WO2023162995A1

WO2023162995A1 - 新規セレンテラジン誘導体

Info

Publication number: WO2023162995A1
Application number: PCT/JP2023/006307
Authority: WO
Inventors: 昌次郎牧; 昇雄北田; 誠培金
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; University of Electro Communications NUC
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; University of Electro Communications NUC
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2023-02-21
Publication date: 2023-08-31
Anticipated expiration: 2024-08-28
Also published as: JP2023126161A; US20250171450A1

Abstract

本発明の課題は、発光輝度が高く、酵素特異性を有する新規セレンテラジン誘導体を提供することであり、その解決手段は、下記一般式（１）又は（２）：［一般式（１）中、Ｒ１は、特定の二環式構造を有し、Ｒ２は、－Ｒ２'又は－ＣＨ２－Ｒ２'で表され、ここで、Ｒ２'は、特定の環構造を有し、Ｒ３は、特定の環構造を有し、一般式（２）中、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎ－ＯＲ４－１、－Ｎ（Ｒ４－１）２、－ＣＦ３で表され、ここで、Ｒ４－１は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｎは、０～３の整数であり、Ｒ５は、特定の環構造を有し、Ｒ６は、水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。］で表されることを特徴とする、セレンテラジン誘導体である。

Description

新規セレンテラジン誘導体

　本発明は、新規セレンテラジン誘導体に関するものである。

　生体内分子イベントの可視化技術は、様々な疾病の診断と治療法の開発に必要不可欠な技術である。生体内分子イベントの可視化技術としては、生物発光を用いた可視化技術が主流であり、ホタルや海洋生物の発光システムを応用した技術が開発されている。これらの中でも、海洋生物の発光システムは、その発光輝度の高さや、発光酵素の小分子量、発光システムの単純さ等から多岐に渡る応用可能性が注目されており、近年ウイルスの可視化等にも好適に用いられている。例えば、海洋生物の発光システムにおいては、発光基質である天然型のセレンテラジン（ｎＣＴＺ）が、海洋生物の発光酵素を触媒とした酸化反応により、波長が４８０ｎｍ程度の光を発することが知られている。

　一方、生体内深部で起こる分子イベントの観察には、従来より更に長波長かつ高輝度な発光システムが求められている。生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として、生物発光系の発光基質を利用する研究が進められている。例えば、生体内深部の観察には、更に長波長かつ高輝度な発光システムが求められており、従来、構造改変によって発光特性を制御したセレンテラジン誘導体が開発されてきた（特許文献１、非特許文献１～３）。

特開２０１８－１６５２６５号公報

Jiang, T.; Du, L.; Li, M. Photochem. Photobiol. Sci. 2016, 15 (4), 466-480. Kaskova, Z. M.; Tsarkova, A. S.; Yampolsky, I. V. Chem. Soc. Rev. 2016, 45 (21), 6048-6077. Nishihara, R.; Suzuki, H.; Hoshino, E.; Suganuma, S.; Sato, M.; Saitoh, T.; Nishiyama, S.; Iwasawa, N.; Citterio, D.; Suzuki, K. Chem. Commun. (Camb). 2015, 51 (2), 391-394.

　しかしながら、発光基質である天然型のセレンテラジン（ｎＣＴＺ）の構造を変えることで発光輝度が大幅に低下することが知られている。そのため、発光輝度を保ったまま、発光基質の構造を改変することが求められている。

　また、従来の海洋生物由来の発光システムにおいては、発光輝度や発光波長、発光酵素特異性の制御が難しかった。ここで、発光システムの発光輝度や発光波長、発光酵素特異性を制御することができるようになれば、生体内で起こる分子イベント、癌の転移等、複数の生体内現象を同時に高感度且つ高速に可視化することが可能になる。例えば、多数の発光酵素が共存している中で、特定の発光酵素のみを光らせることは、その発光酵素だけに特異的に発光する発光基質を添加することにより実現できる。
　しかしながら、従来の海洋生物由来の発光システムにおいては、発光システムの発光輝度や発光酵素特異性を制御することが難しかった。

　そこで、本発明は、上記従来技術の問題を解決し、発光輝度が高く、酵素特異性を有する新規セレンテラジン誘導体を提供することを課題とする。
　また、本発明は、発光輝度が高く、長波長側の発光を示し、酵素特異性を有する新規セレンテラジン誘導体を提供することを更なる課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の二環式構造又は特定のチオエーテル構造を有するセレンテラジン誘導体が、発光輝度が高く、酵素特異性を有することを見出し、本発明を完成させる着想に至った。

　即ち、本発明のセレンテラジン誘導体は、下記一般式（１）：

［一般式（１）中、Ｒ^１は、下記一般式（１－１－１）、（１－１－２）、（１－１－３）又は（１－１－４）：

で表され、ここで、Ｒ^１－１は、炭素数１～４の炭化水素基であり、Ｒ^１－２は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数であり、
　Ｒ^２は、－Ｒ^２’又は－ＣＨ_２－Ｒ^２’で表され、ここで、Ｒ^２’は、下記一般式（１－２－１）、（１－２－２）、（１－２－３）、（１－２－４）又は（１－２－５）：

で表され、ここで、Ｒ^２－１は、水素、ハロゲン、－Ｎ（Ｒ^{２－１－１}）_２又は－ＯＲ^{２－１－１}であり（ここで、Ｒ^{２－１－１}は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。）、Ｒ^２－２は、炭素数１～４の炭化水素基であり、Ｒ^２－３は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数であり、
　Ｒ^３は、下記一般式（１－３－１）、（１－３－２）又は（１－３－３）：

で表され、ここで、Ｒ^３－１は、水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。］、又は、
　下記一般式（２）：

［一般式（２）中、Ｒ^４は、水素、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１、－Ｎ（Ｒ^４－１）_２又は－ＣＦ^３であり、ここで、Ｒ^４－１は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｎは、０～３の整数であり、
　Ｒ^５は、下記一般式（２－５－１）、（２－５－２）、（２－５－３）、（２－５－４）又は（２－５－５）：

で表され、ここで、Ｒ^５－１は、水素、ハロゲン、－Ｎ（Ｒ^{５－１－１}）_２又は－ＯＨであり（ここで、Ｒ^{５－１－１}は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。）、Ｒ^５－２は、炭素数１～４の炭化水素基であり、Ｒ^５－３は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数であり、
　Ｒ^６は、水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。］で表されることを特徴とする。
　かかる本発明のセレンテラジン誘導体は、発光輝度が高く、酵素特異性を有する。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、上記一般式（１）で表され、Ｒ^１が、上記一般式（１－１－３）で表されることが好ましい。この場合、発光輝度が向上する。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、上記一般式（１）で表され、Ｒ^２が、－ＣＨ_２－Ｒ^２’で表され、ここで、Ｒ^２’が、上記一般式（１－２－１）で表されることが好ましい。この場合も、発光輝度が向上する。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、上記一般式（１）で表され、Ｒ^３が、上記一般式（１－３－２）で表されることが好ましい。この場合も、発光輝度が向上する。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、下記構造式（１－１）：

で表されることが特に好ましい。この場合、該セレンテラジン誘導体を用いた発光系からの発光輝度が特に高い。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、上記一般式（２）で表され、Ｒ^４が、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１で表されることが好ましい。この場合、発光輝度が向上する。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、上記一般式（２）で表され、Ｒ^５が、上記一般式（２－５－１）で表されることが好ましい。この場合も、発光輝度が向上する。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、上記一般式（２）で表され、Ｒ^６が、水素であることが好ましい。この場合も、発光輝度が向上する。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、下記構造式（２－１）又は（２－２）：

　本発明によれば、発光輝度が高く、酵素特異性を有する新規セレンテラジン誘導体を提供することができる。

発光酵素としてＡＬｕｃ１６を使用した場合の、生細胞における各発光基質の発光輝度を示すグラフである。発光酵素としてＡＬｕｃ１６を使用した場合の、ライセートにおける各発光基質の発光輝度を示すグラフである。発光酵素としてＡＬｕｃ１６を使用した場合の、各発光基質の発光スペクトルである。発光酵素としてＡＬｕｃ４７を使用した場合の、生細胞における各発光基質の発光輝度を示すグラフである。発光酵素としてＡＬｕｃ４７を使用した場合の、ライセートにおける各発光基質の発光輝度を示すグラフである。発光酵素としてＡＬｕｃ４７を使用した場合の、各発光基質の発光スペクトルである。発光酵素としてＲＬｕｃ８．６ＳＧを使用した場合の、生細胞における各発光基質の発光輝度を示すグラフである。発光酵素としてＲＬｕｃ８．６ＳＧを使用した場合の、ライセートにおける各発光基質の発光輝度を示すグラフである。発光酵素としてＲＬｕｃ８．６ＳＧを使用した場合の、各発光基質の発光スペクトルである。発光酵素としてＮａｎｏＬｕｃを使用した場合の、生細胞における各発光基質の発光輝度を示すグラフである。発光酵素としてＮａｎｏＬｕｃを使用した場合の、ライセートにおける各発光基質の発光輝度を示すグラフである。発光酵素としてＮａｎｏＬｕｃを使用した場合の、各発光基質の発光スペクトルである。

　以下に、本発明のセレンテラジン誘導体を、その実施形態に基づき、詳細に例示説明する。

＜セレンテラジン誘導体＞
　本発明のセレンテラジン誘導体は、上記一般式（１）又は（２）で表されることを特徴とする。
　本発明のセレンテラジン誘導体は、天然型のセレンテラジン（ｎＣＴＺ）に対して、イミダゾピラジノン骨格の６位のヒドロキシフェニル基が酸素又は窒素を含む二環式構造に変換されている点［一般式（１）］、又は、８位のベンジル基中のメチレン基がチオエーテルに変換されている点［一般式（２）］で、天然型のセレンテラジンと相違し、該化学構造の相違に基づき、天然型のセレンテラジンとは異なる酵素特異性を有する。
　また、本発明のセレンテラジン誘導体は、天然型のセレンテラジンとは異なる酵素特異性を有しつつも、発光輝度の低下が抑制されており、生体内のイメージングに十分な発光輝度を保持しており、海洋生物由来の発光系における発光基質として利用できる。

　なお、本発明のセレンテラジン誘導体を発光基質とする発光のメカニズムは、特に限定されるものではないが、天然型のセレンテラジンと同様に、まず、イミダゾピラジノン骨格が、塩基によって７位のＮＨが脱プロトン化されアニオン状態となり、続いて、三重項酸素へ一電子移動し、ラジカルカップリングにより過酸化物アニオンを生成し、この過酸化物アニオンが環化してジオキセタノン中間体を生成し、この分解による脱炭酸により一重項励起状態のアミドピラジンが生成し、これが基底状態に遷移して発光するものと考えられる。また、発光酵素（ルシフェラーゼ）の環境によっては、ジオキセタノンアニオンのプロトン化が起き、中性のジオキセタノンからアミドピラジンの中性種の励起分子が生成して、発光する経路もあり得る。

（一般式（１）で表されるセレンテラジン誘導体）
　本発明の第１の実施態様のセレンテラジン誘導体は、下記一般式（１）で表される。

　上記一般式（１）中、Ｒ^１は、下記一般式（１－１－１）、（１－１－２）、（１－１－３）又は（１－１－４）：

で表される。一般式（１）中のイミダゾピラジノン骨格の６位に対する、一般式（１－１－１）、（１－１－２）、（１－１－３）又は（１－１－４）中のベンゼン環の結合部位は、特に限定されない。
　上記一般式（１－１－４）中、Ｒ^１－１は、炭素数１～４の炭化水素基（特には、炭素鎖）であり、Ｒ^１－２は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数（特には、偶数）である。

　上記一般式（１－１－４）中のＲ^１－１は、炭素数１～４の炭化水素基であるので、一般式（１－１－４）で表される基は、ベンゼン環に４～７員環が縮合した構造を有する。Ｒ^１－１は、炭素数１～４の直鎖の炭化水素基であることが好ましい。
　Ｒ^１－１としての、炭素数１～４の炭化水素基には、ｍ個（２～８個）の置換基Ｒ^１－２が、結合しており、即ち、Ｒ^１－１は、炭素数１～４の、４～１０価の炭化水素基である。置換基Ｒ^１－２は、炭化水素基の水素を置換するものである。また、Ｒ^１－１としての、炭素数１～４の炭化水素基は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。
　Ｒ^１－１が炭素数１の炭化水素基である場合（Ｒ^１－１がＮ及びベンゼン環と共に４員環を形成する場合）、ｍは２であることが好ましい。炭素数１の４価の炭化水素基としては、メタン－テトライル基が挙げられる。
　また、Ｒ^１－１が炭素数２の炭化水素基である場合（Ｒ^１－１がＮ及びベンゼン環と共に５員環を形成する場合）、ｍは２又は４であることが好ましい。この場合、Ｒ^１－１は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^１－１が飽和の場合、ｍは４であり、Ｒ^１－１が不飽和の場合、ｍは２であることが好ましい。炭素数２の４価の炭化水素基（炭素鎖）としては、エテン－テトライル基が挙げられ、炭素数２の６価の炭化水素基（炭素鎖）としては、エタン－ヘキサイル基が挙げられる。
　また、Ｒ^１－１が炭素数３の炭化水素基である場合（Ｒ^１－１がＮ及びベンゼン環と共に六員環を形成する場合）、ｍは２、４又は６であることが好ましい。この場合、Ｒ^１－１は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^１－１が飽和の場合、ｍは６であることが好ましく、Ｒ^１－１が不飽和の場合、ｍは４又は２であることが好ましい。炭素数３の４価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロピン－テトライル基が挙げられ、炭素数３の６価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロペン－ヘキサイル基が挙げられ、炭素数３の８価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロパン－オクタイル基が挙げられる。
　また、Ｒ^１－１が炭素数４の炭化水素基である場合（Ｒ^１－１がＮ及びベンゼン環と共に七員環を形成する場合）、ｍは２、４、６又は８であることが好ましい。この場合、Ｒ^１－１は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^１－１が飽和の場合、ｍは８であることが好ましく、Ｒ^１－１が不飽和の場合、ｍは６、４又は２であることが好ましい。炭素数４の６価の炭化水素基（炭素鎖）としては、ブタジエン－ヘキサイル基が挙げられ、炭素数４の８価の炭化水素基（炭素鎖）としては、ブテン－オクタイル基が挙げられ、炭素数４の１０価の炭化水素基としては、ブタン－デカイル基が挙げられる。

　上記一般式（１－１－４）中のＲ^１－２は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、炭素数１～３の炭化水素基としては、炭素数１～３のアルキル基、炭素数２～３のアルケニル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。炭素数２～３のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。

　ここで、上記一般式（１）中のＲ^１は、上記一般式（１－１－３）で表されることが好ましい。一般式（１）中のＲ^１は、上記一般式（１－１－３）で表される場合、発光輝度が向上する。

　上記一般式（１）中、Ｒ^２は、－Ｒ^２’又は－ＣＨ_２－Ｒ^２’で表され、ここで、Ｒ^２’は、下記一般式（１－２－１）、（１－２－２）、（１－２－３）、（１－２－４）又は（１－２－５）：

で表される。一般式（１）中のイミダゾピラジノン骨格の８位に対する、一般式（１－２－１）、（１－２－２）、（１－２－３）、（１－２－４）又は（１－２－５）中のベンゼン環の結合部位は、特に限定されない。
　上記一般式（１－２－１）中、Ｒ^２－１は、水素、ハロゲン、－Ｎ（Ｒ^{２－１－１}）_２又は－ＯＲ^{２－１－１}であり、ここで、Ｒ^{２－１－１}は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。
　上記一般式（１－２－５）中、Ｒ^２－２は、炭素数１～４の炭化水素基（特には、炭素鎖）であり、Ｒ^２－３は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数（特には、偶数）である。

　上記一般式（１－２－１）中のＲ^２－１に関して、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素等が挙げられる。
　Ｒ^２－１が－Ｎ（Ｒ^{２－１－１}）_２又は－ＯＲ^{２－１－１}である場合、Ｒ^{２－１－１}は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。ここで、炭素数１～３の炭化水素基としては、炭素数１～３のアルキル基、炭素数２～３のアルケニル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。炭素数２～３のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。

　上記一般式（１－２－５）中のＲ^２－２は、炭素数１～４の炭化水素基であるので、一般式（１－２－５）で表される基は、ベンゼン環に４～７員環が縮合した構造を有する。Ｒ^２－２は、炭素数１～４の直鎖の炭化水素基であることが好ましい。
　Ｒ^２－２としての、炭素数１～４の炭化水素基には、ｍ個（２～８個）の置換基Ｒ^２－３が、結合しており、即ち、Ｒ^２－２は、炭素数１～４の、４～１０価の炭化水素基である。置換基Ｒ^２－３は、炭化水素基の水素を置換するものである。また、Ｒ^２－２としての、炭素数１～４の炭化水素基は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。
　Ｒ^２－２が炭素数１の炭化水素基である場合（Ｒ^２－２がＮ及びベンゼン環と共に４員環を形成する場合）、ｍは２であることが好ましい。炭素数１の４価の炭化水素基としては、メタン－テトライル基が挙げられる。
　また、Ｒ^２－２が炭素数２の炭化水素基である場合（Ｒ^２－２がＮ及びベンゼン環と共に５員環を形成する場合）、ｍは２又は４であることが好ましい。この場合、Ｒ^２－２は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^２－２が飽和の場合、ｍは４であることが好ましく、Ｒ^２－２が不飽和の場合、ｍは２であることが好ましい。炭素数２の４価の炭化水素基（炭素鎖）としては、エテン－テトライル基が挙げられ、炭素数２の６価の炭化水素基としては、エタン－ヘキサイル基が挙げられる。
　また、Ｒ^２－２が炭素数３の炭化水素基である場合（Ｒ^２－２がＮ及びベンゼン環と共に六員環を形成する場合）、ｍは２、４又は６であることが好ましい。この場合、Ｒ^２－２は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^２－２が飽和の場合、ｍは６であることが好ましく、Ｒ^２－２が不飽和の場合、ｍは４又は２であることが好ましい。炭素数３の４価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロピン－テトライル基が挙げられ、炭素数３の６価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロペン－ヘキサイル基が挙げられ、炭素数３の８価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロパン－オクタイル基が挙げられる。
　また、Ｒ^２－２が炭素数４の炭化水素基である場合（Ｒ^２－２がＮ及びベンゼン環と共に七員環を形成する場合）、ｍは２、４、６又は８であることが好ましい。この場合、Ｒ^２－２は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^２－２が飽和の場合、ｍは８であることが好ましく、Ｒ^２－２が不飽和の場合、ｍは６、４又は２であることが好ましい。炭素数４の６価の炭化水素基（炭素鎖）としては、ブタジエン－ヘキサイル基が挙げられ、炭素数４の８価の炭化水素基（炭素鎖）としては、ブテン－オクタイル基が挙げられ、炭素数４の１０価の炭化水素基としては、ブタン－デカイル基が挙げられる。

　上記一般式（１－２－５）中のＲ^２－３は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、炭素数１～３の炭化水素基としては、炭素数１～３のアルキル基、炭素数２～３のアルケニル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。炭素数２～３のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。

　ここで、上記一般式（１）中のＲ^２は、－ＣＨ_２－Ｒ^２’で表されることが好ましく、また、該Ｒ^２’が、上記一般式（１－２－１）で表されることが好ましい。一般式（１）中のＲ^２が－ＣＨ_２－Ｒ^２’で表され、該Ｒ^２’が、上記一般式（１－２－１）で表される場合、発光輝度が向上する。

　上記一般式（１）中、Ｒ^３は、下記一般式（１－３－１）、（１－３－２）又は（１－３－３）：

で表される。
　上記一般式（１－３－２）中、Ｒ^３－１は、水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。

　上記一般式（１－３－２）中のＲ^３－１に関して、炭素数１～３の炭化水素基としては、炭素数１～３のアルキル基、炭素数２～３のアルケニル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。炭素数２～３のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。

　ここで、上記一般式（１）中のＲ^３は、上記一般式（１－３－２）で表されることが好ましい。一般式（１）中のＲ^３が上記一般式（１－３－２）で表される場合、発光輝度が向上する。
　また、上記一般式（１－３－２）中のＲ^３－１は、水素であることが好ましい。一般式（１）中のＲ^３が上記一般式（１－３－２）で表され、Ｒ^３－１が水素である場合、発光輝度が更に向上する。

（一般式（２）で表されるセレンテラジン誘導体）
　本発明の第２の実施態様のセレンテラジン誘導体は、下記一般式（２）で表される。

　上記一般式（２）中、Ｒ^４は、水素、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１、－Ｎ（Ｒ^４－１）_２又は－ＣＦ^３であり、ここで、Ｒ^４－１は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｎは、０～３の整数である。一般式（２）中のイミダゾピラジノン骨格の６位に結合しているベンゼン環に対するＲ^４の結合位置は、ｏ－でも、ｍ－でも、ｐ－でもよい。
　Ｒ^４が－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１又は－Ｎ（Ｒ^４－１）_２である場合、Ｒ^４－１は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。ここで、炭素数１～３の炭化水素基としては、炭素数１～３のアルキル基、炭素数２～３のアルケニル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。炭素数２～３のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。

　ここで、上記一般式（２）中のＲ^４は、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１で表されることが好ましい。一般式（２）中のＲ^４が－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１で表される場合、発光輝度が向上する。
　また、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１中のｎは０であることが好ましく、Ｒ^４－１は水素であることが好ましい。即ち、上記一般式（２）中のＲ^４は、－ＯＨであることが特に好ましい。一般式（２）中のＲ^４が－ＯＨである場合、発光輝度が更に向上する。

　上記一般式（２）中、Ｒ^５は、下記一般式（２－５－１）、（２－５－２）、（２－５－３）、（２－５－４）又は（２－５－５）：

で表される。一般式（２）中のＳに対する、一般式（２－５－１）、（２－５－２）、（２－５－３）、（２－５－４）又は（２－５－５）中のベンゼン環の結合部位は、特に限定されない。
　上記一般式（２－５－１）中、Ｒ^５－１は、水素、ハロゲン、－Ｎ（Ｒ^{５－１－１}）_２又は－ＯＨであり、ここで、Ｒ^{５－１－１}は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。
　上記一般式（２－５－５）中、Ｒ^５－２は、炭素数１～４の炭化水素基（特には、炭素鎖）であり、Ｒ^５－３は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数（特には、偶数）である。

　上記一般式（２－５－１）中のＲ^５－１に関して、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素等が挙げられる。
　Ｒ^５－１が－Ｎ（Ｒ^{５－１－１}）_２である場合、Ｒ^{５－１－１}は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。ここで、炭素数１～３の炭化水素基としては、炭素数１～３のアルキル基、炭素数２～３のアルケニル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。炭素数２～３のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。

　上記一般式（２－５－５）中のＲ^５－２は、炭素数１～４の炭化水素基であるので、一般式（２－５－５）で表される基は、ベンゼン環に４～７員環が縮合した構造を有する。Ｒ^５－２は、炭素数１～４の直鎖の炭化水素基であることが好ましい。
　Ｒ^５－２としての、炭素数１～４の炭化水素基には、ｍ個（２～８個）の置換基Ｒ^５－３が、結合しており、即ち、Ｒ^５－２は、炭素数１～４の、４～１０価の炭化水素基である。置換基Ｒ^５－３は、炭化水素基の水素を置換するものである。また、Ｒ^５－２としての、炭素数１～４の炭化水素基は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。
　Ｒ^５－２が炭素数１の炭化水素基である場合（Ｒ^５－２がＮ及びベンゼン環と共に４員環を形成する場合）、ｍは２であることが好ましい。炭素数１の４価の炭化水素基としては、メタン－テトライル基が挙げられる。
　また、Ｒ^５－２が炭素数２の炭化水素基である場合（Ｒ^５－２がＮ及びベンゼン環と共に５員環を形成する場合）、ｍは２又は４であることが好ましい。この場合、Ｒ^５－２は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^５－２が飽和の場合、ｍは４であることが好ましく、Ｒ^２－２が不飽和の場合、ｍは２であることが好ましい。炭素数２の４価の炭化水素基（炭素鎖）としては、エテン－テトライル基が挙げられ、炭素数２の６価の炭化水素基としては、エタン－ヘキサイル基が挙げられる。
　また、Ｒ^５－２が炭素数３の炭化水素基である場合（Ｒ^５－２がＮ及びベンゼン環と共に六員環を形成する場合）、ｍは２、４又は６であることが好ましい。この場合、Ｒ^５－２は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^５－２が飽和の場合、ｍは６であることが好ましく、Ｒ^５－２が不飽和の場合、ｍは４又は２であることが好ましい。炭素数３の４価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロピン－テトライル基が挙げられ、炭素数３の６価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロペン－ヘキサイル基が挙げられ、炭素数３の８価の炭化水素基（炭素鎖）としては、プロパン－オクタイル基が挙げられる。
　また、Ｒ^５－２が炭素数４の炭化水素基である場合（Ｒ^５－２がＮ及びベンゼン環と共に七員環を形成する場合）、ｍは２、４、６又は８であることが好ましい。この場合、Ｒ^５－２は、飽和にも、不飽和にもなり得る。Ｒ^５－２が飽和の場合、ｍは８であることが好ましく、Ｒ^５－２が不飽和の場合、ｍは６、４又は２であることが好ましい。炭素数４の６価の炭化水素基（炭素鎖）としては、ブタジエン－ヘキサイル基が挙げられ、炭素数４の８価の炭化水素基（炭素鎖）としては、ブテン－オクタイル基が挙げられ、炭素数４の１０価の炭化水素基としては、ブタン－デカイル基が挙げられる。

　上記一般式（２－５－５）中のＲ^５－３は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、炭素数１～３の炭化水素基としては、炭素数１～３のアルキル基、炭素数２～３のアルケニル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。炭素数２～３のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。

　ここで、上記一般式（２）中のＲ^５は、上記一般式（２－５－１）で表されることが好ましい。一般式（２）中のＲ^５が上記一般式（２－５－１）で表される場合、発光輝度が向上する。
　また、上記一般式（２－５－１）中のＲ^５－１は水素又はハロゲンであることが好ましく、水素又はフッ素であることが更に好ましい。一般式（２）中のＲ^５が一般式（２－５－１）で表され、Ｒ^５－１が水素又はハロゲンである場合、発光輝度が更に向上し、Ｒ^５－１が水素又はフッ素である場合、発光輝度がより一層向上する。

　上記一般式（２）中、Ｒ^６は、水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。
　Ｒ^６に関して、炭素数１～３の炭化水素基としては、炭素数１～３のアルキル基、炭素数２～３のアルケニル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。炭素数２～３のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。

　ここで、上記一般式（２）中のＲ^６は、水素であることが好ましい。一般式（２）中のＲ^６が水素である場合、発光輝度が向上する。

（一般式（１）で表されるセレンテラジン誘導体の合成方法）
　上記一般式（１）で表されるセレンテラジン誘導体は、特に限定されるものではないが、例えば、以下のようにして合成することができる。
（ｉ－１）まず、２－アミノ－３，５－ジブロモアミノピラジンとベンジルマグネシウムクロリド及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリドを用いたカップリング反応により、ベンジル体を合成する。
（ｉ－２）次に、ベンジル体とボロン酸を用いて鈴木・宮浦カップリングを行い、６位に所望の環構造を導入したベンジル体を合成する。
（ｉｉ－１）或いは、２－アミノ－３，５－ジブロモアミノピラジンとボロン酸を用いて鈴木・宮浦カップリングを行い、フェニル体を合成する。
（ｉｉ－２）次に、フェニル体で再度鈴木・宮浦カップリングを行い、６位に所望の環構造を導入したフェニル体を合成する。
（ｉｉｉ）最後に、６位に所望の環構造を導入したベンジル体又はフェニル体をケトアセタール体と縮合環化反応させ、目的物質である一般式（１）で表されるセレンテラジン誘導体を合成することができる。

（一般式（２）で表されるセレンテラジン誘導体の合成方法）
　上記一般式（２）で表されるセレンテラジン誘導体は、特に限定されるものではないが、例えば、以下のようにして合成することができる。
（ｉ）まず、２－アミノ－３，５－ジブロモアミノピラジンとボロン酸を用いて鈴木・宮浦カップリングを行い、６位に所望の環構造を導入した中間体を合成する。
（ｉｉ）ＮＢＳを用いてブロモ化させ、８位をブロモ化した中間体を合成する。
（ｉｉｉ）８位をブロモ化した中間体とチオールを水素化ナトリウムで置換反応を行い、チオール体を合成する。ここで、所望により、チオール体と三臭化ホウ素を反応させ、脱メチル化反応させてもよい。
（ｉｖ）最後に、チオール体をケトアセタール体と縮合環化反応させ、目的物質である一般式（２）で表されるセレンテラジン誘導体を合成することができる。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、海洋生物発光酵素を触媒とした酸化反応により、発光する。そのため、本発明のセレンテラジン誘導体は、生物学的測定／検出における発光標識として利用でき、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、核酸等を標識するために使用できる。なお、本発明のセレンテラジン誘導体をこれらの物質に結合させる方法は、当業者に周知であり、例えば、当業者に周知の方法を使用して、目的の物質のカルボキシル基やアミノ基に対して本発明のセレンテラジン誘導体を結合させることができる。

　また、本発明のセレンテラジン誘導体は、発光基質の発光によって、海洋生物発光酵素活性を検出することを利用した測定／検出に利用することもできる。例えば、海洋生物発光酵素遺伝子を導入した細胞又は動物に対して、本発明のセレンテラジン誘導体を投与することにより、インビボにおける標的遺伝子又はタンパク質の発現等を測定／検出することができる。

　なお、本発明のセレンテラジン誘導体の中でも、上記一般式（２）で表されるセレンテラジン誘導体は、天然型のセレンテラジンよりも長波長光を発することが可能であり、長波長光は生体内での透過率が高いため、生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として有用である。

　本発明のセレンテラジン誘導体を発光基質（ルシフェリン）として用いる場合、発光酵素（ルシフェラーゼ）としては、天然のものでも、人工のものでも使用できる。
　天然の発光酵素としては、ウミシイタケ（Renilla reniformis）由来のルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）、海洋性カイアシ（Gaussia princeps）由来のルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、発光エビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼ（Ｏｌｕｃ）、ウミサボテン由来のルシフェラーゼ等が挙げられる。
　また、人工の発光酵素としては、発光エビ（Oplophorus gracilirostris）由来の人工の発光酵素であるＰｒｏｍｅｇａ社製の「ＮａｎｏＬｕｃ」、ウミシイタケ（Renilla reniformis）由来の人工の発光酵素であるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８．６－５３５ＳＧ（ＲＬｕｃ８．６ＳＧ）、産業技術総合研究所の金誠培博士らによって開発された発光プランクトン由来の人工発光酵素群であるＡＬｕｃ等が挙げられる。ここで、ＡＬｕｃには、種々の人工発光酵素があり、例えば、ＡＬｕｃ１６、ＡＬｕｃ４７、ＡＬｕｃ４９等が挙げられる。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、ルシフェラーゼ特異性を有し、酵素により発光輝度が大きく異なる。そのため、本発明のセレンテラジン誘導体によれば、生体内で起こる分子イベント、癌の転移等、複数の生体内現象を同時に高感度且つ高速に可視化することが可能となり、例えば、多数の発光酵素標識が共存している中で、特定の発光酵素のみを光らせることが可能となる。

　なお、これら海洋生物発光酵素は、分子サイズが小さく、生体内に導入しても、生体への負荷が小さく、また、生体内に遺伝子を導入した場合の発現効率が高いという利点もある。

　海洋生物発光酵素を産生可能な遺伝子の生体内への組み込み方法は、特に限定されず、例えば、ベクターを用いた方法を利用することができる。かかる海洋生物発光酵素をコードするベクターの作製も、特に限定されず、公知の方法で作製することができる。また、かかるベクターとしては、市販品を使用することもでき、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の「Ｒ－ｌｕｃ」や、Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｇａｍｂｈｉｒ　ｌａｂ．製の「Ｒ－ｌｕｃ８」、「Ｒ－ｌｕｃ８．６_５４７」等を使用することもできる。また、Ｍｉｒｕｓ社製のＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１試薬を用いて、生細胞に海洋生物由来の発光酵素をコードするプラスミドを一過性発現させてもよい。

　なお、本発明のセレンテラジン誘導体は、溶液として使用することが好ましい。ここで、溶液の調製に使用する溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール等のアルコールが挙げられる。また、溶液中のセレンテラジン誘導体の濃度は、目的に応じて適宜選択できるが、例えば、１ｍＭ～５ｍＭの範囲が好ましい。

　以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。

＜ケトアセタール体（５）の合成＞
　市販されている4-ベンジルオキシベンジルアルコール（３）（2g, 9.33 mmol）を乾燥ジクロロメタン（15 mL）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、0℃で攪拌した。混合物に塩化チオニル（1.35 mL, 1.64 mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で2時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、ジクロロメタン（100 mL×3）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮した。析出した固体をヘキサン洗浄し、化合物（４）を白色固体で得た（1.6 g, 6.84 mmol, 74 %）。

・化合物（４）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 7.43-7.37 (m, 4H), 7.34-7.33 (m, 1H), 7.31 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 6.95 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 5.07 (S, 2H), 4.56 (S, 2H)

　マグネシウム削り状（391 mg, 16.09 mmol）を乳鉢で削り、脱気しアルゴン雰囲気下にした後、超脱水テトラヒドロフラン（10 mL）と1,2-ジブロモエタン（0.2 mL）を加え、1時間攪拌した。この反応混合物に、脱水テトラヒドロフラン（10 mL）で溶解させた化合物（４）（1.5 g, 6.45 mmol）を加え、2時間加熱還流した後、反応混合物（グリニャール試薬）を氷冷した。超脱水テトラヒドロフラン（10 mL）に溶解させたジエトキシ酢酸エチル（1.72 mL, 9.67 mmol）を－80℃に冷却した後、上記グリニャール試薬を20分かけて全て滴下し、－80℃で3時間攪拌した。冷却したまま水でクエンチを行い、室温に戻した後、酢酸エチル（200 mL×3）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮した。残渣をエタノール（30 mL）で溶解させ、パラジウム炭素（160 mg）を加え、室温で水素雰囲気下、12時間攪拌した。反応混合物をセライトろ過した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（w = 65 g, φ = 4.0 cm, ヘキサン:酢酸エチル = 4 : 1 → 3 : 1）で精製し、ケトアセタール体（５）を薄黄色油状で得た（669 mg, 2.81 mmol, 43 %）。

・ケトアセタール体（５）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 7.05 (dd, J = 11.5, 2.9 Hz, 2H), 6.75 (dd, J = 11.5, 3.4 Hz, 2H), 5.58 (S, 1H), 4.65 (S, 1H), 3.82 (S, 2H), 3.73-3.67 (m, 2H), 3.58-3.52 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.2 Hz, 6H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+Na]⁺ C₁₃H₁₈Na₁O₄の計算値 261.11141; 実測値 261.11028

＜構造式（１－１）で表される化合物の合成＞
　塩化亜鉛（2.7 g, 19.77 mmol）と1M ベンジルマグネシウムクロリド－テトラヒドロフラン溶液（22 mL, 19.77 mmol）をアルゴン雰囲気化で1時間攪拌した。この混合物に超脱水テトラヒドロフラン（22 mL）で溶解させたビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド（351 mg, 0.49 mmol）と、2-アミノ-3,5-ジブロモピラジン（６）（2.5 g, 9.89 mmol）を加え、4日間室温で攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチル（200 mL×3）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（w = 170 g, φ = 4.0 cm, ヘキサン:酢酸エチル = 4 : 1 → 3 : 1 ）で精製し、化合物（７）を黄色油状で得た（2.1 g, 7.98 mmol, 81 %）。

・化合物（７）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.03 (s, 1H), 7.34-7.21 (m, 5H), 4.41 (s, 2H), 4.08 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₁H₁₁ ⁷⁹Br₁N₃の計算値 264.01363; 実測値 264.01253
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₁H₁₁ ⁸¹Br₁N₃の計算値 266.01103; 実測値 266.01159

　化合物（７）（150 mg, 0.567 mmol）と市販されている1,4-ベンゾジオキサン-6-ボロン酸（133 mg, 0.741 mmol）を1,4-ジオキサン（5 mL）に溶解し、簡易脱気した後、アルゴン雰囲気下にした。この混合物にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（32 mg, 0.028 mmol）と、2 M炭酸ナトリウム水溶液（5 mL）を加え、110℃で1.5時間攪拌した。反応混合物を室温に戻した後、水を加え酢酸エチル（60 mL×2）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで（w = 60 g, φ = 3.0 cm, ヘキサン:酢酸エチル = 1 : 1 → 酢酸エチル）精製し、化合物（８）を薄黄色固体で得た（142 mg, 0.444 mmol, 78 %）。

・化合物（８）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, ACETONE-D6) δ 8.35 (s, 1H), 7.48 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.45 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.30 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.21 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.54 (s, 1H), 4.29 (s, 4H), 4.16 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₉H₁₈N₃O₂の計算値 320.13956; 実測値 320.13990

　基質（８）（30 mg, 0.094 mmol）とケトアセタール体（５）（33 mg, 0.14 mmol）をエタノール（2 mL）で溶解させた後、12 M塩酸（100μL）加え、60℃で12時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、自動分取中圧カラムクロマトグラフィー（クロロホルム : メタノール = 99 : 1→85 : 15 ）で精製し、構造式（１－１）で表される化合物（26 mg, 0.056 mmol, 60 %）を黄色固体で得た。

・構造式（１－１）で表される化合物の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, METHANOL-D4, 0.5% TFA-D) δ 8.39 (s, 1H), 7.44 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.41-7.38 (m, 3H), 7.32-7.29 (m, 2H), 7.26-7.23 (m, 1H), 7.10 (dd, J = 11.5, 2.9 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.73 (dd, J = 11.5, 2.9 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 4.29 (m, 4H), 4.17 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₂₈H₂₄N₃O₄の計算値 466.17655; 実測値 466.17668

＜構造式（２－１）で表される化合物の合成＞
　市販されている2-アミノ-5-ジブロモピラジン（９）（2.0 g, 11.49 mmol）と市販されている4-メトキシフェニルボロン酸（2.6 g, 17.24 mmol）を1,4-ジオキサン（30 mL）に溶解し、簡易脱気した後、アルゴン雰囲気下にした。この混合物にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（654 mg, 0.86 mmol）と、2 M炭酸ナトリウム水溶液（30 mL）を加え、110℃で1.5時間攪拌した。反応混合物を室温に戻した後、水を加え、酢酸エチル（200 mL×2）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで（w = 100 g, φ = 4.0 cm, ヘキサン:酢酸エチル = 2 : 1 → 1 : 1）精製し、化合物（１０）を薄黄色固体で得た（2.62 g, 13.03 mmol, 113 %）。

・化合物（１０）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.40 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.81 (td, J = 6.0, 3.4 Hz, 2H), 6.98 (td, J = 6.0, 3.4 Hz, 2H), 4.54 (s, 2H), 3.86 (s, 3H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₆H₁₄N₃O₁の計算値 202.09755; 実測値 202.09804

　化合物（１０）（2.62 g, 13.02 mmol）をクロロホルム（70 mL）で溶解させた後、N-ブロモスクシンイミド（3.01 g, 16.93 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。反応混合物を氷冷した後、水でクエンチし、クロロホルム（100 mL×2）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（w = 50 g, φ = 4.0 cm, ヘキサン:酢酸エチル = 3 : 1 → 2 : 1）で精製し、化合物（１１）を赤褐色固体で得た（2.04 g, 7.31 mmol, 56%）。

・化合物（１１）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.34 (s, 1H), 7.81 (td, J = 6.0, 3.4 Hz, 2H), 6.97 (td, J = 6.0, 3.4 Hz, 2H), 4.99 (s, 2H), 3.85 (s, 3H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₁H₁₁ ⁷⁹Br₁N₃O₁の計算値 280.00907; 実測値 280.00855
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₁H₁₁ ⁸¹Br₁N₃O₁の計算値 282.00530; 実測値 251.00650

　ベンゼンチオール（273 μL, 2.68 mmol）を乾燥N,N-ジメチルホルムアミド（20 mL）で溶解させ、氷冷した後水素化ナトリウム（178 mg, 4.46 mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、0℃で1時間攪拌した。この混合物に化合物（１１）（500 mg, 1.78 mmol）を加え、100℃で2時間攪拌した。反応混合物を室温に戻した後、水を加え、酢酸エチル（200 mL×3）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、トルエンを加え、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（w = 90 g, φ = 3.0 cm, ヘキサン:酢酸エチル = 2 : 1 → 1 : 1）で精製し、化合物（１２）を褐色固体で得た（441 mg, 1.43 mmol, 80 %）。

・化合物（１２）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.30 (s, 1H), 7.71 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 7.49 (dd, J = 8.3, 1.4 Hz, 2H), 7.40-7.35 (m, 3H), 6.91 (dd, J = 6.9, 2.3 Hz, 2H), 4.84 (s, 2H), 3.83 (s, 3H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₇H₁₆N₃O₁S₁の計算値 310.10158; 実測値 310.10141

　化合物（１２）（150 mg, 0.48 mmol）をアルゴン雰囲気下にし、超脱水ジクロロメタン（8 mL）を加え、－80℃で冷却した。反応混合物に三臭化ホウ素（4.8 mL, 4.85 mmol）を加え、室温に戻し、12時間攪拌した。反応混合物を氷冷し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチを行い、クロロホルム（50 mL×3）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（w = 50 g, φ = 2.0 cm, ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 → 1 : 1）で精製し、化合物（１３）を赤褐色固体で得た（115 mg, 0.39 mmol, 81 %）。

・化合物（１３）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, ACETONE-D6) δ 8.31 (s, 1H), 7.64 (dd, J = 6.9, 2.3 Hz, 2H), 7.51 (dt, J = 8.2, 1.9 Hz, 2H), 7.42-7.35 (m, 3H), 6.80 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 5.75 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₆H₁₄N₃O₁S₁の計算値 296.08613; 実測値 296.08576

　化合物（１３）（30 mg, 0.101 mmol）とケトアセタール体（５）（36 mg, 0.153 mmol）をエタノール（2 mL）で溶解させた後、12 M塩酸（100μL）加え、60℃で12時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、自動分取中圧カラムクロマトグラフィー（クロロホルム : メタノール = 99 : 1→85 : 15 ）で精製し、構造式（２－１）で表される化合物（23 mg, 0.052 mmol, 51 %）を赤褐色固体で得た。

・構造式（２－１）で表される化合物の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, METHANOL-D4) δ 8.16 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 7.2, 2.0 Hz, 2H), 7.53-7.49 (m, 5H), 7.11 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.72 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 6.70 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.03 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₂₅H₂₀N₃O₃S₁の計算値 442.12153; 実測値 442.12254

＜構造式（２－２）で表される化合物の合成＞
　構造式（２－１）で表される化合物の合成の項と同様にして、化合物（１１）を合成した。

　4-フルオロベンゼンチオール（285 μL, 2.14 mmol）を乾燥N,N-ジメチルホルムアミド（20 mL）で溶解させ、氷冷した後、水素化ナトリウム（178 mg, 4.46 mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、0℃で1時間攪拌した。この混合物に、化合物（１１）（500 mg, 1.78 mmol）を加え、100℃で2.5時間攪拌した。反応混合物を室温に戻した後、水を加え、酢酸エチル（200 mL×3）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、トルエンを加え、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（w = 95 g, φ = 3.0 cm, クロロホルム : 酢酸エチル= 2 : 1 → 1 : 1）で精製し、化合物（１４）を薄橙色固体で得た（396 mg, 1.21 mmol, 68 %）。

・化合物（１４）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 8.26 (s, 1H), 7.65 (dd, J = 6.9, 2.3 Hz, 2H), 7.54-7.51 (m, 2H), 7.12-7.08 (m, 2H), 6.89 (dd, J = 6.9, 1.7 Hz, 2H), 4.89 (s, 2H), 3.82 (s, 3H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₇H₁₅F₁N₃O₁S₁の計算値 328.09432; 実測値 328.09199

　化合物（１４）（50 mg, 0.15 mmol）をアルゴン雰囲気下にし、超脱水ジクロロメタン（5 mL）を加え、－80℃で冷却した。反応混合物に三臭化ホウ素（0.9 mL, 1.21 mmol）を加え、室温に戻し、12時間攪拌した。反応混合物を氷冷し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチを行い、クロロホルム（15 mL×3）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（w = 30 g, φ = 1.5 cm, ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 → 1 : 1）で精製し、化合物（１５）を黄色固体で得た（38 mg, 0.12 mmol, 76 %）。

・化合物（１５）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, METHANOL-D4) δ 8.15 (s, 1H), 7.57 (td, J = 5.9, 2.5 Hz, 2H), 7.50 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 7.20-7.16 (m, 2H), 6.73 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₁₆H₁₃F₁N₃O₁S₁の計算値 314.07754; 実測値 314.07634

　化合物（１５）（30 mg, 0.096 mmol）とケトアセタール体（５）（34 mg, 0.14 mmol）をエタノール（2 mL）で溶解させた後、12 M塩酸（100μL）加え、60℃で12時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、自動分取中圧カラムクロマトグラフィー（クロロホルム : メタノール = 99 : 1→85 : 15 ）で精製し、構造式（２－２）で表される化合物（22 mg, 0.049 mmol, 51 %）を褐色固体で得た。

・構造式（２－２）で表される化合物の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, METHANOL-D4) δ 8.10 (s, 1H), 7.65 (qd, J = 5.7, 3.0 Hz, 2H), 7.46 (dd, J = 6.9, 2.3 Hz, 2H), 7.24-7.21 (m, 2H), 7.10 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.71 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.69 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 4.02 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₂₅H₁₉F₁N₃O₃S₁の計算値 460.11304; 実測値 460.11311

＜比較化合物（１７）の合成＞
　構造式（１－１）で表される化合物の合成の項と同様にして、化合物（７）を合成した。
　１，４－ベンゾジオキサン－６－ボロン酸に代えて、３－ピリジルボロン酸を使用し、構造式（１－１）で表される化合物の合成と同様にして、比較化合物（１７）を合成した。
　以下に反応スキームを示す。

・比較化合物（１７）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, METHANOL-D4) δ 8.96 (s, 1H), 8.57 (dd, J = 4.9, 1.4 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.52 (dd, J = 8.0, 5.2 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.28 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.22-7.19 (m, 1H), 7.13 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.41 (s, 2H), 4.07 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₂₅H₂₁N₄O₂の計算値 409.16635; 実測値 409.16645

＜比較化合物（１９）の合成＞
　構造式（１－１）で表される化合物の合成の項と同様にして、化合物（７）を合成した。
　１，４－ベンゾジオキサン－６－ボロン酸に代えて、４－ピリジルボロン酸を使用し、構造式（１－１）で表される化合物の合成と同様にして、比較化合物（１９）を合成した。
　以下に反応スキームを示す。

・比較化合物（１９）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, METHANOL-D4) δ 9.17 (s, 1H), 8.90 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 8.72 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.31-7.28 (m, 2H), 7.24-7.21 (m, 1H), 7.11 (dd, J = 11.5, 2.9 Hz, 2H), 6.71 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.17 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₂₅H₂₁N₄O₂の計算値 409.16614; 実測値 409.16645

＜比較化合物（２２）の合成＞
　ベンジルマグネシウムクロリドに代えて、フェニルボロン酸を使用し、また、１，４－ベンゾジオキサン－６－ボロン酸に代えて、４－ヒドロキシボロン酸を使用し、構造式（１－１）で表される化合物の合成と同様にして、比較化合物（２２）を合成した。
　以下に反応スキームを示す。

・比較化合物（２２）の同定結果
　¹H-NMR (500 MHz, METHANOL-D4) δ 8.01 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.65 (s, 1H), 7.60-7.55 (m, 3H), 7.13 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.90 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 6.66 (dd, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 4.03 (s, 2H)
　HR-ESI-MS: m/z: [M+H]⁺ C₂₅H₂₀N₃O₃の計算値 410.14906; 実測値 410.15047

　また、その他の比較基質として、以下に示す天然基質（ｎＣＴＺ）と、公知の天然類似基質１（ＣＴＺｈ、Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ　ｈ）及び天然類似基質２（ＤＢＣ、ＤｅｅｐＢＬｕｅＣ）を使用した。

＜発光スペクトル測定＞
　ＡＴＴＯ株式会社製発光スペクトル装置ＡＢ－１８５０を用いて測定した。
　測定したスペクトルは全て検出器の特性を補正したスペクトルである。

＜生細胞及びライセート細胞での発光測定＞
　発光測定には、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
　また、発光酵素を発現する生細胞（Ｌｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）としては、アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ－７細胞を使用し、また、該生細胞を溶解したライセート（Ｌｙｓａｔｅ）でも評価した。

＜発光輝度の評価＞
　アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ－７細胞を６穴マイクロプレートに植え、７０％の底面積を埋めるほど生えた時点までＣＯ_２インキュベーターで培養する。ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１試薬（Ｍｉｒｕｓ）を用いて各ウェル細胞に、以下の海洋生物由来の各発光酵素をコードするプラスミドを一過性発現させる。
（ｉ）ＡＬｕｃ１６
（ｉｉ）ＡＬｕｃ４７
（ｉｉｉ）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８．６－５３５ＳＧ（ＲＬｕｃ８．６ＳＧ）
（ｉｖ）ＮａｎｏＬｕｃ
　このリポフェクション後、１日間、ＣＯ_２インキュベーターで継続培養する。それから、各細胞を９６穴マイクロプレートにサブカルチャーし、更に１日間培養する。

　同一プラスミドを導入した細胞ウェルを任意に２つに分け、１つはライセートに、もう一方は生細胞実験に充てる。ライセートのためには、まず、９６穴マイクロプレートから細胞培地を除去してから、Ｐｒｏｍｅｇａ製の細胞溶解試薬（ライセート）を各ウェル４０ｍＬずつインジェクトし、１５分間インキュベーションした。一方、生細胞実験のためには、細胞培地だけを完全に除去した後、ただちに蓋をかけ発光測定までに乾燥しないように処置する。

　一方、各発光基質は、最初にメタノール（ＰＥＧ４００、２５％）で５ｍＭになるように溶解し（ストック溶液）、さらにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１００μＭにまで希釈した（以下、希釈発光基質溶液と称する）。事前に、この「希釈発光基質溶液」を何も入っていない９６穴マイクロプレートの各ウェルにそれぞれ分注しておいた。前述した細胞溶解液（ライセート）の入った９６穴ブラックフレームマイクロプレートの各ウェルに４０μＬの「希釈発光基質溶液」が同時に入るように、１２チャンネルマイクロピペットを用いて、同時に注入した。希釈発光基質溶液注入後、直ちにＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にプレートを移し、９６穴ブラックフレームマイクロプレートからの生物発光輝度を測定し、専用ソフトウェアＬｉｖｉｎｇ　Ｉｍａｇｅ　ｖｅｒ．４．７で分析した。
　結果を図１、図２、図４、図５、図７、図８、図１０及び図１１に示す。図１、図２、図４、図５、図７、図８、図１０及び図１１中、構造式（１－１）で表される化合物を「（１－１）」と表記し、構造式（２－１）で表される化合物を「（２－１）」と表記し、構造式（２－２）で表される化合物を「（２－２）」と表記し、比較化合物（１７）を「（１７）」と表記し、比較化合物（１９）を「（１９）」と表記し、比較化合物（２２）を「（２２）」と表記した。

＜生物発光スペクトルの評価＞
　ＣＯＳ－７細胞を６穴マイクロプレートに植え、７０％の底面積を埋めるほど生えた時点までＣＯ_２インキュベーターで培養する。ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１試薬（Ｍｉｒｕｓ）を用いて各ウェル細胞に、以下の海洋生物由来の各発光酵素をコードするプラスミドを一過性発現させる。
（ｉ）ＡＬｕｃ１６
（ｉｉ）ＡＬｕｃ４７
（ｉｉｉ）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８．６－５３５ＳＧ（ＲＬｕｃ８．６ＳＧ）
（ｉｖ）ＮａｎｏＬｕｃ
　このリポフェクション後、１日間、ＣＯ_２インキュベーターで継続培養する。６穴マイクロプレートの細胞培地を完全に除去した後、各ウェルにＰｒｏｍｅｇａ製の細胞溶解試薬（ライセート）を２００μＬずつ加え、１５分間室温でインキュベーションする。
　このライセート２０μＬをＰＣＲチューブにそれぞれ分注し、発光輝度評価時の１００μＭ希釈発光基質溶液２０μＬ添加した。ＰＣＲチューブを直ちに分光光度計（ＡＢ－１８５０、ＡＴＴＯ）に入れ、高感度モードの０．５秒、５秒、１０秒、３０秒の積算モードより生物発光スペクトルを測定した。
　結果を図３、図６、図９及び図１２に示す。図３、図６、図９及び図１２中、構造式（１－１）で表される化合物を「（１－１）」と表記し、構造式（２－１）で表される化合物を「（２－１）」と表記し、構造式（２－２）で表される化合物を「（２－２）」と表記した。

＜結果＞
　図１及び図２から分かるように、構造式（１－１）で表される化合物は、ＡＬｕｃ１６に対して高輝度で発光を示した。また、図４、図５、図７及び図８から分かるように、構造式（１－１）で表される化合物は、ＡＬｕｃ４７及びＲＬｕｃ８．６ＳＧに対して僅かに発光を示した。一方、図１０及び図１１から分かるように、構造式（１－１）で表される化合物は、ＮａｎｏＬｕｃに対しても発光活性を示さなかった。
　このように、構造式（１－１）で表される化合物は、ＡＬｕｃ１６に酵素特異性を有することが確認された。

　図１、図２、図７、図８、図１０及び図１１から分かるように、構造式（２－１）で表される化合物は、ＡＬｕｃ１６、ＲＬｕｃ８．６ＳＧ、ＮａｎｏＬｕｃに対して発光活性を示した。また、図３、図９及び図１２から分かるように、構造式（２－１）で表される化合物は、ＡＬｕｃ１６、ＲＬｕｃ８．６ＳＧ、ＮａｎｏＬｕｃに対して、それぞれ５３８ｎｍ、５７３ｎｍ、５０７ｎｍの発光スペクトルを示した。また、図４及び図５から分かるように、構造式（２－１）で表される化合物は、ＡＬｕｃ４７に対しても発光を示した。
　また、図１、図２、図７及び図８から分かるように、構造式（２－２）で表される化合物は、ＡＬｕｃ１６、ＲＬｕｃ８．６ＳＧに対して発光活性を示し、図４、図１０及び図１１から分かるように、ＡＬｕｃ４７及びＮａｎｏＬｕｃに対して僅かに発光を示した。
　このように、構造式（２－１）又は（２－２）で表される化合物も、酵素特異性を有することが確認された。
　また、構造式（２－１）又は（２－２）で表される化合物は、天然のセランテラジン等に比べて、発光波長が５０ｎｍ程度長波長化することが確認された。

　本発明のセレンテラジン誘導体は、海洋生物由来の発光酵素類における発光基質として利用できる。また、独特な酵素特異性、強い発光輝度、長波長発光特性を示すことから、様々なバイオアッセイにおいて、広く用いられる。例えば、長波長シフトした発光特性のおかげで、生体深部で起こる分子イベントを容易に可視化できる。また、従来と比較して明るいため、バイオアッセイの検出感度や検出限界を改善することができる。また、今回の発光基質が発光特異性を示すことから、多数の検体の中で特定検体を特異的に検出することができる。このようなマルチプレックス性は、バイオアッセイの効率を飛躍的にあげ、診断コスト削減にも大きく貢献する。

Claims

　下記一般式（１）：

［一般式（１）中、Ｒ^１は、下記一般式（１－１－１）、（１－１－２）、（１－１－３）又は（１－１－４）：

で表され、ここで、Ｒ^１－１は、炭素数１～４の炭化水素基であり、Ｒ^１－２は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数であり、
　Ｒ^２は、－Ｒ^２’又は－ＣＨ_２－Ｒ^２’で表され、ここで、Ｒ^２’は、下記一般式（１－２－１）、（１－２－２）、（１－２－３）、（１－２－４）又は（１－２－５）：

で表され、ここで、Ｒ^２－１は、水素、ハロゲン、－Ｎ（Ｒ^{２－１－１}）_２又は－ＯＲ^{２－１－１}であり（ここで、Ｒ^{２－１－１}は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。）、Ｒ^２－２は、炭素数１～４の炭化水素基であり、Ｒ^２－３は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数であり、
　Ｒ^３は、下記一般式（１－３－１）、（１－３－２）又は（１－３－３）：

で表され、ここで、Ｒ^３－１は、水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。］、又は、
　下記一般式（２）：

［一般式（２）中、Ｒ^４は、水素、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１、－Ｎ（Ｒ^４－１）_２又は－ＣＦ^３であり、ここで、Ｒ^４－１は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｎは、０～３の整数であり、
　Ｒ^５は、下記一般式（２－５－１）、（２－５－２）、（２－５－３）、（２－５－４）又は（２－５－５）：

で表され、ここで、Ｒ^５－１は、水素、ハロゲン、－Ｎ（Ｒ^{５－１－１}）_２又は－ＯＨであり（ここで、Ｒ^{５－１－１}は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。）、Ｒ^５－２は、炭素数１～４の炭化水素基であり、Ｒ^５－３は、それぞれ独立して水素又は炭素数１～３の炭化水素基であり、ｍは、２～８の整数であり、
　Ｒ^６は、水素又は炭素数１～３の炭化水素基である。］で表されることを特徴とする、セレンテラジン誘導体。
　上記一般式（１）で表され、
　Ｒ^１が、上記一般式（１－１－３）で表される、請求項１に記載のセレンテラジン誘導体。
　上記一般式（１）で表され、
　Ｒ^２が、－ＣＨ_２－Ｒ^２’で表され、ここで、Ｒ^２’が、上記一般式（１－２－１）で表される、請求項１又は２に記載のセレンテラジン誘導体。
　上記一般式（１）で表され、
　Ｒ^３が、上記一般式（１－３－２）で表される、請求項１～３のいずれか一項に記載のセレンテラジン誘導体。
　下記構造式（１－１）：

で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載のセレンテラジン誘導体。
　上記一般式（２）で表され、
　Ｒ^４が、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＲ^４－１で表される、請求項１に記載のセレンテラジン誘導体。
　上記一般式（２）で表され、
　Ｒ^５が、上記一般式（２－５－１）で表される、請求項１又は６に記載のセレンテラジン誘導体。
　上記一般式（２）で表され、
　Ｒ^６が、水素である、請求項１、６及び７のいずれか一項に記載のセレンテラジン誘導体。
　下記構造式（２－１）又は（２－２）：

で表される、請求項１及び６～８のいずれか一項に記載のセレンテラジン誘導体。