WO2024166830A1 - 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents

形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 Download PDF

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WO2024166830A1
WO2024166830A1 PCT/JP2024/003569 JP2024003569W WO2024166830A1 WO 2024166830 A1 WO2024166830 A1 WO 2024166830A1 JP 2024003569 W JP2024003569 W JP 2024003569W WO 2024166830 A1 WO2024166830 A1 WO 2024166830A1
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WO
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microorganism
transformed
strain
seq
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尚志 有川
俊輔 佐藤
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Kaneka Corp
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Kaneka Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a transformed microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoic acid, and a method for producing polyhydroxyalkanoic acid using the transformed microorganism.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • microorganisms see Non-Patent Document 1.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • PHA is a thermoplastic polyester that is produced and accumulated as an energy storage substance in the cells of many microbial species, and is biodegradable.
  • non-petroleum-based plastic alternatives are attracting attention due to increased environmental awareness, and it is expected that PHA produced and accumulated within the cells of microorganisms will have a small adverse effect on the ecosystem, as it is incorporated into the carbon cycle process in nature.
  • PHA production using microorganisms for example, it is known that PHA is produced by feeding sugar, vegetable oils and fatty acids as carbon sources to Capriavidus bacteria and allowing them to accumulate PHA within the cells (see Non-Patent Documents 2 and 3).
  • the present invention aims to provide a transformed microorganism with improved productivity of polyhydroxyalkanoic acid, and a method for producing polyhydroxyalkanoic acid by culturing the microorganism.
  • thermophilic microorganism a gene encoding ⁇ -ketothiolase (PhaA) derived from a thermophilic microorganism and/or a gene encoding acetoacetyl-CoA reductase (PhaB) derived from a thermophilic microorganism into a mesophilic microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoic acid, and thus completed the present invention.
  • PhaA ⁇ -ketothiolase
  • PhaB acetoacetyl-CoA reductase
  • the present invention relates to a method for producing a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene
  • the present invention relates to a transformed mesophilic microorganism into which a phaA gene derived from a thermophilic microorganism and/or a phaB gene derived from a thermophilic microorganism has been introduced.
  • the present invention also relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid, which comprises the step of culturing the transformed mesophilic microorganism in the presence of a carbon source.
  • the present invention it is possible to provide a transformed microorganism having improved productivity of polyhydroxyalkanoic acid, and a method for producing polyhydroxyalkanoic acid by culturing the microorganism. According to the present invention, the efficiency of polyhydroxyalkanoic acid production by a microorganism can be improved, and the production cost of polyhydroxyalkanoic acid can be reduced.
  • the present disclosure relates to a transformed microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoic acid (hereinafter also referred to as PHA), and to a method for producing PHA by culturing the transformed microorganism.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • the transformed microorganism according to the present disclosure may be a transformed microorganism in which the host is a mesophilic microorganism, has a PHA synthase gene, and has a gene encoding ⁇ -ketothiolase (PhaA) derived from a thermophilic microorganism introduced therein.
  • the transformed microorganism may be a transformed microorganism in which the host is a mesophilic microorganism, has a PHA synthase gene, and has a gene encoding acetoacetyl-CoA reductase (PhaB) derived from a thermophilic microorganism introduced therein.
  • the transformed microorganism may be a transformed microorganism in which the host is a mesophilic microorganism, has a PHA synthase gene, and has a gene encoding PhaA derived from a thermophilic microorganism and a gene encoding PhaB derived from a thermophilic microorganism introduced therein.
  • mesophilic microorganisms refer to microorganisms whose optimum growth temperature is within the range of 25-40°C
  • thermophilic microorganisms refer to microorganisms that can grow at temperatures of 50°C or higher.
  • the host of the transformed microorganism according to the present disclosure may be a wild-type strain that inherently has a PHA synthase gene, or a mutant strain obtained by artificially mutating such a wild-type strain, or a transformed strain into which an exogenous PHA synthase gene has been introduced by genetic engineering techniques.
  • the method for introducing a foreign gene is not particularly limited, and may be selected from a method for directly inserting or replacing a gene on a chromosome of the host, a method for directly inserting or replacing a gene on a megaplasmid possessed by the host, or a method for arranging a gene on a vector such as a plasmid, phage, or phagemid and introducing the gene, or two or more of these methods may be used in combination.
  • a method for directly inserting or replacing a gene on a chromosome of the host or a megaplasmid possessed by the host is preferred, and a method for directly inserting or replacing a gene on a chromosome of the host is more preferred.
  • the host of the transformed microorganism according to the present disclosure is not particularly limited as long as it is a mesophilic microorganism.
  • the mesophilic microorganism may be a microorganism that originally has a PHA synthase gene, a gene encoding ⁇ -ketothiolase (PhaA), and a gene encoding acetoacetyl-CoA reductase (PhaB).
  • hosts for the transformed microorganisms disclosed herein include bacteria belonging to the genera Ralstonia, Cupriavidus, Wautersia, Aeromonas, Escherichia, Alcaligenes, Pseudomonas, etc., and having an optimal growth temperature within the range of 25 to 40°C.
  • the bacteria are preferably those belonging to the genera Ralstonia, Cupriavidus, and Wautersia, and have an optimum growth temperature within the range of 25 to 40°C, more preferably those belonging to the Cupriavidus, and have an optimum growth temperature within the range of 25 to 40°C, and particularly preferably Cupriavidus necator.
  • PHAs The type of PHA produced by the transformed microorganism according to the present disclosure is not particularly limited as long as it is a PHA that can be produced by a microorganism, but preferred are a homopolymer of one monomer selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms, a copolymer of two or more monomers selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms, a copolymer of one monomer selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms and another hydroxyalkanoic acid (e.g., 2-hydroxyalkanoic acids, 4-hydroxyalkanoic acids, 5-hydroxyalkanoic acids, 6-hydroxyalkanoic acids, etc. having 4 to 16 carbon atoms), and a copolymer of two or more monomers selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms and another hydroxyalkanoic acid.
  • 2-hydroxyalkanoic acids 4-hydroxyalkanoic acids, 5-hydroxyalkano
  • PHAs are homopolymers of 3-hydroxyalkanoic acid having 4 carbon atoms, or copolymers containing 3-hydroxyalkanoic acid having 4 carbon atoms.
  • PHAs include homopolymers of 3-hydroxybutyric acid (abbreviation: 3HB), copolymers of 3HB and 3-hydroxyvaleric acid (abbreviation: 3HV), copolymers of 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid (abbreviation: 3HH), copolymers of 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid (abbreviation: 3HH), copolymers of 3HB and 4-hydroxybutyric acid (abbreviation: 4HB), PHAs containing lactic acid (abbreviation: LA) as a component, such as copolymers of 3HB and LA, such as copolymers of 3HB and LA, but are not limited thereto.
  • P3HB3HH is preferred from the viewpoint of a wide range of applications as a polymer.
  • the type of PHA produced can be appropriately selected depending on the purpose, such as the type of PHA synthesis enzyme gene possessed by the microorganism used or introduced separately, the type of metabolic gene involved in the synthesis, and the culture conditions.
  • the PHA synthase (PhaC) gene possessed by the transformed microorganism according to the present disclosure may be one that is inherent to the host or may be an exogenous one.
  • the PHA synthase gene is not particularly limited, and examples thereof include PHA synthase genes derived from Aeromonas kiyaviei, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas SP 61-3, or Capriavidus necator, chimeric PHA synthase genes combining two or more of the above PHA synthase genes, and genes encoding proteins consisting of amino acid sequences showing 90% or more sequence identity to the amino acid sequences of the above PHA synthases.
  • the sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and even more preferably 99% or more.
  • the number of PHA synthase genes possessed by the transformed microorganism according to the present disclosure may be one or more.
  • the genes may be the same or different.
  • the phaA gene and the phaB gene are genes encoding ⁇ -ketothiolase (PhaA) and acetoacetyl-CoA reductase (PhaB), respectively. These genes are possessed by many microorganisms that can naturally accumulate PHA, and are involved in the biosynthesis of 3HB-CoA, which is the most common biosynthetic substrate for PHA. Specifically, PhaA is involved in catalysis of a reaction in which two molecules of acetyl-CoA are condensed to produce acetoacetyl-CoA, and PhaB is involved in catalysis of a reaction in which acetoacetyl-CoA is reduced to produce 3HB-CoA.
  • PhaA ⁇ -ketothiolase
  • PhaB acetoacetyl-CoA reductase
  • the transformed microorganism according to the present disclosure has a mesophilic host, and the phaA gene derived from a thermophilic microorganism and/or the phaB gene derived from a thermophilic microorganism has been introduced into it. By introducing these genes, it is possible to increase the productivity of PHA by the transformed microorganism.
  • the transformed microorganism can produce PHA with good productivity even under high stress, for example, at a relatively high culture temperature.
  • phaA gene derived from a high-temperature microorganism may be introduced, only the phaB gene derived from a high-temperature microorganism may be introduced, or both genes may be introduced.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure is one in which only the phaA gene derived from a high-temperature microorganism has been introduced, it is preferable that the transformed microorganism has the phaB gene that the host originally has. In this case, the transformed microorganism may or may not further have the phaA gene that the host originally has.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure is one in which only the phaB gene derived from a high-temperature microorganism has been introduced, it is preferable that the host of the transformed microorganism has the phaA gene that it originally possesses. In this case, the transformed microorganism may or may not further have the phaB gene that the host originally possesses.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure has both the phaA gene derived from a high-temperature microorganism and the phaB gene derived from a high-temperature microorganism, the transformed microorganism does not need to have the phaA gene originally possessed by the host and the phaB gene originally possessed by the host. However, since this further improves PHA productivity, it is preferable that the transformed microorganism also has the phaA gene originally possessed by the host and the phaB gene originally possessed by the host.
  • the high-temperature microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism that can grow at 50°C or higher and has the phaA gene and/or the phaB gene.
  • microorganisms include the genera Cupriavidus, Caldimonas, Schlegelella, Thermus, Chelatococcus, Bacillus, Aneurinibacillus, Pseudomonas, Synechococcus, and Spirulina.
  • the genera Cupriavidus, Caldimonas, and Schlegelella are preferred.
  • genes encoding ⁇ -ketothiolase (PhaA) derived from thermophilic microorganisms include, but are not limited to, a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1 derived from Cupriavidus sp.
  • strain S-6 a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2 derived from Caldimonas manganoxidans, a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:3 derived from Schlegelella thermodepolymerans, or a gene having an amino acid sequence that shows 90% or more sequence identity to these amino acid sequences and a base sequence that encodes a protein that exhibits ⁇ -ketothiolase activity.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO:1 is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO:2 or 3 is also preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • thermophilic microorganisms examples include, but are not limited to, a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 derived from Cupriavidus sp.
  • strain S-6 a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 derived from Caldimonas manganoxidans, a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 derived from Schlegelella thermodepolymerans, or a gene having an amino acid sequence that shows 90% or more sequence identity to these amino acid sequences and a base sequence that encodes a protein that exhibits acetoacetyl-CoA reductase activity.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO:4 is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO:5 or 6 is also preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the method for introducing the target gene into the host is not particularly limited, but may include directly inserting or replacing the target gene on the host chromosome, directly inserting or replacing the target gene on a megaplasmid carried by the host, or locating and introducing the target gene on a vector such as a plasmid, phage, or phagemid, and two or more of these methods may be used in combination.
  • a method in which the target gene is directly inserted or replaced onto the host chromosome or onto a megaplasmid carried by the host is preferred, and a method in which the target gene is directly inserted or replaced onto the host chromosome is even more preferred.
  • a “gene expression regulatory sequence” is a DNA sequence that includes a base sequence that controls the transcription amount of the gene (e.g., a promoter sequence) and/or a base sequence that controls the translation amount of messenger RNA transcribed from the gene (e.g., a Shine-Dalgarno sequence).
  • a “gene expression regulatory sequence” any base sequence that exists in nature can be used, or an artificially constructed or modified base sequence can be used.
  • the promoter sequence or Shine-Dalgarno sequence contained in the "gene expression regulatory sequence” includes, but is not limited to, the base sequences shown in any of SEQ ID NOs: 7 to 14, or base sequences containing parts of these base sequences.
  • the substitution, deletion, insertion and/or addition of at least a portion of the genomic DNA can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • Representative methods include a method that utilizes the mechanism of transposon and homologous recombination (Ohman et al., J. Bacteriol., 162:1068-1074 (1985)) and a method based on the principle of site-specific integration caused by the mechanism of homologous recombination and loss by second-stage homologous recombination (Noti et al., Methods Enzymol., 154:197-217 (1987)).
  • the sacB gene from Bacillus subtilis can be coexisted, and the microbial strain from which the gene has been lost by second-stage homologous recombination can be easily isolated as a sucrose-resistant strain (Schweizer, Mol. Microbiol., 6:1195-1204 (1992); Lenz et al., J. Bacteriol., 176:4385-4393 (1994)).
  • genome editing technology using the CRISPR/Cas9 system to modify target DNA Y. Wang et al., ACS Synth Biol. 2016, 5(7):721-732
  • gRNA guide RNA
  • gRNA guide RNA
  • the method for introducing the vector into the cells is not particularly limited, but examples include the calcium chloride method, electroporation method, polyethylene glycol method, and spheroplast method.
  • PHA can be accumulated in the cells.
  • the method for culturing the transformed microorganism according to the present disclosure can be a conventional microbial culture method, and the culture can be performed in a medium containing an appropriate carbon source.
  • the medium composition, the method for adding the carbon source, the culture scale, the aeration and agitation conditions, the culture temperature, the culture time, etc. are not particularly limited.
  • the carbon source is preferably added to the medium continuously or intermittently.
  • the transformed microorganisms disclosed herein can produce PHA with good productivity even at relatively high culture temperatures. For example, good productivity can be achieved even when cultured at temperatures of 35°C or higher.
  • carbon sources can be used as a carbon source during cultivation as long as it can be assimilated by the transformed microorganism according to the present disclosure.
  • carbon sources include, but are not limited to, sugars such as glucose, fructose, and sucrose; oils and fats such as palm oil and palm kernel oil (including palm olein, palm double olein, palm kernel oil olein, etc., which are low-melting point fractions obtained by fractionating these oils), corn oil, coconut oil, olive oil, soybean oil, rapeseed oil, and jatropha oil, and fractionated oils thereof, or by-products of their refinement; fatty acids such as lauric acid, oleic acid, stearic acid, palmitic acid, and myristic acid, and derivatives thereof, and glycerol.
  • sugars such as glucose, fructose, and sucrose
  • oils and fats such as palm oil and palm kernel oil (including palm olein, palm double olein, palm kernel oil olein
  • oils and fats may be partially or entirely degraded oils.
  • Degraded oils refer to oils and fats that have been thermally denatured or that have been altered by reacting with oxygen and/or water under heating.
  • the name of the oils and fats is not limited, and includes those called waste oil, discarded oil, waste cooking oil, waste edible oil, waste vegetable oil, used oil, etc.
  • gases or alcohols such as carbon dioxide, carbon monoxide, methane, methanol, and ethanol, these can also be used as carbon sources.
  • a nitrogen source which is a nutrient source other than the carbon source
  • inorganic salts and other organic nutrient sources.
  • nitrogen sources include, but are not limited to, ammonia; ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate; peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride, and the like.
  • examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline, and vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, and vitamin C, and the like.
  • PHA can be recovered from the cells using known methods. There are no particular limitations on the recovery method, but for example, after culturing is completed, the cells are separated from the culture liquid using a centrifuge or separation membrane, etc., and dried, and then PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform, and cell components are removed from the organic solvent solution containing PHA by filtration, etc., a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA, the supernatant is removed by filtration or centrifugation, and the PHA can be recovered by drying.
  • cell components other than PHA can be dissolved in water using a surfactant, alkali, enzyme, etc., and then the PHA particles can be separated from the aqueous phase by filtration or centrifugation, dried, and recovered.
  • [Item 1] Possessing the polyhydroxyalkanoate synthase gene, A transformed mesophilic microorganism into which a phaA gene derived from a thermophilic microorganism and/or a phaB gene derived from a thermophilic microorganism has been introduced.
  • [Item 2] Item 1. The transformed mesophilic microorganism according to item 1 or 2, wherein the phaA gene derived from the thermophilic microorganism is a gene encoding an amino acid sequence showing 90 to 100% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, or SEQ ID NO:3.
  • a method for producing a polyhydroxyalkanoic acid comprising culturing the transformed mesophilic microorganism according to any one of items 1 to 5 in the presence of a carbon source.
  • Item 7 Item 7. The method for producing a polyhydroxyalkanoic acid according to item 6, wherein the polyhydroxyalkanoic acid is a copolymer of two or more kinds of hydroxyalkanoic acids.
  • Item 8 8. The method for producing a polyhydroxyalkanoic acid according to Item 7, wherein the polyhydroxyalkanoic acid is a copolymer containing 3-hydroxybutyric acid as a monomer unit.
  • Item 9 Item 9. The method for producing a polyhydroxyalkanoic acid according to Item 7 or 8, wherein the polyhydroxyalkanoic acid is a copolymer containing 3-hydroxyhexanoic acid as a monomer unit.
  • the present invention will be described in more detail below with reference to examples, although the present invention is not limited to these examples.
  • the overall genetic manipulation can be carried out, for example, as described in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Enzymes, cloning hosts, and the like used in the genetic manipulation can be purchased from commercial suppliers and used according to their instructions. There are no particular limitations on the enzymes used, so long as they can be used in genetic manipulation.
  • KNK005 trc-phaJ4b/ ⁇ phaZ1,2,6 strain used in this example is a strain in which the phaZ1 gene, phaZ2 gene, and phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidus necator H16 strain have been deleted, the PHA synthase gene on the chromosome has been replaced with a modified version of the PHA synthase gene derived from the genus Aeromonas (a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, i.e., the N149S/D171G mutant (NSDG) gene), and the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome (phaJ4b gene) has been enhanced, and can be prepared in accordance with the method described in PCT Publication WO 2015/115619.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and MunI, and the resulting DNA fragment was ligated to a plasmid vector pCUP2 described in International Publication WO 2007/049716 that was cleaved with MunI, and the DNA fragment ligated in such an orientation that the restriction enzyme SpeI recognition sequence of pCUP2 was located downstream of the lacN17 promoter was selected to obtain pCUP2-lacN17.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 17) having the base sequence of a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 was obtained by PCR using synthetic oligo DNA.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the resulting DNA fragment was ligated to pCUP2-lacN17 cleaved with MunI and SpeI to obtain a plasmid for expressing phaAsp, pCUP2-lacN17-phaAsp.
  • the phaAsp expression plasmid pCUP2-lacN17-phaAsp was introduced into the KNK005dZ/trc-J4b strain, and the resulting strain was named KNK005dZ/trc-J4b/pCUP2-lacN17-phaAsp (hereinafter, also referred to as the "high-temperature microorganism-derived phaA gene-introduced strain").
  • the plasmid vector was introduced into the cells by electroporation as follows.
  • a Biorad Gene Pulser was used as the gene introduction device, and a Biorad gap 0.2 cm cuvette was used. 400 ⁇ l of competent cells and 20 ⁇ l of expression vector were poured into the cuvette and set in the pulse device, and an electric pulse was applied under the conditions of capacitance 25 ⁇ F, voltage 1.5 kV, and resistance value 800 ⁇ .
  • the bacterial solution in the cuvette was shake-cultured in Nutrient Broth medium (DIFCO) at 30°C for 3 hours, and then cultured on a selection plate (Nutrient Agar medium (DIFCO), kanamycin 100 mg/L) at 30°C for 2 days to obtain the grown high-temperature microorganism-derived phaA gene-introduced strain.
  • DIFCO Nutrient Broth medium
  • DIFCO Nutrient Agar medium
  • kanamycin 100 mg/L kanamycin 100 mg/L
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the resulting DNA fragment was ligated to pCUP2-lacN17 cleaved with MunI and SpeI to obtain a plasmid for expressing phaBsp, pCUP2-lacN17-phaBsp.
  • KNK005dZ/trc-J4b/pCUP2-lacN17-phaBsp strain hereinafter, sometimes referred to as the "high-temperature microorganism-derived phaB gene-introduced strain").
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the resulting DNA fragment was ligated to pCUP2-lacN17 cleaved with MunI and SpeI to obtain a plasmid pCUP2-lacN17-phaABsp for expressing phaAsp and phaBsp.
  • KNK005dZ/trc-J4b/pCUP2-lacN17-phaABsp strain hereinafter, sometimes referred to as the "high-temperature microorganism-derived phaAB gene-introduced strain"
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the resulting DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP-A-2007-259708, which had also been digested with SwaI, using a DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) to prepare a plasmid vector pNS2X-sacB+phaABUD for disrupting the host phaAB genes.
  • a DNA ligase Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)
  • a host phaAB gene-disrupted strain was prepared as follows using the plasmid vector pNS2X-sacB+phaABUD for disrupting the host phaAB genes.
  • the host phaAB gene disruption plasmid vector pNS2X-sacB+phaABUD was used to transform E. coli S17-1 strain (ATCC47055), and the resulting transformed microorganism was mixed and cultured with KNK005dZ/trc-J4b strain on Nutrient Agar medium (Difco) to perform conjugation transfer.
  • the resulting culture solution was inoculated onto Son agar medium (sodium citrate 2g/L, sodium chloride 5g/L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2g/L, ammonium dihydrogen phosphate 1g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1g/L, agar 15g/L, pH 6.8) containing 250mg/L kanamycin, and the strains that had grown on the agar medium were selected to obtain strains in which the plasmid was integrated onto the chromosome of KNK005dZ/trc-J4b strain.
  • Son agar medium sodium citrate 2g/L, sodium chloride 5g/L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2g/L, ammonium dihydrogen phosphate 1g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1g/L, agar 15g/L, pH 6.8
  • a plasmid for introducing the phaA gene (phaAsp) and the phaB gene (phaBsp) derived from the thermophilic microorganism Cupriavidus sp. strain S-6 was constructed as follows.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 21) was obtained by PCR using synthetic oligo DNA, which has the nucleotide sequences of the upstream of the phaA structural gene and the downstream of the phaB structural gene of the KNK005dZ/trc-J4b strain, and the nucleotide sequences of a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the resulting DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP 2007-259708 A, which had also been digested with SwaI, using a DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) to transform the thermophilic microorganism Cupriavidus sp.
  • a plasmid vector pNS2X-sacB+phaABsp for introducing the phaA gene (phaAsp) and the phaB gene (phaBsp) derived from strain S-6 was prepared.
  • strain S-6 was introduced into the KNK005dZ/trc-J4b/dphaAB strain by the same conjugation transfer method as above. Furthermore, by culturing as above and selecting with Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, one strain in which phaAsp and phaBsp were introduced at the position on the chromosome where the original host had the phaA and phaB genes was isolated.
  • the resulting strain was named KNK005dZ/trc-J4b/phaAB::phaABsp (hereinafter, also referred to as "high-temperature microorganism-derived phaAB gene chromosomal substitution strain 1").
  • thermophilic microorganism a plasmid for introducing the phaA gene (phaAcm) and the phaB gene (phaBcm) derived from a thermophilic microorganism Caldimonas manganoxidans was prepared as follows.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 22) was obtained by PCR using synthetic oligo DNA, which has the base sequences of the upstream phaA structural gene and downstream phaB structural gene of the KNK005dZ/trc-J4b strain, a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the resulting DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP-A-2007-259708, which had also been digested with SwaI, using a DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) to prepare a plasmid vector pNS2X-sacB+phaABcm for introducing the phaA gene (phaAcm) and phaB gene (phaBcm) derived from the thermophilic microorganism Caldimonas manganoxidans.
  • a DNA ligase Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)
  • the plasmid vector pNS2X-sacB+phaABcm for introducing the phaA gene (phaAcm) and phaB gene (phaBcm) derived from the thermophilic microorganism Caldimonas manganoxidans was introduced into the KNK005dZ/trc-J4b/dphaAB strain by the same conjugation transfer method as above. Furthermore, by culturing as above and selecting with Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, one strain in which phaAcm and phaBcm were introduced at the position on the chromosome where the original host had the phaA and phaB genes was isolated. The obtained strain was named KNK005dZ/trc-J4b/phaAB::phaABcm strain (hereinafter, sometimes referred to as "thermophilic microorganism-derived phaAB gene chromosomal replacement strain 2").
  • thermophilic microorganism a plasmid for introducing the phaA gene (phaAst) and the phaB gene (phaBst) derived from the thermophilic microorganism Schlegelella thermodepolymerans was prepared as follows.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 23) was obtained by PCR using synthetic oligo DNA, which has the base sequences of the upstream phaA structural gene and downstream phaB structural gene of the KNK005dZ/trc-J4b strain, a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the resulting DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP-A-2007-259708, which had also been digested with SwaI, using DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) to prepare a plasmid vector pNS2X-sacB+phaABst for introducing the phaA gene (phaAst) and phaB gene (phaBst) derived from the high-temperature microorganism Schlegelella thermodepolymerans.
  • DNA ligase Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)
  • the plasmid vector pNS2X-sacB+phaABst for introducing the phaA gene (phaAst) and phaB gene (phaBst) derived from the high-temperature microorganism Schlegelella thermodepolymerans was introduced into the KNK005dZ/trc-J4b/dphaAB strain by the same conjugation transfer method as above. Furthermore, by culturing in the same manner as above and selecting with Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, one strain in which phaAst and phaBst were introduced at the position on the chromosome where the original host had the phaA and phaB genes was isolated.
  • the resulting strain was named KNK005dZ/trc-J4b/phaAB::phaABst (hereinafter, also referred to as "high-temperature microorganism-derived phaAB gene chromosomal substitution strain 3").
  • composition of the seed mother medium was 1 w/v % meat extract, 1 w/v % Bacto-Tryptone, 0.2 w/v % yeast extract, 0.9 w/v % Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, and 0.15 w/v % KH 2 PO 4 (pH 6.8).
  • the composition of the preculture medium was 1.1 w/v% Na2HPO4.12H2O , 0.19 w /v % KH2PO4 , 1.29 w /v% ( NH4 ) 2SO4 , 0.1 w /v% MgSO4.7H2O, 2.5 w/v% palm olein oil, and 0.5 v/v% trace metal salt solution (1.6 w/v% FeCl3.6H2O, 1 w/v % CaCl2.2H2O, 0.02 w/v% CoCl2.6H2O , 0.016 w /v% CuSO4.5H2O , and 0.012 w/v% NiCl2.6H2O dissolved in 0.1 N hydrochloric acid ) .
  • the composition of the PHA production medium was 0.385 w/v% Na2HPO4.12H2O , 0.067 w /v % KH2PO4 , 0.291 w /v % ( NH4 ) 2SO4 , 0.1 w/v % MgSO4.7H2O , and 0.5 v/v% trace metal salt solution (1.6 w/v% FeCl3.6H2O, 1 w / v % CaCl2.2H2O, 0.02 w/v % CoCl2.6H2O, 0.016 w / v% CuSO4.5H2O , and 0.012 w/v% NiCl2.6H2O dissolved in 0.1 N hydrochloric acid).
  • the amount of PHA produced was measured as follows. The cells were collected from the culture medium by centrifugation, washed with ethanol, and freeze-dried to obtain the dried cells, and the weight was measured to calculate the dry cell concentration in the culture medium. Furthermore, 100 ml of chloroform was added to 1 g of the obtained dried cells, and the mixture was stirred at room temperature for a day and night to extract the PHA in the cells. After filtering the cell residue, the mixture was concentrated in an evaporator until the total volume was 30 ml, and then 90 ml of hexane was gradually added and left for 1 hour while slowly stirring. The precipitated PHA was filtered and then vacuum dried at 50° C. for 3 hours. The weight of the dried PHA obtained from 1 g of dried cells was measured, and the amount of PHA produced per culture medium was calculated.
  • PHA production culture PHA production culture was carried out as follows. First, a glycerol stock (50 ⁇ l) of the KNK005dZ/trc-J4b strain was inoculated into a seed medium (10 ml) and cultured for 24 hours to carry out seed culture. Next, the seed culture liquid was inoculated at 1.0 v/v% into a 3 L jar fermenter (Marubishi Bioengineering MDL-300 type) containing 1.8 L of preculture medium. The operating conditions were a culture temperature of 30° C., a stirring speed of 500 rpm, and an aeration rate of 1.8 L/min, and the culture was carried out for 28 hours while controlling the pH between 6.7 and 6.8 to carry out preculture. A 14% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the preculture solution was inoculated at 5.0 v/v% into a 5 L jar fermenter (Marubishi Bioengineering MDS-U50 type) containing 2.5 L of PHA production medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 36°C, an agitation speed of 420 rpm, and an aeration rate of 2.1 L/min, and the pH was controlled between 6.7 and 6.8.
  • a 25% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the carbon source was added intermittently. Palm olein oil was used as the carbon source. After 48 hours of cultivation, the amount of PHA produced per culture solution was measured using the method described above.
  • Examples 1 to 6 Under the same conditions as in Comparative Example 1, a culture study was carried out using each of the strains obtained in Microorganism Preparation Examples 1 to 6, and the amount of PHA produced was measured.
  • Table 1 the PHA production amount measured in Comparative Example 1 is set as a reference value, and the PHA production amount of each strain is shown as a relative value to the reference value.
  • thermophilic microorganism From Table 1, it was confirmed that the PHA production of microorganisms was improved by introducing the phaA gene derived from a thermophilic microorganism and/or the phaB gene derived from a thermophilic microorganism.

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Abstract

ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子、及び／又は、高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子が導入された、形質転換中温微生物。前記形質転換中温微生物はカプリアビダス属に属するものであってよい。前記形質転換中温微生物を、炭素源の存在下で培養することより、ポリヒドロキシアルカン酸を製造することができる。

Description

形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の産生能を有する形質転換微生物、及び、当該形質転換微生物を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
　環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり、天然又は自然志向の高まりなどを背景に、微生物を利用した物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義及び重要性が益々高まっており、タンパク質医薬品や遺伝子治療用の核酸などの製造にも、微生物による物質生産が応用されている。例えば、酵母やバクテリアなどの微生物を利用したエタノール、酢酸、医療用タンパク質の生産などが活発に産業応用されている。
　その一例として、ポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡともいう）の微生物による生産が挙げられる（非特許文献１を参照）。ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として産生、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチック代替製品が注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生、蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されている。微生物を利用したＰＨＡ生産では、例えば、カプリアビダス属細菌に炭素源として糖、植物油脂や脂肪酸を与え、細胞内にＰＨＡを蓄積させることでＰＨＡを生産することが知られている（非特許文献２及び３を参照）。
　しかしながら、微生物によるＰＨＡの生産コストは、石油由来汎用プラスチックの生産コストと比較すると高額となる場合がある。生産性を向上させ生産コストを低減することは、ＰＨＡ普及のための課題である。
Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＡＪ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，２０１－１０５（１９９０） Ｓａｔｏ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２０（３），２４６－２５１（２０１５） Ｉｎｓｏｍｐｈｕｎ　Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２７，３８－４５（２０１５）
　以上の通り、ポリヒドロキシアルカン酸の生産性向上は、生産コスト低減に大きく寄与するため、産業上重要な課題である。
　本発明は、上記現状に鑑み、ポリヒドロキシアルカン酸の生産性が向上した形質転換微生物、及び当該微生物を培養することによるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者は前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、高温微生物に由来するβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）をコードする遺伝子及び／又は高温微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）をコードする遺伝子を、ポリヒドロキシアルカン酸を生産可能な中温微生物に導入することで、ポリヒドロキシアルカン酸の生産性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、
　高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子、及び／又は、高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子が導入された、形質転換中温微生物に関する。
　また本発明は、前記形質転換中温微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法にも関する。
　本発明によると、ポリヒドロキシアルカン酸の生産性が向上した形質転換微生物、及び当該微生物を培養することによるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供することができる。
　本発明によると、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産効率を改善し、ポリヒドロキシアルカン酸の生産コストを低減することができる。
　以下に、本発明の実施形態について説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本開示は、ポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡともいう）の生産能を有する形質転換微生物に関する。また、当該形質転換微生物を培養することによるＰＨＡの製造方法に関する。

　本開示に係る形質転換微生物は、宿主が中温微生物であり、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、高温微生物に由来するβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）をコードする遺伝子が導入された形質転換微生物であってよい。また、宿主が中温微生物であり、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、高温微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）をコードする遺伝子が導入された形質転換微生物であってよい。あるいは、宿主が中温微生物であり、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、高温微生物に由来するＰｈａＡをコードする遺伝子、及び、高温微生物に由来するＰｈａＢをコードする遺伝子が導入された形質微生物であってもよい。
　本開示において、中温微生物とは、至適生育温度が２５～４０℃の範囲内にある微生物を指し、高温微生物とは、５０℃以上で生育可能な微生物を指す。
　本開示に係る形質転換微生物の宿主は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株であってもよいし、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、あるいは、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された形質転換株であってもよい。
　外来遺伝子を導入する方法は特に限定されず、宿主の染色体上に遺伝子を直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に遺伝子を直接挿入または置換する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に遺伝子を配置して導入する方法などが選択でき、これらの方法のうち２つ以上を併用しても良い。導入遺伝子の安定性を考慮すると、好ましくは、宿主の染色体上または宿主が保有するメガプラスミド上に遺伝子を直接挿入または置換する方法であり、より好ましくは、宿主の染色体上に遺伝子を直接挿入または置換する方法である。
　本開示に係る形質転換微生物の宿主は、中温微生物であれば特に限定されない。当該中温微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子、β－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）をコードする遺伝子、及び、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）をコードする遺伝子を元来有する微生物であっても良い。
　本開示に係る形質転換微生物の宿主としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌類であって、至適生育温度が２５～４０℃の範囲内にある細菌類が挙げられる。安全性及びＰＨＡ生産性の観点から、好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属に属し、至適生育温度が２５～４０℃の範囲内にある細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属に属し、至適生育温度が２５～４０℃の範囲内にある細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）である。
　（ＰＨＡ）
　本開示に係る形質転換微生物が生産するＰＨＡの種類としては、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、４－ヒドロキシアルカン酸、５－ヒドロキシアルカン酸、６－ヒドロキシアルカン酸など）との共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸との共重合体が好ましい。
　特に好ましいＰＨＡは、炭素数４の３－ヒドロキシアルカン酸の単独重合体、又は、炭素数４の３－ヒドロキシアルカン酸を含む共重合体である。例えば、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：Ｐ３ＨＢ３ＨＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、Ｐ３ＨＢ３ＨＨが好ましい。
　なお、生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
　（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）
　本開示に係る形質転換微生物が有するＰＨＡ合成酵素（ＰｈａＣ）遺伝子は、宿主が本来的に有するものであっても良いし、外来のものであってもよい。ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されず、アエロモナス・キヤビエ、アエロモナス・ハイドロフィラ、シュードモナス　ＳＰ　６１－３、又は、カプリアビダス・ネカトール由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子や、前記２つ以上のＰＨＡ合成遺伝子を組み合わせたキメラＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、前述の各ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
　前記配列同一性は、９５％以上であることが好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　本開示に係る形質転換微生物が有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の数は、１つでも良いし、複数であっても良い。また、複数のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する場合、それらは同一の遺伝子であっても良いし、異なる遺伝子であっても良い。
　（ｐｈａＡ遺伝子及びｐｈａＢ遺伝子）
　ｐｈａＡ遺伝子、及びｐｈａＢ遺伝子は、それぞれβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）をコードする遺伝子である。これらの遺伝子は、ＰＨＡを元来蓄積し得る微生物の多くが保有するものであり、最も一般的なＰＨＡの生合成基質である３ＨＢ－ＣｏＡの生合成に関わる。具体的には、ＰｈａＡは２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを生成する反応の触媒に関わり、ＰｈａＢはアセトアセチルＣｏＡを還元して３ＨＢ－ＣｏＡを生成する反応の触媒に関わる。
　本開示に係る形質転換微生物は、宿主が中温微生物である一方、高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子、及び／又は、高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子が導入されたものである。これら遺伝子が導入されることによって、形質転換微生物によるＰＨＡの生産性を高めることができる。該形質転換微生物は、高ストレス下、例えば比較的高い培養温度下においても、良好な生産性にてＰＨＡを生産することができる。
　本開示においては、高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子のみが導入されてもよいし、高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子のみが導入されてもよいし、双方の遺伝子が導入されてもよい。しかし、高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子が少なくとも導入されることが好ましく、高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子と高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子の双方が導入されることが特に好ましい。
　本開示に係る形質転換微生物が、高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子のみが導入されたものである場合、該形質転換微生物の宿主が元来有するｐｈａＢ遺伝子を有することが好ましい。この場合、宿主の元来有するｐｈａＡ遺伝子をさらに有してもよいし、有しなくてもよい。
　本開示に係る形質転換微生物が、高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子のみが導入されたものである場合、該形質転換微生物の宿主が元来有するｐｈａＡ遺伝子を有することが好ましい。この場合、宿主の元来有するｐｈａＢ遺伝子をさらに有してもよいし、有しなくてもよい。
　本開示に係る形質転換微生物が、高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子と高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子の双方を有する場合、該形質転換微生物の宿主が元来有するｐｈａＡ遺伝子及び宿主が元来有するｐｈａＢ遺伝子は有しなくてもよい。しかし、ＰＨＡ生産性がより向上することから、宿主が元来有するｐｈａＡ遺伝子及び宿主が元来有するｐｈａＢ遺伝子も有することが好ましい。
　高温微生物としては、５０℃以上で生育可能な微生物であって、ｐｈａＡ遺伝子および／またはｐｈａＢ遺伝子を有する微生物であれば特に限定されない。そのような微生物としては、例えば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ属、Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｃｈｅｌａｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ属等が挙げられる。中でも、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ属、Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ属が好ましい。
　高温微生物に由来するβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）をコードする遺伝子としては、例えば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来する配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子、Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ　ｍａｎｇａｎｏｘｉｄａｎｓに由来する配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子、Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｎｓに由来する配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子、またはこれらのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ－ケトチオラーゼ活性を示すタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性は、９０％以上であることが好ましいが、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。また、配列番号２又は３に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性も、９０％以上であることが好ましいが、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　高温微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）をコードする遺伝子としては、例えば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来する配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子、Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ　ｍａｎｇａｎｏｘｉｄａｎｓに由来する配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子、Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｎｓに由来する配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子、またはこれらのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ活性を示すタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
　配列番号４に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性は、９０％以上であることが好ましいが、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９８％以上がより更に好ましく、９９％以上が特に好ましい。また、配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性も、９０％以上であることが好ましいが、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　対象遺伝子を宿主に導入する方法としては特に限定されないが、宿主の染色体上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に対象遺伝子を配置して導入する方法などが選択でき、これらの方法のうち２つ以上を併用しても良い。
　導入遺伝子の安定性を考慮すると、宿主の染色体上または宿主が保有するメガプラスミド上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法が好ましく、宿主の染色体上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法がより好ましい。
　導入する遺伝子を確実に発現させるために、対象遺伝子が、宿主が元来有する「遺伝子発現調節配列」の下流に位置するように導入するか、または、対象遺伝子が、外来の「遺伝子発現調節配列」の下流に位置する形で導入することが好ましい。本開示における「遺伝子発現調節配列」とは、その遺伝子の転写量を制御する塩基配列（例えばプロモーター配列）、及び／または、その遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの翻訳量を調節する塩基配列（例えばシャイン・ダルガノ配列）を含むＤＮＡ配列である。「遺伝子発現調節配列」としては、自然界に存在する任意の塩基配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された塩基配列を利用しても良い。
　「遺伝子発現調節配列」に含まれるプロモーター配列やシャイン・ダルガノ配列としては、例えば、配列番号７～１４のいずれかに示される塩基配列、または、これら塩基配列の一部を含む塩基配列などが挙げられるが、特に限定されない。
　ゲノムＤＮＡの少なくとも一部の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、当業者に周知の方法により行うことができる。代表的な方法としてはトランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ohman et al., J. Bacteriol., 162:1068-1074 (1985)）や、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Noti et al., Methods Enzymol., 154:197-217 (1987)）などがある。また、Bacillus subtilis由来のsacB遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をスクロース耐性株として容易に単離する方法（Schweizer, Mol. Microbiol., 6:1195-1204 (1992)、Lenz et al., J. Bacteriol., 176:4385-4393 (1994)）も利用することができる。さらに別の方法として、標的ＤＮＡを改変するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集技術（Y. Wang et al., ACS Synth Biol. 2016, 5(7):721-732）も利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は改変すべきゲノムＤＮＡの塩基配列の一部に結合しうる配列を有しており、Ｃａｓ９を標的に運ぶ役割をもつ。
　細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
　（ＰＨＡの生産）
　本開示に係る形質転換微生物を培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。本開示に係る形質転換微生物を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、適切な炭素源が存在する培地中で培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。
　本開示に係る形質転換微生物は、比較的高温の培養温度下においても、良好な生産性にてＰＨＡを生産することができる。例えば３５℃以上の温度で培養しても、良好な生産性を達成することができる。
　培養時の炭素源としては、本開示に係る形質転換微生物が資化可能であればどのような炭素源でも使用可能である。特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類；パーム油やパーム核油（これらを分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、パーム核油オレインなども含む）、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体、あるいはグリセロール等が挙げられる。前記油脂は、その一部、又は、全部が、劣化油であってよい。劣化油とは、熱変性し、または、加熱下で酸素および／または水と反応して変質した油脂を指す。その呼称は限定されず、廃油、廃棄油、廃食油、廃食用油、廃植物油、使用済み油等と呼称されているものも含まれる。また、本開示に係る形質転換微生物が二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、エタノールなどのガスやアルコール類を利用可能である場合、これらを炭素源として使用することもできる。
　本開示におけるＰＨＡの製造では、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。下記に限定されないが、窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　培養を適切な時間行なって菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収することができる。回収方法については特に限定されないが、例えば、培養終了後、培養液から遠心分離機や分離膜等で菌体を分離し、乾燥させた後、乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出し、このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって細胞成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させ、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。また、界面活性剤やアルカリ、酵素などを用いてＰＨＡ以外の細胞成分を水に溶解させた後、濾過や遠心分離によってＰＨＡ粒子を水相から分離し乾燥させて回収することもできる。
　以下の各項目では、本開示における好ましい態様を列挙するが、本発明は以下の項目に限定されるものではない。
［項目１］
　ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、
　高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子、及び／又は、高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子が導入された、形質転換中温微生物。
［項目２］
　前記高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子である、項目１又に記載の形質転換中温微生物。
［項目３］
　前記高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子が、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子である、項目１又は２に記載の形質転換中温微生物。
［項目４］
　前記形質転換中温微生物がカプリアビダス属に属する、項目１～３のいずれか１項に記載の形質転換中温微生物。
［項目５］
　カプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物である、項目４に記載の形質転換中温微生物。
［項目６］
　項目１～５のいずれか１項に記載の形質転換中温微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
［項目７］
　ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、項目６に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
［項目８］
　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、項目７に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
［項目９］
　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、項目７又は８に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
　なお全体的な遺伝子操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
　本実施例において使用するＫＮＫ００５　ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株（以下、「ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株」と記載することもある。）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、染色体上のＰＨＡ合成酵素遺伝子を、アエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子の改変体（配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、即ちＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体（ＮＳＤＧ）遺伝子）に置換し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ４ｂ遺伝子）の発現を強化した株であり、ＰＣＴ国際公開第２０１５／１１５６１９号に記載の方法に準じて作製することができる。
　（微生物株作製例１）高温微生物由来ｐｈａＡ遺伝子導入株の作製
　まず、高温微生物Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｓｐ）発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、大腸菌のｌａｃプロモーター改変体であるｌａｃＮ１７プロモーターを有するＤＮＡ断片（配列番号１６）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｕｎＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、国際公開２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものと連結して、ｌａｃＮ１７プロモーターの下流にｐＣＵＰ２の制限酵素ＳｐｅＩ認識配列が位置する向きに連結されたものを選抜し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７を得た。
　次に、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１７）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ｐｈａＡｓｐ発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＡｓｐを得た。
　次に、ｐｈａＡｓｐ発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＡｓｐをＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＡｓｐ株と命名した（以下、「高温微生物由来ｐｈａＡ遺伝子導入株」と記載することもある）。
　プラスミドベクターの細胞への導入は以下のようにエレクトロポレーション法によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた高温微生物由来ｐｈａＡ遺伝子導入株を取得した。
　（微生物株作製例２）高温微生物由来ｐｈａＢ遺伝子導入株の作製
　まず、高温微生物Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来するｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｓｐ）発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１８）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ｐｈａＢｓｐ発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＢｓｐを得た。
　次に、ｐｈａＢｓｐ発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＢｓｐをエレクトロポレーション法によってＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＢｓｐ株と命名した（以下、「高温微生物由来ｐｈａＢ遺伝子導入株」と記載することもある）。
　（微生物株作製例３）高温微生物由来ｐｈａＡＢ遺伝子導入株の作製
　まず、高温微生物Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｓｐ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｓｐ）発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１９）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ｐｈａＡｓｐ及びｐｈａＢｓｐ発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＡＢｓｐを得た。
　次に、ｐｈａＡｓｐ及びｐｈａＢｓｐ発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＡＢｓｐをエレクトロポレーション法によってＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ｐｈａＡＢｓｐ株と命名した（以下、「高温微生物由来ｐｈａＡＢ遺伝子導入株」と記載することもある）。
　（微生物株作製例４）高温微生物由来ｐｈａＡＢ遺伝子染色体置換株１の作製
　まず、宿主ｐｈａＡＢ遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株のｐｈａＡ構造遺伝子上流及びｐｈａＢ構造遺伝子下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２０）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、宿主ｐｈａＡＢ遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢＵＤを作製した。
　次に、宿主ｐｈａＡＢ遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢＵＤを用いて、以下のようにして宿主ｐｈａＡＢ遺伝子破壊株の作製を行った。
　宿主ｐｈａＡＢ遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢＵＤで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、それによって得た形質転換微生物を、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。　得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のｐｈａＡＢ遺伝子を欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株を、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ株と命名した。
　さらに、高温微生物Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｓｐ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｓｐ）導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株のｐｈａＡ構造遺伝子上流及びｐｈａＢ構造遺伝子下流の塩基配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２１）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、高温微生物Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｓｐ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｓｐ）導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢｓｐを作製した。
　次に、高温微生物Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｓｐ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｓｐ）導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢｓｐを、上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来宿主がｐｈａＡ及びｐｈａＢ遺伝子を有していた位置に、ｐｈａＡｓｐ及びｐｈａＢｓｐが導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ株と命名した（以下、「高温微生物由来ｐｈａＡＢ遺伝子染色体置換株１」と記載することもある）。
　（微生物株作製例５）高温微生物由来ｐｈａＡＢ遺伝子染色体置換株２の作製
　まず、高温微生物Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ　ｍａｎｇａｎｏｘｉｄａｎｓに由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｃｍ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｃｍ）導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株のｐｈａＡ構造遺伝子上流及びｐｈａＢ構造遺伝子下流の塩基配列と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２２）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、高温微生物Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ　ｍａｎｇａｎｏｘｉｄａｎｓに由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｃｍ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｃｍ）導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢｃｍを作製した。
　次に、高温微生物Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ　ｍａｎｇａｎｏｘｉｄａｎｓに由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｃｍ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｃｍ）導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢｃｍを、上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来宿主がｐｈａＡ及びｐｈａＢ遺伝子を有していた位置に、ｐｈａＡｃｍ及びｐｈａＢｃｍが導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｃｍ株と命名した（以下、「高温微生物由来ｐｈａＡＢ遺伝子染色体置換株２」と記載することもある）。
　（微生物株作製例６）高温微生物由来ｐｈａＡＢ遺伝子染色体置換株３の作製
　まず、高温微生物Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｎｓに由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｓｔ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｓｔ）導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株のｐｈａＡ構造遺伝子上流及びｐｈａＢ構造遺伝子下流の塩基配列と、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２３）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、高温微生物Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｎｓに由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｓｔ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｓｔ）導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢｓｔを作製した。
　次に、高温微生物Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｎｓに由来するｐｈａＡ遺伝子（ｐｈａＡｓｔ）及びｐｈａＢ遺伝子（ｐｈａＢｓｔ）導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢｓｔを、上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来宿主がｐｈａＡ及びｐｈａＢ遺伝子を有していた位置に、ｐｈａＡｓｔ及びｐｈａＢｓｔが導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｔ株と命名した（以下、「高温微生物由来ｐｈａＡＢ遺伝子染色体置換株３」と記載することもある）。
　（比較例１）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株によるＰＨＡ生産
　下記の条件でＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株を用いた培養検討を行なった。
　（培地）
　種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％　Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
　前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％　パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
　ＰＨＡ生産培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
　（ＰＨＡ生産量の測定方法）
　ＰＨＡ生産量は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得し、重量を測定して培養液中の乾燥菌体濃度を算出した。さらに、得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥菌体１ｇから得られた乾燥ＰＨＡの重量を測定し、培養液あたりのＰＨＡ生産量を算出した。
　（ＰＨＡ生産培養）
　ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　次に、前培養液を、２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３６℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。炭素源としてはパームオレインオイルを使用した。４８時間の培養後、前述の方法で培養液あたりのＰＨＡ生産量を測定した。
　（実施例１～６）
　比較例１と同様の条件で、微生物作製例１～６で得た各菌株を用いた培養検討を行ないＰＨＡ生産量を測定した。
　表１に、比較例１について測定されたＰＨＡ生産量を基準値とし、該基準値に対する相対値として、各菌株のＰＨＡ生産量を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より、高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子及び／又は高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子を導入することで、微生物のＰＨＡ生産量が向上することが確認された。

Claims (9)

  1. 　ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、
    　高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子、及び／又は、高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子が導入された、形質転換中温微生物。
  2. 　前記高温微生物に由来するｐｈａＡ遺伝子が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１に記載の形質転換中温微生物。
  3. 　前記高温微生物に由来するｐｈａＢ遺伝子が、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１又は２に記載の形質転換中温微生物。
  4. 　前記形質転換中温微生物がカプリアビダス属に属する、請求項１又は２に記載の形質転換中温微生物。
  5. 　カプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物である、請求項４に記載の形質転換中温微生物。
  6. 　請求項１又は２に記載の形質転換中温微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

  7. 　ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、請求項６に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  8. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、請求項７に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  9. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、請求項７に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。 
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