WO2024252076A1 - Composition de calibration prete a l'emploi, et procede de calibration d'un spectrometre de masse - Google Patents

Composition de calibration prete a l'emploi, et procede de calibration d'un spectrometre de masse Download PDF

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WO2024252076A1
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PCT/FR2024/000063
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English (en)
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Jean-Philippe Charrier
Rémi-Vinh COUDERT
Frédéric JAUFFRIT
Nadine Perrot
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Biomerieux SA
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers

Definitions

  • the present invention relates to the field of mass spectrometry, which finds various applications in the fields of biomedical research, medicine, diagnostics and biotechnology. More specifically, the invention relates to a calibration composition and a method for calibrating a mass spectrometer using the matrix-assisted desorption-ionization technique, known as MALDI. In particular, the invention is suitable for the matrix-assisted desorption-ionization and time-of-flight measurement technique, known as MALDI-TOF.
  • the calibration composition and the calibration method according to the invention aim to ensure reliable calibration of the spectrometer used and thus to obtain sufficiently precise measurements of the masses of the ions generated from a sample to be analyzed.
  • the invention also relates to the use of a calibration composition according to the invention, as an external standard for the calibration of a mass spectrometer and a method for characterizing a sample containing at least one microorganism.
  • microorganisms and, more generally, that of a sample likely to contain a microorganism, by mass spectrometry and, in particular, by MALDI or MALDI-TOF has been used for a number of years to carry out rapid identification of microorganisms, and also to determine the resistance of microorganisms to certain antimicrobial agents, as illustrated, for example, in application WO 2016/0166580, in the name of the applicant.
  • the identification of a microorganism is carried out from the mass spectrum of the most abundant proteins in the microorganism, by comparison with reference data allowing, in particular, the identification of the family, genus and most often the species of the microorganism.
  • the protocol implemented includes the deposit of a sample to be analyzed, likely to contain a microorganism, on a MALDI analysis plate, the addition of a matrix adapted to the MALDI technique, the acquisition of the mass spectrum using a MALDI-TOF mass spectrometer, and the identification of the species by comparison with reference data stored in a database.
  • the MALDI-TOF technique is also used to detect the resistance of a microorganism to an antibiotic, and in particular to identify a phenotype, responsible for the hydrolysis of beta-lactam antibiotics, due to the secretion of beta-lactamase enzymes, and in particular, carbapenemase enzymes.
  • spectrometers suitable for such characterization, are marketed in particular by the applicant (in particular, under the references VITEK® MS and VITEK® MS Prime), as well as by the companies Bruker Daltonics and Autobio in particular.
  • These spectrometers are of the MALDI-TOF type and include in particular a laser ionization source and a time-of-flight mass analyzer. They are designed to operate with an analysis plate, also called a MALDI plate or MALDI target, on which a sample to be analyzed is deposited in combination with a matrix suitable for the MALDI technique, the latter being able to be deposited at the same time or after the sample.
  • the analysis plate is introduced into an analysis chamber of the spectrometer which is brought to a relatively high vacuum level, with a pressure which is for example less than 10' 5 mbar (10' 3 Pa), typically in the range from 10' 6 to 10' 9 mbar (10' 4 to 10' 7 Pa).
  • a pressure which is for example less than 10' 5 mbar (10' 3 Pa), typically in the range from 10' 6 to 10' 9 mbar (10' 4 to 10' 7 Pa).
  • the sample placed within the MALDI matrix is subjected to gentle ionization by laser.
  • the matrix absorbs the photonic energy and the restitution of this energy leads to the sublimation of the matrix, the desorption of the molecules present in the sample and the appearance of matter in a state called plasma.
  • charge exchanges occur between molecules from the matrix and molecules from the sample, and in particular microorganisms. For example, protons can be torn from the matrix and transferred to proteins, peptides and organic compounds present in the sample.
  • This step allows a gentle ionization of the molecules present without inducing their destruction.
  • the sample thus releases ions of different sizes.
  • the ions generated are then accelerated by an electric field and fly freely in a tube under reduced pressure, called a flight tube.
  • the smallest ions will then "travel" faster than the larger ions, thus allowing their separation.
  • At the terminal end of the flight tube is a detector.
  • a mass spectrum is obtained, representing the intensity of the signal corresponding to the number of ionized molecules of the same mass to charge [m / z], as a function of the time of flight (or TOF for "Time Of flight” in English) of the molecules that strike the detector.
  • the flight time taken by the ions is used to calculate their mass to charge ratio [m / z], expressed in Thomson (Th).
  • Calibrating a mass spectrometer increases the reliability of the measurements taken and therefore the use of the mass spectra generated, particularly for the identification of microorganisms in a sample.
  • Calibration consists of adjusting the experimental mass-on-charge value obtained to a so-called calibrated value which will then appear on the mass spectrum generated and be used to characterize the sample to be analyzed.
  • Such calibrations can be done by using an internal calibrating agent integrated into the sample, or an external calibrating agent, called an external standard, deposited on at least one deposition zone of a MALDI analysis plate.
  • a MALDI I analysis plate typically includes:
  • deposition zones 1 also called spots
  • analysis zones for the deposition of sample(s) to be characterized; after drying, these zones 1 form so-called characterization zones, and
  • deposition zones 2 - one or more deposition zones 2, called reference zones, for the deposition of an external standard; after drying, these zones 2 form so-called control zones; these zones are in the form of wells, most often circular in shape.
  • MALDI plates are typically made from materials such as stainless steel, gold, silicon, a plastic polymer coated with metal, or enriched with a conductive agent (such as carbon black), or coated glass. They typically have a textured surface to facilitate the deposition of samples to be analyzed and external standards.
  • the surface of the plate is generally conductive, at least at the analysis and reference deposition areas.
  • an analysis plate is formed from a polymer such as polypropylene, said polymer being covered with a layer of stainless steel.
  • the polymer may contain a conductive material such as carbon black.
  • Various MALDI plates are commercially available such as the VITEK® MS plates from bioMérieux (disposable) and the MALDI Biotarget plates from Bruker Daltonics (reusable). Such plates I most often comprise from 48 to 96 analysis areas 1, and at least one, or even two or three reference areas 2 and whose size may be different from that of the analysis areas 1.
  • E. coli Escherichia coli ATCC 8739 strain
  • VITEK® MS user manual a freshly cultured Escherichia coli (E. coli) ATCC 8739 strain
  • the bacteria are cultured on agar medium, for 18 to 24 hours, at 37°C.
  • a quantity of bacteria is then recovered and deposited on the MALDI plate, at a reference zone.
  • This calibration method has the inconvenience of having to have freshly cultured bacteria.
  • BTS from the English “Bacterial Test Standard”
  • Bruker is an extract of E. coli enriched with two high molecular weight proteins.
  • BTS was developed to serve as quality control for the MALDI-TOF Biotyper spectrometer from Bruker.
  • the technical data sheet for BTS indicates that its specific composition covers the entire range of protein masses used by the Biotyper for the precise identification of microorganisms, and in particular the range from 3.6 to 17 kDa.
  • the quality control process includes calibrating the mass spectrometer, checking the laser setting and evaluating the quality of the spectrum.
  • Patent CN104931572B can also be cited.
  • the latter proposes a calibration composition which, like Bruker's BTS, is of the bacterial extract type, but with the advantage for its user of being ready to use.
  • This bacterial lysate/extract is prepared according to the following method according to the available automatic translation:
  • Protein A washing solution which is deionized water or ultrapure water is added to the strain mixture, at a mass/volume ratio of 5-10 mg:0.1-0.5mL, and then Protein B washing solution, which is anhydrous ethanol, is added at a volume ratio of 5-2:1; after mixing and centrifugation, the supernatant is discarded;
  • step (3) Add to the precipitate obtained in step (2), a protein dissolution solution A, according to a mass/volume ratio of (5-10 mg):(0.025-0.125 mL), mix well, and then add the same volume of a protein dissolution solution B as for the protein dissolution solution A; centrifuge and take the supernatant as a calibration composition; the protein dissolution solution A is a 50-80% formic acid solution of HPLC grade and the protein dissolution solution B is acetonitrile of HPLC grade.
  • the present invention proposes to provide new calibration compositions which combine the following advantages:
  • the present invention provides a calibration composition for a mass spectrometer, comprising whole E. coli bacteria, suspended in a liquid based on alcohol(s) and/or acetonitrile.
  • a calibration composition according to the invention is formulated in the form of an intrinsically volatile, antiseptic liquid, which allows good preservation over time of bacteria and their proteins.
  • alcohol designates an unsaturated aliphatic alcohol, in particular an unsaturated C1-C4 aliphatic alcohol, preferably ethanol and isopropanol.
  • a calibration composition according to the invention thus contains whole bacteria, preserved in this state until the time of undertaking the calibration operations.
  • the bacterial proteins in particular those chosen as references for the calibration, benefit from protection against biological and/or chemical alterations, ensured both by the very structure of the bacteria remaining whole/intact and by the alcohol(s) and/or acetonitrile.
  • the alcohol(s) and/or acetonitrile of a calibration composition according to the invention have as such an advantageous chemical/reaction neutrality with respect to the proteins.
  • such a liquid and volatile formulation offers the calibration compositions according to the invention the advantage of being able to be used directly and as is, and of greatly facilitating the calibration operations of spectrometers.
  • the operator With a calibration composition according to the invention, the operator will simply have to take the prescribed volume (which corresponds to a pre-established quantity of cells), and deposit it on the analysis plate. To do this, a pipette or any other suitable utensil may be used.
  • the high volatility of the alcohol(s) and/or acetonitrile which compose(s) the liquid phase of a calibration composition according to the invention allows(s) the liquid phase to evaporate quickly to leave on the deposition zone, only a thin and homogeneous layer of cells.
  • the liquid phase of a calibration composition according to the invention is based on alcohol(s). According to a preferred embodiment, it is an aqueous liquid with an alcohol(s) content of at least 20% v/v, typically 70% v/v.
  • the alcohol(s) included in the calibration composition according to the invention is/are ethanol and/or isopropanol.
  • the alcohol-based liquid of a calibration composition according to the invention consists of an aqueous water/ethanol mixture, with an ethanol content of 70%.
  • the liquid phase of a calibration composition according to the invention is based on acetonitrile, that is to say a 100% v/v acetonitrile solution or a water/acetonitrile mixture, with an acetonitrile content of at least 20% v/v, typically 70% v/v.
  • the E. coli bacteria of a calibration composition according to the invention come from a strain unique.
  • these bacteria are derived from strain BL21 or strain ATCC 8739.
  • E. coli strain BL21 was described in 1986 (StudierF.W., Moffatt B A., J Mol Biol. 1986 May 5; 189(1): 113-30. “Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes”), and was fully characterized by sequencing in 2015 (Jeong H., Ju Kim H., Jun Leeb S., Genome Announc. 2015 Mar 19;3(2). e00134-15.
  • E. coli strain BL21 Complete Genome Sequence of Escherichia coli Strain BL21).
  • This E. coli strain is commercially available and can be obtained from Agilent (catalog number #200133).
  • Strain ATCC 8739 is also commercially available, in particular from TATCC. Its genetic sequence is available in GenBank under the number GCA 016864475.1.
  • strain BL21 or ATCC 8739 it is also possible to use any other strain of E coli known to the person skilled in the art, in particular strain E coli K-12 (ATCC 10798).
  • a calibration composition consisting of a suspension of E coli bacteria of the BL21 strain in an aqueous liquid based on alcohol and/or acetonitrile.
  • a calibration composition consisting of a suspension of E coli bacteria of the ATCC 8739 strain in an aqueous liquid based on alcohol and/or acetonitrile.
  • the composition of alcohol(s) and/or acetonitrile is chosen for structural preservation of the E coli bacteria present in the composition, at a temperature of 0 to 37°C, in particular 0 to 25°C.
  • this aqueous liquid based on alcohol(s) and/or acetonitrile, or more generally the calibration composition does not include any acid or other chemical substance likely to react with the proteins, directly or indirectly.
  • any chemical substances such as detergents, bases
  • any chemical substances likely to extract proteins that are not usually detected with a conventional deposit will be avoided.
  • the E coli bacteria are present at a concentration of 2 to 7 McF (McFarland), in particular 3 to 6 McF, for example 5 McF.
  • McFarland a concentration of 2 to 7 McF
  • a concentration can be determined by a densitometer (for example, the DENSIMAT marketed by the company bioMérieux), which makes it possible to measure the optical density of a liquid composition, in particular under incident light with a wavelength between 500 and 600 nm, and preferably at 550 nm.
  • the bacterial concentration of a liquid composition may also be expressed in colony forming units per milliliter (cfu/mL).
  • the E. coli bacteria are present at a concentration of 6.10 8 to 21.10 8 cfu/mL.
  • Table 1 gives the correspondence between optical density, value in McFarland units (McF) and bacterial concentration in 10 8 cfu/mL.
  • the calibration compositions according to the invention are stable. This stability can be demonstrated by mass spectrometry, in particular by MALDI-TOF. No degradation of the proteins present is thus observed, in particular the proteins chosen as references for the calibration. Their masses, apart from the analytical error, do not change. The stability of the calibration compositions according to the invention can also be verified through their capacity to provide calibrations of relatively constant high quality over time.
  • the calibration compositions according to the invention can be stored in tubes, in particular plastic tubes, closed with a cap, or in any other type of suitable and hermetically sealed container. They can then be stored in this way for several months, in particular for at least 1 month, or at least 2 months, and preferably for at least 6 months, at a temperature of 0 to 37°C, typically 0 to 25°C.
  • the calibration compositions according to the invention lead to deposits on MALDI plates which are reliable and reproducible and therefore make it possible to ensure calibrations, and therefore mass spectrometry measurements on samples or microorganisms to be characterized, which are just as reliable and reproducible.
  • the calibration compositions according to the invention are ready-to-use solutions that can easily be implemented during mass spectrometry measurements and/or calibration procedures. Due to their liquid formulation, they are easy to to be collected and deposited. The evaporation of the liquid phase then leaves room for a localized deposit, in the form of a thin and uniform cellular layer. In particular, a precise volume of 1 to 2 ⁇ L, and typically 1 ⁇ L, of a calibration composition according to the invention can be easily and quickly collected and then deposited on the analysis plates, precisely on the deposit areas.
  • the calibration compositions of the invention simplify the calibration workflow to be carried out during mass spectrometry measurements, by avoiding the need to carry out new cultures of E. coli each day, since the calibration compositions are easily stored in a ready-to-use form.
  • the invention relates to the use of a calibration composition according to the invention, as an external standard for the calibration of a mass spectrometer, according to the MALDI technique, and in particular according to the MALDI-TOF technique.
  • the calibration compositions according to the invention could also be used in internal calibration, for example to adjust the acquisition parameters of mass spectrometers, according to the MALDI technique, and in particular according to the MALDI-TOF technique used, or as quality control.
  • a method for calibrating a mass spectrometer adapted to the MALDI technique, and in particular to the MALDI-TOF technique comprising the following steps: a) providing a calibration composition according to the invention, b) depositing said calibration composition and a matrix adapted to the MALDI technique, on at least one deposition zone of a MALDI analysis plate, to obtain a control zone after drying, c) placing said MALDI analysis plate in the mass spectrometer and obtaining a mass spectrum for the control zone according to the MALDI technique, and in particular according to the MALDI-TOF technique, over at least one determined mass-to-charge range and using the experimental values obtained from the masses-to-charge of peaks of said spectrum corresponding to so-called reference protein ions of the calibration composition, as calibration values, d) calculating a calibration relationship based on the theoretical masses-to-charge of the reference protein ions and the calibration values.
  • the determined load mass range covers at least the range from 2000 Th to 20000 Th, preferably from 2000 Th to 15000 Th.
  • the theoretical masses on charge used in step d) may be at least 6 in number, preferably in the number of 8 to 50, and in particular 8 to 32.
  • the strain of the calibration composition is an E. coli ATCC 8729 strain
  • the ions of the reference proteins and therefore the theoretical masses on charge in Th used are chosen from those listed in Table 2.
  • the strain of the calibration composition is an E. coli BL21 strain
  • the ions of the reference proteins and therefore the theoretical masses on charge in Th used are chosen from those listed in Table 5.
  • the theoretical masses on charge used in step d) are at least 6 in number, preferably 8 to 50 in number and are, in particular, chosen from the following theoretical masses on charge m/z in Th:
  • the theoretical masses on charge used in step d) are at least 6 in number, preferably 8 to 32 in number, and in particular 32 in number, and are, in particular, chosen from the following theoretical masses on charge m/z in Th, when the E. coli strain is BL21: 3,128.18; 3,158.57; 3,206.28; 3,579.84; 3,637.70; 4,163.59; 4,185.35; 4,365.31; 4,438.61; 4,613.75; 4,768.45; 4,777.56; 5,069.74; 5,096.78; 5,150.50; 5,381.35; 5,612.32; 6,255.36; 6,316.14; 6,411.55; 7,158.68; 7,274.39; 8,369.69; 8,876.22; 8,994.20; 9,226.49; 9,535.89; 9,554.12; 10,138.48; 10,300.00; 11,223.63 and 11,450.19.
  • the MALDI matrix may be any matrix suitable for the MALDI technique.
  • such a matrix comprises one of the following compounds: 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, ferulic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid.
  • the invention relates to a method for characterizing a sample containing at least one microorganism from the acquisition of a mass spectrum, by the MALDI technique, and in particular by the MALDI-TOF technique, implementing the following steps: i) depositing said sample and a matrix adapted to the MALDI technique, on at least one deposition zone of an analysis plate, and carrying out drying, to obtain a characterization zone, ii) placing said analysis plate in a mass spectrometer adapted to the MALDI technique, and in particular to the MALDI-TOF technique and generating a mass spectrum for the characterization zone, iii) applying the calibration relationship calculated according to the calibration method of the invention for said mass spectrometer, and determining the mass on charge of the peaks in the mass spectrum generated.
  • control analysis area and the characterization area belong to the same MALDI analysis plate. This has the advantage of making calibration operations simpler and faster by reducing the handling steps.
  • the characterization method according to the invention comprises an identification of a microorganism present in the sample, by comparison of the mass on charge values of at least certain peaks of the mass spectrum generated obtained in step iii), with reference values characteristic of the microorganism.
  • FIG. 1 represents a schematic top view of a MALDI plate, notably marketed by the applicant;
  • FIG. 2 in connection with Example 2, shows the evolution over time of the MALDI-TOF mass spectrum obtained with a VITEK® MS, for a composition of E. coli outside the invention; the bacteria being suspended whole in a commercial mixture of solvents (in this case, the HCC A matrix from bioMérieux; ref. 411071);
  • FIG. 3 in connection with Example 3, shows the spectra obtained with a VITEK® MS, for two calibration compositions according to the invention, at 70% v/v ethanol, after a storage period of five months at room temperature; these compositions having been prepared according to 2 different protocols (A: from E. coli ATCC 8739 cultured on agar medium; B: from E.
  • Example 4 shows different MALDI-TOF spectra obtained with a VITEK® MS, corresponding to the analysis of the contents of a tube initially comprising 100 ⁇ L of a calibration composition according to the invention (E coli ATCC 8739 suspended in an aqueous liquid at 70% v/v ethanol), after evaporation of 20%, 50% or 80% of the initial volume;
  • Example 5 shows a MALDI-TOF mass spectrum obtained with a VITEK® MS, before calibration, for a calibration composition of Example 3 (E coli BL21 suspended in an aqueous liquid at 70% v/v ethanol);
  • FIG. 8 shows the second final super calibration graph from the 49 theoretical masses selected from the 6,563 MALDI-TOF spectra obtained with a VITEK® MS, used in Example 8.
  • EXAMPLE 1 Preparation of a calibration composition according to the invention, deposition on MALDI analysis plate, and calibration
  • a calibration composition according to the invention can be prepared by simply placing a selected quantity of whole E. coli bacteria of the selected strain, in a liquid based on alcohol(s) and/or acetonitrile.
  • the calibration composition thus comprises a suspension of E. coli bacteria, preserved whole.
  • the E. coli bacteria used can be those directly purchased or derived from bacteria purchased and cultured, using any suitable technique: on a Petri dish, in broth, etc. These culture techniques are well known to those skilled in the art. As demonstrated in the examples, the culture method has no influence on the stability of the calibration composition obtained.
  • E. coli bacteria are cultured in broth, in a fermenter, until the desired amount of biomass is reached.
  • the biomass is then pelleted by centrifugation and then diluted, in 70% ethanol solution, to obtain the desired concentration.
  • a mechanical dispersion operation may prove useful. It can be carried out for example by creating a vortex or by dispersing the bacteria with an instrument such as an Ultra-Turrax from IKA (Staufen, Germany) equipped with a high-performance rotor-stator. A sonication step could also be carried out.
  • a calibration composition according to the invention can be used directly or can be stored in any suitable container and/or can be marketed as a ready-to-use composition in any suitable container.
  • a suitable container there may be mentioned, in particular, a tube, for example made of plastic, closed by a cap, or any type of suitable hermetically sealed container.
  • the container will have a volume selected to be able to contain the desired quantity of calibration composition, in particular from 10 to 300 ⁇ L and typically 200 ⁇ L. Such volumes make it possible to produce a large number of deposits, which are typically deposits of 1 ⁇ L, and therefore a large number of calibrations.
  • the calibration compositions according to the invention are stable, in particular for at least one year at 2-8°C, at least two months at room temperature (typically at 18-25°C), when they are stored in a closed container, and for at least one day at room temperature, when the container is opened.
  • the calibration compositions according to the invention are therefore stable over time and make it possible to obtain good calibration.
  • a calibration composition according to the invention is deposited at the control zone(s) of a MALDI plate.
  • This deposition can be carried out using a pipetting technique, or possibly a spraying technique.
  • a drop, for example of approximately 1 to 2 ⁇ L of the calibration composition can be deposited, so as to cover the entire deposition zone. It is easy to form a thin, uniform layer of calibration composition on the plate, due to the liquid formulation.
  • a calibration composition according to the invention does not require any particular expertise or skill. It is compatible with manual and automated preparation (for example using the Colibri® technique proposed by the applicant) of MALDI plates, and in particular of the VITEK® MS-DS type.
  • the operation of depositing a calibration composition according to the invention and a matrix adapted to the MALDI technique, on the MALDI plate can be done sequentially or by depositing a mixture of said calibration composition and the matrix.
  • the calibration composition according to the invention can be simply deposited by pipetting 1 ⁇ L onto a control zone of the MALDI plate, followed by the addition of 1 ⁇ L of MALDI matrix, in particular HCC A matrix, and drying.
  • the matrices used in the MALDI technique are generally organic molecules that have specific characteristics. They must be capable of absorbing the energy of the laser used for irradiation, which results in the vaporization of the matrix and the formation of ions. In addition, the matrices must be compatible with the samples analyzed and not interfere with the ions of interest.
  • the matrices used in the MALDI technique are photosensitive and crystallize in the presence of the population of microorganism(s), while preserving the integrity of the molecules present.
  • Such matrices particularly suitable for the MALDI-TOF mass spectrometry technique, are well known. They are formed, for example, from a compound chosen from: 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (present in the HCCA matrix), ferulic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid. Many other compounds are known to the person skilled in the art.
  • such a compound is dissolved, most often in water, preferably of “ultra-pure” quality, or in a mixture of water/organic solvent(s).
  • organic solvents conventionally used include acetone, acetonitrile, methanol or ethanol.
  • the matrix may contain trifluoroacetic acid which facilitates ionization.
  • the matrix is directly deposited on the control zone and covers or is mixed with the calibration composition.
  • the drying of the calibration composition deposited, before or after deposition of the matrix, on the MALDI plate is carried out at a temperature and for a time appropriate to ensure the formation of a thin uniform layer of the latter. Mild conditions well known to the person skilled in the art are preferred.
  • the drying of the calibration composition, alone and/or with the addition of a matrix can be carried out by evaporation by exposing the whole in ambient air for a few minutes. This evaporation also ensures the crystallization of the matrix present.
  • the amount of E. coli bacteria of the calibration composition deposited per control zone is generally at least 10 5 cfu, and in particular from 6.10 5 to 42.10 5 cfu.
  • the MALDI plate is prepared with a layer of calibration composition, in the form of a control zone as described above, it is placed in a mass spectrometer, in particular MALDI or MALDI-TOF, and a corresponding mass spectrum is acquired.
  • a mass spectrometer in particular MALDI or MALDI-TOF
  • the desorbed and ionized proteins are then detected to generate the mass spectrum.
  • the acquisition of the mass spectrum is therefore carried out by irradiating the MALDI plate with a MALDI laser and detecting the desorbed and ionized proteins.
  • any type of MALDI-TOF mass spectrometer can be used for the development of the mass spectrum.
  • Such devices comprise: i) an ionization source (generally a UV laser) intended to ionize the control zone and therefore the calibration composition and/or a sample present on a characterization zone; ii) an accelerator of the ionized molecules by application of a potential difference; iii) a tube under reduced pressure in which the ionized and accelerated molecules move; iv) a mass analyzer intended to separate the molecular ions formed, according to their mass on charge (m/z); v) a detector intended to measure the signal produced directly by the molecular ions.
  • an ionization source generally a UV laser
  • an accelerator of the ionized molecules by application of a potential difference iii)
  • a tube under reduced pressure in which the ionized and accelerated molecules move iv
  • a mass analyzer intended to separate the molecular ions formed, according to their mass
  • the laser beam used for ionization may have any type of wavelength favorable to the sublimation or vaporization of the matrix.
  • an ultraviolet or even infrared wavelength will be used.
  • This ionization may, for example, be carried out with a nitrogen laser emitting a UV ray at 337 nm (for example used in the VITEK® MS), or with a neodymium-doped yttrium and lithium fluoride laser (Nd:YLF) emitting at 349 nm (for example used in the VITEK® MS PRIME).
  • the time of flight taken by the ions to reach the detector is used to calculate their mass.
  • a mass spectrum is obtained, representing the intensity of the signal corresponding to the number of ionized molecules of the same mass on charge [m/z], in function of the m/z ratio of the molecules hitting the detector.
  • the mass-to-charge ratio [m/z] is expressed in Thomson (Th).
  • the mass spectrum is generated in particular by detecting at least some of the ionized and accelerated molecules then allowed to move freely in a tube under reduced pressure, so as to measure the time they take to travel through the tube under reduced pressure and to obtain a signal corresponding to the number of ionized molecules reaching the spectrometer detector at a given time.
  • An uncalibrated spectrum with the flight time of the ions on the abscissa and the intensity of the observed signal on the ordinate, is thus obtained. It is transformed into a mass spectrum by calculating the mass-to-charge ratios (m/z) corresponding to the flight times of the detected molecules. To do this, a flight time calibration equation is established using reference molecules. This results in a calibrated mass spectrum corresponding to the signal of the number of ionized molecules of the same mass-to-charge m/z, as a function of the m/z ratio of the detected molecules.
  • the peaks corresponding to the so-called reference molecules, in ionized form (called ion of a reference molecule) of the calibration composition, called reference peaks, are identified and their theoretical masses on charge m/z will be used as calibration values.
  • This identification can be carried out by comparing the measured flight times, called experimental, of the peaks of the uncalibrated spectrum with the theoretical masses of said ions of the reference proteins, or with the measured masses on charge m/z, called experimental, of the mass spectrum if a previous calibration is already available in the instrument and applied.
  • a calibration relationship and an error are calculated. Different linear or nonlinear regression methods can be used to calculate such a calibration relationship.
  • the least squares method or any method well known to the person skilled in the art can be cited for performing a calibration.
  • Mass spectrometers are usually equipped with appropriate software to implement such methods.
  • the calculation of an error in parts per million (ppm) is performed for each reference charge mass value (or reference protein ion), considering the experimental value obtained and the corresponding theoretical value. To do this, the following formula can be: (theoretical mass - experimental mass) / theoretical mass * 10 6 .
  • the calibration relationship thus established is then applied to determine the masses on charge of the peaks of protein or molecule ions present in the analyzed samples, on characterization zones of the MALDI plate. These corrected masses, also called calibrated, are obtained in step iii) of the characterization procedure of a sample, as previously defined.
  • the calibration compositions and the method for calibrating a mass spectrometer according to the invention make it possible to obtain precise measurements of the masses of the ions analyzed, and therefore a reliable identification of microorganisms.
  • the calibration compositions and the method for calibrating according to the invention are simple to implement and can be used in various analysis applications, and in particular for the identification of microorganisms, by mass spectrometry using the MALDI technique, and in particular MALDI-TOF.
  • the MALDI-TOF analysis can be a simple MALDI-TOF analysis, or even a MALDI-TOF-TOF analysis.
  • the methods according to the invention are computerized or automated methods.
  • the steps of acquisition, calculation, comparison, determination, etc. are carried out by a computer or an electronic device programmed to execute said steps, integrated into the spectrometer used.
  • Specific software may be developed and installed on the computer or electronic device that will be used to execute the calibration method and, in particular, to obtain the calibration relationship.
  • the software is programmed to support the required functionalities, such as the acquisition of mass spectrometry data, the calculation of the masses on charge of the mass peaks of the mass spectrum corresponding to the ions of unknown proteins or molecules.
  • the calibration software can be programmed to analyze the mass spectrometry data and identify peaks corresponding to the calibration values. This step may involve adaptive peak detection, mass-to-charge comparison and thresholding algorithms to accurately identify relevant peaks.
  • the calibration software performs a calculation to determine the calibration relationship.
  • This calculation can use different statistical methods, such as linear or nonlinear regression, to establish a mathematical equation obtained from the theoretical masses on charge of the ions of the reference proteins and the masses on charge measured for the peaks corresponding to said ionized reference proteins, used as calibration values.
  • the software applies it to convert the measured flight times or masses on charge (also called experimental) of the peaks corresponding to an unknown entity on the mass spectra obtained for the samples to be analyzed, into calibrated masses on charge which are then reported on the generated mass spectrum. This step makes it possible to obtain precise measurements of the masses on charge of the ions present in the analyzed samples.
  • samples of biological origin may be of different origins.
  • samples of biological origin in particular animal or human, may be cited.
  • Such a sample may correspond to a sample of biological fluid, such as whole blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, organic secretion, to a tissue sample or to isolated cells.
  • This sample may be deposited as is, or will preferably be subjected, prior to depositing on the MALDI plate, to an enrichment or culture type preparation, to a concentration and/or to an extraction or purification step according to methods known to the person skilled in the art.
  • the sample may also be a food product such as meat, milk, yogurt and any other consumable product likely to be contaminated, or even a cosmetic or pharmaceutical product.
  • such a product may be subjected to an enrichment or culture type preparation, to a concentration and/or to an extraction or purification step, before being deposited on the MALDI plate.
  • the sample to be analyzed will come from a culture in broth or on agar in order to enrich it with microorganisms to be searched for. It is, for example, possible to directly deposit a biomass, a drop of a suspension of microorganisms, in ultra-pure water or a buffer.
  • optical density is measured with the DENSIMAT densitometer (bioMérieux, France) following the recommendations of the user manual (reference 99535, version C, published in 2007).
  • EXAMPLE 2 Evaluation of the stability of a suspension of E. coli in a commercial mixture of solvents (bioMérieux; ref. 411071).
  • HCCA matrix ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix
  • the HCCA matrix is commonly used on MALDI-TOF mass spectrometers for the measurement of peptides and proteins.
  • the stability of the suspension was then analyzed with a MALDI-TOF mass spectrometer (VITEK® MS, bioMérieux), by following the evolution of the calibration peaks between T0 and T7 days (7 days after T0). A progressive modification of the shape of the peaks was observed on all the spectra.
  • the doubly charged peak characteristic of the DNA-binding protein HU-alpha was clearly visible at T0 (m/z 4767). However, a third peak appeared at T24h (1 day after T0), a fourth at T48h (2 days after T0) and at T7d (7d after T0), 8 peaks were detected (Figure 2).
  • a degradation was thus observed over time and taking into account the mixture of solvents used (ethanol, acetonitrile and trifluoroacetic acid), the degradation being of chemical rather than biological origin. Considering that the observed delta of the masses on charge of the ionized proteins between the different peaks over time was approximately 28 Da and that the presence of ethanol and trifluoroacetic acid can protonate the proteins, the inventors believe that it is likely that the degradation corresponds to an ethylation.
  • the HCCA matrix solvent mixture commonly implemented in MALDI-TOF instruments does not provide sufficient stability of the calibration peaks of an E. coli strain over time and therefore cannot be used as a solvent in the calibration solution.
  • Two calibration compositions according to the invention were prepared from the E. coli ATCC 8739 strain used in Example 2, but cultured according to two different methods.
  • the calibration compositions prepared according to the two previous protocols were then used to calibrate a MALDI-TOF mass spectrometer (VITEK® MS, bioMérieux). Both compositions allowed to obtain a very good calibration of the mass spectrometer, because the reference peaks (including in particular, the calibration values used during the calibration) were still present and not degraded (data not shown) thus demonstrating that the strain production method (culture on Petri dish or culture broth) does not affect the quality of the calibration.
  • the method of culturing the E. coli strains used to obtain the calibration composition does not impact either the quality of the calibration on the MALDI-TOF mass spectrometer or even the stability over time of said composition.
  • Calibration composition used A. coli ATCC 8739 strain suspended at a concentration of 5 McF (i.e. to obtain an optical density at 550 nm of 1.0-1.1) in a 70% ethanol solution, and stored in 50 ⁇ L, 100 ⁇ L, 200 ⁇ L and 300 ⁇ L tubes.
  • the tubes were left open at room temperature (24°C ⁇ 1°C) until 20, 50 or 80% of the initial volume had evaporated.
  • the different partially evaporated calibration compositions were then used as calibration solution on a MALDTI-TOF mass spectrometer (VITEK® MS, bioMérieux).
  • EXAMPLE 5 Preparation of a calibration composition according to the invention of E. coli BL21 in 70% ethanol
  • a calibration composition according to the invention was prepared with the E. coli BL21 strain (E. coli BL21 suspended in 70% v/v ethanol).
  • EXAMPLE 6 Calibration of the MALDI-TOF instrument using a calibration composition according to the invention
  • a MALDI-TOF mass spectrometer measures the time of flight of ions in a vacuum, after their acceleration by an electric field. The time of flight is related to the mass of the ions according to the law of kinetic energy:
  • E c 1 ⁇ 2 mV 2 with E c kinetic energy, m mass and V velocity of the ions.
  • a higher degree polynomial can be used to account for physical and electronic imperfections of the mass spectrometer.
  • the equation is calibrated using molecules of known masses to account for experimental variations inherent to the instrument, the MALDI plate on which the sample was deposited or the acquisition conditions (temperature, pressure in the vacuum tube, etc.).
  • the instrument can be delivered by the manufacturer with a factory-pre-recorded calibration. This allows the user to acquire and analyze the first spectra using Thomson (Th) values directly.
  • the Thomson is a unit corresponding to the mass divided by the charge of the ion. Subsequently, the instrument can be regularly recalibrated using Th spectra without ever returning to the time-of-flight values. In this way, the user gets used to adjusting the instrument and viewing spectra using masses and not times-of-flight.
  • the quality of the calibration can easily be assessed by calculating the average of the errors, for the masses on charge of the ions of the reference proteins. As a reminder, this average of the errors is calculated using the absolute values of said errors.
  • a MALDI-TOF mass spectrum obtained with a VITEK® MS spectrometer from bioMérieux was calibrated using the calibration composition prepared according to Example 5.
  • the acquisition range of the instrument was set between 2,000 and 20,000 Th, a usual mass-on-charge range for identifying microorganisms in microbiology laboratories.
  • the spectrum of the calibration composition obtained showing the experimental m/z values without calibration is shown in Figure 5.
  • Table 2 32 selected theoretical m/z for E. coli ATCC 8739
  • the reference protein ions are searched with a tolerance of 800 ppm to calibrate the spectrum by the least squares method using a quadratic equation.
  • the average error before calibration is 372.69 ppm. This average value is then greatly reduced to 68.50 ppm after the first calibration, thus demonstrating that the masses on charge recalibrated by the composition according to the invention (columns “After 1st calibration”, Table 3) are more accurate than before calibration.
  • MALDI-TOF technology has a stochastic behavior that can randomly cause the disappearance or mass shift of certain peaks. For a given sample, some peaks can be visible or invisible from one acquisition to another depending on the crystals sublimated by the laser beam. Some peaks can also have a more or less noisy shape, which can lead to a more or less significant error in the detected mass.
  • Table 3 m/z values recorded for a calibration composition according to the invention (E. coli
  • Table 4 m/z values recorded for a calibration composition according to the invention (E. coli BL21; ethanol 70% v/v), freshly prepared, before and after calibration with reference to the 32 theoretical m/z of E. coli ATCC 8739.
  • Table 4bis m/z values recorded for a calibration composition according to the invention (E. coli BL21; ethanol 70% v/v), stored for 9 months at 2-8°C, before and after calibration
  • Table 4ter m/z values recorded for a calibration composition according to the invention (E. coli BL21; ethanol 70% v/v), stored for 12 months at 2-8°C, before and after calibration
  • EXAMPLE 8 Selection of calibration values depending on the strain used As demonstrated in Example 6, the calibration suspension prepared with E. coli strain BL21 improves the calibration when acquiring MALDI-TOF spectra. However, the quality of the calibration depends on the reference proteins selected to perform the calibration.
  • the purpose of this example is to present the methodology for selecting, for a given strain (in this case, the E. coli BL21 strain), the reference proteins whose theoretical charge masses are known and which will be used for calibration. This methodology is applicable to any other E. coli strain.
  • MALDI-TOF spectrum consists of searching for a list of expected theoretical masses on charge among the values experimental, that is to say the masses on charge measured and obtained from the mass spectrum before calibration. This association is carried out under a certain threshold of precision, a tolerance or an error noted in “ppm” for "parts per million”.
  • Table 5 shows the theoretical masses on charge (m/z) of a number of pre-selected proteins as well as the corresponding names, according to the same convention as Table 2.
  • the post-translational modifications can also be of the formylation type, or acetylation of the 2nd amino acid after cleavage of the methionine at the N-terminus, these modifications are noted f or a.
  • Table 7 5 m/z of a calibration composition according to the invention (E. coli BL21, ethanol 70% v/v), also excluded from the calibration process
  • the absolute measurement error was also corrected by the calibration with a median decreasing from 119.48 ppm to 19.41 ppm, a mean decreasing from 152.48 ppm to 25.23 ppm and a standard deviation decreasing from 126.39 ppm to 23.50 ppm.
  • the method of validating the masses on load corresponding to the calibration values made it possible to provide interpretations 6 times more accurate with a measurement randomness 4 times smaller.
  • the method of selecting the theoretical reference masses on load thus made it possible to significantly improve the calibration performances.
  • the mass spectrometer thus calibrated could then be successfully used for the identification of different microorganisms.
  • Table 9 provides, for information purposes, the results of a time stability test carried out on different calibration compositions according to the invention.
  • the tested compositions were prepared with E. coli BL 21 bacteria, suspended in a pure alcohol solution, or aqueous solutions of alcohol or acetonitrile, namely:
  • Table 9 Stability of calibration compositions, in terms of calibration performance (expressed as mean of errors).

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Abstract

L'invention concerne une composition de calibration prête à l'emploi, pour spectromètre de masse, comprenant des bactéries E. coli entières, en suspension dans un liquide à base d'alcool(s) et/ou d'acétonitrile, aseptisant, volatile et non-dénaturant à l'égard des protéines bactériennes.

Description

COMPOSITION DE CALIBRATION PRETE A L’EMPLOI, ET PROCEDE DE CALIBRATION D’UN SPECTROMETRE DE MASSE
La présente invention concerne le domaine de la spectrométrie de niasse, qui trouve des applications diverses dans les domaines de la recherche biomédicale, de la médecine, du diagnostic et de la biotechnologie. Plus précisément, l'invention concerne une composition de calibration et un procédé de calibration d'un spectromètre de masse utilisant la technique par désorption-ionisation assistée par matrice, dite MALDI. En particulier, l’invention est adaptée à la technique par désorption-ionisation assistée par matrice et mesure du temps de vol, dite MALDI-TOF. La composition de calibration et le procédé de calibration selon l’invention ont pour objectif de permettre d'assurer une calibration fiable du spectromètre utilisé et ainsi d'obtenir des mesures suffisamment précises des masses des ions générés à partir d’un échantillon à analyser.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’une composition de calibration selon l’invention, en tant qu’étalon externe pour la calibration d’un spectromètre de masse et un procédé de caractérisation d’un échantillon contenant au moins un microorganisme.
L’analyse de microorganismes et, plus généralement, celle d'un échantillon susceptible de contenir un microorganisme, par spectrométrie de masse et, en particulier, par MALDI ou MALDI-TOF est utilisée depuis un certain nombre d’années pour réaliser une identification rapide de microorganismes, et également pour déterminer la résistance de microorganismes à certains agents antimicrobiens, comme illustré, par exemple, dans la demande WO 2016/0166580, au nom de la demanderesse. L'identification d'un microorganisme est réalisée à partir du spectre de masse des protéines les plus abondantes dans le microorganisme, par comparaison avec des données de référence permettant, notamment, l’ identification de la famille, du genre et le plus souvent de l'espèce du microorganisme. En routine, le protocole mis en œuvre comprend le dépôt d’un échantillon à analyser, susceptible de contenir un microorganisme, sur une plaque d’analyse MALDI, l'ajout d'une matrice adaptée à la technique MALDI, l'acquisition du spectre de masse à l’aide d’un spectromètre de masse MALDI-TOF, et l'identification de l'espèce par comparaison avec des données de référence stockées dans une base de données. La technique MALDI-TOF est également utilisée pour permettre de détecter la résistance d'un microorganisme à un antibiotique, et notamment pour identifier un phénotype, responsable de l’hydrolyse des antibiotiques du type bêta-lactamine, du fait de la sécrétion d'enzymes de type bêta-lactamase, et notamment, de type carbapénémase. Différents spectromètres de masse, adaptés à une telle caractérisation, sont commercialisés notamment par la demanderesse (en particulier, sous les références VITEK® MS et VITEK® MS Prime), ainsi que par les sociétés Bruker Daltonics et Autobio notamment. Ces spectromètres sont du type MALDI-TOF et comprennent notamment une source d'ionisation laser et un analyseur de masse à temps de vol. Ils sont prévus pour fonctionner avec une plaque d'analyse, nommée également plaque MALDI ou cible MALDI, sur laquelle un échantillon à analyser est déposé en combinaison avec une matrice adaptée à la technique MALDI, cette dernière pouvant être déposée en même temps ou après l’échantillon.
Ensuite, la plaque d'analyse est introduite dans une chambre d'analyse du spectromètre qui est amenée à un niveau de vide relativement important, avec une pression qui est par exemple inférieure à 10'5 mbar (10‘3 Pa), typiquement dans la gamme allant de 10'6 à 10'9 mbar (10’4 à 10'7 Pa). Dans ces conditions de vide, l’échantillon placé au sein de la matrice MALDI est soumis à une ionisation douce par laser. La matrice absorbe alors l'énergie photonique et la restitution de cette énergie entraîne la sublimation de la matrice, la désorption des molécules présentes dans l’échantillon et l'apparition de matière dans un état qualifié de plasma. Au sein de ce plasma, il se produit des échanges de charges entre des molécules issues de la matrice et des molécules issues de l’échantillon, et en particulier des microorganismes. Par exemple, des protons peuvent être arrachés à la matrice et transférés aux protéines, peptides et composés organiques présents dans l’échantillon.
Cette étape permet une ionisation douce des molécules présentes sans induire leur destruction. L’échantillon libère ainsi des ions de différentes tailles. Dans les spectromètres de type MALDI-TOF, les ions générés sont alors accélérés par un champ électrique et volent librement dans un tube sous pression réduite, nommé tube de vol. Les ions les plus petits vont alors « voyager » plus rapidement que les ions plus gros, permettant ainsi leur séparation. A l'extrémité terminale du tube de vol est situé un détecteur. Ainsi, un spectre de masse est obtenu, représentant l'intensité du signal correspondant au nombre de molécules ionisées d'une même masse sur charge [m/z], en fonction du temps de vol (ou TOF pour « Time Of flight » en anglais) des molécules qui frappent le détecteur. Le temps de vol mis par les ions est utilisé pour calculer leur ratio masse sur charge [m/z], exprimé en Thomson (Th).
La calibration d'un spectromètre de masse permet d’augmenter la fiabilité des mesures réalisées et donc l’exploitation des spectres de masse générés, notamment pour l’identification de microorganismes d’un échantillon. La calibration consiste à ajuster la valeur expérimentale de masse sur charge obtenue à une valeur dite calibrée qui va alors figurer sur le spectre de masse généré et être utilisée pour la caractérisation de l’échantillon à analyser. De telles calibrations peuvent se faire par utilisation d’un agent calibrant interne intégré à l’échantillon, ou d’un agent calibrant externe, nommé étalon externe, déposé sur au moins une zone de dépôt d’une plaque d’analyse MALDI.
Comme illustré sur la Figure 1, une plaque d’analyse MALDI I comprend généralement :
- une série de zones de dépôt 1 (également nommées spots), dites zones d’analyse, pour le dépôt d’échantillon(s) à caractériser ; après séchage, ces zones 1 forment des zones dites de caractérisation, et
- une ou plusieurs zones de dépôt 2, dites zones de référence, pour le dépôt d’un étalon externe ; après séchage, ces zones 2 forment des zones dites de contrôle ; ces zones se présentent sous la forme de puits, le plus souvent de forme circulaire.
Les plaques MALDI sont généralement fabriquées à partir de matériaux tels que l'acier inoxydable, l'or, le silicium, un polymère plastique revêtu de métal, ou enrichi en agent conducteur (tel que le noir de charbon), ou encore le verre revêtu. Elles présentent, en général, une surface texturée pour faciliter le dépôt des échantillons à analyser et des étalons externes.
Afin de favoriser l'ionisation ultérieure, la surface de la plaque est généralement conductrice, au moins au niveau des zones de dépôt d'analyse et de référence. A titre d'exemple, une telle plaque d'analyse est formée d'un polymère tel que le polypropylène, ledit polymère étant recouvert d'une couche d'acier inoxydable. Le polymère peut contenir un matériel conducteur tel que le noir de charbon. Différentes plaques MALDI sont disponibles dans le commerce telles que les plaques VITEK® MS de bioMérieux (jetables) et les plaques MALDI Biotarget de Bruker Daltonics (réutilisables). De telles plaques I comprennent le plus souvent de 48 à 96 zones d'analyse 1, et au moins une, voire deux ou trois zones de référence 2 et dont la taille peut être différente de celle des zones d'analyse 1.
Actuellement, pour la calibration de ses appareils, la demanderesse préconise d’utiliser comme étalon externe, une souche Escherichia coli (E. coli) ATCC 8739 fraîchement cultivée, comme cela est décrit dans le manuel utilisateur du VITEK® MS. Les bactéries sont cultivées sur milieu gélosé, pendant 18 à 24 heures, à 37°C. Une quantité de bactérie est alors récupérée puis déposée sur la plaque MALDI, au niveau d’une zone de référence. Cette méthode de calibration présente le désagrément de devoir disposer de bactéries fraîchement cultivées.
De plus, prélever des bactéries d'une culture sur gélose pour les déposer sur une plaque d’analyse MALDI, en une zone spécifiquement dédiée de quelques mm2 (notamment de 5 à 15 mm2), et former une couche de cellules mince et homogène, s’avère être une opération manuelle particulièrement délicate. Les résultats peuvent être de qualité très variable d’un opérateur à l’autre, d’une manipulation à l’autre. Or, si le dépôt d’étalon externe est de mauvaise qualité, l'identification d’un microorganisme sur une plaque d’analyse MALDI qui comprend un grand nombre de spots pour le dépôt d’un échantillon d’intérêt (le plus souvent de 16 à 96 spots d’analyse) peut échouer. L’opérateur est alors contraint de refaire entièrement la préparation de la plaque.
D’autres types d’étalon externe permettant de réaliser une calibration d’un spectromètre de masse sont proposés dans l’art antérieur. A titre d’exemple, le BTS (de l’anglais « Bacterial Test Standard »), commercialisé parla société Bruker, est un extrait d'E. coli enrichi avec deux protéines de haut poids moléculaire. Le BTS a été développé pour servir de contrôle qualité du spectromètre MALDI-TOF Biotyper de la société Bruker. Sur la fiche technique du BTS, il est indiqué que sa composition spécifique couvre l'ensemble de la gamme de masses des protéines utilisée par le Biotyper pour l'identification précise des microorganismes, et, en particulier, la gamme allant de 3,6 à 17 kDa. Avec le BTS, le Biotyper effectue un contrôle de qualité automatique avant chaque cycle d'identification. Le processus de contrôle qualité comprend l'étalonnage du spectromètre de masse, la vérification du réglage du laser et l'évaluation de la qualité du spectre. La performance du système est finalement confirmée par l'identification d'E coli qui doit satisfaire à des critères de performance minimaux. Avant d’être utilisé, une dose de BTS est placé dans environ 50 μL d’un solvant composé de 50 % v/v (volume sur le volume total de solvants) d’acétonitrile, 47,5 % v/v d’eau et 2,5 % v/v d’acide trifluoroacétique. Le mélange est incubé pendant 5 minutes à température ambiante et différentes opérations de mélange par pipetage et centrifugation sont préconisées par le fournisseur Bruker sur le document Réf. 8290190, septembre 2017, IVD Bacterial Test Standard ». Des aliquotes de 5 μL ainsi obtenus peuvent être stockés dans des tubes fermés d’un bouchon et congelés à -18°C ou moins et être, ensuite, utilisés pour réaliser un dépôt sur quatre zones de dépôt différentes d’une plaque MALDI.
Le brevet CN104931572B peut également être cité. Ce dernier propose une composition de calibration qui, à l’instar du BTS de Bruker, est du type extrait bactérien, mais avec l’avantage pour son utilisateur d’être prêt à l’emploi. Ce lysat/extrait bactérien est préparé selon la méthode suivante d’après la traduction automatique disponible :
(1) sélectionner les souches d’E. coli ATCC 8739, MG 1655, JM 109, les cultiver jusqu'à leur phase de croissance logarithmique, les mélanger selon le rapport de masse de 3-8: 1-5: 1-3 ;
(2) une solution de lavage de protéines A qui est de l’eau déionisée ou de l’eau ultrapure est ajoutée au mélange de souche, selon un rapport masse/volume de 5-10 mg:0,l-0,5mL, puis une solution de lavage de protéines B, qui est de l’éthanol anhydre, est ajoutée selon un rapport en volume de 5-2: 1 ; après mélange et centrifugation, le surnageant est éliminé ;
(3) ajouter au précipité obtenu à l’étape (2), une solution de dissolution de protéines A, selon un rapport masse/volume de (5-10 mg):(0, 025-0, 125 mL), bien mélanger, puis ajouter le même volume d'une solution de dissolution de protéines B que pour la solution de dissolution de protéines A ; centrifuger et prendre le surnageant en tant que composition de calibration ; la solution de dissolution de protéines A est une solution d'acide formique de 50 à 80 % de qualité HPLC et la solution de dissolution de protéines B de l'acétonitrile de qualité HPLC.
Il apparait donc que cette composition de calibration est de manufacture complexe ; elle implique des opérations de préparation multiples et délicates.
Au vu des compositions de calibration de l’art antérieur et des déficiences constatées, la présente invention se propose de fournir de nouvelles compositions de calibration qui cumulent les avantages suivants :
- une facilité d’utilisation et de manipulation, notamment en termes d’opération de prélèvement et de dépôt d’une quantité appropriée de bactéries en une couche fine et homogène, qui ne nécessite de l’utilisateur aucune expérience ou tour de main particuliers,
- formulations prêtes à l’emploi, bénéficiant d’une durée de conservation suffisamment longue,
- une industrialisation simple et peu onéreuse.
Dans ce contexte, la présente invention propose une composition de calibration pour spectromètre de masse, comprenant des bactéries E. coli entières, en suspension dans un liquide à base d’alcool(s) et/ou d’acétonitrile.
Pour l’application proposée, les inventeurs ont ainsi constaté et démontré que les alcools du type « alcool aliphatique insaturé » (tels que méthanol, éthanol, propanol et butanol) et l’acétonitrile étaient particulièrement intéressants de par leur bonne volatilité, leurs propriétés aseptisantes non-dénaturantes pour les bactéries, et leur neutralité chimique/réactionnelle à l’égard des protéines. Dès lors, une composition de calibration selon l’invention est formulée sous la forme d’un liquide intrinsèquement volatile, aseptisant, qui permet une bonne conservation dans le temps des bactéries et de leurs protéines.
A des fins de simplification d’écriture, dans la présente description, le terme « alcool » désigne un alcool aliphatique insaturé, notamment un alcool aliphatique insaturé en C1-C4, de préférence l’éthanol et l’isopropanol.
Une composition de calibration selon l’invention renferme ainsi des bactéries entières, conservées dans cet état jusqu’au moment d’entreprendre les opérations de calibration. Maintenues dans un tel environnement, les protéines bactériennes, notamment celles choisies comme références pour la calibration, bénéficient d’une protection contre les altérations biologiques et/ou chimiques, assurée à la fois par la structure-même des bactéries restées entières/intactes et par 1 ’ (les) alcool(s) et/ou l’acétonitrile. Tout en exerçant un effet aseptisant sur l’ensemble de la composition, le(s) alcool(s) et/ou l’acétonitrile d’une composition de calibration selon l’invention, présentent en tant que tels une neutralité chimique/réactionnelle avantageuse à l’égard des protéines.
Outre d’assurer une bonne conservation dans le temps des bactéries et de leurs protéines, une telle formulation liquide et volatile offre aux compositions de calibration selon l’invention l’avantage de pouvoir être utilisées directement et telles quelles, et de faciliter grandement les opérations de calibration de spectrom êtres. Avec une composition de calibration selon l’invention, il suffira à l’opérateur de prélever le volume prescrit (qui correspond à une quantité préétablie de cellules), et à le déposer sur la plaque d’analyse. Pour ce faire, une pipette ou tout autre ustensile adapté pourra être utilisé. La grande volatilité du(es) alcool(s) et/ou de l’acétonitrile qui compose(nt) la phase liquide d’une composition de calibration selon l’invention, permet(tent) à la phase liquide de s’évaporer rapidement pour ne laisser sur la zone de dépôt, qu’une couche de cellules, fine et homogène. Une fois la matrice rajoutée et la plaque d’analyse chargée dans le spectromètre, l’acquisition des données pourra être lancée. De manière similaire, il est possible de mélanger la composition de calibration avec la matrice, puis de déposer un volume de ce mélange sur la plaque d’analyse, et de charger celle-ci dans le spectromètre, une fois le mélange suffisamment sec.
Avantageusement, la phase liquide d’une composition de calibration selon l’invention est à base d’alcool(s). Selon un mode préféré, il s’agit d’un liquide aqueux avec une teneur en alcool(s) d’au moins 20 % v/v, typiquement de 70 % v/v.
Avantageusement et selon l’invention, le(s) alcool(s) entrant dans la composition de calibration selon l’invention, est/sont l’éthanol et/ou l’isopropanol. Selon un mode particulièrement préféré, le liquide à base d’alcool(s) d’une composition de calibration selon l’invention consiste en un mélange aqueux eau/éthanol, avec une teneur en éthanol de 70 %.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la phase liquide d’une composition de calibration selon l’invention est à base d’acétonitrile, c’est-à-dire une solution d’acétonitrile 100 % v/v ou alors un mélange eau/acétonitrile, avec une teneur en acétonitrile d’au moins 20 % v/v, typiquement de 70 % v/v.
De manière avantageuse, pour avoir une composition la plus simple possible, les bactéries E. coli d’une composition de calibration selon l’invention sont issue d’une souche unique. En particulier, ces bactéries sont issues de la souche BL21 ou de la souche ATCC 8739. La souche E. coli BL21 a été décrite en 1986 (StudierF.W., Moffatt B A., J Mol Biol. 1986 May 5; 189(1): 113-30. « Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes »), et a été entièrement caractérisée par séquençage en 2015 (Jeong H., Ju Kim H., Jun Leeb S., Genome Announc. 2015 Mar 19;3(2). e00134-15. Complete Genome Sequence of Escherichia coli Strain BL21). Cette souche d’E coli est commercialement disponible et peut être obtenue auprès de la compagnie Agilent (référence catalogue #200133). La souche ATCC 8739 est également commercialement disponible, notamment auprès de TATCC. Sa séquence génétique est disponible dans GenBank sous le numéro GCA 016864475.1. Bien que non préféré, à la place de la souche BL21 ou ATCC 8739, il est également possible d’utiliser toute autre souche d’E coli connue de la personne du métier, notamment la souche E coli K-12 (ATCC 10798).
Avantageusement et selon l’invention, les compositions de calibration suivantes sont particulièrement préférées :
- une composition de calibration constituée d’une suspension de bactéries E coli de la souche BL21 dans un liquide aqueux à base d’alcool et/ou d’acétonitrile.
- une composition de calibration constituée d’une suspension de bactéries E coli de la souche ATCC 8739 dans un liquide aqueux à base d’alcool et/ou d’acétonitrile.
Dans les compositions de calibration selon l’invention, la composition en alcool(s) et/ou en acétonitrile est choisie pour une conservation structurelle des bactéries E coli présentes dans la composition, à une température de 0 à 37°C, en particulier de 0 à 25°C.
Notamment, de manière avantageuse, ce liquide aqueux à base d’alcool(s) et/ou d’acétonitrile, ou plus globalement la composition de calibration, ne comprend pas d’acide ou autre substance chimique susceptible de réagir avec les protéines, directement ou indirectement. De préférence, toutes substances chimiques (telles que des détergents, des bases) susceptibles d’extraire des protéines qui ne sont habituellement pas détectées avec un dépôt conventionnel seront évitées.
En particulier, dans les compositions de calibration selon l’invention, les bactéries E coli sont présentes à une concentration de 2 à 7 McF (McFarland), notamment de 3 à 6 McF, par exemple de 5 McF. Une telle concentration peut être déterminée par un densitomètre (par exemple, le DENSIMAT commercialisé par la société bioMérieux), qui permet de mesurer la densité optique d’une composition liquide, notamment sous une lumière incidente d’une longueur d’onde entre 500 et 600 nm, et de préférence à 550 nm. La concentration en bactéries d’une composition liquide peut également être exprimée en unités formant colonies par millilitre (cfu/mL). Aussi, de manière avantageuse, dans les compositions de calibration selon l’invention, les bactéries E. coli sont présentes à une concentration de 6.108 à 21.108 cfu/mL.
Le Tableau 1, ci-dessous donne la correspondance entre densité optique, valeur en unités McFarland (McF) et concentration bactérienne en 108 cfu/mL.
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Tableau 1 : Correspondance entre unités McFarland et cfu/mL
Les compositions de calibration selon l’invention sont stables. Cette stabilité peut être mise en évidence par spectrométrie de masse, notamment par MALDI-TOF. Il n’est ainsi observé aucune dégradation des protéines présentes, en particulier les protéines choisies comme références pour la calibration. Leurs massent, à l’erreur analytique près, ne changent pas. La stabilité des compositions de calibration selon l’invention peut aussi être vérifiée à travers leur capacité à fournir des calibrations, de qualité élevée relativement constante dans le temps.
Du fait de leur bonne stabilité, les compositions de calibration selon l’invention peuvent être conservées dans des tubes, notamment en plastique, fermés par un bouchon, ou dans tout autre type de contenant adapté et fermé hermétiquement. Elles peuvent alors être conservées ainsi pendant plusieurs mois, notamment pendant au moins 1 mois, ou au moins 2 mois, et de préférence pendant au moins 6 mois, à une température de 0 à 37°C, typiquement de 0 à 25°C. De manière avantageuse, il n’est pas nécessaire de conserver les compositions selon l’invention sous forme congelée, à des températures négatives, notamment à -18°C.
Ainsi, sans prendre de précautions particulières de stockage, les compositions de calibration selon l’invention conduisent à des dépôts sur plaque MALDI qui sont fiables et reproductibles et permettent donc, de ce fait, d’assurer des calibrations, et donc des mesures de spectrométrie de masse sur des échantillons ou microorganismes à caractériser, qui sont tout aussi fiables et reproductibles.
Les compositions de calibration selon l’invention sont des solutions prêtes à l’emploi qui peuvent facilement être mises en œuvre lors des mesures de spectrométrie de masse et/ou des procédures de calibration. Du fait de leur formulation liquide, elles sont faciles à prélever et à déposer. L’évaporation de la phase liquide laisse alors place à un dépôt localisé, sous la forme d’une couche cellulaire, fine et uniforme. En particulier, un volume précis de 1 à 2 μL, et typiquement de 1 μL, d’une composition de calibration selon l’invention pourra être facilement et rapidement prélevé puis déposé sur les plaques d’analyse, précisément sur les zones de dépôts. Les compositions de calibration de l’invention simplifient le flux de travail de calibration à réaliser lors des mesures de spectrométrie de masse, en évitant d’avoir besoin de réaliser de nouvelles cultures d'E. coli chaque jour, puisque les compositions de calibration sont facilement stockées sous une forme prête à l’emploi.
Selon un autre de ses objets, l’invention concerne l’utilisation d’une composition de calibration selon l’invention, en tant qu’étalon externe pour la calibration d’un spectromètre de masse, selon la technique MALDI, et en particulier selon la technique MALDI-TOF.
Les compositions de calibration selon l’invention pourraient également être utilisées en calibration interne, par exemple pour régler les paramètres d’acquisition des spectromètres de masse, selon la technique MALDI, et en particulier selon la technique MALDI-TOF utilisée, ou en tant que contrôle qualité.
Dans le cadre de l’invention, est également proposé un procédé de calibration d'un spectromètre de masse adapté à la technique MALDI, et en particulier à la technique MALDI- TOF, comprenant les étapes suivantes : a) disposer d'une composition de calibration selon l’invention, b) déposer ladite composition de calibration et une matrice adaptée à la technique MALDI, sur au moins une zone de dépôt d’une plaque d’analyse MALDI, pour obtenir une zone de contrôle après séchage, c) placer ladite plaque d’analyse MALDI dans le spectromètre de masse et obtenir un spectre de masse pour la zone de contrôle selon la technique MALDI, et en particulier selon la technique MALDI-TOF, sur au moins une gamme de masses sur charge déterminée et utiliser les valeurs expérimentales obtenues des masses sur charge de pics dudit spectre correspondant à des ions de protéines dites de référence de la composition de calibration, en tant que valeurs de calibration, d) calculer une relation de calibration basée sur les masses sur charge théoriques des ions des protéines de référence et les valeurs de calibration.
De manière avantageuse, la gamme de masses sur charge déterminée couvre au moins la gamme de 2000 Th à 20000 Th, de préférence de 2000 Th à 15000 Th.
A titre de mode de réalisation spécifique du procédé selon l’invention, les masses sur charge théoriques utilisées à l’étape d), peuvent être au nombre d’au moins 6, de préférence au nombre de 8 à 50, et tout particulièrement de 8 à 32. Selon un mode de réalisation particulier, lorsque la souche de la composition de calibration est une souche E. coli ATCC 8729, les ions des protéines de référence et donc les masses sur charge théoriques en Th utilisées sont choisis parmi ceux listés au Tableau 2.
Selon un autre mode de réalisation particulier, lorsque la souche de la composition de calibration est une souche E. coli BL21 , les ions des protéines de référence et donc les masses sur charge théoriques en Th utilisées sont choisis parmi ceux listés au Tableau 5.
Selon des modes de réalisation spécifiques, les masses sur charge théoriques utilisées à l’étape d) sont au nombre d’au moins 6, de préférence au nombre de 8 à 50 et sont, en particulier, choisies parmi les masses sur charge théoriques m/z en Th suivantes :
- lorsque la souche d’E. coli est BL21 : 3 128,18 ; 3 158,57 ; 3 179,59 ; 3 206,28 ;
3 579,84 ; 3 637,70 ; 3 936,51 ; 4 163,59 ; 4 185,35 ; 4 365,31 ; 4 438,61 ; 4 449,60 ; 4 497,60 ;
4 613,75 ; 4 768,45 ; 4 777,56 ; 5 069,74 ; 5 096,78 ; 5 150,50 ; 5 381,35 ; 5 461,10 ; 5 612,32 ;
5 725,60 ; 6 255,36 ; 6 298,04 ; 6 316,14 ; 6 411,55 ; 6 508,45 ; 6 547,83 ; 6 857,81 ; 7 158,68 ;
7 274,39 ; 7 707,56 ; 7 872,02 ; 8 326,18 ; 8 369,69 ; 8 876,22 ; 8 898,19 ; 8 994,20 ; 9 060,27 ;
9 226,49 ; 9 535,89 ; 9 554,12 ; 9 741,83 ; 10 138,48 ; 10 300,00 ; 11 223,63 ; 11 450,19 et 12 227,19 ;
- lorsque la souche d’E coli est ATCC 8739 : 3 128,18 ; 3 158,57 ; 3 206,28 ; 3 579,84 ;
3 637,70 ; 4 163,59 ; 4 185,35 ; 4 365,31 ; 4 438,61 ; 4 613,75 ; 4 768,45 ; 4 777,56 ; 5 069,74 ;
5 096,78 ; 5 150,50 ; 5 381,35 ; 5 612,32 ; 6 255,36 ; 6 316,14 ; 6 411,55 ; 7 158,68 ; 7 274,39 ;
8 369,69 ; 8 876,22 ; 8 994,20 ; 9 226,49 ; 9 535,89 ; 9 554,12 ; 10 138,48 ; 10 300,00 ;
11 223,63 et 11 450,19.
De manière encore plus spécifique, les masses sur charge théoriques utilisées à l’étape d) sont au nombre d’au moins 6, de préférence au nombre de 8 à 32, et notamment au nombre de 32, et sont, en particulier, choisies parmi les masses sur charge théoriques m/z en Th suivantes, lorsque la souche d’E. coli est BL21 : 3 128,18 ; 3 158,57 ; 3 206,28 ; 3 579,84 ; 3 637,70 ; 4 163,59 ; 4 185,35 ; 4 365,31 ; 4 438,61 ; 4 613,75 ; 4 768,45 ; 4 777,56 ; 5 069,74 ; 5 096,78 ; 5 150,50 ; 5 381,35 ; 5 612,32 ; 6 255,36 ; 6 316,14 ; 6 411,55 ; 7 158,68 ; 7 274,39 ; 8 369,69 ; 8 876,22 ; 8 994,20 ; 9 226,49 ; 9 535,89 ; 9 554,12 ; 10 138,48 ; 10 300,00 ; 11 223,63 et 11 450,19.
La matrice MALDI peut être n’importe quelle matrice adaptée à la technique MALDI. En particulier, une telle matrice comprend l’un des composés suivants : l’acide 3,5- diméthoxy-4-hydroxycinnamique, l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique, l’acide férulique et l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque. Enfin, selon un autre de ses aspects, l’invention concerne un procédé de caractérisation d’un échantillon contenant au moins un microorganisme à partir de l’acquisition d’un spectre de masse, par la technique MALDI, et en particulier par la technique MALDI- TOF, mettant en œuvre les étapes suivantes : i) déposer ledit échantillon et une matrice adaptée à la technique MALDI, sur au moins une zone de dépôt d’une plaque d’analyse, et réaliser un séchage, pour obtenir une zone de caractérisation, ii) placer ladite plaque d’analyse dans un spectromètre de masse adapté à la technique MALDI, et en particulier à la technique MALDI-TOF et générer un spectre de masse pour la zone de caractérisation, iii) appliquer la relation de calibration calculée selon le procédé de calibration de l’invention pour ledit spectromètre de masse, et déterminer la masse sur charge des pics dans le spectre de masse généré.
En particulier, la zone d’analyse contrôle et la zone de caractérisation appartiennent à la même plaque d’analyse MALDI. Ceci présente comme avantages de rendre les opérations de calibration plus simples et plus rapides en réduisant les étapes de manipulation.
Selon un mode de réalisation spécifique, le procédé de caractérisation selon l’invention comprend une identification d’un microorganisme présent dans l’échantillon, par comparaison des valeurs de masse sur charge de certains pics au moins du spectre de masse généré obtenues à l’étape iii), à des valeurs de référence caractéristiques du microorganisme.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-après, qui se réfèrent aux figures annexées et dans lesquelles :
- la Figure 1 représente une vue schématique de dessus d’une plaque MALDI, notamment commercialisée par la demanderesse ;
- la Figure 2, en lien avec l’Exemple 2, présente l’évolution au cours du temps du spectre de masse par MALDI-TOF obtenu avec un VITEK® MS, pour une composition d’E. coli hors invention ; les bactéries étant suspendues entières dans un mélange commercial de solvants (en l’espèce, la matrice HCC A de bioMérieux ; réf. 411071) ;
- la Figure 3, en lien avec l’Exemple 3, présente les spectres obtenus avec un VITEK® MS, pour deux compositions de calibration selon l’invention, à 70 % v/v d’éthanol, après une période de stockage de cinq mois à température ambiante ; ces compositions ayant été préparées selon 2 protocoles différents (A : à partir d’E coli ATCC 8739 cultivée sur milieu gélosé ; B : à partir d’E. coli ATCC 8739 cultivée en bouillon de culture) ; - la Figure 4, en lien avec l’Exemple 4, présente différents spectres MALDI-TOF obtenus avec un VITEK® MS, correspondant à l’analyse du contenu d’un tube comprenant initialement 100 μL d’une composition de calibration selon l’invention (E coli ATCC 8739 en suspension dans une liquide aqueux à 70 % v/v d’éthanol), après une évaporation de 20 %, 50 % ou 80 % du volume initial ;
- la Figure 5, en lien avec l’Exemple 6, présente un spectre de masse MALDI-TOF obtenu avec un VITEK® MS, avant calibration, pour une composition de calibration de l’Exemple 3 (E coli BL21 en suspension dans un liquide aqueux à 70 % v/v d’éthanol) ;
- la Figure 6, en lien avec l’Exemple 7, sont deux représentations graphiques des erreurs attribuées aux pics (m/z) choisis comme références pour la calibration, obtenues pour une composition de calibration selon l’invention (E coli BL21 en suspension dans un liquide aqueux à 70 % v/v d’éthanol), fraîchement préparée (T0), ou après 9 ou 12 mois de stockage à 2-8°C (T9, T12) ; les spectres MS associés ayant été acquis avec un VITEK® MS avant calibration (A) et après une calibration (B) ;
- la Figure 7 présente le premier graphe de super calibration utilisé à l’Exemple 8 ;
- la Figure 8 présente le deuxième graphe de super calibration finale à partir des 49 masses théoriques sélectionnées sur les 6 563 spectres MALDI-TOF obtenus avec un VITEK® MS, utilisé à l’Exemple 8.
EXEMPLE 1 : Préparation d’une composition de calibration selon l’invention, dépôt sur plaque d’analyse MALDI, et calibration
Une composition de calibration selon l’invention peut être préparée en plaçant simplement une quantité choisie de bactéries E. coli entières de la souche sélectionnée, dans un liquide à base d’alcool(s) et/ou d’acétonitrile. La composition de calibration comprend ainsi une suspension de bactéries E. coli, conservées entières. En fonction de la quantité de composition de calibration à préparer, les bactéries d’E. coli utilisées peuvent être celles directement achetées ou issue de bactéries achetées et mises en culture, selon toute technique adaptée : sur boîte de Petri, en bouillon... Ces techniques de culture sont bien connues de la personne du métier. Comme mis en évidence dans les exemples, le mode de culture n’a pas d’influence sur la stabilité de la composition de calibration obtenue.
A titre d’exemple de méthode de préparation d’une composition de calibration selon l’invention, des bactéries E. coli sont cultivées en bouillon, dans un fermenteur, jusqu’à atteindre la quantité de biomasse souhaitée. La biomasse est ensuite culotée par centrifugation puis diluée, en solution d’éthanol à 70 %, pour obtenir la concentration désirée. Pour faciliter l’homogénéisation de la solution et quantifier correctement la concentration bactérienne, une opération de dispersion mécanique peut s’avérer utile. Elle peut être réalisée par exemple en créant un vortex ou encore en dispersant les bactéries avec un instrument tel qu’un Ultra-Turrax de la société IKA (Staufen, Allemagne) doté d’un rotor-stator à hautes performances. Une étape de sonication pourrait également être réalisée. Dans tous les cas, il faut veiller à minimiser l’altération des cellules bactériennes pour éviter de rompre les parois membranaires et former des débris cellulaires. Malgré les précautions prises, quelques bactéries peuvent être altérées et des débris cellulaires peuvent être retrouvés dans les compositions de calibration selon l’invention. Une fois la solution homogénéisée et ajustée à la concentration voulue, par exemple 5 McF, il ne reste plus qu’à la répartir dans un contenant adapté pour faciliter son utilisation.
Une composition de calibration selon l’invention peut être utilisée directement ou peut être stockée dans tout contenant adapté et/ou être commercialisée en tant que composition prête à l’emploi dans tout contenant adapté. En tant que contenant adapté, peut être cité, notamment, un tube, par exemple en plastique, fermé par un bouchon, ou tout type de contenant adapté fermé hermétiquement. Le contenant aura un volume sélectionné pour pouvoir contenir la quantité de composition de calibration souhaitée, notamment de 10 à 300 μL et typiquement de 200 μL. De tels volumes permettent de réaliser un grand nombre de dépôts, qui sont typiquement des dépôts de 1 μL, et donc un grand nombre de calibrations.
Les études préliminaires de stabilité présentées dans les exemples ont montré que les compositions de calibration selon l’invention sont stables, notamment pendant au moins un an à 2-8°C, au moins deux mois à température ambiante (typiquement à 18-25°C), lorsqu’elles sont conservées dans un contenant fermé, et pendant au moins un jour à température ambiante, lorsque le contenant est ouvert. Les compositions de calibration selon l’invention sont donc stables dans le temps et permettent d’obtenir une bonne calibration.
Lors de son utilisation, une composition de calibration selon l’invention est déposée au niveau de la ou des zones de contrôle d’une plaque MALDI. Ce dépôt peut être effectué en utilisant une technique de pipetage, ou éventuellement une technique de pulvérisation. Une goutte, par exemple d’environ 1 à 2 μL de la composition de calibration pourra être déposée, de sorte à recouvrir toute la zone de dépôt. Il est facile de former une fine couche uniforme de composition de calibration sur la plaque, du fait de la formulation liquide.
L’utilisation d’une composition de calibration selon l’invention ne nécessite aucune expertise ou tour de main particulier. Elles est compatible avec une préparation manuelle et automatisée (par exemple en utilisant la technique Colibri® proposée par la demanderesse) des plaques MALDI, et notamment du type VITEK® MS-DS. L’opération consistant à déposer une composition de calibration selon l’invention et une matrice adaptée à la technique MALDI, sur la plaque MALDI peut se faire de manière séquentielle ou en déposant un mélange de ladite composition de calibration et de la matrice.
De manière avantageuse, il sera opéré comme suit : dépôt de la composition de calibration, dépôt de la matrice MALDI, puis séchage. La composition de calibration selon l’invention peut être simplement déposée par pipetage de 1 μL sur une zone de contrôle de la plaque MALDI, suivi de l'ajout de 1 μL de matrice MALDI, notamment de matrice HCC A, et d’un séchage. Les matrices utilisées dans la technique MALDI sont généralement des molécules organiques qui présentent des caractéristiques spécifiques. Elles doivent être capables d'absorber l'énergie du laser utilisé pour l'irradiation, ce qui entraîne la vaporisation de la matrice et la formation d'ions. De plus, les matrices doivent être compatibles avec les échantillons analysés et ne pas interférer avec les ions d’intérêt. Généralement, les matrices utilisées dans la technique MALDI sont photosensibles et cristallisent en présence de la population de microorganisme(s), tout en préservant l’intégrité des molécules présentes. De telles matrices, notamment adaptées à la technique de spectrométrie de masse MALDI-TOF, sont bien connues. Elles sont constituées, par exemple, à partir d’un composé choisi parmi : l’acide 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique, l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (présent dans la matrice HCCA), l’acide férulique et l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque. De nombreux autres composés sont connus de la personne du métier. Il existe également des matrices liquides qui ne cristallisent ni à pression atmosphérique, ni même sous pression réduite. Tout autre composé qui permettra d’ioniser les molécules présentes dans la zone de caractérisation sous l’effet d’un rayon laser pourra être utilisé. Chaque matrice a des propriétés spécifiques qui la rendent adaptée à différents types d'échantillons et d'analyses.
Pour la constitution de la matrice, un tel composé est mis en solution, le plus souvent dans l’eau, de préférence de qualité « ultra-pure », ou dans un mélange eau/solvant(s) organique(s). A titre d’exemple de solvants organiques classiquement utilisés, on peut citer, l’acétone, l'acétonitrile, le méthanol ou l'éthanol. La matrice peut contenir de l’acide trifluoroacétique qui facilite l’ionisation. La matrice est directement déposée sur la zone de contrôle et recouvre ou est mélangée à la composition de calibration.
Le séchage de la composition de calibration déposée, avant ou après dépôt de la matrice, sur la plaque MALDI est réalisé à une température et pendant une durée appropriées pour assurer la formation d'une fine couche uniforme de cette dernière. Des conditions douces bien connues de la personne du métier sont privilégiées. Le séchage de la composition de calibration, seule et/ou additionnée d’une matrice, peut être réalisé par évaporation en exposant l’ensemble à l’air ambiant, pendant quelques minutes. Cette évaporation assure également la cristallisation de la matrice présente.
De manière avantageuse, la quantité de bactéries E. coli de la composition de calibration déposée par zone de contrôle est généralement d’au moins 105 cfu, et notamment de 6.105 à 42.105 cfu.
Une fois la plaque MALDI préparée avec une couche de composition de calibration, sous la forme d’une zone de contrôle comme décrit précédemment, elle est placée dans un spectromètre de masse, notamment MALDI ou MALDI-TOF, et un spectre de masse correspondant est acquis. Cela implique l'irradiation de la plaque MALDI avec un laser MALDI, qui entraîne la désorption et l'ionisation des molécules présentes dans le spot irradié. Les protéines désorbées et ionisées sont ensuite détectées pour générer le spectre de masse. L'acquisition du spectre de masse est donc réalisée en irradiant la plaque MALDI avec un laser MALDI et en détectant les protéines désorbées et ionisées.
En particulier, tout type de spectromètre de masse MALDI-TOF peut être utilisé pour l’élaboration du spectre de masse. De tels appareils comprennent : i) une source d'ionisation (en général, un laser UV) destinée à ioniser la zone de contrôle et donc la composition de calibration et/ou un échantillon présent sur une zone de caractérisation ; ii) un accélérateur des molécules ionisées par application d’une différence de potentiel ; iii) un tube sous pression réduite dans lequel se déplacent les molécules ionisées et accélérées ; iv) un analyseur de masse destiné à séparer les ions moléculaires formés, en fonction de leur masse sur charge (m/z) ; v) un détecteur destiné à mesurer le signal produit directement par les ions moléculaires.
Le rayon laser utilisé pour l’ionisation pourra avoir tout type de longueur d’onde favorable à la sublimation ou à la vaporisation de la matrice. De préférence, une longueur d’onde ultraviolette ou même infrarouge sera utilisée. Cette ionisation pourra, par exemple, être réalisée avec un laser à azote émettant un rayon UV à 337 nm (par exemple utilisé dans le VITEK® MS), ou encore avec un laser au fluorure d'yttrium et de lithium dopé au néodyme (Nd:YLF) émettant à 349 nm par exemple utilisé dans le VITEK® MS PRIME).
Le temps de vol mis par les ions pour atteindre le détecteur est utilisé pour calculer leur masse. Ainsi, un spectre de masse est obtenu, représentant l'intensité du signal correspondant au nombre de molécules ionisées d'une même masse sur charge [m/z], en fonction du rapport m/z des molécules qui frappent le détecteur. Le rapport masse sur charge [m/z] est exprimé en Thomson (Th).
Le spectre de masse est notamment généré grâce à la détection d’au moins une partie des molécules ionisées et accélérées puis laissées se déplacer librement dans un tube sous pression réduite, de manière à mesurer le temps qu'elles mettent pour parcourir le tube sous pression réduite et à obtenir un signal correspondant au nombre de molécules ionisées atteignant le détecteur du spectromètre à un instant donné. Un spectre non calibré, comportant en abscisse le temps de vol des ions et en ordonnée l’intensité du signal observé, est ainsi obtenu. Il est transformé en spectre de masse en calculant les rapports masse sur charge (m/z) correspondant aux temps de vol des molécules détectées. Pour ce faire, une équation de calibration des temps de vol est établie à l’aide de molécules de référence. Il en résulte un spectre de masse calibré correspondant au signal du nombre de molécules ionisées d'une même masse sur charge m/z, en fonction du rapport m/z des molécules détectées.
Lors de l’étape de calibration, les pics correspondants aux molécules dites de référence, sous forme ionisée (nommé ion d’une molécule de référence) de la composition de calibration, dits pics de référence, sont identifiés et leurs masses sur charge m/z théoriques vont être utilisées en tant que valeurs de calibration. Cette identification peut être réalisée en comparant les temps de vol mesurées, dits expérimentaux, des pics du spectre non calibré avec les masses théoriques desdits ions des protéines de référence, ou bien avec les masses sur charge m/z mesurées, dites expérimentales, du spectre de masse si une calibration antérieure est déjà disponible dans l’instrument et appliquée. Une fois que ces valeurs de calibration sont identifiées, une relation de calibration et une erreur sont calculées. Différentes méthodes de régression linéaire ou non linéaire peuvent être utilisées pour calculer une telle relation de calibration. A titre d’exemple, on peut citer la méthode des moindres carrés ou toute méthode bien connue de la personne du métier, pour effectuer une calibration. En général, les spectromètres de masse sont équipés des logiciels adaptés pour mettre en œuvre de telles méthodes. Le calcul d'une erreur en parties par million (ppm) est effectué pour chaque valeur de masse sur charge de référence (ou ion de protéine de référence), en considérant la valeur expérimentale obtenue et la valeur théorique correspondantes. Pour ce faire, la formule suivante peut être : (masse théorique - masse expérimentale) / masse théorique * 106. Pour l’ensembles des ions des protéines de référence sélectionnées, il est alors possible de calculer une erreur moyenne qui correspond à la valeur moyenne des erreurs exprimées en valeurs absolues. Plus Terreur moyenne est basse, plus la calibration est bonne. La relation de calibration ainsi établie est, ensuite, appliquée pour déterminer les masses sur charge des pics d’ions de protéines ou molécules présents dans les échantillons analysés, sur des zones de caractérisation de la plaque MALDI. Ces masses corrigées, nommées également calibrées, sont obtenues à l’étape iii) du précédé de caractérisation d’un échantillon, tel précédemment défini.
En résumé, les compositions de calibration et le procédé de calibration d'un spectromètre de masse selon l'invention permettent d'obtenir des mesures précises des masses des ions analysés, et donc une identification fiable de microorganismes. Les compositions de calibration et le procédé de calibration selon l’invention sont simples à mettre en œuvre et peuvent être utilisés dans diverses applications d'analyse, et en particulier pour l’identification de microorganismes, par spectrométrie de masse utilisant la technique MALDI, et en particulier MALDI-TOF. Dans le cadre de l'invention, l'analyse par MALDI-TOF peut être une analyse par MALDI-TOF simple, ou encore une analyse par MALDI-TOF -TOF.
Les procédés selon l’invention (procédé de calibration et procédé de caractérisation d’un échantillon) sont des procédés informatisés ou automatisés. Dans les procédés selon l’invention, les étapes d’acquisition, calcul, comparaison, détermination... sont réalisées par un ordinateur ou un dispositif électronique programmé pour exécuter lesdites étapes, intégré au spectromètre utilisé. Un logiciel spécifique pourra être développé et installé sur l'ordinateur ou le dispositif électronique qui sera utilisé pour exécuter le procédé de calibration et, notamment, obtenir la relation de calibration. En particulier, le logiciel est programmé pour prendre en charge les fonctionnalités requises, telles que l'acquisition des données de spectrométrie de masse, le calcul des masses sur charge des pics de masse du spectre de masse correspondant aux ions de protéines ou molécules inconnues.
Pour l’identification sur le spectre de masse de la composition de calibration des pics correspondants aux valeurs de calibration, le logiciel de calibration peut être programmé pour analyser les données de spectrométrie de masse et identifier les pics correspondant aux valeurs de calibration. Cette étape peut impliquer des algorithmes de détection de pics, de comparaison de masses sur charge et de seuillage adaptatifs pour identifier de manière précise les pics pertinents.
Pour le calcul de la relation de calibration, une fois identifiés les pics correspondant aux valeurs de calibration, le logiciel de calibration effectue un calcul pour déterminer la relation de calibration. Ce calcul peut utiliser différentes méthodes statistiques, telles que la régression linéaire ou non linéaire, pour établir une équation mathématique obtenue à partir des masses sur charge théoriques des ions des protéines de référence et les masses sur charge mesurées pour les pics correspondant auxdites protéines de référence ionisées, utilisées en tant que valeurs de calibration.
Pour l’application de la relation de calibration, une fois que cette dernière a été déterminée, le logiciel l'applique pour convertir les temps de vol ou masses sur charge mesurés (également qualifiés de expérimentaux) des pics correspondant à une entité inconnue sur les spectres de masse obtenus pour les échantillons à analyser, en masses sur charge calibrées qui sont alors reportées sur le spectre de masse généré. Cette étape permet d'obtenir des mesures précises des masses sur charge des ions présents dans les échantillons analysés.
Les échantillons analysés peuvent être de différentes origines. A titre d’exemple, on peut citer les échantillons d'origine biologique, notamment animale ou humaine. Un tel échantillon peut correspondre à un prélèvement de fluide biologique, du type sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, sécrétion organique, à un prélèvement tissulaire ou à des cellules isolées. Ce prélèvement pourra être déposé tel quel, ou sera, de préférence, soumis préalablement au dépôt sur la plaque MALDI, à une préparation de type enrichissement ou culture, à une concentration et/ou à une étape d’extraction ou de purification selon des méthodes connues de la personne du métier. L’échantillon peut également être un produit de l’agroalimentaire tel que la viande, le lait, le yaourt et tout autre produit consommable susceptible d’être contaminé, ou encore un produit cosmétique ou pharmaceutique. Là encore, un tel produit pourra être soumis à une préparation de type enrichissement ou culture, à une concentration et/ou à une étape d’extraction ou de purification, avant son dépôt sur la plaque MALDI. Le plus souvent, l’échantillon à analyser sera issu d’une culture dans un bouillon ou sur une gélose de manière à l’enrichir en microorganismes à rechercher. Il est, par exemple, possible de procéder directement au dépôt d’une biomasse, d’une goutte d’une suspension de microorganismes, dans de l’eau ultra-pure ou un tampon.
Les exemples ci-après, en référence à certaines des Figures annexées, permettent d’illustrer l’invention, mais n’ont aucun caractère limitatif.
Dans les exemples ci-après, la densité optique est mesurée avec le densitomètre DENSIMAT (bioMérieux, France) en suivant les recommandations du manuel utilisateur (référence 99535, version C, publiée en 2007).
EXEMPLE 2 : Evaluation de la stabilité d’une suspension d’E. coli dans un mélange commercial de solvants (bioMérieux ; réf. 411071).
La souche E. coli ATCC 8739, commercialement disponible et achetée auprès de l’ATCC, a été ajoutée jusqu’à l’obtention d’une concentration de 5 McF (ce qui correspond à une densité optique à 550 nm de 1, 0-1,1) dans une matrice d'acide α-cyano-4- hydroxycinnamique (dite matrice HCCA) composée d’un mélange de 333 ml d’éthanol, 333 ml d’acétonitrile, 333 ml d’eau, 30 ml de d’acide trifluoroacétique et 31 g de matrice HCCA (bioMérieux ; réf. 411071). La matrice HCCA est couramment utilisée sur les spectromètres de masse type MALDI-TOF pour la mesure des peptides et des protéines.
La stabilité de la suspension a ensuite été analysée avec un spectromètre de masse MALDI-TOF (VITEK® MS, bioMérieux), en suivant l’évolution des pics de calibration entre T0 et T7 jours (7 jours après T0). Une modification progressive de la forme des pics a été observée sur l'ensemble des spectres.
A titre d'exemple, le pic doublement chargé caractéristique de la protéine HU-alpha liant l'ADN était bien visible à T0 (m/z 4767). Cependant, un troisième pic est apparu à T24h (1 jour après T0), un quatrième à T48h (2 jours après T0) et à T7j (7j après T0), ce sont 8 pics qui ont été détectés (Figure 2).
Une dégradation a ainsi été observée au cours du temps et compte tenu du mélange de solvants utilisés (éthanol, acétonitrile et acide trifluoroacétique), la dégradation étant d’origine chimique plutôt que biologique. En considérant que le delta observé des masses sur charge des protéines ionisées entre les différents pics au cours du temps était de 28 Da environ et que la présence d'éthanol et d’acide trifluoroacétique peut protoner les protéines, les inventeurs pensent qu’il est probable que la dégradation corresponde à une éthylation.
Par conséquent, le mélange de solvants de la matrice HCCA couramment mise en œuvre dans les instruments MALDI-TOF ne permet pas d’obtenir une stabilité suffisante des pics de calibration d’une souche E. coli au cours du temps et ne peut donc être utilisée en tant que solvant dans la solution de calibration.
EXEMPLE 3 : Absence d’impact du mode de culture de la souche sur la performance d’une composition de calibration selon l’invention
Deux compositions de calibration selon l’invention ont été préparées à partir de la souche E. coli ATCC 8739 utilisée à l’Exemple 2, mais mise en culture selon deux modes différents.
A. Protocole de préparation d’une composition de calibration à partir de la souche E. coli ATCC 8739 obtenue par croissance sur une boîte de Petri en milieu agar solide :
- culture de la souche sur des boîtes de Petri en milieu solide agar (bioMérieux ; réf. 43039) à 37°C pendant 18 à 24 heures, - dilution de la souche à 5 McF (c’est-à-dire pour obtenir une densité optique à 550 nm de 1,0-1, 1) dans de l’éthanol à 70 % (v/v) (c’est à dire que l’on a 70 % en volume d’éthanol et 30 % en volume d’eau), de manière à obtenir une composition de calibration,
- remplissage de tubes (50 μL, 100 μL et 200 μL) avec ladite composition,
- stockage des tubes : température ambiante (18-24°C) et 2-8°C.
Lors de l’utilisation de la composition de calibration, 1 μL de ladite composition et 1 μL de matrice HCCA sont déposés sur la plaque MALDI.
B. Protocole de préparation d’une composition de calibration à partir de la même souche E. coli ATCC 8739 obtenue par culture en bouillon :
- culture de la souche en bouillon de culture à base de trypticase de soja (bioMérieux ; réf. 42100) à 37°C pendant 18 à 24 heures,
- centrifugation pendant 10 minutes à 4500 rpm de manière à concentrer les cellules dans un culot,
- double rinçage du culot avec de l’eau,
- resuspension du culot dans une solution d’éthanol à 70 % et dilution pour obtenir une composition de calibration selon l’invention renfermant des bactéries E. coli concentrées à 5 McF (ce qui équivaut à une densité optique à 550 nm de 1,0-1, 1) dans de l’éthanol à 70 %,
- remplissage de tubes (50 μL, 100 μL et 200 μL) avec ladite composition,
- stockage des tubes : à température ambiante (18-24°C) ou bien à 2-8°C.
Lors de l’utilisation de la composition de calibration, 1 μL de ladite composition et 1 μL de matrice HCCA sont déposés sur la plaque MALDI.
Les compositions de calibration préparées selon les deux protocoles précédents ont ensuite été utilisées pour calibrer un spectromètre de masse MALDI-TOF (VITEK® MS, bioMérieux). Les deux compositions ont permis d’obtenir une très bonne calibration du spectromètre de masse, car les pics de référence (comprenant en particulier, les valeurs de calibration utilisées lors de la calibration) étaient toujours présents et non dégradés (données non présentées) démontrant ainsi que la méthode de production de la souche (culture sur boîte de Petri ou bouillon de culture) n’affecte pas la qualité de la calibration.
De plus, après 5 mois de stockage à température ambiante, aucune dégradation n’a été observée sur les pics des différents spectres (Figure 3). Autrement dit, les pics observés sur la Figure 3, présentent les masses attendues pour la souche ATCC 8739, telles qu’elles figurent dans le Tableau 2. Contrairement à la formulation de l’Exemple 2, aucune dégradation n’est observée, les masses des pics restent constantes, à l’erreur analytique près. Cette erreur analytique est inhérente à la technologie MALDI-TOF. Les résultats obtenus avec un stockage entre 2-8°C étaient également similaires.
Par conséquent, la méthode de culture des souches E. coli utilisée pour obtenir la composition de calibration n’ impacte, ni la qualité de la calibration sur spectromètre de masse MALDI-TOF, ni même la stabilité au cours du temps de ladite composition.
EXEMPLE 4 : Evaluation de l’impact de l’évaporation sur la qualité d’une composition de calibration selon l’invention
Composition de calibration utilisée : souche A. coli ATCC 8739 mise en suspension à une concentration de 5 McF (c’est-à-dire pour obtenir une densité optique à 550 nm de 1,0- 1,1) dans une solution d’éthanol à 70 %, et conservation dans des tubes de 50 μL, 100 μL, 200 μL et 300 μL.
Les tubes ont été laissés ouverts à température ambiante (24°C±1°C) jusqu’à 20, 50 ou 80 % d’évaporation du volume initial. Les différentes compositions de calibration partiellement évaporées ont ensuite été utilisées en tant que solution de calibration sur un spectromètre de masse MALDTI-TOF (VITEK® MS, bioMérieux).
Après analyse, toutes les compositions testées ont permis d’obtenir une très bonne calibration du spectromètre de masse indépendamment du volume initial et du niveau d’évaporation de solvant. Les différents spectres MALDI-TOF pour le tube de 100 μL avec une évaporation de 20 %, 50 % ou 80 % sont présentés Figure 4. Abstraction faite de l’erreur analytique inhérente à la technologie MALDI-TOF, les spectres sont très similaires : les pics décrits dans le Tableau 2 sont observés avec leur masse attendue ; ils permettent donc de calibrer le spectre.
EXEMPLE 5 : Préparation d’une composition de calibration selon l’invention d’/ . coli BL21 dans de l’éthanol à 70 %
De manière similaire à l’Exemple 3 et en mettant en œuvre le protocole de préparation A, une composition de calibration selon l’invention a été préparée avec la souche E. coli BL21 (E. coli BL21 en suspension dans de l’éthanol 70 % v/v).
Comme démontré dans l’Exemple 6 ci-après, cette solution a permis d’obtenir d’excellents résultats en termes de calibration sur un spectromètre de masse MALDI-TOF.
EXEMPLE 6 : calibration de l’instrument MALDI-TOF à l’aide d’une composition de calibration selon l’invention D’une manière générale, un spectromètre de masse de type MALDI-TOF mesure le temps de vol d’ions dans le vide, après leur accélération par un champ électrique. Le temps de vol est relié à la masse des ions selon la loi de l’énergie cinétique :
Ec=½ mV2 avec Ec énergie cinétique, m masse et V vitesse des ions.
Il est donc possible de déterminer la masse des ions à partir de la mesure de leur temps de vol en établissant la relation liant ces deux grandeurs physiques, généralement au moyen d’une équation quadratique, c’est-à-dire d’un polynôme de degrés 2.
Dans certain cas, un polynôme de degré plus élevé peut être utilisé pour tenir compte des imperfections physiques et électroniques du spectromètre de masse. En pratique, l’équation est calibrée grâce à des molécules de masses connues pour tenir compte des variations expérimentales inhérentes à l’instrument, à la plaque MALDI sur laquelle a été déposé l’échantillon ou encore aux conditions d’acquisition (température, pression dans le tube à vide, etc.).
L’instrument peut être livré par le fabricant avec une calibration pré-enregistrée en usine. Cela permet à l’utilisateur d’acquérir et d’analyser les premiers spectres en utilisant directement des valeurs en Thomson (Th). Le Thomson est une unité correspondant à la masse divisée par la charge de l’ion. Par la suite, l’instrument pourra être régulièrement recalibré à l’aide de spectres en Th sans jamais revenir aux valeurs de temps de vol. Ainsi, l’utilisateur prend l’habitude de régler l’instrument et de visualiser les spectres en utilisant des masses et non des temps de vol.
La qualité de la calibration peut facilement être évaluée en calculant la moyenne des erreurs, pour les masses sur charge des ions des protéines de référence. Pour rappel, cette moyenne des erreurs est calculée en utilisant les valeurs absolues desdites erreurs.
A titre d’exemple, un spectre de masse MALDI-TOF obtenu avec un spectromètre VITEK® MS de la société bioMérieux a été calibré à l’aide de la composition de calibration préparée selon l ’Exemple 5.
La gamme d’acquisition de l’instrument a été réglée entre 2 000 et 20 000 Th, gamme de masses sur charges usuelle pour identifier des microorganismes dans les laboratoires de microbiologie. Le spectre de la composition de calibration obtenu présentant les valeurs expérimentales de m/z sans calibration est représenté Figure 5.
Ce spectre a ensuite été calibré à l’aide d’un jeu de masses sur charge des ions de protéines présentes chez E. coli extrait du Tableau 2. Dans le Tableau 2, dans la colonne « charge de l'ion », 5 désigne un ion portant une charge, d désigne un ion portant deux charges. Les protéines présentent des modifications post-traductionnelles par rapport à la protéine dont le nom et la séquence est donnée. Dans la colonne « modifications post-traductionnelles », c correspond au clivage de la méthionine en N-terminale et m correspond, après clivage de la méthionine en N-terminale, à une méthylation du 2eme acide aminé (alors terminal). Le nom de l’ion de la protéine de référence est donné de manière à combiner le nom de la protéine correspondant à la séquence NCBI, sa charge et la ou les modifications post-traductionnelles.
Figure imgf000024_0001
Tableau 2 : 32 m/z théoriques sélectionnées pour E. coli ATCC 8739
Les ions des protéines de référence sont recherchés avec une tolérance de 800 ppm pour calibrer le spectre par la méthode des moindres carrés en utilisant une équation quadratique. La moyenne des erreurs avant calibration est de 372,69 ppm. Cette valeur moyenne est ensuite grandement diminuée à 68,50 ppm après la première calibration, démontrant ainsi que les masses sur charge recalibrées par la composition selon l’invention (colonnes « Après 1ère calibration », Tableau 3) sont plus exactes qu’avant calibration.
Pour améliorer encore un peu plus la calibration, il est même possible d’effectuer une deuxième calibration après avoir réduit la tolérance à 300 ppm. Cette opération permet d’éliminer quelques associations erronées susceptibles de fausser légèrement la première calibration. Ces associations erronées correspondent à des pics attribués par erreur à une masse théorique donnée, compte tenu d’une tolérance d’erreur importante (800 ppm). Cette deuxième calibration permet d’améliorer légèrement la précision de mesure en ne considérant que les pics présentant une erreur inférieure à 300 ppm. La moyenne des erreurs est alors égale à 63, 18 ppm.
De façon intéressante, il n’est pas nécessaire de retrouver toutes les masses sur charge recherchées sur le spectre de masse. Ainsi, le pic 28 n’est pas observé dans le spectre avant recalibration. Après la première recalibration, les pics 23 et 27 deviennent hors tolérances et ne sont plus utilisés pour la 2eme calibration. Il n’est donc pas nécessaire que l’ensemble des pics soient présents pour assurer une bonne calibration. La méthode est robuste à l’absence d’un ou plusieurs pics. Cette propriété est particulièrement importante pour calibrer un spectre MALDI-TOF. La technologie MALDI-TOF a en effet un comportement stochastique qui peut entrainer de façon aléatoire la disparition ou le décalage en masse de certains pics. Pour un échantillon donné, certains pics peuvent être visibles ou invisibles d’une acquisition à l’autre selon les cristaux sublimés par le rayon laser. Certains pics peuvent aussi avoir une forme plus ou moins bruité, ce qui peut conduire à une erreur plus ou moins importante de la masse détectée.
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Tableau 3 : m/z relevées pour une composition de calibration selon l'invention (E. coli
BL21 ; éthanol 70 % v/v), avant et après calibration, en utilisant les 32 m/z théoriques d'E. coli ATCC 8739 figurant dans le Tableau 2.
EXEMPLE 7 : Etude de stabilité d’une composition de calibration selon l ’Exemple 5
La possibilité d’une calibration par l’intermédiaire de la composition de calibration selon l’Exemple 5, qui est stable au cours du temps, a été établie en vérifiant qu’il était possible de calibrer un spectromètre de masse MALDI-TOF de type VITEK® MS avec un lot de cette composition de calibration fraîchement préparée selon l’Exemple 5 (condition T0), puis avec le même lot de composition de calibration conservée 9 mois (condition T9) ou 12 mois (condition T12) à 2-8°C.
Pour simuler des conditions d’utilisation intensives, les lots conservés à 2-8°C pendant 9 ou 12 mois ont ensuite été laissés pendant lh30 bouchon ouvert pour laisser une partie du solvant s’évaporer avant d’être ensuite refermés pendant 180h à température ambiante (18-25°C). Les masses sur charge avant et après calibration obtenues avec la liste de 32 pics de référence figurent dans les Tableaux 4, 4bis et 4ter ci-après. Les erreurs de mesure des pics de calibration ont été reportées sur la Figure 6 (A : avant calibration ; B : après calibration).
Une excellente calibration est obtenue à TO, T9 et T12, caractérisée par une réduction importante de la moyenne des erreurs, qui passe respectivement de 157,69 à 17,64 ppm, de 186,45 à 19,45 ppm et de 287,29 à 29,01 ppm.
Ces résultats démontrent une excellente calibration avec une solution liquide de T0 à 12 mois malgré la simulation d’une utilisation intensive avec un temps d’évaporation d’ lh30 et une durée de 7,5 jours à température ambiante. De façon intéressante, l’amélioration de la qualité de calibration est obtenue même si la présence de quelques pics/valeurs (notées NA) n’est pas observée.
Figure imgf000027_0001
Tableau 4 : m/z relevées pour une composition de ca ibration selon l'invention (E. coli BL21 ; éthanol 70 % v/v), fraîchement préparée, avant et après calibration par référence aux 32 m/z théoriques d'E. coli ATCC 8739.
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Tableau 4bis : m/z relevées pour une composition de calibration selon l'invention (E. coli BL21 ; éthanol 70 % v/v), conservées pendant 9 mois à 2-8°C, avant et après calibration
Figure imgf000028_0001
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Tableau 4ter : m/z relevées pour une composition de calibration selon l'invention (E. coli BL21 ; éthanol 70 % v/v), conservées pendant 12 mois à 2-8°C, avant et après calibration
EXEMPLE 8 : Sélection des valeurs de calibration en fonction de la souche utilisée Comme démontré dans l’Exemple 6, la suspension de calibration préparée avec la souche BL21 d’E. coli permet d’améliorer la calibration lors de l’acquisition des spectres MALDI-TOF. Cependant, la qualité de la calibration dépend des protéines de référence sélectionnées pour effectuer la calibration.
Le présent exemple a pour objectif de présenter la méthodologie permettant de sélectionner, pour une souche donnée (en l’occurrence, la souche E. coli BL21), les protéines de référence dont les masses sur charge théoriques sont connues et qui seront utilisées pour la calibration. La présente méthodologie est applicable pour n’importe quelle autre souche d’E coli.
D’une manière générale, l’interprétation d’un spectre MALDI-TOF consiste à rechercher une liste de masses sur charge théoriques attendues parmi les valeurs expérimentales, c’est-à-dire les masses sur charge mesurées et obtenues à partir du spectre de masse avant calibration. Cette association se réalise sous un certain seuil de précision, une tolérance ou une erreur notée en « ppm » pour « partie par million ».
A) Sélection des masses sur charge théoriques pour la souche E. coli BL21 Une sélection des masses sur charge théoriques a été effectuée sur la plage de m/z allant de 3000 à 12500 Th (fixée trivialement par rapport aux capacités du spectromètre de masse) avec pour objectif de sélectionner des protéines et les ions associés de manière à ce que les masses sur charge théoriques correspondantes se répartissent uniformément sur ladite plage.
Le Tableau 5 ci-dessous reprend les masses sur charge théoriques (m/z) d’un nombre de protéines pré-sélectionnées ainsi que les noms correspondants, selon la même convention que Tableau 2. Non rencontrées dans ce Tableau 2, les modifications post- traductionnelles peuvent être aussi du type formylation, ou acétylation du 2eme acide aminé après clivage de la méthionine en N-terminale, ces modifications sont notées f ou a.
Figure imgf000030_0001
Tableau 5 : 49 m/z théoriques d'E. coli BL21
B) Spectres MALDI-TOF expérimentaux
Dans ses bases de données, la demanderesse dispose de 14 332 spectres MALDI-
TOF expérimentaux de la souche E. coli BL 21, acquis au fil du temps (6 614 ont été obtenu avec le spectromètre de masse VITEK® MS et 7 718, avec le spectromètre de masse VITEK® MS PRIME).
Parmi ces spectres, 52 d’entre eux admettent moins de la moitié des masses sur charge théoriques recherchées et sont écartés pour conserver finalement 14 280 spectres MALDI-TOF expérimentaux.
C) Validation des masses sur charge théoriques utilisées pour la calibration
Cl. Première validation des masses sur charge théoriques
Avant d’exploiter les résultats d’interprétation, la qualité de la calibration a été vérifiée. En effet, une mauvaise calibration peut fausser l’interprétation des pics expérimentaux, notamment à travers une précision irrégulière.
Par exemple, il est possible d’avoir des masses sur charge théoriques « décalées », ajoutant systématiquement un biais à la calibration, ou alors des masses sur charge théoriques « instables », brouillant la précision globale de la calibration. Dans les faits, les deux situations se rencontrent, d’où la nécessité d’écarter les masses théoriques qui peuvent être perturbatrices pour la calibration.
Pour cela, uniquement une partie des spectres a été exploitée. L’association entre un échantillon de 7 724 spectres MALDI-TOF et les 49 masses théoriques sélectionnées a abouti à 295 829 interprétations, soit environ 38 interprétations par spectre, c’est-à-dire 38 masses sur charge théoriques observées, dites expérimentales, sur les 49 recherchées.
Pour avoir une vue d’ensemble de la calibration, l’interprétation globale de chaque masse sur charge théorique a été affichée sur le même graphe, appelé graphe de super calibration. La médiane de l’erreur d’interprétation de chaque masse sur charge théorique a été affichée avec un intervalle de variance correspondant à F écart-type de l’erreur, comme présenté sur la Figure 7.
A partir du graphe de super calibration de la Figure 7, trois critères ont permis ensuite d’écarter les masses sur charge théoriques perturbatrices pour la calibration :
- La visibilité des masses sur charge théoriques : certaines masses sur charge théoriques sont très peu fréquemment observées et sont par conséquent écartées pour la calibration. Cela concerne quatre masses sur charge théoriques.
- Le décalage en masse sur charge : certaines masses sur charge théoriques semblent anormalement décalées, ainsi un seuil de 100 ppm est appliqué sur l’erreur médiane. Ce critère concerne sept masses sur charge théoriques.
- La stabilité de la masse : certaines masses sur charge théoriques admettent un écart-type et un intervalle de variance qui sont plus élevés. Ainsi, un seuil de 100 ppm est appliqué sur l’ écart-type afin de pouvoir écarter les masses sur charge théoriques présentant un écart-type d’erreur supérieur à 100 ppm. Ce critère concerne six masses sur charge théoriques.
En combinant les trois critères, douze masses sur charge théoriques distinctes ont été écartées pour la calibration et sont reprises dans le Tableau 6 ci-dessous.
Figure imgf000032_0001
Tableau 6 : 12 m/z d'une composition de calibration selon l'invention (E. coli BL21, éthanol 70 % v/v), écartées du processus de calibration
A Tissue de la première validation, 37 masses sur charge théoriques ont été conservées.
C2. Deuxième validation des masses sur charge théoriques
L’analyse a ensuite été réalisée sur un échantillon de 7 650 spectres pour obtenir le graphe de super calibration représentant pour chaque masse sur charge théorique la médiane de Terreur d’interprétation avec un intervalle de variance correspondant à T écart-type de Terreur.
Ensuite, un seuil de 40 ppm a été appliqué sur la médiane de Terreur. L’application de ce seuil a permis d’écarter 5 masses sur charge théoriques pour la calibration qui sont reprises dans le Tableau 7 ci-dessous.
Figure imgf000032_0002
Tableau 7 : 5 m/z d'une composition de calibration selon l'invention (E. coli BL21, éthanol 70 % v/v), également écartées du processus de calibration
A Tissue de la deuxième validation, 32 masses sur charge théoriques sont conservées pour la calibration et les 17 non conservées sont tout de même recherchées pour améliorer le contrôle. Ceci est résumé dans la partie suivante.
D) Méthode finale d’interprétation
6 563 spectres acquis avec le spectromètre VITEK® MS ont été étudiés. Avant interprétation, les spectres ont été calibrés en utilisant 32 masses théoriques présélectionnées. La calibration a consisté en deux régressions quadratiques successives aux seuils de tolérance respectivement de 500 ppm et 300 ppm en utilisant les 32 masses sur charge théoriques de calibration sélectionnées.
Enfin, un total de 49 masses sur charge (théoriques de calibration et additionnelles) ont été recherchées avec un seuil de tolérance de 300 ppm.
E) Résultats
Comme mentionné précédemment, pour comprendre la calibration d’un point de vue général, l’interprétation globale de chaque masse sur charge théorique a été affichée sur le même graphe. La médiane de l’erreur d’interprétation de chaque masse sur charge théorique a été affichée avec un intervalle de confiance correspondant à l’écart-type de l’erreur, comme présenté sur la Figure 8.
Puis, les performances d’interprétation ont été calculées sur l’ensemble des 32 masses sur charge, utilisées en tant que valeurs de calibration et des 17 masses sur charge additionnelles. Les résultats sont présentés dans le Tableau 8, ci-après.
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Tableau 8 : Performances de calibration selon l'invention
Il ressort du Tableau 8, que premièrement, les 32 masses sur charge utilisées correspondant aux valeurs de calibration sont très fréquemment visibles, avec un taux de visibilité moyen de 95% sur l’ensemble des spectres.
Deuxièmement, l’erreur absolue de mesure a également été rectifiée par la calibration avec une médiane diminuant de 119,48 ppm à 19,41 ppm, une moyenne diminuant de 152,48 ppm à 25,23 ppm et un écart-type diminuant de 126,39 ppm à 23,50 ppm. Autrement dit, la méthode de validation des masses sur charge correspondant aux valeurs de calibration a permis d’aboutir à la fourniture d’interprétations 6 fois plus précises avec un aléa de mesure 4 fois plus petit. La méthode de sélection des masses sur charge théoriques de référence a ainsi permis d’améliorer significativement les performances de calibration. Par ailleurs, le spectromètre de masse ainsi calibré a pu être ensuite utilisé avec succès pour l’identification de différents microorganismes.
EXEMPLE 9 : Stabilité et performances de compositions de calibration selon l’invention
Le Tableau 9 ci -après fournit, à titre indicatif, les résultats d’un test de stabilité dans le temps réalisé sur différentes compositions de calibration selon l’invention.
Les compositions testées ont été préparées avec des bactéries E. coli BL 21, mises en suspension dans une solution d’alcool pure, ou des solutions aqueuses d’alcool ou d’acétonitrile, en l’occurrence :
- une solution d’éthanol 100 % (v/v),
- une solution d’éthanol 20 % (v/v),
- une solution d’éthanol 50 % (v/v),
- une solution d’éthanol 70 % (v/v),
- une solution d’isopropanol 70 % (v/v), et
- une solution d’acétonitrile 70 % (v/v).
La stabilité de ces compositions de calibration a été évaluée selon la performance de calibration obtenue. Celle-ci est exprimée en moyenne des erreurs, associées aux 32 masses de calibration sélectionnées à l’Exemple 8.
Les mesures ont été effectuées avec des compositions de calibration « fraîchement » préparées (T0) ou après 8 jours de conservation à température ambiante (T8).
Figure imgf000034_0001
Tableau 9 : Stabilité de compositions de calibration, en termes de performance de calibration (exprimée en moyenne des erreurs).
Les six compositions de calibration, dont la performance de calibration est reportée Tableau 9, permettent donc de réduire la moyenne des erreurs d’un facteur moyen d’environ 6 à T0 et d’environ 10 à T8, ce qui démontre une excellente calibration selon l’invention.
A titre de comparaison, des calibrations réalisées avec des bactéries E. coli ATCC 8739 fraîchement cultivées, comme prescrit dans le manuel utilisateur du VITEK® MS, obtiennent des moyennes des erreurs de Tordre de 30 ppm après calibration (et selon des mesures récentes réalisés dans les mêmes conditions que l’exemple 8 : 109,94 ppm avant calibration et 26,9 ppm après calibration).
A noter aussi qu’une préparation des bactéries E. coli BL 21, mises en suspension dans une solution d’acide formique à 70 %, a conduit à des spectres de masse comportant trop peu de pics pour permettre une calibration.

Claims

Revendications
1. Composition de calibration pour spectromètre de masse comprenant des bactéries E. coli entières, en suspension dans un liquide à base d’alcool(s) et/ou d’acétonitrile [aseptisant, volatile et non-dénaturant/non-réactifs à l’égard des protéines bactériennes] .
2. Composition de calibration selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit liquide est à base d’alcool(s).
3. Composition de calibration selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit liquide est un liquide aqueux ayant une teneur en alcool(s) d’au moins 20 % v/v.
4. Composition de calibration selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle ledit ou lesdits alcools est/sont l’éthanol et/ou l’isopropanol.
5. Composition de calibration selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle ledit liquide est un mélange eau/alcool, de préférence un mélange eau/éthanol, ayant une teneur en alcool de 70 % v/v.
6. Composition de calibration selon la revendication 1, dans laquelle ledit liquide est un mélange aqueux eau/acétonitrile.
7. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les bactéries E. coli sont de souche unique.
8. Composition de calibration selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les bactéries E. coli sont de la souche BL21 ou de la souche ATCC 8739.
9. Composition de calibration selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les bactéries E. coli sont présentes à une concentration de 6.108 à 21.108 cfu/mL de la composition de calibration.
10. Procédé de calibration d'un spectromètre de masse adapté à la technique MALDI, comprenant les étapes suivantes : a) disposer d'une composition de calibration selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, b) déposer ladite composition de calibration et une matrice adaptée à la technique MALDI, sur au moins une zone de dépôt d’une plaque d’analyse MALDI, pour obtenir une zone de contrôle après séchage, c) placer ladite plaque d’analyse MALDI dans le spectromètre de masse et obtenir un spectre de masse pour la zone de contrôle selon la technique MALDI, et en particulier selon la technique MALDI-TOF, sur au moins une gamme de masses sur charge déterminée et utiliser les valeurs expérimentales obtenues des masses sur charge de pics dudit spectre correspondant à des ions de protéines dites de référence de la composition de calibration, en tant que valeurs de calibration, d) calculer une relation de calibration basée sur les masses sur charge théoriques des ions des protéines de référence et les valeurs de calibration.
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