WO2024089346A1 - Nouvelle utilisation d'un peptide pour ameliorer la matrice extracellulaire du derme de la peau et/ou des muqueuses - Google Patents

Nouvelle utilisation d'un peptide pour ameliorer la matrice extracellulaire du derme de la peau et/ou des muqueuses Download PDF

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WO2024089346A1
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peptide
skin
healthy
dermis
seq
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PCT/FR2023/051646
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Nicolas Berthelemy
Sébastien CADAU
David Herault
Philippe Moussou
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BASF Beauty Care Solutions France SAS
Original Assignee
BASF Beauty Care Solutions France SAS
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    • A61Q19/005—Preparations for sensitive skin

Definitions

  • the subject of the present invention is the use of a peptide of sequence SEQ ID No. 1 and/or its homologs, derivatives and/or salts, optionally in a fermentate of a microorganism producing it or in a protein hydrolyzate, for improve the extracellular matrix fibers of the dermis of the skin and/or mucous membranes, in particular the flexibility and/or density of the skin, including the scalp, and/or mucous membranes and/or the anchoring of the skin appendages , preferably hair, in particular to prevent and/or reduce hair loss.
  • the present invention also relates to the applications of this peptide in cosmetic and/or dermatological compositions.
  • the extracellular matrix plays an essential role in the structure of tissues of the human and animal body, in particular through its functions of support, adhesion and regulation of cellular exchanges.
  • the ECM is largely made up of glycoproteins, proteins and glycosaminoglycans. These molecules are synthesized in native form in cells in contact with the ECM. From the intracellular compartment, they are excreted outside the cells. After maturation phenomena, they are organized and arranged into a network of fibers which forms the ECM. In this fibrillar form, they are then in their functional form.
  • ECM molecules are thus particularly studied in the cosmetic and pharmaceutical fields where many ingredients aim to prevent and compensate for this degradation to improve the general condition of the dermis.
  • One of the classic approaches consists of inhibiting proteases, thus preventing the degradation of elastic fibers. This purely prophylactic action does not, however, restore the properties of the MEC once they have been reduced.
  • a second approach then consists of stimulating the synthesis of pro-collagen I and elastin proteins by fibroblasts.
  • the mere increase in these syntheses measured on cells in culture in vitro does not necessarily translate into a greater quantity of functional molecules, that is to say, organized in the ECM. This approach is therefore not sufficient to restore some of the skin's properties, notably flexibility and density.
  • Elastin is synthesized in the form of soluble tropoelastin by fibroblasts and acquires its physicochemical properties, notably stretchability and return to the initial state after stretching, after its crosslinking by enzymes of the lysyl oxidases family and its deposition on fibrillin-rich microfibrils in the extracellular matrix to form mature elastic fibers.
  • fibrillins and in particular fibrillin-1, fibulin-5, EMILIN-1, and MFAP4 (Microfibril Associated Protein 4) are also particularly important in the formation of these mature elastic fibers.
  • the present invention thus aims to provide a new cosmetic and/or dermatological active ingredient to improve the ECM fibers of the dermis of the skin, in particular of the scalp as well as the mucous membranes.
  • the present invention also aims to provide a new cosmetic and/or dermatological active ingredient to improve the density and/or flexibility of the skin and/or mucous membranes.
  • the present invention also aims to provide a new cosmetic and/or dermatological active ingredient for the specific care and/or treatment needs of skin and/or mucous membranes having a weakened and/or altered ECM of the dermis, in particular under the effect of agents aggressive, which is particularly the case for sensitive and/or sensitized skin and/or mucous membranes.
  • the inventors have discovered that the peptide of SEQ ID No. 1, its homologs, salts and/or derivatives is capable of improving the fibers of the ECM of the dermis.
  • SEQ ID No. 1 has already been described in the field of cosmetics among a large number of peptides derived from rice and peas in patent application W02017009484A1 (as SEQ ID No. 349) in as an anti-inflammatory capable of inhibiting the secretion of TNFalpha by macrophages in the presence of lipopolysaccharides, as well as in patent application W02017009490A1 (as SEQ ID No. 245) as an agent capable of increasing the cell proliferation in the basal lamina of the epidermis and to have a mitotic effect on the basal lamina of the epidermis and thus treat the visible signs of aging.
  • This peptide is naturally present in a rice grain protein Oryza sativa, from which it can be obtained. However, it is not naturally present in sufficient quantity to be detected and produce the properties which are the subject of the invention. In the context of the present invention, it was obtained by chemical synthesis and by a biotechnological production process using a yeast Saccharomyces cerevisiae. However, it can also be obtained by enzymatic hydrolysis of rice grain as described in patent applications W02017009484A1 and W02017009490A1. [001 l]Although there are also a large number of rice peptide hydrolysates on the cosmetics market, they differ greatly in terms of their profile and their composition, in particular by the different protein fragments that they contain.
  • the enzymes are chosen so as to obtain the peptides of interest and lead to the obtaining of specific hydrolysates, very different with regard to the peptide fragments they contain, whether in terms of the nature of the fragments. , molecular weight and distribution.
  • the subject of the invention is thus the non-therapeutic cosmetic use of the peptide of SEQ ID No. 1, its homologs, derivatives and/or salts to improve the ECM fibers of the dermis of healthy skin and/or healthy mucous membranes.
  • This peptide has a number of additional advantages in that it also increases the synthesis of collagen 1 by fibroblasts, and reduces inflammation by inhibition of the release of TNF alpha by macrophages and by inhibition of the release of interleukin -8 by keratinocytes.
  • the peptide according to the invention through its complementary properties, provides a perfectly adapted and complete solution for the care and/or treatment of sensitive and/or sensitized skin and/or mucous membranes.
  • the peptide of SEQ ID No. 1 according to the invention can be obtained by chemical synthesis according to conventional methods.
  • the peptide of SEQ ID No. 1 is obtained by synthesis by a recombinant microorganism, preferably by a bacterium such as Escherichia coli or by a yeast of the genus Pichia or Saccharomyces, preferably S. cerevisiae .
  • the peptide of SEQ IDN°1 is used in combination in the fermentate of the microorganism producing it.
  • the peptide according to the invention is in the form of a hydrolyzate of Oryza sativa rice proteins, advantageously with a peptide content of at least equal to or greater than 0.00001% by weight of material. dry relative to the total weight of the hydrolyzate, preferably between 0.0001% and 10%, more preferably between 0.001% and 3%, by weight of dry matter relative to the total weight of the hydrolyzate.
  • the peptide according to the invention is the peptide of SEQ ID No. 1: TVFDGVLRPGQL
  • This peptide contains the 12 amino acids: Tyr Val Phe Asp Gly Val Leu Arg Pro Gly Gin Leu and has an average molecular weight of 1301.51 g/mol.
  • This sequence of 12 amino acids is naturally present in rice grain proteins (Oryza sativa) and the peptide can be obtained by enzymatic hydrolysis of rice grains as described in patent applications W02017009484A1 and W02017009490A1, or by chemical synthesis or biotechnology according to conventional methods in the field. It can also be purified or obtained as indicated in Example 1.
  • peptide means any isolated, natural or synthetic amino acid sequence, where appropriate capable of being obtained by chemical or biotechnological synthesis or by extraction from a biological tissue. , for example a plant, an animal or a microorganism, in particular yeast, expressing naturally or after transduction the amino acid sequence, possibly after post-translational modification thereof.
  • derivative is meant the peptide modified by adding a functional group, for example coupled with a hydrophilic or hydrophobic penetrating agent, stability agent or with a protective group according to conventional methods known to man. of the art, in particular by acylation of the terminal -NH2 group, or amidation or alkylation of the terminal -COOH group. This may in particular involve grafting onto the free -NH 2 group of the last amino acid, a carboxyl group comprising 1 to 24 carbons, saturated or unsaturated, linear or branched and which may also contain -OH groups, -SH, COOH or CONH 2 .
  • It may also involve grafting onto the free COOH group of the last amino acid, an amide group (-CONH 2 ) or an alkoxy group onto the free -COOH group of the last amino acid, said group comprising 1 to 24 carbons, saturated or unsaturated, linear or branched and may also contain - OH, -SH, COOH or CONH 2 groups.
  • the term “homolog” of an amino acid sequence means an amino acid sequence having a sequence identity of at least 85%, more preferably 90%, in particular of at least 95%, and more particularly at least 98%, more preferably at least 99% with said sequence and having biological activity of the same nature.
  • sequence homology can be identified by any standard technique in the field, for example via the BLAST computer interface available on the NCBI website at the address http://blast.ncbi.nlm.nih.gov configured with the default settings.
  • a homolog of an amino acid sequence may differ from this sequence, for example, by one or more deletion(s) and/or insertion(s), and/or one or more substitution(s) of an amino acid.
  • a homolog of an amino acid sequence may comprise one or more conservative amino acid substitutions.
  • a conservative substitution is the replacement, in a sequence of an amino acid by another amino acid having physicochemical properties substantially similar, or sufficiently close to those of the original amino acid, so that the properties and functions of the peptide are not, or substantially not, affected.
  • the changes in amino acid sequences presented above can be generally referred to as “mutations”.
  • homologs of the peptides according to the invention also relate to mutants and variants of the amino acid sequences of the invention having a biological activity of the same nature.
  • biological activity of the same nature of an amino acid sequence of the invention is meant in particular its capacity to present the properties according to the invention.
  • salts means the peptide comprising a counterion coming from the acid used during cleavage after its chemical synthesis.
  • Salts of the peptide according to the invention include trifluoroacetate, acetate and hydrogen chloride.
  • the peptide according to the invention can thus be presented in the form of its homolog, its salt, and/or its derivative.
  • the peptide according to the invention is exactly that of SEQ 1.
  • the amino acids constituting the peptide according to the invention can be in their L, D or DL forms. Preferably, they are all under the L configuration.
  • the term "improving the fibers of the extracellular matrix (ECM) of the dermis” means improving the structure and/or organization and/or density of the collagen and/or elastic fibers of the dermis. extracellular matrix of the dermis. This improvement is measured by an increase in the number of functional fibers in the extracellular matrix of the dermis and results in an increase in the flexibility and/or density properties of the skin and/or mucous membranes.
  • the use according to the invention is to increase the density and/or flexibility of healthy skin and/or healthy mucous membranes.
  • this property can be measured according to conventional techniques, in particular by measuring the elastic modulus (or Young's modulus), for example on a model of reconstructed skin - the improvement of the ECM fibers of the dermis then results in a reduction in the value of the elastic modulus measured after treatment with the peptide according to the invention compared to the value obtained without treatment.
  • Such a method is described in Example 4.
  • this property can be measured according to conventional techniques, in particular by determining the total density of the dermis by measuring the echogenicity of ultrasound in the dermis.
  • the improvement in the density of the fiber network of the ECM of the dermis results in an increase in the total density value of the dermis measured after treatment of the skin with the peptide according to the invention in comparison with untreated skin. Such a method is described in Example 6.
  • the improvement of the fibers of the extracellular matrix of the dermis does not include the increase in the synthesis of collagen and elastin, which is not sufficient in itself to induce an improvement of the fibers of the dermis. extracellular matrix, particularly for sensitive and/or sensitized skin. Furthermore, preferably, the use according to the present invention is not for the prevention and/or treatment of signs of aging.
  • the improvement of the fibers of the extracellular matrix of the dermis is measured by the increase in the quantity of fibrillin 1 in the fibers of the ECM of the dermis and/or by the increase in the quantity of EMILIN-1 in the fibers of the ECM of the dermis and/or by increasing the quantity of collagen fibers in the extracellular matrix of the dermis.
  • the use according to the invention is to increase the quantity of fibrillin 1 in the ECM fibers of the healthy dermis and/or to increase the quantity of EMILIN-1 in the ECM fibers of the healthy dermis and/or or to increase the quantity of collagen fibers in the extracellular matrix of the healthy dermis.
  • the use according to the invention is also to increase the quantity of fibulin-5 synthesized by the fibroblasts of the healthy dermis and/or to increase the quantity of MFAP4 synthesized by the fibroblasts of the healthy dermis and therefore to increase the synthesis of fibulin. 5 and/or MFAP4 by the fibroblasts of the healthy dermis.
  • the quantity of fibrillin 1 in the ECM of the dermis can be measured by immunostaining in a reconstructed skin model, as for example described in example 2, and the increase can be evaluated in the presence of the peptide according to the invention by comparison with the measurement carried out in the absence of this peptide.
  • the quantity of EMILIN-1 in the ECM of the dermis can be measured by immunostaining in a model of reconstructed skin, as for example described in Example 2, and the increase can be evaluated in the presence of the peptide according to the invention by comparison with the measurement carried out in the absence of the peptide.
  • the quantity of ECM collagen fibers can be measured by measuring the intensity of a second harmonic signal by confocal photon microscopy, as described in Example 3.
  • the quantities of fibulin-5 and/or MFAP4 synthesized by dermal fibroblasts can be measured by immunostaining on a lysate of dermal fibroblasts after culture, as for example described in Example 5, and the increase can be evaluated after culture in the presence of the peptide according to the invention by comparison with the measurement carried out after culture in the absence of the peptide.
  • the peptide according to the invention is also suitable for improving the anchoring of skin appendages, in particular of hair.
  • the peptide according to the invention thus makes it possible to prevent and/or reduce loss of skin appendages, particularly hair loss.
  • appanal appendages means nails and “keratin fibers”.
  • keratin fibers is meant the hair fiber (the hair), the eyelashes, the eyebrows, the hairs in particular of the nasal mucosa, the ears, the beard and/or the mustache.
  • the peptide according to the invention is thus particularly suitable for the care and/or treatment of sensitive or sensitized skin and/or mucous membranes.
  • sensitive skin and/or mucous membranes can be defined as healthy skin and/or healthy mucous membranes which, by nature, have very little tolerance for aggressive agents, particularly environmental agents such as as polluting agents, climatic factors (wind, cold, heat), UV exposure, emotional factors including stress and/or chemical agents (heavy metals, detergents, compounds contained in cosmetic treatments such as perfumes, preservatives, alcohols, pH, AHA or dermatological such as acidic vitamin A) and/or aggressive conditions including perspiration and mechanical attacks such as hair removal, shaving, rubbing and even water, particularly hard water.
  • Sensitive skin is not pathological skin unlike allergic skin.
  • the “sensitive skin” character can be estimated by the subject himself with subjective skin sensations or by the dermatologist with objective skin reactions.
  • sensitive skin and/or mucous membranes will appear in well-defined locations such as, for example, the scalp, the face, skin folds, the buttocks in infants, etc. These may therefore be areas of sensitive skin and/or mucous membranes.
  • “sensitized skin and/or mucous membranes” are healthy skin and/or healthy mucous membranes made temporarily sensitive and therefore not pathological as such.
  • cosmetics means a non-pharmaceutical, non-therapeutic use, which is not intended for the prevention and/or treatment of skin and/or mucous membranes and/or appendages classified as pathological. by a specialist in the field, such as a dermatologist. It is therefore for use on healthy skin and/or mucous membranes and/or appendages.
  • healthy skin in particular healthy scalp and/or healthy mucosa and/or healthy appendages
  • healthy appendages means all or part of an area of skin, in particular the scalp and/or mucous membrane and/or healthy appendages, in particular human appendages.
  • a dermatologist that is to say therefore not presenting cancer, infection, scar, disease or affection skin such as candidiasis, impetigo, psoriasis, eczema, acne, ichthyosis, gingivitis or dermatitis or sores or injuries or canker sores or ulceration or burns and/or other dermatoses, or aphthoses or inflammation (especially sunburn) or irritation, or urticaria or allergy such as contact allergy or pathologies associated with a decrease in ECM fibers and/or a decrease in the content of Fibrillin -1 and/or the content of EMILIN -1 and /or a reduction in the quantity of collagen fibers and/or any of their combinations, in particular solar elastose.
  • the healthy skin and/or mucous membrane according to the invention is not likely to develop a pathology associated with a reduction in ECM fibers and/or a reduction in the Fibrillin -1 content and/or the content in EMILIN -1 and/or a reduction in the quantity of collagen fibers and/or any of their combinations, in particular solar elastose.
  • skin means the skin of all or part of the body, in particular human body, including the scalp, chosen from the face, hands, arms, neckline, legs. , the neck, back, shoulders, stomach, wrists, forearms, ankles, thighs, nape of the neck, scalp, joint folds and/or armpits, labial mucous membranes, preferably the face , particularly around the eyes and/or mouth and forehead.
  • the skin is that which can be exposed to attacks, in particular likely to degrade the fibers of the ECM, in particular the areas of exposure to aggressive environmental agents or to chemical agents, friction and/or maceration. . This concerns more particularly the face, scalp, hands, neck, Vietnameselleté, joint folds and/or armpits.
  • the term “mucous membrane(s)” means the ocular, nasal, vaginal, anal mucosa and/or the oral mucosa, in particular the oral-labial mucosa, preferably the labial, ocular and /or nasal.
  • the application is topically, advantageously on specific parts and/or areas of the body chosen from the scalp, face, hands, arms, neckline, legs, neck, the back, shoulders, stomach, wrists, forearms, ankles, thighs, neck, joint folds, and/or armpits, labial mucous membranes.
  • topically acceptable means an ingredient suitable for topical application, non-toxic, non-irritating to the skin. and/or mucous membranes and/or skin appendages, which does not induce an allergic response and which is not chemically unstable.
  • the peptide according to the invention can be obtained by chemical synthesis, by biotechnological synthesis using a microorganism by producing naturally or recombinantly and/or by enzymatic hydrolysis of a biological material containing in particular a microorganism , of plant or animal nature.
  • the peptide is used in the form of a rice protein hydrolyzate (Oryza sativa), that is to say a peptide hydrolyzate of Oryza sativa , in particular enriched with peptide according to the invention, preferably in liquid form.
  • a rice protein hydrolyzate Oryza sativa
  • a peptide hydrolyzate of Oryza sativa in particular enriched with peptide according to the invention, preferably in liquid form.
  • the peptide is used in the form of a fermentate of microorganisms by producing, preferably a recombinant yeast, more preferably chosen from recombinant yeasts of the Genus Pichia or Saccharomyces, again more preferably Saccharomyces cerevisiae yeast, in particular genetically modified to produce this sequence, said fermentate being preferentially enriched with peptide according to the invention.
  • the peptide is used in a form purified from a hydrolyzate or a fermentate by the usual techniques for purifying peptides, in particular chosen from membrane filtration, chromatography, precipitation and/or immunoprecipitation.
  • hydrolyzate means the product of chemical and/or enzymatic hydrolysis of biological material containing and/or producing, naturally or by genetic modification, the peptide according to the invention, such as animal, plant or microorganism material, particularly yeast.
  • the term “fermentate” means the must of fermentation by a microorganism producing, naturally or by genetic modification, the peptide according to the invention, in particular yeast or bacteria.
  • the ferment thus corresponds to the culture medium containing the nutrients necessary for the growth and multiplication of the microorganism as well as the fermentation products excreted by the microorganism or released during lysis of the microorganism.
  • the term "the hydrolyzate or fermentate enriched with peptide according to the invention” means a hydrolyzate or a fermentate in which the peptide of SEQ ID No. 1, according to the invention, is detected at a content going beyond the threshold of the detection limit with sensitive techniques in the matter, for example LC-MS, that is to say in general a content at least equal to or greater than 0.00001% by weight in peptide relative to the total dry matter weight of the hydrolyzate or fermentate.
  • the peptide SEQ ID No. 1 is contained in a hydrolyzate, preferably in a quantity of at least equal to or greater than 0.00001% by weight of dry matter relative to the weight total of the hydrolyzate, preferably between 0.0001% and 10%, more preferably between 0.001% and 1%, by weight of dry matter relative to the total weight of the hydrolyzate.
  • the peptide hydrolyzate (or protein hydrolyzate) of rice is obtained by enzymatic hydrolysis in a single step.
  • the hydrolyzate can be obtained by successive hydrolysis using the same enzyme or a mixture of enzymes.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out by one or more proteolytic enzymes, which may be proteases of plant origin or from microorganisms.
  • the enzymatic hydrolysis takes place until its completion, which can be determined by those skilled in the art in a known manner, for example by determining the constant pH or by photometry using the detection of free NH 2 groups or by determining the constant quantity of peptides SEQ ID No. 1 by liquid chromatography and mass spectroscopy.
  • the quantity of enzyme(s) used is not critical in itself, but must be in the range of 0.05 to 5%, preferably 0.1 to 2% by weight relative to to the weight of the starting material containing the peptide.
  • the hydrolysates obtained can finally be treated, for example by filtration of the undissolved fractions.
  • the pH is preferably set at values between 3.0 and 7.5, preferably between 3.5 and 5.5.
  • the peptide according to the invention can be obtained by chemical synthesis according to conventional techniques in the field, in particular those described.
  • the peptide according to the invention will have a purity level of at least 50%, preferably at least 70%, advantageously at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% (w/w ).
  • the peptide according to the invention can be obtained by biotechnological synthesis, in particular from a recombinant strain of bacteria or yeast, that is to say genetically modified to produce the peptide. according to the invention.
  • the yeast strain is preferably chosen from Pichia and Saccharomyces, in particular Saccharomyces cerevisiae.
  • the production of the peptide by a yeast strain conventionally comprises the following steps:
  • the peptide according to the invention is produced as described in example le).
  • the peptide is contained in the fermentate and used directly in this form.
  • the hydrolysates or fermentates obtained are in liquid form, in particular aqueous solutions, and can be used directly or in concentrated form; they preferably have a dry matter content in the range of 1 to 50% by weight, preferably 5 to 30% by weight relative to the total weight of the hydrolyzate or fermentate.
  • Adjuvants can be added such as polyols, glycols, acids (citric acid, sorbic acid, sulfuric acid, benzoic acid or their salts, etc.).
  • the hydrolysates or fermentates obtained at this stage can be further concentrated and/or purified to select the targeted molecular weight fractions, by successive stages of ultrafiltration or nanofiltration through filters of variable porosity, or by means of a chromatographic type method, for example to specifically enrich the fermentate or the hydrolyzate with these peptides.
  • peptide hydrolysates or fermentates according to the invention in powder form by drying (atomized, freeze-dried, etc.) with or without a support such as mannitol, maltodextrin, cyclodextrin, according to conventional formulation techniques known to those skilled in the art.
  • the preferred hydrolyzate or fermentate according to the invention contains the peptide of SEQ ID No. 1, in a total content at least equal to or greater than 0.00001% by weight relative to the total weight in dry matter of the hydrolyzate or fermentate, preferably between 0.0001% and 10%, more preferably between 0.001% and 3%, even more preferably between 0.01% and 1%.
  • the average molecular weight expressed in dalton (or g/mol) is determined by steric exclusion chromatography known to those skilled in the art.
  • the rice peptide hydrolyzate according to the invention can be obtained by carrying out the following steps:
  • hydrolysis preferably the hydrolysis is carried out enzymatically by means of proteolytic enzymes, preferably of plant origin or derived from microorganisms, by selecting the enzyme or enzymes and adjusting the temperature and pH conditions to obtain the right degree of hydrolysis and molecular weight profile;
  • this inactivation is carried out according to the technical recommendation of the supplier(s) of the enzyme(s);
  • the rice protein hydrolyzate enriched with peptide according to the invention which is in liquid form and which also constitutes an embodiment of the invention.
  • the peptide according to the invention pure or in the form of hydrolyzate enriched in peptide or fermentate enriched in peptide, is used topically.
  • the term “topical route” means the application of the peptide according to the invention, preferably in the form of hydrolyzate or fermentate enriched with peptide and/or the composition and/or of the ingredient according to the invention on the surface of the skin, in particular the scalp and/or mucous membranes, and/or skin appendages, preferably hair, in particular by direct application or by vaporization.
  • cosmetic ingredient(s) and/or pharmaceutical(s) means one or more plant extracts and/or one or more natural or synthetic molecules and/or mixtures thereof. intended for cosmetic and/or pharmaceutical application.
  • Cosmetic ingredients are defined in particular by the international nomenclature of cosmetic ingredients (INCI).
  • suitable cosmetic or pharmaceutical vehicle means that the composition or components thereof are suitable for use in contact with human skin and/or mucous membranes without toxicity. , incompatibility, instability, allergic response, or their equivalents, undue.
  • the cosmetic or pharmaceutical ingredient in particular dermatological in liquid form containing the peptide according to the invention, in particular in the form of a fermentate enriched with peptide according to the invention and in particular that of example IC, can be used in a cosmetic or pharmaceutical composition, in particular dermatological, preferably at a content by weight of dry matter relative to the total weight of the composition of between 0.01 and 10%, advantageously between 0.1 and 5%, in particular between 0.2 and 3%.
  • the peptide according to the invention is found under the form of a cosmetic composition comprising it and further advantageously comprising a suitable cosmetic vehicle.
  • the peptide according to the invention in particular the peptide of SEQ ID No. 1, preferably in the form of the fermentate enriched with peptide, is present in the cosmetic or pharmaceutical composition in a content of between lxl0' 5 % to 10% by weight, preferably from lxl0' 5 % to 0.1% by weight, more advantageously from lxl0' 4 % to 0.01% by weight of dry matter relative to the weight total composition.
  • compositions according to the invention may contain any suitable solvent and/or any suitable vehicle and/or any suitable excipient, possibly in combination with other compounds of interest. They may in particular contain a cosmetically or dermatologically acceptable excipient and/or an appropriate cosmetic or pharmaceutical vehicle chosen from surfactants, preservatives, buffering agents, swelling agents, chelating agents, biocidal agents, denaturants, opacifying agents.
  • a cosmetically or dermatologically acceptable excipient and/or an appropriate cosmetic or pharmaceutical vehicle chosen from surfactants, preservatives, buffering agents, swelling agents, chelating agents, biocidal agents, denaturants, opacifying agents.
  • the excipient(s) and/or vehicle(s) are chosen from the group comprising polyglycerols, esters, polymers and cellulose derivatives, lanolin derivatives, phospholipids, lactoferrins, lactoperoxidases, sucrose-based stabilizers, vitamin E and its derivatives, xanthan gums, natural and synthetic waxes, vegetable oils, triglycerides, unsaponifiables, phytosterols, silicones, protein hydrolysates, betaines , aminoxides, plant extracts, sucrose esters, titanium dioxides, glycines, and parabens, and more preferably from the group consisting of steareth-2, steareth-21, glycol-15 stearyl ether, cetearyl alcohol, phenoxyethanol, methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, butylene glycol, caprylyl glycol, natural tocophe
  • the cosmetic or pharmaceutical composition or the peptide preferably the hydrolyzate or the fermentate enriched with peptide according to the invention possibly in the form of a cosmetic or pharmaceutical ingredient, can be presented in all the galenic forms conventionally used for topical application. such as liquid or solid forms or even in the form of liquid under pressure.
  • aqueous or oily solution an aqueous cream or gel or an oily gel, in particular in a pot or tube, in particular a shower gel, a shampoo, a milk, an emulsion, a hydrogel, a microemulsion or a nanoemulsion, in particular oil-in-water or water-in-oil or multiple or silicone, a serum, a lotion, in particular in a glass or plastic bottle or in a measuring bottle or in an aerosol, an ampoule, a liquid soap, a paste, a dermatological bar, an ointment, a foam, an aerosol, a mask, a patch, an anhydrous product, preferably liquid, pasty or solid, for example in the form of a stick, particularly in the form of a stick or powder, particularly for makeup.
  • the composition is in the form of a serum, a lotion, a cream, a milk, an ointment, a paste, a foam, an emulsion, a hydrogel, a shower gel, a mask, a stick of a patch, or makeup powders, advantageously a cream or a lotion.
  • the composition is in the form of a cream, lotion for the skin and/or hair or a shampoo, conditioner, rinseable or not (leave-on type).
  • the peptide according to the present invention preferably the fermentate enriched with peptide according to the invention, has the advantage of not attacking and/or stripping the skin and/or mucous membranes allowing the sebum level to be maintained and is suitable for all particularly for the care and/or treatment of sensitive and/or sensitized skin and/or mucous membranes.
  • the cosmetic or pharmaceutical composition or the peptide according to the invention may be in the form of an eye drop, an lotion, an aerosol, a gel, or a mucoadhesive composition.
  • the cosmetic or pharmaceutical composition may also comprise other cosmetic or pharmaceutical ingredients, active in the treatment of the skin and/or mucous membranes and/or integuments inducing a complementary or synergistic effect with the peptide according to the invention, chosen for example from active cosmetic ingredients known as anti-aging.
  • the cosmetic or pharmaceutical composition will contain the peptide according to the invention, preferably in the form of a fermentate enriched with peptide, in combination with at least one other ingredient selected from:
  • - retinol preferably at a dose of between 0.01% and 1% by weight of dry matter relative to the total weight of the composition
  • composition - vitamin C preferably at a dose of between 0.5% and 25% by weight of dry matter relative to the total weight of the composition - vitamin E, preferably at a dose of between 0.02% and 0.5% by weight of dry matter relative to the total weight of the composition
  • - niacinamide preferably at a dose of between 0.1% and 10% by weight of dry matter relative to the total weight of the composition
  • - hyaluronic acid preferably at a dose of between 0.01% and 3% by weight of dry matter relative to the total weight of the composition
  • the subject of the present invention is such a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising the peptide according to the invention and one of the ingredients selected above chosen from retinol, vitamin C, vitamin E, niacinamide, hyaluronic acid, a hydrolyzate extracted from Hibiscus escuientus seed flour and a mixture thereof.
  • Such a composition is particularly useful by topical application to healthy skin and/or healthy mucous membranes to prevent and/or reduce the signs of aging of the skin and/or mucous membranes, chrono and/or UV induced and/or to improve the fibers of the extracellular matrix of the dermis of healthy skin and/or healthy mucous membranes.
  • the peptide according to the invention could also be used in association with cosmetic ingredients active on sensitive skin, in particular the protein extract of de-oiled ungerminated seed of Moringa oieifera marketed under the trade name Purisoft®, a plant extract of Cestrum iatifoiium marketed under the name Symbiocell TM, a butter extracted from the fruit of the Irvingia gabonensis tree marketed under the name IrwinolTM, an extract of 'Eperua faicata root marketed under the name EperulineTM, an N-acetyl- peptide L-Tyrosyl-L-Prolyl-L-Phenylalanyl-L- Phenylalaninamide (INCI: Acetyl Tetrapeptide 15) marketed under the name SkinasensylTM, an extract of Inonotus marketed under the name InolixirTM by the Applicant.
  • Purisoft® a plant extract of Cestrum iat
  • the peptide according to the present invention could also be used in combination with ingredients active on the skin and/or mucosal microbial flora and/or active on the barrier function of the skin, in particular moisturizing and/or soothing active ingredients, including a oligosaccharide obtained by enzymatic synthesis marketed by the company Solabia under the name BioEcoliaTM or a complex of alpha-glucooligosaccharides marketed by the same company under the name EcoskinTM, an extract of A'/isma p/antago-aquatica, an extract dA' rgania spinosa (LipofructylTM Argan), a mixture of ceramides (SphingocerylTM VEG), purifying extracts of Bo/do (BetapurTM), products based on inulin or fructooligosaccharides, extracts of bifidobacteria or even a extract of Orthosiphon stamineus to combat oily skin (
  • the present invention also relates to a method of non-therapeutic cosmetic care and/or treatment comprising application topically, in particular daily, to at least one area of healthy skin, advantageously a healthy scalp, and/ or healthy mucosa and/or healthy integuments, the peptide according to the invention and/or its homologs, salts and/or derivatives, preferably in the form of a fermentate enriched with peptide according to the invention or of a composition cosmetic according to the invention, to improve the fibers of the ECM of the dermis of healthy skin and/or healthy mucous membranes, in particular the structure and/or organization and/or density of the collagen and/or elastic fibers of the extracellular matrix of the dermis, more particularly to increase the density and/or flexibility of healthy skin and/or healthy mucous membranes.
  • the area of skin and/or mucous membrane is chosen from the scalp, the face, the hands, the arms, the neckline, the legs, the neck, the back, the shoulders, the stomach, the wrists, forearms, ankles, thighs, neck, joint folds and/or armpits, labial mucous membranes.
  • the invention also relates to a cosmetic treatment method for improving the ECM fibers of the dermis of healthy skin, and/or healthy mucous membranes of an individual who needs it/who has it. wishes including the steps:
  • the subject of the present invention is also the peptide of SEQ ID No. 1 and/or its homologs and/or its salts and/or its derivatives according to the present invention, preferably in the form of a fermentate enriched in peptide according to the invention, for its use alone or in a pharmaceutical composition, in particular dermatological, comprising it, in the treatment and/or prevention of at least one pathology associated with a drop in ECM fibers and/or with a reduction in the Fibrillin -1 content and/or the EMILIN -1 content and/or a reduction in the quantity of collagen fibers and/or any of their combinations, such as for example solar elastosis.
  • the peptide is present in a pharmaceutical composition, in particular dermatological, in a content of between lxl0' 6 % to 10% by weight, preferably from lxl0" 5 % to 0.1% by weight, even advantageously from lxl0 ' 4 % to 0.01% by weight, of dry matter per relative to the total weight of the composition, said composition further advantageously comprising a suitable pharmaceutical vehicle, advantageously a suitable dermatological vehicle.
  • each example has a general scope.
  • the temperature is expressed in degrees Celsius and the pressure is atmospheric pressure.
  • Figures 1A-1B-1C represent 3 photographs obtained by confocal microscopy of a histological section of skin reconstructed after immunostaining of filaggrin (in green): 1A-untreated control; lB-after treatment with 0.00001% (0.1 pg/ml) of peptide according to the invention; IC- after treatment with 0.0001% (1 pg/ml) of peptide according to the invention.
  • Figures 2A-2B-2C represent three photographs obtained by confocal microscopy of a histological section of skin reconstructed after immunostaining of EMILIN -1 (in green): 2A-untreated control; 2B-after treatment with 0.00001% (0.1 pg/ml) of peptide according to the invention; 2C- after treatment with 0.0001% (1 pg/ml) of peptide according to the invention.
  • FIG. 3A-3B Figures 3A-3B represent two photographs obtained by multiphoton confocal microscopy of a reconstructed dermis and visualization of the second harmonic signal (SHG) (in white): 3A-untreated control; 3B- after treatment with 0.0001% (1 pg/ml) of peptide according to the invention. Tl
  • This 12 amino acid peptide can be obtained from a rice protein hydrolyzate (Oryza sativa) obtained by enzymatic hydrolysis with a single proteinase or as described in patent application W02017009484A1 for obtaining the sequence SEQ ID No. 349 or as described in patent application W02017009490A1 for obtaining SEQ ID No. 245. lB)
  • the peptide according to the invention was obtained by chemical synthesis at a purity of 99.4% determined by HPLS-UV.
  • the identity of the peptide according to the invention was confirmed by LC-MS by the spectrum of the peptide comprising ions 1305.5 (M+H+) and 651 (M+2H+).
  • l.C From a recombinant microorganism fermentate
  • An expression system for the peptide according to the invention coupled to export signal sequences was constructed in the yeast Saccharomyces cerevisiae for the production and secretion of the peptide in the culture medium.
  • the transgenic yeast was grown on a standard medium (SY-2) containing glucose as a carbon source, ammonium sulfate as a nitrogen source and minerals (KH 2 PO 4 , MgSO 4 , Na 2 SO 4 , NaCI, CaCI 2 ) as well as vitamins and having a pH 4.1.
  • a bioreactor was seeded with an inoculation rate of 7% (w/w) in the standard SY medium -2 compared to the total weight of yeast and culture medium.
  • the culture was carried out at 30°C, the pH regulated at 4, the partial pressure of oxygen (pO 2 ) regulated at a minimum of 30% by action on agitation and a maximum aeration of 0.3 WM.
  • pO 2 partial pressure of oxygen
  • the fermentation must is recovered and centrifuged to recover the supernatant and remove the yeast biomass.
  • This supernatant was concentrated between 5 and 10 times by evaporation under vacuum at 25°C, and activated carbon was added at a concentration of 25% (w/w) of activated carbon relative to the dry mass of the concentrate.
  • the liquid obtained is lyophilized to obtain a powder with a peptide content according to the invention of 2984 pg/g determined by HPLC-UV.
  • the identity of the peptide was confirmed by LC-MS by the spectrum of the peptide comprising the ions 1305.5 (M+H+) and 651 (M+2H+).
  • a 3D reconstructed skin model (Mimeskin) was used to evaluate the performance of the peptide according to the invention obtained by chemical synthesis as described in Example 1B).
  • a quantity of 2xl0 6 fibroblasts was seeded on a dermal culture support containing a mixture of collagen, glycosaminoglycans (GAG) and chitosan (Mimedisc) and cultured in immersion at 37°C with 5% CO 2 for 56 days for the phase construction of the dermis, then 10 6 keratinocytes were seeded and cultured for 7 days for the keratinocyte proliferation phase. Then, the models were placed at the air-liquid interface for the keratinocyte differentiation phase, and the culture was continued for 14 days.
  • the cultures were treated or not (untreated control) with the peptide according to the invention in aqueous solution at a dose of 0.1 pg/mL or 1 pg/mL from day 2 and every 2 days except when the cells were seeded.
  • histological sections were made using a cryostat. After fixation, sections were immunostained for detection of fibrillin-1 and EMILIN-1 in fluorescence (Fig. 1A-1B-1C and 2A-2B-2C, green). Evans blue was used as a counterstain for visualization of overall morphology (in red).
  • Observations were performed using a confocal laser scanning microscope (TCS-SP2, Leica) and the percentage surface occupancy of the targeted protein on the dermis surface was quantified by image analysis. THE Results are expressed as an average percentage compared to the untreated control standardized to 100%. The statistical analysis was carried out versus the untreated control after checking the normality of the distribution of values (Shapiro-Wilk test) with the Student's t test. The significance threshold is 5%.
  • the peptide according to the invention stimulated fibrillin-1 by +69% and +87% respectively.
  • the peptide according to the invention stimulated EMILIN-1 by +19% and +27% respectively.
  • FIGS 2A-2B-2C illustrate the increase in EMILIN-1 which is a ligand for microfibrils participating in their correct organization and functionality in the extracellular matrix.
  • the peptide according to the invention therefore makes it possible to increase the content of fibrillin 1 and Emilin-1 and therefore the organization of elastic microfibrils.
  • a 3D reconstructed dermis model (Mimederm) was used to evaluate the performance of the peptide obtained by chemical synthesis.
  • 2xl0 6 fibroblasts were seeded on a dermal culture support containing a mixture of collagen, glycosaminoglycans (GAG) and chitosan (Mimedisc) and cultured in immersion at 37°C with 5% CO 2 for 56 days.
  • the cultures were treated or not (untreated control) with the peptide according to the invention obtained by chemical synthesis (described in Example 1B) in aqueous solution at a dose of 1 pg/mL from day 2 and every day. 2 days.
  • SHG second harmonic signal
  • SHG imaging is a specific technique for observing collagen fibrils and fibers in the extracellular matrix. Collagen organized into fibrils have a non-centrosymmetric structure which is necessary to produce a SHG signal.
  • the SHG signal is visualized in white in Figures 3A-3B (autofluorescence of the cells on the surface and of the reconstructed skin support visualized in green).
  • results are expressed as an average percentage compared to the untreated control standardized to 100%.
  • the statistical analysis was carried out versus the untreated control after checking the normality of the distribution of values (Shapiro-Wilk test) with the Student's t test.
  • the significance threshold is 5%.
  • Figs. 3A-3B illustrate the greater presence of organized collagen fibers in the extracellular matrix of the dermis. A much greater intensity of the SHG signal is observed in Fig. 3B showing a greater density of collagen fibers in the extracellular matrix when the peptide according to the invention was present. Analysis of the volume occupied by the SHG signal also shows an increase in the quantity of these fibers in the extracellular matrix of +68% in the presence of the peptide according to the invention compared to the untreated control.
  • a 3D reconstructed skin model (Mimeskin) was used to evaluate the performance of the peptide according to the invention obtained by fermentation of a recombinant yeast as described in Example 1C).
  • 2xl0 6 fibroblasts were seeded on a dermal culture support containing a mixture of collagen, glycosaminoglycans (GAG) and chitosan (Mimedisc) and cultured in immersion at 37°C with 5% CO 2 for 57 days for the construction phase of the dermis, then 10 6 keratinocytes were seeded and cultured for 7 days for the keratinocyte proliferation phase.
  • the models were placed at the air-liquid interface for the keratinocyte differentiation phase, and the culture was continued for 14 days.
  • the cultures were treated or not (untreated control) with the peptide according to the invention in aqueous solution at a dose of 0.8 pg/mL or 3 pg/mL from day 2 and every 2 days except when the cells were seeded.
  • 3 histological sections were made using a cryostat, and measurements of the elastic modulus were made by Atomic Force Microscopy (AFM) on the dermis with a conical probe. of 0.5 N/m. The results are expressed as average value over the different cryosections.
  • AFM Atomic Force Microscopy
  • Elastic modulus is the quantity that measures a material's resistance to elastic deformation when a force is applied to it. The higher the elastic modulus of the material, the stiffer it is. Conversely, the lower it is, the more flexible the material.
  • the Student's t test was performed and showed results significantly different from the result measured with the untreated model (p ⁇ 0.001) for the two doses tested.
  • the values of the Young's modulus in the absence (untreated) or presence of peptide according to the invention are summarized in Table 1 below.
  • Example 5 Evaluation of the properties of the peptide according to the invention on fibulin-5 and on MFAP4
  • Mature and functional elastic fibers in the ECM require the assembly of various glycoproteins including fibulin-5 and MFAP4 (Microfibril Associated Protein 4).
  • An assay on culture of human dermal fibroblasts was used to evaluate the performance of the peptide according to the invention obtained by synthesis as described in Example 1B) on the synthesis of these glycoproteins.
  • Human dermal fibroblasts were seeded at 5x10 4 cells/cm 2 and cultured with a defined medium (FGM) in immersion at 37° C. with 5% CO2 until confluence.
  • FGM defined medium
  • the cells When confluence was reached, the cells were incubated for 48 hours in the presence or absence (untreated control) of the peptide according to the invention (example 1B) in aqueous solution at a dose of 0.1 pg/mL and 1 pg/ mL. Then, the cells were collected and lysed to measure the level of fibulin-5 in the lysate. The culture medium was collected to measure the level of MFAP4. The concentration in the samples was determined by a BCA assay in order to adjust the deposition of each sample to the same protein concentration for Western blot analysis.
  • the levels of fibulin-5 and MFAP4 were increased by +22% and +38% respectively at the dose of 0.1 pg/ml of the peptide.
  • the peptide according to the invention therefore makes it possible to increase the content of fibulin-5 and MFAP4 synthesized by fibroblasts and therefore to contribute to the organization of elastic microfibrils.
  • Example 6 Evaluation of the properties of the peptide according to the invention on the density of the dermis
  • the evaluation of the Total dermal density was performed on the cheeks using a device called DUB Skin Scanner which uses the principle of ultrasound echogenicity to measure the fiber network density of the extracellular matrix of the dermis.
  • the effectiveness of the composition containing the peptide according to Example 1C) was compared with that of the so-called placebo emulsion.
  • the total density of the dermis with the formulation containing the peptide according to Example 1.C) was increased by 4.9% (p>0.05) and 12.9% (p ⁇ 0.05) respectively.
  • the peptide according to the invention therefore makes it possible to increase the density of the fiber network in the ECM.
  • Example 7 Examples of wording

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation cosmétique non thérapeutique du peptide de séquence SEQ ID N°1 et/ou ses homologues et/ou sels et/ou dérivés, notamment sous la forme d'hydrolysat de riz enrichi en ce peptide ou d'un fermentât enrichi en ce peptide, pour améliorer les fibres de la MEC du derme de la peau et/ou des muqueuses. La présente invention a également pour objet les applications de ce peptide dans des compositions cosmétiques et/ou dermatologiques.

Description

Nouvelle utilisation d'un peptide pour améliorer la matrice extracellulaire du derme de la peau et/ou des muqueuses
Domaine Technique
[0001] La présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide de séquence SEQ ID N°1 et/ou ses homologues, dérivés et/ou sels, éventuellement dans un fermentât de microorganisme le produisant ou dans un hydrolysat protéique, pour améliorer les fibres de la matrice-extracellulaire du derme de la peau et/ou des muqueuses, en particulier la flexibilité et/ou la densité de la peau, incluant le cuir chevelu, et/ou des muqueuses et/ou l'ancrage des phanères, préférentiellement des cheveux, notamment pour en prévenir et/ou diminuer la chute. La présente invention a également pour objet les applications de ce peptide dans des compositions cosmétiques et/ou dermatologiques.
Technique antérieure
[0002] La matrice extracellulaire (MEC) tient un rôle essentiel dans la structure des tissus du corps humain et animal, en particulier par ses fonctions de soutien, d’adhérence et de régulation des échanges cellulaires. La MEC est constituée en grande partie de glycoprotéines, protéines et glycosaminoglycanes. Ces molécules sont synthétisées sous forme native dans les cellules en contact avec la MEC. Du compartiment intracellulaire, elles sont excrétées en dehors des cellules. Après des phénomènes de maturation, elles s'organisent et s'agencent en un réseau de fibres qui forme la MEC. Sous cette forme fibrillaire, elles sont alors sous leur forme fonctionnelle.
[0003] L' exposition de la peau aux agents agressifs de l'environnement tels que les variations de température, notamment la chaleur et le froid, l’humidité, l’air sec, le soleil et/ou la pollution, active les protéases responsables d'une dégradation de la MEC du derme, notamment par diminution du nombre de fibres de collagène et des fibres élastiques dans le derme. Ceci se traduit par une perte des propriétés générales de la peau et notamment du derme telles que la densité et sa flexibilité. Les molécules de la MEC sont ainsi particulièrement étudiées dans les domaines cosmétiques et pharmaceutiques où de nombreux ingrédients visent à prévenir et compenser cette dégradation pour améliorer l'état général du derme.
[0004] Une des approches classiques consiste à inhiber les protéases, empêchant ainsi la dégradation des fibres élastiques. Cette action purement prophylactique ne permet toutefois pas de rétablir les propriétés de la MEC une fois que celles-ci ont été diminuées. Une seconde approche consiste alors à stimuler la synthèse des protéines pro-collagène I et élastine par les fibroblastes. Toutefois la seule augmentation de ces synthèses mesurée sur des cellules en culture in vitro ne se traduit pas nécessairement par une quantité plus importante de molécules fonctionnelles c'est-à-dire, organisées dans la MEC. Cette approche n'est donc pas suffisante pour rétablir certaines des propriétés de la peau notamment la flexibilité et la densité.
[0005] Rétablir ces propriétés requiert en effet d'obtenir une organisation et un agencement spécifique des fibres de la MEC du derme, ce qui implique de nombreux partenaires. En effet, pour ce qui concerne le collagène, la formation des structures en triple hélice pour le collagène (tropocollagène) et sa sécrétion en dehors de la cellule dans la matrice extracellulaire mais aussi l'assemblage et l'organisation des triples hélices de collagène en fibrilles qui elles-mêmes s'organisent en fibres matures plus larges sont nécessaires pour maintenir et rétablir une MEC fonctionnelle dans le derme et les propriétés du derme.
[0006] De même la formation de fibres élastiques matures capables de s'étirer est nécessaire pour maintenir une MEC fonctionnelle dans le derme. L'élastine est synthétisée sous forme de tropoélastine soluble par les fibroblastes et acquiert ses propriétés physico-chimiques, notamment étirabilité et retour à l'état initial après étirement, après sa réticulation par des enzymes de la famille des lysyl oxydases et son dépôt sur des microfibrilles riches en fibrillines dans la matrice extracellulaire pour former les fibres élastiques matures. Outre les fibrillines, et en particulier la fibrilline-1, la fibuline-5, l'EMILIN-1, et MFAP4 (Microfibril Associated Protein 4) sont aussi particulièrement importantes dans la formation de ces fibres élastiques matures. [0007] La présente invention vise ainsi à fournir un nouvel actif cosmétique et /ou dermatologique pour améliorer les fibres de la MEC du derme de la peau, notamment du cuir chevelu ainsi que des muqueuses. La présente invention vise également à fournir un nouvel actif cosmétique et /ou dermatologique pour améliorer la densité et/ou la flexibilité de la peau et/ou des muqueuses. La présente invention vise également à fournir un nouvel actif cosmétique et/ou dermatologique pour les besoins spécifiques de soin et/ou de traitement des peaux et/ou muqueuses ayant une MEC du derme affaiblie et/ou altérée, notamment sous l'effet des agents agressifs, ce qui est notamment le cas des peaux et/ou muqueuses sensibles et/ou sensibilisées.
[0008] De manière surprenante et inattendue, les inventeurs ont découvert que le peptide de SEQ ID N°l, ses homologues, sels et/ou dérivés est capable d'améliorer les fibres de la MEC du derme.
[0009] Le peptide de SEQ ID N° 1 a déjà été décrit dans le domaine de la cosmétique parmi un grand nombre de peptides issus de riz et de pois dans la demande de brevet W02017009484A1 (en tant que SEQ ID N°349) en tant qu'anti-inflammatoire capable d'inhiber la sécrétion de TNFalpha par les macrophages en présence de lipopolysaccharides, ainsi que dans la demande de brevet W02017009490A1 (en tant que SEQ ID N° 245) en tant qu'agent capable d'augmenter la prolifération cellulaire dans la lame basale de l'épiderme et d'avoir un effet mitotique sur la lame basale de l'épiderme et ainsi traiter les signes visibles du vieillissement.
[0010]Ce peptide est naturellement présent dans une protéine de grain de riz Oryza sativa, à partir duquel il peut être obtenu. Toutefois il n'est pas naturellement présent en quantité suffisante pour y être détecté et produire les propriétés objets de l'invention. Dans le cadre de la présente invention, il a été obtenu par synthèse chimique et par procédé de production biotechnologique par une levure Saccharomyces cerevisiae. Il peut toutefois également être obtenu par hydrolyse enzymatique de grain de riz comme cela est décrit dans les demandes de brevet W02017009484A1 et W02017009490A1. [001 l]S'il existe par ailleurs un grand nombre d'hydrolysats peptidique de riz sur le marché de la cosmétique, ceux-ci différent grandement quant à leur profil et à leur composition, en particulier par les différents fragments protéiques qu'ils contiennent, ce qui impacte fortement leurs propriétés biologiques. En matière d'hydrolyse des protéines, les ponts reliant les différents peptides et acides aminés sont en effet clivés par différentes méthodes classiques dans ce domaine telles que via des acides, des bases ou par catalyse. Mais ces différentes techniques conduisent à l'obtention d'hydrolysats protéiques de composition très variée pouvant conduire jusqu'à l'obtention d'acides aminés libres. L'hydrolyse chimique par utilisation d'acide ou de base, en ce qu'elle est aspécifique, conduit classiquement à l'obtention de produits dits de moindre qualité notamment en terme de couleurs, odeurs et/ou stabilité. L'hydrolyse enzymatique par sa spécificité offre l'avantage de pouvoir être effectuée dans des conditions ménagées notamment pH, température et pression. Toutefois, là encore, les enzymes sont choisies de manière à obtenir les peptides d'intérêt et conduisent à l'obtention d'hydrolysats spécifiques, très différents au regard des fragments peptidiques qu'ils contiennent, que ce soient en terme de nature de fragments, de poids moléculaire et de distribution.
[0012]Ces hydrolysats de riz de toute nature sont utilisés dans le domaine de la cosmétique pour des applications pour le soin de la peau et/ou des cheveux.
[0013]Toutefois, de par leurs procédés d'obtention aspécifiques ou dirigés vers l'obtention d'autres peptides, tous ces hydrolysats différent grandement dans leurs compositions et leurs propriétés et aucun ne décrit ni ne contient le peptide selon l'invention en quantité suffisante pour permettre l'obtention des propriétés selon l'invention.
[0014] L'invention a ainsi pour objet l'utilisation cosmétique non thérapeutique du peptide de SEQ ID N°l, de ses homologues, dérivés et/ou sels pour améliorer les fibres de la MEC du derme de la peau saine et/ou des muqueuses saines.
[0015]Ce peptide présente bon nombre d'avantages supplémentaires en ce qu'il augmente également la synthèse de collagène 1 par les fibroblastes, et diminue l'inflammation par inhibition de la libération de TNF alpha par des macrophages et par inhibition de la libération d'interleukine -8 par des kératinocytes.
[0016] Le peptide selon l'invention par ses propriétés complémentaires fournit une solution parfaitement adaptée et complète pour le soin et/ou le traitement des peaux et/ou muqueuses sensibles et/ou sensibilisées.
[0017] Par ailleurs, toutes ces propriétés complémentaires en font également un excellent agent de soin et/ou traitement cosmétique de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères saines du corps et du visage.
[0018] Le peptide de SEQ ID N°1 selon l'invention peut être obtenu par synthèse chimique selon les méthodes classiques. Toutefois, selon un mode préférentiel de l'invention, le peptide de SEQ ID N°1 est obtenu par synthèse par un microorganisme recombinant, préférentiellement par une bactérie telle que Escherichia coli ou par une levure du genre Pichia ou Saccharomyces, préférentiellement S. cerevisiae. De manière particulièrement intéressante, le peptide de SEQ IDN°1 est utilisé en association dans le fermentât du microorganisme le produisant.
[0019] De manière alternative, le peptide selon l'invention est sous la forme d'un hydrolysat de protéines de riz Oryza sativa, avantageusement à une teneur en peptide d'au moins égale ou supérieure à 0,00001% en poids de matière sèche par rapport au poids total de l'hydrolysat, préférentiellement comprise entre 0,0001% et 10%, plus préférentiellement entre 0,001% et 3%, en poids de matière sèche par rapport au poids total de l'hydrolysat.
[0020] Le peptide selon l'invention est le peptide de SEQ ID N°1 : TVFDGVLRPGQL
[0021] Ce peptide contient les 12 acides aminés : Tyr Val Phe Asp Gly Val Leu Arg Pro Gly Gin Leu et a un poids moléculaire moyen de 1301,51 g/mol.
[0022] Cette séquence de 12 acides aminés est naturellement présente dans les protéines de grains de riz (Oryza sativa) et le peptide peut être obtenu par hydrolyse enzymatique de grains de riz tel que décrit dans les demandes de brevets W02017009484A1 et W02017009490A1, ou par synthèse chimique ou biotechnologique selon les méthodes classiques en la matière. Il peut également être purifié ou obtenu comme indiqué dans l'exemple 1.
[0023] Selon l'invention, on entend par « peptide », toute séquence d'acides aminés isolée, naturelle ou synthétique, le cas échéant susceptible d'être obtenue par synthèse chimique ou biotechnologique ou par extraction à partir d'un tissu biologique, par exemple un végétal, un animal ou un microorganisme notamment levure, exprimant naturellement ou après transduction la séquence d'acides aminés, éventuellement après modification post-traductionnelle de celle-ci.
[0024] On entend par « dérivé », le peptide modifié par ajout d'un groupement fonctionnel, par exemple couplé avec un agent de pénétration hydrophile ou hydrophobe, agent de stabilité ou avec un groupement protecteur selon les méthodes classiques connues par l'homme du métier, notamment par acylation du groupement -NH2 terminal, ou amidation ou alkylation du groupement -COOH terminal. Il pourra notamment s'agir d'un greffage sur le groupement -NH2 libre du dernier acide aminé, d'un groupement carboxyle comprenant 1 à 24 carbones, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié et pouvant contenir en outre des groupements -OH, -SH, COOH ou CONH2. Il pourra également s'agir d'un greffage sur le groupement COOH libre du dernier acide aminé, d'un groupe amide (-CONH2) ou d'un groupement alcoxy sur le groupement -COOH libre du dernier acide aminé, ledit groupement comprenant 1 à 24 carbones, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié et pouvant contenant en outre des groupements - OH, -SH, COOH ou CONH2.
[0025] Les techniques de synthèse chimique des peptides sont connues par l'homme du métier et on peut citer à titre d'exemple les techniques décrites dans les références J.M. Stewart and J.D. Yound, solid phase peptide synthesis, 2nd editions, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), ainsi que M. Bodanzsky and . Bodanzsky, The practive of peptide synthesis, Springer Veriag. New York (1984).
[0026] Selon l'invention, on entend par «homologue» d'une séquence d'acides aminés, une séquence d'acide aminés présentant une identité de séquence d'au moins 85%, encore préférentiellement 90%, en particulier d'au moins 95%, et plus particulièrement d'au moins 98%, encore préférentiellement au moins 99% avec ladite séquence et possédant une activité biologique de même nature. L'homologie de séquence peut être identifiée par toute technique classique dans le domaine comme par exemple via l'interface informatique BLAST disponible sur le site internet NCBI à l’adresse http://blast.ncbi.nlm.nih.gov configurée avec les paramètres par défaut.
[0027] Un homologue d'une séquence d'acides aminés peut différer de cette séquence, par exemple, par une ou plusieurs délétion(s) et/ou insertion(s), et/ou une ou plusieurs substitution(s) d'un acide aminé. Selon une variante de réalisation, un homologue d'une séquence d'acides aminés peut comprendre une ou plusieurs substitutions conservatrices d'acides aminés. Une substitution conservatrice est le remplacement, dans une séquence d’un acide aminé par un autre acide aminé doté de propriétés physico-chimiques sensiblement similaires, ou suffisamment proches de celles de l’acide aminé d’origine, pour que les propriétés et fonctions du peptide ne soient pas, ou sensiblement pas, affectées. Les modifications des séquences d’acides aminés présentées ci-dessus peuvent être dénommées, de manière générale, « mutation ». Ainsi, les homologues des peptides selon l’invention concernent également les mutants et les variants des séquences d’acides aminés de l’invention ayant une activité biologique de même nature. Par « activité biologique de même nature » d’une séquence d’acides aminés de l’invention, on entend en particulier sa capacité à présenter les propriétés selon l'invention.
[0028] Selon l'invention on entend par « sels », le peptide comprenant un contre-ion provenant de l'acide utilisé lors du clivage après sa synthèse chimique. Les sels du peptide selon l'invention incluent le trifluoroacétate, l'acétate et le chlorure d'hydrogène.
[0029] Le peptide selon l'invention peut ainsi se présenter sous la forme de son homologue, de son sel, et/ou de son dérivé. De manière préférentielle, le peptide selon l'invention est exactement celui de la SEQ 1. [0030] Les acides aminés constituant le peptide selon l'invention peuvent être sous leurs formes L, D ou DL. De manière préférentielle, ils sont tous sous la configuration L.
[0031] Selon l'invention, on entend par « améliorer les fibres de la matrice extracellulaire (MEC) du derme », améliorer la structure et/ou l'organisation et/ou la densité des fibres de collagène et/ou élastiques de la matrice extracellulaire du derme. Cette amélioration se mesure par une augmentation du nombre de fibres fonctionnelles dans la matrice extracellulaire du derme et se traduit par une augmentation des propriétés de flexibilité et/ou densité de la peau et/ou des muqueuses. Ainsi avantageusement, l'utilisation selon l'invention est pour augmenter la densité et/ou la flexibilité de la peau saine et/ou des muqueuses saines. Ces propriétés peuvent être mesurées par les méthodes classiques connues de l'homme du métier. On pourra citer à titre d'exemple, les techniques suivantes :
- flexibilité : cette propriété peut être mesurée selon les techniques classiques, notamment par mesure du module élastique (ou module de Young), par exemple sur un modèle de peau reconstruite- l'amélioration des fibres de la MEC du derme se traduit alors par une diminution de la valeur du module élastique mesurée après traitement avec le peptide selon l'invention par comparaison à la valeur obtenue sans traitement. Une telle méthode est décrite dans l'exemple 4.
- densité : cette propriété peut être mesurée selon les techniques classiques, notamment par la détermination de la densité totale du derme en mesurant l'échogénicité des ultrasons dans le derme. L'amélioration de la densité du réseau de fibres de la MEC du derme se traduit pas une augmentation de la valeur de densité totale du derme mesurée après traitement de la peau avec le peptide selon l'invention par comparaison avec une peau non traitée. Une telle méthode est décrite dans l'exemple 6.
[0032] Selon l'invention, l'amélioration des fibres de la matrice extracellulaire du derme n'inclue pas l'augmentation de synthèse de collagène et d'élastine, laquelle ne suffit pas à induire à elle seule une amélioration des fibres de la matrice extracellulaire, en particulier pour les peaux sensibles et/ou sensibilisées. Par ailleurs, de manière préférentielle, l'utilisation selon la présente invention n'est pas pour la prévention et/ou le traitement des signes de vieillissement.
[0033] Selon l'invention, l'amélioration des fibres de la matrice extracellulaire du derme est mesurée par l'augmentation de la quantité de fibrilline 1 dans les fibres de la MEC du derme et/ou par l'augmentation de la quantité d'EMILIN-1 dans les fibres de la MEC du derme et/ou par l’augmentation de la quantité des fibres de collagène dans la matrice extracellulaire du derme. Ainsi avantageusement, l'utilisation selon l'invention est pour augmenter la quantité de fibrilline 1 dans les fibres de la MEC du derme sain et/ou pour augmenter la quantité d'EMILIN-1 dans les fibres de la MEC du derme sain et/ou pour augmenter la quantité des fibres de collagène dans la matrice extracellulaire du derme sain. L'utilisation selon l'invention est également en outre pour augmenter la quantité de fibuline-5 synthétisée par les fibroblastes du derme sain et/ou pour augmenter la quantité de MFAP4 synthétisée par les fibroblastes du derme sain et donc pour augmenter la synthèse de fibuline 5 et/ou de MFAP4 par les fibroblastes du derme sain.
[0034] La quantité de fibrilline 1 dans la MEC du derme peut être mesurée par immunomarquage dans un modèle de peau reconstruite, comme par exemple décrit dans l'exemple 2, et l'augmentation peut être évaluée en présence du peptide selon l'invention par comparaison avec la mesure effectuée en l'absence de ce peptide.
[0035] La quantité d'EMILIN- 1 dans la MEC du derme peut être mesurée par immunomarquage dans un modèle de peau reconstruite, comme par exemple décrit dans l'exemple 2, et l'augmentation peut être évaluée en présence du peptide selon l'invention par comparaison avec la mesure effectuée en l'absence du peptide.
[0036] La quantité des fibres de collagène de la MEC peut être mesurée par mesure de l'intensité d'un signal de seconde harmonique par microscopie confocale photonique, comme décrit dans l'exemple 3.
[0037] Les quantités de fibuline-5 et/ou de MFAP4 synthétisées par les fibroblastes dermiques peuvent être mesurées par immunomarquage sur un lysat de fibroblastes dermiques après culture, comme par exemple décrit dans l'exemple 5, et l'augmentation peut être évaluée après culture en présence du peptide selon l'invention par comparaison avec la mesure effectuée après culture en l'absence du peptide.
[0038] Le peptide selon l'invention convient également pour améliorer l'ancrage des phanères, en particulier des cheveux. Le peptide selon l'invention permet ainsi de prévenir et/ou diminuer les chutes des phanères en particulier des cheveux.
[0039]Au sens de la présente invention, on entend par « phanères » par « phanères » les ongles et les « fibres kératiniques ».
[0040] On entend par « fibres kératiniques », la fibre capillaire (les cheveux), les cils, les sourcils, les poils notamment de la muqueuse nasale, des oreilles, de la barbe et/ou de la moustache.
[0041] Le peptide selon l'invention convient ainsi particulièrement pour le soin et/ou le traitement des peaux et/ou muqueuses sensibles ou sensibilisées.
[0042]Ainsi avantageusement l'utilisation selon l'invention est destinée au soin des peaux et/ou muqueuses sensibles et/ou sensibilisées.
[0043] De manière générale, les « peaux et/ou muqueuses sensibles » peuvent être définies comme des peaux saines et/ou des muqueuses saines qui, par nature, ne tolèrent que très peu les agents agressifs notamment les agents de l'environnement tels que les agents polluants, les facteurs climatiques (vent, froid, chaleur), les expositions aux UV, les facteurs émotionnels notamment le stress et/ou les agents chimiques (métaux lourds, détergents, composés contenus dans les traitements cosmétiques tels que les parfums, les conservateurs, alcools, pH, AHA ou dermatologiques tels que vitamine A acide) et/ou les conditions agressives notamment la transpiration et les agressions mécaniques telles que épilation, rasage, frottement et même l'eau en particulier calcaire. Les peaux sensibles ne sont pas des peaux à caractère pathologique à la différence des peaux allergiques. Elles peuvent néanmoins réagir aux agents et/ou conditions agressives par des manifestations inesthétiques et/ou inconfortables cutanées et/ou mucosales telles qu'une sécheresse cutanée et/ou mucosale, une perte d'homogénéité du teint de la peau et/ou des muqueuses notamment par l'apparition de rougeurs, des sensations de tiraillements, picotements, fourmillements, tensions et/ou démangeaisons, un aspect rugueux de la peau et/ou des muqueuses et/ou une perte de douceur au toucher. Ainsi, le caractère « peau sensible » peut être estimé par le sujet lui-même avec des sensations cutanées subjectives ou par le dermatologue avec des réactions cutanées objectives.
[0044] La plupart du temps, la peau et/ou muqueuse sensible va se manifester dans des localisations bien définies telles que par exemple le cuir chevelu, le visage, les plis cutanés, les fesses chez le nourrisson, etc. Il peut donc s'agir de zones de peau et/ou de muqueuse sensibles.
[0045] De même, les « peaux et/ou muqueuses sensibilisées » sont des peaux saines et/ou muqueuses saines rendues sensibles momentanément donc non pathologiques en tant que telles.
[0046] On entend au sens la présente invention par « cosmétique » une utilisation non pharmaceutique, non thérapeutique, qui n'est pas destinée à la prévention et/ou au traitement de peaux et/ou de muqueuses et/ou phanères qualifiées de pathologiques par un spécialiste du domaine, tel qu'un dermatologue. Il s'agit donc d'une utilisation sur peaux et/ou muqueuses et/ou phanères saines.
[0047] On entend par « peau saine notamment cuir chevelu sain et/ou muqueuse saine et/ou phanère saine » tout ou partie d'une zone de peau notamment le cuir chevelu et/ou muqueuse et/ou de phanère saine, notamment humaine, et sur laquelle est appliquée le peptide selon l'invention et qui est dite « non pathologique » par un dermatologue c'est-à-dire ne présentant donc pas de cancer, d'infection, de cicatrice, de maladie ou d'affection cutanée telle que candidose, impétigo, psoriasis, eczéma, acné, ichtyose, gingivite ou dermatite ou de plaies ou de blessures ou aphtes ou ulcération ou de brulure et/ou autres dermatoses, ou aphtoses ou d'inflammation (en particulier coup de soleil) ou d'irritation, ou urticaire ou allergie telle que allergie de contact ou de pathologies associées à une baisse de fibres de la MEC et/ou à une diminution de la teneur en Fibrilline -1 et/ou de la teneur en EMILIN -1 et/ou à une diminution de la quantité des fibres de collagène et/ou l'une quelconque de leurs combinaisons, en particulier l'élastose solaire. Avantageusement la peau et/ou la muqueuse saine selon l'invention n'est pas susceptible de développer une pathologie associée à une baisse de fibres de la MEC et/ou à une diminution de la teneur en Fibrilline -1 et/ou de la teneur en EMILIN -1 et/ou à une diminution de la quantité des fibres de collagène et/ou l’une quelconque de leurs combinaisons, en particulier l'élastose solaire.
[0048] On entend au sens de la présente invention par « peau », la peau de tout ou partie du corps, notamment humain, y compris le cuir chevelu, choisi parmi le visage, les mains, les bras, le décolleté, les jambes, le cou, le dos, les épaules, le ventre, les poignets, les avant-bras, les chevilles, les cuisses, la nuque, le cuir chevelu, les plis articulaires et/ou des aisselles, les muqueuses labiales, préférentiellement le visage, notamment le contour des yeux et/ou de la bouche et le front. En particulier la peau est celle qui peut être exposée à des agressions, en particulier susceptibles de dégrader les fibres de la MEC, notamment les zones d'exposition aux agents agressifs de l'environnement ou aux agents chimiques, de frottements et/ou de macération. Il s'agit ainsi plus particulièrement du visage, du cuir chevelu, des mains, du cou, du décolleté, des plis articulaires et/ou des aisselles.
[0049]Au sens de la présente invention, on entend par « muqueuse(s) », la muqueuse oculaire, nasale, vaginale, anale et/ou la muqueuse buccale, notamment la muqueuse buccale labiale, préférentiellement, les muqueuses labiales, oculaires et/ou nasales.
[0050] De manière préférentiellement, l'application est par voie topique, avantageusement sur des parties spécifiques et/ou zones du corps choisies parmi le cuir chevelu, le visage, les mains, les bras, le décolleté, les jambes, le cou, le dos, les épaules, le ventre, les poignets, les avant-bras, les chevilles, les cuisses, la nuque, les plis articulaires, et/ou des aisselles, les muqueuses labiales.
[0051] Le peptide selon l'invention est topiquement acceptable. Au sens de la présente invention, on entend par « topiquement acceptable », un ingrédient adapté à une application par voie topique, non toxique, non irritant pour la peau et/ou les muqueuses et/ou les phanères, qui n'induit pas de réponse allergique et qui n'est pas instable sur le plan chimique.
[0052] Le peptide selon l'invention peut être obtenu par synthèse chimique, par synthèse biotechnologique à l'aide d'un microorganisme en produisant naturellement ou recombinant et/ou par hydrolyse enzymatique d'un matériel biologique en contenant notamment d'un microorganisme, de nature végétale ou animale.
[0053]Ainsi, selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide est utilisé sous la forme d'un hydrolysat de protéines de riz (Oryza sativa), c'est-à- dire d'un hydrolysat peptidique de Oryza sativa, en particulier enrichi en peptide selon l'invention, préférentiellement sous forme liquide.
[0054] Selon un mode réalisation alternatif de la présente invention, le peptide est utilisé sous la forme d'un fermentât de microorganismes en produisant, préférentiellement d'une levure recombinante, plus préférentiellement choisi parmi les levures recombinantes du Genre Pichia ou Saccharomyces, encore plus préférentiellement de la levure Saccharomyces cerevisiae, en particulier modifiée génétiquement pour produire cette séquence, ledit fermentât étant préférentiellement enrichi en peptide selon l'invention.
[0055] Selon un mode de réalisation alternatif de la présente invention, le peptide est utilisé sous une forme purifiée à partir d'un hydrolysat ou d'un fermentât par les techniques habituelles de purification des peptides notamment choisies parmi la filtration sur membranes, la chromatographie, la précipitation et/ou l'immunoprécipitation.
[0056] Selon l'invention, on entend par « hydrolysat », le produit d'hydrolyse chimique et/ou enzymatique de matière biologique contenant et/ou produisant, naturellement ou par modification génétique, le peptide selon l'invention, telle que la matière animale, végétale ou microorganisme notamment levure.
[0057] Selon l'invention, on entend par « fermentât », le moût de la fermentation par un microorganisme produisant, naturellement ou par modification génétique, le peptide selon l'invention, notamment la levure ou les bactéries. Le fermentât correspond ainsi au milieu de culture contenant les éléments nutritifs nécessaires à la croissance et multiplication du microorganisme ainsi que les produits de la fermentation excrétés par le microorganisme ou libérés lors de la lyse du microorganisme.
[0058] Selon l'invention, on entend par "l'hydrolysat ou fermentât enrichi en peptide selon l'invention", un hydrolysat ou un fermentât dans lequel on détecte le peptide de SEQ ID N°l, selon l'invention à une teneur allant au-delà du seuil de la limite de détection avec les techniques sensibles en la matière, par exemple LC-MS, c'est-à-dire en générale une teneur au moins égale ou supérieure à 0,00001% en poids en peptide par rapport au poids total en matière sèche de l'hydrolysat ou fermentât.
[0059] Selon un mode alternatif de l'invention, le peptide SEQ ID N°1 est contenu dans un hydrolysat, préférentiellement à une quantité d'au moins égale ou supérieure à 0,00001% en poids de matière sèche par rapport au poids total de l'hydrolysat, préférentiellement comprise entre 0,0001% et 10%, plus préférentiellement entre 0,001% et 1%, en poids de matière sèche par rapport au poids total de l'hydrolysat.
[0060] Selon un mode préféré de réalisation, l'hydrolysat peptidique (ou hydrolysat de protéines) de riz est obtenu par hydrolyse enzymatique en une seule étape. Selon un mode alternatif, l'hydrolysat peut être obtenu par hydrolyse successive utilisant la même enzyme ou un mélange d'enzymes.
[0061] L'hydrolyse enzymatique est effectuée par une ou plusieurs enzymes protéolytiques, qui peuvent être des protéases d'origine végétale ou issues de microorganismes.
[0062] Selon un mode de réalisation, l’hydrolyse enzymatique a lieu jusqu'à son achèvement, qui peut être déterminée par l'homme du métier de manière connue, par exemple en déterminant le pH constant ou par photométrie à l'aide de la détection de groupements NH2 libres ou en déterminant la quantité constante de peptides SEQ ID N°1 par chromatographie liquide et spectroscopie de masse. [0063] La quantité d'enzyme (s) utilisée (s) n'est pas critique en soi, mais doit être dans la gamme de 0,05 à 5 %, de préférence de 0,1 à 2% en poids par rapport au poids de la matière de départ contenant le peptide.
[0064] Les hydrolysats obtenus peuvent enfin être traités, par exemple par filtration des fractions non dissoutes. Pour une meilleure stabilisation, le pH est de préférence fixé à des valeurs comprises entre 3,0 et 7,5, de préférence entre 3,5 et 5,5.
[0065] Selon un mode alternatif, le peptide selon l'invention peut être obtenu par synthèse chimique selon les techniques classiques en la matière notamment celles décrites. De manière avantageuse, le peptide selon l'invention aura un niveau de pureté d'au moins 50%, préférentiellement au moins 70%, avantageusement au moins 80%, préférentiellement au moins 90%, encore préférentiellement au moins 95% (p/p).
[0066] Selon un autre mode alternatif, le peptide selon l'invention peut être obtenu par synthèse biotechnologique, en particulier à partir d'une souche de bactérie ou de levure recombinante, c'est-à-dire modifiée génétiquement pour produire le peptide selon l'invention.
[0067] La souche de levure est préférentiellement choisie parmi Pichia et Saccharomyces, en particulier Saccharomyces cerevisiae.
[0068] La production du peptide par une souche de levure comprend classiquement les étapes suivantes :
- transformation de la levure à l'aide d'un système d'expression du peptide selon l'invention couplé à des séquences signal d'exportation, typiquement de type plasmide ;
- culture de la levure transgénique sur un milieu de culture ;
- fermentation dite en batch et/ou en Fed-batch ;
- récupération du moût de fermentation et élimination de la biomasse de levure, par exemple par centrifugation ;
- Concentration et/ou séparation du peptide. [0069] De manière préférentielle, le peptide selon l'invention est produit tel que décrit dans l'exemple le).
[0070] Dans un mode de réalisation particulièrement avantageuse, le peptide est contenu dans le fermentât et utilisé directement sous cette forme.
[0071] Dans un mode de réalisation, les hydrolysats ou fermentâts obtenus sont sous forme liquide, en particulier des solutions aqueuses, et peuvent être utilisés directement ou sous forme concentrée; ils ont de préférence une teneur en matières sèches dans la gamme de 1 à 50% en poids, de préférence de 5 à 30% en poids par rapport au poids total de l'hydrolysat ou du fermentât. Des adjuvants peuvent être ajoutés tels que polyols, glycols, acides (acide citrique, acide sorbique, acide sulfurique, acide benzoïque ou leurs sels....).
[0072] Les hydrolysats ou fermentâts obtenus à ce stade peuvent être davantage concentrés et/ou purifiés pour sélectionner les fractions de poids moléculaire ciblées, par des étapes successives d’ultrafiltration ou de nanofiltration à travers des filtres à porosité variable, ou au moyen d’une méthode de type chromatographique, par exemple pour enrichir spécifiquement le fermentât ou l'hydrolysat en ces peptides.
[0073] Il est également possible de produire les hydrolysats peptidiques ou fermentâts selon l'invention sous forme de poudre par séchage, (atomiseur, lyophilisé,....) avec ou sans support tel que le mannitol, la maltodextrine, la cyclodextrine, selon les techniques classiques de formulation connues de l'homme du métier.
[0074] Selon un mode de réalisation, l'hydrolysat ou fermentât préféré selon l’invention contient le peptide de SEQ ID N°l, en une teneur totale au moins égale ou supérieure à 0,00001% en poids par rapport au poids total en matière sèche de l'hydrolysat ou du fermentât, préférentiellement comprise entre 0,0001% et 10%, plus préférentiellement entre 0,001% et 3%, encore plus préférentiellement entre 0,01% et 1%.
[0075] Le poids moléculaire moyen exprimé en dalton (ou g/mol) est déterminé par chromatographie d'exclusion stérique connue de l'homme du métier. [0076] L'hydrolysat peptidique de riz selon l'invention peut être obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes :
- solubilisation de la protéine de riz, ou d’un isolat de protéine de riz contenant au moins 70%, de préférence au moins 80% de protéines, dans l’eau à une température supérieure à 70°C pour la pasteurisation;
- hydrolyse des protéines ; de préférence l’hydrolyse est réalisée enzymatiquement au moyen d’enzymes protéolytiques, de préférence d’origine végétale ou dérivées de microorganismes, en sélectionnant l’enzyme ou les enzymes et en ajustant les conditions de température et de pH pour obtenir le bon degré d’hydrolyse et le profil de poids moléculaire ;
- inactivation de la ou des enzyme (s), préférentiellement par traitement thermique: cette inactivation est réalisée selon la recommandation technique du (des) fournisseur (s) de la ou des enzyme (s);
- séparation des phases solubles et insolubles, par centrifugation et / ou filtration, et récupération de la phase soluble contenant les peptides;
- éventuellement une étape de concentration pour augmenter le taux de matière sèche, suivie d’une étape de filtration pour récupérer la phase soluble contenant les peptides;
- l’obtention d’un filtrat, l’hydrolysat de protéines de riz enrichi en peptide selon l'invention qui se présente sous forme liquide et qui constitue également un mode de réalisation de l’invention.
[0077] Les étapes des procédés décrits ci-dessus, prises individuellement, sont courantes dans le domaine des hydrolysats de protéines et l’homme du métier est à même d’ajuster les paramètres de réaction en fonction de ses connaissances générales pour obtenir l’hydrolysat de protéines de riz selon l’invention.
[0078] Le peptide selon l'invention, pur ou sous la forme d'hydrolysat enrichi en peptide ou de fermentât enrichi en peptide, est utilisé par voie topique.
[0079] Selon un mode de réalisation, il peut être utilisé :
- sous la forme d'un ingrédient cosmétique ou pharmaceutique destiné à être incorporé dans une composition cosmétique ou pharmaceutique, et comprenant en outre un véhicule cosmétique ou pharmaceutique approprié, ou
- sous la forme d'une composition cosmétique ou pharmaceutique le comprenant et comprenant en outre avantageusement un véhicule cosmétique ou pharmaceutique approprié.
[0080]Au sens de la présente invention, on entend par « voie topique », l'application du peptide selon l'invention, préférentiellement sous la forme d'hydrolysat ou de fermentât enrichi en peptide et/ou de la composition et/ou de l'ingrédient selon l'invention sur la surface de la peau notamment le cuir chevelu et/ou des muqueuses, et/ou des phanères, préférentiellement cheveux, notamment par application directe ou par vaporisation.
[0081] Au sens de la présente invention, on entend par « ingrédient(s) cosmétique(s) et/ou pharmaceutique(s) » un ou des extraits végétaux et/ou une ou des molécules naturelles ou synthétiques et/ou leurs mélanges destiné à une application cosmétique et/ou pharmaceutique. Les ingrédients cosmétiques sont notamment définis par la nomenclature internationale des ingrédients cosmétiques (INCI).
[0082]Au sens de la présente invention, le terme « véhicule cosmétique ou pharmaceutique approprié », signifie que la composition ou les composants de celle-ci sont adaptés à l’utilisation en contact avec la peau et/ou les muqueuses humaines sans toxicité, incompatibilité, instabilité, réponse allergique, ou leurs équivalents, indue.
[0083] L'ingrédient cosmétique ou pharmaceutique, en particulier dermatologique sous forme liquide contenant le peptide selon l'invention, notamment sous la forme d'un fermentât enrichi en peptide selon l'invention et notamment celui de l'exemple IC, peut être utilisé dans une composition cosmétique ou pharmaceutique, en particulier dermatologique, préférentiellement à une teneur en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition comprise entre 0,01 et 10%, avantageusement entre 0,1 et 5%, en particulier entre 0,2 et 3%.
[0084] Dans un mode de réalisation de l'invention, le peptide selon l'invention (le peptide de SEQ ID N°1 et/ou ses homologues, dérivés et/ou sels) se trouve sous la forme d'une composition cosmétique le comprenant et comprenant en outre avantageusement un véhicule cosmétique approprié.
[0085] Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide selon l'invention ,en particulier le peptide de SEQ ID N°l, préférentiellement sous la forme du fermentât enrichi en peptide, est présent dans la composition cosmétique ou pharmaceutique en une teneur comprise entre lxl0’5% à 10% en poids, préférentiellement de lxl0‘5% à 0,1% en poids, encore avantageusement de lxl0’4% à 0,01% en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition.
[0086] Les compositions selon l'invention peuvent contenir tout solvant approprié et/ou tout véhicule approprié et/ou tout excipient approprié, éventuellement en combinaison avec d'autres composés d'intérêts. Elles peuvent notamment contenir un excipient cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable et/ou un véhicule cosmétique ou pharmaceutique approprié choisis parmi des agents tensioactifs, des conservateurs, des agents tampon, des agents gonflants, des agents chélatants, des agents biocides, des dénaturants, des agents opacifiants, des ajusteurs de pH, des agents réducteurs, des agents stabilisants, des émulsifiants, des épaississants, des gélifiants, des polymères filmogènes, des solvants, des charges, des bactéricides, des absorbeurs d’odeurs, des agents matifiants, des agents conditionneurs, des agents de texture, des agents de brillance, des pigments, des colorants, des parfums et des filtres solaires chimiques ou minéraux, des oligo-éléments, des huiles essentielles, des édulcorants, des agents modificateurs du goût. Ces combinaisons sont également couvertes par la présente invention. Le CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992) décrit différents ingrédients cosmétiques et pharmaceutiques utilisés couramment dans l’industrie cosmétique et pharmaceutique, qui sont en particulier adaptés à une administration par voie orale et/ou à une utilisation topique.
[0087]Avantageusement, le ou les excipients et/ou le ou les véhicules sont choisis dans le groupe comprenant les polyglycérols, les esters, les polymères et dérivés de cellulose, les dérivés de lanoline, les phospholipides, les lactoferrines, les lactoperoxidases, les stabilisants à base de sucrose, la vitamine E et ses dérivés, les gommes de xanthane, les cires naturelles et synthétiques, les huiles végétales, les triglycérides, les insaponifiables, les phytostérols, les silicones, les hydrolysats de protéines, les betaines, les aminoxides, les extraits de plantes, les esters de saccharose, les dioxydes de titane, les glycines, et les parabens, et encore de préférence parmi le groupe consistant en le stéareth-2, le stéareth-21, le glycol-15 stéaryle éther, le cétéaryl alcool, le phénoxyéthanol, le méthylparabène, l'éthylparabène, le propylparabène, le butylparabène, le butylène glycol, le caprylyl glycol, les tocophérols naturels, la glycérine, le dihydroxycétyl sodium phosphate, l'isopropyl hydroxycétyl éther, le glycol stéarate, la triisononanoine, l'octyl cocoate, le polyacrylamide, l' isoparaffine, le laureth-7, un carbomer, le propylène glycol, l'hexylène glycol, le glycérol, le bisabolol, une diméthicone, l'hydroxyde de sodium, le PEG 30- dipolyhydroxystérate, les triglycérides caprique/caprylique, le cétéaryl octanoate, le dibutyl adipate, l'huile de pépins de raisin, l'huile de jojoba, le sulfate de magnésium, l'EDTA, une cyclométhicone, la gomme de xanthane, l'acide citrique, le lauryl sulfate de sodium, les cires et les huiles minérales, l'isostéaryl isostéarate, le dipélargonate de propylène glycol, l'isostéarate de propylène glycol, le PEG 8, la cire d'abeille, les glycérides d'huile de cœur de palme hydrogénée, l'huile de lanoline, l'huile de sésame, le cétyl lactate, le lanoline alcool, l'huile de ricin, le dioxyde de titane, le lactose, le saccharose, le polyéthylène basse densité, une solution isotonique salée, et leurs mélanges.
[0088] La composition cosmétique ou pharmaceutique ou le peptide, préférentiellement l'hydrolysat ou le fermentât enrichi en peptide selon l'invention éventuellement sous forme d'ingrédient cosmétique ou pharmaceutique, peut se présenter sous toutes les formes galéniques classiquement utilisées pour une application topique telles que les formes liquides ou solides ou même sous la forme de liquide sous pression. Elles peuvent notamment être formulées sous la forme d'une solution, aqueuse ou huileuse, une crème ou un gel aqueux ou un gel huileux, notamment en pot ou en tube, notamment un gel douche, un shampoing, un lait, une émulsion, un hydrogel, une microémulsion ou une nanoémulsion, notamment huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple ou siliconée, un sérum, une lotion, notamment en flacon de verre, de plastique ou en flacon doseur ou en aérosol, une ampoule, un savon liquide, une pâte, un pain dermatologique, une pommade, une mousse, un aérosol, un masque, un patch, un produit anhydre, de préférence liquide, pâteux ou solide, par exemple sous forme de bâtonnet notamment en stick ou en poudres, notamment de maquillage. En particulier la composition se présente sous la forme d'un sérum, d'une lotion, d'une crème, d’un lait, d’une pommade, d’une pâte, d’une mousse, d’une émulsion, d'un hydrogel, d'un gel douche, d'un masque, d'un stick d'un patch, ou de poudres de maquillage, avantageusement d'une crème ou d'une lotion. De manière préférentielle, la composition se présente sous la forme d'une crème, lotion pour la peau et/ou les cheveux ou d'un shampoing, après- shampoing, rinçable ou non (type leave-on).
[0089] Le peptide selon la présente invention, préférentiellement le fermentât enrichi en peptide selon l'invention, présente l'avantage de ne pas agresser et/ou décaper la peau et/ou les muqueuses permettant le maintien du taux de sébum et convient tout particulièrement pour le soin et/ou le traitement des peaux et/ou muqueuses sensibles et/ou sensibilisées.
[0090] Dans le cas d'une administration par voie mucosale, la composition cosmétique ou pharmaceutique ou le peptide selon l'invention éventuellement sous forme d'ingrédient cosmétique ou pharmaceutique, peut se présenter sous la forme d'un collyre, d'une lotion, d'un aérosol, d'un gel, ou d'une composition mucoadhésive.
[0091] La composition cosmétique ou pharmaceutique pourra en outre comprendre d'autres ingrédients cosmétiques ou pharmaceutiques, actifs sur le traitement de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères induisant un effet complémentaire ou de synergie avec le peptide selon l'invention, choisi par exemple parmi les ingrédients cosmétiques actifs dit anti-âges.
[0092] Parmi les ingrédients cosmétiques actifs anti-âges, on peut citer :
- ceux pour prévenir l'apparition de la pigmentation et/ou d'augmentation de l'éclat du teint, notamment un extrait du champignon Inonotus obliquas commercialisé sous le nom Inolixir™ par la demanderesse, un extrait d'huile dA' rgania spinosa commercialisé sous le nom d'Arganyl™ par la demanderesse, un extrait de graines de Moringa o/eifera commercialisé sous le nom de Purisoft™ par la demanderesse, une combinaison d'un extrait de Sa/via miitiorrhiza et de niacinamide commercialisée sous le nom de ColIRepair™ par la demanderesse, un extrait dA' chiHea millefolium commercialisé sous le nom de Neurobiox™ par la demanderesse, un extrait de feuilles de Cassia aiata commercialisé sous le nom de DN-Age™ et/ou un extrait de litchi commercialisé sous le nom de Litchiderm™ en tant qu'actifs anti-oxydants, d'un extrait de chicorée commercialisé sous le nom de Lox-Age™, un extrait de levure commercialisé sous le nom de Vitacell™, un extrait de Polygonum bistorta commercialisé sous le nom de Perlaura™, un extrait de galanga commercialisé sous le nom de Hyalufix™, d'un extrait de maïs commercialisé sous le nom de Deliner™ ou un extrait de Voandzeia subterranea commercialisé sous le nom d'Epigenist™ par la demanderesse ;
- ceux favorisant la fermeté de la peau, notamment par action sur le collagène, tels qu'un tétrapeptide synthétique commercialisé sous le nom de Dermican™, un extrait d'Hibiscus abeimoschus commercialisé sous le nom de Linefactor™, un extrait purifié de pois commercialisé sous le nom de Proteasyl™, un extrait de Maniikara muitinervis commercialisé sous le nom d'Elestan™, un extrait de Khaya senegaiensis commercialisé sous le nom de Collalift™18, un extrait de pulpe d'Argan commercialisé sous le nom d'Argassential™, un extrait de Schizandra chinensis commercialisé sous le nom de Sqisandryl™ par la Demanderesse, le rétinol, la vitamine C, un extrait de Daviiia rugosa commercialisé sous le nom de Collguard™, un extrait d'hydrolysat de protéine de soja commercialisé sous le nom de Phytokine™.
[0093] Dans un mode de réalisation particulièrement avantageuse, la composition cosmétique ou pharmaceutique contiendra le peptide selon l’invention, préférentiellement sous la forme d’un fermentât enrichi en peptide, en combinaison avec au moins un autre ingrédient sélectionné parmi :
- le rétinol, préférentiellement à une dose comprise entre 0,01 % et 1 % en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition,
- la vitamine C, préférentiellement à une dose comprise entre 0,5% et 25 % en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition - la vitamine E, préférentiellement à une dose comprise entre 0 ,02%et 0,5% en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition
- le niacinamide, préférentiellement à une dose comprise entre 0,1 % et 10% en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition
- l'acide hyaluronique, préférentiellement à une dose comprise entre 0, 01% et 3% en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition,
- un hydrolysat extrait de farine de graines d 'Hibiscus escuientus riche en protéines décrit dans l'exemple 1 de la demande de brevet EP0975322B1 et commercialisé sur support de dextrine sous la marque Myoxinol par BASF préférentiellement à une dose comprise entre 0, 5% et 2% en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition.
[0094] De manière particulière, la présente invention a pour objet une telle composition cosmétique comprenant le peptide selon l’invention et un des ingrédients ci-dessus sélectionné choisi parmi le rétinol, la vitamine C, la vitamine E, le niacinamide, l’acide hyaluronique, un hydrolysat extrait de farine de graines d’Hibiscus escuientus et un de leurs mélanges.
[0095] Une telle composition est particulièrement utile par application topique sur la peau saine et/ou les muqueuses saines pour prévenir et/ou diminuer les signes de vieillissement de la peau et/ou des muqueuses, chrono et/ou UV induits et/ou pour améliorer les fibres de la matrice extracellulaire du derme de la peau saine et/ou des muqueuses saines.
[0096] Le peptide selon l'invention pourra par ailleurs être utilisé en association avec des ingrédients cosmétiques actifs sur les peaux sensibles, notamment l'extrait protéique de graine non germée déshuilée de Moringa oieifera commercialisé sous la dénomination commerciale Purisoft®, un extrait végétal de Cestrum iatifoiium commercialisé sous le nom de Symbiocell ™, un beurre extrait du fruit de l'arbre Irvingia gabonensis commercialisé sous le nom Irwinol™ , un extrait de racine 'Eperua faicata commercialisé sous le nom de Eperuline™ , un peptide N- acetyl-L-Tyrosyl-L-Prolyl-L-Phenylalanyl-L- Phenylalaninamide (INCI :Acetyl Tetrapeptide 15) commercialisé sous le nom de Skinasensyl™, un extrait de Inonotus
Figure imgf000024_0001
commercialisé sous le nom d'Inolixir™ par la Demanderesse. [0097] On pourra également utiliser le peptide selon la présente invention en combinaison avec des ingrédients actifs sur la flore microbienne cutanée et/ou mucosale et/ou actifs sur la fonction barrière de la peau notamment actifs hydratants et/ou apaisants, parmi lesquels un oligosaccharide obtenu par synthèse enzymatique commercialisé par la société Solabia sous le nom de BioEcolia™ ou un complexe d'alpha-glucooligosaccharides commercialisé par la même société sous le nom de Ecoskin™, un extrait dA' /isma p/antago-aquatica, un extrait dA' rgania spinosa (Lipofructyl™ Argan), un mélange de céramides (Sphingoceryl™ VEG) , des extraits purifiants de Bo/do (Betapur™), des produits à base d'inuline ou de fructooligosaccharides, des extraits de bifidobactéries ou encore un extrait d'Orthosiphon stamineus pour lutter contre la peau grasse (MAT-XS™ Bright), un extrait naturel de miel commercialisé par la Demanderesse sous le nom de Melhydran™ pour sa propriété hydratante, un extrait de lin commercialisé sous le nom Oligolin™ par la Demanderesse, un extrait de levure modifié par biotechnologique et commercialisé par la Demanderesse sous le nom Relipidium™, un extrait de racine de Pueraria lobata commercialisé sous le nom Inhipase™ par la Demanderesse, un dérivé de béta-glucan issu de levure de boulanger commercialisé par Mibelle sous le nom CM-Glucan Forte ™ et/ou un extrait de Mirabilis jaiapa commercialisé sous le nom de Pacifeel™ par Sederma.
[0098] La présente invention a également pour objet un procédé de soin et/ou traitement cosmétique non thérapeutique comprenant l'application par voie topique, en particulier quotidienne, sur au moins une zone de peau saine, avantageusement de cuir chevelu sain, et/ou de muqueuse saine et/ou de phanère saine, du peptide selon l'invention et/ou de ses homologues, sels et/ou dérivés, préférentiellement sous la forme d'un fermentât enrichi en peptide selon l'invention ou d'une composition cosmétique selon l'invention, pour améliorer les fibres de la MEC du derme de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la structure et/ou l'organisation et/ou la densité des fibres de collagène et/ou élastiques de la matrice extracellulaire du derme, plus particulièrement pour augmenter la densité et/ou la flexibilité de la peau saine et/ou des muqueuses saines. [0099] De façon avantageuse, la zone de peau et/ou muqueuse est choisi parmi le cuir chevelu, le visage, les mains, les bras, le décolleté, les jambes, le cou, le dos, les épaules, le ventre, les poignets, les avant-bras, les chevilles, les cuisses, la nuque, les plis articulaires et/ou des aisselles, les muqueuses labiales.
[0100] De manière avantageuse, l'invention a également pour objet une méthode de traitement cosmétique pour améliorer les fibres de la MEC du derme de la peau saine, et/ou des muqueuses saines d'un individu qui en a besoin/qui le souhaite comprenant les étapes :
- L'identification sur l'individu d'une zone de peau saine, et/ou de muqueuses saines, dont on souhaite améliorer les fibres de la MEC du derme, et
- L'application topique sur cette zone de peau saine et/ou de muqueuses saines, du peptide selon l'invention ou d'une composition cosmétique contenant le peptide selon l'invention en une quantité efficace pour améliorer les fibres de la MEC du derme, en particulier en une teneur de peptide de SEQ ID N°1 et/ou de ses homologues, sels et/ou dérivés comprise entre lxl0'6% à 10% en poids, préférentiellement de lxl0‘5% à 0,1% en poids, encore avantageusement de lxl0’4% à 0,01% en poids, de matière sèche par rapport au poids total de la composition.
[0101] La présente invention a également pour objet le peptide de SEQ ID N°1 et/ou ses homologues et/ou ses sels et/ou ses dérivés selon la présente invention, préférentiellement sous forme sous la forme d'un fermentât enrichi en peptide selon l'invention, pour son utilisation seul ou dans une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, le comprenant, dans le traitement et/ou la prévention d'au moins une pathologie associée à une baisse de fibres de la MEC et/ou à une diminution de la teneur en Fibrilline -1 et/ou de la teneur en EMILIN -1 et/ou à une diminution de la quantité des fibres de collagène et/ou l’une quelconque de leurs combinaisons, comme par exemple l'élastose solaire.
[0102] Avantageusement, le peptide est présent dans une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, en une teneur comprise entre lxl0‘6% à 10% en poids, préférentiellement de lxl0“5% à 0,1% en poids, encore avantageusement de lxl0’4% à 0,01% en poids, de matière sèche par rapport au poids total de la composition, ladite composition comprenant en outre avantageusement un véhicule pharmaceutique approprié, avantageusement un véhicule dermatologique approprié.
[0103] D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples et aux figures qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention.
[0104] Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.
[0105] Ainsi, chaque exemple a une portée générale.
[0106] D'autre part, dans les exemples, et sauf indication contraire, la température est exprimée en degré Celsius et la pression est la pression atmosphérique.
Brève description des dessins
[0107] Les figures 1A-1B-1C représente 3 photographies obtenues par microscopie confocale d'une coupe histologique de peau reconstruite après immunomarquage de la filaggrine (en vert) : lA-témoin non traité ; lB-après traitement par 0,00001% (0,1 pg/ml) de peptide selon l'invention ; IC- après traitement par 0,0001% (1 pg/ml) de peptide selon l'invention.
[0108] Les figures 2A-2B-2C représente trois photographies obtenues par microscopie confocale d'une coupe histologique de peau reconstruite après immunomarquage de l'EMILIN -1 (en vert) : 2A-témoin non traité ; 2B-après traitement par 0,00001% (0,1 pg/ml) de peptide selon l'invention ; 2C- après traitement par 0,0001% (1 pg/ml) de peptide selon l'invention.
[0109] [Fig. 3A-3B] Les figures 3A-3B représente deux photographies obtenues par microscopie confocale multiphotonique d'un derme reconstruit et visualisation du signal de seconde harmonique (SHG) (en blanc) : 3A-témoin non traité ; 3B- après traitement par 0,0001% (1 pg/ml)de peptide selon l'invention. Tl
Exemples fférents modes d'obtention du
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de SEO ID N°1
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l.A ) A partir d'un
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[0110]Ce peptide de 12 acides aminés peut être obtenu à partir d'un hydrolysat de protéine de riz (Oryza sativa) obtenu par hydrolyse enzymatique avec une seule protéinase ou comme décrit dans la demande de brevet W02017009484A1 pour l'obtention de la séquence SEQ ID N°349 ou comme décrit dans la demande de brevet W02017009490A1 pour l'obtention de la SEQ ID N°245. l.B) Par
Figure imgf000028_0004
[0111] Le peptide selon l'invention a été obtenu par synthèse chimique à une pureté de 99,4% déterminé par HPLS-UV . L'identité du peptide selon l'invention a été confirmé par LC-MS par le spectre du peptide comportant des ions 1305,5 (M+H+) et 651 (M+2H+). l.C) A partir d'un fermentât de microorganisme recombinant
[0112] Un système d'expression du peptide selon l'invention couplé à des séquences signal d'exportation a été construit dans la levure Saccharomyces cerevisiae pour la production et la sécrétion du peptide dans le milieu de culture. La levure transgénique a été cultivée sur un milieu standard (SY-2) contenant du glucose comme source de carbone, du sulfate d'ammonium comme source d'azote et des minéraux (KH2PO4, MgSO4, Na2SO4, NaCI, CaCI2) ainsi que des vitamines et ayant un pH 4,1. Après préculture de 12h à 16h sur le milieu standard SY-2 pour atteindre une densité optique (DO) de 5-8, un bioréacteur a été ensemencé avec un taux d'inoculation de 7% (poids/poids) dans le milieu standard SY-2 par rapport au poids total levure et milieu de culture. La culture a été conduite à 30°C, le pH régulé à 4, la pression partielle en oxygène (pO2) régulée à 30% minimum par action sur l'agitation et une aération maximale de 0,3 WM. Après une phase de llh en fermentation dite batch, une phase de 37h en fermentation dite fed-batch a été conduite avec ajout de glucose et de sulfate d'ammonium. Après 48h de culture, le moût de fermentation est récupéré et centrifugé pour récupérer le surnageant et éliminer la biomasse de levure. Ce surnageant a été concentré entre 5 et 10 fois par évaporation sous vide à 25°C, et du charbon actif a été ajouté à la concentration de 25% (poids/poids) de charbon actif par rapport à la masse sèche du concentrât. Après une pré-filtration pour éliminer le charbon actif et une filtration sur filtre de 0,22 pm, le liquide obtenu est lyophilisé pour obtenir une poudre avec une teneur en peptide selon l'invention de 2984 pg/g déterminée par HPLC-UV. L'identité du peptide a été confirmée par LC-MS par le spectre du peptide comportant les ions 1305,5 (M+H+) et 651 (M+2H+).
2 : Evaluation des propriétés du peptide selon l'invention sur la fibrillin -1 et sur l'EMILIN-1
[0113] Un modèle de peau reconstruite en 3D (Mimeskin) a été utilisé pour évaluer la performance du peptide selon l'invention obtenu par synthèse chimique comme décrit dans l'exemple l.B). Une quantité de 2xl06 fibroblastes a été ensemencée sur un support dermique de culture contenant un mélange de collagène, glycosaminoglycanes (GAG) et chitosan (Mimedisc) et cultivée en immersion à 37°C avec 5% de CO2 pendant 56 jours pour la phase de construction du derme, puis 106 kératinocytes ont été ensemencés et cultivés pendant 7 jours pour la phase de prolifération des kératinocytes. Ensuite, les modèles ont été placés à l'interface air-liquide pour la phase de différentiation des kératinocytes, et la culture a été poursuivie pendant 14 jours. Les cultures ont été traitées ou non (témoin non traité) avec le peptide selon l'invention en solution aqueuse à la dose de 0,1 pg/mL ou 1 pg/mL à partir du jour 2 et tous les 2 jours sauf lorsque les cellules ont été ensemencées. Chaque condition a été réalisée avec n = 4 (4 réplicats). Sur chaque condition et chaque réplicat, des coupes histologiques ont été réalisées à l'aide d'un cryostat. Après la fixation, les sections ont été immunomarquées pour la détection de la fibrilline-1 et de l'EMILIN-1 en fluorescence (Fig. 1A-1B-1C et 2A-2B-2C, en vert). Le bleu Evans a été utilisé comme contre-colorant pour la visualisation de la morphologie globale (en rouge). Les observations ont été réalisées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (TCS-SP2, Leica) et le pourcentage d'occupation de surface de la protéine ciblée sur la surface du derme a été quantifié par analyse d'images. Les résultats sont exprimés en pourcentage moyen comparé au témoin non traité standardisé à 100%. L'analyse statistique a été réalisée versus le témoin non traité après vérification de la normalité de la distribution des valeurs (Shapiro- Wilk test) avec le test t de Student. Le seuil de significativité est de 5%.
[0114] Après traitement aux doses de 0,1 pg/ml et 1 pg/ml, le peptide selon l'invention a stimulé la fibrilline-1 de +69% et +87% respectivement. Après traitement aux doses de 0,1 pg/ml et 1 pg/ml, le peptide selon l'invention a stimulé l'EMILIN-1 de +19% et +27% respectivement.
[0115]Cette augmentation du réseau de microfibrilles de fibrilline-1 dans la matrice extracellulaire est nettement observable dans les figures 1A-1B-1C.
[0116] Les figures 2A-2B-2C illustrent l'augmentation de l'EMILIN-1 qui est un ligand des microfibrilles participant à leur organisation correcte et leur fonctionnalité dans la matrice extracellulaire.
[0117] Le peptide selon l'invention permet donc d'augmenter la teneur en fibrilline 1 et Emilin-1 et donc l'organisation des microfibrilles élastiques.
Exemple 3 Evaluation des propriétés du peptide selon l'invention sur les fibres de collagène.
[0118] Un modèle de derme reconstruite en 3D (Mimederm) a été utilisé pour évaluer la performance du peptide obtenu par synthèse chimique. 2xl06 fibroblastes ont été ensemencés sur un support dermique de culture contenant un mélange de collagène, glycosaminoglycanes (GAG) et chitosan (Mimedisc) et cultivés en immersion à 37°C avec 5% de CO2 pendant 56 jours. Les cultures ont été traitées ou non (témoin non traité) avec le peptide selon l'invention obtenu par synthèse chimique (décrit dans l'exemple l.B) en solution aqueuse à la dose de 1 pg/mL à partir du jour 2 et tous les 2 jours. Chaque condition a été réalisée en n =3 (3 réplicats). Sur chaque condition et chaque réplicat, une analyse par microscopie confocale multiphotonique permettant la génération d'un signal de seconde harmonique (SHG) a été réalisée.
[0119] L'imagerie en SHG est une technique spécifique pour l'observation des fibrilles et fibres de collagène dans la matrice extracellulaire. Le collagène organisé en fibrilles a une structure non-centrosymétrique qui est nécessaire pour produire un signal SHG. Le signal SHG est visualisé en blanc dans les figures 3A-3B (autofluorescence des cellules en surface et du support de la peau reconstruite visualisée en vert).
[0120] Les résultats sont exprimés en pourcentage moyen comparé au témoin non traité standardisé à 100%. L'analyse statistique a été réalisée versus le témoin non traité après vérification de la normalité de la distribution des valeurs (Shapiro-Wilk test) avec le test t de Student. Le seuil de significativité est de 5%.
[0121] Les Fig. 3A-3B illustrent la présence plus importante de fibres de collagène organisées dans la matrice extracellulaire du derme. On observe une intensité du signal SHG beaucoup plus importante sur Fig. 3B mettant en évidence une plus grande densité de fibres de collagène dans la matrice extracellulaire lorsque le peptide selon l'invention a été présent. L'analyse du volume occupé par le signal SHG montre également une augmentation de la quantité de ces fibres dans la matrice extracellulaire de +68% en présence du peptide selon l'invention par rapport au témoin non traité.
4 : Evaluation des
Figure imgf000031_0002
iétés du
Figure imgf000031_0001
selon l'invention sur la flexibilité du derme
[0122] Un modèle de peau reconstruite en 3D (Mimeskin) a été utilisé pour évaluer la performance du peptide selon l'invention obtenu par fermentation d'une levure recombinante comme décrit dans l'exemple l.C). 2xl06 fibroblastes ont été ensemencés sur un support dermique de culture contenant un mélange de collagène, glycosaminoglycanes (GAG) et chitosan (Mimedisc) et cultivés en immersion à 37°C avec 5% de CO2 pendant 57 jours pour la phase de construction du derme, puis 106 kératinocytes ont été ensemencés et cultivés pendant 7 jours pour la phase de prolifération des kératinocytes. Ensuite, les modèles ont été placés à l'interface air-liquide pour la phase de différentiation des kératinocytes, et la culture a été poursuivie pendant 14 jours. Les cultures ont été traités ou non (témoin non traité) avec le peptide selon l'invention en solution aqueuse à la dose de 0,8 pg/mL ou 3 pg/mL à partir du jour 2 et tous les 2 jours sauf lorsque les cellules ont été ensemencées. Chaque condition a été réalisée en n =4 (4 réplicats). Sur chaque condition et chaque réplicat, 3 coupes histologiques ont été réalisées à l'aide d'un cryostat, et des mesures du module élastique ont été réalisées par microscopie de force atomique (Atomic Force Microscopy, AFM) sur le derme avec une sonde conique de 0,5 N/m. Les résultats sont exprimés en valeur moyenne sur les différentes cryosections. Le module élastique (ou module de Young) est la quantité qui mesure la résistance d'un matériau à la déformation élastique lorsqu'une force lui est appliquée. Plus le module élastique du matériau est élevé, plus il est rigide. Inversement, plus il est bas, plus le matériau est flexible. Le test t de Student a été effectué et a montré des résultats significativement différents du résultat mesuré avec le modèle non traité (p<0,001) pour les deux doses testées. Les valeurs du module de Young en absence (non traité) ou en présente de peptide selon l'invention sont rassemblés dans le tableau 1 ci-dessous.
[0123] [Tableau 1]
Figure imgf000032_0001
[0124] Les résultats montrent une amélioration de la flexibilité du derme.
Exemple 5 : Evaluation des propriétés du peptide selon l'invention sur la fibuline-5 et sur la MFAP4
[0125] Les fibres élastiques matures et fonctionnelles dans la MEC nécessitent l'assemblage de diverses glycoprotéines dont la fibuline-5 et la MFAP4 (Microfibril Associated Protein 4). Un essai sur culture de fibroblastes dermiques humains a été utilisé pour évaluer la performance du peptide selon l'invention obtenu par synthèse comme décrit dans l'exemple l.B) sur la synthèse de ces glycoprotéines. [0126] Des fibroblastes dermiques humains ont été ensemencés à 5xl04 cellules/cm2 et cultivés avec un milieu défini (FGM) en immersion à 37°C avec 5% de CO2 jusqu'à confluence. Lorsque la confluence a été atteinte, les cellules ont été incubées pendant 48h en présence ou absence (témoin non traité) du peptide selon l'invention (exemple l.B) en solution aqueuse à la dose de 0,1 pg/mL et 1 pg/mL. Ensuite, les cellules ont été récupérée et lysées pour mesurer le taux de fibuline-5 dans le lysat. Le milieu de culture a été récupéré pour y mesurer le taux de MFAP4. La concentration dans les échantillons a été déterminée par un test BCA afin d'ajuster le dépôt de chaque échantillon à la même concentration en protéines pour l'analyse en western blot. La fibuline-5 et la MFAP4 ont été analysées par électrophorèse capillaire après incubation avec un anticorps primaire, immunomarquage avec un anticorps secondaire at mesure de la chimiluminescence. Chaque condition a été réalisée en n =4 à 6 (4 à 6 réplicats). Les résultats sont exprimés en pourcentage moyen comparé au témoin non traité standardisé à 100%. L'analyse statistique a été réalisée versus le témoin non traité après vérification de la normalité de la distribution des valeurs (Shapiro- Wilk test) avec le test One Way ANOVA (méthode de Dunnett). Le seuil de significativité est de 5%.
[0127] Par rapport au témoin non traité, les taux de fibuline-5 et de MFAP4 ont été augmentés respectivement de +22% et de +38% à la dose de 0,1 pg/ml du peptide. Le peptide selon l'invention permet donc d'augmenter la teneur en fibuline-5 et de MFAP4 synthétisé par les fibroblastes et donc de contribuer à l'organisation des microfibrilles élastiques.
Exemple 6. Evaluation des propriétés du peptide selon l'invention sur la densité du derme
[0128] Une population de 28 femmes âgées de 45 à 65 ans avec une peau de type I, II ou III selon l'échelle de Fitzpatrick s'est appliquée en hémi-visage une crème sous forme d'émulsion comprenant une concentration finale en poids du peptide selon l'exemple l.C) de 0,1% (p/p) par rapport au poids total de la formulation (Formulation exemple 7.c), ou sans ledit peptide remplacé par de l'eau (placebo), à raison de 2 applications par jour et ce, pendant 2 mois. L'évaluation de la densité totale du derme a été réalisée sur les joues à l'aide d'un appareil appelé DUB Skin Scanner qui utilise le principe de l'échogénicité des ultrasons pour mesurer la densité de réseau de fibres de la matrice extracellulaire du derme. L'efficacité de la composition contenant le peptide selon l'exemple l.C) a été comparée avec celle de l'émulsion dite placébo.
[0129] Les mesures de la densité totale du derme ont été réalisées au début de l'étude (DO) après un mois d'application (D28) et enfin après 2 mois d'application (D56). L'efficacité du peptide sur la densité totale du derme a été déterminée en comparant le % de variation après 28 et 56 jours d'application par rapport à DO de la formulation contenant le peptide selon l'exemple l.C) avec celui de la formule placébo. Les valeurs ont été exprimées en moyenne sur les volontaires analysés. L'analyse statistique a été réalisée après vérification de la normalité de la distribution des valeurs (Shapiro-Wilk test) avec le test t de Student. Le seuil de significativité est de 5% (p<0,05).
[0130]Après 28 et 56 jours, la densité totale du derme avec la formulation contenant le peptide selon l'exemple l.C) a été augmentée de 4,9% (p>0,05) et de 12,9% (p<0,05) respectivement. Le peptide selon l'invention permet donc d'augmenter la densité du réseau de fibres dans la MEC.
Exemple 7 : Exemples de formulation
[0131] Les proportions sont exprimées en % en poids total et les noms en majuscules correspondent aux noms INCI des ingrédients.
La)
[0132] [Tableau 2]
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
[0133] [Tableau 3]
Figure imgf000035_0002
[0134] [Tableau 4]
Figure imgf000036_0001
[0135] Le peptide utilisé dans le cadre de l'invention est celui présenté dans le tableau 5 ci -après : [0136] [Tableau 5]
Figure imgf000036_0002

Claims

Revendications
[Revendication 1] Utilisation cosmétique non thérapeutique du peptide de SEQ ID N°1 et/ou de ses homologues, dérivés et/ou sels pour améliorer les fibres de la matrice extracellulaire du derme de la peau saine et/ou des muqueuses saines.
[Revendication 2] Utilisation selon la revendication 1 pour améliorer la structure et/ou l'organisation et/ou la densité des fibres de collagène et/ou élastiques de la matrice extracellulaire du derme.
[Revendication 3] Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour augmenter la densité et/ou la flexibilité de la peau saine et/ou des muqueuses saines.
[Revendication 4] Utilisation selon l'une quelconque des revendications pour améliorer l'ancrage des phanères, préférentiellement en prévenir et/ou ralentir la chute, encore préférentiellement des cheveux.
[Revendication 5] Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour augmenter la quantité de fibrilline 1 dans les fibres de la MEC du derme sain et/ou pour augmenter la quantité d'EMILIN-1 dans les fibres de la MEC du derme sain et/ou pour augmenter la quantité des fibres de collagène dans la matrice extracellulaire du derme sain, pour augmenter la synthèse de fibuline 5 et/ou de MFAP4 par les fibroblastes du derme sain.
[Revendication 6] Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le peptide est sous la forme du peptide de SEQ ID N°1 pur à au moins 50% (p/p).
[Revendication 7] Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle le peptide de SEQ ID N°1 est sous la forme d'un hydrolysat peptidique de Oryza sativa, en particulier enrichi en peptide de SEQ ID N°l, préférentiellement sous forme liquide.
[Revendication 8] Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle le peptide de SEQ ID N°1 est sous la forme d'un fermentât de microorganisme en produisant, préférentiellement choisi parmi les levures recombinantes du Genre Pichia Q Saccharomyces.
[Revendication 9] Utilisation selon la revendication précédente dans laquelle la levure est Saccharomyces cerevisiae.
[Revendication 10] Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le peptide de SEQ ID N°1 et/ou ses homologues, dérivés et/ou sels se trouve sous la forme d'une composition cosmétique le comprenant et comprenant en outre avantageusement un véhicule cosmétique approprié.
[Revendication 11] Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le peptide de SEQ ID N°1 est présent dans la composition cosmétique en une teneur comprise entre lxl0“5% à 10% en poids, préférentiellement de lxl0‘5% à 0,1% en poids, encore avantageusement de lxl0“4% à 0,01% en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition.
[Revendication 12] Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'il s'agit d'une utilisation par voie topique
[Revendication 13] Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est destinée au soin des peaux et/ou muqueuses sensibles et/ou sensibilisées.
[Revendication 14] Procédé de soin et/ou traitement cosmétique non thérapeutique caractérisé en ce qu'il comprend l'application par voie topique sur au moins une zone de peau saine, avantageusement de cuir chevelu sain, et/ou de muqueuse saine, du peptide de SEQ ID N°1 et/ou de ses homologues, sels et/ou dérivés, pour améliorer les fibres de la matrice extracellulaire du derme de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la structure et/ou l'organisation et/ou la densité des fibres de collagène et/ou élastiques de la matrice extracellulaire du derme.
[Revendication 15] Procédé selon la revendication précédente pour augmenter la densité et/ou la flexibilité de la peau saine et/ou des muqueuses saines.
[Revendication 16] Procédé de soin cosmétique selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 dans lequel le peptide de SEQ ID N°1 et/ou ses homologues et/ou sels et/ou dérivés est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 11.
[Revendication 17] Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à
16 dans lequel la zone de peau et/ou muqueuse est choisi parmi le cuir chevelu, le visage, les mains, les bras, le décolleté, les jambes, le cou, le dos, les épaules, le ventre, les poignets, les avant-bras, les chevilles, les cuisses, la nuque, les plis articulaires et/ou des aisselles, les muqueuses labiales.
[Revendication 18] Peptide de SEQ ID N°1 et/ou ses homologues et/ou sels et/ou dérivés pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie associée à une baisse de fibres de la MEC et/ou à une diminution de la teneur en Fibrilline -1 et/ou de la teneur en EMILIN -1 et/ou à une diminution de la quantité des fibres de collagène et/ou l’une quelconque de leurs combinaisons, notamment l'élastose solaire.
[Revendication 19] Peptide de SEQ ID N°1 pour son utilisation selon la revendication 18 caractérisé en ce que le peptide de SEQ ID N°1 et/ou ses homologues est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 9.
[Revendication 20] Peptide de SEQ ID N°1 pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que le peptide est présent dans une composition pharmaceutique en une teneur comprise entre lxl0‘6% à 10% en poids, préférentiellement de lxl0‘5% à 0,1% en poids, encore avantageusement de lxl0’4% à 0,01% en poids, de matière sèche par rapport au poids total de la composition, ladite composition comprenant en outre avantageusement un véhicule pharmaceutique approprié.
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