del genoma de KD3 (SEC ID Nº 2).

La Figura 24 es un esquema de los siguientes vectores: A. Ad5. La barra punteada indica el genoma de ADN de 36 kpb. La flecha blanca indica la unidad de transcripción temprana inmediata E1A, y las flechas negras son las unidades de transcripción temprana retardada E1B, E2, E3 y E4. Las flechas barradas indican las cinco familias de los ARNm tardíos principales, y también el ARNm de ADP, que se sintetiza como parte de la unidad de transcripción tardía principal. Cada ARNm tardío principal tiene una secuencia líder tripartita (secuencias líder 1, 2 y 3) ayustada en su terminación 5'. B. dl309. dl309 es idéntico a Ad5 excepto porque tiene los genes E3-RID y E3-14,7K eliminados. dl309 expresa ADP a niveles similares que Ad5. C. KD1. KD1 tiene dos pequeñas deleciones (indicadas por marcas "X") en el gen E1A que anulan la unión de las proteínas de E1A a pRB o p300/CBP. Carece de todos los genes de E3 excepto adp. La ADP se expresa antes y con mayor abundancia en la infección que la ADP de Ad5 o dl309. Doronin et al., J. Virol. 74: 6147-6155. D. KD1-SPB. KD1-SPB es idéntico a KD1, excepto porque tiene el promotor E3 reemplazado por el promotor de la proteína B tensioactiva (SPB-P).

La Figura 25 presenta gráficas que ilustran que KD1-SPB crece tan bien como KD1 en células de carcinoma pulmonar H441, pero mucho peor que KD1 en células de hepatoma Hep 3B. Se titularon soluciones madre con bandas de CsCl de KD1-SPB y KD1 utilizando métodos estándar (Tollefson et al., p. 1-9 en W.S.M. Wold (ed.), "Adenovirus Methods and Protocols", Humana Press, Inc., Totowa, NJ, 1998) en células 293-E4 o 293 (A) o en células A549 (B). Los datos se representan como el número de placas observado cualquier día del ensayo de placa en forma del porcentaje del número de placas observadas el día final del ensayo (Tollefson et al., Virology 220: 152-162, 1996).

La Figura 26 presenta micrografías que ilustran que KD1-SPB induce ECP en células H441 pero no en células Hep 3B. Se infectaron ficticiamente monocapas de H441 y Hep 3B o se infectaron con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB, después se fotografiaron con contraste de fase a los 4 ó 7 días p.i.

La Figura 27 describe hibridaciones Southern y una gráfica que ilustra que el ADN de KD1-SPB se sintetiza eficazmente en células H441 pero no en Hep 3B. Se infectaron células H441 o Hep 3B con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB. Se aisló el ADN genómico total a 0, 5, 24, 48, 72 y 96 h p.i., se digirió con HindIII, se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfirió y se hibridó con ADN de Ad marcado con ^{32}P. A. Autorradiograma. B. Cuantificación por PhosphorImager de las bandas de ADN en el panel A.

La Figura 28 presenta gráficas que describen curvas de crecimiento de una etapa que muestran que KD1-SPB crece bien en células H441 pero no en Hep 3B. Se infectaron las células con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB. Se extrajeron los vectores los días indicados p.i. y se determinaron las titulaciones mediante ensayo de placa.

La Figura 29 describe inmunotransferencias que muestran que KD1-SPB expresa E4ORF3 y ADP en células H441 pero no Hep 3B. Se infectaron las células con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB. A las 24 h p.i., se analizaron en los extractos proteicos E1A, E4ORF3 y ADP utilizando antisueros específicos. Las proteínas de E1A aparecen en forma de bandas múltiples. ADP aparece en forma de dos bandas; estando la banda superior glicosilada y siendo la banda inferior una especie escindida proteolíticamente (Scaria et al., Virology 191: 743-753, 1992; Tollefson et al., J. Virol. 66: 3633-3642).

La Figura 30 describe micrografías de inmunofluorescencia que muestran que KD1-SPB expresa E4ORF3 en células H441 pero no Hep 3B. Se infectaron células en crecimiento en cubreobjetos con 20 UFP/célula de KD1, KD1-SPB o dl309 (tipo silvestre). A las 48 h (panel A) o los 6 días (panel B), se fijaron las células y se tiñeron con un antisuero anti-péptido policlonal de conejo contra E4ORF3. Se tomaron fotografías utilizando una lente Planapo 100X. Cada panel muestra aproximadamente 8 núcleos. Esta figura es parte del mismo experimento mostrado en la Figura 31.

La Figura 31 describe micrografías de inmunofluorescencia que muestran que KD1-SPB no expresa E2-DBP ni fibra eficazmente en células Hep 3B. Las células Hep 3B se infectaron con 20 UFP/célula o KD1-SPB o KD1. A las 48 h (A) o los 6 días (B) p.i., se fijaron las células y se tiñeron por duplicado utilizando un antisuero policlonal de conejo contra DBP y un anticuerpo monoclonal de ratón contra fibra. Se muestran los mismos campos para DBP y fibra. Esta figura es parte del mismo experimento mostrado en la Figura 30.

La Figura 32 presenta gráficas que ilustran que KD1-SPB lisa células H441 pero no Hep 3B tan eficazmente como KD1. Se infectaron ficticiamente células H441 o Hep 3B o se infectaron con 20 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB. Se determinó la lisis celular mediante la liberación de lactato deshidrogenasa de las células al medio.

La Figura 33 presenta gráficas que ilustran que KD1-SPB suprime el crecimiento de tumores H441 en ratones desnudos tan bien como KD1. Se inyectaron las células tumorales en los costados de ratones desnudos y se dejaron crecer hasta volúmenes de aproximadamente 100 \mul (H441) o 150 \mul (Hep 3B). Se inyectaron los tumores (n= 10) con DMEM (inf. ficticia) o con 5 x 10^{7} UFP de KD1 o KD1-SPB. Se repitieron dos veces por semana las inyecciones de los virus durante 3 semanas hasta una dosis total de 3,0 x 10^{8} UFP por tumor. Se midieron los tumores y se calculó el aumento medio en veces del tamaño del tumor.

Descripción de las realizaciones preferidas

Según la presente invención, se ha descubierto que la sobreexpresión de ADP por un adenovirus recombinante da como resultado una lisis celular y propagación más rápidas del virus a lo largo de una monocapa celular que virus que expresan tipos silvestres de ADP. Se ha descubierto también que esta función de ADP es manifiesta en un adenovirus que contiene mutaciones E1A que limitan la replicación adenovírica a células neoplásicas. Por tanto, vectores que sean tanto competentes de replicación en células neoplásicas como que sobreexpresen ADP, deberían ser útiles en terapia anticancerosa.

En el contexto de esta descripción, se definirán los siguientes términos de la manera siguiente a menos que se indique otra cosa:

"Origen natural", aplicado a un objeto tal como un polinucleótido, polipéptido o virus, significa que el objeto puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por un ser humano.

"Célula neoplásica" significa una célula que exhibe un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular, e incluye células de replicación activa así como células en un estado de reposo no replicativo temporal (G_{1} o G_{2}). Una célula neoplásica puede tener un fenotipo bien diferenciado o un fenotipo mal diferenciado, y puede comprender un neoplasma benigno o un neoplasma maligno.

"Virus recombinante" significa cualquier genoma vírico o virión que sea diferente de un virus de tipo silvestre debido a una deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos en el genoma vírico de tipo silvestre. Los virus recombinantes pueden tener cambios en el número de secuencias aminoacídicas codificadas y expresadas o en la cantidad o actividad de las proteínas expresadas por el virus. En particular, el término incluye virus recombinantes generados mediante la intervención de un ser humano.

"Competente de replicación", aplicado a un vector, significa que el vector es capaz de replicarse en células normales y/o neoplásicas. Aplicado a un virus recombinante, "competente de replicación" significa que el virus exhibe las siguientes características fenotípicas en células normales y/o neoplásicas: infección celular, replicación del genoma vírico y producción y liberación de nuevas partículas víricas; aunque una o más de estas características no tienen porqué aparecer a la misma velocidad a la que aparecen en el mismo tipo celular infectado con un virus de tipo silvestre, y pueden aparecer a una velocidad más rápida o más lenta. Cuando el virus recombinante deriva de un virus tal como un adenovirus que lisa la célula como parte de su ciclo vital, se prefiere que al menos de 5 a 25% de las células en una monocapa de cultivo celular estén muertas 5 días después de la infección. Preferiblemente, un virus competente de replicación infecta y lisa al menos de 25 a 50%, más preferiblemente al menos un 75%, y lo más preferiblemente al menos un 90% de las células de la monocapa a los 5 días postinfección (p.i.).

"Defectuoso de replicación" aplicado a un virus recombinante significa que el virus es incapaz de, o está muy comprometido para, replicar su genoma en cualquier tipo celular en ausencia de un virus competente de replicación complementario. Las excepciones a esto son estirpes celulares tales como células 293 que se han modificado por ingeniería genética para expresar proteínas de E1A y E1B de adenovirus.

"Limitado de replicación" aplicado a un vector de la invención significa que el vector se replica mejor en una célula en división, concretamente una célula neoplásica o no neoplásica en división, que en una célula del mismo tipo que no sea neoplásica y/o no esté en división, lo que se designa también en la presente memoria como una célula normal no en división. Preferiblemente, un virus limitado de replicación destruye al menos un 10% más células neoplásicas que células normales no en división en monocapas de cultivo celular del mismo tamaño, medido mediante el número de células que muestran efectos citopáticos (ECP) a los 5 días p.i. Más preferiblemente, un virus limitado de replicación destruye entre 25% y 50%, y aún más preferiblemente entre 50% y 75% más células neoplásicas que células normales. Lo más preferiblemente, un adenovirus limitado de replicación destruye entre 75% y 100% más células neoplásicas que normales en monocapas de igual tamaño a los 5 días p.i.

En una realización, la invención proporciona un vector que es competente de replicación en células neoplásicas y que sobreexpresa una ADP. Los vectores útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, plásmidos vectores de expresión, vectores bacterianos tales como de la especie Salmonella que son capaces de invadir y sobrevivir en una serie de diferentes tipos celulares, vectores derivados de virus de ADN tales como adenovirus humanos y no humanos, virus asociados a adenovirus (VAA), poxvirus, herpesvirus y vectores derivados de virus de ARN tales como retrovirus y alfavirus. Los vectores preferidos incluyen virus recombinantes modificados por ingeniería genética para sobreexpresar una ADP. Los adenovirus recombinantes son particularmente preferidos para uso como vector, especialmente vectores derivados de Ad1, Ad2, Ad5 o Ad6.

Los vectores según la invención sobreexpresan ADP. Aplicado a vectores Ad y VAA recombinantes, la expresión "sobreexpresan ADP" significa que se sintetizan más moléculas de ADP por genoma vírico presente en una célula en división infectada con el vector de las que se expresan por cualquier vector adenovírico recombinante o VAA conocido anteriormente en una célula en división del mismo tipo. Aplicado a otros vectores no adenovíricos, "sobreexpresa ADP" significa que el virus expresa suficiente ADP para lisar una célula que contiene el vector.

Los vectores que sobreexpresan ADP pueden prepararse utilizando metodología rutinaria. Véase, por ejemplo "A Laboratory Cloning Manual", 2ª ed., vol. 3, Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Por ejemplo, puede clonarse un polinucleótido que codifica la ADP en un plásmido vector de expresión conocido por expresar eficazmente proteínas heterólogas en células de mamífero. El polinucleótido debería incluir también señales de terminación y poliadenilación apropiadas. Pueden añadirse también elementos potenciadores al plásmido para aumentar la cantidad de expresión de ADP. Pueden prepararse vectores víricos que sobreexpresan ADP utilizando materiales y técnicas similares.

Cuando el virus es un adenovirus recombinante, la sobreexpresión de ADP puede conseguirse de multitud de maneras. En general, cualquier tipo de deleción en la región E3 que retire un sitio de ayuste para cualquiera de los ARNm de E3 conducirá a la sobreexpresión del ARNm de ADP, puesto que más de las moléculas pre-ARNm de E3 se procesarán al ARNm de ADP. Esto se ejemplifica en los vectores KD1, KD3, GZ1 y GZ3 (SEC ID Nº 1-4), cuya construcción se describe a continuación. Otros medios de conseguir la sobreexpresión de ADP en vectores de Ad incluyen, pero sin limitación: inserción de señales de ayuste y escisión/poliadenilación pre-ARNm en sitios que flanquean al gen de ADP; expresión de ADP a partir de otro promotor, por ejemplo el promotor de citomegalovirus humano, insertado en una variedad de sitios del genoma de Ad; e inserción del gen de ADP detrás del gen de otro ARNm de Ad, junto con una secuencia en el extremo 5' de la secuencia de ADP que permite la iniciación interna de la traducción de ADP, por ejemplo la secuencia líder tripartita de Ad o una secuencia de iniciación de ribosoma interna vírica.

La ADP expresada por un vector según la invención es cualquier polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica de ADP completa de origen natural o variante de la misma que confiere a un vector que expresa ADP la capacidad de lisar una célula que contiene el vector, de tal modo que se liberan copias replicadas del vector desde la célula infectada. Una ADP completa preferida comprende la secuencia aminoacídica de ADP codificada por Ad1, Ad2, Ad5 o Ad6. Estas secuencias de ADP de origen natural se indican en las SEC ID Nº 5-8, respectivamente. Las variantes de ADP incluyen fragmentos y mutantes de deleción de proteínas proapoptóticas de adenovirus de origen natural, así como moléculas completas, fragmentos y mutantes de deleción que contienen sustituciones aminoacídicas conservativas, a condición de que dichas variantes retengan la capacidad, cuando se expresan por un vector dentro de una célula, de lisar la célula.

Sustituciones aminoacídicas conservativas designa la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Los aminoácidos sustituidos conservativamente pueden agruparse según las propiedades químicas de sus cadenas laterales. Por ejemplo, una agrupación de aminoácidos incluye aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales neutras e hidrófobas (A, V, L, I, P, W, F y M); otra agrupación es la de aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales neutras y polares (G, S, T, Y, C, N y Q); otra agrupación es la de aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (K, R y H); otra agrupación es aquella en la que los aminoácidos tienen cadenas laterales ácidas (D y E); otra agrupación es aquella en la que los aminoácidos tienen cadenas laterales alifáticas (G, A, V, L e I); otra agrupación es aquellas en la que los aminoácidos tienen cadenas laterales hidroxiloalifáticas (S y T); otra agrupación es aquella en la que los aminoácidos tienen cadenas laterales que contienen amina (N, Q, K, R y H); otra agrupación es aquella en la que los aminoácidos tienen cadenas laterales aromáticas (F, Y y W); y otra agrupación es aquella en la que los aminoácidos tienen cadenas laterales que contienen azufre (C y M). Los grupos de sustituciones aminoacídicas conservativas preferidos son: R-K, E-D, Y-F, L-M, V-I y Q-H.

Como se utiliza en la presente memoria, una variante de ADP puede incluir modificaciones de una ADP de origen natural en la que se han insertado, eliminado o reemplazado uno o más aminoácidos por un aminoácido diferente o un aminoácido modificado o inusual, así como modificaciones tales como glicosilación o fosforilación de uno o más aminoácidos, a condición de que la variante de ADP que contiene la secuencia modificada retenga la actividad de lisis celular.

Como se describe a continuación, los inventores realizaron en la presente memoria un análisis de estructura-función de la ADP que definía los dominios específicos en la ADP necesarios para promover la muerte celular. Utilizando esta información, cuando se combina con metodología de ADN recombinante y de clonación conocida, se cree que el experto en la técnica puede construir fácilmente variantes de ADP de una proteína proapoptótica de adenovirus de origen natural y ensayar su actividad de lisis celular. Un mutante de deleción de ADP preferido comprende una secuencia aminoacídica de ADP de cualquiera de los mutantes de deleción dl716, dl715, dl714 y dl737, cuyas secuencias de ADP se indican en las SEC ID Nº 9-12, respectivamente.

Cuando el vector deriva de un virus, se prefiere que el virus carezca de la expresión de una o más proteínas víricas implicadas en evitar las defensas antivíricas del hospedador, tales como inflamación mediada por sistema inmune y/o apoptosis de células infectadas. Por ejemplo, un adenovirus contiene un módulo de genes que evita la destrucción de células infectadas con Ad por el sistema inmune (Wold et al., Semin. Virol., 1998 (8: 515-523, 1998). La proteína 14,7K de E3 y la proteína RID de E3 (internalización y degradación de receptor), que es un complejo consistente en RID\alpha y RID\beta, inhiben la apoptosis de células infectadas con Ad inducida por el factor de necrosis tumoral (TNF) y el ligando Fas que se expresan, o se secretan, por macrófagos activados, células asesinas naturales (NK) y linfocitos citotóxicos (CTL) (Tollefson et al., Nature 392: 727-730, 1998). La proteína gp19K de E3 inhibe la destrucción por CTL de células infectadas bloqueando el transporte de antígenos MHC de clase I a la superficie celular (Wold et al., supra). Por tanto, se cree que la infección de células tumorales por dichos vectores víricos estimulará la infiltración de células inflamatorias y linfocitos en el tumor, y no evitará la apoptosis de las células tumorales infectadas inducida por células citolíticas del sistema inmune, ni frente a citocinas inductoras de apoptosis. Por ejemplo, es conocido que cuando se infectan ratones con Ad mutantes que carecen de la proteínas gp19K, RID y 14,7K de E3, hay un aumento drástico (comparado con Ad positivo de E3) de la infiltración de células inflamatorias y linfocitos en el tejido infectado (Sparer et al., J. Virol. 70: 2431-2439, 1996). Se esperaría que una infiltración similar de tumores infectados con un vector vírico que expresa ADP de la invención promoviera adicionalmente la destrucción del tumor al añadir un ataque del sistema inmune a la actividad destructora mediada por ADP. Por ejemplo, se cree que la infección vírica estimulará la formación de CTL específicos de tumor que pueden destruir células neoplásicas no sólo en el tumor sino también las que han metastatizado. Además, se espera también que se generarán CTL específicos de vector que podrían atacar a las células infectadas con vector si el vector se propaga más allá del tumor a células normales. Debido a que los vectores víricos que sobreexpresan ADP se propagarán rápidamente a través del tumor, se cree que estos mecanismos inmunes tendrán poco efecto sobre la propagación del vector.

Cuando el vector es un adenovirus recombinante, se prefiere que el adenovirus carezca de la expresión de cada una de las proteínas gp19K, RID y 14,7K de E3. Por "carecer de expresión" y "carencia de expresión" de una(s)

\hbox{proteína(s),}

se quiere indicar que el genoma vírico contiene una o más mutaciones que inactivan la expresión de una proteína funcional, concretamente aquella que tiene todas las funciones de la proteína de tipo silvestre. La mutación inactivadora incluye, pero sin limitación, la sustitución o deleción de uno o más nucleótidos en el(los) gen(es) codificante(s) que evita(n) la expresión de transcriptos funcionales o que da(n) como resultado transcriptos que codifican productos de traducción no funcionales. Un modo particularmente preferido de inactivar la expresión de las proteínas gp19K, RID y 14,7K de E3 de Ad es eliminar la región E3 que contiene los genes que codifican estas proteínas. Preferiblemente, se eliminan también uno o ambos de los genes E3 que codifican las proteínas 6,7K y 12,5K de E3 porque, como se discute en los ejemplos a continuación, se cree que la deleción de la mayoría o todos los genes E3 distintos del gen de ADP facilita la sobreexpresión de ARNm de ADP al reducir la competición por ayuste de los pre-ARNm tardíos principales. Los vectores de Ad preferidos que contienen una deleción E3 que sobreexpresan ADP son GZ1 (SEC ID Nº 3) y GZ3 (SEC ID Nº 4), cuya construcción y propiedades se describen en los ejemplos a continuación.

La invención proporciona también vectores que expresan ADP cuya replicación está limitada a células en división. Puede utilizarse cualquier medio conocido de proporcionar dicho fenotipo limitado de replicación. Por ejemplo, el documento WO 96/40238 describe microbios que invaden preferiblemente células tumorales, así como métodos para identificar y aislar promotores bacterianos que se activan selectivamente en tumores. Se contempla también que la expresión de una o más proteínas de vector esenciales para la replicación puede disponerse bajo el control del promotor de un gen celular cuya expresión es conocida por estar activada en células neoplásicas. Los ejemplos de dichos genes incluyen, pero sin limitación: los marcadores de cáncer de mama mamaglobina (Watson et al., Oncogene 16: 817-824, 1998), BRCA1 (Norris et al., J. Biol. Chem. 270: 22777-22782, 1995), her2/neu (Scott et al., J. Biol. Chem. 269: 19848-19858, 1994), antígeno específico de próstata (patente de EE.UU. 5.698.443), proteína B tensioactiva para alveolos pulmonares (Yan et al., J. Biol. Chem. 270: 24852-24857, 1995); factor VII del hígado (Greenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 12347-12351, 1995); y survivina para cáncer en general (Li et al., Nature 396: 580-584). Cuando el vector es un adenovirus, se contempla que dichos promotores específicos de tumor pueden sustituir al promotor E4. Debido a que los productos del gen E4 son esenciales para la replicación de Ad, disponer su expresión bajo el control de un promotor específico de tumor limitaría la replicación del vector a células tumorales en las que el promotor está activado.

Se ejemplifica otra estrategia para limitar la replicación de vectores de Ad que expresan ADP a células neoplásicas por los vectores KD1 (SEC ID Nº 1), KD2 (SEC ID Nº 13) y KD3 (SEC ID Nº 2), cuya construcción y propiedades se describen en los ejemplos a continuación. Esta estrategia explota un mutante de Ad5 preexistente en el gen E1A, denominado dl101/1107 (Howe et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 5883-5887, 1990), también designado en la presente memoria como dl01/07, y que puede crecer bien sólo en células cancerosas. El papel de E1A es conducir las células desde las fases G_{0} y G_{1} del ciclo celular a la fase S. Esto se consigue mediante dos mecanismos, uno que implica pRB (y miembros de la familia), y otro que implica p300 y la proteína relacionada CBP (DePinho, R.A. Nature 391: 533-536, 1998). Un dominio en E1A se une a miembros de la familia de pRB. pRB existe normalmente en la célula en forma de un complejo con el factor de transcripción E2F-1 y miembros de la familia de E2F (E2F), unido mediante E2F a sitios de unión de E2F en promotores de células expresadas en fase S. Aquí, pRB actúa como correpresor transcripcional. La unión de E1A a pRB alivia esta represión, y causa la liberación de E2F de los complejos pRB/E2F. El E2F libre activa entonces los promotores de genes expresados en fase S, por ejemplo timidina quinasa, ribonucleótido reductasa, etc. Otro dominio de E1A se une al complejo de proteína adaptadora de la transcripción p300/CBP. p300/CBP es un coactivador transcripcional que se une a muchos factores de transcripción diferentes y en consecuencia está dirigido a promotores. p300/CPB tiene actividad acetiltransferasa de histona intrínseca. La unión de E1A a p300/CBP se cree que inhibe esta actividad acetiltransferasa de histona, permitiendo la acetilación de histonas y la represión de la transcripción (Chakravarti et al., Cell 96: 393-403, 1999; Hamamori et al., Cell 96: 405-413, 1999). Concebiblemente, algunos de los genes que se reprimen como resultado de la interacción de E1A con p300/CBP desempeñan un papel en el bloqueo del ciclo celular, aunque no es conocido. Las células cancerosas están dividiéndose, luego tienen E2F libre y presuntamente algunos genes regulados por p300/CBP están reprimidos. Consistentemente con estas ideas, E1A debe unirse tanto a p300/CRB como a la familia de pRB para transformar células primarias a un estado de división constitutivo (Howe et al., supra). El mutante dl01/07 carece tanto de los dominios de unión a p300/CBP como a pRB y, como se esperaba, se replica muy mal en células "normales" sin división o en células cancerosas con falta de suero, pero bien en células cancerosas en crecimiento. Como se describe a continuación, el crecimiento de los vectores KD1 y KD3, que contienen la mutación dl01/07 de E1A, es mucho mejor en células cancerosas en división en comparación con células no en división. Debido a que el mutante dl01/07 es completamente defectuoso para la transformación oncogénica de células de rata (Howe et al., supra), los vectores según la invención que contienen esta mutación de E1A no pueden inducir cáncer en seres humanos (por improbable que pueda ser) mediante un mecanismo dependiente de E1A.

La invención incluye también vectores que sobreexpresan ADP cuya replicación está limitada a tejidos específicos por disponerse la expresión de una o más proteínas esenciales para la replicación bajo el control de un promotor específico de tejido y/o un promotor específico de tumor. Se han descrito en la técnica una serie de promotores específicos de tejido y/o específicos de tumor. Los ejemplos no limitantes incluyen el promotor de la proteína B tensioactiva, que es sólo activo en células que contienen el factor de transcripción TTF1 (concretamente en células alveolares de tipo II (Yan et al., supra)), como se describe en la patente de EE.UU. 5.466.596 de Breitman et al., que dirige la expresión génica específicamente a células de linaje endotelial; antígeno específico de próstata que se expresa en células de próstata (Rodríguez et al., supra); promotor de proteína telomerasa humana (hTERT) (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.054.575); y gen de alfa-lactoalbúmina humana, que se expresa en células de cáncer de mama (Anderson et al., Gene Therapy 6: 854-864, 1999). Se han reseñado muchos otros potenciadores/promotores específicos de tejido, específicos de tumor o preferidos de tejido (Miller y Whelan, Human Gene Therapy 8: 803-815, 1997). Como se ejemplifica con el promotor de proteína B tensioactiva en los ejemplos 6 y 10, los vectores que expresan promotores específicos de tejido se esperaría que mostraran especificidad de tejido en la replicación vírica, la propagación vírica, la lisis celular y la supresión tumoral.

La replicación de vectores según la invención puede controlarse también disponiendo uno o más genes esenciales para la replicación del vector bajo el control de un promotor que se activa mediante un agente inductor exógeno, tal como metales, hormonas, antibióticos y cambios de temperatura. Los ejemplos de dichos promotores inducibles incluyen, pero sin limitación, promotores de metalotioneína, el promotor de glucocorticoides, el promotor de respuesta a tetraciclina y los promotores de proteína de shock térmico (hsp), tales como los promotores hsp 65 y 70.

La invención proporciona también composiciones que comprenden un vector recombinante que sobreexpresa ADP en una cantidad eficaz para promover la destrucción de células neoplásicas y un método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del vector a una célula neoplásica en un paciente. Se cree que las composiciones y métodos de la presente invención son útiles para destruir células neoplásicas de cualquier origen, y se incluyen células neoplásicas comprendidas en tumores así como células neoplásicas metastásicas.

Se contempla también que los vectores víricos que expresan ADP pueden administrarse a células neoplásicas junto con un virus defectuoso de replicación que expresa un producto génico anticanceroso. Por ejemplo, están bien caracterizados muchos vectores de Ad E1^{-} defectuosos de replicación para uso en terapia del cáncer. Es una limitación de los vectores defectuosos de replicación que sólo sintetizan la proteína terapéutica en la célula que infectan inicialmente, no pueden propagarse a otras células. Además, puesto que el genoma no se replica, la transcripción puede ocurrir sólo por los genomas de entrada, y esto podría ser tan bajo como una copia por célula. En contraposición, el genoma de vectores de Ad competentes de replicación se amplifica aproximadamente 10^{4} veces en la célula que se infectó inicialmente, proporcionando más moldes para la transcripción. Se consigue más amplificación a medida que el vector se propaga a otras células. Al combinar vectores víricos defectuosos de replicación que expresan un producto génico anticanceroso con los vectores víricos competentes de replicación descritos anteriormente, se espera que el resultado sea la amplificación de moldes y una rápida propagación de ambos vectores a las células circundantes. Por ejemplo, con vectores basados en Ad, el tamaño de descarga para cada vector debería ser grande, \sim10^{4} UFP/célula, de modo que la probabilidad de coinfección de las células circundantes por ambos vectores será alta. Por tanto, tanto el vector competente de replicación como el defectuoso de replicación deberían propagarse simultáneamente a través del tumor, proporcionando una terapia anticancerosa aún más eficaz.

Como método alternativo de suministro de un producto génico anticanceroso con un vector de Ad que sobreexpresa ADP, el gen anticanceroso puede introducirse por ingeniería genética en cualquiera de los vectores competentes de replicación que sobreexpresan ADP descritos en la presente memoria, para proporcionar tanto la ADP como la función anticancerosa en un solo vector. El gen anticanceroso puede introducirse por ingeniería genética en una localización apropiada del vector, como puede determinarse fácilmente por el experto en la técnica. Por ejemplo, el gen anticanceroso puede introducirse por ingeniería genética en la región E3.

La expresión del producto génico anticanceroso codificado por el vector defectuoso de replicación puede estar bajo el control de promotores constitutivos, inducibles o específicos del tipo celular. El producto génico anticanceroso puede ser cualquier sustancia que promueva la destrucción de una célula neoplásica. La expresión "producto génico" como se utiliza en la presente memoria designa cualquier producto o productos biológicos producidos como resultado de las reacciones bioquímicas que ocurren bajo el control de un gen. El producto génico puede ser, por ejemplo, una molécula de ARN, un péptido, una proteína o un producto producido bajo el control de una enzima u otra molécula que es el producto inicial del gen, concretamente un producto metabólico. Por ejemplo, un gen puede controlar primero la síntesis de una molécula de ARN que se traduce mediante la acción de ribosomas a una enzima conversora de profármaco, que convierte un profármaco no tóxico administrado a un paciente con cáncer en un agente destructor de células; siendo la molécula de ARN, la enzima y el agente destructor de células generado por la enzima todos productos génicos como se utiliza aquí la expresión. Los ejemplos de productos génicos anticancerosos incluyen, pero sin limitación, agentes destructores de células tales como agentes promotores de la apoptosis y toxinas; enzimas conversoras de profármacos; inhibidores de la angiogénesis y moléculas y antígenos inmunorreguladoras capaces de estimular una respuesta inmune, humoral y/o celular frente a la célula neoplásica.

Los agentes promotores de la apoptosis incluyen, pero sin limitación, los miembros proapoptóticos de la familia BCL-2 tales como BAX, BAD, BID y BIK, así como moléculas sin sentido que bloquean la expresión de miembros antiapoptóticos de la familia BCL-2. Son ejemplos de moléculas inmunoreguladoras las citocinas, tales como factor de necrosis tumoral, ligando Fas/Apo1/CD95, ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral, interleucinas, factor activador de macrófagos e interferón \gamma. Los inhibidores de la angiogénesis incluyen, pero sin limitación, endostatina y angiostatina. Las toxinas incluyen, pero sin limitación, factor de necrosis tumoral, linfotoxina, la toxina de plantas ricina, que no es tóxica para seres humanos debido a la falta de receptores de ricina en células animales, y la subunidad tóxica de toxinas bacterianas. Se describen ejemplos de enzimas conversoras de profármacos y combinaciones de profármacos en el documento WO 96/40238, e incluyen timidina quinasa y aciclovir o ganciclovir; y citosina desaminasa bacteriana y 5-fluorocitosina.

Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier vía conocida en la técnica, incluyendo por ejemplo la inyección directa en un tumor o mediante otras vías de inyección tales como intravenosa, subcutánea, intramuscular, transdérmica, intratecal e intracerebral. La administración puede ser rápida como mediante inyección o durante un periodo de tiempo tal como mediante infusión lenta o administración de una formulación de liberación lenta. Para tratar tejidos en el sistema nervioso central, la administración puede ser mediante inyección o infusión en el fluido cerebroespinal (FCE). Cuando se pretende administrar un vector recombinante de la invención a células en el sistema nervioso central, la administración puede ser con uno o más agentes capaces de promover la penetración del vector a través de la barrera hematoencefálica. Preferiblemente, los vectores de la invención se administran con un vehículo tal como liposomas o polímeros que contienen un resto director para limitar el suministro del vector a las células diana. Los ejemplos de restos directores incluyen, pero sin limitación, ligandos o receptores de moléculas de superficie celular específicas.

Las composiciones según la invención pueden emplearse en forma de preparaciones farmacéuticas. Dichas preparaciones se realizan de manera bien conocida en la técnica farmacéutica. Una preparación preferida utiliza un vehículo de solución salina fisiológica, pero se contempla que pueden utilizarse también otros vehículos farmacéuticamente aceptables tales como concentraciones fisiológicas de otras sales no tóxicas, solución acuosa de glucosa al 5%, agua estéril o similares. Puede ser también deseable que esté presente un tampón adecuado en la composición. Dichas soluciones pueden liofilizarse, si se desea, y almacenarse en una ampolla estéril listas para reconstitución mediante la adición de agua estéril para inyección rápida. El disolvente primario debe ser acuoso o como alternativa no acuoso.

El vehículo puede contener también otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o el olor de la formulación. De forma similar, el vehículo puede contener aún otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener la liberación o absorción o penetración a través de la barrera hematoencefálica. Dichos excipientes son aquellas sustancias empleadas habitual y ordinariamente para formular dosificaciones para administración parenteral en forma de dosificación unitaria o multidosis o para infusión directa en el fluido cerebroespinal mediante infusión continua o periódica.

Se contempla también que ciertas formulaciones que contienen vectores que expresan ADP han de administrarse por vía oral. Dichas formulaciones preferiblemente se encapsulan y se formulan con vehículos adecuados en formas de dosificación sólidas. Algunos ejemplos de vehículos, excipientes y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, silicato de calcio, celulosa microcristalina, poli(vinilpirrolidona), celulosa, gelatina, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoatos de metilo y propilo, talco, estearato de magnesio, agua, aceite mineral y similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes o agentes aromatizantes. Las composiciones pueden formularse de modo que proporcionen una liberación rápida, prolongada o retardada de los ingredientes activos después de la administración al paciente empleando procedimientos bien conocidos en la técnica. Las formulaciones pueden contener también sustancias que reducen la degradación proteolítica y promueven la absorción, tales como por ejemplo agentes tensioactivos.

La dosis específica se calcula según el peso corporal aproximado o área superficial corporal del paciente o el volumen de espacio corporal a ocupar. La dosis se calculará también dependiendo de la vía de administración particular seleccionada. Se realiza rutinariamente un refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para tratamiento por los expertos en la técnica. Dichos cálculos pueden realizarse sin experimentación indebida por un experto en la técnica. Las dosificaciones exactas se determinan junto con estudios estándar de respuesta a la dosis. Se entenderá que la cantidad de composición administrada realmente se determinará por un médico a la vista de las circunstancias relevantes, incluyendo la afección o afecciones a tratar, la elección de la composición a administrar, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente y la vía de administración elegida. La administración de dosis puede repetirse dependiendo de los parámetros farmacocinéticos de la formulación de dosificación y la vía de administración utilizada.

La invención contempla también inmunizar pasivamente pacientes que se han tratado con un vector vírico que sobreexpresa ADP. La inmunización pasiva puede incluir administrar al paciente antisuero creado frente al vector vírico o gamma-globulina o anticuerpos policlonales o monoclonales purificados específicos de vector aislados del antisuero. Preferiblemente, el paciente se inmuniza pasivamente después de un periodo de tiempo suficiente para que el vector vírico se replique y se propague a lo largo del tumor.

Se describen las realizaciones preferidas de la invención en los siguientes ejemplos. Otras realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones de la presente memoria resultarán evidentes para un experto en la técnica a partir de consideraciones de la memoria descriptiva o la práctica de la invención como se da a conocer en la presente memoria. Se pretende que la memoria descriptiva, junto con los ejemplos, sea considerada sólo ejemplar, estando indicados el alcance y el espíritu de la invención por las reivindicaciones que siguen a los ejemplos.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la construcción y caracterización de los vectores anticancerosos KD1 y KD3.

Para construir KD1, los inventores eliminaron la región E3 entera de un único plásmido, dejando sólo un único sitio PacI para clonación. El plásmido de partida fue pCRII, adquirido en Invitrogen, que contiene el fragmento BamHIA Ad5 que tiene una deleción de todos los genes E3; la deleción de E3 es idéntica a la de KD1 y GZ3, cuyas secuencias se dan en la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 4, respectivamente. Se clonó el gen de ADP de Ad5 en el sitio PacI, después se introdujo en la región E3 del genoma del mutante E1A de Ad5 denominado dl01/07. Esto se realizó mediante cotransfección en células 293 de riñón embriónico humano del fragmento BamHIA anteriormente citado que contiene el gen de ADP junto con el fragmento de restricción EcoRIA superpuesto obtenido de dl01/07. Se forman genomas víricos completos en la célula mediante recombinación de superposición entre las secuencias de Ad en el fragmento BamHI en el plásmido y el fragmento EcoRIA. Se construyó KD3 de la misma manera, excepto porque se retuvo el gen de la proteína 12,5K de E3 en el plásmido de partida. Se preparó también un vector denominado KD2 que sobreexpresa marginalmente ADP. Se recogieron placas de cada Ad recombinante, se examinaron, se purificaron, se expandieron a soluciones madre con bandas de CsCl, se secuenciaron, se titularon y se caracterizaron. GZ1 y GZ3 son vectores de Ad que son idénticos a KD1 y KD3, respectivamente, excepto porque GZ1 y GZ3 tienen secuencias E1A de tipo silvestre como se encuentran en AD5 o en el mutante dl309 de Ad5. GZ1 y GZ3 se construyeron como se describe para KD1 y KD3, excepto porque se utilizó el fragmento EcoRIA de Ad5 para GZ1 y GZ3.

Se caracterizaron KD1 y KD3 en cultivo celular infectando la estirpe celular de carcinoma pulmonar A549 humana con una alta titulación (1-8 x 10^{10} unidades formadoras de placa [UFP] por ml) de soluciones madre víricas de uno de estos vectores recombinantes, o con uno de los virus control dl01/07, dl309, dl327 y Ad5 (wt). Se utilizaron 50 UFP por célula para cada virus. Se presentan las descripciones de estos virus, así como de algunos otros virus utilizados en estos ejemplos, en la Tabla 1.

TABLA 1

1

2

3

Utilizando un protocolo basado en la reacción en cadena con polimerasa (PCR), se introdujo un codón de terminación en fase en el gen de la proteína gp19K de E3 en la región E3 del mutante dl309 de Ad5 (Jones y Shenk, Cell 17: 683-689, 1979). Se realizó la mutagénesis utilizando un fragmento SunI-Bstl107I, nucleótidos 28.390 a 29.012 en el genoma de Ad5, que se sustituyó después por el fragmento equivalente en dl309. dl01/07 es el original de KD1 y KD3. A su vez, el mutante de Ad5 denominado dl309 es el original de dl01/07, concretamente dl309 es idéntico a dl01/07 excepto porque dl309 no tiene la mutación E1A. Tanto dl01/07 como dl309 tienen deleciones de los genes de las proteínas RID\alpha, RID\beta y 14,7K de E3, pero retienen el gen de ADP. El mutante dl327 de Ad5 tiene E1A de tipo silvestre, carece del gen de ADP y carece de cualquier otro gen de E3 excepto del de la proteína 12,5K.

A las 24 y 36 horas postinfección (h p.i.), se extrajeron las proteínas de las células A549 y se analizó la ADP mediante inmunotransferencia utilizando un antisuero de conejo contra ADP (Tollefson et al., J. Virol. 66: 3633-3642, 1992). Se muestran los resultados en la Figura 2. Se detectó mucha más ADP a las 24 y 36 h p.i. en células infectadas con KD1 y KD3 que en células infectadas con dl01/07. Además, se sintetizó mucha más ADP por GZ1 y GZ3 que por dl309 u otros virus. Lo más importante, KD1, KD3, GZ1 y GZ3 expresaron mucha más ADP a las 24 h p.i. que dl01/07 o dl309 (Fig. 2). Este resultado es consistente con la observación discutida a continuación de que las células infectadas con KD1, KD3, GZ1 o GZ3 se lisan más rápidamente, y que estos virus se propagan de célula a célula más rápidamente que dl01/07 o dl309. Resulta destacable que KD1, KD3, GZ1 y GZ3 expresan mucha más ADP a las 24 y 36 h p.i. que el mutante dl1520 de Ad5 (Fig. 2); dl1520 es el nombre original dado a ONYX-015 (Heise et al., Nature Medicine 3: 639-645, 1997). Como se esperaba, no se detectó ADP en células infectadas con pm734.1 (Fig. 2), un mutante que carece de los aminoácidos 1 a 48 en ADP (Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1996). La expresión de las proteínas de E1A por dl01/07, KD1, KD2 y KD3 fue ligeramente menor que por Ad5, dl309 o dl327, y como se esperaba por la deleción dl01/07, las proteínas fueron más pequeñas (Fig. 3A). dl327 es isogénico con dl324 (Thimmappaya et al., 1982, Cell 31: 543-51, 1983) y carece del gen de ADP y de todas las demás proteínas de E3 excepto la proteína 12,5K.

La cantidad de ADP detectada en las células infectadas con KD1 y KD3 es significativamente mayor que la cantidad detectada en células infectadas con dl309 (Fig. 2). Si se toma en consideración el hecho de que los virus con la mutación E1A se replican algo más lentamente, como evidencia la aparición retardada de las proteínas tardías (Fig. 3B), resulta evidente que KD1 y KD3 expresan mucha más ADP por genoma vírico presente en la célula que dl309. Este descubrimiento se apoya en el hecho de que cuando se coinfectan células A549 con un virus que contiene la mutación E1A y dl327, que carece de ADP pero que tiene E1A de tipo silvestre, las velocidades de replicación de los virus mutantes de E1A se aceleran, como se indica por la aparición anterior de proteínas tardías (comparar las Fig. 3B y 3D). Por tanto, dl327 complementa la mutación E1A. En conclusión, estos experimentos demuestran que la ADP se sobreexpresa drásticamente por KD1, KD3, GZ1 y GZ3. La ADP se sobreexpresa marginalmente por KD2 (no mostrado).

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra que KD1 y KD3 lisan células más rápidamente y se propagan de célula a célula más rápidamente que otros adenovirus.

Se examinó la capacidad de KD1 y KD3 de lisar células mediante un ensayo de viabilidad celular con exclusión con azul de tripano, que se realizó esencialmente como se describe por Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1996. Brevemente, se infectaron ficticiamente células A549 o se infectaron con 20 UFP/célula de KD1, KD3, dl01/07, dl327 o dl309. Se determinó el número de células viables a diversos días p.i. utilizando un hemocitómetro (se contaron de 600 a 1000 células por punto temporal) y se muestran los resultados en la Fig. 4.

Sólo un 25% de las células infectadas con KD1 y un 9% de las células infectadas con KD3 estaban vivas a los 5 días p.i. en comparación con un 44% de células infectadas con dl01/07, que tiene la misma mutación E1A que KD1 y KD3. Los vectores KD1 y KD3 lisaban también células más rápidamente que dl309, que tiene una región E1A de tipo silvestre. Cuando se infectaron con dl327 (ADP^{-}, E1A^{+}), un 94% de las células estaban vivas después de 5 días. Cuando se estimó la lisis celular mediante la liberación de lactato deshidrogenasa, KD1 y KD3 lisaron de nuevo las células más rápidamente que dl01/07 y dl307, y dl327 causó poca lisis celular (datos no mostrados). Por tanto, la ADP es necesaria para una lisis celular eficaz, y la sobreexpresión de ADP aumenta la velocidad de lisis celular.

Como otro medio para medir la lisis celular y para examinar la replicación vírica en células cancerosas, se infectaron grupos separados de células A549 con 20 UFP/célula de KD1, KD3, dl01/07 o dl309 y se determinó la cantidad de virus intracelular y extracelular mediante ensayo de placa en células A549. A los 2 días p.i., la cantidad total de virus formados en cada grupo fue similar, 2-4 x 10^{8} UFP/ml, indicando que la replicación de todos los virus es similar. Sin embargo, cuando se calculó la relación de virus extracelular a intracelular, el valor para KD1 y KD3 fue 2-3 órdenes de magnitud mayor que para Ad5, dl309 o dl01/07 (datos no mostrados). Por tanto, se libera virus mucho más rápidamente de células infectadas con KD1 y KD3, que sobreexpresan ADP, que con virus que expresan cantidades de tipo silvestre de ADP.

Se midió la capacidad de KD1 y KD3 de propagarse de célula a célula en un ensayo de "propagación celular". En este ensayo, se infectaron ficticiamente monocapas de células A549 en un disco de cultivo de 48 pocillos o se infectaron con 10^{-3}, 10^{-2}, 10^{-1}, 10^{0} ó 10 UFP/célula de dl327, dl309, Ad5, dl01/07, KD1 o KD3. A bajas UFP/célula, los virus deben pasar por dos o tres rondas de replicación para infectar cada célula en la monocapa. A 1,0 y 10 UFP/célula, la monocapa debería destruirse por el virus que infectó inicialmente las células. Para evaluar la cantidad de propagación en las monocapas a los 7 días p.i., se añadió a las monocapas violeta cristal, que tiñe células vivas pero no células muertas. Se muestran los resultados en la Fig. 5.

Notablemente, a los 7 días p.i., la monocapa se eliminó virtualmente por KD1 y KD3 a 10^{-3} UFP/célula, mientras que se requirió 1,0 UFP/célula con dl01/07, dl309 y Ad5. Este resultando atestigua la potencia de la ADP en la mediación de la lisis celular y la propagación vírica en células A549. KD1 y KD3 son también más eficaces que dl01/07 para destruir otros tipos de estirpes celulares cancerosas (adquiridas la mayoría en la American Type Culture Collection [ATCC]) como se determina en este ensayo de propagación celular. KD1 y/o KD3 destruyeron células HeLa (carcinoma cervical), DU145 (próstata) y pC3 (próstata) a 10^{-2} UFP/célula, ME-180 (cuello de la matriz) y Hep 3B (hígado) a 10^{-1} UFP/célula, y U118 (glioblastoma) y U373 (glioblastoma) a 10 UFP/célula. Se requirió de 10 a 100 veces más dl01/07 para destruir estas células (datos no mostrados). Estos resultados indican que KD1 y KD3 pueden ser eficaces contra muchos tipos de cáncer.

Un aspecto importante del descubrimiento de que los vectores que sobreexpresan ADP lisan células a multiplicidades de infección muy bajas es que la multiplicidad de infección en tumores humanos es probable que sea baja en sitios distales del sitio de inyección del vector o distales de los vasos sanguíneos que portan el vector al tumor. Por tanto, los vectores que sobreexpresan ADP tienen una ventaja frente a los vectores que expresan menos ADP o nada de ADP.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra que KD1 y KD3 se replican mal en células no cancerosas no en crecimiento. El fenotipo de replicación de KD1 y KD3 se evaluó utilizando células de fibroblasto humano HEL-299 "normales", que crecen en suero al 10% o que se vuelven quiescentes utilizando suero al 0,1%. Todos los Ad deberían replicarse bien en células en crecimiento, pero los virus con la mutación dl01/07 E1A deberían replicarse mal en células quiescentes debido a que E1A es necesaria para conducirlas a G_{0}. dl309, que tiene E1A de tipo silvestre, debería replicarse bien tanto en células en crecimiento como de crecimiento detenido.

Se infectaron las células con 100 UFP/célula de KD1, KD3, dl01/07 o dl309. Se extrajo el virus a diferentes días p.i. y se tituló. En suero al 10%, KD1, KD3 y dl01/07 se replicaron bien, alcanzando titulaciones de 10^{6}-10^{7} UFP/ml, sólo ligeramente menores que dl309 (Fig. 6). Sin embargo, en células quiescentes, la replicación de KD1, KD3 y dl01/07 fue 1,5-2 órdenes de magnitud menor que en células en crecimiento, en el intervalo de 10^{4} a 2 x 10^{5} UFP/ml. La titulación de dl309 alcanzó 10^{7} UFP/ml, casi el nivel alcanzado en células en crecimiento. A los 10 días p.i., las monocapas de células HEL-299 quiescentes infectadas con 100 UFP/célula de KD1, KD3 o dl01/07 estaban intactas, mientras que aquellas infectadas con dl309 o dl327, que tienen E1A de tipo silvestre, mostraron un efecto citopático fuerte típico de Ad indicativo de muerte celular (datos no mostrados). Por tanto, la replicación de KD1 y KD3 está rigurosamente limitada a estirpes celulares en crecimiento.

La restricción asociada a la mutación dl01/07 E1A se ensayó también en células humanas primarias (adquiridas en Clonetics) en crecimiento en forma de monocapas. Las células epiteliales bronquiales (Fig. 7) y células epiteliales pequeñas de las vías respiratorias no se destruyeron por 10 UFP/célula de KD1, KD3 o dl01/07 a los 5 días p.i., mientras que se destruyeron por 10 UFP/célula de dl309 o dl327 (datos no mostrados). Las células endoteliales pulmonares no se destruyeron tampoco después de 10 días por KD1, KD3 o dl01/07 a 10 UFP/célula, pero se destruyeron por 1 UFP/célula de dl309. Estas monocapas eran subconfluentes cuando se infectaron inicialmente, después crecieron hasta confluencia. El resultado interesante aquí es que aunque estas células primarias estaban en crecimiento, no soportaban la replicación en este marco temporal y no se destruyeron por KD1 ni KD3. Por tanto, se cree que estos vectores se limitarán a células cancerosas y tendrán poco o ningún efecto sobre células tales como células basales que se dividen normalmente en el cuerpo. Además, es improbable que KD1 y KD3 afecten a leucocitos en división porque dichas células se infectan mal por Ad.

En resumen, los experimentos anteriores demuestran que KD1 y KD3 lisan células cancerosas, se propagan de célula a célula rápidamente y se replican mal en células quiescentes y no cancerosas. Estas propiedades deberían hacerlos útiles en terapia anticancerosa.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra que KD1 y KD3 inhiben el crecimiento de tumores humanos en un modelo animal.

Los inventores no pudieron evaluar tumores de ratón o rata en ratones o ratas normales porque son totalmente no permisivos. Se han utilizado estirpes celulares cancerosas humanas en crecimiento en ratones desnudos por Onyx Pharmaceuticals (Richmond, CA) para evaluar la eficacia de ONYX-015, un vector de Ad que carece de la expresión de la proteína de 55 kDa de E1B (Heise et al., Nature Med. 3: 639-645, 1997). Han encontrado que las células A549, que se utilizaron en muchos de sus estudios de cultivo celular, forman tumores sólidos excelentes de crecimiento rápido cuando se inyectan por vía subcutánea a ratones desnudos. El tumor promedio alcanza aproximadamente 500 \mul en cuatro semanas, y está encapsulado, vascularizado y unido a la piel (habitualmente) o músculo del ratón.

Se inocularon ratones desnudos en cada costado trasero con 2 x 10^{7} células A549. Después de 1 semana, se habían formado tumores en un intervalo de tamaño de 20 \mul a 50 \mul. Se inyectaron los tumores individuales tres días después, y en semanas posteriores durante 4 semanas (total de 5 inyecciones) con 50 \mul de tampón o 50 \mul de tampón que contiene 5 x 10^{7} UFP de dl309, dl01/07, KD1, KD3 o pm734.1, con una dosis vírica total por tumor de 3 x 10^{8} UFP. El mutante pm734.1 carece de actividad ADP debido a dos mutaciones sin sentido en el gen de ADP, pero todas las demás proteínas de Ad se espera que se sinteticen a niveles de tipo silvestre (Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1996). Se ensayó la eficacia de cada virus (o tampón) sobre seis tumores. Se midieron a intervalos semanales la longitud (L) y anchura (A) de los tumores utilizando un calibre digital Mitutoyo. Se calcularon los volúmenes de tumor multiplicando L x A x A/2. Se dividió este valor entre el volumen de tumor en el momento de inyección inicial del virus, se calculó el aumento en veces del crecimiento del tumor y se representó el promedio para los seis tumores.

Como se muestra en la Fig. 8A, los tumores que recibieron tampón siguieron creciendo, aumentando aproximadamente 14 veces en 5 semanas. En contraposición, los tumores inyectados con dl309, que expresa cantidades normales de ADP y carecen de las proteínas RID y 14,7K de E3, crecieron sólo aproximadamente 2,5 veces en 5 semanas. Con pm734.1, que carece de ADP, los tumores crecieron tan bien como aquellos que recibieron tampón. Por tanto, dl309 redujo notablemente la velocidad de crecimiento del tumor, y la ADP es necesaria para esta reducción. Los tumores inoculados con dl01/07 crecieron aproximadamente 8 veces en 5 semanas. Puesto que dl01/07 es idéntico a dl309 excepto por la mutación E1A, este resultado indica que la mutación E1A reduce significativamente la capacidad del Ad de evitar el crecimiento de tumores. Este efecto es debido probablemente a una reducción de la replicación vírica en los tumores como resultado de una menor expresión de ADP, pero podría reflejar también otras propiedades de E1A en células tumorales, por ejemplo la incapacidad de las proteínas del mutante E1A de inducir la apoptosis. Lo más importante, los tumores inoculados con KD1 o KD3 crecieron sólo aproximadamente 2,5 veces. Por tanto, la sobreexpresión de ADP por KD1 y KD3 permite que KD1 y KD3 reduzcan el crecimiento tumoral a una velocidad notablemente más lenta que dl01/07 (su virus control original), e incluso a una velocidad similar a la de dl309.

El descubrimiento de que KD1 y KD3 son tan eficaces como el Ad de tipo silvestre (concretamente dl309) en la reducción de la velocidad de crecimiento del tumor de A549 es altamente significativo en el contexto del tratamiento del cáncer, ya que KD1 y KD3 están limitados a células cancerosas mientras que el Ad de tipo silvestre no tiene dicha limitación.

Los tumores en la Fig. 8A recibieron cinco inyecciones de vectores, pero sólo una dosis de vector, en este caso de 5 x 10^{8} de cada uno de KD3 o GZ3, es suficiente para reducir significativamente la velocidad de crecimiento del tumor de A549 (Fig. 8B).

Los inventores han encontrado también que KD1 y KD3 reducen la velocidad de crecimiento en ratones desnudos de una estirpe celular de cáncer de hígado humano, células Hep 3B. Estas células forman tumores de crecimiento rápido que están altamente vascularizados. Se inocularon ratones desnudos en cada costado trasero con 1 x 10^{7} células Hep 3B. Después de que los tumores alcanzaran aproximadamente 100 \mul, se inyectaron dos veces por semana durante 3 semanas con 50 \mul de tampón o 5 x 10^{7} UFP de KD1, KD3 o dl309. Había típicamente 8-10 tumores por virus de ensayo. Se midieron los tamaños de tumor y se representó el aumento en veces del tamaño de 0 a 3,5 después de la inyección inicial de virus como se describe anteriormente para los tumores de A549. Los tumores que recibieron tampón solo crecieron 9 veces en 3 semanas, y se extrapoló que crecerían aproximadamente 12 veces en 3,5 semanas (después de 3 semanas, los ratones tuvieron que sacrificarse porque los tumores se estaban haciendo demasiado grandes) (Fig. 9). Los tumores que recibieron KD1 o KD3 crecieron aproximadamente 4 veces, estableciendo que KD1 y KD3 reducen el crecimiento de tumores Hep 3B en ratones desnudos. Los tumores que se inyectaron con dl309 crecieron 2 veces (Fig. 9). El descubrimiento de que KD1 y KD3 eran algo menos eficaces que dl309 es probablemente debido a que no crecen tan bien como dl309 en células Hep 3B, como indica un ensayo de propagación celular en cultivo (datos no mostrados). En cualquier caso, los puntos importantes son que KD1 y KD3 son eficaces frente a tumores Hep 3B, y que pueden contener la mutación E1A que limita su replicación a células cancerosas.

Estos resultados apuntan a la potencia de la ADP como agente antitumoral cuando se expresa en un vector de Ad. Es altamente probable que KD1 y KD3 proporcionen un beneficio clínico significativo cuando se utilicen para infectar tumores que crecen en seres humanos.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra el uso de vectores de Ad defectuosos de replicación en combinación con KD1 o KD3.

Está bien establecido que los virus competentes de replicación (CR) complementan los mutantes defectuosos de replicación (DR). Es decir, cuando se infecta la misma célula, el virus competente suministrará la(s) proteína(s) que no puede(n) prepararse por el genoma mutante, y ambos virus crecerán. Para ensayar la capacidad de KD1 y KD3 de complementar los virus DR, se construyeron dos vectores DR que expresaban \beta-galactosidasa. El primero, denominado Ad-\beta-gal, tiene un ADNc que codifica \beta-gal bajo el control del promotor del virus del sarcoma de Rous que sustituye a la región E1 eliminada. Ad-\beta-gal tiene también la región E3 eliminada, incluyendo el gen de ADP. El segundo, denominado Ad-\beta-gal/FasL, es idéntico a Ad-\beta-gal excepto porque expresa también FasL de múrido del promotor/potenciador de citomegalovirus humano. Estos vectores se construyeron mediante recombinación de superposición en células 293 humanas que expresan constitutivamente los genes E1A y E1B de Ad y complementan la replicación de los vectores E1-.

Estos vectores DR deberían infectar y expresar \beta-gal en células A549, pero no deberían replicarse porque carecen de las proteínas de E1A. Sin embargo, los vectores deberían replicarse cuando las células se coinfectan con Ad CR. Para probar esto, se infectaron células A549 con 10 UFP/célula de Ad-\beta-gal solo, o con 10 UFP/célula de Ad-\beta-gal más 10 UFP/célula de KD1, KD3, dl01/07, dl309 o dl327. A los 2 días p.i., se extrajo el virus y se determinaron las titulaciones de Ad-\beta-gal mediante la expresión de \beta-gal en células A549. Se muestran los rendimientos en la tabla 2 a continuación.

TABLA 2

Virus	Rendimiento (placas azules por ml)
Ad-\beta-gal	1 x 10^{2}
Ad-\beta-gal + KD1	2 x 10^{5}
Ad-\beta-gal + KD3	3 x 10^{5}
Ad-\beta-gal + dl01/07	4 x 10^{4}
Ad-\beta-gal + dl309	3 x 10^{5}
Ad-\beta-gal + dl327	3,0 x 10^{5}

Los datos en la Tabla 2 indican que los virus complementarios aumentaron el rendimiento de Ad-\beta-gal en aproximadamente 10^{3}.

Un rasgo clave de KD1 y KD3 es que se propagan de célula a célula más rápidamente que otros Ad. En consecuencia, deberían complementar la propagación de Ad-\beta-gal. Para ensayar esto, se realizó un ensayo de centro infeccioso. Se infectaron células A549 con Ad-\beta-gal más KD1, KD3 o dl01/07. Después de 2 h, se recogieron las células, se diluyeron y se sembraron en monocapas de células A549 frescas. Después de 4 días, se tiñeron las células con X-gal y se muestran los resultados en la Fig. 10.

Con Ad-\beta-gal solo, sólo la célula infectada originalmente (antes del sembrado) debería teñirse, y el vector no debería propagarse a otras células en la monocapa sembrada. Este fue de hecho el caso. Las monocapas sembradas con células A549 infectadas con Ad-\beta-gal solo (disco mostrado en la parte superior izquierda de la Fig. 10A) contenían una serie de células azules individuales (no visibles en la impresión); se muestran los ejemplos en la vista aumentada de la Fig. 10B. Sin embargo, cuando se sembraron las monocapas con células A549 coinfectadas con Ad-\beta-gal y KD1 o KD3, había numerosas "cometas" de células azules (Fig. 10A). Cada cometa representa Ad-\beta-gal que se ha propagado desde una célula infectada inicialmente. La mayoría de las células en un cometa se tiñeron con X-gal (Fig. 10C). Se observaron también cometas con dl01/07, pero no en la medida de KD1 y KF3 (Fig. 10A). Con dl327 (ADP^{-}), hubo poca propagación desde la célula infectada originalmente (datos no mostrados). En resumen, KD1 y KD3 no sólo complementan la replicación de Ad-\beta-gal, sino que también potencian su rápida propagación.

Se espera que KD1 y KD3 complementarán y potenciarán también la propagación de vectores DR que expresan productos génicos terapéuticos anticancerosos, y esta expectativa puede verificarse fácilmente utilizando Ad-\beta-gal/FasL en ensayos de replicación y de centro infeccioso como se describen anteriormente.

KD1 y KD3 no sólo complementan la replicación de vectores DR en cultivo celular, sino que lo hacen también en tumores Hep 3B en crecimiento en los costados traseros de ratones desnudos. El vector DR utilizado fue AdLuc, un Ad que carece de las regiones E1 y E3, y tiene insertado en la región E1 un módulo de expresión en el que se expresa el gen de luciferasa de luciérnaga a partir del promotor del virus del sarcoma de Rous (Harrod et al., Human Gene Therapy 9: 1885-1898, 1998). Los tumores Hep 3B se inyectaron con 1 x 10^{7} UFP de AdLuc más tampón, o 1 x 10^{7} UFP de AdLuc más 5 x 10^{7} UFP de KD1, KD3, dl01/07 o dl309. Después de 2 semanas, se sacrificaron los ratones y se extirparon los tumores. Se extrajeron las proteínas de los tumores y se determinó la actividad luciferasa utilizando un luminómetro. Las cuentas de luciferasa por tumor fueron 6.800 para AdLuc más tampón, 113.500 para KD1 y 146.900 para KD3 (Fig. 11). Por tanto, KD3 y KD1 causaron respectivamente un aumento de 22 y 17 veces de la actividad luciferasa. Este aumento podría ser debido a la elevada síntesis de luciferasa en las células que se coinfectaron inicialmente con AdLuc y KD1 o KD3, y podría ser debido también a la propagación de AdLuc de célula a célula en el tumor, mediada por KD1 o KD3.

En resumen, infectar un tumor con un vector que sobreexpresa ADP competente de replicación según la invención junto con un vector DR que expresa un producto génico anticanceroso debería aumentar en gran medida la cantidad de proteína anticancerosa sintetizada en el tumor, aumentando así la capacidad del vector defectuoso de replicación de promover la destrucción del tumor.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la construcción y caracterización de un vector de Ad recombinante según la invención, que está limitado de replicación a células alveolares de tipo II cancerosas.

Como se demuestra anteriormente, la mutación dl01/07 en KD1 y KD3 limita el crecimiento de estos vectores a células cancerosas. Para limitar adicionalmente su fenotipo de replicación, se eliminó el promotor E4 en cada virus y se reemplazó por el promotor de proteína tensioactiva B (SPB) para producir los vectores denominados KD1-SPB (SEC ID Nº 14), KD3-SPB (SEC Nº ID 15) y dl01/07-SPB (SEC ID Nº 16). El promotor SPB es sólo activo en células que contienen el factor de transcripción TTF1, que se ha encontrado hasta ahora principalmente en células alveolares de tipo II de pulmón humano (Lazzaro et al., Development 113: 1093-1104, 1991). Por tanto, KD1-SPB, KD3-SPB y dl01/07-SPB deberían estar rigurosamente limitados a células alveolares de tipo II cancerosas de pulmón humano. Muchos cánceres de pulmón son de este tipo.

Los vectores KD1-SPB y KD3-SPB se prepararon de la manera siguiente. El promotor E4 se localiza en el extremo derecho del genoma de Ad (Fig. 1). Utilizando un plásmido basado en pCRII (Invitrogen) que contiene las secuencias de ADN de Ad5 del sitio BamHI (59 unidades de mapa) en el extremo derecho del genoma, y utilizando un protocolo basado en PCR, se eliminaron casi todos los sitios de unión a factores de transcripción de los pares de bases 35.623 a 35.775 de Ad5 desde el promotor E4, y se reemplazaron por un fragmento de 500 pares de bases que contiene el promotor SPB (Yan et al., J. Biol. Chem. 270: 24852-24857, 1995). Los plásmidos finales contienen la sustitución E4-SPB en la región E4 y las versiones dl01/07, KD1 o KD3 de la región E3, respectivamente, para los virus dl01/07-SPB, KD1-SPB y KD3-SPB. Estos plásmidos se cotransfectaron en células 293 con un fragmento que contenía la porción izquierda del genoma de dl01/07, y se dejaron desarrollar las placas. Se examinaron en las placas los rasgos esperados, se purificaron y después se expandieron a una solución madre.

Se desarrolló la estirpe celular A549-TTF1 para ensayar la predicción de que la replicación de dl01/07-SPB, KD1-SPB y KD3-SPB se limitaría a células cancerosas que expresaran el factor de transcripción TTF1. Estas células se cotransfectaron con dos plásmidos, uno en el que TTF1 se expresa a partir del promotor CMV, y otro que codifica la resistencia a la neomicina. Se aislaron los clones resistentes y se mostró que expresan la actividad TTF1, como se determina mediante transfección transitoria con un plásmido que expresa cloranfenicol transferasa a partir del promotor de proteína C tensioactiva que requiere TTF1.

Se sometieron KD1-SPB y KD1 a un ensayo de desarrollo de placa estándar en células A549-TTF1 y células A549 originales. Se muestran los resultados en la Fig. 12. Con KD1-SPB en células A549, no fueron visibles placas después de 8 días, se observaron sólo aproximadamente un 4% del número final de placas después de 10 días, y se observaron aproximadamente un 50% de las placas finales después de 12 días. Con KD1-SPB en células A549-TTF1, fueron visibles placas después de 6 días, y se observaron aproximadamente un 60% de las placas después de 10 días. Por tanto, como se esperaba, KD1-SPB creció significativamente más rápidamente en las células que contenían TTF1. KD1 formó placas más rápidamente que KD1-SPB tanto en células A549 como A549-TTF1, indicando que la sustitución por el promotor E4-SPB no es tan eficaz como el promotor E4 de tipo silvestre en la inducción de la replicación de Ad. Sin embargo, esta diferencia entre KD1-SPB y KD1 en células A549-TTF1 es tolerable, retardándose sólo KD1-SPB aproximadamente 1 día. Curiosamente, la titulación final obtenida para todas las soluciones madres de virus el día 16 fue similar, indicando que las células A549 pueden contener una cantidad muy pequeña de actividad TTF1 endógena. Se predice que KD3-SPB y dl01/07-SPB se comportarán de forma similar a KD1-SPB cuando crezcan en células A549-TTF1 y células A549.

La restricción de KD1-SPB a células que contienen TTF1 se examinó adicionalmente en un ensayo de propagación celular utilizando células H441, una estirpe celular de adenocarcinoma pulmonar humano que expresa TTF1 (Yan et al., supra) y células Hep 3B, una estirpe celular de cáncer de hígado que no se espera que exprese TTF1. Se infectaron pocillos de disco de cultivo que contenían células H441 o Hep 3B con KD1-SPB o KD1 a multiplicidades en el intervalo de 10 a 10^{-4} UFP/célula. Las células H441 y Hep 3B se tiñeron con violeta cristal a los 5 días y 8 días p.i., respectivamente. KD1-SPB y KD1 crecieron y se propagaron igualmente bien en células H441, causando la destrucción de la monocapa a 10^{-1} UFP por célula (Fig. 13). (Algunas de las monocapas de H441 se han separado por pelado del pocillo con KD1-SPB a 10^{-2} UFP por célula, y en los pocillos con KD1 y KD1-SPB a 10^{-4} UFP por pocillo; esto ocurre ocasionalmente en ensayos de propagación celular, y no refleja infección vírica). Con células Hep 3B, KD1 creció y se propagó mucho mejor que KD1-SPB, causando 10^{-2} UFP por célula de KD1 más destrucción de la monocapa que 1,0 UFP por célula de KD1-SPB (Fig. 13).

En resumen, el ejemplo demuestra que puede construirse un Ad competente de replicación que se replica bien en células que expresan el factor de transcripción apropiado, con un promotor específico de tejido sustituido en lugar del promotor E4. Esta metodología debería ser aplicable a muchos otros promotores específicos de tejido y específicos de tipo de célula. Una posibilidad sería un promotor específico de hígado. Otra posibilidad sería el uso del promotor E2F u otro promotor con sitios E2F, puesto que este promotor sería activo sólo en células tales como células cancerosas que tienen E2F libre. Una tercera posibilidad sería el uso de un promotor regulable, por ejemplo el promotor de respuesta a tetraciclina (Massie et al., J. Virol. 72: 2289-2296, 1998), en el que la actividad del promotor está controlada por el nivel de tetraciclina o un análogo de tetraciclina en el paciente.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la construcción y caracterización de vectores que sobreexpresan ADP y no están limitados de replicación.

Como se demostró anteriormente, la mutación dl01/07 E1A en KD1 y KD3 es atenuante, inhibiendo el crecimiento en células epiteliales y endoteliales primarias humanas no en división e incluso en división. Los Ad con esta mutación son capaces de replicarse bien en células cancerosas en división. Sin embargo, la replicación de dichos mutantes E1A no es tan eficaz como, por ejemplo, dl309, que tiene un gen E1A de tipo silvestre. Por ejemplo, la velocidad de replicación de dl01/07, como se determina mediante la velocidad a la que se desarrollan las placas, se reduce de tal manera que las placas de dl01/07 aparecen sólo un día después que las de dl309 (datos no mostrados). Este retardo es debido en parte a un retardo en la expresión de los genes tardíos de Ad (véase la Fig. 3). La idea de que la mutación dl01/07 retarda la velocidad de replicación en células A549 es apoyada adicionalmente por los datos de la Fig. 8A, en la que dl01/07 no evitó el crecimiento tumoral casi como dl309. A pesar de este efecto negativo de la mutación dl01/07 E1A, existen aspectos teóricos y prácticos para tener esta mutación en los vectores KD1 y KD3, como se ha discutido. Sin embargo, uno puede imaginar fácilmente situaciones (por ejemplo pacientes con cáncer terminal) en las que la capacidad de un vector Ad de destruir el tumor supere el requisito de que el vector esté totalmente limitado a células tumorales. En dichos casos, sería ventajoso tener vectores similares a KD1 y KD3, pero con el gen E1A de tipo silvestre. Las velocidades a las que dichos vectores expresan sus genes, lisan células y se propagan de célula a célula deberían ser mayores que las de KD1 y KD3. Dichos vectores podrían causar cierto daño a células y tejidos no cancerosos, pero esto es también cierto para otros modelos de tratamiento anticanceroso tales como cirugía, quimioterapia y terapia de radiación.

A la vista de estas consideraciones, se han construido los vectores denominados GZ1 y GZ3, que son idénticos a KD1 y KD3, respectivamente, excepto porque tienen una región E1A de tipo silvestre. Estos vectores se construyeron mediante recombinación de superposición en células A549. El fragmento a la izquierda contenía la región E1A de tipo silvestre de Ad5, y el fragmento del extremo derecho contenía las modificaciones en E3 de KD1 o KD3. Se recogieron las placas, se analizó el genotipo esperado, se purificaron en placa y se expandieron a soluciones madre con bandas de CsCl. Las titulaciones de estas soluciones madre en células A549 fueron 2,9 x 10^{10} UFP/ml para GZ1 y 1,6 x 10^{11} UFP/ml para GZ3. Por tanto, estos vectores pueden crecer en soluciones madre de alta titulación comparables al Ad de tipo silvestre. Las placas de GZ1 y GZ3 son mayores y aparecen mucho antes que las placas de dl309. Las grandes placas de aparición rápida reflejan la capacidad del Ad de lisar células y propagarse de célula a célula (Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1996; Tollefson et al., Virology 220: 152-162, 1996), y esta propiedad, como se ha discutido, es debida a la función de la ADP.

La velocidad de aparición de placa puede cuantificarse en un ensayo de desarrollo de placa (Tollefson et al., supra). Aquí, se realiza un ensayo de placa típico, y se calculan las placas observadas los días posteriores del ensayo como un porcentaje del número de placas observadas al final del ensayo de placa. Como se muestra en la Fig. 14, después de 4 días de ensayo de placa en células A549, GZ1 y GZ3 tenían, respectivamente, un 48% y un 34% del número final de placas, mientras que dl309 tenía sólo un 1%. Es muy infrecuente en ensayos de placa de Ad en células A549 que las placas aparezcan después de sólo 4 días. Estas grandes placas reflejan la sobreexpresión de ADP. Estas placas de GZ1 y GZ3 aparecen antes que las de KD1 y KD3 (datos no mostrados) sin duda porque GZ1 y GZ3 se replican más rápidamente debido a que tienen una región E1A de tipo silvestre.

GZ1 y GZ3 lisan células y se propagan de célula a célula mucho más eficazmente que dl309. A los 6 días p.i. de células A549, se observó aproximadamente tanta destrucción de monocapa con GZ1 y GZ3 a 10^{-3} UFP como se observó con dl309 a 10^{-1} UFP por célula (Fig. 15, panel superior). Este resultado subraya adicionalmente la conclusión de que la sobreexpresión de ADP promueve la lisis celular y la propagación vírica.

En teoría, GZ1 y GZ3 deberían ser capaces de replicarse no sólo en células tumorales sino también en células normales. Aunque pueden replicarse en células normales, es bastante posible que GZ1 y GZ3 puedan ser útiles como vectores anticancerosos. En primer lugar, GZ1 y GZ3 podrían inyectarse directamente al tumor. Muchos tumores son autocontenidos (encapsulados) excepto por el suministro sanguíneo. Las barreras físicas del tumor podrían minimizar la diseminación de virus a otros tejidos. En segundo lugar, los Ad son en general bastante benignos. La mayoría de las infecciones por Ad5 son en niños y dan como resultado una enfermedad moderada o asintomática, y se contienen mediante una fuerte inmunidad humoral y celular. La inmunidad anti-Ad parece durar toda la vida. GZ1 y GZ3 podrían utilizarse sólo en pacientes que tengan un sistema inmune intacto, y quizás también con inmunidad anti-Ad preexistente. Además, los pacientes podrían inmunizarse pasivamente frente a Ad utilizando gammaglobulina o incluso anticuerpos neutralizantes anti-Ad purificados específicos. En tercer lugar, considerando que Ad5 es un virus respiratorio que infecta lo más eficazmente células epiteliales pulmonares que presentan el receptor específico de Ad5 (denominado CAR), así como integrinas específicas (por ejemplo a_{v} b5), los vectores competentes de replicación derivados de Ad5 pueden no propagarse eficazmente en muchos tejidos no cancerosos del cuerpo. Además, se cree que pueden construirse versiones de GZ1 y GZ3 que tienen el promotor de E4 sustituido por un promotor específico de tumor, específico de tejido, específico de célula o sintético. Dichos vectores tendrían los rasgos positivos asociados a E1A de tipo silvestre y ADP, y también estarían limitados de replicación a tejido tumoral y/o a tipos celulares particulares.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra que la combinación de KD1, KD3, GZ1 o GZ3 con radiación es más eficaz en la destrucción de células A549, en crecimiento en cultivo o en crecimiento en forma de tumores en ratones desnudos, que los vectores solos o la radiación sola.

Esto se mostró en un ensayo de propagación celular. Se infectaron ficticiamente células A549 en crecimiento en tres discos de cultivo de 48 pocillos o se infectaron con diferentes virus a multiplicidades de infección en el intervalo de 10 a 10^{-4} UFP por célula como se indica en la Fig. 15. Un disco no se irradió. Un segundo disco recibió 600 centigreys (cGy) de radiación a las 24 h p.i., y un tercer disco recibió 2000 cGy de radiación al mismo tiempo. Se tiñeron todos los discos con violeta cristal a los 6 días p.i. Con las células que no se irradiaron (panel superior en la Fig. 15), KD1 y KD3 causaron la destrucción de la monocapa a multiplicidades de infección menores que su control original, dl01/07. Esto fue también cierto para GZ1 y GZ3 comparados con su control original dl309. (La escasez de células en las células infectadas con GZ1 o GZ3 a 10^{-4} UFP es un artefacto experimental, y no está causada por la infección por GZ1 o GZ3). Estos resultados de KD1, KD3, GZ1 y GZ3 son consistentes con los resultados anteriores que muestran que la sobreexpresión de ADP conduce a lisis celular y propagación vírica aumentadas.

Con el disco que se infectó y después se irradió con 600 cGy, hubo una destrucción celular y propagación vírica notablemente aumentadas en comparación con las células no irradiadas (comparar el panel inferior de la Fig. 15 con el panel superior). Por ejemplo, con KD1, KD3, GZ1 y GZ3 había aproximadamente la misma cantidad de destrucción celular en los pocillos irradiados a 10^{-4} UFP por célula que en los pocillos no irradiados a 10^{-2} UFP por célula. Se observaron resultados similares con el disco que recibió 2000 cGy de radiación (datos no mostrados), y también con discos que recibieron 600 ó 2000 cGy de radiación 24 h antes de la infección (datos no mostrados).

Se cuantificó la cantidad de destrucción celular extrayendo el violeta cristal de las células con ácido acético al 33%, y midiendo después la absorbancia a 490 nm (datos no mostrados). Se fijó la absorbancia con células infectadas ficticiamente no irradiadas a un 100% de viabilidad celular. Con células infectadas ficticiamente que recibieron 600 cGy, hubo un 15% de pérdida de viabilidad (concretamente se extrajo un 15% menos de violeta cristal). Con KD1 a 10^{-3} UFP por célula, las células no irradiadas fueron un 80% viables, mientras que las células que recibieron 600 cGy de radiación fueron sólo aproximadamente un 30% viables. Se observaron diferencias similares en la viabilidad entre células irradiadas y no irradiadas con KD3, GZ1 y GZ3. Estos resultados indican que la combinación de radiación más vector tiene un efecto sinérgico sobre la lisis celular y la propagación del vector, en lugar de un efecto aditivo. Si el efecto fuera sólo aditivo, entonces con las muestras de KD1 a 10^{-3} UFP por célula la viabilidad celular debería haber sido de un 65% (15% de reducción de la viabilidad debido a la radiación sola, 20% de reducción debida al KD1 solo). De hecho, la viabilidad celular fue de un 30% en lugar de un 65%.

Como se ha citado, se observaron aproximadamente la misma lisis celular y propagación vírica con 600 cGy que con 2000 cGy. Para determinar la dosis óptima de radiación para sinergia con los vectores, se realizó un experimento similar al descrito anteriormente con células A549 infectadas ficticiamente, o con dl01/07, KD1, KD3, dl309, GZ1 o GZ3. Las placas de 48 pocillos recibieron 0, 150, 300 ó 600 cGy de radiación a las 24 h p.i. Se tiñeron las células con violeta cristal. Los resultados con células que recibieron 0 frente a 600 cGy de radiación fueron similares a los de la Fig. 15. El violeta cristal se extrajo de las células infectadas con 10^{-3} UFP por célula de los diferentes virus. Se determinó la absorbancia del violeta cristal, y se representó el porcentaje de viabilidad celular utilizando la absorbancia de las células infectadas ficticiamente no irradiadas como un 100% de viabilidad celular. Como se ilustra en la Fig. 16, se obtuvo una reducción aproximadamente lineal de la viabilidad celular en todos los pocillos al aumentar la dosis de radiación, aunque la pendiente de la curva era más negativa con KD1, KD3, GZ1 o GZ3 que con inf. ficticia, dl01/07 o dl309. Con KD1, KD3, GZ1 y GZ3, había mucha más lisis celular y propagación del vector que con sus virus control originales, y había una sinergia entre vectores e radiación. Por ejemplo, con células infectadas ficticiamente, 600 cGy redujeron la viabilidad celular en aproximadamente un 30% (fueron viables un 70% de las células). El KD1 sin radiación redujo la viabilidad celular en aproximadamente un 23%. La combinación de 600 cGy de radiación más KD1 redujo la viabilidad celular en aproximadamente un 85%, más de un 53% de la cual es la suma de la radiación sola y KD1 solo. Cuando se consideran los datos en las Fig. 15 y 16 conjuntamente, es óptima una dosis de aproximadamente 600 cGy en este tipo de experimento de cultivo celular.

La combinación de KD3 o GZ3 con radiación se examinó también en el modelo de ratón desnudo con tumor A549 (véase el ejemplo 4). Se inyectaron células A459 en los costados traseros de ratones desnudos y se dejaron formar tumores. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 50 \mul, se inyectaron con tampón o con 5 x 10^{8} UFP de KD3 o GZ3. Se inyectaron de 8 a 10 tumores por condición de ensayo. El día 1 p.i., la mitad de los ratones recibieron 600 cGy de radiación corporal completa. Se midió el tamaño del tumor frente al tiempo, y se representó como el aumento en veces del tamaño del tumor frente a los días p.i. (como se describe en el ejemplo 4). Como se muestra en la Fig. 17, los tumores inyectados con tampón no irradiados crecieron más rápidamente que los inyectados con KD3 o GZ3. Los tumores que recibieron la combinación de KD3 e radiación no crecieron, y aquellos que recibieron la combinación de GZ3 e radiación se redujeron en tamaño después de 14 días. Estos resultados indican que la combinación de KD3 más radiación o GZ3 más radiación es más eficaz que cualquier vector solo o radiación sola en la reducción de la velocidad de crecimiento del tumor de A549 en ratones desnudos. Es probable que la radiación aumente la eficacia en el tratamiento de tumores de KD1 y GZ1, o incluso de cualquier otro vector Ad competente de replicación o defectuoso de replicación.

El mecanismo mediante el que la radiación causa que los vectores que sobreexpresan ADP lisen células y se propaguen de célula a célula más eficazmente no es comprendido. Se espera que la radiación induzca mecanismos de reparación del ADN celular, y que pueda permitir una síntesis más eficaz de ADN de Ad. La radiación puede potenciar la función de la ADP. La ADP probablemente funciona interaccionando con una o más proteínas celulares, y la radiación puede afectar a esta(s) proteína(s) de tal modo que la ADP funcione más eficazmente.

Se cree que KD1, KD3, GZ1 o GZ3 o cualquier otro vector Ad competente de replicación, cuando se utiliza en combinación con radiación será más eficaz que el vector solo o la radiación sola para proporcionar beneficio clínico a pacientes con cáncer. Los vectores deberían permitir más destrucción tumoral con una cantidad dada de radiación. Dicho de otra manera, la radiación debería causar más destrucción tumoral con una cantidad dada de vector. Estos vectores deberían permitir también al oncólogo-radiólogo utilizar menos radiación para conseguir la misma cantidad de destrucción tumoral. Menos radiación reduciría los efectos secundarios de la radiación.

Se cree también que un cóctel de vectores, cuando se utiliza en combinación con radiación, será más eficaz que el cóctel solo o la radiación sola. El cóctel consistiría en vectores productores de ADP más uno o más vectores defectuosos de replicación que expresan una proteína terapéutica anticancerosa (véase el ejemplo 5).

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra un análisis de estructura-función de la proteína proapoptótica de adenovirus.

La ADP es una glicoproteína de membrana integral unida por N unida por O de 11,6 kDa que se localiza en la membrana nuclear interna (MN) (Scaria et al., Virology 191: 743-753). Como se ilustra en la Fig. 18, la ADP codificada por Ad2 (SEC ID Nº 6) consiste en 101 aminoácidos; los aa 1-40 (SEC ID Nº 17) son luminales, los aa 41-59 (SEC ID Nº 18) constituyen el dominio transmembrana de señal-anclaje (SA), los aa 63-70 (SEC ID Nº 19) constituyen un dominio de prolina básica (PB) en el dominio nucleplasmático (NP), que constituye los aa 61-101 (SEC ID Nº 20). Para determinar cuáles dominios de ADP son necesarios para promover la muerte celular, se prepararon una serie de mutantes de deleción de rec700 que carecían de diversas porciones del gen de ADP, y se examinó la capacidad de la ADP de localizarse en la MN y promover la muerte celular. El virus rec700 es un recombinante Ad5-Ad-Ad5 que se ha descrito en otro sitio (Wold et al., Virology 148: 168-180, 1986).

Se ilustra esquemáticamente la estructura de la ADP en rec700 y en cada mutante de deleción en la Fig. 18. El gen de ADP en cada mutante de deleción se ha secuenciado utilizando métodos de PCR para asegurar que las mutaciones son correctas. Se ensayó la estructura y actividad de la ADP en los mutantes de deleción infectando células A549 seguido de análisis de inmunotransferencia de las proteínas mutantes de ADP así como de la capacidad de lisar células. Todos los mutantes de deleción expresaron una proteína ADP estable excepto pm734.1 (\Delta1-48, concretamente se eliminan los aa 1-48). La ADP pm734.7 (N_{14}), que tiene la Asn_{14} mutada a Ser, está O-glicosilada pero no N-glicosilada debido a que la Asn_{14} es el único sitio de N-glicosilación (datos no mostrados). La ADP dl735 (\Delta4-11) está N-glicosilada, pero no O-glicosilada porque se han eliminado los sitios de O-glicosilación (datos no mostrados). La ADP pm734.4 (M56), que tiene la Met_{56} en el dominio SA mutada a Ser, contiene exclusivamente oligosacáridos ricos en manosa unidos por N (datos no mostrados); esto ocurre porque la mutación Met_{56} evita la salida de la ADP del retículo endoplasmático (RE). La ADP dl738, que carece de los aa 46-60 en el dominio de señal-anclaje, forma agregados insolubles en el citoplasma; por lo tanto los aa 41-59 incluyen de hecho el dominio de señal-anclaje. La ADP pm734 (\Delta1-40), que se inicia en Met_{41} en la termianción N del dominio SA, migró conjuntamente con el grupo inferior de bandas generadas por el procesamiento proteolítico (datos no mostrados). Esto indica que los sitios de escisión proteolítica aparecen cerca de Met_{41}. Consistentemente con esto, no se observaron productos proteolíticos con dl737 (\Delta29-45) (datos no mostrados). Además, el tamaño de los productos se redujo en todos los mutantes con deleciones en los aa 41-101 (dl715.1, dl715, dl714, dl716) (datos no mostrados).

Se monitorizó la capacidad de estos mutantes de promover la muerte celular mediante ensayos de exclusión con azul de tripano, desarrollo de placa y liberación de lactato deshidrogenasa (Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1996). Los resultados con azul de tripano en la Fig. 15A indican que la función promotora de muerte celular de la ADP se anulaba mediante la deleción de los aa 1-40 (pm734), los aa 11-26 (dl736.1), los aa 18-22 (dl735.1) o los aa 4-11 (dl735). La mutación del sitio de N-glicosilación en Asn_{14} (pm734.7) redujo la actividad promotora de muerte celular aproximadamente en un 50% del rec700 (WT). dl737 (\Delta29-45) era eficaz como rec700 en la promoción de la muerte celular; esto indica que los productos de procesamiento proteolítico no deben de ser necesarios para promover la muerte celular, porque no se forman con dl737. El dominio SA es esencial para la muerte celular porque dl738 (\Delta46-60) y pm734.4 (M56) eran completamente defectuosos (Fig. 19). dl715.1 era casi completamente defectuoso, indicando que el dominio BP es extremadamente importante. Sorprendentemente, los aa 71-94 (dl714), 76-89 (dl715) y 79-101 (dl716) podían eliminarse sin afectar a la actividad promotora de muerte celular de la ADP (Fig. 19). Por otro lado, la deleción de los aa 81-88 (dl717) anuló casi completamente la actividad de la ADP (Fig. 19); este es probablemente el resultado de una distribución aberrante de la ADP (véase a continuación). Se obtuvieron resultados similares cuando se examinó la capacidad de estos mutantes de ADP de promover la muerte celular con ensayos de desarrollo de placa, liberación de LDH y MTT estándar.

Los efectos de estas mutaciones sobre la localización intracelular de la ADP son extremadamente interesantes. Cuando se examina mediante inmunofluorescencia (IF) a las 33 h p.i. (datos no mostrados), la ADP de rec700 (WT) se localizó claramente en la MN; la localización en aparato de Golgi fue también evidente. Con dl714 (\Delta71-94) y dl715 (\Delta76-89), la ADP se localizó en todas las membranas, concretamente el RE, aparato de Golgi, membrana plasmática y MN. Esto fue aún más evidente a las 45 h p.i. (datos no mostrados). Por tanto, los aa 71-94 parecen incluir una señal que dirige la ADP específicamente a la MN. La ADP se distribuye muy probablemente por la red trans del aparato de Golgi (RTG) por la MN, de modo que esta supuesta señal en ADP funciona probablemente en esta ruta de distribución. La ADP de dl717 (\Delta81-88) es intrigante: se localiza en la MN y el aparato de Golgi, pero en muchas células se observaron "puntos" y estructuras circulares. De nuevo, esto fue más evidente a las 45 h p.i., cuando estas estructuras fueron el rasgo predominante. Las células infectadas con dl717 no han empezado a morir a las 45 h p.i., de modo que estas estructuras no son desechos celulares. La intrigante posibilidad es que estas estructuras sean vesículas de membrana que se han estrangulado de la RTG pero que son defectuosas en la dirección y/o fusión con la MN.

Con dl738 (\Delta46-60 en el dominio SA), la ADP agregó en el citoplasma. Esto indica de nuevo que los aa 46-60 incluyen la secuencia de SA. Con pm734.4 (M56), la ADP se localizó principalmente en la MN. Como se discute anteriormente, la ADP pm734.4 tiene exclusivamente oligosacáridos ricos en manosa unidos por N, indicando que nunca deja el RE. Quizás la supuesta señal de localización en MN en la región C-terminal de la ADP pm734.4 dirige la ADP a la MN mediante difusión lateral desde el RE (que es continuo con la MN externa e interna).

Con dl7377 (\Delta29-45), la ADP se localizó en la MN. La ADP de pm734 (\Delta1-40), pm734.7 (N14) (la glicosilación unida por N no puede ocurrir) y dl735 (\Delta4-11; los sitios de O-glicosilación están eliminados) se localizó mucho más predominantemente en el aparato de Golgi que en la MN. La ADP de dl735.1 (\Delta18-22) y dl736.1 (\Delta11-26) se localizó también mucho más fuertemente en el aparato de Golgi que en la MN. Por tanto, los residuos 1-26 y/o la glicosilación parecen ser necesarios para un transporte eficaz de la ADP desde el aparato de Golgi/RTG a la MN.

En resumen, los aa 41-59 incluyen el dominio SA, la Met_{56} en el dominio SA es necesaria para salir del RE, los aa 1-26 son necesarios para una salida eficaz del aparato de Golgi, y los aa 76-94 son necesarios para dirigir la ADP específicamente a la MN. Con respecto a la promoción de la muerte celular, las regiones esenciales son los aa 1-26, el dominio SA (la ADP no entra en las membranas), la Met_{56} en el dominio SA, y el dominio BP (aa 63-70). No resulta evidente si el fenotipo promotor de muerte celular defectuoso de pm734(\Delta1-40), dl735 (\Delta4-11), dl735.1 (\Delta18-22), dl736.1 (\Delta11-26) y pm734.7 (N14) es debido a la falta de secuencias (u oligosacáridos) que promueven la muerte celular o a una salida mucho más lenta de la ADP del aparato de Golgi a la MN. dl714 (\Delta71-94) y dl715 (\Delta76-89) expresan un fenotipo de tipo silvestre para promover la muerte celular incluso aunque son defectuosos en la localización específicamente en la MN; esto es probablemente porque entra suficiente ADP en la MN para promover la muerte celular. Aunque la deleción en dl717 (\Delta81-88) se encuentra en las deleciones en dl715 (\Delta76-89) y dl714 (\Delta71-94), la ADP dl717 es sólo aproximadamente un 15% tan eficaz como rec700 (wt), dl715 y dl714 en la promoción de la muerte celular. Esto puede ser porque la ADP dl717 tiende a permanecer en vesículas en lugar de localizarse en la MN. En conjunto, estos datos indican que la ADP debe localizarse en la MN para promover la muerte celular.

Ejemplo 10

Este ejemplo caracteriza adicionalmente los vectores de Ad específicos de tejido descritos en el ejemplo 6. Como se discute en la presente memoria, el promotor E4 de Ad se elimina y se reemplaza por el promotor de la proteína tensioactiva B (PTB) en estos vectores (Figura 24).

Materiales y métodos

Las células, vectores y métodos descritos en el ejemplo 6 se utilizaron también en este ejemplo. Además de las estirpes celulares cancerosas humanas A549 (carcinoma pulmonar humano), Hep 3B (carcinoma hepatocelular humano) y H441 (adenocarcinoma pulmonar papilar) utilizadas en el ejemplo 6, se utilizaron células HEK 293 (obtenidas de Microbix (Toronto, ON)) y Vk10-9. Las células Vk10-9 son células 293 que además de E1 contienen y expresan E4 y pIX. Estas células se designarán como células 293-E4.

Los experimentos que emplean microscopía de contraste de fase de células Hep 3B y H441 se realizaron de la manera siguiente. Se hicieron crecer monocapas de células Hep 3B o H441 en discos de 60 mm con 5 ml de DMEM (10% de FBS), y se infectaron ficticiamente o se infectaron con KD1 o KD1-SPB a una multiplicidad de infección de 10 unidades formadoras de placa (UFP) por célula. Se tomaron fotografías de contraste de fase de las monocapas a los 4 y 7 días postinfección (p.i.).

Se realizaron experimentos que emplean transferencias Western de células H441 o Hep 3B de la manera siguiente. Se infectaron células H441 o Hep 3B (en discos de 60 mm) con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB. A las 24 h p.i., se lavaron las células tres veces con PBS y se recogieron mediante rascado. Se lisaron las células con tampón RIPA. Se midió la concentración de proteína mediante el kit de ensayo de proteína BIO-RAD DC (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA), y se sometieron a electroforesis 10 \mug de cada muestra en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 15% (SDS-PAGE). Se sometieron a electrotransferencia los geles en membranas de PVDF (Immobilon, Millipore, Bedford, MA). Se bloquearon las membranas en TBST (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,2%) que contenía leche desecada al 10% (Carnation) durante una noche a 4ºC. Después de bloquear, se incubaron las membranas con un antisuero policlonal de conejo contra E4ORF3 (obsequio de Gary Ketner) o ADP (Tollefson et al., J. Virol. 66: 3633-3642, 1992) o con M73, un anticuerpo monoclonal contra E1A (Harlow, et al., J. Virol. 55: 533-546, 1985). Los anticuerpos secundarios fueron IgG-HRP de cabra anti-conejo o IgG-HRP de cabra anti-ratón. Las transferencias se revelaron utilizando el protocolo ECL (Amersham Pharmacia, Arlington Heights, IL).

Se realizaron experimentos que emplean un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa para la lisis celular (Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306) de la manera siguiente. Se infectaron células H441 (7,7 x 10^{5} células por disco de 35 mm) y células Hep 3B (9,0 x 10^{5} células por disco de 35 mm) a 20 UFP/célula en 1 ml de DMEM libre de suero. Después de un periodo de adsorción de 1 h, se añadieron 3 ml de DMEM (10% de FBS) (concentración final de PBS de 7,5%). Se incubaron las células a 37ºC con 6% de CO_{2}. A intervalos diarios, se recogieron los sobrenadantes, se sometieron a microfuga para retirar las células flotantes y se congelaron los sobrenadantes libres de célula a -70ºC hasta el ensayo. Se prepararon las muestras de lisis total mediante la adición del tampón de lisis 10x incluido en el kit Cyto Tox 96 (Promega, Madison, WI). Después de recoger todas las muestras, se ensayaron muestras de 20 \mul por triplicado utilizando el kit de ensayo de LDH Cyto Tox 96, y se leyeron en un lector EL340 Microplate (BioTecTM Instruments Inc.) a 490 nm.

Se realizaron experimentos que emplean la evaluación por inmunofluorescencia de células H441 y Hep 3B de la manera siguiente. Se sembraron células H441 y Hep 3B en cubreobjetos Corning nº 1 en discos de 35 mm. Se infectaron H44 (1,5 x 10^{6} células/disco de 35 mm) y Hep 3B (9,0 x 10^{5} células/disco de 35 mm) con 20 UFP/célula de los virus indicados en 1 ml de DMEM libre de suero. Después de 1 h, se añadió 1 ml de DMEM/20% de FBS (concentración final de 10% de FBS). A los tiempos indicados (48 h ó 6 d p.i.), se fijaron las células durante 10 min con paraformaldehído al 3,7% en PBS, después se permeabilizaron durante 6 minutos en metanol (-20ºC) y se rehidrataron con PBS. Se tiñeron los cubreobjetos con antisuero de conejo anti-péptido contra la proteína de unión a ADN codificado por E2A de Ad (DBP) (dilución 1:400, obsequio de Maurice Green) y anticuerpo monoclonal de ratón contra fibra (dilución 1:400, obsequio de Jeff Engler), o se tiñeron con antisuero de conejo contra E4ORF3 (dilución 1:250; obsequio de Gary Ketner). Se utilizaron anticuerpos secundarios (Cappel/ICN) a dilución 1:50. Se diluyeron todos los anticuerpos en PBS que contenía 1% de BSA y 0,1% de azida de sodio. Se tomaron fotografías con un microscopio de epifluorescencia Nikon utilizando una lente 100x Planapo y película Tmax 400 (Kodak). Se reveló la película en revelador Diafine.

Se realizó el análisis de la replicación vírica de ADN mediante hibridación Southern de la manera siguiente. Se hicieron crecer células H441 y Hep 3B en discos de 60 mm en DMEM suplementado con 10% de FBS. Se infectaron las células a 70% de confluencia con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB. Se incubaron los discos en atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada a 37ºC. Se aislaron los ADN genómicos totales a las 5, 24, 48, 72 y 96 h p.i. Se digirieron iguales cantidades de ADN genómicos totales con HindIII y se resolvieron en un gel de agarosa al 1% antes de transferir a membranas. Se utilizó una primera sonda aleatoria de plásmido pBHG10 marcada con ^{32}P (Bett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8802-8806, 1994) para hibridación, y se sometieron a autorradiografía las transferencias. Se cuantificaron los fragmentos de ADN en un PhosphorImager de Molecular Dynamics.

Se determinaron los rendimientos víricos de la manera siguiente. Se infectaron células Hep 3B o H441 crecidas en forma de monocapas en discos de 35 mm con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB. Los días 0 a 4 (para H441) o los días 0 a 9 (para Hep 3B) p.i., se congelaron las células y el medio de cultivo a -70ºC. Se congelaron y descongelaron las muestras tres veces para liberar el virus de las células, y se determinaron los rendimientos víricos totales mediante ensayo de placa en monocapas A549.

Se examinó el efecto de KD1-SPB y KD1 sobre tumores H441 y Hep 3B en un modelo de ratón desnudo (Doronin et al., J. Virol. 74: 6147-6155, 2000). Se inyectaron células tumorales (10^{7} células en 200 \mul de DMEM, 50% de Matrigel (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) para células H441, o 10^{7} células en 200 \mul de DMEM más 10% de Matrigel para células Hep 3B) en los costados de ratones desnudos atímicos de 5-6 semanas, y se dejaron crecer durante 3 semanas hasta volúmenes de aproximadamente 100 \mul (H441) o 150 \mul (Hep 3B). Se inyectaron tumores preestablecidos (n = 10) con 50 \mul de DMEM o 5 x 10^{7} UFP de los virus indicados en DMEM. Se repitieron dos veces por semana las inyecciones de los virus durante 3 semanas hasta la dosis total de 3,0 x 10^{8} UFP por tumor. Se tomaron las medidas de tamaño del tumor dos veces por semana para células H441, o semanalmente para células Hep 3B utilizando un calibre digital Sylvac. Se calcularon los volúmenes de tumor según la fórmula: longitud x

\hbox{anchura ^{2}  /
2.}

Los datos se representan como medias del aumento del tamaño del tumor respecto al tamaño del tumor en la inyección inicial. Resultados

Se compararon las propiedades de KD1-SPB en diversos tipos celulares con las de su "original" KD1. La Figura 25 muestra las propiedades de desarrollo de placa de estos vectores en células 293-E4, 293 y A549. Los datos se representan como el número de placas observadas cualquier día del ensayo de placa como porcentaje del número de placas observadas al final del ensayo (concretamente, cuando dejan de aparecer nuevas placas) (Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1966). Este ensayo es un indicador del tamaño de las placas. KD1 formó placas igualmente bien en células 293-E4 y 293 (Figura 25A). Con KD1-SPB, se observaron placas aproximadamente 3-4 días antes que en 293-E4 en comparación con células 293 (Fig. 2A). En células A549, KD1 formó placas 4-6 días antes que KD1-SPB (Figura 25B).

Se caracterizaron con detalle las propiedades de KD1-SPB frente a KD1 en células H441, una estirpe celular de adenocarcinoma de pulmón papilar humano conocida por expresar el factor de transcripción TTF1 y en la que está activo el promotor SPB (Yan et al., J. Biol. Chem. 270: 24852-24857, 1995). Las células Hep 3B, un carcinoma hepatocelular humano en el que el promotor SPB no debería estar activo, se utilizaron como control negativo. Se infectaron las monocapas de H441 y Hep 3B con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB y se fotografiaron a los 4 y 7 días p.i. Las células Hep 3B infectadas ficticiamente formaron una monocapa relativamente homogénea, pero las células H441 tendían a formar estructuras que parecían sincitios (Figura 26A, B). Como se esperaba, KD1 produjo efecto citopático (ECP) en ambas estirpes celulares a los 4 y 7 días p.i. (Figura 26A, B). También como se esperaba, KD1-SPB causó ECP en células H441, pero no en células Hep 3B. Puesto que el ECP en células infectadas con Ad es habitualmente un indicador de crecimiento celular, estos resultados sugieren que KD1-SPB crece en células H441 pero no en Hep 3B.

Para examinar la replicación de ADN vírico, se infectaron células H441 y Hep 3B con 10 UFP/célula de KD1 o KD1-SPB, después se determinó la acumulación de ADN vírico mediante transferencia de ADN. Con células H441, se detectaron fácilmente ADN de KD1 y KD1-SPB a niveles similares a 48-96 h p.i. (Figura 27A). Con células Hep 3B, los niveles de ADN de KD1 fueron similares a los de células H441, pero el ADN de KD1-SPB fue apenas detectable. Esto se confirmó mediante análisis por PhosphorImager de las bandas de ADN (Figura 27B).

Se determinó el crecimiento de KD1-SPB y KD1 en células H441 y Hep 3B mediante un ensayo de crecimiento en una etapa: se infectaron las células con 10 UFP de vector/célula, después se determinó el rendimiento total del vector mediante ensayo de placa. El rendimiento total de ambos vectores fue similar en células H441, alcanzando una meseta después de 2 días (Fig. 28A). El rendimiento de KD1 llegó a una meseta en células Hep 3B después de 2-4 días p.i. (Figura 28B). Sin embargo, los niveles de KD1-SPB fueron aproximadamente 5 órdenes de magnitud menores en células Hep 3B después de 2-4 días, e incluso a los 9 días no habían alcanzado los niveles de KD1. Los inventores concluyeron que KD1-SPB crece con especificidad significativa en células H441 frente a Hep 3B. Además, KD1-SPB crece tan bien como KD1 en células H441, indicando que la deleción del promotor E4 por sí misma no compromete significativamente el vector, y que el promotor E4 puede reemplazarse por un promotor específico de tejido en un vector competente de replicación.

Para obtener detalles adicionales sobre la replicación de KD1-SPB frente a KD1 en células H441 y Hep 3B, se examinó la expresión de proteínas representativas de Ad por KD1-SPB y KD1. Se infectaron ficticiamente células H441 o Hep 3B o se infectaron con 10 UFP/ml de KD1 o KD1-SPB, después se extrajeron a las 24 h p.i. las proteínas, y se examinaron las proteínas de E1A, E4ORF3 y ADP mediante inmunotransferencia. E4ORF3 es una de las seis proteínas codificadas por la unidad de transcripción E4 (Leppard, J. Gen. Virol. 78: 2131-2138, 1997). Como se anticipaba, KD1-SPB expresó E4ORF3 bien en células H441, pero sólo a niveles de trazas en células Hep 3B (Figura 29). KD1-SPB expresó las proteínas de E1A en células Hep 3B. Se espera la síntesis de proteínas de E1A mediante KD1-SPB en células Hep 3B porque la expresión de E1A no requiere proteínas de E4; esto indica también que el bloqueo para la infección con KD1-SPB está cadena abajo de E1A. KD1 expresó E1A en ambas estirpes celulares, pero la cantidad fue menor que la obtenida con KD1-SPB en células Hep 3B (Figura 29). Los niveles aumentados de E1A observados con KD1-SPB pueden reflejar su baja capacidad de entrar en la fase tardía de infección (véase la discusión). KD1-SPB expresó ADP tan bien como KD1 en células H441, pero no produjo ADP detectable en células Hep 3B. La ADP es principalmente una proteína tardía, de modo que este resultado es consistente con la falta relativa de expresión de la proteína de E4, la replicación de ADN y el crecimiento de KD1-SPB en células Hep 3B.

Para aumentar el conocimiento de los eventos de replicación que ocurren en células individuales, se examinó la expresión de E4ORF3, E2A-DBP y la proteína tardía de fibra mediante inmunofluorescencia. Se infectaron células H441 o Hep 3B con 20 UFP/célula. A las 48 h o 6 días p.i., se fijaron las células y se inmunotiñeron. Se detectó E4ORF3 en los núcleos de células H441 a las 48 h p.i. con KD1, KD1-SPB o dl309 (Figura 30A). (dl309 es un mutante de Ad5 que tiene E1A de tipo silvestre, expresa niveles de ADP de Ad5 y carece de los genes E3-RID y E3-14,7K). E4ORF3 no pudo detectarse en la gran mayoría de las células Hep 3B infectadas con KD1-SPB (Figura 30A), incluso a los 6 días p.i. (Figura 30B). Por tanto, KD1-SPB expresa E4ORF3 bien en células H441 pero no en Hep 3B.

La Figura 31A muestra inmunofluorescencia de doble marcaje de DBP y fibra en las mismas células Hep 3B a las 48 h p.i. con KD1 o KD1-SPB. Con KD1, hubo un patrón de tinción fuertemente moteado en el núcleo que es típico de DPB a las 48 h p.i. (Figura 31A, panel superior izquierdo). Hubo una fuerte tinción de fibra a lo largo de estas mismas células (Figura 31A, panel superior derecho). Se espera la tinción de citoplasma y núcleo porque la fibra se sintetiza en el citoplasma y después se transporta al núcleo donde se ensamblan los viriones. Con KD1-SPB a las 48 h p.i., aproximadamente un 25% de las células mostraron la tinción moteada de DPB, y sólo una célula (7% del total) con el patrón moteado avanzado se tiñó también para fibra (Figura 31A, dos paneles inferiores). Incluso a los 6 días p.i., sólo aproximadamente un 30% de las células mostraron tinción de DBP y, aproximadamente un 20% de fibra (Figura 31B). Por tanto, notablemente menos células Hep 3B infectadas con KD1-SPB expresaron DPB y especialmente fibra, comparadas con KD1. Estos resultados indican que KD1-SPB se replica tan bien como KD1 en células H441, sin duda debido a que el promotor SPB está activo en las células H441 (Yan et al., J. Biol. Chem. 270: 24852-24857, 1995). KD1-SPB se replica apenas en células Hep 3B, presumiblemente debido a que el promotor SPB es mínimamente activo en estas células.

A la terminación de la replicación, se lisan las células infectadas con Ad y el virus se propaga a otras células; este proceso está mediado en gran parte por la ADP (Tollefson et al., Virology 220: 152-162, 1996; Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1996). Para examinar la lisis celular inducida por vector, se infectaron ficticiamente células H441 y Hep 3B o se infectaron con 20 UFP/célula de KD1, KD1-SPB o dl309, y se determinó la lisis celular mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (Tollefson et al., J. Virol. 70: 2296-2306, 1996). Todos los vectores lisaron células H441 empezando 2-3 días p.i. (Figura 32A). KD1 y dl309 lisaron también células Hep 3B en el mismo periodo de tiempo; sin embargo, KD1-SPB causó sólo una lisis celular mínima (Figura 9B). Por tanto, estos datos, junto con los datos de propagación celular en el ejemplo 6 y la Figura 13, demuestran que KD1-SPB lisa células y se propaga eficazmente de célula a célula en células H441 pero no Hep 3B.

Se realizó un experimento para determinar si KD1-SPB o KD1 suprimirían los tumores H441 en ratones desnudos. Se inyectaron células H441 en cada costado trasero. Cuando los tumores habían crecido aproximadamente hasta 100 \mul (H441) o 150 \mul (Hep 3B), se inyectaron dos veces a la semana durante 3 semanas DMEM (inf. ficticia) o 5 x 10^{7} UFP de virus de ensayo en 50 \mul de DMEM (3,0 x 10^{8} UFP total). Se utilizaron diez tumores (5 ratones) para cada virus. Se suprimió el crecimiento de tumores H441 de forma similar mediante KD1-SPB y KD1 (Figura 33A). KD1 suprimió el crecimiento de tumores Hep 3B, mientras que KD1-SPB causó sólo una supresión mínima (Figura 33B). Estos resultados muestran que KD1-SPB es tan eficaz como KD1 en la supresión de tumores cuando el promotor SPB está activo. Además, la especificidad de tipo celular observada con KD1-SPB in vitro se mantiene in vivo.

Discusión

La especificidad tumoral es uno de los mayores retos a los que se enfrenta la terapia génica del cáncer, concretamente tener que expresar el gen terapéutico específicamente en células cancerosas. La especificidad es muy importante en células CR. Se han descrito dos estrategias principales que en teoría confieren especificidad: la dirección transduccional y la dirección transcripcional. Se ha intentado dirigir la especificidad de los vectores hacia receptores de superficie celular específicos en las células diana mediante diversos métodos. Aunque este enfoque es teóricamente atractivo, podría encontrar múltiples obstáculos tales como la falta de incorporación de la proteína modificada por ingeniería genética al virión (Scaria et al., Virology 191: 743-753, 1992) o la falta de infectividad mediante el receptor diana (Cosset et al., J. Virol. 69: 6314-6322, 1995). La dirección transcripcional utiliza promotores específicos de tumor y tejido. En vectores defectuosos de replicación, estas secuencias reguladoras confinan la expresión de genes citotóxicos a tejidos específicos. En vectores competentes de replicación, como una capa de regulación añadida, la replicación de vector per se puede disponerse bajo el control de secuencias promotoras/potenciadoras específicas de tumor o tejido. En Ad competentes de replicación, se ha utilizado exclusivamente la inserción del promotor/potenciador específico de tejido o tumor en la región promotora/potenciadora E1A (Hallenbeck et al., Hum. Gene Ther. 10: 1721-1733, 1999; Rodríguez et al., Cancer Res. 57: 2559-2563, 1997; Yu et al., Cancer Res. 59: 4200-4203, 1999; Yu et al., Cancer Res. 59: 1498-1504, 1999). La explicación detrás de estos vectores es que la expresión de E1A, y por lo tanto del programa de transcripción de Ad completo, dependerá de estos promotores específicos de tejido o tumor. Sin embargo, como aproximación genérica, puede haber dificultades. El promotor/potenciador E1A es muy complejo. El potenciador controla no sólo el promotor E1A, sino también promotores distantes tales como el promotor E4 (Shenk, T., pág. 2111-2148 en B.N. Fields, D.M. Knipe y P.M. Howley (Eds.) "Fields Virology", Lippincott-Raven, Filadelfia, 1996). Además, se ha mostrado que el potenciador E1A en la región repetida terminal inversa cambia la especificidad de tejido de promotores celulares (Shi et al., Hum. Gene Ther. 8: 403-410, 1997). Además, el promotor/potenciador E1A está parcialmente encajado en las señales necesarias para empaquetar el genoma de Ad en viriones, y puede ser problemático retirar todos los elementos potenciadores E1A sin dañar la producción vírica. En consecuencia, los inventores eligieron reemplazar el promotor E4 por un promotor específico de tejido. Los genes E4 son esenciales para la replicación de Ad, y por lo tanto esperaban que la replicación del virus recombinante fuera dependiente de los elementos reguladores específicos de tejido.

Para construir KD1-SPB, se eliminaron las aproximadamente 300 pb del promotor E4 y se insertó la versión B-500 (aproximadamente 500 pb) del promotor SPB (Yan et al., supra) (Figura 24C, D). Seleccionaron el promotor SPB debido a su estricta especificidad de tejido: es activo exclusivamente en células alveolares de tipo II y en células epiteliales bronquiales del pulmón (Bohinski et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 5671-5681, 1994). Puesto que el virus KD1 original contiene y expresa dos mutaciones E1A que limitan la replicación vírica a células tumorales (Doronin et al., supra), los inventores anticiparon que el virus se replicaría selectivamente en células derivadas de tumores pulmonares. Por tanto, se utilizaron células H441, una estirpe celular de carcinoma pulmonar papilar, para caracterizar la replicación, la expresión génica y el perfil funcional de KD1-SPB.

KD1-SPB formó placas 3-4 días antes en células 293-E4 que expresan proteínas de E4 que en células 293, mientras que KD1 formó placas con la mima cinética en ambas estirpes celulares. Estos datos muestran que el promotor E4 es activo en células 293, y que el promotor SPB presenta una actividad muy baja en células 293. No resulta evidente porqué KD1-SPB forma placas en células 293; estas células derivan de riñón embriónico humano y al menos uno de los factores de transcripción que regulan el promotor SPB (Bohinski et al., supra), el factor hepatocítico nuclear 3, se expresa en riñón embriónico. Es también posible que TTF1, el factor regulador maestro de la expresión de SPB, sea mínimamente activo en células 293.

KD1 creció a titulaciones igualmente altas en células H441 y Hep 3B (Figura 28A, B). En contraposición, KD1-SPB se replicó tan eficazmente como KD1 en células H441, en las que el promotor SPB es activo (Yan et al., supra) (Figura 28A), pero se replicó mal en células Hep 3B, lo más probablemente debido a que el promotor SPB es inactivo (Figura 28B). Esta selectividad se ha confirmado midiendo la producción de ADN vírico en las dos estirpes celulares. La replicación de ADN de KD1-SPB fue similar tanto cinética como cuantitativamente a la replicación de ADN de KD1 en H441, sin embargo en células Hep 3B, el ADN de KD1-SPB fue casi indetectable (Figura 27A, B). El efecto citopático, un marcador vicario de la replicación de Ad, mostró una especificidad similar (Figura 26).

Para confirmar adicionalmente las predicciones de los inventores sobre la base molecular de la especificidad de tejido observada, monitorizaron la expresión de proteína vírica. Cuando se infectaron células con KD1-SPB, todas las proteínas víricas tempranas o tardías, excepto E1A, se expresaron de un modo específico de tejido (alta expresión en H441, de baja a indetectable expresión en Hep 3B) (Figuras 29-31). Encontraron una buena correlación entre los niveles de actividad del promotor E4 (expresión de E4ORF3) y la expresión de E2A-DBP, ADP y proteínas de fibra. Por tanto, el promotor SPB retiene su especificidad de tejido en el genoma de Ad y parece ser el factor limitante de la expresión génica de Ad en las estirpes celulares ensayadas. Como se esperaba, la expresión de E1A no es específica de tejido. Por tanto, la etapa reguladora de replicación de ADN de Ad específico de tejido está cadena abajo de E1A. En células Hep 3B, KD1-SPB expresó E1A a un nivel mayor que KD1 (Figura 29), sugiriendo fuertemente que la replicación de KD1-SPB en la mayoría de las células Hep 3B permanece en la etapa temprana.

El efecto citolítico de KD1-SPB mostró también un perfil específico de tejido (Figura 32, Figura 13 del ejemplo 6), concretamente una lisis preferida de células H441 frente a células Hep 3B, un patrón similar a la especificidad observada al nivel de replicación de ADN (Figura 27) y de síntesis de proteínas víricas (Figuras 29-31). Esta especificidad de tipo celular se observó también cuando se hicieron crecer estas células como tumores en ratones desnudos. El crecimiento de tumores H441 se suprimió mediante KD1-SPB y KD1 con una eficacia similar (Figura 33A). En contraposición, KD1-SPB al contrario que KD1 tenía sólo un efecto mínimo sobre el crecimiento de tumores Hep 3B (Figura 33B).

En resumen, la sustitución del promotor E4 por un promotor específico de tejido permite una alta replicación específica de tejido de vectores de Ad, y en el tejido diana es tan eficaz como la replicación del virus original. KD1-SPB carece de todos los genes de E3 excepto ADP. Se ha mostrado que gp19K, RID y 14,7K de E3 protegen las células infectadas con Ad del ataque por linfocitos citotóxicos y de las citocinas inductoras de la apoptosis tales como factor de necrosis tumoral y ligando Fas (Wold et al., pág. 200-232 en A.J. Cann (ed.), "DNA Virus Replication: Frontiers in Molecular Biology", Oxford University Press, Oxford, 2000; Wold et al., Curr. Opin. Immunol. 11: 380-386, 1999).

El índice terapéutico (virus producido en células H441 comparado con células Hep 3B) de KD1-SPB es 10^{4}-10^{5} para los primeros 4-5 días (Figura 28). Estos datos son comparables con los datos reseñados por Calydon (10^{4}-10^{5}) para sus virus específicos de próstata (Rodríguez, et al., supra; Yu et al., Cancer Res. 59: 4200-4203, 1999; Yu et al., Cancer Res. 59: 1498-1504, 1999). Los inventores sugieren que KD1-SPB tiene cierta ventaja añadida frente a vectores reseñados por otros laboratorios porque codifica una forma mutante de E1A que limita la aplicación a células cancerosas (Doronin et al., supra).

Aunque el pulmón figura como el segundo sitio más frecuente de cáncer tanto para hombres como para mujeres en los EE.UU., (Reis et al., Cancer Res. 88: 2398-2424, 2000), el cáncer de pulmón no ha sido una diana importante para terapia génica del cáncer por vectores porque la inyección intratumoral del virus no es generalmente factible en los pulmones. Sin embargo, ha habido un informe reciente de inyección intratumoral de un vector de Ad defectuoso de replicación en un tumor pulmonar, y dicho enfoque podría intentarse con KD1-SPB. Puede ser también factible administrar KD1-SPB sistémicamente al pulmón.

A la vista de lo anterior, se observará que se consiguen las diversas ventajas de la invención y se obtienen otros resultados ventajosos.

Ya que podrían hacerse diversos cambios en los métodos y composiciones anteriores sin apartarse del alcance de la invención, se pretende que todo el material contenido en la descripción anterior y mostrado en los dibujos adjuntos deba interpretarse como ilustrativo y no en un sentido limitante.

Todas las referencias citadas en esta memoria descriptiva, incluyendo patentes y solicitudes de patente, se incorporan a la presente memoria como referencia. La discusión de las referencias en la presente memoria se pretende únicamente para resumir las afirmaciones realizadas por sus autores y no se admite que ninguna referencia constituya técnica anterior. Los solicitantes se reservan el derecho de objetar la exactitud y pertinencia de las citadas referencias.

<110> Wold, William S.M.

\hskip1cm

Toth, Karoly

\hskip1cm

Doronin, Konstantin

\hskip1cm

Tollefson, Ann. E.

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<120> Vectores antincancerosos competentes de replicación

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<130> 16153-5152

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<140>

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<141>

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<150> 09/351.778

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<151> 1999-07-12

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<160> 20

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 33592

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<212> ADN

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 1

4

5

6

7

8

9

10

11

12

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<210> 2

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<211> 34341

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<212> ADN

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 2

13

14

15

16

17

18

19

20

21

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<210> 3

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<211> 33699

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<212> ADN

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 3

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

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<210> 4

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<211> 34448

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<212> ADN

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 4

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

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<210> 5

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<211> 94

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 5

42

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<210> 6

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<211> 101

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 6

43

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<210> 7

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<211> 93

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 7

44

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<210> 8

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<211> 95

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 8

45

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<210> 9

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<211> 78

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 9

46

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<210> 10

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<211> 87

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 10

47

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<210> 11

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<211> 77

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 11

48

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<210> 12

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<211> 84

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 12

49

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<210> 13

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<211> 35724

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<212> ADN

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 13

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

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<210> 14

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<211> 33988

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<212> ADN

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 14

60

61

62

63

64

65

66

67

68

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<210> 15

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<211> 34737

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<212> ADN

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 15

69

70

71

72

73

74

75

76

77

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<210> 16

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<211> 36114

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<212> ADN

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 16

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

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<210> 17

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 17

89

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<210> 18

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 18

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\sa{Met Trp Trp Phe Ser Ile Ala Leu Met Phe Val Cys Leu Ile Ile Met}

\sac{Trp Leu Ile}

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<210> 19

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 19

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\sa{Lys Arg Arg Arg Ala Arg Pro Pro}

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<210> 20

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<211> 42

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<212> PRT

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<213> Subgrupo C de adenovirus

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<400> 20

90

Claims (15)

1. Un adenovirus recombinante que sobreexpresa una proteína proapoptótica de adenovirus y que es competente de replicación en células neoplásicas, comprendiendo dicha proteína proapoptótica de adenovirus una secuencia seleccionada de una secuencia como se indica en la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 7, la SEC ID Nº 8, la SEC ID Nº 9, la SEC ID Nº 10, la SEC ID Nº 11 o la SEC ID Nº 12, o una variante sustituida conservativamente de la misma.

2. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, que se caracteriza adicionalmente por carecer de la expresión de al menos una proteína de E3 seleccionada del grupo consistente en: gp19K, RID\alpha, RID\beta y 14,7K.

3. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, que se selecciona de una cualquiera de la SEC ID Nº 1, la SEC ID Nº 2, la SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 4 o la SEC ID Nº 13.

4. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un promotor específico de tejido, un promotor específico de tumor o un promotor inducible en sustitución del promotor E4.

5. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 4, en el que el promotor específico de tejido es un promotor de proteína B tensioactiva.

6. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 5, que comprende la SEC ID Nº 14, la SEC ID Nº 15 o la SEC ID Nº 16.

7. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, en el que el vector comprende adicionalmente un gen que codifica un producto anticanceroso.

8. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 7, en el que el gen que codifica un producto anticanceroso está en la región E3 del vector.

9. Un adenovirus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en un método de tratamiento de un tumor en un paciente.

10. Un adenovirus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, junto con uno o más adenovirus defectuosos de replicación que expresan un producto génico anticanceroso para uso en un método de tratamiento de un tumor en un paciente, complementando el adenovirus recombinante la propagación del adenovirus defectuoso de replicación en el tumor.

11. Uso de un adenovirus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un paciente.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que dicho tumor se trata adicionalmente con radiación.

13. Uso según la reivindicación 11, en el que dicho tumor se trata adicionalmente con quimioterapia.

14. Una composición que comprende el adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un segundo virus recombinante que es defectuoso de replicación y que expresa un producto génico anticanceroso, complementando el adenovirus recombinante la replicación del segundo virus recombinante.

15. Una composición que comprende el adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un segundo virus recombinante que es competente de replicación en una célula neoplásica.