WO2024190865A1 - 脂質粒子 - Google Patents

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直純 原田
義 井上
孝利 曽我
友香 五十嵐
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United Immunity Co Ltd
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    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers

Definitions

  • the present invention relates to lipid particles, etc.
  • Lipid nanoparticles can encapsulate various drugs and are used as drug delivery carriers. With the recent outbreak of COVID-19, vaccines using LNPs to prevent infectious diseases have come into widespread use.
  • LNPs used in vaccines contain polyethylene glycol (PEG)-modified lipids to inhibit particle aggregation (Patent Document 1).
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG is an allergen, and since it is contained in various products used daily or for medical purposes, there is a high degree of contact with it, raising concerns about anaphylactic reactions caused by PEG.
  • the present invention aims to provide lipid particles that can be produced without relying on PEG-modified lipids, or that have superior efficacy, safety, or stability to lipid particles that rely on PEG-modified lipids, or that have different immune dynamics from lipid particles that rely on PEG-modified lipids.
  • the present inventors have conducted intensive research and have surprisingly found that the above problems can be solved by lipid particles that contain ionized lipids, phospholipids, and sterols as lipid constituents, and that contain modified polysaccharides that include hydrophobic groups. Based on this finding, the present inventors have conducted further research and have completed the present invention. That is, the present invention encompasses the following aspects.
  • Item 1 A lipid particle that contains an ionized lipid, a phospholipid, and a sterol as lipid constituents, and also contains a modified polysaccharide that contains a hydrophobic group.
  • the content of the ionized lipid is 35 to 70 mol% relative to 100 mol% of the lipids constituting the lipid particles,
  • the content of the phospholipid is 4 to 25 mol% relative to 100 mol% of the lipids constituting the lipid particles, and the content of the sterol is 15 to 55 mol% relative to 100 mol% of the lipids constituting the lipid particles.
  • Item 2. The lipid particle according to item 1.
  • Item 3 The lipid particle according to item 1 or 2, wherein the constituent polysaccharide of the modified polysaccharide includes pullulan.
  • Item 4 The lipid particle according to any one of items 1 to 3, wherein the hydrophobic group includes a hydrophobic group having a sterol skeleton.
  • Item 5 The lipid particle according to any one of items 1 to 4, wherein the weight-average molecular weight of the modified polysaccharide is 5,000 to 2,000,000.
  • Item 6 A lipid particle according to any one of items 1 to 5, containing a drug.
  • Item 7 The lipid particle according to Item 6, wherein the drug is a nucleic acid.
  • Item 8 The lipid particle according to Item 7, wherein the nucleic acid is at least one selected from mRNA, immunostimulatory double-stranded RNA, siRNA, miRNA, ribozyme, CpG oligo DNA, antisense oligo DNA, nucleic acid aptamer, degoy, double-stranded DNA for gene expression, and dinucleotide.
  • the nucleic acid is at least one selected from mRNA, immunostimulatory double-stranded RNA, siRNA, miRNA, ribozyme, CpG oligo DNA, antisense oligo DNA, nucleic acid aptamer, degoy, double-stranded DNA for gene expression, and dinucleotide.
  • Item 9 The lipid particle according to item 7 or 8, wherein the nucleic acid is mRNA or CpG oligo DNA.
  • Item 10 The lipid particle according to any one of items 7 to 9, wherein the nucleic acid is mRNA.
  • Item 11 The lipid particle according to any one of items 7 to 9, wherein the nucleic acid is a CpG oligo DNA.
  • the ionized lipid has the general formula (1):
  • R1 represents an alkyl group.
  • R2 represents an alkyl group.
  • R3 represents an alkyl group.
  • R4 represents an alkyl group or a hydrogen atom.
  • m represents an integer from 1 to 8.
  • n represents an integer from 3 to 10.
  • p represents an integer from 3 to 10.
  • a represents an integer of 3 to 5.
  • b represents 0 or 1.
  • c represents an integer of 0 to 4.
  • R5 and R6 may be the same or different and represent an alkyl group or an alkenyl group.
  • X represents an optionally substituted non-aromatic nitrogen-containing heterocyclic group or an optionally substituted amino group.
  • amino lipids represented by the general formula (3):
  • R7 and R8 are the same or different and each represents an alkyl group or an alkenyl group.
  • Y represents an optionally substituted non-aromatic nitrogen-containing heterocyclic group or an optionally substituted amino group.
  • E represents a linker.
  • Item 12 The lipid particle according to any one of Items 1 to 11, wherein the lipid particle is at least one selected from the group consisting of amino lipids represented by the formula:
  • Item 13 The particles according to Item 1, further comprising a conjugated lipid that inhibits particle aggregation.
  • Item 14 A lipid particle according to any one of items 1 to 13, wherein the content of the complex lipid is 0 to 2 mol % relative to 100 mol % of the lipids constituting the lipid particle.
  • Item 15 The lipid particle according to item 13 or 14, wherein the conjugated lipid is a polyethylene glycol-lipid conjugate.
  • Item 16 A lipid particle according to any one of items 1 to 15, having a mass average particle diameter of 10 to 200 nm.
  • Item 17 A pharmaceutical comprising the lipid particles described in any one of items 1 to 16.
  • Item 18 The pharmaceutical according to Item 17, which is a therapeutic drug for cancer, immune disorders, central nervous system disorders, etc., an infectious disease vaccine, or a cancer vaccine.
  • Item 18A A method for preventing or treating cancer, an immune disease, a central nervous system disease, or an infectious disease, comprising administering the lipid particles according to any one of items 1 to 16 to a subject (e.g., a patient) (preferably a subject with cancer, a subject with an immune disease, a subject with a central nervous system disease, a subject with an infectious disease, or a subject in need of cancer prevention, an immune disease prevention, a central nervous system disease prevention, or an infectious disease prevention).
  • a subject e.g., a patient
  • a subject with cancer a subject with an immune disease, a subject with a central nervous system disease, a subject with an infectious disease, or a subject in need of cancer prevention, an immune disease prevention, a central nervous system disease prevention, or an infectious disease prevention.
  • Item 18B The lipid particles according to any one of items 1 to 16 for use as a therapeutic agent for cancer, immune disorders, central nervous system disorders, etc., or as an infectious disease vaccine or cancer vaccine.
  • Item 18C Use of the lipid particle according to any one of Items 1 to 16 for producing a therapeutic drug for cancer, immune diseases, central nervous system diseases, etc., or an infectious disease vaccine or a cancer vaccine.
  • Item 18D Use of the lipid particle according to any one of Items 1 to 16 as a therapeutic agent for cancer, immune diseases, central nervous system diseases, etc., or as an infectious disease vaccine or cancer vaccine.
  • Item 19 The pharmaceutical agent according to item 17 or 18 for use in subcutaneous administration, intravenous administration, intramuscular administration, intranasal administration, or intratracheal administration.
  • the present invention can provide lipid particles that can be produced without relying on PEG-modified lipids, or that have superior efficacy, safety, or stability to lipid particles that rely on PEG-modified lipids, or that have different immune dynamics from lipid particles that rely on PEG-modified lipids.
  • Test Example 5 the results are shown for when LNP was added and then incubated overnight at 37°C without treatment at 4°C. Results are shown for when LNP(EGFP) (Reference Example 2) or CHP:LNP(EGFP) (Example 2) was added, and the negative control shows the results when no LNP was added. M0 shows the results when M0 macrophages were used, and M2 shows the results when M2-like macrophages were used. This shows the results in Test Example 5, where LNP was added, followed by treatment at 4° C. for 2 hours, then the medium was replaced and further incubation was performed overnight at 37° C. The meanings of each notation in the figure are the same as in FIG.
  • the present invention relates to lipid particles (sometimes referred to as "lipid particles of the present invention” in this specification) that contain an ionized lipid, a phospholipid, and a sterol as lipids constituting the lipid particles, and also contain a modified polysaccharide containing a hydrophobic group. This will be described below.
  • the ionizable lipid is not particularly limited as long as it is capable of forming lipid particles and is a lipid that exhibits a positive charge in the lipid particles.
  • Examples of the ionizable lipid include [4-hydroxybutyl)azanediyl]di(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate) (ALC-0315), 9-heptadecanyl 8- ⁇ (2-hydroxyethyl)[6-oxo-6-(undecyloxy)hexyl]amino ⁇ octanoate (SM-102), (6Z,9Z,28Z,31Z)-Heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate (D-Lin-MC3-DMA), 1,2-Dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA),
  • the ionized lipid is preferably represented by the general formula (1) from the viewpoint of expression of the lipid particles of the present invention in cells, preferably antigen-presenting cells:
  • R1 represents an alkyl group.
  • R2 represents an alkyl group.
  • R3 represents an alkyl group.
  • R4 represents an alkyl group or a hydrogen atom.
  • m represents an integer from 1 to 8.
  • n represents an integer from 3 to 10.
  • p represents an integer from 3 to 10.
  • a represents an integer of 3 to 5.
  • b represents 0 or 1.
  • c represents an integer of 0 to 4.
  • R5 and R6 may be the same or different and represent an alkyl group or an alkenyl group.
  • X represents an optionally substituted non-aromatic nitrogen-containing heterocyclic group or an optionally substituted amino group.
  • amino lipids represented by the general formula (3):
  • R7 and R8 are the same or different and each represents an alkyl group or an alkenyl group.
  • Y represents an optionally substituted non-aromatic nitrogen-containing heterocyclic group or an optionally substituted amino group.
  • E represents a linker.
  • the amino lipid is at least one selected from the group consisting of amino lipids represented by the following formula: By using the amino lipid, it is possible to more significantly exhibit the above-mentioned accumulation property.
  • the alkyl group and the alkenyl group are linear or branched, and are particularly preferably linear.
  • the lower limit of the number of carbon atoms of the alkyl group and the alkenyl group can be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • the upper limit of the number of carbon atoms of the alkyl group and the alkenyl group can be, for example, 30, 25, 20, 18, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, or 4.
  • the number of carbon atoms can be within a range that is any combination of the above upper and lower limits.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group represented by R1 is not particularly limited as long as the compound of general formula (1) is a lipid, and is, for example, 3 to 20. From the viewpoint of the accumulation property, the number of carbon atoms is preferably 3 to 12, more preferably 3 to 10, even more preferably 4 to 8, even more preferably 5 to 7, and particularly preferably 6.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group represented by R2 is not particularly limited as long as the compound of general formula (1) is a lipid, and is, for example, 3 to 20. From the viewpoint of the above-mentioned accumulation property, the number of carbon atoms is preferably 4 to 15, more preferably 5 to 12, even more preferably 6 to 10, still more preferably 7 to 9, and particularly preferably 8.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group represented by R3 is not particularly limited as long as the compound of general formula (1) is a lipid, and is, for example, 3 to 20. From the viewpoint of the above-mentioned accumulation property, the number of carbon atoms is preferably 3 to 12, more preferably 3 to 10, even more preferably 4 to 8, even more preferably 5 to 7, and particularly preferably 6.
  • R4 is preferably an alkyl group.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group represented by R4 is not particularly limited as long as the compound of general formula (1) is a lipid, and is, for example, 3 to 20. From the viewpoint of the above-mentioned accumulation property, the number of carbon atoms is preferably 4 to 15, more preferably 5 to 12, even more preferably 6 to 10, still more preferably 7 to 9, and particularly preferably 8.
  • L1 is preferably --O--C(.dbd.O)-- (the --O-- side of the divalent group represents the hydroxy group side in general formula (1)).
  • L2 is preferably --O--C(.dbd.O)-- (the --O-- side of the divalent group represents the hydroxy group side in general formula (1)).
  • m is preferably 2 to 6, more preferably 3 to 5, and particularly preferably 4.
  • n is preferably 4 to 8, more preferably 5 to 7, and particularly preferably 6.
  • p is preferably 4 to 8, more preferably 5 to 7, and particularly preferably 6.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group represented by R5 is not particularly limited as long as the compound of general formula (2) becomes a lipid, and is, for example, 12 to 24.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group represented by R 6 is not particularly limited as long as the compound of general formula (2) becomes a lipid, and is, for example, 12 to 24.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group represented by R7 is not particularly limited, so long as the compound of general formula (2) becomes a lipid, and is, for example, 12 to 24.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group represented by R 8 is not particularly limited, so long as the compound of general formula (2) becomes a lipid, and is, for example, 12 to 24.
  • the substituent is preferably an alkyl group.
  • alkyl groups include alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms.
  • a non-aromatic nitrogen-containing heterocyclic group is a monovalent group formed by removing one hydrogen atom from a non-aromatic nitrogen-containing heterocycle.
  • non-aromatic nitrogen-containing heterocycles include pyrrolidinyl groups, piperidinyl groups, morpholinyl groups, and piperazinyl groups.
  • the linker represented by E can be, for example, a linker having 1 to 10, preferably 3 to 8, atoms constituting the chain.
  • the ionic lipid may be a single type or a combination of two or more types.
  • the content of the ionic lipid is preferably 35 to 70 mol%, more preferably 40 to 65 mol%, even more preferably 45 to 60 mol%, and even more preferably 45 to 55 mol%, relative to 100 mol% of the lipids constituting the lipid particles, from the viewpoints of lipid particle formability, the above-mentioned accumulation property, stability, etc.
  • Ionic lipids can be prepared by purchasing commercially available products, or can be produced according to or in accordance with known methods. For production, see, for example, WO2018/230710 and WO2010/129687.
  • the phospholipids are not particularly limited as long as they are capable of forming lipid particles, but examples include phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylethanolamine, etc.
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • POPC palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine
  • POPE palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine
  • POPG palmitoyloleoyl-phosphatidylglycerol
  • DPPE dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine
  • DMPE dimyristoyl-phosphatidylethanolamine
  • DSPE distearoyl-phosphatidylethanolamine
  • monomethyl-phosphatidylethanolamine dimethyl-phosphatidylethanolamine
  • DEPE dielaidoyl-phosphatidylethanolamine
  • SOPE stearoyloleoyl-phosphatidylethanolamine
  • EPC egg phosphatidylcholine
  • the phospholipid is preferably phosphatidylcholine, more preferably DSPC, DPPC, etc., and even more preferably DSPC.
  • the phospholipids can be one type alone or a combination of two or more types.
  • the content of phospholipids is preferably 4 to 25 mol%, more preferably 4 to 20 mol%, even more preferably 4 to 15 mol%, even more preferably 6 to 12 mol%, and particularly preferably 8 to 11 mol%, based on 100 mol% of the lipids constituting the lipid particles, from the viewpoints of lipid particle formability, stability, etc.
  • the sterol is not particularly limited as long as it has a sterol skeleton and is capable of forming lipid particles, but examples include cholesterol, cholesteryl hemisuccinate, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol, phytosterol, phytosterol, stigmasterol, zymosterol, ergosterol, sitosterol, campesterol, brassicasterol, etc.
  • cholesterol derivatives such as cholestanol, cholestanone, cholestenone, coprostanol, cholesteryl-2'-hydroxyethyl ether, and cholesteryl-4'-hydroxybutyl ether are also included.
  • the sterol is preferably cholesterol from the viewpoints of lipid particle formation, stability, etc.
  • the sterols can be one type alone or a combination of two or more types.
  • the sterol content is preferably 15 to 55 mol%, more preferably 25 to 50 mol%, even more preferably 30 to 45 mol%, and even more preferably 35 to 45 mol%, relative to 100 mol% of the lipids constituting the lipid particles, from the viewpoints of lipid particle formability, stability, etc.
  • the modified polysaccharide is not particularly limited as long as it is a compound obtained by modifying a polysaccharide and contains a hydrophobic group as a modifying group.
  • a modified polysaccharide it has been found that by using a modified polysaccharide, it is possible to form lipid particles (particularly lipid particles containing each lipid in the above-mentioned content) without relying on PEG-modified lipids (preferably, no lipid is used, but a small amount of PEG may be contained as long as side reactions caused by PEG are avoided).
  • the polysaccharides constituting the modified polysaccharides are not particularly limited as long as they are polymers in which the sugar residues are glycosidicly bonded.
  • residues derived from monosaccharides such as glucose, mannose, galactose, and fucose, or from sugars such as disaccharides and oligosaccharides, can be used as the sugar residues constituting the polysaccharides.
  • the sugar residues may be 1,2-, 1,3-, 1,4-, or 1,6-glycosidic bonds, and the bonds may be either ⁇ - or ⁇ -type bonds.
  • the polysaccharides may be either linear or branched.
  • the sugar residue is preferably a glucose residue
  • examples of the polysaccharides include natural or synthetic pullulan, mannan, dextran, amylose, amylopectin, and the like.
  • pullulan, mannan, dextran, and the like are preferably used, more preferably pullulan, mannan, and the like, and particularly preferably pullulan, and the like are used.
  • the weight-average molecular weight of the polysaccharide is not particularly limited as long as the modified polysaccharide can form gelling particles, but is, for example, 5,000 to 2,000,000.
  • the weight-average molecular weight is preferably 10,000 to 1,000,000, more preferably 20,000 to 500,000, even more preferably 40,000 to 250,000, and even more preferably 80,000 to 125,000.
  • polysaccharides commercially available products can be used, or those obtained according to known manufacturing methods can be used.
  • the hydrophobic group is not particularly limited as long as it is a group having hydrophobic properties. From the viewpoint of lipid particle formability, stability, etc., preferred examples of the hydrophobic group include hydrophobic groups having a sterol skeleton and hydrocarbon groups, and particularly preferred examples include hydrophobic groups having a sterol skeleton.
  • the sterol skeleton is an alcohol with a hydroxy group bonded to the cyclopentahydrophenanthrene ring shown in formula (I).
  • the symbols A through D in formula (I) represent each ring that makes up the cyclopentahydrophenanthrene ring.
  • the cyclopentahydrophenanthrene ring may have a double bond, and the position of the hydroxyl group is not particularly limited.
  • the sterol has a hydroxyl group bonded to the C-3 position and a double bond to the B ring, or the stanol has a hydroxyl group bonded to the C-3 position and is composed of a saturated ring.
  • hydrophobic groups having a sterol skeleton include groups derived from compounds in which the sterol skeleton is modified, for example, by substituting a hydrocarbon group (e.g., a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms) at the ring carbon.
  • group derived from refers to a group obtained by removing a functional group such as a hydrogen atom or a hydroxyl group from a certain compound.
  • hydrophobic groups having a sterol skeleton examples include cholesterol-derived groups, cholestanol-derived groups, lanosterol-derived groups, ergosterol-derived groups, ⁇ -sitosterol-derived groups, campesterol-derived groups, stigmasterol-derived groups, and brassicasterol-derived groups.
  • sterol-derived groups such as cholesterol-derived groups, cholestanol-derived groups, lanosterol-derived groups, and ergosterol-derived groups, and more preferred are cholesterol-derived groups.
  • the hydrocarbon group as the hydrophobic group is not particularly limited, and examples thereof include chain (preferably linear) hydrocarbon groups (preferably alkyl groups) having 8 to 50 carbon atoms (preferably 10 to 30, more preferably 12 to 20).
  • the weight-average molecular weight of the modified polysaccharide is not particularly limited as long as the modified polysaccharide can form gelling particles, but is, for example, 5,000 to 2,000,000.
  • the weight-average molecular weight is preferably 10,000 to 1,000,000, more preferably 20,000 to 500,000, even more preferably 40,000 to 250,000, and even more preferably 80,000 to 125,000.
  • the number of hydrophobic groups contained in the modified polysaccharide is not particularly limited as long as the modified polysaccharide can form gelling particles, and is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, per 100 sugar residues that form the polysaccharide.
  • the hydrophobic group can be linked to the polysaccharide directly or indirectly (e.g., via a linker).
  • a preferred modified polysaccharide is, for example, one in which the primary hydroxyl groups of, for example, 1 to 10 (preferably 1 to 5) saccharide units per 100 saccharide residues constituting the polysaccharide are represented by the formula (II): -O-( CH2 ) xCONH ( CH2 ) yNH -CO-O-R (II) (wherein R represents a hydrophobic group or a hydrocarbon group having a sterol skeleton; x represents 0 or 1; and y represents any positive integer), and y is preferably 1 to 8.
  • the modified polysaccharides can be synthesized according to or in accordance with known methods (e.g., International Publication No. WO00/12564).
  • One example is the following method. First, a diisocyanate compound represented by OCN-R A NCO (wherein R A is a hydrocarbon group having 1 to 50 carbon atoms) is reacted with a hydroxyl-containing hydrocarbon or sterol having 12 to 50 carbon atoms to produce an isocyanate group-containing hydrophobic compound in which one molecule of a hydroxyl-containing hydrocarbon or sterol having 12 to 50 carbon atoms is reacted.
  • OCN-R A NCO wherein R A is a hydrocarbon group having 1 to 50 carbon atoms
  • the resulting isocyanate group-containing hydrophobic compound is further reacted with a polysaccharide to produce a hydrophobic group-containing polysaccharide containing a hydrocarbon group or a steryl group having 12 to 50 carbon atoms as a hydrophobic group.
  • the resulting reaction product is purified with a ketone solvent to produce a high-purity hydrophobic group-containing polysaccharide.
  • the modified polysaccharides can be one type alone or a combination of two or more types.
  • the content of the modified polysaccharide is, for example, 0.5 to 15 mol %, preferably 1 to 10 mol %, relative to 100 mol % of the lipids constituting the lipid particles, from the viewpoints of lipid particle formability, stability, etc.
  • the lipid particles of the present invention may contain a complexed lipid (hereinafter simply referred to as a "complexed lipid”) that inhibits aggregation of the particles.
  • the complexed lipid is not particularly limited as long as it can inhibit aggregation of lipid particles and can constitute lipid particles, and examples of the complexed lipid include polyethylene glycol (PEG)-lipid conjugates, polyamide (ATTA)-lipid conjugates, and cationic polymer-lipid conjugates (CPLs).
  • the complexed lipid may contain PEG-lipids including, for example, PEG-diacylglycerol (DAG), PEG dialkyloxypropyl (DAA), PEG-phospholipid, PEG-ceramide (Cer), or a mixture thereof.
  • PEG-lipids including, for example, PEG-diacylglycerol (DAG), PEG dialkyloxypropyl (DAA), PEG-phospholipid, PEG-ceramide (Cer), or a mixture thereof.
  • the molecular weight of the PEG portion of the PEG-lipid conjugate is not particularly limited, and may be, for example, 200 to 10,000, preferably 500 to 7,000, more preferably 500 to 4,000, even more preferably 1,000 to 3,000, and even more preferably 1,500 to 2,500.
  • the conjugated lipids can be one type alone or a combination of two or more types.
  • the content of the complex lipid is, for example, 0 to 2 mol% relative to 100 mol% of the lipids constituting the lipid particles, from the viewpoints of lipid particle formability, stability, and avoidance of anaphylactic shock.
  • the content is preferably 0 to 1 mol%, more preferably 0 to 0.5 mol%, even more preferably 0 to 0.2 mol%, even more preferably 0 to 0.1 mol%, particularly preferably 0 to 0.01 mol%, and especially preferably 0 mol% (no complex lipid is contained).
  • the lipid particles of the present invention preferably contain a drug.
  • Drugs are not particularly limited, but include, for example, nucleic acid adjuvants and anticancer drugs, and may be contained in combination.
  • the drug is disposed inside the lipid particle of the present invention (separated from the outside of the lipid particle).
  • the drug particularly, a nucleic acid
  • the drug is disposed inside the lipid particle of the present invention in a state complexed with an ionized lipid.
  • the nucleic acid of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include mRNA, immunostimulatory double-stranded RNA (poly-IC RNA, etc.), siRNA, miRNA, ribozyme, CpG oligo DNA, antisense oligo DNA, nucleic acid aptamer, degoy, double-stranded DNA for gene expression, and dinucleotides.
  • the nucleic acid may be not only DNA and RNA, but also anything that can be a pharmaceutical active ingredient, and includes those that have been subjected to known chemical modifications, as exemplified below.
  • the phosphate residues of each nucleotide can be replaced with chemically modified phosphate residues, such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, and phosphorodithioate.
  • the hydroxyl group at the 2nd position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide may be replaced with -OR (R represents, for example, CH3 (2' - O-Me), CH2CH2OCH3 (2' - O -MOE), CH2CH2NHC (NH) NH2 , CH2CONHCH3 , CH2CH2CN , etc.).
  • the base portion may be chemically modified, for example, by introducing a methyl group or a cationic functional group at the 5th position of the pyrimidine base, or by replacing the carbonyl group at the 2nd position with a thiocarbonyl.
  • Further examples include those in which the phosphate portion or the hydroxyl portion is modified with, for example, biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, etc., but are not limited to these.
  • the term "nucleic acid” includes any of BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid), etc.
  • the nucleic acid of the present invention can be preferably CpG oligo DNA or mRNA, particularly mRNA encoding a microbial antigen or a cancer antigen as described below.
  • CpG oligo DNA is as follows: Class A: D35-CpG, ODN1585, ODN2216, ODN2336, etc.
  • Class B K3-CpG, ODNBW006, ODN D-SL01, ODN1668, OND1826, OND2006 (CpG7909, PF-3512676), ODN2007, ODN684, etc.
  • Class C ODN D-SL03, ODN 2395, ODN M362, etc.
  • CpG-28 CpG-685 (GNKG-168), CpG-ODN C274, KSK-13 (KSK-CpG), CpG ODN 10104 (CpG-10104), CpG ODN-1585, ODN-5890, 1018-ISS, EMD-1201081 (HYB-2055, IMO-2055), etc.
  • CpG oligo DNA may be a commercially available product, or may be one obtained according to a known manufacturing method.
  • it may be a modified product containing a hydrophobic group A having a sterol skeleton based on the contents of US2022/0111061 A1, but is preferably not a modified product containing a hydrophobic group A having a sterol skeleton.
  • examples of microbial antigens encoded by it include viral antigens, fungal antigens, etc.
  • Viruses from which viral antigens are derived include, but are not limited to, influenza viruses (e.g., types A and B), rubella viruses, Ebola viruses, coronaviruses, measles viruses, chickenpox/shingles viruses, herpes simplex viruses, mumps viruses, arboviruses, respiratory syncytial viruses, SARS viruses, hepatitis viruses (e.g., hepatitis B viruses, hepatitis C viruses), yellow fever viruses, AIDS viruses, rabies viruses, hantaviruses, dengue viruses, Nipah viruses, and lyssaviruses; and non-enveloped viruses (viruses that do not have an envelope) such as adenoviruses, noroviruses, rotaviruses, human papillomaviruses, poliovirus
  • influenza viruses
  • the bacteria from which the bacterial antigen is derived are not particularly limited, but examples include Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Salmonella, Helicobacter pylori, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Campylobacter, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Propionibacterium acnes, Clostridium faecalis, Clostridium difficile, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella, Klebsiella pneumoniae, Koinebacterium, Streptococcus hemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Mycoplasma, Candida, Aspergillus, etc.
  • the cancer antigens it encodes include, but are not limited to, ERK1, ERK2, MART-1/Melan-A, gp100, adenosine deaminase binding protein (ADAbp), FAP, cyclophilin b, colorectal-related antigen (CRC)-C017-1A/GA733, carcinoembryonic antigen (CEA), CAP-1, CAP-2, etv6, AML1, prostate-specific antigen (PSA), PSA-1, PSA-2, PSA-3, prostate-specific membrane antigen (PSMA), T-cell receptor/C D3-zeta chain, CD20, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-
  • Target cancers are not particularly limited, and examples include leukemia (including chronic lymphocytic leukemia and acute lymphocytic leukemia), lymphoma (including non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, T-cell lymphoma, B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, malignant lymphoma, diffuse lymphoma, and follicular lymphoma), myeloma (including multiple myeloma), breast cancer, colon cancer, kidney cancer, stomach cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, endometrial cancer, and esophageal cancer.
  • leukemia including chronic lymphocytic leukemia and acute lymphocytic leukemia
  • lymphoma including non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, T-cell lymphoma, B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, mal
  • the adjuvant is not particularly limited as long as it exhibits an adjuvant function that supports or enhances the original function of the active ingredient when used in combination with the main active ingredient, but specifically can be selected from nucleic acids, lipopolysaccharides, lipopeptides, synthetic low molecular weight compounds, etc., and preferably CpG oligo DNA, poly IC RNA, imidazoquinolines (e.g., R848 and imiquimod), STING agonists (e.g., cyclic di-GMP), monophosphoryl lipids, lipopeptides, etc. are used.
  • adjuvants include, for example, taxane drugs, anthracycline drugs, JAK/STAT inhibitors, indole deoxygenase (IDO) inhibitors, and tryptophan deoxygenase (TDO) inhibitors.
  • IDO indole deoxygenase
  • TDO tryptophan deoxygenase
  • inhibitors include compounds that have an antagonistic effect against the factor, as well as neutralizing antibodies, siRNA, and antisense DNA against the factor.
  • Anti-cancer drugs include, for example, alkylating agents, metabolic antagonists, microtubule inhibitors, antibiotic anti-cancer drugs, topoisomerase inhibitors, platinum preparations, molecular targeted drugs, hormones, and biological agents.
  • the drug can be a single type or a combination of two or more types.
  • the mass ratio of the drug to the lipid particle component CHP is 200 or less, more preferably 100 or less, and even more preferably 90 or less.
  • the upper limit of the mass ratio can be, for example, 70, 50, 40, 30, 20, 10, or 8 and the lower limit of the mass ratio can be, for example, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, or 1.
  • the above upper and lower limits can be combined in any manner.
  • the liquid containing the lipid particles of the present invention can contain a drug (preferably a nucleic acid, more preferably an mRNA) at a concentration of, for example, 1 to 1000 ⁇ g/mL, preferably 5 to 500 ⁇ g/mL, more preferably 15 to 400 ⁇ g/mL, even more preferably 30 to 300 ⁇ g/mL, and even more preferably 50 to 200 ⁇ g/mL.
  • a drug preferably a nucleic acid, more preferably an mRNA
  • the lipid particles of the present invention may contain other components (other than the solvent) in addition to the above.
  • other components include various components that are known to be incorporated into lipid particles, such as antioxidants and membrane proteins.
  • Antioxidants can be included to prevent oxidation of the membrane, and are used as necessary as a component of the membrane.
  • antioxidants used as components of the membrane include butylated hydroxytoluene, propyl gallate, tocopherol, tocopherol acetate, concentrated mixed tocopherols, vitamin E, ascorbic acid, L-ascorbic acid stearate, ascorbic acid palmitate, sodium bisulfite, sodium sulfite, sodium edetate, erythorbic acid, citric acid, etc.
  • Membrane proteins can be included to add functionality to the membrane or to stabilize the membrane structure, and are used as membrane components as necessary.
  • membrane proteins include surface membrane proteins, integral membrane proteins, albumin, and recombinant albumin.
  • the content of other components is, for example, 10% by mass or less, preferably 5% by mass or less, more preferably 2% by mass or less, and even more preferably 1% by mass or less, relative to 100% by mass of the lipid particles of the present invention.
  • the mass-average particle diameter of the lipid particles of the present invention is, for example, 200 nm or less, preferably 10 to 200 nm, more preferably 20 to 200 nm, even more preferably 40 to 190 nm, even more preferably 40 to 180 nm, and particularly preferably 40 to 160 nm.
  • the particle diameter can be measured by dynamic light scattering.
  • the lipid particles of the present invention are usually formed in an aqueous solution.
  • aqueous solutions include various buffer solutions (e.g., acetate buffer, phosphate buffer, formate buffer, histidine buffer, etc.).
  • the lipid particles of the present invention can be preferably produced by a method including a step of mixing an alcoholic solution containing the lipids constituting the lipid particles with an aqueous solution containing modified polysaccharides (preferably further containing a drug), or a step of mixing an alcoholic solution containing the lipids constituting the lipid particles with an aqueous solution (preferably further containing a drug) and an aqueous solution containing modified polysaccharides (step 1).
  • the lipid particles of the present invention can be obtained simply and efficiently without relying on PEG-modified lipids or avoiding side reactions caused by PEG.
  • the alcohol that is the solvent for the alcohol solution is not particularly limited as long as it is an alcohol that can dissolve lipids.
  • a preferred example of the alcohol is ethanol.
  • the alcohol solution preferably contains the lipids constituting the lipid particles in the molar ratio described above. This makes it possible to obtain lipid particles containing the lipids constituting the lipid particles in the molar ratio described above.
  • the lipid concentration in the alcohol solution is, for example, 2 to 20 mM, preferably 4 to 12 M.
  • An aqueous solution is a solution in which the solvent contains water (preferably the water content is 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 100%).
  • the concentration of the modified polysaccharide in the aqueous solution is, for example, 0.2 to 5 mg/mL, preferably 0.4 to 3 mg/mL, and more preferably 0.6 to 1.5 mg/mL.
  • the mixing ratio of the aqueous solution to the alcohol solution is, for example, 1 to 20, preferably 2 to 4.
  • the mixing method is not particularly limited as long as it allows the formation of lipid particles, but is usually performed by vigorously stirring with a vortex or the like.
  • the mixture is mixed within the reaction system.
  • Step 1 is usually carried out at room temperature or with heating.
  • the lipid particles of the present invention are useful in that they can be produced without relying on PEG-modified lipids, and/or have superior efficacy, safety, or stability to lipid particles that rely on PEG-modified lipids, or have different immune dynamics from lipid particles that rely on PEG-modified lipids.
  • a conjugated lipid that inhibits particle aggregation such as a PEG-modified lipid
  • a conjugated lipid that inhibits particle aggregation such as a PEG-modified lipid
  • a conjugated lipid that inhibits particle aggregation may be further included, and is useful in that it has superior efficacy, safety, or stability to lipid particles that rely on PEG-modified lipids, or has different immune dynamics from lipid particles that rely on PEG-modified lipids.
  • Safety can be, for example, reduced anti-PEG antibody induction, reduced inflammation at the administration site, reduced fever after administration, etc.
  • Stability refers to the stability of the formulation, and for example, the increase in particle size due to freezing and thawing is suppressed.
  • lipid particles containing conventional PEG-modified lipids such as those used in COVID-19 vaccines, cannot withstand freezing and thawing, and the particle size increases with repeated freezing and thawing regardless of the presence or absence of an isotonic agent (Sucrose).
  • the lipid particles of the present invention can improve the stability of the lipid particle formulation by containing modified polysaccharides such as CHP.
  • the lipid particles of the present invention that do not contain PEG-modified lipids and are produced by the production method of Example 4 (Method 2) described below have even better stability against freezing and thawing, and can suppress the increase in particle size even without Sucrose.
  • Immune dynamics can be, for example, differences in the quality of induced cellular immunity.
  • the lipid particles of the present invention can encapsulate drugs and selectively accumulate in DC-SIGN (CD209)-expressing cells (e.g., M2-like macrophages and antigen-presenting cells). Therefore, the lipid particles of the present invention can be used, for example, as medicines, reagents, etc. (sometimes referred to as "drugs of the present invention” in the present specification), more specifically, as therapeutic drugs for cancer, immune diseases, diabetes-induced diseases, central nervous system diseases, etc., infectious disease vaccines, or cancer vaccines. Infectious disease vaccines are not particularly limited as long as they are vaccines used against infectious diseases, and include not only preventive vaccines but also therapeutic vaccines.
  • the drug of the present invention is not particularly limited as long as it contains the lipid particles of the present invention, and may further contain additives as necessary.
  • additives include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances, chelating agents, etc.
  • the manner of use of the drug of the present invention is not particularly limited, and an appropriate manner of use can be adopted depending on the type of drug.
  • the drug of the present invention can be used, for example, in vitro (e.g., added to the medium for cultured cells) or in vivo (e.g., administered to animals).
  • Examples of mammals include humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer.
  • Examples of cells include animal cells.
  • Examples of cells include blood cells, hematopoietic stem cells and progenitor cells, gametes (sperm, eggs), fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, nerve cells, liver cells, keratinocytes, muscle cells, epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, and cancer cells.
  • the drug of the present invention can be in any dosage form, for example, oral preparations such as tablets (including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, lozenges, jelly drops, etc.), pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), and jellies, or parenteral preparations such as injectable preparations (for example, drip injections (e.g., intravenous drip preparations, etc.), intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, and intradermal injections), topical preparations (for example, ointments, poultices, and lotions), suppositories, inhalants, eye drops, eye ointments, nasal drops, ear drops, and liposomes.
  • oral preparations such as tablets (including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, lozenges, jelly drops, etc.), pills,
  • the route of administration of the drug of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained, and examples of the route include oral administration; enteral administration such as tube feeding and enema administration; and parenteral administration such as intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, intracardiac administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, nasal administration, intratracheal administration, and eye drop administration.
  • the content of the lipid particles of the present invention in the drug of the present invention depends on the mode of use, the subject of application, the condition of the subject of application, etc., and is not limited, but can be, for example, 0.0001 to 100% by weight, preferably 0.001 to 50% by weight.
  • the dosage of the drug of the present invention when administered to an animal is not particularly limited as long as it is an effective amount that exerts a medicinal effect, and is usually, in terms of the weight of the lipid particles of the present invention, generally 0.1 to 1000 mg/kg body weight per day in the case of oral administration, and preferably 0.5 to 500 mg/kg body weight per day, and in the case of parenteral administration, 0.01 to 100 mg/kg body weight per day, and preferably 0.05 to 50 mg/kg body weight per day.
  • the above dosages can be increased or decreased as appropriate depending on the age, pathological condition, symptoms, etc.
  • Preparation Example 1 Preparation of pullulan nanogel According to the previous report (Macromolecules 1993, 23, 3062-3068), cholesterol-modified pullulan (CHP) was prepared by introducing 1.2 cholesterol molecules per 100 monosaccharides into pullulan with a weight-average molecular weight of 100,000. A pullulan nanogel solution was prepared using the prepared CHP by a known method.
  • CHP cholesterol-modified pullulan
  • LNP 1 mRNA: ovalbumin (OVA) mRNA
  • OVA ovalbumin
  • An ethanol solution (lipid concentration: 8 mM) of lipids mixed in a ratio (molar ratio) of ALC-0315 ([(4-Hydroxybutyl)azanediyl]di(hexane-6,1-diyl) bis(2-hexyldecanoate)):DSPC (Distearoylphosphatidylcholine):DMG-PEG200 (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-methoxypolyethylene glycol):Cholesterol 50:10:1.5:38.5 was prepared (Liquid B).
  • the mixed solution was solvent-substituted with PBS using a dialysis membrane (MWCO; 3.5K).
  • the collected solution was concentrated 5 times using an Amicon tube (MWCO; 30K) and passed through a 0.45 ⁇ m filter to obtain an LNP (OVA) solution (mass average particle size: 81nm, ELSZ-2000ZS Otsuka Electronics Co., Ltd.).
  • Ribo Green Assay (Invitrogen) was performed, and the mRNA concentration was calculated to be 185 ⁇ g/mL.
  • LNP 2 mRNA: EGFP mRNA
  • mRNA for the fluorescent protein EGFP was used instead of OVA mRNA (mass average particle size: 75 nm, mRNA concentration: 186 ⁇ g/mL).
  • LNP 3 mRNA: HPV E7 mRNA
  • HPV E7 HPV E7 mRNA
  • Example 1 Preparation of CHP:LNP 1 (mRNA: OVA mRNA) To 1 mL of the LNP (OVA) solution (Reference Example 1), the same amount of 10 mg/mL CHP aqueous solution was added and stirred for 30 minutes. The solution was passed through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a CHP:LNP (OVA) solution (mass average particle size: 122 nm, mRNA concentration: 93 ⁇ g/mL). (Method 1).
  • Example 2 Preparation of CHP:LNP 2 (mRNA: EGFP mRNA) A CHP:LNP(EGFP) solution was obtained in the same manner as in Example 1, except that the LNP(EGFP) solution (Reference Example 2) was used instead of the LNP(OVA) solution (Reference Example 1) (mass average particle size: 117 nm, mRNA concentration: 95 ⁇ g/mL) (Method 1).
  • Example 3 Preparation of CHP:LNP 3 (mRNA: HPV E7 mRNA) A CHP:LNP(HPV E7) solution is obtained in the same manner as in Example 1, except that the LNP(HPV E7) solution (Reference Example 3) is used instead of the LNP(OVA) solution (Reference Example 1) (Method 1).
  • Example 4 Preparation of CHP:LNP 4 (mRNA: OVA mRNA)
  • An ethanol solution of lipids mixed in a molar ratio of MC3:DSPC:Cholesterol 50:10:40 (lipid concentration: 8 mM) was prepared (Solution B).
  • the mixed solution was solvent-substituted with PBS using a dialysis membrane (MWCO; 3.5K).
  • the collected solution was concentrated 5-fold using an Amicon tube (MWCO; 30K) and passed through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a CHP:LNP(OVA) solution (mass average particle size: 155 nm, mRNA concentration: 70 ⁇ g/mL) (Method 2).
  • the mixed solution was solvent-exchanged with PBS using a dialysis membrane (MWCO; 3.5K).
  • the collected solution was concentrated 5-fold using an Amicon tube (MWCO; 30K) and passed through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a CHP:LNP(EGFP) solution (weight average particle size: 135 nm, mRNA concentration: 82 ⁇ g/mL) (Method 2).
  • Example 6 Preparation of CHP:LNP 6 (mRNA: HPV E7 mRNA) A CHP:LNP (HPV E7) solution is obtained in the same manner as in Example 4, except that HPV E7 mRNA is used instead of OVA mRNA (Method 2).
  • Examples 7-23 Preparation of CHP:LNP 7 CHP:LNP was prepared using the methods (Method 1, Method 2), nucleic acid, ionized lipid, and lipid ratio shown in Table 1 below. The preparation compositions and physical properties of the CHP:LNP prepared in Examples 1 to 23 are shown in the table below.
  • Example 58 Preparation of CHP:LNP 8 (mRNA: mCherry mRNA)
  • a pullulan nanogel solution CHP concentration: 2 mg/mL, solvent PBS) was prepared by the method shown in Preparation Example 1 (Solution C).
  • the mixed solution was solvent-substituted with PBS using a dialysis membrane (MWCO; 10K).
  • the collected solution was concentrated 7-fold using an Amicon tube (MWCO; 100K) and passed through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a CHP:LNP (mCherry) solution (weight average particle size: 131 nm, mRNA concentration: 135 ⁇ g/mL) (Method 3).
  • Examples 24-57 and 59-62 Preparation of CHP:LNP 9 CHP:LNP was prepared using the preparation methods (Method 1, Method 2, Method 3), nucleic acid, ionized lipid, phospholipid, PEG-modified lipid, lipid ratio, and CHP concentration shown in Tables 2 and 3.
  • the preparation compositions and physical properties of CHP:LNP prepared in Examples 24 to 62 are shown in the following table together with those of Examples 1 to 23.
  • Test Example 1 Antigenicity evaluation test by immunization of mice CHP:LNP(OVA) (Example 1, Example 4) or LNP(OVA) (Reference Example 1) were subcutaneously administered at 10 ⁇ g of mRNA to C57BL/6 mice (Japan SLC). In addition, the same doses were intramuscularly administered to other mice for comparison. After 3 weeks, the same doses and administration methods were administered again, and after another week, blood samples were taken, and spleen cells and lymph nodes were collected.
  • Spleen cells were promptly harvested and stimulated with OVA CD4 epitope peptide (ROCOLAND, Ovalbumin 323-339-OH) and OVA CD8 epitope peptide (ROCOLAND, OVA 257-264).
  • Secreted IFN- ⁇ was measured using ELISA, and intracellular IFN- ⁇ , IL-2, and TNF ⁇ were measured using intracellular cytokine staining.
  • expression analysis of multiple cell surface markers (CD3, CD4, CD8, CD127, CD62L, CD44, KLRG1, Tim-3, Lag-3, PD-1) will be performed on cells derived from the regional lymph nodes and collected spleen cells to analyze the status of T cells.
  • antigen-presenting cells are identified by co-staining with cell surface markers such as CD11b, CD11c, F4/80, B220, and CD8a.
  • cell surface markers such as CD11b, CD11c, F4/80, B220, and CD8a.
  • SIGN-R1 an antibody against SIGN-R1
  • OVA-specific antibodies in serum will be measured using ELISA.
  • Test Example 2 Comparative toxicity test of CHP:LNP(OVA) and LNP(OVA) (1) Cytokine release syndrome CHP:LNP(OVA) (Example 1, Example 4) or LNP(OVA) (Reference Example 1) was subcutaneously administered at 10 ⁇ g as mRNA to C57BL/6 mice. Blood was collected over time, and the blood concentrations of IL-6, IL-1 ⁇ , etc. were measured by ELISA or multiplex bead-based assay panel (BioLegend).
  • Example 1 Body temperature fluctuation CHP:LNP(OVA) (Example 1, Example 4) or LNP(OVA) (Reference Example 1) was subcutaneously administered at 10 ⁇ g as mRNA amount to C57BL/6 mice. Rectal body temperature was then measured over time.
  • Test Example 3 Vaccine evaluation test by immunization of mice C57BL/6 mice are immunized subcutaneously with CHP:LNP (HPV E7) (Example 6) or LNP (HPV E7) (Reference Example 3) at 10 ⁇ g of mRNA. Two or three weeks later, a second immunization is performed with the same dose, and on the same day, 1 x 10 5 cells of a mouse lung cancer cell line (TC-1 cells) stably expressing HPV E7 protein are subcutaneously transplanted. The size of the tumor is then measured over time.
  • CHP:LNP HPV E7
  • LNP HPV E7
  • Test Example 4 Immunogenicity test CHP:LNP(OVA) (Example 1, Example 4) or LNP(OVA) (Reference Example 1) is subcutaneously administered at 10 ⁇ g as mRNA to C57BL/6 mice. The same dose is then subcutaneously administered multiple times (2 to 5 times) at 2- or 3-week intervals. The amount of anti-PEG antibody and anti-CHP antibody in the blood is then measured by ELISA.
  • Test Example 5 Functional evaluation test using human peripheral blood lymphocyte-derived macrophages CD14 positive monocytes were isolated from human peripheral blood and seeded in 500 ⁇ L of basal medium (RPMI, 10% fetal bovine serum, 50 ng/mL M-CSF) at 2 x 105 cells/well on a 24-well tissue culture plate and cultured for 3 days in an incubator at 37°C and 5% CO2 . After that, the medium was replaced with 500 ⁇ L of basal medium and cultured for another 3 days.
  • basal medium RPMI, 10% fetal bovine serum, 50 ng/mL M-CSF
  • the medium was replaced with 500 ⁇ L of basal medium, while for differentiation induction of M2-like macrophages, the medium was replaced with 500 ⁇ L of differentiation induction medium containing 50 ng/mL IL-4, 50 ng/mL IL-6, 50 ng/mL IL-10, and 50 ng/mL IL-13, and cultured for two days.
  • CHP:LNP (EGFP) (Example 2, Example 5) or LNP (EGFP) (Reference Example 2) containing 0.5 ⁇ g of mRNA was added to the basal medium, and after 2 hours of culture at 4 ° C., the medium was replaced with 500 ⁇ L and incubated overnight at 37 ° C. and 5% CO 2.
  • Test Example 6 Experiment to confirm expression in antigen-presenting cells by subcutaneous administration to mice CHP:LNP(EGFP) (Example 5) or LNP(EGFP) (Reference Example 2) were subcutaneously administered at 10 ⁇ g of mRNA to C57BL/6 mice. After 24 hours, the inguinal lymph nodes were excised, and the cells were collected and analyzed by a flow cytometer.
  • Test Example 7 Measurement of particle size before and after freezing and thawing CHP:LNP (Examples 19, 20, 23, 26-54, 57-62) was frozen once at -30°C and then thawed, and the particle size before and after freezing and thawing was measured.
  • LNP with the same composition but not containing CHP (Reference Examples 19, 26, 32, 36, 39, 42, 44-50, 54, 60) was also frozen once at -30°C and then thawed, and the particle size before and after freezing and thawing was measured.
  • Test Example 8 Functional evaluation test using human peripheral blood lymphocyte-derived macrophages-2 M0 macrophages and M2-like macrophages were prepared in the same manner as in Test Example 5, and CHP:LNP (mCherry) (Examples 51, 58, and 61) or LNP (mCherry) (Reference Example 50) containing 0.5 ⁇ g of mRNA was added to the basal medium and incubated overnight at 37 ° C. and 5% CO 2. After washing with PBS, 200 ⁇ L of Cell Dissociation solution (Biological Industries) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C.
  • PBS solvent
  • Test Example 10 Experiment to confirm expression in nearby lymph nodes after subcutaneous administration to mice - 1 C57BL/6 mice were intradermally administered 5 ⁇ g of CHP:LNP(mCherry) (Example 40) or LNP(mCherry) (Reference Example 39) as mRNA around the right dorsal buttock. 17 hours after administration, the fluorescence intensity of mCherry protein was detected using an in vivo imaging device (Vilber Bio Imaging) to measure expression at the administration site and nearby lymph nodes (inguinal lymph nodes). In addition, the fluorescent protein was detected at the same wavelength in the excised nearby lymph nodes (inguinal lymph nodes) using the same device.
  • an in vivo imaging device Vilber Bio Imaging
  • Test Example 11 Evaluation of skin inflammation at the administration site - 2 After shaving the hair of C57BL/6 mice, 9.8 ⁇ g of CHP:LNP(EGFP) (Example 2) or LNP(EGFP) (Reference Example 2) was administered intradermally around the back and buttocks. Three and five days after administration, skin tissues were collected and fixed with 4% paraformaldehyde for 48 hours, and then replaced with a 70% ethanol solution. Then, HE staining and immunostaining with anti-IBA1 antibody were performed, and pathological observation was performed.

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Abstract

PEG修飾脂質に依拠せずに製造可能であり、又は、PEG修飾脂質に依拠した脂質粒子よりも薬効、安全性、又は安定性に優れ、若しくはPEG修飾脂質に依拠した脂質粒子とは免疫動態が異なる脂質粒子を提供すること。　脂質粒子であって、脂質粒子構成脂質としてイオン化脂質、リン脂質、及びステロールを含有し、且つ疎水性基を含む修飾多糖類を含有する、脂質粒子。

Description

脂質粒子
　本発明は、脂質粒子等に関する。
　脂質ナノ粒子（LNP：Lipid Nano Particle）は、種々の薬剤を内包することが可能であり、ドラッグデリバリー担体として用いられている。近年のCOVID-19の流行に伴い、LNPを利用した感染症予防用ワクチンが広く利用されるに至っている。
　現在ワクチンに利用されているLNPにおいては、粒子の凝集を阻害するためにポリエチレングリコール（PEG）修飾脂質が含まれている（特許文献１）。PEG修飾脂質を使用しない場合はLNPを得ることができないのが現状である。しかしながら、PEGはアレルゲン性を有しており、また日常的に又は医療目的で使用される各種製品に含まれているため接触頻度が高いので、PEGに起因するアナフィラキシー反応の懸念がある。
米国特許第8058069号明細書
　本発明は、PEG修飾脂質に依拠せずに製造可能であり、又は、PEG修飾脂質に依拠した脂質粒子よりも薬効、安全性、又は安定性に優れ、若しくはPEG修飾脂質に依拠した脂質粒子とは免疫動態が異なる脂質粒子を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑み得て鋭意研究を進めた結果、驚くべきことに、脂質粒子であって、脂質粒子構成脂質としてイオン化脂質、リン脂質、及びステロールを含有し、且つ疎水性基を含む修飾多糖類を含有する、脂質粒子、であれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　脂質粒子であって、脂質粒子構成脂質としてイオン化脂質、リン脂質、及びステロールを含有し、且つ疎水性基を含む修飾多糖類を含有する、脂質粒子。
　項２．　前記イオン化脂質の含有量が、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して35～70モル％であり、
前記リン脂質の含有量が、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して4～25モル％であり、且つ
前記ステロールの含有量が、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して15～55モル％である、
項１に記載の脂質粒子。
　項３．　前記修飾多糖類の構成多糖類がプルランを含む、項１又は２に記載の脂質粒子。
　項４．　前記疎水性基がステロール骨格を有する疎水性基を含む、項１～３のいずれかに記載の脂質粒子。
　項５．　前記修飾多糖類の重量平均分子量が5000～2,000,000である、項１～４のいずれかに記載の脂質粒子。
　項６．　薬剤を含有する、項１～５のいずれかに記載の脂質粒子。
　項７．　前記薬剤が核酸である、項６に記載の脂質粒子。
　項８．　前記核酸が、mRNA、免疫刺激性二本鎖RNA、 siRNA、miRNA、リボザイム、CpGオリゴDNA、アンチセンスオリゴDNA、核酸アプタマー、デゴイ、遺伝子発現用二本鎖DNA、及びジヌクレオチドから選択される少なくとも１つである、項７に記載の脂質粒子。
　項９．　前記核酸がmRNAまたはCpGオリゴDNAである、項７又は８に記載の脂質粒子。
　項１０．　前記核酸がmRNAである、項７～９のいずれかに記載の脂質粒子。
　項１１．　前記核酸がCpGオリゴDNAである、項７～９のいずれかに記載の脂質粒子。
　項１２．　前記イオン化脂質が一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式中：R1はアルキル基を示す。R2はアルキル基を示す。R3はアルキル基を示す。R4はアルキル基又は水素原子を示す。L1は－O－C（＝O）－又は－C（＝O）－O－を示す。L2は－O－C（＝O）－又は－C（＝O）－O－を示す。mは1～8の整数を示す。nは3～10の整数を示す。pは3～10の整数を示す。］
であらわされるアミノ脂質、一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［式中：aは3～5の整数を示す。bは0又は1を示す。cは0～4の整数を示す。R5及びR6は同一又は異なって、アルキル基又はアルケニル基を示す。Xは置換されていてもよい非芳香族窒素含有ヘテロ環基又は置換されていてもよいアミノ基を示す。］
で表されるアミノ脂質、及び一般式（3）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中：R7及びR8は同一又は異なって、アルキル基又はアルケニル基を示す。Yは置換されていてもよい非芳香族窒素含有ヘテロ環基又は置換されていてもよいアミノ基を示す。Eはリンカーを示す。］
で表されるアミノ脂質からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～１１のいずれかに記載の脂質粒子。
　項１３．　さらに、粒子の凝集を阻害する複合化脂質を含む項１に記載の粒子。
　項１４．　前記複合化脂質の含有量が、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して0～2モル％である、項１～１３のいずれかに記載の脂質粒子。
　項１５．　前記複合化脂質がポリエチレングリコール-脂質コンジュゲートである、項１３又は１４に記載の脂質粒子。
　項１６．　質量平均粒子径が10～200nmである、項１～１５のいずれかに記載の脂質粒子。
　項１７．　項１～１６のいずれかに記載の脂質粒子を含有する、医薬。
　項１８．　がん、免疫疾患、中枢性疾患等の治療薬、感染症ワクチン又はがんワクチンである、項１７に記載の医薬。
　項１８Ａ．項１～１６のいずれかに記載の脂質粒子を対象（例えば患者）（好ましくはがんを有する対象、免疫疾患を有する対象、中枢性疾患を有する対象、感染症を有する対象、或いはがんの予防を必要とする対象、免疫疾患の予防を必要とする対象、中枢性疾患の予防を必要とする対象、感染症の予防を必要とする対象）に投与することを含む、がん、免疫疾患、中枢性疾患、又は感染症の予防又は治療方法。
　項１８Ｂ．がん、免疫疾患、中枢性疾患等の治療薬、或いは感染症ワクチン又はがんワクチンとしての使用のための、項１～１６のいずれかに記載の脂質粒子。
　項１８Ｃ．項１～１６のいずれかに記載の脂質粒子の、がん、免疫疾患、中枢性疾患等の治療薬、或いは感染症ワクチン又はがんワクチンの製造のための使用。
　項１８Ｄ．項１～１６のいずれかに記載の脂質粒子の、がん、免疫疾患、中枢性疾患等の治療薬、或いは感染症ワクチン又はがんワクチンとしての使用。
　項１９．　皮下投与、経静脈投与、筋肉内投与、経鼻投与又は気道内投与に用いるための、項１７又は１８に記載の医薬。
　本発明によれば、PEG修飾脂質に依拠せずに製造可能であり、又は、PEG修飾脂質に依拠した脂質粒子よりも薬効、安全性、又は安定性に優れ、若しくはPEG修飾脂質に依拠した脂質粒子とは免疫動態が異なる脂質粒子を提供することができる。
試験例5において、LNP添加後、4℃での処理を経ずに37℃一晩インキュベートした場合の結果を示す。 LNP（EGFP）（参考例2）またはCHP:LNP（EGFP）（実施例2）を添加した場合の結果を示し、陰性コントロールはLNPを添加しない場合の結果を示す。M0はM0マクロファージを用いた場合の結果を示し、M2はM2様マクロファージを用いた場合の結果を示す。 試験例5において、LNP添加後、4℃で2時間処理後、培地を置換してさらに37℃一晩インキュベートした場合の結果を示す。図中の各表記の意味については図１と同様である。 試験例5において、LNP添加後、4℃での処理を経ずに37℃一晩インキュベートした場合の結果を示す。図中の各表記の意味については図１と同様である。 試験例8において、LNP添加後、4℃での処理を経ずに37℃一晩インキュベートした場合の結果を示す。図中の各表記の意味については図１と同様である。 試験例9において、LNP投与後の血中PEG抗体の測定結果を示す。陰性コントロールはLNPを投与しない場合の結果を示す。 試験例10における投与局所の代表例の結果を示す。陰性コントロールはLNPを投与しない場合の結果を示す。 試験例10において摘出した近傍リンパ節（鼠経リンパ節）の代表例の結果を示す。陰性コントロールはLNPを投与しない場合の結果を示す。 試験例12例におけるLNP投与後の経時的な体重推移の結果を示す。比較対象は、LNPを投与しない場合の結果を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．脂質粒子
　本発明は、その一態様において、脂質粒子であって、脂質粒子構成脂質としてイオン化脂質、リン脂質、及びステロールを含有し、且つ疎水性基を含む修飾多糖類を含有する、脂質粒子（本明細書において、「本発明の脂質粒子」と示すこともある。）、に関する。以下にこれについて説明する。
　イオン化脂質は、脂質粒子を構成可能であり且つ脂質粒子内で正電荷を示す脂質である限りにおいて特に制限されない。イオン化脂質としては、例えば［4-ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン-6，1-ジイル）ビス（2-ヘキシルデカノエート）（ALC-0315）、9-ヘプタデカニル 8-｛（2-ヒドロキシエチル）［6-オキソ-6-（ウンデシロキシ）ヘキシル］アミノ｝オクタノエート（SM-102）、(6Z,9Z,28Z,31Z)-Heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate (D-Lin-MC3-DMA)、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、2,2-ジリノレイル-4-（2-ジメチルアミノエチル）-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-C2-DMA;「XTC2」）、2,2-ジリノレイル-4-（3-ジメチルアミノプロピル）-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-C3-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-（4-ジメチルアミノブチル）-[1,
3]-ジオキソラン（DLin-K-C4-DMA）、2,2-ジリノレイル-5-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキサン（DLin-K6-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-N-メチルペピアジノ（methylpepiazino）-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-MPZ）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン （DLin-C-DAP）、1,2-ジリノレイルオキシ（dilinoleyoxy）-3-（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（DLin-DAC）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-モルホリノプロパン（DLin-MA）、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinDAP）、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-S- DMA）、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-2-DMAP）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩（DLin-TMA.Cl）、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩（DLin-TAP.Cl）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-（N-メチルピペラジノ）プロパン（DLin-MPZ）、3-（N,N-ジリノレイルアミノ）-1,2-プロパンジオール（DLinAP）、3-（N,N-ジオレイルアミノ）-1,2-プロパンジオ（propanedio）（DOAP）、1,2-ジリノレイルオキソ-3-（2-N,N-ジメチルアミノ）エトキシプロパン（DLin-EG-DMA）、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DODMA）、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DSDMA）、N-（1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-（1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、3-（N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル）コレステロール（DC-Chol）、N-（1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル）-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2（スペルミン-カルボキサミド）エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、3-ジメチルアミノ-2-（コレスタ-5-エン-3-β-オキシブタン-4-オキシ)-1-（cis,cis-9,12- オクタデカジエノキシ）プロパン （CLinDMA）、2-[5'-（コレスタ-5-エン-3-β-オキシ）-3'-オキサペントキシ）-3- ジメチル-1 -（cis,cis-9',1-2'-オクタデカジエノキシ）プロパン（CpLinDMA）、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、1,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、1,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、1,1'-[7-[4-(ジプロピルアミノ)ブチル]-7-ヒドロキシ-1,13-トリデカネジイル] ジ-(9Z)-9-オクタデセノエート (CL 4H6)、5-ヒドロキシ-11-[[(9Z)-1-オキソ-9-オクタデセン-1-イル]オキシ]-5-[6-[[(9Z)-1-オキソ-9-オクタデセン-1-イル]オキシ]ヘキシル] ウンデシル 1-メチル-4-ピぺリジンカルボキシレート (CL 15H6)、1,1′-[7-[4-(ジメチルアミノ)ブチル]-7-ヒドロキシ-1,13-トリデカンジイル] ジ-(9Z)-9-オクタデカネート（CL 1H6）等が挙げられる。
　イオン化脂質は、本発明の脂質粒子の細胞、好ましくは、抗原提示細胞での発現の観点から、好ましくは一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［式中：R1はアルキル基を示す。R2はアルキル基を示す。R3はアルキル基を示す。R4はアルキル基又は水素原子を示す。L1は－O－C（＝O）－又は－C（＝O）－O－を示す。L2は－O－C（＝O）－又は－C（＝O）－O－を示す。mは1～8の整数を示す。nは3～10の整数を示す。pは3～10の整数を示す。］
で表されるアミノ脂質、一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［式中：aは3～5の整数を示す。bは0又は1を示す。cは0～4の整数を示す。R5及びR6は同一又は異なって、アルキル基又はアルケニル基を示す。Xは置換されていてもよい非芳香族窒素含有ヘテロ環基又は置換されていてもよいアミノ基を示す。］
で表されるアミノ脂質、及び一般式（3）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［式中：R7及びR8は同一又は異なって、アルキル基又はアルケニル基を示す。Yは置換されていてもよい非芳香族窒素含有ヘテロ環基又は置換されていてもよいアミノ基を示す。Eはリンカーを示す。］
で表されるアミノ脂質からなる群より選択される少なくとも1種である。当該アミノ脂質を用いることにより、上記集積性をより顕著に発揮させることが可能である。
　アルキル基、アルケニル基は、直鎖状又は分岐鎖状であり、特に好ましくは直鎖状である。アルキル基、アルケニル基の炭素原子数の下限は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であることができる。アルキル基、アルケニル基の炭素原子数の上限は、例えば30、25、20、18、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、又は4であることができる。炭素原子数は、上記の上限及び下限を任意に組み合わせてなる範囲であることができる。
　R1で示されるアルキル基の炭素原子数は、一般式（1）の化合物が脂質となる限りにおいて特に制限されず、例えば3～20である。当該炭素原子数は、上記集積性の観点から、好ましくは3～12、より好ましくは3～10、さらに好ましくは4～8、よりさらに好ましくは5～7、特に好ましくは6である。
　R2で示されるアルキル基の炭素原子数は、一般式（1）の化合物が脂質となる限りにおいて特に制限されず、例えば3～20である。当該炭素原子数は、上記集積性の観点から、好ましくは4～15、より好ましくは5～12、さらに好ましくは6～10、よりさらに好ましくは7～9、特に好ましくは8である。
　R3で示されるアルキル基の炭素原子数は、一般式（1）の化合物が脂質となる限りにおいて特に制限されず、例えば3～20である。当該炭素原子数は、上記集積性の観点から、好ましくは3～12、より好ましくは3～10、さらに好ましくは4～8、よりさらに好ましくは5～7、特に好ましくは6である。
　R4は、上記集積性の観点から、好ましくはアルキル基である。
　R4で示されるアルキル基の炭素原子数は、一般式（1）の化合物が脂質となる限りにおいて特に制限されず、例えば3～20である。当該炭素原子数は、上記集積性の観点から、好ましくは4～15、より好ましくは5～12、さらに好ましくは6～10、よりさらに好ましくは7～9、特に好ましくは8である。
　L1は、上記集積性の観点から、好ましくは－O－C（＝O）－（当該2価の基の－O－側が一般式（1）におけるヒドロキシ基側を示す。）である。
　L2は、上記集積性の観点から、好ましくは－O－C（＝O）－（当該2価の基の－O－側が一般式（1）におけるヒドロキシ基側を示す。）である。
　mは、上記集積性の観点から、好ましくは2～6、より好ましくは3～5、特に好ましくは4である。
　nは、上記集積性の観点から、好ましくは4～8、より好ましくは5～7、特に好ましくは6である。
　pは、上記集積性の観点から、好ましくは4～8、より好ましくは5～7、特に好ましくは6である。
　R5で示されるアルキル基の炭素原子数は、一般式（2）の化合物が脂質となる限りにおいて特に制限されず、例えば12～24である。
　R6で示されるアルキル基の炭素原子数は、一般式（2）の化合物が脂質となる限りにおいて特に制限されず、例えば12～24である。
　R7で示されるアルキル基の炭素原子数は、一般式（2）の化合物が脂質となる限りにおいて特に制限されず、例えば12～24である。
　R8で示されるアルキル基の炭素原子数は、一般式（2）の化合物が脂質となる限りにおいて特に制限されず、例えば12～24である。
　非芳香族窒素含有ヘテロ環基、アミノ基が置換されている場合、その置換基はアルキル基であることが好ましい。当該アルキル基としては、例えば炭素原子数1～4のアルキル基が挙げられる。
　非芳香族窒素含有ヘテロ環基は非芳香族窒素含有ヘテロ環から一つの水素原子を除いてなる一価の基である。非芳香族窒素含有ヘテロ環としては、例えばピロリジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基、ピペラジニル基等が挙げられる。
　Eで示されるリンカーとしては、鎖構成原子数が例えば1～10、好ましくは3～8のリンカーであることができる。当該リンカーは、好ましくは鎖中に－O－C（＝O）－又は－C（＝O）－O－が介在していてもよいアルキル基である。
　イオン性脂質は、1種単独であることができ、2種以上の組み合わせであることもできる。
　イオン性脂質の含有量は、脂質粒子形成性、上記集積性、安定性等の観点から、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して、好ましくは35～70モル％、より好ましくは40～65モル％、さらに好ましくは45～60モル％、よりさらに好ましくは45～55モル％である。
　イオン性脂質は、市販品を購入して準備することができるし、公知の方法に従って又は準じて製造することができる。製造については、例えばWO2018/230710、WO2010/129687を参照することができる。
　リン脂質としては、脂質粒子を構成可能なものである限り特に制限されないが、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチド酸、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。より具体的な例としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル- ホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-ホスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（SOPE）、卵ホスファチジルコリン（EPC）等が挙げられる。
　リン脂質は、脂質粒子形成性、安定性等の観点から、好ましくはホスファチジルコリン、より好ましくはDSPC、DPPC等、さらに好ましくはDSPCである。
　リン脂質は、1種単独であることができ、2種以上の組み合わせであることもできる。
　リン脂質の含有量は、脂質粒子形成性、安定性等の観点から、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して、好ましくは4～25モル％、より好ましくは4～20モル％、さらに好ましくは4～15モル％、よりさらに好ましくは6～12モル％、とりわけ好ましくは8～11モル％である。
　ステロールとしては、ステロール骨格を有し、脂質粒子を構成可能なものである限り特に制限されないが、例えばコレステロール、コレステリルヘミスクシネート、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール、フィトステロール、フィトステロール、スチグマステロール、チモステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等が挙げられる。また、これら以外にも、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2'-ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル-4'-ヒドロキシブチルエーテル等のコレステロールの誘導体も挙げられる。
　ステロールは、脂質粒子形成性、安定性等の観点から、好ましくはコレステロールである。
　ステロールは、1種単独であることができ、2種以上の組み合わせであることもできる。
　ステロールの含有量は、脂質粒子形成性、安定性等の観点から、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して、好ましくは15～55モル％、より好ましくは25～50モル％、さらに好ましくは30～45モル％、よりさらに好ましくは35～45モル％である。
　修飾多糖類は、多糖類が修飾してなる化合物であって、修飾基として疎水性基を含む限り、特に制限されない。本発明では、修飾多糖類を用いることにより、PEG修飾脂質に依拠せず（好ましくは当該脂質を使用しないものであるが、PEGに起因する副反応等を回避したものであれば多少のPEGを含んでいてもよい）、脂質粒子（特に、各脂質を上記含有量で含有する脂質粒子）を形成可能であることを見出した。
　修飾多糖類を構成する多糖類（すなわち、修飾前の多糖類）としては、糖残基がグリコシド結合した高分子であれば特に限定されることはない。多糖類を構成する糖残基としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース等の単糖類、または二糖類またはオリゴ糖類などの糖類に由来する残基を採用することができる。糖残基は1,2-、1,3-、1,4-又は1,6-グリコシド結合していてもよく、その結合はα－またはβ－型結合のいずれであってもよい。また、多糖類は直鎖状でも分枝鎖状のいずれでもよい。糖残基としてはグルコース残基が好ましく、多糖類としては、例えば天然または合成由来のプルラン、マンナン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン等が挙げられる。これらの中でも、脂質粒子形成性、安定性等の観点から、好ましくはプルラン、マンナン、デキストラン等、より好ましくはプルラン、マンナン等、特に好ましくはプルラン等が用いられる。
　多糖類の重量平均分子量は、修飾多糖類がゲル化粒子を構成可能な限り特に制限されないが、例えば5,000～2,000,000である。該重量平均分子量は、好ましくは10,000～1,000,000、より好ましくは20,000～500,000、さらに好ましくは40,000～250,000、よりさらに好ましくは80,000～125,000である。
　多糖類としては、市販品を使用することができ、或いは公知の製造方法に従って得られたものを使用することができる。
　疎水性基は、疎水性を有する基である限り特に制限されない。疎水性基としては、脂質粒子形成性、安定性等の観点から、好ましくはステロール骨格を有する疎水性基、炭化水素基等が挙げられ、特に好ましくはステロール骨格を有する疎水性基が挙げられる。
　ステロール骨格は、式（I）に示すシクロペンタヒドロフェナントレン環にヒドロキシ基が結合したアルコールである。式（I）のA～Dの記号は、シクロペンタヒドロフェナントレン環を構成する各環を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　ステロール骨格においては、シクロペンタヒドロフェナントレン環に二重結合を有していてもよく、水酸基の結合する位置も特段限定されない。好ましくは、C-3位の位置にヒドロキシ基が結合し、B環に二重結合を有するステロール類、又は、C-3位の位置にヒドロキシ基が結合し、飽和環で構成されたスタノール類である。ステロール骨格を有する疎水性基は、ステロール骨格が修飾されてなる、例えば、環構成炭素において炭化水素基（例えば炭素原子数1～20の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基等）に置換されてなる化合物に由来する基が挙げられる。ここで、「由来する基」とは、ある化合物において、水素原子、又は水酸基等の官能基が除かれてなる基を示す。
　ステロール骨格を有する疎水性基としては、例えばコレステロール由来の基、コレスタノール由来の基、ラノステロール由来の基、エルゴステロール由来の基、β－シトステロール由来の基、カンペステロール由来の基、スティグマステロール由来の基、ブラシカステロール由来の基等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコレステロール由来の基、コレスタノール由来の基、ラノステロール由来の基、エルゴステロール由来の基等のステロール由来の基が挙げられ、より好ましくはコレステロール由来の基が挙げられる。
　疎水性基としての炭化水素基としては、特に制限されず、例えば炭素原子数8～50（好ましくは10～30、より好ましくは12～20）の鎖状（好ましくは直鎖状）炭化水素基（好ましくはアルキル基）が挙げられる。
　修飾多糖類の重量平均分子量は、修飾多糖類がゲル化粒子を構成可能な限り特に制限されないが、例えば5,000～2,000,000である。該重量平均分子量は、好ましくは10,000～1,000,000、より好ましくは20,000～500,000、さらに好ましくは40,000～250,000、よりさらに好ましくは80,000～125,000である。
　修飾多糖類が含む疎水性基の数は、修飾多糖類がゲル化粒子を構成可能な限り特に制限されず、例えば多糖類を構成する糖残基100個当たり、例えば1～10個、好ましくは1～5個である。
　疎水性基は、多糖類に、直接又は間接的に（例えばリンカーを介して）連結することができる。
　修飾多糖類としては、例えば、多糖類を構成する糖残基100個当たり例えば1～10個（好ましくは1～5個）の糖単位の1級水酸基が、式（II）：－O－（CH2）xCONH（CH2）yNH－CO－O－R （II）（式中、Rはステロール骨格を有する疎水性基又は炭化水素基を示し；xは0又は1を示し；yは任意の正の整数を示す）で表されるものが好ましい。yは好ましくは1～8である。
　修飾多糖類は、公知の方法（例えば国際公開第WO00/12564号）に従って又は準じて、合成することができる。一例として次の方法は挙げられる。最初に、炭素数12～50の水酸基含有炭化水素又はステロールと、OCN-RA NCO（式中、RAは炭素数1～50の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物を反応させて、炭素数12～50の水酸基含有炭化水素又はステロールが1分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物を製造する。次いで、得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数12～50の炭化水素基又はステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。得られた反応生成物をケトン系溶媒で精製して高純度疎水性基含有多糖類の製造が可能である。
　修飾多糖類は、1種単独であることもできるし、2種以上の組合せであることもできる。
　修飾多糖類の含有量は、脂質粒子形成性、安定性等の観点から、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して、例えば0.5～15モル％、好ましくは1～10モル％である。
　本発明の脂質粒子は、粒子の凝集を阻害する複合化脂質（以下、単に「複合化脂質」と示す。）を含有することができる。複合化脂質としては、脂質粒子の凝集を阻害することができ、且つ脂質粒子を構成可能なものである限り特に制限されないが、例えばポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、陽イオン性ポリマー-脂質コンジュゲート（CPL）等が挙げられる。より具体的には、例えば、PEG-ジアシルグリセロール（DAG）、PEGジアルキルオキシプロピル（DAA）、PEG-リン脂質、PEG-セラミド（Cer）、またはそれらの混合物を含めたPEG-脂質を含みうる。PEG-脂質コンジュゲートのPEG部分の分子量は、特に制限されないが、例えば200～10000、好ましくは500～7000、より好ましくは500～4000、さらに好ましくは1000～3000、よりさらに好ましくは1500～2500である。
　複合化脂質は、1種単独であることもできるし、2種以上の組合せであることもできる。
　複合化脂質の含有量は、脂質粒子形成性、安定性及びアナフィラキシーショックを回避する等の観点から、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して、例えば0～2モル％である。当該含有量は、好ましくは0～1モル％、より好ましくは0～0.5モル％、さらに好ましくは0～0.2モル％、よりさらに好ましくは0～0.1モル％、とりわけ好ましくは0～0.01モル％、特に好ましくは0モル％（複合化脂質を含有しないこと）である。
　本発明の脂質粒子は、薬剤を含有することが好ましい。薬剤としては、特に制限されないが、例えば核酸アジュバント、及び抗がん剤等が挙げられ、それらを組み合わせて含有することができる。
　本発明の好ましい一態様において、薬剤は、本発明の脂質粒子の内側に（脂質粒子の外部と隔てられた状態で）配置されている。好ましくは、薬剤（特に、核酸）は、本発明の脂質粒子の内側に、イオン化脂質と複合化した状態で配置されている。
　本発明の核酸は特に制限されず、例えばmRNA、免疫刺激性二本鎖RNA (poly-IC RNAなど）, siRNA、miRNA、リボザイム、CpGオリゴDNA、アンチセンスオリゴDNA、核酸アプタマー、デゴイ、遺伝子発現用二本鎖DNA、及びジヌクレオチド等が挙げられる。核酸は、DNA、RNAのみならず、医薬有効成分と成り得るものであればそれでよく、これらに、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものも包含する。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、「核酸」の語は、BNA（Bridged Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、PNA（Peptide Nucleic Acid）等の何れも包含する。
　本発明の核酸は、好ましくはCpGオリゴDNA、又はmRNA、特に後述の微生物抗原、がん抗原をコードするmRNAであることができる。
　CpGオリゴDNAの具体例は以下の通りである。
クラスA：D35-CpG、ODN1585、ODN2216、ODN2336等
クラスB：K3-CpG、ODNBW006、ODN D－SL01、ODN1668、OND1826、OND2006（CpG7909、PF-3512676）、ODN2007、ODN684等
クラスC：ODN D-SL03、ODN 2395、ODN M362等
が挙げられる。
　また、その他、例えばCpG-28、CpG-685（GNKG-168）、CpG-ODN C274、KSK-13（KSK-CpG）、CpG ODN 10104（CpG-10104）、CpG ODN-1585、ODN-5890、1018-ISS、EMD-1201081（HYB-2055、IMO-2055）等が挙げられる。
　CpGオリゴDNAとしては、市販品を使用することができ、或いは公知の製造方法に従って得られたものを使用することができる。例えば、US2022/0111061 A1の内容に基づき、ステロール骨格を有する疎水性基Aを含む修飾されたものであっても良いが、好ましくはステロール骨格を有する疎水性基Aを含む修飾されたものではない。
　mRNAの場合にそれがコードする微生物抗原としては、例えばウイルス抗原、菌抗原等が挙げられる。ウイルス抗原の由来ウイルスとしては、特に制限されないが、例えばインフルエンザウイルス（例えばA型、B型等）、風疹ウイルス、エボラウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、アルボウイルス、RSウイルス、SARSウイルス、肝炎ウイルス（例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス等）、黄熱ウイルス、エイズウイルス、狂犬病ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ニパウイルス、リッサウイルス等のエンベロープウイルス（エンベロープを有するウイルス）；　アデノウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、ライノウイルス等の非エンベロープウイルス（エンベロープを有さないウイルス）等が挙げられる。菌抗原の由来菌としては、特に制限されないが、例えば百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、ピロリ菌、ウエルシュ菌、ボツリヌス菌、カンピロバクター、大腸菌、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、セレウス菌、腸炎ビブリオ、アクネ菌、フェカーリス菌、ディフィシル菌、肺炎球菌、インフルエンザ桿菌、モラキセラ菌、肺炎桿菌、コイネバクテリウム、溶連菌、緑膿菌、ブドウ球菌、マイコプラズマ、カンジダ菌、アスペルギルス菌等が挙げられる。
　mRNAの場合にそれがコードするがん抗原は、限定されないが、ERK1、ERK2、MART－1／Melan－A、gp100、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ADAbp）、FAP、シクロフィリンb、結腸直腸関連抗原（CRC）－C017－1A／GA733、がん胎児性抗原（CEA）、CAP－1、CAP－2、etv6、AML1、前立腺特異的抗原（PSA）、P SA－1、PSA－2、PSA－3、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、T細胞受容体／CD3－ゼータ鎖、CD20、MAGE－A1、MAGE－A2、MAGE－A3、MAGE－A4、MAGE－A5、MAGE－A6、MAGE－A7、MAGE－A8、MAGE－A9、MAGE－A10、MAGE－A11、MAGE－A12、MAGE－Xp2（MAGE－B2）、MAGE－Xp3（MAGE－B3）、MAGE－Xp4（MAGE－B4）、MAGE－C1、MAGE－C2、MAGE－C3、MAGE－C4、MAGE－C5、GAGE－1、GAGE－2、GAGE－3、GAGE－4、GAGE－5、GAGE－6、GAGE－7、GAGE－8およびGAGE－9、BAGE、RAGE、LAGE－1、NAG、GnT－V、MUM－1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2／neu、p21ras、RCAS1、α－フェトプロテイン、E－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、γ－カテニン、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY－ESO－1、cdc27、大腸腺腫症タンパク質（APC）、フォドリン、コネキシン37、Igイディオタイプ、p15、gp75、GM2ガングリオシド、GD2ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のSmadファミリー、lmp－1、P1A、EBVがコードする核抗原（EBNA）－1、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX－1、SSX－2（HOM－MEL－40）、SSX－1、SSX－4、SSX－5、SCP－1、CT－7、CD20、c－erbB－2、これらの部分ペプチドから選択され得る。
　対象がんとしては、特に制限されず、例えば白血病（慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、T細胞系リンパ腫、B細胞系リンパ腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、びまん性リンパ腫、濾胞性リンパ腫を含む）、骨髄腫（多発性骨髄腫を含む）、乳がん、大腸がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、肝臓がん、頭頚部扁平上皮がん、皮膚がん、悪性黒色腫、尿路がん、前立腺がん、絨毛がん、咽頭がん、喉頭がん、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫及びウィルムス腫瘍等が挙げられる。
　アジュバントとしては、主剤の有効成分と併用することにより有効成分が有する本来の機能を補助したり増強したりするアジュバント機能を発揮するものであれば特に制限されないが、具体的には核酸、リポ多糖、リポペプチド、合成低分子化合物などから選択することができ、好ましくはCpGオリゴDNA、ポリIC　RNA、イミダゾキノリン（例えばR848やイミキモドなど）、STINGアゴニスト（例えばサイクリックdi－GMPなど）、モノホスホリルリピッドやリポペプチドなどが用いられる。また、上記以外にも、アジュバントとしては、例えば、タキサン系の薬物、アントラサイクリン系の薬物、JAK／STATの阻害物質、インドールデオキシゲナーゼ（IDO）の阻害物質、トリプトファンデオキシゲナーゼ（TDO）の阻害物質などが挙げられる。これらの阻害物質には、当該因子に対して拮抗作用を持つ化合物の他、当該因子の中和抗体やsiRNAやアンチセンスDNAも含まれる。
　抗がん剤としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬、ホルモン剤、生物製剤などが挙げられる。
　薬剤は、1種単独であることもできるし、2種以上の組合せであることもできる。
　本発明の脂質粒子において、脂質粒子構成成分であるCHPに対する薬剤の質量比（CHP/mRNA質量）は、200以下、より好ましくは、100以下、さらに好ましくは90以下である。当該質量比の上限は、例えば70、50、40、30、20、10、又は8であることができ、当該質量比の下限は、例えば0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、又は1であることができる。上記の上限及び下限は任意に組み合わせることができる。
　本発明の一態様において、本発明の脂質粒子を含む液体は、薬剤（好ましくは核酸、より好ましくはmRNA）を、例えば1～1000μg／mL、好ましくは5～500μg／mL、より好ましくは15～400μg／mL、さらに好ましくは30～300μg／mL、よりさらに好ましくは50～200μg／mLの濃度で含有することができる。
　本発明の脂質粒子は、上記以外にも他の成分（溶媒以外）を含んでいてもよい。他の成分としては、脂質粒子に配合することが公知の各種成分が挙げられ、具体的には例えば抗酸化剤、膜タンパク質等が挙げられる。
　抗酸化剤は、膜の酸化防止のために含有させることができ、膜の構成成分として必要に応じて使用される。膜の構成成分として使用される抗酸化剤としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、トコフェロール、酢酸トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ビタミンE、アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、パルミチン酸アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、クエン酸等が例示される。
　膜タンパク質は、膜への機能付加又は膜の構造安定化を目的として含有させることができ、膜構成成分として必要に応じて使用される。膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質、アルブミン、組換えアルブミン等が挙げられる。
　他の成分の含有量は、本発明の脂質粒子100質量％に対して、例えば10質量％以下、好ましくは5質量％以下、より好ましくは2質量％以下、さらに好ましくは1質量％以下である。
　本発明の脂質粒子の質量平均粒子径は、例えば200nm以下、好ましくは10～200nm、より好ましくは20～200nm、さらに好ましくは40～190nm、よりさらに好ましくは40～180nm、とりわけ好ましくは40～160nmである。該粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。
　本発明の脂質粒子は、通常、水系溶液中で形成されている。水系溶液としては、例えば各種緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液等）が挙げられる。
　本発明の脂質粒子は、好適には、脂質粒子構成脂質を含有するアルコール溶液と、修飾多糖類を含有する（好ましくはさらに薬剤を含有する）水系溶液とを混合する工程、又は脂質粒子構成脂質を含有するアルコール溶液と、水系溶液（好ましくはさらに薬剤を含有する）と、修飾多糖類を含有する水系溶液とを混合する工程（工程1）を含む方法によって、製造することができる。当該方法を採用することにより、簡便且つ効率的に、PEG修飾脂質に依拠せずに、又は、PEGに起因する副反応等を回避した本発明の脂質粒子を得ることができる。
　アルコール溶液の溶媒であるアルコールとしては、脂質を溶解可能なアルコールである限り特に制限されない。アルコールとしては、エタノールが好ましく挙げられる。
　アルコール溶液は、脂質粒子構成脂質を上述のモル比となるように含有することが好ましい。これにより、脂質粒子構成脂質の上述のモル比で含む脂質粒子を得ることができる。
　アルコール溶液中の脂質濃度は、例えば2～20mM、好ましくは4～12Mである。
　水系溶液は、溶媒が水を含有する（好ましくは水の含有割合が80％以上、90％以上、95％以上、又は100％である）溶媒である溶液である。
　水系溶液中の修飾多糖類の濃度は、例えば0.2～5mg／mL、好ましくは0.4～3mg／mL、より好ましくは0.6～1.5mg／mLである。
　水系溶液とアルコール溶液との混合比（水系溶液／アルコール溶液、v/v）は、例えば1～20、好ましくは2～4である。
　混合態様は、脂質粒子の形成が可能な態様である限り特に制限されないが、通常は、ボルテックス等で激しく撹拌する態様である。或いは、マイクロ流路を用いた反応系で行う場合は、反応系内で混合される。
　工程1は、通常、室温下又は加温下で実行される。
　本発明の脂質粒子は、PEG修飾脂質に依拠せずに製造可能であり、及び／又は、PEG修飾脂質に依拠した脂質粒子よりも薬効、安全性、又は安定性に優れ、若しくはPEG修飾脂質に依拠した脂質粒子とは免疫動態が異なる点において有用である。
　また、本発明の脂質粒子の別の態様では、PEG修飾脂質等の粒子の凝集を阻害する複合化脂質をさらに含むことができるが、PEG修飾脂質に依拠した脂質粒子よりも薬効、安全性、又は安定性に優れ、若しくはPEG修飾脂質に依拠した脂質粒子とは免疫動態が異なる点において有用である。
　安全性は、例えば抗PEG抗体誘導の低下、投与部位の炎症の低下、投与後発熱の低下等であることができる。
　安定性は、製剤としての安定性であり、例えば凍結融解による粒子径の増大が抑制されている。具体的には、COVID-19ワクチンに代表される従来のPEG修飾脂質等を含む脂質粒子は、凍結融解に耐えることが出来ず、等張化剤(Sucrose)の有無に関わらず、凍結融解を繰り返すことで、粒子径が大きくなるが、本発明の脂質粒子は、CHP等の修飾多糖類を含むことにより、脂質粒子製剤の安定性を向上させることができ、また、後述の実施例4（Method2）の作製方法で作られたPEG修飾脂質を含まない本発明の脂質粒子は、凍結融解に対する安定性は、さらに向上し、Sucroseが無くても、粒子径増大を抑えることが出来る。
　免疫動態は、例えば誘導される細胞免疫の質の違い等であることができる。
　2．用途
　本発明の脂質粒子は、薬剤を内包することができ、またDC-SIGN（CD209）発現細胞（例えばM2様マクロファージや抗原提示細胞）へ選択的集積性を有する。このため、本発明の脂質粒子は、例えば医薬、試薬等（本明細書において、「本発明の薬剤」と示すこともある。）に、より具体的には、例えば、がん、免疫疾患、糖尿病起因性疾患、中枢性等の治療薬や、感染症ワクチン又はがんワクチンに利用することが可能である。感染症ワクチンとしては、感染症に対して使用されるワクチンであれば特に制限されず、予防用のワクチンだけでなく、治療用のワクチンも含まれる。
　本発明の薬剤は、本発明の脂質粒子を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の薬剤の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の薬剤は、その用途に応じて、例えばin vitroで使用する（例えば、培養細胞の培地に添加する。）こともできるし、in vivoで使用する（例えば、動物に投与する。）こともできる。
　本発明の薬剤の適用対象は特に限定されないが、哺乳動物では、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等が挙げられる。また、細胞としては、動物細胞等が挙げられる。細胞の種類も特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
　本発明の薬剤は、任意の剤形、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口製剤形態や、注射用製剤（例えば、点滴注射剤（例えば点滴静注用製剤等）、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等の非経口製剤形態を取ることができる。
　本発明の薬剤の投与経路としては、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与；　経管栄養、注腸投与等の経腸投与；　経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経鼻投与、気道内投与、点眼投与等の非経口投与等が挙げられる。
　本発明の薬剤中の本発明の脂質粒子の含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の薬剤を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、本発明の脂質粒子の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1～1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5～500 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01～100 mg/kg体重、好ましくは0.05～50 mg/kg体重である。上記投与量は、年齢、病態、症状等により適宜増減することもできる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　調製例1．プルランナノゲルの調製
　既報（Macromolecules 1993, 23, 3062-3068）の記載に従って、重量平均分子量100,000のプルランに100単糖あたりコレステロールが1.2個導入されたコレステロール修飾プルラン（CHP）を作製した。作製されたCHPを用いて、既知の方法で、プルランナノゲル溶液を調整した。
　参考例1．LNPの作製1（mRNA：オボアルブミン（OVA） mRNA）
　OVA mRNA水溶液（mRNA濃度：70μg/mL、溶媒：25mM NaAc, 154mM NaCl, pH=4.5）を調製した（A液）。ALC-0315（[(4-Hydroxybutyl)azanediyl]di(hexane-6,1-diyl) bis(2-hexyldecanoate)）：DSPC（Distearoylphosphatidylcholine）：DMG-PEG200（1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-methoxypolyethylene glycol）：Cholesterol＝50：10：1.5：38.5の割合（モル比）で混合した脂質のエタノール溶液（脂質濃度：8 mM）を調製した（B液）。調製したそれぞれの溶液を、iLiNPマイクロ流路チップ（ライラックファーマ）、或いは、NanoAssemblr（Precision NanoSystems）を用いて、流速500μL/min（iLiNPマイクロ流路チップ）あるいは、流速12mL/min (NanoAssemblr)（Flow Rate Ratio；A：B＝3）で混合した。混合した溶液を、透析膜（MWCO；3.5K）を用いて、PBSへ溶媒置換した。回収した溶液を、アミコンチューブ（MWCO; 30K）を用いて5倍濃縮し、0.45μmのフィルターに通し、LNP（OVA）溶液を得た（質量平均粒子径：81nm、ELSZ-2000ZS大塚電子株式会社）。Ribo Green Assay (Invitrogen) を行い、mRNA濃度として、185μg/mLを算出した。
　参考例2．LNPの作製2（mRNA：EGFP mRNA）
　OVA mRNAに代えて蛍光タンパク質であるEGFPのmRNAを用いる以外は参考例1と同様にしてLNP（EGFP）溶液を得た（質量平均粒子径：75nm、mRNA濃度：186μg/mL）。
　参考例3．LNPの作製3（mRNA：HPV E7 mRNA）
　OVA mRNAに代えてヒトパピローマウイルスのE7タンパク質のmRNAを用いる以外は参考例1と同様にしてLNP（HPV E7）溶液を得る。
　実施例1．CHP:LNPの作製1（mRNA：OVA mRNA）
　LNP（OVA）溶液（参考例1）1mLに対し、同量の10mg/mL CHP水溶液を加え、30分間攪拌した。0.45μmのフィルターに通し、CHP:LNP（OVA）溶液を得た（質量平均粒子径：122nm、mRNA濃度：93μg/mL）。(Method 1) 。
　実施例2．CHP:LNPの作製2（mRNA：EGFP mRNA）
　LNP（OVA）溶液（参考例1）に代えてLNP（EGFP）溶液（参考例2）を用いる以外は実施例1と同様にしてCHP:LNP（EGFP）溶液を得た（質量平均粒子径：117nm、mRNA濃度：95μg/mL）。(Method 1) 。
　実施例3．CHP:LNPの作製3（mRNA：HPV E7 mRNA）
　LNP（OVA）溶液（参考例1）に代えてLNP（HPV E7）溶液（参考例3）を用いる以外は実施例1と同様にしてCHP:LNP（HPV E7）溶液を得る。(Method 1) 。
　実施例4．CHP:LNPの作製4（mRNA：OVA mRNA）
　OVA mRNA水溶液（mRNA濃度：70μg/mL、溶媒：1mg/mL CHP in 25mM NaAc, 154mM NaCl, pH=4.0）を調製した（A液）。MC3：DSPC：Cholesterol＝50：10：40の割合（モル比）で混合した脂質のエタノール溶液（脂質濃度：8mM）を調製した（B液）。調製したそれぞれの溶液を、iLiNPマイクロ流路チップ、或いは、NanoAssemblrを用いて、流速500μL/min（iLiNPマイクロ流路チップ）、或いは、流速12mL/min（NanoAssemblr）（Flow Rate Ratio；A：B＝3）で混合した。混合した溶液を、透析膜（MWCO;3.5K）を用いて、PBSへ溶媒置換した。回収した溶液を、アミコンチューブ（MWCO; 30K）を用いて5倍濃縮し、0.45μmのフィルターに通し、CHP :LNP（OVA）溶液を得た（質量平均粒子径：155nm、mRNA濃度：70μg/mL）。(Method 2) 。
　実施例5．CHP:LNPの作製5（mRNA：EGFP mRNA）
　EGFP mRNA水溶液（mRNA濃度：70μg/mL、溶媒：2mg/mL CHP in 25mM NaAc, 154mM NaCl, pH=4.0）を調製した（A液）。ALC-0315：DSPC：Cholesterol＝45.5：9：45.5の割合（モル比）で混合した脂質のエタノール溶液（脂質濃度：8mM）を調製した（B液）。調製したそれぞれの溶液を、iLiNPマイクロ流路チップ、或いは、NanoAssemblrを用いて、流速500μL/min（iLiNPマイクロ流路チップ）、或いは、流速12mL/min（NanoAssemblr）（Flow Rate Ratio；A：B＝3）で混合した。混合した溶液を、透析膜（MWCO;3.5K）を用いて、PBSへ溶媒置換した。回収した溶液を、アミコンチューブ（MWCO; 30K）を用いて5倍濃縮し、0.45μmのフィルターに通し、CHP:LNP（EGFP）溶液を得た（重量平均粒子径：135nm、mRNA濃度：82μg/mL）。(Method 2) 。
　実施例6．CHP:LNPの作製6（mRNA：HPV E7 mRNA）
　OVA mRNAに代えてHPV E7 mRNAを用いる以外は実施例4と同様にしてCHP:LNP（HPV E7）溶液を得る。(Method 2) 。
　実施例7～23．CHP: LNPの作製7
　以下の表１に示す方法（Method1、Method2）、核酸、イオン化脂質、脂質割合を採用して、CHP: LNPを作製した。実施例1～23で作製したCHP:LNPの作製組成と物性値を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　実施例58．CHP:LNPの作製8（mRNA：mCherry mRNA）
　mCherry mRNA水溶液（mRNA濃度：70μg/mL、溶媒 25mM NaAc, 154mM NaCl, pH=4.0）を調製した（A液）。SM-102：DSPC：Cholesterol＝45.5：9：45.5の割合（モル比）で混合した脂質のエタノール溶液（脂質濃度：8mM）を調製した（B液）。さらに、調整例1で示した方法で、プルランナノゲル溶液（CHP濃度：2mg/mL、溶媒　PBS）を調整した（C液）。調製したそれぞれの溶液を、NanoAssemblr(Precision NanoSystems)を用いて、流速12mL/min（Flow Rate Ratio；A：B＝1:3:2.46）で混合した。混合した溶液を、透析膜（MWCO;10K）を用いて、PBSへ溶媒置換した。回収した溶液を、アミコンチューブ（MWCO; 100K）を用いて7倍濃縮し、0.45μmのフィルターに通し、CHP:LNP（mCherry）溶液を得た（重量平均粒子径：131nm、mRNA濃度：135μg/mL）。(Method 3)。
　実施例24～57及び59～62. CHP:LNPの作製9
　以下の表２及び表３に示す作製方法（Method1、Method2、Method3）、核酸、イオン化脂質、リン脂質、PEG修飾脂質、脂質割合、CHP濃度を採用して、CHP: LNPをそれぞれ作製した。実施例24～62で作製したCHP:LNPの作製組成と物性値を、実施例1～23と併せて以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 　なお、特にPEG修飾脂質を加えない、或いは少量の場合は、析出して製造することができなかったり、粒子径が200nm以上の非常に大きな粒子となることが多く、体内への投与に資するLNPが作成できないが、予想外にも、CHPを付与することによって、本願発明の実施例１～62では何れも理想的な粒子径のLNPを製造することができた。
　試験例1．マウスへの免疫による抗原性評価試験
　C57BL／6マウス（日本エスエルシー）に、CHP:LNP（OVA）（実施例１、実施例4）、またはLNP（OVA）（参考例1）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与を行う。また、比較対象として、別のマウスに、それぞれ同用量にて筋肉内投与を行う。3週後に再び同じ用量と投与方法で投与を行い、さらに1 週間後に採血と脾臓細胞、所属リンパ節を採取する。
　速やかに脾臓細胞を回収し、OVAのCD4エピトープペプチド（ROCOLAND、Ovalbumin 323-339-OH）とOVAのCD8エピトープペプチド（ROCOLAND、OVA 257-264）で刺激し、分泌されるIFN-γをELISA法で、細胞内のIFN－γ、IL-2、TNFαを細胞内サイトカイン染色法で測定する。
また、所属リンパ節由来細胞と回収した脾臓細胞について、複数細胞表面マーカー（CD3、CD4、CD8、CD127、CD62L、CD44、KLRG1、Tim-3、Lag-3、 PD-1）で発現解析を行い、T細胞の状態を解析する。
　OVA抗原とMHC複合体を認識する抗体（Biolegend）を用いて、抗原提示細胞の頻度と提示されたOVA抗原量を測定する。この際、細胞表面マーカーとしてCD11b, CD11c, F4/80, B220, CD8aなどを共染色することで抗原提示細胞の特定を行う。また、SIGN-R1に対する抗体を用いて抗原提示細胞への取り込みが受容体依存的であるか評価する。
　血清中のOVA特異的抗体をELISA法で測定する。
　試験例2．CHP:LNP（OVA）とLNP（OVA）の毒性比較試験
　（1）サイトカイン放出症候群
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（OVA）（実施例1、実施例4）、またはLNP（OVA）（参考例1）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与を行う。経時的に採血を行い、IL－6やIL－1β等の血中濃度をELISA法またはmultiplex bead-based assay panel（BioLegend）で測定する。
　（2）投与部位局所の皮膚炎症
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（OVA）（実施例1、実施例4）、またはLNP（OVA）（参考例1）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与を行う。24時間後に投与部位の皮膚を摘出する。皮膚の紅潮を観察した後、浸潤しているリンパ球数を測定する。
　（3）体重変動
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（OVA）（実施例1、実施例4）、またはLNP（OVA）（参考例1）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与を行う。その後、経時的に体重変化を測定する。
　（4）体温変動
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（OVA）（実施例1、実施例4）、またはLNP（OVA）（参考例1）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与を行う。その後、経時的に直腸体温を測定する。
　試験例3．マウスへの免疫によるワクチン評価試験
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（HPV E7）（実施例6）、またはLNP（HPV E7）（参考例3）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与にて免疫する。2または3週間後、同用量にて2回目の免疫を行い、その同日に1x105個のHPV E7タンパク安定発現マウス肺癌細胞株（TC－1細胞）を皮下に移植する。その後、腫瘍の大きさを経時的に測定する。
　試験例4．免疫原性試験
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（OVA）（実施例1、実施例4）、またはLNP（OVA）（参考例1）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与する。その後、2または3週間隔で同用量にて複数回（2回~5回）の皮下投与を行う。その後、血中の抗PEG抗体量と抗CHP抗体量をELISA法で測定する。
　試験例5．ヒト末梢血リンパ球由来マクロファージでの機能評価試験
　ヒトの末梢血からCD14陽性単球を単離し、24穴Tissue culture plateに、2 x 105 個／ウェルで500 μLの基礎培地（RPMI、10％ウシ胎児血清、50 ng／mL M－CSF）で播種し、37℃、5％CO2のインキュベーターで3日間培養した。その後、500μLの基礎培地で交換してさらに3日間培養した。M0マクロファージの分化誘導は、500μLの基礎培地で交換し、一方、M2様マクロファージへの分化誘導は、基礎培地に50 ng／mL IL－4、50 ng／mL IL－6、50 ng／mL IL－10、50 ng／mL IL－13を添加した、500 μLの分化誘導用培地で交換し、二日間培養した。mRNA量として0.5μgずつ含有したCHP:LNP（EGFP）（実施例2、実施例5）、またはLNP（EGFP）（参考例2）を、基礎培地に添加し、4℃条件のみ、2時間培養後、500 μLの培地に置換し、一晩37℃、5％CO2でインキュベートした。その後、PBSで洗浄後、200 μLのCell Dissociation 溶液(Biological Industries)を添加して、20分間、37℃でインキュベートし、200 μLのWash溶液（Miltenyi）を加え、ピペッティングにて細胞を剥がし、500gで5分間遠心して細胞を回収した。その後、PB450標識抗CD206抗体（BD Biosciences）と、APC標識抗DC-SIGN抗体（R＆D Systems）で染色し、フローサイトメーターで解析した。
　＜試験結果＞
　CHP:LNP（EGFP）（実施例2）またはLNP（EGFP）添加後、4℃での処理を経ずに37℃一晩インキュベートした場合の結果を図１に示す。また、CHP:LNP（EGFP）（実施例2）またはLNP（EGFP）添加後、4℃で2時間処理後、培地を交換し、37℃一晩インキュベートした場合の結果を図２に示す。また別実験で、CHP:LNP（EGFP）（実施例2）、PEGを含まないCHP:LNP（EGFP）（実施例5）またはLNP（EGFP）添加後、37℃一晩インキュベートした場合の結果を図３に示す。
　試験例6．マウス皮下投与による抗原提示細胞での発現確認実験
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（EGFP）（実施例5）、またはLNP（EGFP）（参考例2）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与を行う。24時間後に鼠経リンパ節を摘出し、細胞を回収して、フローサイトメーターで解析を行う。
　試験例7. 凍結融解前後の粒子径の測定
　CHP:LNP（実施例19, 20, 23, 26～54, 57～62）を-30℃で一度凍結し、その後融解させ、凍結融解前後での粒子径を測定した。また、その比較対象としてCHPを含まない同じ組成のLNP（参考例19, 26, 32, 36, 39, 42, 44～50, 54,60）についても同様に、-30℃で一度凍結し、その後融解させ、凍結融解前後の粒子径を測定した。
　＜試験結果＞
　得られた結果を以下の表４に示す。比較対象のCHPを含まないLNPは、凍結融解を一度行うだけで粒子径が増大するが、予想外にも、CHP:LNPは凍結融解前後で粒子径の増大が抑制されていた。以上から、CHPはLNPの安定性を向上する効果があるといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　試験例8．ヒト末梢血リンパ球由来マクロファージでの機能評価試験-2
　試験例5と同様の方法で、M0マクロファージとM2様マクロファージを準備し、mRNA量として0.5μgずつ含有したCHP:LNP（mCherry）（実施例51、58、61）、または、LNP（mCherry）（参考例50）を基礎培地に添加し、一晩37℃、5％CO2でインキュベートした。その後、PBSで洗浄後、200 μLのCell Dissociation 溶液(Biological Industries)を添加して、20分間、37℃でインキュベートし、200 μLのWash溶液（Miltenyi）を加え、ピペッティングにて細胞を剥がし、500gで5分間遠心して細胞を回収した。その後、PB450標識抗CD206抗体（BD Biosciences）と、APC標識抗DC-SIGN抗体（R＆D Systems）で染色し、フローサイトメーターで解析した。
　＜試験結果＞
　結果を図４に示す。CHPを付与したLNP（CHP:LNP）でのみ、DC-SIGN陰性細胞であるM0マクロファージに比べ、DC-SIGN陽性細胞であるM2様マクロファージで高発現していた。以上から、CHPを付与したLNPは、イオン化脂質に依らずDC-SIGN陽性細胞に選択的にmRNAの送達が可能であり、搭載したmRNAからタンパク質を発現できる性能があることが判った。
　試験例9. 免疫原性試験-2
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（mCherry）（実施例40）、PEG修飾脂質を含まないCHP:LNP（mCherry）（実施例57）、または、LNP（mCherry）（参考例39）を、mRNA量として10μgずつ皮下投与をした。試験群は各n=5とした。さらに3週間後に同用量にて再度皮下投与を行った。その1週間後に、血中の抗PEG抗体の量をELISA法（Life Diagnostics）で測定した。陰性コントロールとしては溶媒のみ（PBS）を投与した。
　＜試験結果＞
　得られた結果を図５に示す。陰性コントロール、CHPを付与したLNP（CHP:LNP（mCherry））、CHPを付与したPEG修飾脂質を含まないLNP（CHP:LNP（mCherry）PEG Free）投与群と比較して、LNP（mCherry）投与群は、有意に抗PEG抗体（IgM）が検出された（*；p <0.05, unpaired t検定）。以上の結果から、CHPを付与したLNPは、PEG修飾脂質を含んでいても、抗PEG抗体に起因する副反応、例えば、アナフィラキシーや、繰り返し投与によって薬効が減弱するAccelerated blood clearance（ABC）現象を回避できる可能性を示唆している。　
　試験例10. マウス皮下投与による近傍リンパ節での発現確認実験-1
　C57BL/6マウスに、CHP:LNP（mCherry）（実施例40）、またはLNP（mCherry）（参考例39）を、mRNA量として5μgずつを、右側背臀部周囲の皮内に投与した。投与後17時間目にin vivo イメージング機器（Vilber Bio Imaging）を用いて、mCherryタンパク質の蛍光強度を検出し、投与局所および近傍リンパ節（鼠経リンパ節）での発現を測定した。また、摘出した近傍リンパ節（鼠経リンパ節）を、同機器を用いて、同波長で蛍光タンパクを検出した。
　＜試験結果＞
　投与局所の代表例の結果を図６に示す。また、摘出した近傍リンパ節（鼠経リンパ節）の代表例の結果を図７に示す。投与局所では、LNP（mCherry）は広く発現が確認できたが、CHP:LNP（mCherry）の発現は低く、一方、近傍リンパ節では、CHP:LNP（mCherry）のほうがLNP（mCherry）に比べて発現が高かった。また、摘出した近傍リンパ節では、LNP（mCherry）に比して、CHP:LNP（mCherry）で高い発現が確認できた。以上の結果は、皮内投与した場合、CHPを付与したLNPは、LNPに比べて近傍のリンパ節への送達能が優れていることを示している。
　試験例11. 投与部位局所の皮膚炎症評価-2
　C57BL/6マウスを剃毛後、CHP:LNP（EGFP）（実施例2）、またはLNP（EGFP）（参考例2）を、mRNA量として9.8μgずつを、背臀部周囲の皮内に投与した。投与後3、5日目後に、それぞれ皮膚組織を採取し、4%パラホルムアルデヒドで48時間固定後、70%エタノール溶液に置換した。その後、HE染色と抗IBA1抗体による免疫染色を行い、病理観察を行った。　　　
　＜試験結果＞
　得られた結果を表５に示す。LNP（EGFP）の投与群では、炎症性細胞の浸潤、活性化マクロファージの指標であるIBA1陽性細胞の増加が、CHP:LNP（EGFP）投与群に比べて高かった。以上の結果は、脂質ナノ粒子の局所投与によって誘発される炎症が、CHPを付与したLNP（CHP:LNP）ではLNPに比べて抑制されることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 　試験例12. 体重に及ぼす影響の評価
　C57BL／6マウスに、CHP:LNP（OVA）（実施例1）、または、LNP（OVA）（参考例1）を、mRNA量として10μgずつを皮下投与した（0日目）。さらに、初回投与から3週間後（21日目）に、同用量にて再度皮下投与した。体重測定は、各投与日とその直後2日間は連続して測定し、さらに初回投与から28日目まで、週一回の頻度で行った。試験群は各n=3とした。比較対象群は薬液を何も投与を行わなかった。
　＜試験結果＞
　得られた結果を図8に示す。各群の投与初日（0日目）の体重を100%と換算し、各群の平均値を用いてグラフ化した。なお、図中の矢印はLNPを投与した日を示す。その結果、LNP投与群では、各投与の翌日に体重減少が認められたが、一方、CHPを付与したLNP投与群では、その変化は軽微であり、薬剤未投与群と近い体重推移を示した。以上から、LNPにCHPを付与することによって、LNPに起因する体重減少という副作用を軽減できることが示された。

Claims (19)

  1. 脂質粒子であって、脂質粒子構成脂質としてイオン化脂質、リン脂質、及びステロールを含有し、且つ疎水性基を含む修飾多糖類を含有する、脂質粒子。
  2. 前記イオン化脂質の含有量が、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して35～70モル％であり、
    前記リン脂質の含有量が、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して4～25モル％であり、且つ
    前記ステロールの含有量が、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して15～55モル％である、
    請求項１に記載の脂質粒子。
  3. 前記修飾多糖類の構成多糖類がプルランを含む、請求項１に記載の脂質粒子。
  4. 前記疎水性基がステロール骨格を有する疎水性基を含む、請求項１に記載の脂質粒子。
  5. 前記修飾多糖類の重量平均分子量が5000～2,000,000である、請求項１に記載の脂質粒子。
  6. 薬剤を含有する、請求項１に記載の脂質粒子。
  7. 前記薬剤が核酸である、請求項６に記載の脂質粒子。
  8. 前記核酸が、mRNA、免疫刺激性二本鎖RNA、 siRNA、miRNA、リボザイム、CpGオリゴDNA、アンチセンスオリゴDNA、核酸アプタマー、デゴイ、遺伝子発現用二本鎖DNA、及びジヌクレオチドから選択される少なくとも１つである、請求項７に記載の脂質粒子。
  9. 前記核酸がmRNAまたはCpGオリゴDNAである、請求項７に記載の脂質粒子。
  10. 前記核酸がmRNAである、請求項７に記載の脂質粒子。
  11. 前記核酸がCpGオリゴDNAである、請求項７に記載の脂質粒子。
  12. 前記イオン化脂質が一般式（1）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中：R1はアルキル基を示す。R2はアルキル基を示す。R3はアルキル基を示す。R4はアルキル基又は水素原子を示す。L1は－O－C（＝O）－又は－C（＝O）－O－を示す。L2は－O－C（＝O）－又は－C（＝O）－O－を示す。mは1～8の整数を示す。nは3～10の整数を示す。pは3～10の整数を示す。］
    であらわされるアミノ脂質、一般式（2）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中：aは3～5の整数を示す。bは0又は1を示す。cは0～4の整数を示す。R5及びR6は同一又は異なって、アルキル基又はアルケニル基を示す。Xは置換されていてもよい非芳香族窒素含有ヘテロ環基又は置換されていてもよいアミノ基を示す。］
    で表されるアミノ脂質、及び一般式（3）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中：R7及びR8は同一又は異なって、アルキル基又はアルケニル基を示す。Yは置換されていてもよい非芳香族窒素含有ヘテロ環基又は置換されていてもよいアミノ基を示す。Eはリンカーを示す。］
    で表されるアミノ脂質からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１に記載の脂質粒子。
  13. さらに、粒子の凝集を阻害する複合化脂質を含む請求項１に記載の粒子。
  14. 前記複合化脂質の含有量が、前記脂質粒子構成脂質100モル％に対して0～2モル％である、請求項１３に記載の脂質粒子。
  15. 前記複合化脂質がポリエチレングリコール-脂質コンジュゲートである、請求項１３に記載の脂質粒子。
  16. 質量平均粒子径が10～200nmである、請求項１に記載の脂質粒子。
  17. 請求項１～１６のいずれかに記載の脂質粒子を含有する、医薬。
  18. がん、免疫疾患、中枢性疾患等の治療薬、感染症ワクチン又はがんワクチンである、請求項１７に記載の医薬。
  19. 皮下投与、経静脈投与、筋肉内投与、経鼻投与又は気道内投与に用いるための、請求項１７に記載の医薬。
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