WO2024200975A1 - Utilisation de polykétide synthases de type iii de champignons ascomycètes comme phloroglucinol synthases - Google Patents

Utilisation de polykétide synthases de type iii de champignons ascomycètes comme phloroglucinol synthases Download PDF

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phloroglucinol
acid molecule
host cell
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PCT/FR2024/050406
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Govindan RAGHUNATHAN
Nicolas CANU
Mohammed EL BACHIRI
Rajendra Sharma
Giuliano NIGRO
Nicolas PANEL
Sophie Bozonnet
Magali Remaud-Simeon
Vincent LAFAQUIERE
Isabelle Andre
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Compagnie Generale des Etablissements Michelin SCA
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Compagnie Generale des Etablissements Michelin SCA
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
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    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • TITLE Use of type III polyketide synthases from Ascomycetes fungi as phloroglucinol synthases
  • the present invention is in the fields of microbial biochemistry and more particularly in the field of synthesis by microbial enzymes of phloroglucinol. It relates to the use of type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as phloroglucinol synthases, associated methods of producing phloroglucinol, as well as nucleic acids, vectors and host cells intended for the production of phloroglucinol.
  • Phloroglucinol is an aromatic organic compound used in particular in the manufacture of pharmaceutical products and explosives.
  • Phloroglucinol synthesis is catalyzed by certain type III polyketide synthases called phloroglucinol synthases. Phloroglucinol synthases perform the condensation of three malonyl-CoA molecules to form one phloroglucinol molecule according to the following reaction scheme (Reaction I): Reaction I
  • Phlorotannins include fucols, phloretols, and fucophloretols, which are derivatives of phloroglucinol in the cell wall of brown algae.
  • various protective activities of brown algae have also been attributed to phlorotannins.
  • Natural phloroglucinol synthesis was initially described in the Gram-negative bacteria Pseudomonas fluorescens ( ⁇ chkar et al., 2005; Zha et al., 2006) and in the brown alga Ectocarpus siliculosus (Meslet-Cladière et al., 2013).
  • the enzyme phloroglucinol synthase involved in phloroglucinol synthesis was identified in both species.
  • phloroglucinol synthase is encoded by the PHLD gene ( ⁇ chkar et al., 2005; Zha et al., 2006).
  • the phloroglucinol synthase activity of PHLD could be demonstrated in Escherichia coli expressing a heterologous PHLD gene ( ⁇ chkar et al., This activity was confirmed in vitro by small-scale enzymatic tests carried out with a recombinant PHLD expressed and purified from Escherichia coli cultures (Zha et al., 2006).
  • phloroglucinol synthase is encoded by the PKS1 gene (Meslet-Cladière et al., 2013).
  • the phloroglucinol synthase activity of PKS1 has been demonstrated in vitro, from recombinant PKS1 expressed and purified in Escherichia coli and from cellular extracts of E. siliculosus (Meslet-Cladière et al., 2013, WO 2013/045510).
  • PHLD and PKS1 enzymes exhibit low enzymatic activities.
  • the PHLD enzymes of Pseudomonas fluorescens and PKS1 of Ectocarpus siliculosus produce little or no phloroglucinol when these sequences are expressed in yeast instead of in Escherichia coli (WO2019/002799; WO2019/002798).
  • eukaryotic systems can be advantageous, particularly for large-scale production. They allow the production of enzymes that can be modified at the post-translational level.
  • WO2019/002799 and WO2019/002798 describe phloroglucinol synthases capable of synthesizing phloroglucinol at a much higher level than PKS1 from Ectocarpus siliculosus when sequences encoding these enzymes are transfected into yeast. These phloroglucinol synthases are derived from actinomycete bacteria (WO2019/002799) or eukaryotic algae (WO2019/002798).
  • type III polyketide synthases are a large class of enzymes that include proteins with sequence similarities but exhibit very dissimilar enzymatic activities (Meslet-Cladière et al., 2013).
  • phloroglucinol synthase activity is only one of the multiple activities that may be present in a type III polyketide synthase and only a small proportion of type III polyketide synthases therefore possess phloroglucinol synthase activity.
  • no sequence motif associated with phloroglucinol synthase activity has been described, making the identification of type III polyketide synthases possessing such activity particularly difficult.
  • the invention relates to the use of a polypeptide chosen from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi, of a nucleic acid molecule encoding it, of a vector comprising a nucleic acid molecule encoding it or of a host cell expressing it, for producing phloroglucinol.
  • the invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide as defined in the use according to the invention, characterized in that: a) the isolated nucleic acid molecule further comprises a promoter controlling the expression of the nucleic acid sequence; or b) the isolated nucleic acid molecule further comprises a transcription terminator controlling the expression of the nucleic acid sequence; or c) the nucleic acid sequence is further optimized for expression in a host cell, in particular in a yeast or in a bacterium; or d) any combination of a) to c).
  • the invention relates to a vector comprising a nucleic acid molecule according to the invention, said vector preferably being a plasmid.
  • the invention relates to a host cell comprising a nucleic acid molecule according to the invention or a vector according to the invention.
  • the invention relates to a method for producing phloroglucinol, comprising the steps of:
  • step (ii) in vitro culture of the host cell of step (i) under conditions allowing the growth of said host cell and/or the expression of the nucleic acid molecule contained in said host cell, so as to produce phloroglucinol;
  • step (iii) optionally recovering the culture medium comprising phloroglucinol, obtained after step (ii); and (iv) optionally, purification of phloroglucinol from the culture medium of step (iii).
  • the invention relates to a method for producing phloroglucinol, comprising the steps of:
  • step (ii) incubating the mixture from step (i) under conditions suitable for producing phloroglucinol
  • step (iii) optionally the recovery of the reaction medium comprising phloroglucinol, obtained after step (ii);
  • step (iv) optionally, the purification of phloroglucinol from the reaction medium of step (iii).
  • Figure 1 represents the alignment of the amino acid sequences SEQ ID NO: 1 (PhlD of Hirsutella minnesotensis 3608 denoted PlhD-Hm2), SEQ ID NO: 2 (PhlD of Hirsutella minnesotensis 3608 denoted PlhD-Hm1) and SEQ ID NO: 3 (PhlD of Aspergillus tanneri denoted PlhD-At).
  • FIG. 2 shows the map of the PBIM5 plasmid used in the examples.
  • a or “an” is meant one or more. In other words, when “a” or “an” is used in relation to a feature, it covers both embodiments with the feature of interest occurring only once and those with the feature of interest occurring multiple times. In other words, unless otherwise indicated (such as “only one” or “a single” or “only one”), “a” is used as a synonym for “one or more” or “at least one”.
  • a polypeptide “comprises” an amino acid sequence when the amino acid sequence is part of the final amino acid sequence of the polypeptide. Such a polypeptide may have up to several hundred additional amino acid residues.
  • a polypeptide “consists essentially of” an amino acid sequence when such an amino acid sequence is present with possibly only a few additional amino acid residues (for example, a peptide of up to 20 amino acids, such as a 6-histidine Hisxô tag, may additionally be present).
  • Consisting of” or “consisting of” means excluding more than trace amounts of other components or steps.
  • a polypeptide “consists of” an amino acid sequence when the polypeptide does not contain any amino acids other than the stated amino acid sequence.
  • Type III polyketide synthase means a multifunctional enzyme or enzyme complex that produces polyketides and does not utilize an acyl carrier protein (ACP) domain.
  • ACP acyl carrier protein
  • Polyketide refers to a large family of secondary metabolites in bacteria, fungi, plants, and some animal strains that arise from the iterative condensation of acetyl or malonyl subunits by polyketide synthase enzymes. Polyketides also serve as raw materials for the manufacture of a wide range of natural and semi-synthetic products.
  • Phloroglucinol synthase is a multifunctional enzyme or enzyme complex belonging to the type III polyketide synthase family that catalyzes the synthesis of phloroglucinol.
  • a phloroglucinol synthase catalyzes the condensation of three malonyl-CoA molecules to form one phloroglucinol molecule.
  • enzyme activity or “catalytic activity” or even “activity” of an enzyme is meant the efficiency of an enzyme in converting a substrate into a product in a given environment. The efficiency of the enzyme takes into account here the rate of conversion of the substrate into a product by the enzyme and the rate of conversion of the substrate into a product by the enzyme.
  • rate of conversion of the substrate into a product by the enzyme is meant here the ratio between the quantity of final product obtained relative to the initial quantity of substrate for a defined quantity of enzyme.
  • an enzymatic activity within the meaning of the invention can be expressed as the quantity of phloroglucinol produced in a given volume (in g/L).
  • fungus means a unicellular or multicellular organism of the kingdom Fungi. This kingdom includes several divisions, including that of the Ascomycetes, also called higher fungi, i.e. with septate mycelium.
  • the division of the Ascomycetes includes several subdivisions, including that of the Pezizomycotina, comprising filamentous fungi. This subdivision includes in particular the families Ophiocordycipitaceae (which includes in particular the genus Hirsutella) and Trichocomaceae (which includes in particular the genus Aspergillus).
  • the genus Hirsutella includes in particular the species Hirsutella minnesotensis 3608.
  • the genus Aspergillus includes in particular the species Aspergillus tanneri, Aspergillus aculeatus (in particular the strains ⁇ TCC 16872 / CBS 172.66 / WB 5094), Aspergillus arachidicola, Aspergillus awamori, Aspergillus bertholletiae, Aspergillus bombycis, Aspergillus brasiliensis (in particular the strains CBS 101740 / IMI 381727 / IBT 21946), Aspergillus caelatus, Aspergillus calidoustus, Aspergillus homomorphus (in particular the strain CBS 101889), Aspergillus leporis, Aspergillus luchuensis (in particular the strain CBS 106.47), Aspergillus minisclerotigenes, Aspergillus niger (notamment les souches ⁇ TCC 1015 / CBS 113.46
  • the division Ascomycetes also includes the subdivisions Taphrinomycotina and Saccharomycotina.
  • the subdivision Saccharomycotina includes the order Saccharomycetales (budding yeasts), which includes the genera Saccharomyces (including species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, and Saccharomyces bayanus), Candida, Eremothecium, Dekkera (including species Dekkera brucelensis and Dekkera intermedia), Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Lodderomyces, Yarrowi, Zigosaccharomyces (including the species Zi osaccharomyces bailii), Torulaspora (including the species Torulaspora globosa and Torulaspora glabrata), Kluyveromyces (including the species Kluyveromyces themotolerens), and Brettanomycces
  • Taphrinomycotina includes the class Schizosaccharomycetes (yeasts that reproduce by fission, which includes the genus Schizosaccharomyces which includes the species Schizosaccharomyces pombe).
  • the kingdom Fungi also includes the division Basidiomycota, which includes the yeast genera Cryptococcus and Malassezia.
  • PHLD.Pf we mean indifferently the gene coding for the phloroglucinol synthase PH LD of Pseudomonas fluorescens, or the polypeptide encoded by this gene.
  • PKS1.Es or “PHLD.Es” we mean indifferently the gene coding for the phloroglucinol synthase PKS1 of Ectocarpus siliculosus, or the polypeptide encoded by this gene.
  • PhlD or “PHLD” herein refers to a candidate gene encoding a candidate phloroglucinol synthase enzyme, or the polypeptide encoded by this gene. According to the nomenclature chosen by the Inventors, “PhlD.ii” or “PHLD.ii” herein refers to the candidate gene or the candidate polypeptide from a given organism. The letters “ii” represent the initials of the genus and species to which said organism belongs. For example, PhlD.Hm corresponds to a candidate phloroglucinol synthase enzyme from a species Hirsutella minnesotensis, and PhlD.
  • Nonpolar amino acids refers to a family of amino acids whose average positions of positive and negative partial charges coincide.
  • nonpolar amino acids are: glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), tryptophan (W), phenylalanine (F), tyrosine (Y), methionine (M), and cysteine (C).
  • Those other than glycine (G) can be subdivided into three subfamilies: 1) "aliphatic nonpolar amino acids,” which have an aliphatic-type side chain and include alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), and proline (P), 2) "aromatic nonpolar amino acids,” which have an aromatic-type side chain and include tryptophan (W), phenylalanine (F), and tyrosine (Y), and 3) "sulfur-containing nonpolar amino acids” whose side chain includes a sulfur atom and which include methionine (M) and cysteine (C).
  • aliphatic nonpolar amino acids which have an aliphatic-type side chain and include alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), and proline (P)
  • aromatic nonpolar amino acids which have an aromatic-type side chain and include tryptophan (W), phenylalanine (F), and
  • Polar amino acids are defined as a family of amino acids whose average positions of positive and negative partial charges are not coincident.
  • polar amino acids are: serine (S), threonine (T), asparagine (N), glutamine (Q), glutamic acid (E), aspartic acid (D), lysine (K), arginine (R), histidine (H).
  • Nucleic acid molecule means a polymer of any length of deoxyribonucleic acid (DNA), or polydeoxyribonucleotides, including but not limited to complementary DNA or cDNA, genomic DNA, plasmids, vectors, viral genomes, isolated DNA, probes, primers and any mixture thereof; or a polymer of any length of ribonucleic acid (RNA), or polyribonucleotides, including but not limited to messenger RNA or mRNA, antisense RNA; or mixed polyribo-polydeoxyribonucleotides. They include single or double-stranded, linear or circular, natural or synthetic polynucleotides. In addition, a polynucleotide may include non-natural nucleotides and may be interrupted by non-nucleotide components.
  • nucleic acid As used herein, the terms “nucleic acid”, “nucleic acid molecule”, “polynucleotide” and “nucleotide sequence” are used interchangeably.
  • isolated molecule means a molecule, including a protein, polypeptide, peptide, nucleic acid molecule, plasmid vector, viral vector or host cell, that is removed from its natural environment (i.e. separated from at least one other component with which it is naturally associated).
  • polypeptide polymers of amino acid residues which comprise at least nine amino acids linked by peptide bonds.
  • the polymer may be linear, branched or cyclic.
  • the polymer may comprise naturally occurring amino acids and/or amino acid analogues and may be interrupted by non-amino acid residues.
  • the amino acid polymer contains more than 50 amino acid residues, it is preferably called a polypeptide or protein, whereas if the polymer consists of 50 amino acids or less, it is preferably called a "peptide”.
  • identity is meant an exact sequence match between two polypeptides or two amino acid molecules.
  • the “identity percentages” referred to in the context of the disclosure of the present invention are determined on the basis of a global alignment of the sequences (nucleic or protein) to be compared, that is to say on an alignment of the sequences taken in their entirety over their entire length using any algorithm well known to those skilled in the art such as the Needleman and Wunsch-1970 algorithm.
  • This sequence comparison can be carried out using any software well known to those skilled in the art, for example the needle software using the "Gap open” parameter equal to 10.0, the “Gap extend” parameter equal to 0.5 and a "Blosum 62" matrix.
  • the needle software is for example available on the website ebi.ac.uk world wide under the name "Align”.
  • vector is meant a vehicle, preferably a nucleic acid molecule or a viral particle, which contains the elements necessary to enable the delivery, propagation and/or expression of one or more nucleic acid molecules in a host cell or organism.
  • this term encompasses vectors for maintenance (cloning vectors), vectors for expression in various host cells or organisms (expression vectors), extrachromosomal vectors (e.g. multicopy plasmids) or integrating vectors (e.g. designed to integrate into the genome of a host cell and produce additional copies of the nucleic acid molecule contained therein when the host cell replicates).
  • the term also encompasses shuttle vectors (e.g. functioning in both prokaryotic and/or eukaryotic hosts) and transfer vectors (e.g. for the transfer of nucleic acid molecule(s) into the genome of a host cell).
  • the vectors according to the invention may be natural, synthetic or artificial genetic sources, or a combination of natural and artificial genetic elements.
  • vector should be understood broadly to include both plasmid (or plasmid) and viral vectors.
  • Plasmid as used herein means a replicable DNA construct.
  • plasmid vectors contain selectable marker genes that allow host cells carrying the plasmid to be positively identified and/or selected. or negative in the presence of the compound corresponding to the selection marker.
  • selectable marker genes A variety of positive and negative selection marker genes are known in the art. For illustration, an antibiotic resistance gene can be used as a positive selection marker gene to select a host cell in the presence of the corresponding antibiotic.
  • viral vector refers to a nucleic acid vector that comprises at least one element of a virus genome and may be packaged into a viral particle or virus-like particle.
  • Viral vectors may be replication competent or selective (e.g., designed to replicate better or selectively in specific host cells), or may be genetically disabled so as to be defective or deficient in replication.
  • a “host cell” means a cell containing a heterologous nucleic acid molecule.
  • heterologous or “exogenous” is meant that the nucleic acid molecule comes from a species different from the species of the host cell.
  • a host cell is not a cell that exists in nature but is a molecular biology tool obtained by genetic manipulation techniques.
  • the host cell may consist of a single type of cell or a group of different types of cells (in which case there is a mixture of host cells of distinct types).
  • the host cell may also be a hybrid cell, i.e. resulting from the fusion of at least two cells of different types.
  • the host cell may belong to cultured cell lines, primary cells, stem cells or proliferative cells.
  • the term "host cell” includes prokaryotic cells and eukaryotic cells.
  • Prokaryote means a unicellular microorganism whose cellular structure does not include a nucleus. Prokaryotes include the kingdoms of bacteria and archaea.
  • Baceria means a microscopic and prokaryotic organism present in all environments.
  • Eukaryote means, in contrast to prokaryotes, any unicellular or multicellular organism whose cells have a structured nucleus.
  • Eukaryotic cells include yeast, insect, plant, and animal cells (including non-human mammalian cells).
  • the host cell may, for example, be isolated or organized into tissue, organ, or within a complete organism. If the host cell is within a complete organism, the organism is not human.
  • type III polyketide synthases are a vast class of enzymes that bring together proteins with sequence similarities while exhibiting very dissimilar enzymatic activities (Meslet-Cladière et al., 2013).
  • phloroglucinol synthase activity is only one of the multiple activities that may be present in a type III polyketide synthase.
  • no sequence motif associated with phloroglucinol synthase activity has been described, making the identification of type III polyketide synthases with such activity particularly difficult.
  • the inventors have further demonstrated that the novel type III polyketide synthases identified in Ascomycetes fungi have phloroglucinol synthase activity.
  • the invention therefore relates to the use of a polypeptide chosen from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi, of an isolated nucleic acid molecule encoding it, of a vector comprising a nucleic acid molecule encoding it or of a non-human host cell expressing it, for producing phloroglucinol.
  • polypeptide used in the invention is chosen from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi, and advantageously has phloroglucinol synthase activity.
  • type III polyketide synthases of fungi of the Ophiocordycipitaceae and Trichocomaceae families advantageously of the Hirsutella and Aspergillus genera, more advantageously of the Hirsutella minnesotensis 3608 and Aspergillus tanneri species.
  • the polypeptide used in the invention corresponds to those identified herein as having phloroglucinol synthase activity or to derivatives thereof.
  • the polypeptide used in the invention comprises, essentially consists of or consists of an amino acid sequence having at least 70% identity, at least 75% identity, advantageously at least 80% identity, at least 85% identity, more advantageously at least 90% identity, at least 91% identity, at least 92% identity, at least 93% identity, at least 94% identity, even more advantageously at least 95% identity, at least 96% identity, at least 97% identity, at least 98% identity, at least 99% identity, at least 99.5% identity, or even 100% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 (PhlD of Hirsutella minnesotensis 3608 denoted PlhD-Hm2), SEQ ID NO: 2 (PhlD of Hirsutella minnesotensis 3608 denoted PlhD-Hm1) and SEQ ID NO: 3 (
  • the inventors have identified motifs conserved between the three sequences SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3 (see the alignment in Figure 1), which are therefore advantageously present in the sequence of the polypeptide used in the invention.
  • the polypeptide used in the invention further comprises (in addition to a minimum percentage of identity with SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3 as described above) at least one fragment chosen from:
  • LVTSTGFXiAPGVDV wherein Xi is selected from apolar amino acids (i.e. glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), tryptophan (W), phenylalanine (F), tyrosine (Y), methionine (M) and cysteine (C), SEQ ID NO:4);
  • VNFMGCAAAMNGLR SEQ ID NO:5
  • X2 is selected from neutral apolar or polar amino acids (i.e. glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), tryptophan (W), phenylalanine (F), tyrosine (Y), methionine (M), cysteine (C), serine (S), threonine (T), asparagine (N), and glutamine (Q)) (SEQ ID NO:7);
  • AFSFAPGX3TVEG wherein X3 is selected from apolar amino acids (i.e. glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), tryptophan (W), phenylalanine (F), tyrosine (Y), methionine (M) and cysteine (C)) (SEQ ID NO: 10).
  • G glycine
  • A alanine
  • V valine
  • L leucine
  • I isoleucine
  • P proline
  • W tryptophan
  • phenylalanine F
  • Y tyrosine
  • M methionine
  • C cysteine
  • the polypeptide used in the invention further comprises (in addition to a minimum percentage of identity with SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3 as described above) at least one fragment chosen from:
  • LVTSTGFXiAPGVDV wherein X1 is selected from aliphatic apolar amino acids (i.e. alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), and proline (P), SEQ ID NO:11);
  • VNFMGCAAAMNGLR SEQ ID NO:5;
  • ISSLF ⁇ DGX2AAMWGS wherein X2 is selected from nonpolar sulfur-containing or neutral polar amino acids (i.e. methionine (M), cysteine (C), serine (S), threonine (T), asparagine (N), and glutamine (Q)) (SEQ ID NO:12);
  • M methionine
  • C cysteine
  • S serine
  • T threonine
  • N asparagine
  • Q glutamine
  • X3 is selected from aliphatic apolar amino acids (i.e. alanine ( ⁇ ), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), and proline (P)) (SEQ ID NO:13).
  • polypeptide used in the invention further comprises (in addition to a minimum percentage of identity with SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3 as described above) at least one fragment chosen from:
  • LVTSTGFX1 ⁇ PGVDV wherein X1 is selected from valine and isoleucine (SEQ ID NO:14);
  • VNFMGCAAAMNGLR SEQ ID NO:5
  • AFSFAPGX3TVEG wherein X3 is selected from valine and isoleucine (SEQ ID NO:16).
  • the polypeptide used in the invention further comprises (in addition to a minimum percentage of identity with SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3 as described above) at least one fragment chosen from: (a) LVTTSTGFI ⁇ PGVDV (SEQ ID NO: 17);
  • VNFMGCAAAMNGLR SEQ ID NO:5
  • the polypeptide used in the invention further comprises (in addition to a minimum percentage of identity with SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3 as described above) several of the fragments (a) to (g) as described above (general, intermediate, limited, very limited embodiment).
  • the polypeptide used in the invention may further comprise (in addition to a minimum percentage of identity with SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3 as described above (general, intermediate or limited embodiment)):
  • the polypeptide used in the invention comprises, is essentially constituted or is constituted of an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3, preferably the polypeptide used in the invention comprises, is essentially constituted or is constituted of the amino acid sequence SEQ ID NO:1.
  • the isolated nucleic acid molecule used in the invention may be any nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding any polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above.
  • the isolated nucleic acid molecule further comprises a promoter controlling the expression of the nucleic acid sequence encoding polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above.
  • the promoter is an exogenous promoter, in particular a yeast promoter, preferably a promoter selected from ADH2 (pADH2, this promoter allows expression in particular when the culture medium contains ethanol as a carbon source), CCW12 (pCCW12, this promoter allows expression in particular when the culture medium contains glucose as a carbon source), and TEF1 (pTEF1, this promoter allows expression in particular when the culture medium contains glucose or sucrose as a carbon source), more preferably a promoter selected from ADH2 (pADH2) from Saccharomyces cerevisiae, CCW12 (pCCW12) from S.
  • TEF1 from S. cerevisiae, and TEF1 (pTEF1) from S. cerevisiae, more preferably a promoter selected from ADH2 of sequence SEQ ID NO: 20, CCW12 of sequence SEQ ID NO: 21, and TEF1 of sequence SEQ ID NO: 22.
  • the isolated nucleic acid molecule further comprises a transcription terminator of the nucleic acid sequence encoding the polypeptide chosen from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above.
  • the terminator is an exogenous terminator, in particular a yeast terminator, preferably the RPL3 terminator (tRPL3) or the ADH1 terminator, more preferably the RPL3 terminator of S. cerevisiae or the ADH1 terminator of S. cerevisiae, more preferably the RPL3 terminator of sequence SEQ ID NO: 23 or the ADH1 terminator of sequence SEQ ID NO: 24.
  • the isolated nucleic acid molecule further comprises both a promoter and a terminator which are as defined above.
  • the nucleic acid molecule further comprises an export sequence.
  • this export sequence allows the secretion or excretion of the polypeptide(s) encoded by the nucleic acid molecule into the cellular environment.
  • the isolated nucleic acid molecule further comprises both a promoter, a terminator and an export sequence as defined above.
  • the nucleic acid molecule may be isolated from homologous strains in culture, preferably selected from the genera Hirsutella and Aspergillus, more preferably from the species Hirsutella minnesotensis 3608 and Aspergillus tanneri.
  • the The nucleic acid molecule may be isolated from a vector or a heterologous host cell comprising said molecule, said vector or said host cell being as defined above and as described below in the sections "Host Cells" or "Vectors".
  • the isolated nucleic acid molecule may be synthesized in vitro by nucleic synthesis techniques known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid sequence included in the isolated nucleic acid molecule used in the invention is further optimized for expression in a host cell, in particular in a yeast or in a bacterium.
  • Various software is available to the person skilled in the art for optimizing codons for expression in a host cell, in particular in yeast or bacteria.
  • Examples of such software include the Twist Codon Optimization tool software (provided by Twist Biosciences), the GenSmartTM Codon Optimization software (provided by GenScript and the functionalities of which are described in application WO2020024917A1), the IDT Codon Optimization Tool software (provided by Integrated DNA technologies), and Azenta’s codon optimization tool software (provided by Azenta).
  • Examples of optimized nucleic acid sequences respectively encoding the polypeptides of amino acid sequence SEQ ID NO: 1 to 3 are the amino acid sequences nucleic acids SEQ ID NO:25 to SEQ ID NO:27, respectively, presented in Table 2 below and which are optimized (at least partially) for expression in yeast, in particular Saccharomyces cerevisiae:
  • the person skilled in the art would be able to generate other nucleic sequences optimized for expression in yeast, in particular Saccharomyces cerevisiae, or in another type of host cell (in particular another species of yeast or a bacterium).
  • the person skilled in the art can obtain this sequence by in vitro synthesis directly with the optimized codons.
  • the optimized sequence can also be obtained by in vitro site-directed mutagenesis from a sample of the nucleic acid molecule whose codons are to be adapted, using amplification by polymerase chain reaction (PCR).
  • the isolated nucleic acid molecule further comprises both a promoter and a terminator as defined above, and the nucleic acid sequence comprised in the isolated nucleic acid molecule used in the invention is further optimized for expression in a host cell, advantageously in a yeast or a bacterium, preferably in a yeast, as described above.
  • the isolated nucleic acid molecule further comprises both a promoter, a terminator and an export sequence as defined above, and the nucleic acid sequence comprised in the isolated nucleic acid molecule used in the invention is further optimized for expression in a host cell, advantageously in a yeast or a bacterium, preferably in a yeast, as described above.
  • the vector used in the invention may be any vector comprising any nucleic acid molecule as defined above.
  • Vectors that are suitable for use in the present invention include, but are not limited to, bacteriophage, plasmid or cosmid vectors for expression in prokaryotic host cells such as bacteria (e.g., E. coli, or bacteria of the genus Pseudomonas); vectors for expression in yeast (e.g., Saccharomyces cerevisiae, Schyzosaccharomyces pombe, Pichia pastoris); baculovirus vectors for expression in insect cell systems (e.g., Sf 9 cells); viral and plasmid vectors for expression in plant cell systems (e.g., Ti plasmid, Cauliflower mosaic virus, CaMV, Tobacco mosaic virus TMV); and viral and plasmid vectors for expression in vertebrate, including mammalian, cells or organisms.
  • bacteria e.g., E. coli, or bacteria of the genus Pseudomonas
  • yeast e.g., Saccharomy
  • suitable expression vectors are generally commercially available (e.g., from suppliers such as Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega, etc.), available from depository institutions such as the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.), or have been the subject of numerous publications describing their sequence, structures and methods of production, so that the skilled person can apply them without difficulty.
  • the invention is particularly concerned with the production of phloroglucinol in yeasts, and the vector used in the invention is therefore advantageously suitable and even optimized for the transfection of yeasts.
  • the vector used in the invention may in particular advantageously be a plasmid vector suitable for the transfection of yeasts.
  • plasmid vectors suitable for the transfection of yeasts include, without limitation, pREP4, pCEP4 (Invitrogen), pCI (Promega), pV ⁇ X (Invitrogen), pgWiz (Gene Therapy System Inc), and YCplac22 ( ⁇ TCC 87585), as well as any derivative of these vectors (in particular a derivative of YCplac22 in which the pair (PGK promoter and CYC terminators) and the pair (TEF1 promoter and ⁇ DH1 terminator) have been integrated), but any other vector suitable for transfection of yeasts may be used.
  • the host cell used in the invention may be any host cell expressing any polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above. It may in particular be selected from host cells comprising an isolated nucleic acid molecule as defined above or a vector as defined above.
  • a host cell is a cell containing a heterologous nucleic acid molecule.
  • the heterologous nucleic acid molecule corresponds to the isolated nucleic acid molecule as defined above or to the vector as defined above.
  • the host cell used may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • the prokaryotic cells it may be chosen from bacteria.
  • the eukaryotic cells it may be chosen from yeast cells, fungal cells, algal cells, insect cells, plant cells or non-human mammalian cells).
  • the host cell used is preferably a yeast, said yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida, Eremothecium, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Lodderomyces, Yarrowia, Zi osaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus and Malassezia.
  • yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida, Eremothecium, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Lodderomyces, Yarrowia, Zi osaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus and Malassezia.
  • the yeast is selected from the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zi osaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa and Torulaspora glabrata.
  • the yeast is of the genus Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • the host cell used may also be a bacterium, said bacterium being in particular selected from among the proteobacteria, the actinomycete bacteria and the Firmicutes bacteria.
  • the host cell may advantageously be chosen from among the genera Escherichia (in particular among the strains of the species Escherichia coli, the species most used for the production of recombinant proteins) and Pseudomonas.
  • the actinomycete bacteria the host cell may advantageously be chosen from among the genera Streptomyces and Corynebacterium.
  • the host cell may advantageously be chosen from among the genera Bacillus and Lactobacillus.
  • the host cell used comprises at least one copy of the isolated nucleic acid molecule as defined above integrated into its genome. It may in particular comprise a single copy of the isolated nucleic acid molecule as defined above integrated into its genome.
  • the copy(ies) of the nucleic acid molecule may be integrated at different loci, preferentially at the UR ⁇ 3 locus, at the JLP1 locus, at the LEU2 locus, or at the TRP1 locus of the genome of said yeast cell.
  • the host cell is a yeast cell and several copies of the nucleic acid molecule are integrated, the different copies may be integrated at the same locus, or at different loci, preferentially at any of the combinations of the UR ⁇ 3, JLP1, LEU2, and/or TRP1 loci.
  • the codons used in the nucleic acid molecule encoding the polypeptide selected from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi included in the host cell or in the vector included in the host cell have been adapted for optimal expression in the selected host cell.
  • optimal expression can be obtained when the codons chosen to encode the amino acid sequence are those preferentially used by the organism of origin of the host cell.
  • the person skilled in the art will be able to find which codons are to be favored in the literature or by using codon optimization software.
  • codon optimization software for yeast can also be used for other types of host cells.
  • the codons used in the nucleic acid molecule encoding the polypeptide selected from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi included in the host cell or in the vector included in the host cell have advantageously been adapted for optimal expression in yeasts, and in particular in yeasts of the genus Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • the host cells can be cultured in aerobic or anaerobic bioreactors, on a small and large scale, in flasks or Petri dishes.
  • the culture can be carried out at a temperature, pH, culture medium and oxygen content appropriate for a given host cell.
  • yeasts and more particularly for Saccharomyces cerevisiae
  • the culture is advantageously carried out by any suitable method.
  • the methods for culturing a Saccharomyces cerevisiae strain are known in the art, and the person skilled in the art knows how to optimize the culture conditions for each strain according to its nature.
  • yeast Technology 2nd Edition, 1991, Reed and Nagodawithana, published by Van Nostrand Reinhold (ISBN 0-442-31892-8).
  • the cultivation of a yeast strain in particular of the species Saccharomyces cerevisiae, can generally be carried out at a temperature between 20 and 37°C, in a rich liquid medium (for example the YPD medium available from VWR) or synthetic (defined to precisely meet the needs of the strain), in aerobic or anaerobic culture.
  • a rich liquid medium for example the YPD medium available from VWR
  • synthetic defined to precisely meet the needs of the strain
  • polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi is used to produce phloroglucinol, regardless of the production method used.
  • the person skilled in the art will be able to choose the most appropriate between the polypeptide chosen from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi, the molecule nucleic acids encoding it, the vector comprising a nucleic acid molecule encoding it or the host cell expressing it, each as defined above.
  • polypeptide selected from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as described above can be used directly to produce phloroglucinol in vitro, provided that it is brought into contact with malonyl-CoA.
  • the phloroglucinol synthases carry out the condensation of three molecules of malonyl-CoA to form a molecule of phloroglucinol according to the reaction scheme Reaction I previously described.
  • the nucleic acid molecule encoding it and the vector comprising a nucleic acid molecule encoding it can be used to transfect a host cell, which can then be used either to produce the polypeptide (which can then produce phloroglucinol in vitro) or to directly produce phloroglucinol when cultured in the presence of a suitable substrate (such as a carbon source such as glucose or ethanol).
  • a suitable substrate such as a carbon source such as glucose or ethanol.
  • the invention also relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above, characterized in that: a) the isolated nucleic acid molecule further comprises a promoter controlling the expression of the nucleic acid sequence; or b) the isolated nucleic acid molecule further comprises a transcription terminator controlling the expression of the nucleic acid sequence; or c) the nucleic acid sequence is further optimized for expression in a host cell, in particular in a yeast or in a bacterium; or (d) any combination of (a) to (c).
  • Such isolated nucleic acid molecules are useful either for the production of a polypeptide selected from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above, or for directly producing phloroglucinol when transfected (directly or within a vector) into a host cell, cultured in the presence of an appropriate substrate.
  • the isolated nucleic acid molecule further comprises a promoter controlling expression of the nucleic acid sequence.
  • the isolated nucleic acid molecule further comprises a transcription terminator controlling expression of the nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid sequence is further optimized for expression in a host cell, in particular in a yeast or in a bacterium, advantageously in a yeast.
  • the isolated nucleic acid molecule may combine several of the features a) to c).
  • the isolated nucleic acid molecule may be characterized in that: d) the isolated nucleic acid molecule further comprises a promoter and a transcription terminator controlling the expression of the nucleic acid sequence (combination of a) and b)); e) the isolated nucleic acid molecule further comprises a promoter controlling the expression of the nucleic acid sequence and the nucleic acid sequence is further optimized for expression in a host cell, in particular in a yeast or in a bacterium, advantageously in a yeast (combination of a) and c)); f) the isolated nucleic acid molecule further comprises a transcription terminator controlling the expression of the nucleic acid sequence and the nucleic acid sequence is further optimized for expression in a host cell, in particular in a yeast or in a bacterium, advantageously in a yeast (combination of b) and c)); or g) the isolated nucle
  • the promoter is advantageously an exogenous promoter, in particular a yeast promoter, and preferably a promoter selected from ⁇ DH2 (p ⁇ DH2), CCW12 (pCCW12) and TEF1 (pTEF1), more preferably a promoter selected from ⁇ DH2 (p ⁇ DH2) of Saccharomyces cerevisiae, CCW12 (pCCW12) of S. cerevisiae, and TEF1 (pTEF1) of S. cerevisiae, more preferably a promoter selected from ⁇ DH2 of sequence SEQ ID NO: 20, CCW12 of sequence SEQ ID NO: 21 and TEF1 of sequence SEQ ID NO: 22.
  • the transcription terminator is advantageously an exogenous terminator, such as a yeast terminator, and preferably the RPL3 terminator (tRPL3) or the ⁇ DH1 terminator (t ⁇ DH1), more preferably the S. cerevisiae RPL3 terminator or the S. cerevisiae ⁇ DH1 terminator, more preferably the RPL3 terminator of sequence SEQ ID NO: 23 or the ⁇ DH1 terminator of sequence SEQ ID NO: 24.
  • nucleic acid sequence is further optimized for expression in yeast (embodiments c), e), f), and g) above), it is advantageously optimized for expression in yeast of the genus Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae. In particular, it is advantageously selected from SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 27.
  • nucleic acid sequence is further optimized for expression in a bacterium (embodiments c), e), f), and g) above), it is advantageously optimized for expression in a bacterium of the genera Escherichia (in particular strains of the species Escherichia coli, the species most used for the production of recombinant proteins) and Pseudomonas.
  • the invention also relates to a vector comprising a nucleic acid molecule according to the invention.
  • the vector according to the invention may comprise any nucleic acid molecule according to the invention described above. It may be chosen from any type of vector described previously in the section targeting the vectors likely to be used in the use according to the invention.
  • the invention also relates to a host cell comprising a nucleic acid molecule according to the invention, or a vector according to the invention.
  • the host cell according to the invention may comprise any nucleic acid molecule according to the invention described above or any vector according to the invention as described above. It may further comprise any characteristic or combination of characteristics described previously in the section relating to the host cells capable of being used in the use according to the invention.
  • the present invention further relates to a method for producing a polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above.
  • the method for producing such a polypeptide comprises, essentially consists of, or consists of the following steps:
  • nucleic acid molecule or vector comprising a nucleic acid molecule as described above (nucleic acid molecule or vector used in or according to the invention) into a suitable host cell in accordance with the foregoing description;
  • the method for producing such a polypeptide comprises, essentially consists of, or consists at least of the step consisting of:
  • a host cell expressing said polypeptide for example a host cell as described above (host cell used in the invention or according to the invention), under conditions allowing the expression of the nucleic acid molecule contained in said host cell, so as to produce said polypeptide.
  • Step (i) of introducing the nucleic acid molecule or vector into a suitable host cell may be carried out by any suitable method known to a person skilled in the art, such as transfection by calcium phosphate, transfection by liposomes comprising the nucleic acid molecule or vector to be transfected, transfection by polycationic agents, electroporation, and transfection by heat shock.
  • step (i) may be carried out by transfection (by any method described above) into the host cell of a transfer plasmid comprising the sequence coding for the polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above, flanked in 5' and 3' by sequences homologous to genomic sequences of the host cell, thus allowing homologous recombination between the transfer plasmid and the genome of the host cell.
  • This method is particularly applicable when the host cell is a yeast, in particular Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae, or a bacterium.
  • Step (ii) of in vitro culture of the host cell is carried out under conditions allowing the expression of the nucleic acid molecule contained in said host cell, so as to produce said polypeptide.
  • These conditions vary depending on the host cell used and the person skilled in the art will be able to determine them on the basis of his general knowledge.
  • the host cell is a yeast, in particular Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae
  • step (ii) can be carried out by any appropriate method, in particular as described in the section above concerning the host cells used in the use according to the invention.
  • the method for producing the polypeptide may further comprise at least one additional step selected from the following steps:
  • step (a) recovering the host cells expressing said polypeptide and/or the supernatant comprising the polypeptide, obtained after the culture step; and (B) purification of the polypeptide from the host cells and/or supernatant recovered in step (a).
  • the optional step (a) of recovering the host cells expressing said polypeptide and/or the supernatant comprising the polypeptide can be carried out by any appropriate technique known to the person skilled in the art.
  • the cells and the supernatant can in particular be separated by decantation or centrifugation.
  • step (B) of purifying the polypeptide from the host cells and/or the supernatant recovered in step (a) can be carried out by any suitable technique known to the person skilled in the art.
  • any liquid phase protein purification technique can be used, such as for example the different types of chromatography (gel filtration, ion exchange, by hydrophobic interaction, by affinity when the protein comprises an affinity tag, high performance liquid chromatography “HPLC”).
  • the purification further comprises one or more prior step(s) of lysis of the cells and optionally of removal of the cellular debris, before the use of a liquid phase purification technique.
  • nucleic acid molecule encoding the polypeptide selected from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as described above and the vector comprising a nucleic acid molecule encoding this polypeptide can be used to transfect a host cell, which can then be used either to produce the polypeptide (which can then produce phloroglucinol in vitro) or to directly produce phloroglucinol when cultured in the presence of an appropriate substrate.
  • the method for producing phloroglucinol uses a host cell expressing the polypeptide chosen from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above (for example a host cell according to the invention), which is cultured in the presence of a substrate suitable for producing phloroglucinol.
  • This embodiment can be subdivided into two sub-embodiments, depending on whether the method comprises (embodiment M1A) or not (embodiment M1 B) a prior step of obtaining the host cells.
  • the invention relates to a method for producing phloroglucinol which comprises, consists essentially of, or consists of the following steps:
  • nucleic acid molecule or vector comprising a nucleic acid molecule as described above (nucleic acid molecule or vector used in the invention or according to the invention) into a suitable host cell in accordance with the preceding description;
  • step (ii1) contacting the host cells obtained in step (ii) with an appropriate substrate;
  • step (iii1) in vitro culture of the host cell of step (ii1) under conditions allowing the expression of the nucleic acid molecule contained in said host cell, so as to produce phloroglucinol;
  • step (iv1) optionally recovering the culture medium comprising phloroglucinol, obtained after step (iii1);
  • step (v1) optionally, purification of phloroglucinol from the culture medium of step (iv1).
  • the invention relates to a method for producing phloroglucinol, which comprises, consists essentially of, or consists of the following steps:
  • step (iii1) in vitro culture of the host cell of step (ii1) under conditions allowing the expression of the nucleic acid molecule contained in said host cell, so as to produce phloroglucinol;
  • step (iv1) optionally recovering the culture medium comprising phloroglucinol, obtained after step (iii1);
  • step (v1) optionally, purification of phloroglucinol from the culture medium of step (iv1).
  • the host cell is a yeast (in particular of the genus Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae):
  • step (ii) of introducing the nucleic acid molecule or vector into a suitable host cell may be carried out by any method described herein in the context of step (i) of the methods of producing the polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as described above.
  • the substrate brought into contact with the host cell in step (ii1) is advantageously a carbon source.
  • the carbon source is a pure carbon source or an industrial co-product (such as molasses or poor sewage, for example from the sugar industry).
  • the substrate in the pure carbon source or the industrial co-product is a simple sugar, such as glucose (or dextrose), fructose, galactose, mannose, sucrose, lactose, or maltose; a complex sugar, such as a monosaccharide, a disaccharide or trisaccharides, or a polysaccharide such as starch; an alcohol, such as ethanol; an acid; a fatty acid and an ester derivative thereof; or a mixture of sugars, alcohols, acids and/or fatty acids or their ester derivatives.
  • the substrate is glucose or ethanol.
  • step (iii1) of in vitro culture of the host cell under conditions allowing the expression of the nucleic acid molecule contained in said host cell, so as to produce phloroglucinol can be carried out by any method described here in the context of step (ii) of the methods of production of the polypeptide chosen from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as described above.
  • step (iv1) of recovering the culture medium comprising the phloroglucinol can be carried out by any technique described here for the separation of the cells and the supernatant in the context of the optional step (a) of the methods of producing the polypeptide chosen from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as described above.
  • step (v1) of purification of phloroglucinol from the culture medium can be carried out by any appropriate technique, such as liquid-liquid extraction.
  • polypeptide selected from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as described above can be used directly to produce phloroglucinol in vitro, provided that it is brought into contact with malonyl-CoA.
  • phloroglucinol synthases carry out the condensation of three molecules of malonyl-CoA to form a phloroglucinol molecule according to the reaction scheme Reaction I previously described.
  • the method for producing phloroglucinol uses the polypeptide selected from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as described above to produce phloroglucinol in vitro in the presence of malonyl-CoA.
  • This embodiment can be subdivided into two sub-embodiments, depending on whether the method comprises (embodiment M2A) or not (embodiment M2B) a prior step of producing the polypeptide selected from the type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi as defined above.
  • the invention relates to a method for producing phloroglucinol, which comprises, consists essentially of, or consists of the following steps:
  • step (ii2) bringing the polypeptide obtained in step (i2) of the method as described above into contact with malonyl-CoA;
  • step (iii2) incubating the mixture from step (ii2) under conditions suitable for producing phloroglucinol
  • step (iv2) optionally the recovery of the reaction medium comprising phloroglucinol, obtained after step (iii2);
  • step (v2) optionally, the purification of phloroglucinol from the reaction medium of step (iv2).
  • the invention relates to a method for producing phloroglucinol, which comprises, consists essentially of, or consists of the following steps:
  • step (iii2) incubating the mixture from step (ii2) under conditions suitable for producing phloroglucinol
  • step (iv2) optionally the recovery of the reaction medium comprising phloroglucinol, obtained after step (iii2); and (v2) optionally, the purification of phloroglucinol from the reaction medium of step (iv2).
  • yeast in particular of the genus Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae:
  • step (i2) can be carried out by any method described herein for producing a polypeptide selected from type III polyketide synthases of Ascomycetes fungi.
  • step (ii2) consists in bringing the polypeptide into contact with its substrate malonyl-CoA to allow the production of phloroglucinol.
  • This contacting is carried out in a medium and at a temperature which do not alter the enzymatic activity of the polypeptide.
  • a suitable medium may in particular be chosen from a sodium phosphate buffer at pH 7 (in particular at a concentration of approximately 25-75 mM) comprising NaCl (in particular at a concentration of approximately 5-15 mM) and bovine serum albumin (BSA, in particular at a concentration of approximately 150-250 mg/L).
  • a suitable temperature is in the range 20 to 37 °C.
  • step (iii2) consists in incubating the polypeptide and its substrate under conditions allowing the production of phloroglucinol. These conditions involve a medium and an incubation temperature which do not alter the enzymatic activity of the polypeptide, as described above for step (ii2).
  • the incubation time is chosen according to the amount of substrate present in the medium. The person skilled in the art will know how to adapt the initial concentration of substrate to the incubation time. It may also be envisaged to add substrate during the incubation time to continue the production of phloroglucinol.
  • step (iv2) of recovery of the reaction medium does not require any particular technique since there are no cells to exclude or lyse before purification.
  • step (v2) of purification of phloroglucinol from the culture medium can be carried out by any appropriate technique, such as liquid-liquid extraction.
  • PhlDs are type III polyketide synthases (PKSs) involved in the biocatalytic synthesis of phloroglucinol from three molecules of malonyl-CoA molecules (Zha et al., 2006).
  • PPSs type III polyketide synthases
  • sequence similarity network (SSN; Gerlt, et al., 2015), with each cluster corresponding to a different phylum or class.
  • SSNs are useful for analyzing sequence datasets and studying sequence-function relationships.
  • SSN is a convenient way to visualize the relationships between protein sequences by constructing a graph where each member of a protein family is represented by a node connected by an edge to the nodes of all other members that share a sequence similarity greater than a user-specified value.
  • These graph networks are easy to visualize and are more easily interpretable than traditional dendrogram and phylogenetic tree approaches. This representation makes it easier to assign a putative function to a protein in a given cluster if a member has already been characterized and to track evolutionary relationships between clusters.
  • sequence clusters from different classes were generated with an E value ⁇ 1 O' 130 .
  • Using a stricter threshold score (E value ⁇ 10 170 ) allowed to separate a cluster containing type III PKSs from the genus Tsukamurella, also known to have high phloroglucinol production activity in S. cerevisiae (W02019/002799).
  • Example 2 Sequences of three type III polyketide synthases from Ascomycetes fungi identified in Example 1
  • polypeptides of amino acid sequences SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3 are among the 23 sequences selected in Example 1 and all three are from Ascomycete fungi.
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to the amino acid sequence of a PhlD of Hirsutella minnesotensis 3608 (denoted PlhD-Hm2);
  • SEQ ID NO:2 corresponds to the amino acid sequence of a PhlD of Hirsutella minnesotensis 3608 (denoted PlhD-Hm1);
  • SEQ ID NO:3 corresponds to the amino acid sequence of a PhlD of Aspergillus tanneri (denoted PlhD-At). A multiple alignment of their amino acid sequences is shown in Figure 1.
  • Table 3 above shows that the 3 sequences newly identified as possible phloroglucinol synthases have only low sequence identity with the sequences of previously identified phloroglucinol synthases, and belong to a different kingdom (fungi versus bacteria or eukaryotic algae).
  • Example 3 Ability of type III polyketide synthases from Ascomycetes fungi to produce phloroglucinol in yeast
  • the 3 previously identified putative phloroglucinol synthases (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3) were tested for their ability to produce phloroglucinol when expressed by a yeast of the species Saccharomyces cerevisiae. Their activity was further compared to that of prior art PHLDs.
  • the nucleic sequences SEQ ID NO: 25 to 27 encoding respectively the 3 putative phloroglucinol synthases previously identified (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) were modified by adding to their 5' and 3' ends respectively sequences homologous to the desired site of integration into the genome of S. cerevisiae CEN.PK2-1 D yeast cells, leading to the sequences SEQ ID NO: 28 to 30.
  • the sequences SEQ ID NO: 31 to 33 which include sequences homologous to the desired site of integration into the genome, were used.
  • sequences SEQ ID NO: 28 to 33 were then cloned into a plasmid called “PBIM5” or “YCplac22_PGK_CYC_TEF_ ⁇ DH” (derived from the commercial plasmid YCplac22 by addition of the pair (PGK promoter and CYC terminator, see Gietz RD et al., 1988) as well as the pair (TEF1 promoter and ⁇ DH1 terminator), see Figure 2), under the control of the TEF1 promoter and the ⁇ DH1 terminator.
  • the sequences SEQ ID NO: 28 to 33 were then integrated into the genome of S. cerevisiae CEN.PK2-1 D yeast cells by in vivo homologous recombination, and the cloned sequences verified by Sanger sequencing.
  • a single cell clone obtained as described above was collected and inoculated into a well.
  • the plate was incubated at 30°C for approximately 20 hours at 800 rpm in a shaking incubator. The following day, a new 96-well plate filled with 500 ⁇ l of complete synthetic medium was inoculated with 10 ⁇ l of culture. Three individual plates were inoculated for 24-, 48-, and 72-hour samplings.
  • the absorbance was measured in the microtiter plate at 600 nm in the Tecan plate reader. For this, 20 ⁇ l of culture was diluted with 180 ⁇ l of milliQ water.
  • the 96-well plate was centrifuged at 3700 rpm for 10 minutes and the supernatant was used for the colorimetric assay.
  • -150 ⁇ l of 500 mg/L 4-hydroxy-3-methyoxycinnamaldehyde in HCl/EtOH v:v (1:3) were added to the sample and the Phloroglucinol standard. Incubation was performed at room temperature for 30 min.
  • Table 4 shows that the 3 previously identified putative phloroglucinol synthases (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3), although derived from Ascomycetes fungi, are capable of producing phloroglucinol when expressed in yeast.
  • Gietz RD Sugino A. New yeast Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene 74:527-534, 1988.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, d'une molécule d'acides nucléiques codant pour celui-ci, d'un vecteur comprenant une molécule d'acides nucléiques codant pour celui-ci ou d'une cellule hôte exprimant celui-ci, pour produire du phloroglucinol. L'invention concerne également des molécules d'acides nucléiques particulières codant pour une polykétide synthases de type III de cyanobactéries, des vecteurs et des cellules hôtes, ainsi que des méthodes de production de phloroglucinol.

Description

DESCRIPTION
TITRE : Utilisation de polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes comme phloroglucinol synthases
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se situe dans les domaines de la biochimie microbienne et plus particulièrement dans le domaine de la synthèse par des enzymes microbiennes du phloroglucinol. Elle concerne l’utilisation de polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes comme phloroglucinol synthases, des méthodes de production de phloroglucinol associées, ainsi que des acides nucléiques, vecteurs et cellules hôtes destinés à la production de phloroglucinol.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Le phloroglucinol est un composé organique aromatique utilisé notamment dans la fabrication de produits pharmaceutiques et d’explosifs.
La synthèse de phloroglucinol est catalysée par certaines polykétide synthases de type III appelées phloroglucinol synthases. Les phloroglucinol synthases réalisent la condensation de trois molécules de malonyl-CoA pour former une molécule de phloroglucinol selon le schéma réactionnel suivant (Réaction I):
Figure imgf000002_0001
Réaction I
De nombreux oligomères peuvent ensuite être synthétisés à partir du phloroglucinol, tels que les phlorotannins. Les phlorotannins incluent notamment les fucols, les phloretols et les fucophloretols, qui sont des produits dérivés du phloroglucinol composant la paroi des algues brunes. En outre, diverses activités protectrices des algues brunes ont également été attribuées aux phlorotannins.
La synthèse naturelle de phloroglucinol a été décrite initialement chez les bactéries Gram- Pseudomonas fluorescens (Àchkar et al., 2005 ; Zha et al., 2006) et chez l’algue brune Ectocarpus siliculosus (Meslet-Cladière et al., 2013). L’enzyme phloroglucinol synthase impliquée dans la synthèse du phloroglucinol a été identifiée chez ces deux espèces.
Chez Pseudomonas fluorescens, la phloroglucinol synthase est codée par le gène PHLD (Àchkar et al., 2005 ; Zha et al., 2006). L’activité de phloroglucinol synthase de PHLD a pu être démontrée chez Escherichia coli exprimant un gène PHLD hétérologue (Àchkar et al., 2005). Cette activité a été confirmée in vitro, par des tests enzymatiques à petite échelle réalisés avec une PHLD recombinante exprimée et purifiée à partir de cultures d’Escherichia coli (Zha et al., 2006).
Chez Ectocarpus siliculosus, la phloroglucinol synthase est codée par le gène PKS1 (Meslet- Cladière et al., 2013). L’activité de phloroglucinol synthase de PKS1 a été démontrée in vitro, à partir de PKS1 recombinante exprimée et purifiée chez Escherichia coli et à partir d’extraits cellulaires d’£. siliculosus (Meslet-Cladière et al., 2013, WO 2013/045510).
Toutefois, les enzymes PHLD et PKS1 présentent des activités enzymatiques faibles. En outre, il a été montré que les enzymes PHLD de Pseudomonas fluorescens et PKS1 de Ectocarpus siliculosus ne produisent pas ou peu de phloroglucinol lorsque ces séquences sont exprimées chez la levure au lieu de chez Escherichia coli (WO2019/002799 ; WO2019/002798). Or, les systèmes eucaryotes peuvent être avantageux, notamment pour des productions à grande échelle. Ils permettent en effet l’obtention d’enzymes pouvant être modifiées au niveau post-traductionnel.
WO2019/002799 et WO2019/002798 décrivent des phloroglucinol synthases capables de synthétiser du phloroglucinol à un niveau bien plus élevé que la PKS1 de Ectocarpus siliculosus lorsque des séquences codant pour ces enzymes sont transfectées chez la levure. Ces phloroglucinol synthases sont issues de bactéries actinomycètes (WO2019/002799) ou d’algues eucaryotes (WO2019/002798).
Il existe cependant un besoin pour d’autres phloroglucinol synthases capables de synthétiser du phloroglucinol à haut niveau, notamment lorsque des séquences codant pour ces enzymes sont transfectées dans une cellule hôte, en particulier chez la levure.
Cependant, les polykétide synthases de type III sont une vaste classe d’enzymes rassemblant des protéines présentant des similarités de séquences tout en présentant des activités enzymatiques très dissemblables (Meslet-Cladière et al., 2013). Ainsi, l’activité phloroglucinol synthase n’est que l’une des multiples activités susceptibles d’être présentes chez une polykétide synthase de type III et seule une faible proportion des polykétide synthase de type III possède donc une activité phloroglucinol synthase. En outre, aucun motif de séquence associé à l’activité phloroglucinol synthase n’a été décrit, rendant l’identification des polykétide synthases de type III possédant une telle activité particulièrement difficile.
EXPOSE DE L'INVENTION
De manière surprenante, car des gènes codant pour des phloroglucinol synthases n’avaient jusqu’ici été identifiés que chez les bactéries et les algues, les Inventeurs ont toutefois pu identifier de nouvelles phloroglucinol synthases issues de champignons Ascomycètes, capables de synthétiser du phloroglucinol à un niveau intéressant lorsque des séquences codant pour ces enzymes sont transfectées dans une cellule hôte, en particulier chez une levure ou chez une bactérie.
Ainsi, selon un premier aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, d’une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci, d’un vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci ou d’une cellule hôte exprimant celui-ci, pour produire du phloroglucinol.
Selon un deuxième aspect, l’invention concerne une molécule d’acides nucléiques isolée comprenant une séquence d’acides nucléiques codant pour un polypeptide tel que défini dans l’utilisation selon l’invention, caractérisée en ce que : a) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques ; ou b) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques ; ou c) la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, en particulier dans une levure ou dans une bactérie ; ou d) toute combinaison de a) à c).
Selon un troisième aspect, l’invention concerne un vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ledit vecteur étant de préférence un plasmide.
Selon un quatrième aspect, l’invention concerne une cellule hôte comprenant une molécule d’acides nucléiques selon l’invention ou un vecteur selon l’invention.
Selon un cinquième aspect, l’invention concerne une méthode pour produire du phloroglucinol, comprenant les étapes consistant en :
(i) la mise en contact d’une cellule hôte exprimant le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini dans l’utilisation selon l’invention, par exemple une cellule hôte selon l’invention, avec un substrat approprié ;
(ii) la culture in vitro de la cellule hôte de l’étape (i) dans des conditions permettant la croissance de ladite cellule hôte et/ou l’expression de la molécule d’acides nucléiques contenue dans ladite cellule hôte, de manière à produire du phloroglucinol ;
(iii) optionnellement la récupération du milieu de culture comprenant le phloroglucinol, obtenu après l’étape (ii) ; et (iv) optionnellement, la purification du phloroglucinol à partir du milieu de culture de l’étape (iii).
Selon un sixième aspect, l’invention concerne une méthode pour produire du phloroglucinol, comprenant les étapes consistant en :
(i) la mise en contact d’un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini dans l’utilisation selon l’invention avec du malonyl-CoA ;
(ii) l’incubation du mélange issu de l’étape (i) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol ;
(iii) optionnellement la récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol, obtenu après l’étape (ii) ; et
(iv) optionnellement, la purification du phloroglucinol à partir du milieu réactionnel de l’étape (iii).
DESCRIPTION DES FIGURES
[Fig. 1] La figure 1 représente l’alignement des séquences d’acides aminés SEQ ID NO :1 (PhlD de Hirsutella minnesotensis 3608 dénotée PlhD-Hm2), SEQ ID NO :2 (PhlD de Hirsutella minnesotensis 3608 dénotée PlhD-Hm1 ) et SEQ ID NO :3 (PhlD d’ Aspergillus tanneri dénotée PlhD-At).
[Fig. 2] la figure 2 représente la carte du plasmide PBIM5 utilisé dans les exemples.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définitions
Par « un » ou « une », on entend un/une ou plusieurs. Autrement dit, lorsqu’on utilise « un » ou « une » vis-à-vis d’une caractéristique, on couvre à la fois les modes de réalisation avec une seule fois la caractéristique d’intérêt et ceux avec plusieurs fois la caractéristique d’intérêt. En d’autres termes, sauf indication contraire (comme « un seul » ou « un unique » ou « seulement un »), « un(e) » est utilisé comme synonyme de « un(e) ou plusieurs » ou « au moins un(e) ».
Dans le présent document, lorsqu’ils sont utilisés pour définir des produits, des compositions et des méthodes, les termes « comprenant » (et toute forme de « comprenant », telle que « comprend »), « ayant » (et toute forme de « ayant », telle que « a »), « incluant » (et toute forme d’inclusion, telle que « inclut ») ou « contenant » (et toute forme de « contenant », telle que « contient ») sont ouverts et n’excluent pas des éléments ou des étapes de méthode supplémentaires, non mentionnés. Ainsi, un polypeptide « comprend » une séquence d'acides aminés lorsque la séquence d'acides aminés fait partie de la séquence finale d'acides aminés du polypeptide. Un tel polypeptide peut avoir jusqu'à plusieurs centaines de résidus d'acides aminés supplémentaires. Par « consistant essentiellement en » ou « constitué essentiellement de », on entend l'exclusion d'autres composants ou étapes d'une quelconque importance essentielle. Ainsi, un polypeptide "consiste essentiellement en" une séquence d'acides aminés lorsqu'une telle séquence d'acides aminés est présente avec éventuellement seulement quelques résidus d'acides aminés supplémentaires (par exemple, un peptide d’au plus 20 acides aminés, tel qu’une étiquette de 6 histidines Hisxô, peut en outre être présent). « Consistant en » ou « constitué de » signifie excluant plus que des traces d'autres composants ou étapes. Par exemple, un polypeptide "consiste en" une séquence d'acides aminés lorsque le polypeptide ne contient pas d'autres acides aminés que la séquence d'acides aminés indiquée.
Par « polykétide synthase de type III », on entend une enzyme multifonctionnelle ou un complexe enzymatique produisant des polykétides et qui n’utilise pas de domaine de protéine porteuse d'acyle (ou ACP, pour « acyl carrier protein »).
Par « polykétide », on entend une grande famille de métabolites secondaires chez les bactéries, les mycètes, les plantes et certaines lignées d'animaux qui proviennent de la condensation itérative de sous-unités acétyle ou malonyle par des enzymes polykétide- synthases. Les polykétides servent également de matières premières pour la fabrication d’un éventail large de produits naturels et semi-synthétiques.
Par « phloroglucinol », on entend un composé organique aromatique benzène- 1,3,5- triol présentant la formule chimique suivante (Formule I) :
Figure imgf000006_0001
Formule !
Par « phloroglucinol synthase », on entend une enzyme multifonctionnelle ou un complexe enzymatique appartenant à la famille des polykétide synthases de type III et catalysant la synthèse du phloroglucinol. Une phloroglucinol synthase catalyse la condensation de trois molécules de malonyl-CoA pour former une molécule de phloroglucinol. Par « activité enzymatique » ou « activité catalytique » ou encore « activité » d’une enzyme, on entend l’efficacité d’une enzyme à convertir un substrat en produit dans un environnement donné. L’efficacité de l’enzyme prend en compte ici la vitesse de conversion du substrat en produit par l’enzyme et le taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme. Par « taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme » on entend ici le ratio entre la quantité de produit final obtenu par rapport à la quantité initiale de substrat pour une quantité définie d’enzyme. Par exemple, une activité enzymatique au sens de l’invention peut être exprimée en quantité de phloroglucinol produit dans un volume donné (en g/L).
Par « champignon », on entend un organisme unicellulaire ou multicellulaire du règne Fungi. Ce règne comprend plusieurs divisions, dont celle des Ascomycètes, également appelés champignons supérieurs, c'est-à-dire à mycélium cloisonné. La division des Ascomycètes comprend plusieurs sous-divisions, dont celle des Pezizomycotina, comprenant des champignons filamenteux. Cette sous-division comprend notamment les familles Ophiocordycipitaceae (qui comprend notamment le genre Hirsutella) et Trichocomaceae (qui comprend notamment le genre Aspergillus). Le genre Hirsutella comprend notamment l’espèce Hirsutella minnesotensis 3608. Le genre Aspergillus comprend notamment les espèces Aspergillus tanneri, Aspergillus aculeatus (notamment les souches ÀTCC 16872 / CBS 172.66 / WB 5094), Aspergillus arachidicola, Aspergillus awamori, Aspergillus bertholletiae, Aspergillus bombycis, Aspergillus brasiliensis (notamment les souches CBS 101740 / IMI 381727 / IBT 21946), Aspergillus caelatus, Aspergillus calidoustus, Aspergillus homomorphus (notamment la souche CBS 101889), Aspergillus leporis, Aspergillus luchuensis (notamment la souche CBS 106.47), Aspergillus minisclerotigenes, Aspergillus niger (notamment les souches ÀTCC 1015 / CBS 113.46 / FGSC À1144 / LSHB Àc4 / NCTC 3858a / NRRL 328 / USDÀ 3528.7, CBS 513.88 / FGSC À1513), Aspergillus nomiae NRRL 13137, Aspergillus novoparasiticus, Aspergillus oryzae (notamment les souches ÀTCC 42149 / RIB 40), Aspergillus parasiticus (notamment les souches ATCC 56775 / NRRL 5862 / SRRC 143 / SU-1 ), Aspergillus pseudonomiae, Aspergillus pseudotamarii, Aspergillus steynii IBT 23096, Aspergillus tamarii, Aspergillus uvarum CBS 121591 , Aspergillus violaceofuscus (notamment la souche CBS 115571 ), et Aspergillus welwitschiae. La division des Ascomycètes comprend également les sous-divisions Taphrinomycotina et Saccharomycotina. La sous-division Saccharomycotina comprend l’ordre Saccharomycetales (levures bourgeonnantes), qui comprend les genres Saccharomyces (inclut notamment les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, et Saccharomyces bayanus), Candida, Eremothecium, Dekkera (inclut notamment les espèces Dekkera brucelensis et Dekkera intermedia), Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Lodderomyces, Yarrowi , Zigosaccharomyces (inclut notamment l’espèce Zi osaccharomyces bailii), Torulaspora (inclut notamment les espèces Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata), Kluyveromyces (inclut notamment l’espèce Kluyveromyces themotolerens), et Brettanomycces (inclut notamment les espèces Brettanomycces custersii et Brettanomycces intermedius). La sous- division Taphrinomycotina comprend la classe Schizosaccharomycetes (levures qui se reproduisent par fission, qui comprend notamment le genre Schizosaccharomyces qui inclut notamment l’espèce Schizosaccharomyces pombe). Le règne fungi comprend également la division Basidiomycota, qui comprend les genres de levures Cryptococcus et Malassezia.
Par « PHLD.Pf », on entend indifféremment le gène codant pour la phloroglucinol synthase PH LD de Pseudomonas fluorescens, ou le polypeptide codé par ce gène.
Par « PKS1.Es » ou « PHLD.Es », on entend indifféremment le gène codant pour la phloroglucinol synthase PKS1 d’Ectocarpus siliculosus, ou le polypeptide codé par ce gène.
« PhlD » ou « PHLD » désigne ici un gène candidat codant pour une enzyme phloroglucinol synthase candidate, ou le polypeptide codé par ce gène. Selon la nomenclature choisie par les Inventeurs, « PhlD.ii » ou « PHLD.ii » désigne ici le gène candidat ou le polypeptide candidat issu d’un organisme donné. Les lettres « ii » représentent les initiales du genre et de l’espèce auxquels ledit organisme appartient. Par exemple, PhlD.Hm correspond à une enzyme phloroglucinol synthase candidate d’une espèce Hirsutella minnesotensis, et PhlD. At correspond à une enzyme phloroglucinol synthase candidate d’une espèce Aspergillus tanneri. Un nombre peut suivre les initiales lorsque plusieurs enzymes phloroglucinol synthases candidates ont été identifiées chez la même espèce.
Par « acides aminés apolaires » ou « acides aminés non polaires », on entend une famille d’acides aminés dont les positions moyennes des charges partielles positives et négatives sont confondues. Parmi les 20 acides aminés conventionnels, les acides aminés apolaires sont les suivants : la glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), tryptophane (W), phénylalanine (F), tyrosine (Y), méthionine (M) et cystéine (C). Ceux autres que la glycine (G) peuvent être subdivisés en trois sous-familles : 1 ) les « acides aminés apolaires aliphatiques », qui possèdent une chaîne latérale de type aliphatique et incluent l’alanine (A), la valine (V), la leucine (L), l’isoleucine (I), et la proline (P), 2) les « acides aminés apolaires aromatiques », qui possèdent une chaîne latérale de type aromatique et incluent le tryptophane (W), la phénylalanine (F), et la tyrosine (Y), et 3) les « acides aminés apolaires soufrés » dont la chaîne latérale comprend un atome de soufre et qui incluent la méthionine (M) et la cystéine (C). Par « acides aminés polaires », on entend une famille d’acides aminés dont les positions moyennes des charges partielles positives et négatives ne sont pas confondues. Parmi les 20 acides aminés conventionnels, les acides aminés polaires sont les suivants : sérine (S), thréonine (T), asparagine (N), glutamine (Q), acide glutamique (E), acide aspartique (D), lysine (K), arginine (R), histidine (H). Ils peuvent être subdivisés en trois sous-familles : 1 ) les « acides aminés polaires neutres (ou non chargés) », qui possèdent une chaîne latérale non chargée et incluent la sérine (S), la thréonine (T), l’ asparagine (N), et la glutamine (Q), 2) les « acides aminés polaires chargés négativement », qui possèdent une chaîne latérale chargée négativement et incluent l’acide glutamique (E) et acide aspartique (D), et 3) les « acides aminés polaires chargés positivement » qui possèdent une chaîne latérale chargée positivement et qui incluent la lysine (K), l’arginine (R), et l’histidine (H).
Par «molécule d’acides nucléiques », on entend un polymère de n'importe quelle longueur d’acide désoxyribonucléique (ADN), ou polydésoxyribonucléotides, incluant notamment les ADN complémentaires ou ADNc, les ADN génomiques, les plasmides, les vecteurs, les génomes viraux, l'ADN isolé, les sondes, les amorces et tout mélange de ceux-ci ; ou un polymère de n'importe quelle longueur d’acide ribonucléique (ARN), ou polyribonucléotides, incluant notamment les ARN messagers ou ARNm, ARN antisens ; ou des polyribo- polydésoxyribonucléotides mélangés. Ils englobent des polynucléotides simples ou à double brins, linéaires ou circulaires, naturels ou synthétiques. En outre, un polynucléotide peut comprendre des nucléotides non naturels et peut être interrompu par des composants non nucléotidiques.
Dans le cadre de la présente invention, les termes "acide nucléique", "molécule d'acides nucléiques", "polynucléotide" et "séquence nucléotidique" sont utilisés de manière interchangeable.
Par « molécule isolée », on entend une molécule, notamment une protéine, un polypeptide, un peptide, une molécule d’acides nucléiques, un vecteur plasmidique, un vecteur viral ou une cellule hôte, qui est extrait de son environnement naturel (c'est-à-dire séparé d'au moins un autre composant auquel il est naturellement associé).
Par « polypeptide », “protéine” et “peptide”, on entend des polymères de résidus d'acides aminés qui comprennent au moins neuf acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Le polymère peut être linéaire, ramifié ou cyclique. Le polymère peut comprendre des acides aminés naturels et/ou analogues d’acides aminés et il peut être interrompu par des résidus non-acides aminés. Comme indication générale et sans y être cependant lié dans la présente demande, si le polymère d'acides aminés contient plus de 50 résidus d'acides aminés, il est de préférence appelé un polypeptide ou une protéine, alors que si le polymère est constitué de 50 acides aminés ou moins, il est de préférence appelé "peptide".
Par « identité », on entend une correspondance exacte de séquence entre deux polypeptides ou deux molécules d’acides aminés. Les « pourcentages d’identité » auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés sur la base d’un alignement global des séquences (nucléiques ou protéiques) à comparer, c’est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité sur toute leur longueur en utilisant tout algorithme bien connu de l'homme du métier tel que l’algorithme de Needleman et Wunsch-1970. Cette comparaison de séquences peut être effectuée à l'aide de tout logiciel bien connu de l'homme du métier, par exemple le logiciel needle en utilisant le paramètre « Gap open » égal à 10.0, le paramètre « Gap extend » égal à 0.5 et une matrice « Blosum 62 ». Le logiciel needle est par exemple disponible sur le site internet ebi.ac.uk world wide sous la dénomination « Align ».
Par « vecteur », on entend un véhicule, de préférence une molécule d'acide nucléique ou une particule virale, qui contient les éléments nécessaires pour permettre l'administration, la propagation et/ou l'expression d'une ou plusieurs molécule(s) d'acides nucléiques dans une cellule hôte ou un organisme.
D’un point de vue fonctionnel, ce terme englobe des vecteurs pour la maintenance (vecteurs de clonage), des vecteurs pour l'expression dans diverses cellules ou organismes hôtes (vecteurs d'expression), des vecteurs extrachromosomiques (par exemple des plasmides multicopie) ou des vecteurs d'intégration (par exemple conçus pour s'intégrer dans le génome d’une cellule hôte et produire des copies supplémentaires de la molécule d'acides nucléiques qu’il contient lorsque la cellule hôte se réplique). Ce terme englobe également des vecteurs navettes (par exemple, fonctionnant à la fois dans des hôtes procaryotes et/ou eucaryotes) et des vecteurs de transfert (par exemple pour le transfert de molécule(s) d'acides nucléiques dans le génome d’une cellule hôte).
D’un point de vue structurel, les vecteurs selon l’invention peuvent être des sources génétiques naturelles, synthétiques ou artificielles, ou une combinaison d'éléments génétiques naturels et artificiels.
Ainsi, dans le contexte de l'invention, le terme "vecteur" doit être compris de manière large en incluant des vecteurs plasmidiques (ou plasmides) et viraux.
Un "plasmide" tel qu'utilisé ici désigne une construction d'ADN réplicable. Habituellement, les vecteurs plasmidiques contiennent des gènes marqueurs de sélection qui permettent aux cellules hôtes portant le plasmide d'être identifiées et/ou sélectionnées de manière positive ou négative en présence du composé correspondant au marqueur de sélection. Une variété de gènes marqueurs de sélection positifs et négatifs sont connus dans la technique. À titre d'illustration, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positif permettant de sélectionner une cellule hôte en présence de l'antibiotique correspondant.
Le terme "vecteur viral" tel qu'utilisé ici se réfère à un vecteur d'acide nucléique qui comprend au moins un élément d'un génome du virus et peut être conditionné dans une particule virale ou une particule virale. Les vecteurs viraux peuvent être compétents pour la réplication ou sélectifs (par exemple, conçus pour se répliquer mieux ou sélectivement dans des cellules hôtes spécifiques), ou peuvent être génétiquement désactivés de manière à être défectueux ou déficients pour la réplication.
Par « cellule hôte », on entend une cellule contenant une molécule d’acides nucléiques hétérologue. Par « hétérologue » ou « exogène », on entend que la molécule d’acides nucléiques provient d’une espèce différente de l’espèce de la cellule hôte. Ainsi, une cellule hôte n’est pas une cellule qui existe à l’état naturel mais est un outil de biologie moléculaire obtenu par les techniques de manipulations génétiques.
La cellule hôte peut être constituée d'un type unique de cellules ou d'un groupe de différents types de cellules (on a alors un mélange de cellules hôtes de type distinct). La cellule hôte peut également être une cellule hybride, c’est-à-dire résultant de la fusion d’au moins deux cellules de types différent. La cellule hôte peut appartenir à des lignées cellulaires cultivées, à des cellules primaires, à des cellules souches ou à des cellules prolifératives. Dans le cadre de l'invention, le terme "cellule hôte" comprend des cellules procaryotes et des cellules eucaryotes. Par « procaryote », on entend un micro-organisme unicellulaire dont la structure cellulaire ne comporte pas de noyau. Les procaryotes incluent les règnes des bactéries et des archées. Par « bactérie », on entend un organisme microscopique et procaryote présent dans tous les milieux. Par « eucaryote », on entend par opposition aux procaryotes tout organisme unicellulaire ou multicellulaire dont les cellules possèdent un noyau structuré. Les cellules eucaryotes incluent les cellules de levures, d'insectes, de plantes et d’animaux (notamment des cellules de mammifères non humaines). La cellule hôte peut par exemple être isolée ou organisée en tissu, en organe ou encore être au sein d’un organisme complet. Dans le cas où la cellule hôte est au sein d’un organisme complet, ledit organisme n’est pas humain.
Dans la description détaillée qui suit, les modes de réalisation pourront être pris seuls ou combinés de manière appropriée par l’homme du métier. Utilisation de polypeptides isolés, molécules d’acides nucléiques, vecteurs, cellules hôtes pour la production de phloroglucinol
On s’intéresse ici à l’utilisation de polypeptides isolés choisis parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes.
En effet, de manière tout à fait surprenante, les Inventeurs ont identifié des gènes codant de nouvelles polykétide synthases de type III dans le génome de champignons Ascomycètes. De plus, les polykétide synthases de type III sont une vaste classe d’enzymes rassemblant des protéines présentant des similarités de séquences tout en présentant des activités enzymatiques très dissemblables (Meslet-Cladière et al., 2013). Ainsi, l’activité phloroglucinol synthase n’est que l’une des multiples activités susceptibles d’être présentes chez une polykétide synthase de type III. En outre, aucun motif de séquence associé à l’activité phloroglucinol synthase n’a été décrit, rendant l’identification des polykétide synthases de type III possédant une telle activité particulièrement difficile. Or, les Inventeurs ont en outre mis en évidence que les nouvelles polykétide synthases de type III identifiées chez des champignons Ascomycètes ont une activité de phloroglucinol synthase.
Dans un premier aspect, l’invention concerne donc l’utilisation d’un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, d’une molécule d’acides nucléiques isolée codant pour celui-ci, d’un vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci ou d’une cellule hôte non humaine exprimant celui-ci, pour produire du phloroglucinol.
Polypeptide utilisé
Le polypeptide utilisé dans l’invention est choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, et possède avantageusement une activité phloroglucinol synthase.
Il peut notamment être choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons des familles Ophiocordycipitaceae et Trichocomaceae, avantageusement des genres Hirsutella et Aspergillus, plus avantageusement des espèces Hirsutella minnesotensis 3608 et Aspergillus tanneri.
Avantageusement, le polypeptide utilisé dans l’invention correspond à ceux identifiés ici comme ayant une activité phloroglucinol synthase ou à des dérivés de celui-ci. Notamment, le polypeptide utilisé dans l’invention comprend, est essentiellement constitué ou est constitué d’une séquence d’acides aminés ayant au moins 70% d’identité, au moins 75% d’identité, avantageusement au moins 80% d’identité, au moins 85% d’identité, plus avantageusement au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, encore plus avantageusement au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité, au moins 99% d’identité, au moins 99,5% d’identité, voire 100% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 (PhlD de Hirsutella minnesotensis 3608 dénotée PlhD-Hm2), SEQ ID NO :2 (PhlD de Hirsutella minnesotensis 3608 dénotée PlhD-Hm1 ) et SEQ ID NO :3 (PhlD d’ Aspergillus tanneri dénotée PlhD-Àt).
Les séquences SEQ ID NO :1 à 3 sont présentées dans le Tableau 1 ci-dessous :
[Table 1 ]
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En outre, les Inventeurs ont identifié des motifs conservés entre les trois séquences SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3 (voir l’alignement de la Figure 1 ), qui sont donc avantageusement présents dans la séquence du polypeptide utilisé dans l’invention.
Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux général, le polypeptide utilisé dans l’invention comprend en outre (en sus d’un pourcentage d’identité minimal avec SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO :3 tel que décrit ci-dessus) au moins un fragment choisi parmi :
(a) LVTSTGFXiAPGVDV, dans laquelle Xi est choisi parmi les acides aminés apolaires (i.e. glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), tryptophane (W), phénylalanine (F), tyrosine (Y), méthionine (M) et cystéine (C), SEQ ID NO :4) ;
(b) VNFMGCAAAMNGLR (SEQ ID NO :5);
(c) CCVELSSVNAV (SEQ ID NO:6) ;
(d) ISSLFADGX2AAMWGS, dans laquelle X2 est choisi parmi les acides aminés apolaires ou polaires neutres (i.e. glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), tryptophane (W), phénylalanine (F), tyrosine (Y), méthionine (M), cystéine (C), la sérine (S), la thréonine (T), l’asparagine (N), et la glutamine (Q)) (SEQ ID NO:7) ;
(e) WAIHPGGPKIIEES (SEQ ID NO :8);
(f) GNMLSASLPFVL (SEQ ID NO :9); et
(g) AFSFAPGX3TVEG, dans laquelle X3 est choisi parmi les acides aminés apolaires (i.e. glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), tryptophane (W), phénylalanine (F), tyrosine (Y), méthionine (M) et cystéine (C)) (SEQ ID NO : 10).
Avantageusement, dans un mode de réalisation intermédiaire, le polypeptide utilisé dans l’invention comprend en outre (en sus d’un pourcentage d’identité minimal avec SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO :3 tel que décrit ci-dessus) au moins un fragment choisi parmi :
(a) LVTSTGFXiAPGVDV, dans laquelle X1 est choisi parmi les acides aminés apolaires aliphatiques (i.e. l’alanine (A), la valine (V), la leucine (L), l’isoleucine (I), et la proline (P), SEQ ID NO :11 ) ; (b) VNFMGCAAAMNGLR (SEQ ID NO :5);
(c) CCVELSSVNÀV (SEQ ID NO:6) ;
(d) ISSLFÀDGX2AAMWGS, dans laquelle X2 est choisi parmi les acides aminés apolaires soufrés ou polaires neutres (i.e. la méthionine (M), la cystéine (C), la sérine (S), la thréonine (T), l’asparagine (N), et la glutamine (Q)) (SEQ ID NO:12) ;
(e) WÀIHPGGPKIIEES (SEQ ID NO :8);
(f) GNMLSÀSLPFVL (SEQ ID NO :9); et
(g) ÀFSFÀPGX3TVEG, dans laquelle X3 est choisi parmi les acides aminés apolaires aliphatiques (i.e. l’alanine (À), la valine (V), la leucine (L), l’isoleucine (I), et la proline (P)) (SEQ ID NO :13).
Plus avantageusement encore, dans un mode de réalisation limité, le polypeptide utilisé dans l’invention comprend en outre (en sus d’un pourcentage d’identité minimal avec SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO :3 tel que décrit ci-dessus) au moins un fragment choisi parmi :
(a) LVTSTGFX1ÀPGVDV, dans laquelle X1 est choisi parmi la valine et l’isoleucine (SEQ ID NO :14) ;
(b) VNFMGCAAAMNGLR (SEQ ID NO :5);
(c) CCVELSSVNAV (SEQ ID NO:6) ;
(d) ISSLFADGX2AAMWGS, dans laquelle X2 est choisi parmi la cystéine et la sérine (SEQ ID NO:15) ;
(e) WAIHPGGPKIIEES (SEQ ID NO :8);
(f) GNMLSASLPFVL (SEQ ID NO :9); et
(g) AFSFAPGX3TVEG, dans laquelle X3 est choisi parmi la valine et l’isoleucine (SEQ ID NO :16).
De manière particulièrement avantageuse, dans un mode de réalisation très limité, le polypeptide utilisé dans l’invention comprend en outre (en sus d’un pourcentage d’identité minimal avec SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO :3 tel que décrit ci-dessus) au moins un fragment choisi parmi : (a) LVTSTGFIÀPGVDV (SEQ ID NO : 17) ;
(b) VNFMGCAAAMNGLR (SEQ ID NO :5);
(c) CCVELSSVNAV (SEQ ID NO:6) ;
(d) ISSLFADGCAAMWGS (SEQ ID NO:18) ;
(e) WAIHPGGPKIIEES (SEQ ID NO :8);
(f) GNMLSASLPFVL (SEQ ID NO :9); et
(g) AFSFAPGVTVEG (SEQ ID NO : 19).
Avantageusement, le polypeptide utilisé dans l’invention comprend en outre (en sus d’un pourcentage d’identité minimal avec SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO :3 tel que décrit ci-dessus) plusieurs des fragments (a) à (g tels que décrits ci-dessus (mode de réalisation général, intermédiaire, limité, très limité). Notamment, le polypeptide utilisé dans l’invention peut comprendre en outre (en sus d’un pourcentage d’identité minimal avec SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO :3 tel que décrit ci-dessus (mode de réalisation général, intermédiaire ou limité)) :
- les fragments (a), (b), et (d), ou
- tous les fragments (a) à (g).
De manière particulièrement avantageuse, le polypeptide utilisé dans l’invention comprend, est essentiellement constitué ou est constitué d’une séquence d’acides aminés choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3, de préférence le polypeptide utilisé dans l’invention comprend, est essentiellement constitué, ou est constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 .
Molécule d’acides nucléiques isolée utilisée
La molécule d’acides nucléiques isolée utilisée dans l’invention peut être toute molécule d’acides nucléiques comprenant une séquence d’acides nucléiques codant pour tout polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques codant pour du polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus. De manière avantageuse, le promoteur est un promoteur exogène, en particulier un promoteur de levure, de préférence un promoteur choisi parmi ADH2 (pADH2, ce promoteur permet l’expression notamment lorsque le milieu de culture contient de l’éthanol comme source de carbone), CCW12 (pCCW12, ce promoteur permet l’expression notamment lorsque le milieu de culture contient du glucose comme source de carbone), et TEF1 (pTEF1 , ce promoteur permet l’expression notamment lorsque le milieu de culture contient du glucose ou saccharose comme source de carbone), de préférence encore un promoteur choisi parmi ADH2 (pADH2) de Saccharomyces cerevisiae, CCW12 (pCCW12) de S. cerevisiae, et TEF1 (pTEF1 ) de S. cerevisiae, de préférence encore un promoteur choisi parmi ADH2 de séquence SEQ ID NO: 20, CCW12 de séquence SEQ ID NO: 21 , et TEF1 de séquence SEQ ID NO: 22.
Selon un mode de réalisation alternatif ou combinable avec le précédent, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un terminateur de transcription de la séquence d’acides nucléiques codant pour du polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus. De manière avantageuse, le terminateur est un terminateur exogène, en particulier un terminateur de levure, de préférence le terminateur RPL3 (tRPL3) ou le terminateur ADH1 , de préférence encore le terminateur RPL3 de S. cerevisiae ou le terminateur ADH1 de S. cerevisiae, de préférence encore le terminateur RPL3 de séquence SEQ ID NO: 23 ou le terminateur ADH1 de séquence SEQ ID NO:24.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre à la fois un promoteur et un terminateur qui sont tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation alternatif ou combinable avec chacun des modes de réalisations visant la molécule d’acides nucléiques isolée utilisée dans l’invention, la molécule d’acides nucléiques comprend en outre une séquence d’export. Avantageusement, cette séquence d’export permet la sécrétion ou l’excrétion du ou des polypeptides codés par la molécule d’acides nucléiques dans le milieu cellulaire.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre à la fois un promoteur, un terminateur et une séquence d’export tels que définis ci- dessus.
La molécule d’acides nucléiques peut être isolée à partir de souches homologues en culture, de préférence choisies parmi les genres Hirsutella et Aspergillus, plus avantageusement parmi les espèces Hirsutella minnesotensis 3608 et Aspergillus tanneri. Alternativement, la molécule d’acides nucléiques peut être isolée à partir d’un vecteur ou d’une cellule hôte hétérologue comprenant ladite molécule, ledit vecteur ou ladite cellule hôte étant tel(le) que défini(e) plus haut et que décrit(e) ci-après dans les sections « Cellules hôtes » ou « Vecteurs ». Alternativement, la molécule d’acides nucléiques isolée peut être synthétisée in vitro par des techniques de synthèse nucléique connues de la personne du métier.
Selon un mode de réalisation alternatif ou combinable avec chacun des modes de réalisations visant la molécule d’acides nucléiques isolée utilisée dans l’invention, la séquence d’acides nucléiques comprise dans la molécule d’acides nucléiques isolée utilisée dans l’invention est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, en particulier dans une levure ou dans une bactérie.
Pour optimiser l’expression dans une cellule hôte, en particulier dans une levure ou dans une bactérie, la personne du métier sait utiliser le biais d'usage du code génétique, qui désigne l'utilisation préférentielle pour un organisme donné d'un des triplets de nucléotides ou codons possibles pour coder un même acide aminé. En effet, il existe en général plusieurs combinaisons de trois nucléotides (appelées « codon ») codant pour le même acide-aminé (sauf pour la méthionine et le tryptophane), appelés codons synonymes, mais certaines de ces combinaisons sont en général utilisées préférentiellement par un organisme donné. Pour la production d’une séquence d’acides aminés d’intérêt, une expression optimale peut ainsi être obtenue lorsque les codons choisis pour coder la séquence d’acides aminés sont ceux utilisés de manière préférentielle par l’organisme d’origine de la cellule hôte. Selon l’organisme de production choisi (notamment la levure ou la bactérie), des séquences nucléiques optimales différentes seront donc utilisées lorsque la séquence d’acides nucléiques comprise dans la molécule d’acides nucléiques isolée utilisée dans l’invention est en outre optimisée pour l’expression dans l’organisme de production choisi.
Différents logiciels sont accessibles à la personne du métier pour optimiser les codons pour une expression chez une cellule hôte, notamment chez une levure ou chez une bactérie. Des exemples de tels logiciels incluent le logiciel Twist Codon Optimization tool (fourni par Twist Biosciences), le logiciel GenSmart™ Codon Optimization (fourni par GenScript et dont les fonctionnalités sont décrites dans la demande W02020024917A1 ), le logiciel IDT Codon Optimization Tool (fourni par Integrated DNA technologies), et le logiciel Azenta’s codon optimization tool (fourni par Azenta).
Des exemples de séquences nucléiques optimisées codant respectivement pour les polypeptides de séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 à 3 sont les séquences d’acides nucléiques SEQ ID NO :25 à SEQ ID NO :27, respectivement, présentées dans le Tableau 2 ci- dessous et qui sont optimisées (au moins partiellement) pour une expression chez une levure, notamment Saccharomyces cerevisiae :
[Table 2]
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Néanmoins, la personne du métier saurait générer d’autres séquences nucléiques optimisées pour une expression dans une levure, notamment Saccharomyces cerevisiae, ou dans un autre type de cellule hôte (notamment une autre espèce de levure ou une bactérie). Une fois la séquence nucléique optimisée définie, la personne du métier peut obtenir cette séquence par synthèse in vitro directement avec les codons optimisés. Lorsque le nombre de nucléotides à modifier par rapport à la séquence d’origine n’est pas trop élevé, la séquence optimisée peut aussi être obtenue par mutagénèse dirigée in vitro à partir d’un échantillon de la molécule d’acides nucléiques dont les codons sont à adapter, à l’aide d’une amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre à la fois un promoteur et un terminateur tels que définis ci-dessus, et la séquence d’acides nucléiques comprise dans la molécule d’acides nucléiques isolée utilisée dans l’invention est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, avantageusement dans une levure ou une bactérie, de préférence dans une levure, tel que décrit ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre à la fois un promoteur, un terminateur et une séquence d’export tels que définis ci-dessus, et la séquence d’acides nucléiques comprise dans la molécule d’acides nucléiques isolée utilisée dans l’invention est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, avantageusement dans une levure ou une bactérie, de préférence dans une levure, tel que décrit ci-dessus.
Vecteur utilisé
Le vecteur utilisé dans l’invention peut être tout vecteur comprenant toute molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus.
Les vecteurs qui sont appropriés dans le cadre de la présente invention comprennent, sans limitation, des vecteurs bactériophages, plasmides ou cosmides pour l'expression dans des cellules hôtes procaryotes telles que des bactéries (par exemple E. coli, ou des bactéries du genre Pseudomonas) des vecteurs pour l'expression chez la levure (par exemple Saccharomyces cerevisiae, Schyzosaccharomyces pombe, Pichia pastoris); des vecteurs de baculovirus pour l'expression dans des systèmes de cellules d'insectes (par exemple, des cellules de Sf 9); des vecteurs viraux et plasmidiques pour l'expression dans des systèmes de cellules végétales (par exemple le plasmide Ti, le virus de la mosaïque du chou-fleur, CaMV, le virus de la mosaïque du tabac TMV); ainsi que des vecteurs viraux et plasmidiques pour l'expression dans des cellules ou des organismes de vertébrés, notamment de mammifères.
En fonction de l’hôte d’intérêt, la personne du métier connaît des vecteurs d’expression appropriés. Ces vecteurs sont généralement disponibles dans le commerce (par exemple, auprès des fournisseurs tels Invitrogen, Stratagene, Àmersham Biosciences, Promega, etc.), disponibles auprès d'institutions de dépôt telles que l’American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.), ou ont fait l'objet de nombreuses publications décrivant leur séquence, leurs structures et leurs méthodes de production, de sorte que la personne du métier peut les appliquer sans difficultés. L’invention s’intéresse tout particulièrement à la production de phloroglucinol dans des levures, et le vecteur utilisé dans l’invention est donc avantageusement approprié et même optimisé pour la transfection de levures. Le vecteur utilisé dans l’invention peut notamment être avantageusement un vecteur plasmidique approprié pour la transfection de levures. Des exemples représentatifs de vecteurs plasmidiques appropriés pour la transfection de levures comprennent, sans limitation, pREP4, pCEP4 (Invitrogen), pCI (Promega), pVÀX (Invitrogen), pgWiz (Gene Therapy System Inc), et YCplac22 (ÀTCC 87585), ainsi que tout dérivé de ces vecteurs (notamment un dérivé de YCplac22 dans lequel ont été intégrés le couple (promoteur PGK et terminateurs CYC) ainsi que le couple (promoteur TEF1 et terminateur ÀDH1 )), mais tout autre vecteur approprié pour transfection de levures peut être utilisé.
Cellule hôte utilisée
La cellule hôte utilisée dans l’invention peut être toute cellule hôte exprimant tout polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus. Elle peut notamment être choisie parmi les cellules hôtes comprenant une molécule d’acides nucléiques isolée telle que définie ci-dessus ou un vecteur tel que défini ci-dessus.
Tel que défini ci-dessus, une cellule hôte est une cellule contenant une molécule d’acides nucléiques hétérologue. Dans le cadre de l’invention, la molécule d’acides nucléiques hétérologue correspond à la molécule d’acides nucléiques isolée telle que définie ci-dessus ou au vecteur tel que défini ci-dessus.
La cellule hôte utilisée peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Parmi les cellules procaryotes, elle peut être choisie parmi les bactéries. Parmi les cellules eucaryotes, elle peut être choisie parmi les cellules de levure, les cellules de champignons, les cellules d’algues, les cellules d'insectes, de plantes ou de mammifères non humaines).
La cellule hôte utilisée est de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genres Saccharomyces, Candida, Eremothecium, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Lodderomyces, Yarrowia, Zi osaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus et Malassezia.
De manière encore plus particulière, la levure est sélectionnée parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zi osaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata.
Encore plus particulièrement, la levure est du genre Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae.
La cellule hôte utilisé peut aussi être une bactérie, ladite bactérie étant en particulier sélectionnée parmi les protéobactéries, les bactéries actinomycètes et les bactéries Firmicutes. Parmi les protéobactéries, la cellule hôte peut avantageusement être choisie parmi les genres Escherichia (notamment parmi les souches de l’espèce Escherichia coli, espèce la plus utilisée pour la production de protéines recombinantes) et Pseudomonas. Parmi les bactéries actinomycètes, la cellule hôte peut avantageusement être choisie parmi les genres Streptomyces et Corynebacterium. Parmi les bactéries Firmicutes, cellule hôte peut avantageusement être choisie parmi les genres Bacillus et Lactobacillus.
La cellule hôte utilisée comprend au moins une copie de la molécule d’acides nucléiques isolée telle que définie ci-dessus intégrée dans son génome. Elle peut notamment comprendre une copie unique de la molécule d’acides nucléiques isolée telle que définie ci- dessus intégrée dans son génome.
Lorsque la cellule hôte utilisée est une cellule de levure (notamment du genre Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae), la ou les copies de la molécule d’acides nucléiques peut être intégrée à différents loci, préférentiellement au locus URÀ3, au locus JLP1 , au locus LEU2, ou au locus TRP1 du génome de ladite cellule de levure. Lorsque la cellule hôte est une cellule de levure et que plusieurs copies de la molécule d’acides nucléiques sont intégrées, les différentes copies peuvent être intégrées au même locus, ou encore à différents loci, préférentiellement à l’une quelconque des combinaisons des loci URÀ3, JLP1 , LEU2, et/ou TRP1.
Avantageusement, les codons utilisés dans la molécule d’acides nucléiques codant pour le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes comprise dans la cellule hôte ou dans le vecteur compris dans la cellule hôte ont été adaptés pour une expression optimale dans la cellule hôte sélectionnée. Comme expliqué précédemment, la production d’une séquence d’acides aminés d’intérêt, une expression optimale peut être obtenue lorsque les codons choisis pour coder la séquence d’acides aminés sont ceux utilisés de manière préférentielle par l’organisme d’origine de la cellule hôte. Quel que soit le type de cellule hôte, la personne du métier saura trouver quels codons sont à privilégier dans la littérature ou en utilisant un logiciel d’optimisation des codons. Les exemples de logiciels d’optimisation des codons mentionnés ci-dessus pour la levure peuvent également être utilisés pour d’autres type de cellules hôte. Les levures, et notamment celles du genre Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae, étant tout particulièrement préférées comme cellules hôtes, les codons utilisés dans la molécule d’acides nucléiques codant pour le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes comprise dans la cellule hôte ou dans le vecteur compris dans la cellule hôte ont avantageusement été adaptés pour une expression optimale dans les levures, et notamment dans les levures du genre Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae.
Pour l’utilisation selon l’invention, les cellules hôtes peuvent être cultivées dans des bioréacteurs aérobie ou anaérobie, à petite et grande échelle, dans des flacons ou des boites de Petri. La culture peut être effectuée à une température, un pH, un milieu de culture et une teneur en oxygène appropriés pour une cellule hôte donnée. Pour les levures, et plus particulièrement pour Saccharomyces cerevisiae, la culture est avantageusement effectuée par n'importe quelle méthode appropriée. Les procédés de culture d'une souche Saccharomyces cerevisiae sont connus dans l'art, et l'homme du métier sait optimiser les conditions de culture pour chaque souche en fonction de sa nature. Des procédés classiques sont notamment décrits dans l'ouvrage de référence "Yeast Technology", 2ème Edition, 1991 , Reed and Nagodawithana, publié par Van Nostrand Reinhold (ISBN 0-442-31892-8). Notamment, la culture d'une souche de levure, en particulier de l’espèce Saccharomyces cerevisiae, peut généralement être réalisée à une température comprise entre 20 et 37° C, dans un milieu liquide riche (par exemple le milieu YPD accessible auprès de VWR) ou synthétique (défini pour répondre précisément aux besoins de la souche), en culture aérobie ou anaérobie.
Utilisation
Le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, la molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci, le vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci ou la cellule hôte exprimant celui-ci, chacun étant tel que défini ci-dessus, est utilisé pour produire du phloroglucinol, quelle que soit la méthode de production utilisée.
Selon la méthode, la personne du métier saura choisir le plus approprié entre le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, la molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci, le vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci ou la cellule hôte exprimant celui-ci, chacun étant tel que défini ci-dessus.
Notamment, le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que décrit ci-dessus peut être utilisé directement pour produire du phloroglucinol in vitro, à condition de le mettre en contact avec du malonyl-CoA. En effet, les phloroglucinol synthases réalisent la condensation de trois molécules de malonyl-CoA pour former une molécule de phloroglucinol selon le schéma réactionnel Réaction I précédemment décrit.
La molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci et le vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci peuvent être utilisés pour transfecter une cellule hôte, qui peut ensuite être utilisée soit pour produire le polypeptide (qui peut alors produire du phloroglucinol in vitro) soit pour produire directement du phloroglucinol lorsqu’elle est cultivée en présence d’un substrat approprié (tel qu’une source de carbone comme le glucose ou l’éthanol).
Des exemples de méthodes plus précises dans lesquelles le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, la molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci, le vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci ou la cellule hôte exprimant celui-ci tels que décrits ci-dessus sont décrits dans la section ci-dessous concernant des méthodes selon l’invention pour produire du phloroglucinol.
Molécule d’acides nucléiques isolée selon l’invention
L’invention concerne également une molécule d’acides nucléiques isolée comprenant une séquence d’acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus, caractérisée en ce que : a) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques ; ou b) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques ; ou c) la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, notamment dans une levure ou dans une bactérie ; ou d) toute combinaison de a) à c).
De telles molécules d’acides nucléiques isolées sont utiles pour soit pour la production d’un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus, soit pour produire directement du phloroglucinol lorsqu’elles sont transfectées (directement ou au sein d’un vecteur) dans une cellule hôte, cultivée en présence d’un substrat approprié.
Dans le mode de réalisation a), la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques.
Dans le mode de réalisation b), la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques.
Dans le mode de réalisation c), la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, notamment dans une levure ou dans une bactérie, avantageusement dans une levure.
Dans d’autres modes de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée peut combiner plusieurs des caractéristiques a) à c). En particulier, la molécule d’acides nucléiques isolée peut être caractérisée en ce que : d) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur et un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques (combinaison de a) et b)) ; e) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques et la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, notamment dans une levure ou dans une bactérie, avantageusement dans une levure (combinaison de a) et c)) ; f) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques et la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, notamment dans une levure ou dans une bactérie, avantageusement dans une levure (combinaison de b) et c)) ; ou g) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur et un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques et la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, notamment dans une levure ou dans une bactérie, avantageusement dans une levure (combinaison de a), b) et c)).
Lorsque la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques (modes de réalisation a), d), e), et g) ci- dessus), le promoteur est avantageusement un promoteur exogène, en particulier un promoteur de levure, et de préférence un promoteur choisi parmi ÀDH2 (pÀDH2), CCW12 (pCCW12) et TEF1 (pTEF1 ), de préférence encore un promoteur choisi parmi ÀDH2 (pÀDH2) de Saccharomyces cerevisiae, CCW12 (pCCW12) de S. cerevisiae, et TEF1 (pTEF1 ) de S. cerevisiae, de préférence encore un promoteur choisi parmi ÀDH2 de séquence SEQ ID NO : 20, CCW12 de séquence SEQ ID NO: 21 et TEF1 de séquence SEQ ID NO :22.
Lorsque la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques (modes de réalisation b), d), f), et g) ci-dessus), le terminateur de transcription est avantageusement un terminateur exogène, tel qu’un terminateur de levure, et de préférence le terminateur RPL3 (tRPL3) ou le terminateur ÀDH1 (tÀDH1 ), de préférence encore le terminateur RPL3 de S. cerevisiae ou le terminateur ÀDH1 de S. cerevisiae, de préférence encore le terminateur RPL3 de séquence SEQ ID NO: 23 ou le terminateur ÀDH1 de séquence de SEQ ID NO: 24.
Lorsque la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une levure (modes de réalisation c), e), f), et g) ci-dessus), elle est avantageusement optimisée pour l’expression dans une levure du genre Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. En particulier, elle est avantageusement choisie parmi SEQ ID NO :25 à SEQ ID NO :27.
Lorsque la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une bactérie (modes de réalisation c), e), f), et g) ci-dessus), elle est avantageusement optimisée pour l’expression dans une bactérie des genres Escherichia (notamment des souches de l’espèce Escherichia coli, espèce la plus utilisée pour la production de protéines recombinantes) et Pseudomonas.
Vecteur selon l’invention
L’invention concerne également un vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques selon l’invention. Le vecteur selon l’invention peut comprendre toute molécule d’acides nucléiques selon l’invention décrite ci-dessus. Il peut être choisi parmi tout type de vecteur décrit précédemment dans la section visant les vecteurs susceptibles d’être utilisés dans l’utilisation selon l’invention.
Cellule hôte selon l’invention
L’invention concerne également une cellule hôte comprenant une molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ou un vecteur selon l’invention.
La cellule hôte selon l’invention peut comprendre toute molécule d’acides nucléiques selon l’invention décrite ci-dessus ou tout vecteur selon l’invention tel que décrit ci-dessus. Elle peut en outre comprendre toute caractéristique ou combinaison de caractéristique décrite précédemment dans la section visant les cellules hôtes susceptibles d’être utilisées dans l’utilisation selon l’invention.
Méthodes pour produire un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes
La présente invention concerne en outre une méthode pour produire un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci- dessus.
Selon un mode de réalisation, la méthode pour produire un tel polypeptide comprend, est essentiellement constituée, ou est constituée des étapes suivantes :
(i) l’introduction d’une molécule d’acides nucléiques ou d’un vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques tels que décrits ci-dessus (molécule d’acides nucléiques ou vecteur utilisés dans l’invention ou selon l’invention) dans une cellule hôte appropriée conforme à la description qui précède ; et
(ii) la culture in vitro de ladite cellule hôte obtenue à l’étape (i) dans des conditions permettant l’expression de ladite molécule d’acides nucléiques, de manière à produire ledit polypeptide. Selon un autre mode de réalisation, la méthode pour produire un tel polypeptide comprend, est essentiellement constituée, ou est constituée au moins de l’étape consistant en :
(ii) la culture in vitro d’une cellule hôte exprimant ledit polypeptide, par exemple une cellule hôte telle que décrite ci-dessus (cellule hôte utilisée dans l’invention ou selon l’invention), dans des conditions permettant l’expression de la molécule d’acides nucléiques contenue dans ladite cellule hôte, de manière à produire ledit polypeptide.
L’étape (i) d’introduction de la molécule d’acides nucléiques ou du vecteur dans une cellule hôte appropriée peut être réalisée par toute méthode appropriée connue de la personne du métier, telle que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par des liposomes comprenant la molécule d’acides nucléiques ou le vecteur à transfecter, la transfection par des agents polycationiques, l’électroporation, et la transfection par choc thermique. Notamment, l’étape (i) peut être réalisée par transfection (par toute méthode décrite ci- dessus) dans la cellule hôte d’un plasmide de transfert comprenant la séquence codant pour le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus, encadrée en 5’ et en 3’ par des séquences homologues à des séquences génomiques de la cellule hôte, permettant ainsi une recombinaison homologue entre le plasmide de transfert et le génome de la cellule hôte. Cette méthode est notamment applicable lorsque la cellule hôte est une levure, en particulier du Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae, ou une bactérie.
L’étape (ii) de culture in vitro de la cellule hôte est réalisée dans des conditions permettant l’expression de la molécule d’acides nucléiques contenue dans ladite cellule hôte, de manière à produire ledit polypeptide. Ces conditions varient en fonction de la cellule hôte utilisée et la personne du métier saura les déterminer sur la base de ses connaissances générales. Notamment, lorsque la cellule hôte est une levure, en particulier du Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae, l’étape (ii) peut être réalisée par toute méthode appropriée, notamment tel que décrit dans la section ci-dessus concernant les cellules hôtes utilisées dans l’utilisation selon l’invention.
La méthode pour produire le polypeptide peut en outre comprendre au moins une étape additionnelle choisie parmi les étapes suivantes :
(a) la récupération des cellules hôtes exprimant ledit polypeptide et/ou du surnageant comprenant le polypeptide, obtenus après l’étape de culture ; et (B) la purification du polypeptide à partir des cellules hôtes et/ou du surnageant récupérées à l’étape (a).
L’étape optionnelle (a) de récupération des cellules hôtes exprimant ledit polypeptide et/ou du surnageant comprenant le polypeptide peut être réalisée par toute technique appropriée connue de la personne du métier. Les cellules et le surnageant peuvent notamment être séparés par décantation ou centrifugation.
L’étape optionnelle (B) de purification du polypeptide à partir des cellules hôtes et/ou du surnageant récupérées à l’étape (a) peut être réalisée par toute technique appropriée connue de la personne du métier. Lorsque le polypeptide est purifié à partir du surnageant, toute technique de purification de protéine en phase liquide peut être utilisée, comme par exemple les différents types de chromatographie (filtration sur gel, échange d’ions, par interaction hydrophobe, par affinité lorsque la protéine comprend une étiquette d’affinité, chromatographie liquide haute performance « HPLC »). Lorsque le polypeptide est purifié à partir des cellules ou des cellules et du surnageant, la purification comprend en outre une ou plusieurs étape(s) préalable(s) de lyse des cellules et éventuellement d’élimination des débris cellulaire, avant l’utilisation d’une technique de purification en phase liquide.
Méthodes pour produire du phloroglucinol
Comme expliqué dans la sous-section « Utilisation » de la section visant l’utilisation selon l’invention, différentes méthodes de production de phloroglucinol peuvent être mises en oeuvre selon qu’elles reposent sur le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, la molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci, le vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci ou la cellule hôte exprimant celui-ci, chacun étant tel que défini ci-dessus.
Notamment, la molécule d’acides nucléiques codant pour le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que décrit ci-dessus et le vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour ce polypeptide peuvent être utilisés pour transfecter une cellule hôte, qui peut ensuite être utilisée soit pour produire le polypeptide (qui peut alors produire du phloroglucinol in vitro) soit pour produire directement du phloroglucinol lorsqu’elle est cultivée en présence d’un substrat approprié.
Ainsi, selon un mode de réalisation M1 , la méthode de production de phloroglucinol utilise une cellule hôte exprimant le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus (par exemple une cellule hôte selon l’invention), qui est cultivée en présence d’un substrat appropriée pour produire du phloroglucinol. Ce mode de réalisation peut être subdivisé en deux sous-modes de réalisation, selon que la méthode comprend (mode de réalisation M1À) ou non (mode de réalisation M1 B) une étape préalable d’obtention des cellules hôtes.
Dans le mode de réalisation M1À, l’invention concerne une méthode pour produire du phloroglucinol qui comprend, est essentiellement constituée, ou est constituée des étapes suivantes :
(il ) l’introduction d’une molécule d’acides nucléiques ou d’un vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques tels que décrits ci-dessus (molécule d’acides nucléiques ou vecteur utilisés dans l’invention ou selon l’invention) dans une cellule hôte appropriée conforme à la description qui précède ;
(ii1 ) la mise en contact des cellules hôtes obtenues à l’étape (il ) avec un substrat approprié ;
(iii1 ) la culture in vitro de la cellule hôte de l’étape (ii1 ) dans des conditions permettant l’expression de la molécule d’acides nucléiques contenue dans ladite cellule hôte, de manière à produire du phloroglucinol ;
(iv1 ) optionnellement la récupération du milieu de culture comprenant le phloroglucinol, obtenu après l’étape (iii1 ) ; et
(v1 ) optionnellement, la purification du phloroglucinol à partir du milieu de culture de l’étape (iv1 ).
Dans le mode de réalisation M1 B, l’invention concerne une méthode pour produire du phloroglucinol, qui comprend, est essentiellement constituée, ou est constituée des étapes suivantes :
(ii1 ) la mise en contact d’une cellule hôte non humaine exprimant le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus (par exemple une cellule hôte selon l’invention), avec un substrat approprié ;
(iii1 ) la culture in vitro de la cellule hôte de l’étape (ii1 ) dans des conditions permettant l’expression de la molécule d’acides nucléiques contenue dans ladite cellule hôte, de manière à produire du phloroglucinol ;
(iv1 ) optionnellement la récupération du milieu de culture comprenant le phloroglucinol, obtenu après l’étape (iii1 ) ; et
(v1 ) optionnellement, la purification du phloroglucinol à partir du milieu de culture de l’étape (iv1 ). Aux fins des méthodes M1 A et M1 B, et notamment lorsque la cellule hôte est une levure (en particulier du genre Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae) :
- l’étape (il ) d’introduction de la molécule d’acides nucléiques ou du vecteur dans une cellule hôte appropriée peut être réalisée par toute méthode décrite ici dans le contexte de l’étape (i) des méthodes de production du polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que décrit ci-dessus.
- le substrat mise en contact avec la cellule hôte à l’étape (ii1 ) est avantageusement une source de carbone. Avantageusement, la source de carbone est une source de carbone pure ou un coproduit industriel (tel que la mélasse ou les égouts pauvres, par exemple issus de l’industrie sucrière). De préférence, le substrat dans la source de carbone pure ou le coproduit industriel est un sucre simple, tel que le glucose (ou dextrose), le fructose, le galactose, le mannose, le saccharose, le lactose, ou le maltose ; un sucre complexe, tel qu’un monosaccharide, un disaccharide ou trisaccharides, ou encore un polysaccharide comme l'amidon ; un alcool, tel que l’éthanol ; un acide ; un acide gras et un dérivé d’ester de celui-ci ; ou un mélange de sucres, d’alcools, d’acides et/ou d’acides gras ou leurs dérivés d’ester. De préférence, le substrat est le glucose ou l’éthanol.
- l’étape (iii1 ) de culture in vitro de la cellule hôte dans des conditions permettant l’expression de la molécule d’acides nucléiques contenue dans ladite cellule hôte, de manière à produire du phloroglucinol peut être réalisée par toute méthode décrite ici dans le contexte de l’étape (ii) des méthodes de production du polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que décrit ci-dessus.
- lorsqu’elle est présente, l’étape (iv1 ) de récupération du milieu de culture comprenant le phloroglucinol peut être réalisée par toute technique décrite ici pour la séparation des cellules et du surnageant dans le contexte de l’étape optionnelle (a) des méthodes de production du polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que décrit ci-dessus.
- lorsqu’elle est présente, l’étape (v1 ) de purification du phloroglucinol à partir du milieu de culture peut être réalisée par toute technique appropriée, telle que l’extraction liquide- liquide.
De manière alternative, le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que décrit ci-dessus peut être utilisé directement pour produire du phloroglucinol in vitro, à condition de le mettre en contact avec du malonyl- CoA. En effet, les phloroglucinol synthases réalisent la condensation de trois molécules de malonyl-CoA pour former une molécule de phloroglucinol selon le schéma réactionnel Réaction I précédemment décrit.
Ainsi, selon un mode de réalisation M2, la méthode de production de phloroglucinol utilise le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que décrit ci-dessus pour produire du phloroglucinol in vitro en présence de malonyl-CoA. Ce mode de réalisation peut être subdivisé en deux sous-modes de réalisation, selon que la méthode comprend (mode de réalisation M2A) ou non (mode de réalisation M2B) une étape préalable de production du polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus.
Dans le mode de réalisation M2A, l’invention concerne méthode pour produire du phloroglucinol, qui comprend, est essentiellement constituée, ou est constituée des étapes suivantes :
(i2) la production d’un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus par l’une des méthodes de production de polypeptide décrite ci-dessus ;
(ii2) la mise en contact du polypeptide obtenu à l’étape (i2) de la méthode telle que décrite ci-dessus, avec du malonyl-CoA ;
(iii2) l’incubation du mélange issu de l’étape (ii2) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol ;
(iv2) optionnellement la récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol, obtenu après l’étape (iii2) ; et
(v2) optionnellement, la purification du phloroglucinol à partir du milieu réactionnel de l’étape (iv2).
Dans le mode de réalisation M2B, l’invention concerne une méthode pour produire du phloroglucinol, qui comprend, est essentiellement constituée, ou est constituée des étapes suivantes :
(ii2) la mise en contact d’un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini ci-dessus avec du malonyl- CoA ;
(iii2) l’incubation du mélange issu de l’étape (ii2) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol ;
(iv2) optionnellement la récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol, obtenu après l’étape (iii2) ; et (v2) optionnellement, la purification du phloroglucinol à partir du milieu réactionnel de l’étape (iv2).
Aux fins de ces méthodes M2A et M2B, et notamment lorsque la cellule hôte est une levure (en particulier du genre Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae) :
- l’étape (i2) peut être réalisée par toute méthode décrite ici pour produire un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes.
- l’étape (ii2) consiste à mettre en contact the polypeptide avec son substrat le malonyl- CoA pour permettre la production de phloroglucinol. Cette mise en contact est faite dans un milieu et à une température qui n’altèrent pas l’activité enzymatique du polypeptide. Un milieu approprié peut notamment être choisi parmi un tampon phosphate de sodium à pH 7 (notamment à une concentration d’environ 25-75 mM) comprenant du NaCl (notamment à une concentration d’environ 5-15 mM) et de l’albumine sérique bovine (ASB, notamment à une concentration d’environ 150-250 mg/L). Une température appropriée se situe dans la gamme 20 à 37 °C.
- l’étape (iii2) consiste à incuber le polypeptide et son substrat dans des conditions permettant la production de phloroglucinol. Ces conditions impliquent un milieu et une température d’incubation qui n’altèrent pas l’activité enzymatique du polypeptide, tel que décrit ci-dessus pour l’étape (ii2). La durée d’incubation est choisie en fonction de la quantité de substrat présente dans le milieu. La personne du métier saura adapter la concentration initiale de substrat à la durée d’incubation. Il est peut aussi être envisagé d’ajouter du substrat pendant la durée de l’incubation pour continuer la production de phloroglucinol.
- lorsqu’elle est présente, l’étape (iv2) de récupération du milieu réactionnel ne nécessite aucune technique particulière puisqu’il n’y a ici aucune cellule à exclure ou lyser avant purification.
- lorsqu’elle est présente, l’étape (v2) de purification du phloroglucinol à partir du milieu de culture peut être réalisée par toute technique appropriée, telle que l’extraction liquide- liquide.
Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention.
EXEMPLES Exemple 1. Identification de polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes
Les PhlD sont des polykétides synthases (PKS) de type III impliquées dans la synthèse biocatalytique du phloroglucinol à partir de trois molécules de molécules de malonyl-CoA (Zha et al., 2006). Pour identifier de nouvelles PhlD par une approche basée sur les séquences, nous avons utilisé la séquence de la PhlD de Tsukamurella pulmonis (PhlD_Tpu). Cette dernière s'est en effet avérée être la meilleure enzyme produisant du phloroglucinol parmi les 12 enzymes précédemment testées dans S. cerevisiae, l'organisme hôte utilisé pour le clonage et la production de protéines (W02019/002799).
Un blast (Johnson et al., 2008) [NCBI] de la séquence protéique de PhlD_Tpu a été effectué contre les bases de données protéiques standards (séquences protéiques non-redondantes, protein databank, Swissprot, protéines issues de métagénomes et séquences protéiques brevetées, versions du 22.11.2019). Les séquences obtenues ont été filtrées en collectant toutes les séquences ayant un pourcentage d’identité supérieure à 20% par rapport à la séquence d'entrée. Les séquences redondantes ont ensuite été supprimées (CD-HIT, identité de séquence >95%), réduisant le jeu de données à environ 3 320 séquences. De plus, les séquences de 45 PKS caractérisées provenant de la littérature ont été incluses si elles n'étaient pas présentes dans l'ensemble de données générées précédemment. Les séquences ont enfin été regroupées en utilisant un réseau de similarité de séquence (« SSN » pour « Sequence Similarity Networks », Gerlt, et al., 2015), chaque groupe correspondant à un embranchement ou à une classe différente. Les réseaux SSN sont utiles pour analyser les ensembles de données de séquences et étudier les relations séquence-fonction. Le SSN est un moyen pratique de visualiser les relations entre les séquences de protéines via la construction d'un graphe où chaque membre d'une famille de protéines est représenté par un nœud relié par une arête aux nœuds de tous les autres membres qui partagent une similarité de séquence supérieure à une valeur spécifiée par l'utilisateur. Ces réseaux de graphes sont faciles à visualiser et sont plus aisément interprétables que les approches traditionnelles des dendrogrammes et des arbres phylogénétiques. Cette représentation permet d'attribuer plus facilement une fonction putative à une protéine d'un cluster donné si un membre a déjà été caractérisé et de suivre les relations évolutives entre les clusters.
Ces graphes peuvent être visualisés à l'aide d'un logiciel de visualisation tel que Cytoscape (Shannon et al., 2003), où des sous-régions des graphes (arêtes et nœuds) peuvent être agrandies ou manipulées de manière itérative, permettant ainsi de mieux identifier la similarité des séquences à l'échelle microscopique du réseau. Après analyse minutieuse des clusters, nous avons identifié des séquences PKS déjà caractérisées comme produisant du phloroglucinol ou d'autres composés apparentés connus pour être produits par des enzymes de la famille PKS. La majorité de ces enzymes se retrouvent dans les groupes des plantes, des algues brunes et des actinobactéries. D'autres enzymes ont toutefois également été caractérisées dans d'autres clusters isolés. Les séquences P. fluorescens PhlD et PhlD_Tpu de P. fluorescens connues pour produire du phloroglucinol ont également été identifiées, ce qui valide la méthode utilisée.
Pour approfondir la classification des séquences et leurs interconnexions, des clusters de séquences provenant de différentes classes ont été générés avec une valeur E <1 O'130. Cela a permis de retrouver deux PKS de type III provenant de macroalgues brunes (Ectocarpus siliculosus-PKS .Es et Sargassium binderi-PHLD.Sbi) déjà signalées comme produisant du phloroglucinol dans Saccharomyces cerevisiae (W02019/002799). L'utilisation d'un score seuil plus strict (valeur E <10 170) a permis de séparer un cluster contenant des PKS de type III du genre Tsukamurella, également connues pour avoir une forte activité de production de phloroglucinol dans S. cerevisiae (W02019/002799). Ces résultats valident encore une fois la méthode utilisée.
Enfin, nous avons regroupé les informations issues des deux analyses de clustering avec une valeur E <10'130 et une valeur E <1 O'170 et avons sélectionné au total 23 séquences issues de sept clusters et de différentes classes pour évaluer leur capacité à produire du phloroglucinol.
Example 2. Séquences de trois polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes identifiées à l’ Exemple 1
Les polypeptides de séquences d’acides aminés SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3 font partie des 23 séquences sélectionnées à l’ Exemple 1 et sont toutes trois issues de champignons Ascomycètes.
Plus particulièrement :
- SEQ ID NO :1 correspond à la séquence d’acides aminés d’une PhlD de Hirsutella minnesotensis 3608 (dénotée PlhD-Hm2) ;
- SEQ ID NO :2 correspond à la séquence d’acides aminés d’une PhlD de Hirsutella minnesotensis 3608 (dénotée PlhD-Hm1 ) ; et
- SEQ ID NO :3 correspond à la séquence d’acides aminés d’une PhlD d’ Aspergillus tanneri (dénotée PlhD-At). Un alignement multiple de leurs séquences d’acides aminés est présenté sur la Figure 1.
Leurs pourcentages d’identité deux à deux, ainsi que vis-à-vis d’autres PhlD de l’art antérieur sont en outre présentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
[Table 3]
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Le Tableau 3 ci-dessus montre que les 3 séquences nouvellement identifiées comme de possibles phloroglucinol synthases n’ont qu’une faible identité de séquence avec les séquences des phloroglucinol synthases précédemment identifiées, et appartiennent à un règne différent (champignon versus bactéries ou algues eucaryotes).
Exemple 3. Capacité de polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes à produire du phloroglucinol chez la levure
Les 3 phloroglucinol synthases putatives précédemment identifiées (SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3) ont été testées pour leur capacité à produire du phloroglucinol lorsqu’elles sont exprimées par une levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. Leur activité a en outre été comparée à celle de PHLD de l’art antérieur.
Matériels et méthodes
Cellules de levure
Des cellules de la levure S. cerevisiae CEN.PK2-1 D (voir Entian KD and Kôtter P, 2007, commercialement accessible notamment chez Euroscarf) ont été utilisées. Préparation de clones cellulaires de S. cerevisiae CEN.PK2- 1D exprimant les 3 phloroglucinol synthases putatives ou des phloroglucinol synthase de l’art antérieur
Les séquences nucléiques SEQ ID NO :25 à 27 codant respectivement pour les 3 phloroglucinol synthases putatives précédemment identifiées (SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3) ont été modifiées en ajoutant à leurs extrémités 5' et 3' respectivement des séquences homologues au site souhaité d’intégration dans le génome des cellules de levure S. cerevisiae CEN.PK2-1 D, conduisant aux séquences SEQ ID NO :28 à 30. Pour les phloroglucinol synthases PHLD.Pf, PHLD.Tsp et PHLD.Tt, les séquences SEQ ID NO :31 à 33, qui comprennent des séquences homologues au site souhaité d’intégration dans le génome, ont été utilisées.
Les séquences SEQ ID NO :28 à 33 ont ensuite été clonées dans un plasmide appelé « PBIM5 » ou « YCplac22_PGK_CYC_TEF_ÀDH » (dérivé du plasmide commercial YCplac22 par ajout du couple (promoteur PGK et terminateur CYC, voir Gietz RD et al., 1988) ainsi que le couple (promoteur TEF1 et terminateur ÀDH1 ), voir Figure 2), sous contrôle du promoteur TEF1 et du terminateur ÀDH1. Les séquences SEQ ID NO :28 à 33 ont ensuite été intégrées dans le génome de cellules de la levure S. cerevisiae CEN.PK2-1 D par recombinaison homologue in vivo, et les séquences clonées vérifiées par séquençage Sanger.
Culture en plaque 96 puits pour la production de phloroglucinol
Chaque puits a été rempli avec 500 pl de milieu synthétique complet Trp_drop out commercialisé par Formedium.
Un clone cellulaire unique obtenu tel que décrit ci-dessus a été prélevé et inoculé dans un puits.
La plaque a été incubée à 30° C pendant environ 20 heures à 800 tours par minute dans un incubateur vibrant. Le jour suivant, une nouvelle plaque de 96 puits remplie de 500 pl de milieu synthétique complet a été inoculée avec 10 pl de culture. Trois plaques individuelles ont été inoculées pour des échantillonnages de 24, 48 et 72 heures.
Quantification de la production de phloroglucinol par test calorimétrique
Toutes les 24 heures, chaque plaque a été retirée de l'incubateur et les mesures ont été effectuées comme décrit ci-dessous :
-Tout d'abord, l'absorbance a été mesurée dans la plaque de microtitration à 600 nm dans le lecteur de plaque Tecan. Pour cela, 20 pl de culture ont été dilués avec 180 pl d'eau milliQ.
-Ensuite, la plaque de 96 puits a été centrifugée à 3700 rpm pendant 10 minutes et le surnageant a été utilisé pour le test colorimétrique. -150 pl de 500mg/L de 4-hydroxy-3méthyoxycinnamaldéhyde dans HCl/EtOH v:v (1 :3) ont été ajoutés à l'échantillon et au standard Phloroglucinol. L'incubation a été réalisée à température ambiante pendant 30min.
Résultats
Les quantités de phloroglucinol produites dans le test utilisé par les levures exprimant les différentes PhlD sont présentées dans le Tableau 4 ci-dessous.
[Table 4]
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Le Tableau 4 montre que les 3 phloroglucinol synthases putatives précédemment identifiées (SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3), bien qu’issues de champignons Ascomycètes, sont capables de produire du phloroglucinol lorsqu’elles sont exprimées dans une levure.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Entian KD and Kôtter P Yeast Genetic Strain and Plasmid Collections. Methods in Microbiology (2007) 36: 629-666.
Gerlt, J. A. et al. Enzyme Function Initiative- Enzyme Similarity Tool (EFI-EST): A web tool for generating protein sequence similarity networks. Biochim. Biophys. Acta BBA - Proteins Proteomics 1854, 1019-1037 (2015).
Gietz RD, Sugino A. New yeast Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene 74: 527-534, 1988.
Johnson, M. et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Res. 36, W5-W9 (2008). Meslet-Cladière L, Delage L, Leroux CJ, Goulitquer S, Leblanc C, Creis E, Gall EÀ, Stiger- Pouvreau V, Czjzek M, and Potin P. (2013) “Structure/function analysis of a type III polyketide synthase in the brown alga Ectocarpus siliculosus reveals a biochemical pathway in phlorotannin monomer biosynthesis.” Plant Cell. 25:3089-3103. Needleman et Wunsch. „ À General Method Applicable to The Search For Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins” J. Mol. Biol. 48,443-453, 1970.
Shannon, P. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13, 2498-2504 (2003).
Zha W, Rubin-Pitel SB and Zhao H. (2006) “Characterization of the substrate specificity of PHLD, a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens.” J Biol Chem. 281 :32036-32047.
WO2013/045510
WO2019/002798
WO2019/002799 W02020/024917A1

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d’un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes, d’une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci, d’un vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques codant pour celui-ci ou d’une cellule hôte non humaine exprimant celui-ci, pour produire du phloroglucinol ; l’utilisation étant caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend une séquence d’acides aminés ayant au moins 70% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ledit polypeptide est choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons des familles Ophiocordycipitaceae et Trichocomaceae, avantageusement des genres Hirsutella et Aspergillus, plus avantageusement des espèces Hirsutella minnesotensis 3608 et Aspergillus tanneri.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend une séquence d’acides aminés ayant au moins 80% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3.
4. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend en outre au moins un fragment choisi parmi :
(a) LVTSTGFXiAPGVDV, dans laquelle Xi est choisi parmi les acides aminés apolaires (SEQ ID NO :4) ;
(b) VNFMGCAAAMNGLR (SEQ ID NO :5);
(c) CCVELSSVNAV (SEQ ID NO:6) ;
(d) ISSLFADGX2AAMWGS, dans laquelle X2 est choisi parmi les acides aminés apolaires ou polaires neutres (SEQ ID NO : 7) ;
(e) WAIHPGGPKIIEES (SEQ ID NO :8);
(f) GNMLSASLPFVL (SEQ ID NO :9); et
(g) AFSFAPGX3TVEG, dans laquelle X7 est choisi parmi les acides aminés apolaires (SEQ ID NO :10).
5. Utilisation selon la revendication 4, dans laquelle caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend en outre au moins un fragment choisi parmi :
(a) LVTSTGFXiAPGVDV, dans laquelle X1 est choisi parmi les acides aminés apolaires aliphatiques (SEQ ID NO :11 ) ; (b) VNFMGCAAAMNGLR (SEQ ID NO :5);
(c) CCVELSSVNÀV (SEQ ID NO:6) ;
(d) ISSLFÀDGX2AAMWGS, dans laquelle X2 est choisi parmi les acides aminés apolaires soufrés ou polaires neutres (SEQ ID NO: 12) ;
(e) WÀIHPGGPKIIEES (SEQ ID NO :8);
(f) GNMLSÀSLPFVL (SEQ ID NO :9); et
(g) ÀFSFÀPGX3TVEG, dans laquelle X3 est choisi parmi les acides aminés apolaires aliphatiques (SEQ ID NO :13).
6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend en outre au moins un fragment choisi parmi :
(a) LVTSTGFX1ÀPGVDV, dans laquelle X1 est choisi parmi la valine et l’isoleucine (SEQ ID NO :14) ;
(b) VNFMGCAAAMNGLR (SEQ ID NO :5);
(c) CCVELSSVNAV (SEQ ID NO:6) ;
(d) ISSLFADGX2AAMWGS, dans laquelle X2 est choisi parmi la cystéine et la sérine (SEQ ID NO:15) ;
(e) WAIHPGGPKIIEES (SEQ ID NO :8);
(f) GNMLSASLPFVL (SEQ ID NO :9); et
(g) AFSFAPGX3TVEG, dans laquelle X3 est choisi parmi la valine et l’isoleucine (SEQ ID NO :21 ).
7. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend une séquence d’acides aminés choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2 et SEQ ID NO :3.
8. Molécule d’acides nucléiques isolée comprenant une séquence d’acides nucléiques codant pour un polypeptide tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que : a) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques ; ou b) la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques ; ou c) la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une cellule hôte, notamment une levure ou une bactérie ; ou d) toute combinaison de a) à c).
9. Molécule d’acides nucléiques isolée selon la revendication 8, caractérisée en ce que lorsque la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques, le promoteur est un promoteur exogène, en particulier un promoteur de levure.
10. Molécule d’acides nucléiques isolée selon la revendication 8, caractérisée en ce que lorsque la molécule d’acides nucléiques isolée comprend en outre un terminateur de transcription contrôlant l’expression de la séquence d’acides nucléiques, le terminateur de transcription est un terminateur exogène, tel qu’un terminateur de levure.
11. Molécule d’acides nucléiques isolée selon la revendication 8, caractérisée en ce que la séquence d’acides nucléiques est en outre optimisée pour l’expression dans une levure, avantageusement elle est choisie parmi SEQ ID NO :25 à SEQ ID NO :27.
12. Vecteur comprenant une molécule d’acides nucléiques selon l’une quelconque des revendications 8 à 11 , ledit vecteur étant de préférence un plasmide.
13. Cellule hôte non humaine comprenant une molécule d’acides nucléiques selon l’une quelconque des revendications 8 à 11 , ou un vecteur selon la revendication 12.
14. Cellule hôte non humaine selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une levure, avantageusement sélectionnée parmi les genres Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zi osaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus et Malassezia de manière plus particulière parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zi osaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa ou Torulaspora glabrata ; encore plus particulièrement, la levure est du genre Saccharomyces, de préférence de l’espèce Saccharomyces cerevisiae.
15. Méthode pour produire du phloroglucinol, qui comprend les étapes suivantes : (111 ) la mise en contact d’une cellule hôte non humaine exprimant le polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 7, avec un substrat approprié ;
(iii1 ) la culture in vitro de la cellule hôte de l’étape (i) dans des conditions permettant l’expression de la molécule d’acides nucléiques contenue dans ladite cellule hôte, de manière à produire du phloroglucinol ;
(iv1 ) optionnellement la récupération du milieu de culture comprenant le phloroglucinol, obtenu après l’étape (ii) ; et
(v1 ) optionnellement, la purification du phloroglucinol à partir du milieu de culture de l’étape (iii).
16. Méthode pour produire du phloroglucinol, qui comprend les étapes suivantes :
(112) la mise en contact d’un polypeptide choisi parmi les polykétide synthases de type III de champignons Ascomycètes tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 7 avec du malonyl-CoA ;
(iii2) l’incubation du mélange issu de l’étape (i) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol ;
(iv2) optionnellement la récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol, obtenu après l’étape (ii) ; et
(v2) optionnellement, la purification du phloroglucinol à partir du milieu réactionnel de l’étape (iii).
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