WO2024253069A1 - 温度応答性マイクロキャリア - Google Patents

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WO2024253069A1
WO2024253069A1 PCT/JP2024/020256 JP2024020256W WO2024253069A1 WO 2024253069 A1 WO2024253069 A1 WO 2024253069A1 JP 2024020256 W JP2024020256 W JP 2024020256W WO 2024253069 A1 WO2024253069 A1 WO 2024253069A1
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temperature
cooling
microcarrier
polymer
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伸哉 今富
聖也 平床
大空 池谷
栄鎮 金
政浩 林
聡文 最上
博之 伊藤
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Tosoh Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F293/00—Macromolecular compounds obtained by polymerisation on to a macromolecule having groups capable of inducing the formation of new polymer chains bound exclusively at one or both ends of the starting macromolecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/12—Powdering or granulating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a temperature-responsive microcarrier consisting of beads coated with a polymer coating film that contains a temperature-responsive polymer and a negatively charged polymer.
  • Patent Document 1 describes a microcarrier made of beads made from synthetic polymers and natural polymers such as polysaccharides. By placing the microcarrier in a container containing a cell suspension and culturing it, the cells grow on the surface of the microcarrier, and cell growth per unit volume of medium can be increased.
  • the temperature-responsive microcarrier described in Patent Document 2 when using the temperature-responsive microcarrier described in Patent Document 2, cells can be detached from the microcarrier surface by cooling without the need for proteolytic enzymes, simplifying the process.
  • the temperature-responsive microcarrier described in Patent Document 2 does not always detach cells sufficiently, and there is a demand for a temperature-responsive microcarrier that exhibits more suitable temperature responsiveness.
  • the present inventors have conducted extensive research and found that a suitable temperature responsiveness can be achieved by using a microcarrier made of beads coated with a polymer coating film containing a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature of 0° C. to 50° C. and a negatively charged polymer, and have thus completed the present invention. That is, the present invention includes the following aspects. ⁇ 1> A microcarrier comprising beads coated with a polymer coating film containing a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature of 0°C to 50°C and a negatively charged polymer. ⁇ 2> The microcarrier according to ⁇ 1>, wherein the proportion of the negatively charged polymer is 0.1 to 20 wt %.
  • ⁇ 3> The microcarrier according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the negatively charged polymer contains a carboxy group.
  • ⁇ 4> The microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the ratio of carboxyl groups in the negatively charged polymer is 10 to 50 wt %.
  • ⁇ 5> The microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the bead surface is cationic.
  • ⁇ 6> The microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the beads are modified with a functional group having a positive charge.
  • ⁇ 7> The microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the beads are trimethylammonium chloride-modified polystyrene.
  • ⁇ 8> The microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the particle size of the beads is 20 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • ⁇ 9> The microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the temperature-responsive polymer is a block copolymer containing the following blocks (A), (B), and (C): (A) A polymer block having an HLB value (Griffin method) in the range of 7 or more and 20 or less.
  • HLB value Griffin method
  • (B) A polymer block having an HLB value (Griffin method) in the range of 0 or more and less than 7.
  • C A temperature-responsive polymer block having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0°C to 50°C.
  • LCST lower critical solution temperature
  • ⁇ 10> A method for producing a microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>.
  • ⁇ 11> A method for producing a microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, comprising a step of coating the beads with a polymer coating film containing a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature of 0°C to 50°C and a polymer having a negative charge.
  • ⁇ 12> A cell culture method using the microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>.
  • a cell culture method comprising the step of culturing cells in a medium containing the microcarrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>.
  • a microcarrier consisting of beads coated with a polymer coating film containing a temperature-responsive polymer with a lower critical dissolution temperature between 0°C and 50°C and a negatively charged polymer can exhibit suitable temperature responsiveness.
  • the present invention is a microcarrier consisting of beads coated with a polymer coating film that contains a temperature-responsive polymer with a lower critical solution temperature between 0°C and 50°C and a negatively charged polymer.
  • the temperature-responsive polymer in the present invention is not particularly limited as long as the compatibility changes when the lower critical solution temperature is from 0° C. to 50° C. However, in order to significantly exhibit the change in compatibility, it is preferable that the temperature-responsive polymer is a block copolymer.
  • An example of the block copolymer is a block copolymer containing the following blocks (A), (B), and (C).
  • B A polymer block having an HLB value (Griffin method) in the range of 0 or more and less than 7.
  • C A temperature-responsive polymer block having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0°C to 50°C.
  • the HLB value (Hydrophile-Lipophile Balance: HLB) is a value expressing the degree of affinity for water and oil, as described in W. C. Griffin, Journal of the Society of Cosmetic Chemists, 1, 311 (1949). It takes a value from 0 to 20, and the closer to 0, the higher the hydrophobicity, and the closer to 20, the higher the hydrophilicity.
  • Methods for calculating the HLB value by a formula include the Atlas method, the Griffin method, the Davis method, and the Kawakami method.
  • the value calculated by the Griffin method is used, and the value is calculated by the following formula based on the formula weight of the hydrophilic portion in the repeating unit of each block constituting the block copolymer of the present invention and the total formula weight of the repeating units.
  • HLB value 20 x (formula weight of hydrophilic portion in repeating unit) ⁇ (total formula weight of repeating units)
  • hydrophilic moieties in the repeating units of each block include a sulfone moiety (-SO 3 -), a phosphono group (-PO 3 -), a carboxyl group (-COOH), an ester group (-COO-), an amide group (-CONH-), an imide group (-CON-), an aldehyde group (-CHO), a carbonyl group (-CO-), a hydroxyl group (-OH), an amino group (-NH 2 ), an acetyl group (-COCH 3 ), an ethyleneamine group (-CH 2 CH 2 N-), an ethyleneoxy group (-CH 2 CH 2 O-), an alkali metal ion, an alkaline earth metal ion, an ammonium ion, a halide ion, and an acetate ion.
  • the atoms constituting the hydrophilic portion must not overlap with the atoms constituting other hydrophilic portions.
  • An example of calculating the HLB value in a repeating unit is shown below.
  • the hydrophilic portion is one part ester portion, one part phosphono group portion, and one part ethyleneamine portion, and the molecular weight of the hydrophilic portion is 181.04, so the HLB value is 12.3.
  • the hydrophilic portion is one part ester portion and one part ethyleneamine portion, and the molecular weight of the hydrophilic portion is 86.07, so the HLB value is 11.0.
  • the hydrophilic portion is one part ester portion, and the molecular weight of the hydrophilic portion is 44.01, so the HLB value is 8.8.
  • the hydrophilic portion is one part ester, and the molecular weight of the hydrophilic portion is 44.01, so the HLB value is 6.2.
  • the lower critical solution temperature is the temperature below which a polymer dissolves in water to form a transparent solution, but above which it becomes insoluble and either becomes cloudy or precipitates, resulting in phase separation.
  • temperature-responsive polymers include homopolymers composed only of component (C), copolymers composed of components (A) and (C), and copolymers composed of components (B) and (C).
  • the copolymers may be random or block copolymers.
  • the number average molecular weight of the temperature-responsive polymer is not particularly limited, but an example is 1,000 to 1,000,000, preferably 5,000 to 500,000, and more preferably 10,000 to 200,000.
  • a negatively charged polymer is a polymer having a functional group that ionizes in water and exhibits anionic properties.
  • the functional group that exhibits anionic properties examples include hydroxyl groups, carboxy groups, and sulfo groups. Among these, carboxy groups are preferred because of the ease of controlling the acidity.
  • the repeating units of the negatively charged polymer examples include vinylphenol, acrylic acid, methacrylic acid, and styrene sulfonic acid.
  • the negatively charged polymer may also contain repeating units of a polymer that does not have a negative charge, and an example is a copolymer of styrene sulfonic acid and styrene.
  • the copolymer may also be a random copolymer or a block copolymer.
  • the functional group of the negatively charged polymer is a carboxy group
  • the proportion of carboxy groups in the negatively charged polymer is 10 to 50 wt%, preferably 15 to 40 wt%, and more preferably 20 to 30 wt%.
  • the number average molecular weight of the negatively charged polymer is not particularly limited, but an example is 1,000 to 1,000,000, preferably 5,000 to 500,000, and more preferably 10,000 to 200,000.
  • beads are powder particles.
  • the particle size of the beads there is no particular limitation on the particle size of the beads, and examples thereof are 1 ⁇ m to 10 mm, 5 ⁇ m to 5 mm, and 20 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the shape of the beads there is no particular limitation on the shape of the beads, and examples thereof include a sphere, a rectangular parallelepiped, a cylindrical column, a cylindrical shape, and a star shape.
  • the true density of the beads but the higher the density of the polymer solution used in producing the temperature-responsive microcarrier, the more preferable it is, and an example thereof is 0.9 to 20.0 g/cm 2.
  • the beads may or may not have pores.
  • the specific surface area per dry weight of the beads there is no particular limitation on the specific surface area per dry weight of the beads, and an example thereof is 10 to 100,000 cm 2 /g.
  • the specific surface area per dry weight can be measured by the BET (Brunauer Emmett Teller) method, but in this application, it is calculated from the average particle size and particle specific gravity obtained from SEM images.
  • the material of the beads there is no particular limit to the material of the beads, and various materials can be used, such as metals, metal oxides, inorganic salts, synthetic polymers, biopolymers, or composites of these.
  • the surface of the beads it is preferable that the surface is cationic or modified with a positively charged functional group in order to enhance cell proliferation.
  • positively charged functional groups include ammonium groups and ammonium group derivatives.
  • Specific examples of beads include polystyrene, and trimethylammonium chloride-modified polystyrene is preferred.
  • the method for producing the temperature-responsive microcarrier is not particularly limited, but examples include a general method of physically coating the beads by adsorbing a polymer, or a chemical coating method by fixing a polymer to the beads by covalent bonding.
  • the coating method is not particularly limited, and examples include the impregnation method, immersion method, and Henschel mixer method. In the impregnation method and immersion method, the beads are immersed or sprayed with a polymer solution, and the solvent is removed by reducing the pressure to obtain a temperature-responsive microcarrier.
  • the beads are stirred with an impeller in a reaction vessel equipped with an impeller, and a polymer coating solution is added while blowing a drying gas into the reaction vessel, thereby obtaining a temperature-responsive microcarrier in a short time.
  • the Henschel mixer method and the impregnation method have the advantage that the entire amount of the polymer solution used can be adsorbed, making it easy to adjust the composition ratio and coating amount of the temperature-responsive polymer and the negatively charged polymer.
  • the polymer is fixed to the beads by a chemical covalent bond, there is no particular limitation on the type of chemical covalent bond, examples of which include ester bonds, amide bonds, ether bonds, and thioether bonds.
  • Temperature-responsive microcarriers can be obtained by removing unreacted compounds by washing after the reaction.
  • the drying gas there is no particular limitation on the drying gas, and any gas that is not reactive with the beads and polymer coating solution, such as nitrogen, air, argon, and neon, can be used.
  • the method for producing a temperature-responsive microcarrier may be, for example, a method characterized by comprising a step of coating beads with a polymer coating film containing a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature of 0°C to 50°C and a polymer having a negative charge.
  • the proportion of the negatively charged polymer in the temperature-responsive microcarrier is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 20 wt %, and in order to exhibit suitable temperature responsiveness, is preferably 0.3 to 10 wt %, more preferably 0.5 to 5 wt %, even more preferably 0.5 to 4 wt %, and particularly preferably 0.5 to 3 wt %.
  • the temperature-responsive microcarriers can be used for cell culture, particularly for cell culture of adherent cells.
  • Adherent cells are cells that grow while adhering to the surface of a cell culture substrate such as a microcarrier.
  • a cell culture substrate such as a microcarrier.
  • adherent cells There are no particular limitations on the origin of the adherent cells to be cultured, but examples include mammals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, rats, nude mice, mice, guinea pigs, pigs, sheep, Chinese hamsters, and cows, and birds such as chickens and ducks.
  • the type of cells (adherent cells) to be cultured is not particularly limited, and examples thereof include human or animal-derived mesenchymal stem cells, CHO cells derived from Chinese hamster ovaries, VERO cells derived from African green monkey kidney epithelium, MDCK cells derived from dog kidneys, MRC-5 cells derived from normal human fetal lung tissue, CEF cells derived from chicken fetuses, BHK cells derived from hamster kidneys, L929 cells derived from mouse connective tissue, HEK293 cells derived from human fetal kidneys, MDBK cells derived from bovine kidneys, CRFK cells derived from cat kidneys, CPK cells derived from guinea pig kidneys, HeLa cells derived from human cervical cancer, and further, epithelial cells and endothelial cells constituting each tissue and organ in the body, skeletal muscle cells that exhibit contractility, smooth muscle cells, cardiac muscle cells, neuron cells that constitute the nervous system, glial cells, fibros,
  • cell lines in which the above-mentioned cell types have been immortalized.
  • Other examples include cells contained in blood, lymph, cerebrospinal fluid, sputum, urine, or feces, and microorganisms, viruses, protozoa, etc. present in the body or in the environment.
  • the type of medium used it may be a serum medium or a serum-free medium, and can be selected appropriately depending on the type of cell.
  • the type of basal medium used in the culture of the present invention is not particularly limited, and examples of the medium that can be used include MEM, ⁇ MEM, DMEM, EMEM, GMEM, DMEM/Ham's F-12, Ham's F-12, Ham's F-10, Medium 199, and RPMI 1640.
  • the medium may be a serum medium or a serum-free medium, and the serum used is not particularly limited, and examples of the serum that can be used include fetal bovine serum (FBS), calf serum, adult bovine serum, horse serum, sheep serum, goat serum, pig serum, chicken serum, rabbit serum, and human serum.
  • FBS fetal bovine serum
  • the complete medium may or may not contain antibiotics, and can be selected appropriately depending on the type of cells.
  • the cells may be cultured under stationary conditions or under agitated conditions.
  • the agitation speed there is no particular limitation on the agitation speed, and one example is 1 to 1000 rpm.
  • the culture temperature during culture but it is preferable to perform the culture at or above the LCST, which can provide an environment in which the surface of the temperature-responsive polymer-coated microcarrier becomes hydrophobic and cells can easily adhere. After culture, the cells on the microcarrier can be recovered by cooling to a temperature below the LCST.
  • the cells may be directly cooled using a cooler, or the medium may be replaced with a cooling liquid.
  • the cooling liquid may be a basal medium, a complete medium containing growth factors and serum, or a phosphate buffer, but by selecting a phosphate buffer, the cells are easily detached from the microcarrier. If a chelating agent such as EDTA or EGTA is introduced into the phosphate buffer for cooling, the cells are more easily detached from the microcarrier as single cells.
  • single cells mean that the cells have left the state in which they were connected to each other and have been separated into individual cells.
  • the concentration of the chelating agent in the phosphate buffer is not particularly limited and is between 1 ⁇ M and 1 mM.
  • the cooling liquid it is preferable for the cooling liquid to have a flow, as this can promote cooling of the temperature-responsive microcarriers. For example, a flow can be obtained by stirring or pipetting.
  • the cell culture method using the temperature-responsive microcarrier of the present invention may be, for example, a method characterized by including a step of culturing cells in a medium containing the microcarrier of the present invention.
  • the cell culture method using the temperature-responsive microcarrier of the present invention may further include a cooling cell detachment step of detaching the cells from the microcarrier using a cooling liquid containing a chelating agent.
  • the culture performance of the temperature-responsive microcarrier of the present invention is evaluated by the total cell number and the cooling detachment rate. If the total cell number is equal to or lower than the total cell number cultured in a current general-purpose microcarrier with the same culture area, it is judged to have poor culture performance.
  • the current general-purpose microcarrier is Cytodex1 with a cationic surface from Cytiva and/or Cellbind with an anionic surface from Corning.
  • the method for evaluating the temperature-responsive cooling detachment rate there is no particular limitation on the method for evaluating the temperature-responsive cooling detachment rate, but as an example, (1) the number of cells recovered by cooling is measured, and (2) the number of cells that were not detached by cooling is measured using a protease, and the number of cells in (1) is divided by the sum of the number of cells in (1) and (2), and the result is multiplied by 100 to evaluate the cooling detachment rate.
  • the method for measuring the number of cells but it can be evaluated using a hemocytometer or the like.
  • the GPC device used was a Tosoh Corporation HLC-8320GPC, and two Tosoh Corporation TSKgel SuperAWM-H columns were used. The column temperature was set to 40°C, and the eluent was 2,2,2-trifluoroethanol containing 10 mM sodium trifluoroacetate.
  • the measurement sample was prepared at 1.0 mg/mL and measured.
  • polymethylmethacrylate Sigma-Aldrich
  • the reaction solution was purified by reprecipitation with water and dried under reduced pressure to obtain a yellow solid.
  • the obtained yellow solid was dissolved in chloroform, and the chloroform phase was collected using a separatory funnel.
  • the collected chloroform phase was concentrated in an evaporator and purified by reprecipitation with hexane.
  • the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 5.805 g of polymer MBI.
  • ⁇ Polymer CStS having negative charge> 1.156 g (8 mmol) of p-carboxystyrene (CSt) and 1.271 g (12 mmol) of styrene (St) were added to a 100 mL two-neck flask, and 3.3 mg (20 ⁇ mol) of azobisisobutyronitrile and 20 mL of tert-butyl alcohol were added. After argon gas replacement, the mixture was heated and stirred at 64° C. for 24 hours. The reaction solution was purified by reprecipitation with n-heptane and dried under reduced pressure to obtain 0.92 g of polymer CStS. The composition ratio of polymer CStS was CSt/St 33/67 (mol%), the number average molecular weight Mn was 106,000, and the molecular weight distribution Mw/Mn was 1.84.
  • the rotary evaporator was a Tokyo Rika Kikai N-1300
  • the small cooling water circulation device was a Tokyo Rika Kikai CCA-1112A
  • the diaphragm type vacuum pump was a Tokyo Rika Kikai NVP-2100V
  • the water bath was a Tokyo Rika Kikai OSB-2200.
  • Water was used as the fluid for the small cooling water circulation device, and the temperature was set to 3°C. The temperature of the water bath was set to 50°C.
  • Example 1 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.0025 wt% polymer CStS were added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m were further added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12,000 Pa for 1 minute.
  • the mixture was further subjected to constant pressure treatment at 10,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6,000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4,000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and the mixture was finally subjected to vacuum impregnation treatment by reducing the pressure to 1,500 Pa by treating for 30 minutes with the vacuum pump at its maximum output.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, ultrasonic waves were applied, and the flask was left to stand for 10 minutes.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarrier 1, which contains 4.76 wt% of negatively charged polymer.
  • ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture> To a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able, 204 mg (culture area 87 cm2 ) of temperature-responsive microcarrier 1 and 30 mL of mesenchymal stem cell proliferation medium 2 manufactured by PromoCell were added. Furthermore, 5 x 105 cells of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (passage number 2) manufactured by Lonza were added and cultured for 6 days under stirring conditions of 100 rpm in an incubator with a 5 vol% CO2 atmosphere at 37°C.
  • the 30 mL single-use bioreactor was transferred to a safety cabinet at room temperature, left to settle the microcarriers, 22.5 mL of the medium was removed, and 22.5 mL of phosphate buffered saline (PBS(-)) containing 1 mM EDTA at 4 ° C. without calcium and magnesium was added and left to stand for 10 minutes. After standing, the mixture was stirred at 300 rpm for 3 minutes at room temperature.
  • the cell suspension was passed through a 50 mL tube with a cell strainer with a 70 ⁇ m opening, and 5 mL of PBS(-) was added twice on the cell strainer, the cells were collected in the tube, concentrated by centrifugation, and the cell number was counted.
  • the number of cells collected by cooling was 70.8 ⁇ 10 5 cells.
  • the microcarriers on the cell strainer were then transferred to a 15 mL tube, 5 mL of TrypLE Express Enzyme (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added, and the tube was left to stand for 5 minutes in a 5 vol% CO2 atmosphere at 37 °C.
  • the cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a 70 ⁇ m opening, and 5 mL of PBS (-) was added twice onto the cell strainer to collect the cells in the tube, which were then concentrated by centrifugation to count the number of cells.
  • the number of cells that could not be collected by cooling was 22.1 ⁇ 105.
  • the cooling detachment rate was 76%.
  • Example 2 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.0015 wt% polymer CStS were added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m were added and left to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was treated at a constant pressure of 12,000 Pa for 1 minute.
  • the mixture was further treated at a constant pressure of 10,000 Pa for 1 minute, at 8,000 Pa for 1 minute, at 6,000 Pa for 2 minutes, and at 4,000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and the mixture was finally treated for 30 minutes with the vacuum pump at its maximum output, reducing the pressure to 1,500 Pa and performing vacuum impregnation.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, and the flask was left to stand for 10 minutes while being exposed to ultrasonic waves.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarrier 2, which contains 2.91 wt% of negatively charged polymer.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that temperature-responsive microcarrier 2 was used.
  • the number of cells recovered by cooling was 78.2 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 18.2 x 105.
  • the cooling detachment rate was 81%.
  • Example 3 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.0005 wt% polymer CStS were added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m were further added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12000 Pa for 1 minute.
  • the mixture was further subjected to constant pressure treatment at 10000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and the vacuum pump was finally set to maximum output for 30 minutes to reduce the pressure to 1500 Pa, and vacuum impregnation treatment was performed.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, ultrasonic waves were applied, and the flask was left to stand for 10 minutes.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarrier 3, which contains 0.99 wt% of negatively charged polymer.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except for using temperature-responsive microcarrier 3.
  • the number of cells recovered by cooling was 96.4 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 19.1 x 105.
  • the cooling detachment rate was 83%.
  • Example 4 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.00038 wt% polymer CStS were added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m were further added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12000 Pa for 1 minute. The mixture was further subjected to constant pressure treatment at 10000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4000 Pa for 3 minutes, for vacuum impregnation treatment.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, ultrasonic waves were applied, and the flask was left to stand for 10 minutes.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarrier 4, which contains 0.74 wt% of negatively charged polymer.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that temperature-responsive microcarrier 4 was used.
  • the number of cells recovered by cooling was 93.4 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 3.6 x 105.
  • the cooling detachment rate was 96%.
  • Example 5 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.00025 wt% polymer CStS were added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m were further added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12,000 Pa for 1 minute.
  • the mixture was further subjected to constant pressure treatment at 10,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6,000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4,000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and the vacuum pump was finally set to maximum output for 30 minutes to reduce the pressure to 1,500 Pa, and vacuum impregnation treatment was performed.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, ultrasonic waves were applied, and the flask was left to stand for 10 minutes.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarrier 5, which contains 0.50 wt% of negatively charged polymer.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that temperature-responsive microcarrier 5 was used.
  • the number of cells recovered by cooling was 73.2 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 29.3 x 105.
  • the cooling detachment rate was 71%.
  • Example 6 12 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 12 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.00038 wt% polymer CStS were added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m were added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12,000 Pa for 1 minute.
  • the mixture was further subjected to constant pressure treatment at 10,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6,000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4,000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and the vacuum pump was set to maximum output for 30 minutes to reduce the pressure to 1,500 Pa, and vacuum impregnation treatment was performed.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, and the mixture was exposed to ultrasound and left to stand for 10 minutes.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the mixture was treated for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarriers 6 with a negatively charged polymer ratio of 0.74 wt%.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that temperature-responsive microcarriers 6 were used.
  • the number of cells recovered by cooling was 109.0 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 1.6 x 105.
  • the cooling detachment rate was 98%.
  • the mixture was further subjected to constant pressure treatment at 10,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6,000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4,000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and the vacuum pump was set to maximum output for 30 minutes to reduce the pressure to 1,500 Pa, and vacuum impregnation treatment was performed.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, ultrasonic waves were applied, and the flask was left to stand for 10 minutes.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarrier 7, which contains 0.74 wt% of negatively charged polymer.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except for using temperature-responsive microcarriers 7.
  • the number of cells recovered by cooling was 94.7 x 105 , and the number of cells that could not be recovered by cooling was 20.5 x 105.
  • the cooling detachment rate was 82%.
  • Example 8 In a 200 mL flask, 6 g of a 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 6 g of a 1-methoxy-2-propanol solution of 0.00038 wt% polymer CStS were added. Furthermore, 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) having a diameter of 130 ⁇ m were added and left to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12000 Pa for 1 minute.
  • a 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 6 g of a 1-methoxy-2-propanol solution of 0.00038 wt% polymer CStS were added. Furthermore, 10 g of dried polystyrene
  • constant pressure treatment was performed at 10000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and finally, the vacuum pump was set to maximum output and treated for 30 minutes to reduce the pressure to 1500 Pa, and vacuum impregnation treatment was performed.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that temperature-responsive microcarriers 8 were used.
  • the number of cells recovered by cooling was 84.7 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 28.6 x 105.
  • the cooling detachment rate was 75%.
  • Example 9 ⁇ VERO cell culture> 356 mg (culture area 150 cm 2 ) of temperature-responsive microcarrier 2 and 30 mL of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Wako Pure Chemical Industries) containing 10% fetal bovine serum (Biowest Co., Ltd.) and 1% antibiotic-antimycotic solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able Co., Ltd. Furthermore, 1 x 10 6 cells of VERO cells (passage number 16) manufactured by JCRB Cell Bank were added and cultured for 8 days under stirring conditions of 120 rpm in an incubator with a 5 vol% CO 2 atmosphere at 37°C.
  • DMEM Dynamic Eagle Medium
  • fetal bovine serum Biowest Co., Ltd.
  • antibiotic-antimycotic solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the 30 mL single-use bioreactor was transferred to a safety cabinet at room temperature, the cell suspension was passed through a 50 mL tube with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, the floating cells were removed, and only the microcarriers to which the cells on the cell strainer were attached were collected, and phosphate buffered saline (PBS (-)) free of calcium and magnesium at 4 ° C was added and allowed to stand for 10 minutes. After standing, pipetting was performed 60 times, and the detached cells were collected by passing them through a 50 mL tube with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, and the cells were concentrated by centrifugation and counted.
  • PBS (-) phosphate buffered saline
  • Example 10 ⁇ VERO cell culture> VERO cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ VERO cell culture> of Example 9, except that temperature-responsive microcarrier 3 was used.
  • the number of cells recovered by cooling was 11.0 x 106
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 1.8 x 106.
  • the cooling detachment rate was 86%.
  • Example 11 ⁇ VERO cell culture> VERO cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ VERO cell culture> of Example 9, except that temperature-responsive microcarrier 4 was used.
  • the number of cells recovered by cooling was 12.8 x 106
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 0.8 x 106.
  • the cooling detachment rate was 94%.
  • Comparative Example 1 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% polymer CStS were added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m were further added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12,000 Pa for 1 minute.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that temperature-responsive microcarrier 9 was used.
  • the number of cells recovered by cooling was 22.3 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 89.0 x 105.
  • the cooling detachment rate was 20%.
  • Comparative Example 2 10 g of a 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI was added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m was further added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12,000 Pa for 1 minute.
  • the mixture was further subjected to constant pressure treatment at 10,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6,000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4,000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and the vacuum pump was set to maximum output for 30 minutes to reduce the pressure to 1,500 Pa, and vacuum impregnation treatment was performed.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, and the flask was left to stand for 10 minutes while being exposed to ultrasonic waves.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarriers 10 with a negatively charged polymer ratio of 0.00 wt%.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that the temperature-responsive microcarrier 10 was used.
  • the number of cells recovered by cooling was 39.3 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 10.7 x 105.
  • the cooling detachment rate was 79%, but the total number of cells was lower than the total number of cells cultured using the current general-purpose microcarrier described in Reference Example 1.
  • Comparative Example 3 10 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% polymer CStS was added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m was added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12,000 Pa for 1 minute. The mixture was then subjected to constant pressure treatment at 10,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6,000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4,000 Pa for 3 minutes. The stirring speed was set to 120 rpm, and the vacuum pump was set to maximum output for 30 minutes to reduce the pressure to 1,500 Pa, and vacuum impregnation treatment was performed.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, ultrasonic waves were applied, and the flask was left to stand for 10 minutes.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain microcarriers 11 with a negatively charged polymer ratio of 100.00 wt%.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except for using the temperature-responsive microcarrier 11.
  • the number of cells recovered by cooling was 2.3 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 98.5 x 105.
  • the cooling detachment rate was 2%.
  • VERO cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ VERO cell culture> of Example 9, except that temperature-responsive microcarrier 11 was used.
  • the number of cells recovered by cooling was 1.4 x 106
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 11.1 x 106.
  • the cooling detachment rate was 85%.
  • Reference Example 1 Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture> 20 mg (culture area 87 cm2 ) of autoclave-sterilized Cytodex1 (surface: cationic, average specific gravity: 1.03) was added to a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able Co., Ltd. Furthermore, 5 x 105 cells of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (passage number 2) manufactured by Lonza were added and cultured for 6 days under stirring conditions of 60 rpm in an incubator with a 5 vol% CO2 atmosphere at 37°C.
  • the 30 mL single-use bioreactor was transferred to a safety cabinet at room temperature, left to settle Cytodex1, 27 mL of medium was removed, and 27 mL of PBS(-) was added. Cytodex1 was left to settle, 27 mL of liquid was removed, 5 mL of TrypLE Express Enzyme (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added, and the mixture was left to stand for 5 minutes in a 5 vol% CO2 atmosphere at 37 ° C.
  • the cell suspension was passed through a 50 mL tube with a cell strainer with a 70 ⁇ m opening, and 5 mL of PBS(-) was added twice on the cell strainer, the cells were collected in the tube, concentrated by centrifugation, and the cell number was measured. The cell number was 51.7 ⁇ 10 5 cells.
  • Reference Example 2 ⁇ VERO cell culture> VERO cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ VERO cell culture> in Example 9, except that 34.1 mg (culture area 150 cm2 ) of the microcarrier of Reference Example 1 (Cytodex 1, surface: cationic, average specific gravity: 1.03) was used and the stirring speed was set to 60 rpm.
  • the number of cells recovered by cooling was 1.4 x 106
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 8.7 x 106.
  • the cooling detachment rate was 14%.
  • Reference Example 3 ⁇ VERO cell culture> 416 mg (culture area 150 cm 2 ) of autoclave-sterilized Cellbind (surface: anionic, average specific gravity: 1.026) was added to a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able. 30 mL of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Wako Pure Chemical Industries) containing 10% fetal bovine serum (Biowest) and 1% antibiotic-antimycotic solution (Wako Pure Chemical Industries) was then added. 1 ⁇ 10 6 cells of VERO cells (passage number 16) manufactured by JCRB Cell Bank were then added and cultured for 8 days at 37° C. in an incubator with a 5 vol% CO 2 atmosphere at 120 rpm.
  • DMEM Disulbecco's Modified Eagle Medium, Wako Pure Chemical Industries
  • VERO cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ VERO cell culture> in Example 9, except that Cellbind microcarriers were used.
  • the number of cells recovered by cooling was 1.4 x 106
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 14.1 x 106.
  • the cooling detachment rate was 9%.
  • Example 12 12 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.050 wt% temperature-responsive block copolymer MBI and 12 g of 1-methoxy-2-propanol solution of 0.00038 wt% polymer CStS were added to a 200 mL flask. 10 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.03) with a diameter of 130 ⁇ m were added and allowed to stand for 1 minute. The flask was placed in an evaporator, the stirring speed was set to 60 rpm, and the mixture was subjected to constant pressure treatment at 12,000 Pa for 1 minute.
  • the mixture was further subjected to constant pressure treatment at 10,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 8,000 Pa for 1 minute, constant pressure treatment at 6,000 Pa for 2 minutes, and constant pressure treatment at 4,000 Pa for 3 minutes.
  • the stirring speed was set to 120 rpm, and the vacuum pump was set to maximum output for 30 minutes to reduce the pressure to 1,500 Pa, and vacuum impregnation treatment was performed.
  • the flask was removed from the evaporator, 150 mL of ion-exchanged water was added, ultrasonic waves were applied, and the flask was left to stand for 10 minutes.
  • the beads collected by filtration were transferred to a 200 mL flask, and the stirring speed in the evaporator was set to 120 rpm.
  • the vacuum pump was set to maximum output and the flask was left to stand for 30 minutes to obtain temperature-responsive microcarriers 12 with a negatively charged polymer ratio of 0.74 wt%.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that 195 mg (culture area 87 cm2 ) of temperature-responsive microcarriers 12 were used and the stirring speed was set to 60 rpm.
  • the number of cells recovered by cooling was 61.3 x 105 , and the number of cells that could not be recovered by cooling was 1.4 x 105.
  • the cooling detachment rate was 98%.
  • Example 13 A 500 mL separable flask was set and equipped with a PTFE (poly(1,1,2,2-tetrafluoroethylene)) stirring blade. 40 g of dried polystyrene beads (surface: cationic, average specific gravity: 1.08) with a diameter of 130 ⁇ m was added and purged with nitrogen gas in the flask while stirring at 100 rpm.
  • PTFE poly(1,1,2,2-tetrafluoroethylene)
  • Example 4 Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture> Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that 238 mg (culture area 87 cm2 ) of Cellbind (surface: anionic, average specific gravity: 1.026) microcarriers sterilized by autoclave were used and the stirring speed was set to 60 rpm. The number of cells recovered by cooling was 20.0 x 105 , and the number of cells that could not be recovered by cooling was 28.2 x 105. The cooling detachment rate was 59%.
  • Example 5 Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture> Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in Example 1 ⁇ Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture>, except that 20 mg (culture area 87 cm2 ) of autoclave-sterilized Cytodex1 microcarriers (surface: cationic, average specific gravity: 1.03) was used and the stirring speed was set to 60 rpm. The number of cells recovered by cooling was 21.1 x 105 , and the number of cells that could not be recovered by cooling was 28.9 x 105. The cooling detachment rate was 42%.
  • Example 14 ⁇ VERO cell culture> VERO cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ VERO cell culture> of Example 9, except that 340 mg (culture area 150 cm2 ) of temperature-responsive microcarriers 13 were used and the stirring speed was set to 60 rpm. The number of cells recovered by cooling was 122.0 x 105 , and the number of cells that could not be recovered by cooling was 12.0 x 105. The cooling detachment rate was 91%.
  • Example 15 Serum-free culture of VERO cells 356 mg (culture area 150 cm 2 ) of temperature-responsive microcarrier 13 and 1 L of VP-SFM (1X) (Thermo Fisher Scientific, product number: 11681020) were added to a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able, and 20 mL of 200 mM L-Glutamine Solution (1X) (ATCC, product number: 30-2214) were added to the VP-SFM (1X) and 30 mL of a final medium with a final concentration of 20 mM were added. Furthermore, 1 x 10 6 cells of Vero cells (American Type Culture Collection (ATCC), product number: CCL-81) were added and cultured for 8 days at 37 ° C. in an incubator with a 5 vol % CO 2 atmosphere at 100 rpm stirring condition.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the 30 mL single-use bioreactor was transferred to a safety cabinet at room temperature, the cell suspension was passed through a 50 mL tube with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, the floating cells were removed, and only the microcarriers to which the cells on the cell strainer were attached were collected, and phosphate buffered saline (PBS (-)) free of calcium and magnesium at 4 ° C was added and allowed to stand for 10 minutes. After standing, pipetting was performed 60 times, and the detached cells were collected by passing them through a 50 mL tube with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, and the cells were concentrated by centrifugation and counted.
  • PBS (-) phosphate buffered saline
  • the number of cells collected by cooling was 46.5 ⁇ 10 5 cells. Furthermore, the microcarriers on the cell strainer were transferred to a 15 mL tube, 5 mL of CTS TrypLE Select Enzyme (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes in a 5 vol% CO 2 atmosphere at 37 ° C. The cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, the cells were collected, concentrated by centrifugation, and the cell number was counted. The number of cells that could not be collected by cooling was 4.2 ⁇ 10 5 cells. The cooling detachment rate was 92%.
  • Example 16 ⁇ BHK-21 cell culture> 340 mg (culture area 150 cm 2 ) of temperature-responsive microcarrier 12 and 30 mL of complete medium of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Wako Pure Chemical Industries) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Biowest Co., Ltd.) and 1% antibiotic-antimycotic solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able Co., Ltd. Furthermore, 1 x 10 6 cells of BHK-21 cells (ATCC, product number: CCL-10) were added and cultured for 7 days at 60 rpm stirring in an incubator with a 5 vol% CO 2 atmosphere at 37°C.
  • DMEM Dynamic fetal bovine serum
  • the 30 mL single-use bioreactor was transferred to a safety cabinet at room temperature, the cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, the floating cells were removed, and only the microcarriers to which the cells on the cell strainer were attached were collected, and phosphate buffered saline (PBS (-)) containing no calcium or magnesium at 4 ° C was added and allowed to stand for 10 minutes. After standing, pipetting was performed 60 times, and the detached cells were collected by passing them through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, and the cells were concentrated by centrifugation and counted.
  • PBS (-) phosphate buffered saline
  • the number of cells collected by cooling was 148.0 ⁇ 10 5 cells.
  • the microcarriers on the cell strainer were then transferred to a 15 mL tube, 5 mL of CTS TrypLE Select Enzyme (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes in a 5 vol% CO2 atmosphere at 37 °C.
  • the cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a 70 ⁇ m opening, the cells were collected, and the cells were concentrated by centrifugation to count the number of cells.
  • the number of cells that could not be collected by cooling was 19.0 ⁇ 105.
  • the cooling detachment rate was 89%.
  • Example 17 ⁇ CRFK cell culture> 356 mg (culture area 150 cm 2 ) of temperature-responsive microcarrier 4 and 30 mL of complete medium of EMEM (ATCC-formulated Eagle's Minimum Essential Medium, ATCC, product number: 30-2003) containing 10% horse serum (HS, Sigma-Aldrich Japan, LLC) were added to a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able Co., Ltd. Furthermore, 0.8 x 10 6 cells of CRFK cells (ATCC, product number: CCL-94) were added and cultured for 7 days at 100 rpm stirring in an incubator with a 5 vol% CO 2 atmosphere at 37°C.
  • EMEM ATCC-formulated Eagle's Minimum Essential Medium, ATCC, product number: 30-2003
  • horse serum HS, Sigma-Aldrich Japan, LLC
  • the 30 mL single-use bioreactor was transferred to a safety cabinet at room temperature, the cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, the floating cells were removed, and only the microcarriers to which the cells on the cell strainer were attached were collected, and phosphate buffered saline (PBS (-)) containing no calcium or magnesium at 4 ° C was added and allowed to stand for 10 minutes. After standing, pipetting was performed 60 times, and the detached cells were collected by passing them through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, and the cells were concentrated by centrifugation and counted.
  • PBS (-) phosphate buffered saline
  • the number of cells collected by cooling was 26.8.0 ⁇ 10 5 cells.
  • the microcarriers on the cell strainer were then transferred to a 15 mL tube, 5 mL of CTS TrypLE Select Enzyme (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes in a 5 vol% CO2 atmosphere at 37 °C.
  • the cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a 70 ⁇ m opening, the cells were collected, and the cells were concentrated by centrifugation to count the number of cells.
  • the number of cells that could not be collected by cooling was 3.1 ⁇ 10 5 cells.
  • the cooling detachment rate was 90%.
  • Example 18 CRFK cell culture> CRFK cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ CRFK cell culture> in Example 17, except that 340 mg of microcarriers 12 (culture area 150 cm 2 ) was used and the stirring speed was set to 60 rpm. The number of cells recovered by cooling was 13.8 ⁇ 10 5 , and the number of cells that could not be recovered by cooling was 3.8 ⁇ 10 5 . The cooling detachment rate was 78%.
  • Example 19 CRFK cell culture> CRFK cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ CRFK cell culture> in Example 17, except that 356 mg of microcarrier 13 (culture area 150 cm 2 ) was used. The number of cells recovered by cooling was 21.2 ⁇ 10 5 , and the number of cells that could not be recovered by cooling was 4.6 ⁇ 10 5 . The cooling detachment rate was 82%.
  • Example 20 ⁇ MDCK cell culture> 356 mg (culture area 150 cm 2 ) of temperature-responsive microcarrier 4 and 30 mL of complete medium of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Wako Pure Chemical Industries) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Biowest Co., Ltd.) and 1% antibiotic-antimycotic solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able Co., Ltd. Furthermore, 0.6 x 10 6 cells of MDCK cells (manufactured by Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB), product number: JCRB9029) were added and cultured for 7 days at 37 ° C. in an incubator with 5 vol % CO 2 atmosphere at 100 rpm stirring conditions.
  • DMEM Dynamic Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotic-antimycotic solution Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the 30 mL single-use bioreactor was transferred to a safety cabinet at room temperature, the cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, the floating cells were removed, and only the microcarriers to which the cells on the cell strainer were attached were collected, and phosphate buffered saline (PBS (-)) containing no calcium or magnesium at 4 ° C was added and allowed to stand for 10 minutes. After standing, pipetting was performed 60 times, and the detached cells were collected by passing them through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, and the cells were concentrated by centrifugation and counted.
  • PBS (-) phosphate buffered saline
  • the number of cells collected by cooling was 137.0 ⁇ 10 5 cells.
  • the microcarriers on the cell strainer were then transferred to a 15 mL tube, 5 mL of CTS TrypLE Select Enzyme (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes in a 5 vol% CO2 atmosphere at 37 °C.
  • the cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a 70 ⁇ m opening, the cells were collected, and the cells were concentrated by centrifugation to count the number of cells.
  • the number of cells that could not be collected by cooling was 37.0 ⁇ 10 5 cells.
  • the cooling detachment rate was 79%.
  • Example 21 ⁇ MDCK cell culture> MDCK cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ MDCK cell culture> of Example 19, except that 340 mg of microcarriers 12 (culture area 150 cm 2 ) was used and the stirring speed was set to 60 rpm. The number of cells recovered by cooling was 112.0 ⁇ 10 5 , and the number of cells that could not be recovered by cooling was 32.0 ⁇ 10 5 . The cooling detachment rate was 78%.
  • Example 11 MDCK cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ MDCK cell culture> of Example 20, except that 416 mg (culture area 150 cm2 ) of Cellbind (surface: anionic, average specific gravity: 1.026) microcarriers sterilized by autoclave were used and the stirring speed was set to 60 rpm.
  • the number of cells recovered by cooling was 2.3 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 68.8 x 105.
  • the cooling detachment rate was 3%.
  • Example 12 MDCK cell culture> MDCK cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ MDCK cell culture> of Example 20, except that 34.1 mg (culture area 150 cm2 ) of autoclave-sterilized Cytodex1 (surface: cationic, average specific gravity: 1.03) microcarriers were used and the stirring speed was set to 60 rpm.
  • the number of cells recovered by cooling was 16.7 x 105
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 157.4 x 105.
  • the cooling detachment rate was 10%.
  • Example 22 ⁇ MRC-5 cell culture> 204 mg (culture area 87 cm 2 ) of temperature-responsive microcarrier 4 and 30 mL of complete medium of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Wako Pure Chemical Industries) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Biowest Co., Ltd.) and 1% antibiotic-antimycotic solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to a 30 mL single-use bioreactor manufactured by Able Co., Ltd. Furthermore, 0.5 x 10 6 cells of MRC-5 cells (manufactured by Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB), product number: JCRB9008) were added and cultured for 6 days at 37 ° C. in an incubator with 5 vol % CO 2 atmosphere at 100 rpm stirring conditions.
  • DMEM Dynamic Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotic-antimycotic solution Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the 30 mL single-use bioreactor was transferred to a safety cabinet at room temperature, the cell suspension was passed through a 50 mL tube with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, the floating cells were removed, and only the microcarriers to which the cells on the cell strainer were attached were collected, and phosphate buffered saline (PBS (-)) free of calcium and magnesium at 4 ° C was added and allowed to stand for 10 minutes. After standing, pipetting was performed 60 times, and the detached cells were collected by passing them through a 50 mL tube with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, and the cells were concentrated by centrifugation and counted.
  • PBS (-) phosphate buffered saline
  • the number of cells collected by cooling was 9.8 ⁇ 10 5 cells. Furthermore, the microcarriers on the cell strainer were transferred to a 15 mL tube, 5 mL of CTS TrypLE Select Enzyme (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes in a 5 vol% CO 2 atmosphere at 37 ° C. The cell suspension was passed through a 50 mL tube equipped with a cell strainer with a mesh size of 70 ⁇ m, the cells were collected, concentrated by centrifugation, and the number of cells was counted. The number of cells that could not be collected by cooling was 4.1 ⁇ 10 5 cells. The cooling detachment rate was 71%.
  • Example 23 ⁇ MRC-5 cell culture> MRC-5 cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ MRC-5 cell culture> in Example 22, except that 195 mg of microcarriers 12 (culture area 87 cm 2 ) were used and the stirring speed was 60 rpm.
  • the number of cells recovered by cooling was 18.8 ⁇ 10 5
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 1.0 ⁇ 10 5 .
  • the cooling detachment rate was 95%.
  • MRC-5 cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ MRC-5 cell culture> in Example 22, except that 238 mg (culture area 87 cm 2 ) of Cellbind (surface: anionic, average specific gravity: 1.026) microcarriers sterilized by autoclave were used and the stirring speed was set to 60 rpm.
  • the number of cells recovered by cooling was 3.4 ⁇ 10 5
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 8.8 ⁇ 10 5 .
  • the cooling detachment rate was 28%.
  • MRC-5 cells were cultured and the number of cells was counted in the same manner as in ⁇ MRC-5 cell culture> in Example 22, except that 20 mg (culture area 87 cm 2 ) of autoclave-sterilized Cytodex 1 (surface: cationic, average specific gravity: 1.03) microcarriers were used and the stirring speed was set to 60 rpm.
  • the number of cells recovered by cooling was 4.2 ⁇ 10 5
  • the number of cells that could not be recovered by cooling was 9.2 ⁇ 10 5 .
  • the cooling detachment rate was 31%.

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Abstract

本発明は、下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーを含むポリマーコート膜を被覆したビーズからなるマイクロキャリアに関する。

Description

温度応答性マイクロキャリア
　本発明は、温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーを含むポリマーコート膜を被覆したビーズからなる温度応答性マイクロキャリアに関する。
　細胞を原料にして製造する細胞医薬品は難治疾患の治療薬として注目を集めている。また、抗体医薬品やワクチンなどの生産のため大量細胞培養法が注目を集めており、原料細胞を効率的に製造する技術が求められている。一般的にヒト細胞を含め多くの動物細胞は足場依存性があり、細胞を増殖する際は細胞が接着し安定的に増殖できる適切な足場が必要である。コスト低減に当たり、単位培地量当たりの細胞増殖が高くなる足場の設計を行う必要があった。これを解決するため、合成高分子や多糖などの天然高分子を原料としたビーズから構成されるマイクロキャリアが特許文献１に記載されている。マイクロキャリアを細胞懸濁液入りの容器に投入し培養することで、細胞はマイクロキャリア表面で増殖し、単位培地量当たりの細胞増殖を高めることができる。
　細胞がマイクロキャリア表面を全て覆うまで培養した後は、細胞をマイクロキャリアから剥がして新しいマイクロキャリアに植え継ぐ拡大培養を行う。一般的なマイクロキャリアではトリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いてマイクロキャリアから細胞を剥がすが、タンパク質分解酵素が残存すると培養に悪影響を与えるため、タンパク質分解酵素を除去ないし中和する工程が必要となる。
　これに対し、特許文献２記載の温度応答性マイクロキャリアを用いる場合は、冷却することで細胞をタンパク質分解酵素不要でマイクロキャリア表面から剥離できるため工程の簡略化が可能になる。しかしながら特許文献２記載の温度応答性マイクロキャリアでは必ずしも十分に細胞を剥離できず、より好適な温度応答性を発現する温度応答性マイクロキャリアが求められた。
特表２０１３－５１５４７３号公報 特許第６９５４０４７号公報
　本特許の目的は、好適な温度応答性を発現する温度応答性マイクロキャリアを提供することにある。
　本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーを含むポリマーコート膜を被覆したビーズからなるマイクロキャリアにより、好適な温度応答性を発現することを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は以下の態様を含包する。
＜１＞下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーを含むポリマーコート膜を被覆したビーズからなるマイクロキャリア。
＜２＞負電荷を有するポリマーの割合が０．１～２０ｗｔ％であることを特徴とする＜１＞記載のマイクロキャリア。
＜３＞負電荷を有するポリマー中にカルボキシ基が含まれることを特徴とする＜１＞又は＜２＞記載のマイクロキャリア。
＜４＞負電荷を有するポリマー中のカルボキシ基の割合が１０～５０ｗｔ％であることを特徴とする＜１＞～＜３＞記載のマイクロキャリア。
＜５＞ビーズ表面がカチオン性であることを特徴とする＜１＞～＜４＞記載のマイクロキャリア。
＜６＞ビーズに正電荷を有する官能基が修飾していることを特徴とする＜１＞～＜５＞記載のマイクロキャリア。
＜７＞ビーズがトリメチルアンモニウムクロライド修飾ポリスチレンであることを特徴とする＜１＞～＜６＞記載のマイクロキャリア。
＜８＞ビーズの粒径が２０μｍ～１０００μｍであることを特徴とする＜１＞～＜７＞記載のマイクロキャリア。
＜９＞温度応答性ポリマーが下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体であることを特徴とする＜１＞～＜８＞記載のマイクロキャリア。
（Ａ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある重合体ブロック。
（Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある重合体ブロック。
（Ｃ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
＜１０＞＜１＞～＜９＞記載のマイクロキャリアの製造方法。
＜１１＞ビーズを、下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーとを含むポリマーコート膜で被覆する工程を備えることを特徴とする＜１＞～＜９＞記載のマイクロキャリアの製造方法。
＜１２＞＜１＞～＜９＞記載のマイクロキャリアを用いた細胞培養方法。
＜１３＞＜１＞～＜９＞記載のマイクロキャリアを含有する培地で、細胞を培養する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
＜１４＞キレート剤を導入した冷却液を用いて、細胞をマイクロキャリアから剥離する冷却細胞剥離工程を含むことを特徴とする＜１２＞又は＜１３＞記載の細胞培養方法。
　下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーを含むポリマーコート膜を被覆したビーズからなるマイクロキャリアにより、好適な温度応答性を発現することができる。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜変更して実施できる。
　本発明は下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーを含むポリマーコート膜を被覆したビーズからなるマイクロキャリアである。
　本発明における温度応答性ポリマーは下限臨界溶解温度が０℃～５０℃で相溶性が変化すれば特に限定はないが、相溶性の変化を顕著に表すためにブロック共重合体であることが好ましく、一例として下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体を例示できる。
（Ａ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある重合体ブロック。
（Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある重合体ブロック。
（Ｃ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
　ＨＬＢ値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　Ｂａｌａｎｃｅ：ＨＬＢ）とは、Ｗ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，　１，　３１１（１９４９）．に記載の、水と油への親和性の程度を表す値であり、０から２０までの値を取り、０に近いほど疎水性が高く、２０に近いほど親水性が高くなる。計算式によりＨＬＢ値を算出方法として、アトラス法、グリフィン法、デイビス法、川上法があるが、本明細書においては、グリフィン法により算出した値を使用し、本発明のブロック共重合体を構成する各ブロックの繰り返し単位中の親水部の式量と繰り返し単位の総式量を元に、下記の計算式により算出した。
　ＨＬＢ値＝２０×（繰り返し単位中の親水部の式量）÷（繰り返し単位の総式量）
　前述の、各ブロックの繰り返し単位中の親水部の定義として、スルホン部（－ＳＯ３－）、ホスホノ基部（－ＰＯ３－）、カルボキシル基部（－ＣＯＯＨ）、エステル部（－ＣＯＯ－）、アミド部（－ＣＯＮＨ－）、イミド部（－ＣＯＮ－）、アルデヒド基部（－ＣＨＯ）、カルボニル基部（－ＣＯ－）、ヒドロキシル基部（－ＯＨ）、アミノ基部（－ＮＨ２）、アセチル基部（－ＣＯＣＨ３）、エチレンアミン部（－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ－）、エチレンオキシ部（－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、ハロゲン化物イオン、酢酸イオンを例示することができる。
　繰り返し単位中の親水部の算出では、親水部を構成する原子が、他の親水部を構成する原子として重複してはならない。繰り返し単位中のＨＬＢ値の算出例を以下に記載した。例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（分子量：２９５．２７）の場合、親水部は、エステル部が１部、ホスホノ基部が１部およびエチレンアミン部が１部であり、親水部の分子量は１８１．０４であるから、ＨＬＢ値は１２．３である。２－ジメチルアミノエチルメタクリレート（分子量：１５７．１１）の場合、親水部は、エステル部が１部およびエチレンアミン部が１部であり、親水部の分子量は８６．０７であるから、ＨＬＢ値は１１．０である。メチルメタクリレート（分子量：１００．１２）の場合、親水部は、エステル部が１部であり、親水部の分子量は４４．０１であるから、ＨＬＢ値は８．８である。ｎ－ブチルメタクリレート（分子量：１４２．２０）の場合、親水部は、エステル部が１部であり、親水部の分子量は４４．０１であるから、ＨＬＢ値は６．２である。
　下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とは、この温度よりも低い温度では高分子が水に溶解して透明の溶液になるが、この温度よりも高い温度では不溶化して白濁するか沈殿が生じ、相分離する温度である。ブロック（Ｃ）に含まれる繰返し単位とその水に対するＬＣＳＴは、例えば、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２２℃）、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４４℃）、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２３℃）、またはＮ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２０℃）などが例示できる。本発明におけるブロック（Ｃ）は、前記繰り返し単位を１種類のみ用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また温度応答性を有するのであれば、前記温度応答性繰返し単位の他に、異なる繰返し単位を含んでも良い。
　（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体の一例として、（Ａ）２－メトキシエチルアクリレート（ＨＬＢ値＝１３．５）の繰り返し単位、（Ｂ）ｎ－ブチルアクリレート（ＨＬＢ値＝６．９）の繰り返し単位、（Ｃ）Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）の繰り返し単位からなるブロック共重合体が挙げられる。
　温度応答性ポリマーのその他の例として、（Ｃ）成分のみから構成されるホモポリマーや、（Ａ）成分と（Ｃ）成分から構成される共重合体、（Ｂ）成分と（Ｃ）成分から構成される共重合体が挙げられる。共重合体はランダム共重合体であっても、ブロック共重合体であっても良い。
　温度応答性ポリマーの数平均分子量は特に限定はないが、一例として１０００～１００００００であり、好ましくは５０００～５０００００、さらに好ましくは１００００～２０００００である。
　本発明において負電荷を有するポリマーとは、水中で電離してアニオン性を示す官能基を有するポリマーである。アニオン性を示す官能基は特に限定はないが、一例としてヒドロキシ基、カルボキシ基、スルホ基であり、これらの中でも酸性の制御が容易なことからカルボキシ基が好ましい。負電荷を有するポリマーの繰り返し単位は特に限定はないが、一例として、ビニルフェノール、アクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸が挙げられる。負電荷を有するポリマーに、負電荷を有するポリマーの繰り返し単位の他に、負電荷を有さないポリマーの繰り返し単位を含んでも良く、一例としてスチレンスルホン酸とスチレンの共重合体が挙げられる。また共重合体はランダム共重合体やブロック共重合体であっても良い。
　負電荷を有するポリマーの官能基がカルボキシ基である場合、負電荷を有するポリマー中のカルボキシ基の割合は特に限定はないが、温度応答性を良好に発現するために、一例として１０～５０ｗｔ％であり、好ましく１５～４０ｗｔ％、より好ましくは２０～３０ｗｔ％である。
　負電荷を有するポリマーの数平均分子量は特に限定はないが、一例として１０００～１００００００であり、好ましくは５０００～５０００００、さらに好ましくは１００００～２０００００である。
　本発明においてビーズとは粉粒体である。ビーズの粒径に特に限定はなく、一例として１μｍ～１０ｍｍ、５μｍ～５ｍｍ、２０μｍ～１０００μｍである。ビーズの形状は特に限定はなく、一例として球形、直方形、円柱形、円筒形、星形などが挙げられる。ビーズの真密度は特に限定はないが、温度応答性マイクロキャリアを製造する際に使用するポリマー溶液の密度より高いほど好ましく、一例として０．９～２０．０ｇ／ｃｍ２である。またビーズに細孔があってもなくても良い。ビーズの乾燥重量当たりの比表面積は特に限定はないが、一例として１０～１０００００ｃｍ２／ｇである。乾燥重量当たりの比表面積はＢＥＴ（Ｂｒｕｎａｕｅｒ　Ｅｍｍｅｔｔ　Ｔｅｌｌｅｒ）法で測定した値を用いることもできるが、本出願ではＳＥＭ画像から求めた平均粒子径と粒子比重から計算して求めた。
　ビーズの素材に特に限定はなく、一例として金属、金属酸化物、無機塩、合成高分子、生体高分子、またはそれらの複合物など様々な素材に適用できる。ビーズの表面は特に限定はないが、細胞増殖を高めるためにカチオン性であること、又は正電荷を有する官能基が修飾していることが好ましい。正電荷を有する官能基の一例として、アンモニウム基やアンモニウム基誘導体が挙げられる。具体的なビーズとしては例えば、ポリスチレン等が挙げられ、トリメチルアンモニウムクロライド修飾ポリスチレンが好ましい。
　本発明において温度応答性マイクロキャリアの製法は特に限定はないが、一般的な、ビーズにポリマーを吸着させるなどの物理的に被覆する方法又はビーズにポリマーを共有結合で固定するなどの化学的に被覆する方法が挙げられる。ビーズにポリマーを吸着させるなどビーズを物理的に被覆する場合は、被覆する方法に特に限定はなく、一例として含浸法や浸漬法、ヘンシェルミキサー法が挙げられる。含浸法及び浸漬法はビーズにポリマー溶液を浸漬ないし吹付を行い、減圧して溶媒を除去することで温度応答性マイクロキャリアが得られる。ヘンシェルミキサー法は、撹拌翼付きの反応槽でビーズを撹拌翼により撹拌させながら、乾燥用の気体を反応槽内に吹き込みつつ、ポリマーコート溶液を加えることで、短時間で温度応答性マイクロキャリアを得る方法である。ヘンシェルミキサー法及び含浸法は用いたポリマー溶液を全量吸着できるため温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーの組成比調整や被覆量調整が容易な利点がある。また、後者のビーズにポリマーを化学共有結合で固定する場合は、化学共有結合の種類に特に限定はなく、一例としてエステル結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合などが挙げられ、反応後に洗浄して未反応化合物を除去することで温度応答性マイクロキャリアが得られる。被覆後の乾燥工程において、乾燥用の気体に制限はなく、例えば窒素、空気、アルゴン、ネオン等、ビーズ及びポリマーコート溶液と反応性の無い気体であれば特に制限はない。
　本発明において温度応答性マイクロキャリアの製造方法は、例えば、ビーズを、下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーとを含むポリマーコート膜で被覆する工程を備えることを特徴とする方法であってもよい。
　本発明において温度応答性マイクロキャリアの負電荷を有するポリマーの割合は特に限定はないが、一例として０．１～２０ｗｔ％であり、好適な温度応答性を発現するために、好ましくは０．３～１０ｗｔ％、より好ましくは０．５～５ｗｔ％、更に好ましくは０．５～４ｗｔ％であり、特に好ましくは０．５～３ｗｔ％である。
　本発明において温度応答性マイクロキャリアは細胞培養、特に接着性細胞の細胞培養に使用できる。接着性細胞とはマイクロキャリア等の細胞培養基材の表面に付着しながら増殖する細胞である。培養する接着細胞の由来は特に限定はないが、一例としてヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ等の哺乳類やニワトリ、アヒル等の鳥類等が挙げられる。また、培養する細胞（接着細胞）の種類に特に限定はなく、一例としてヒト又は動物由来間葉系幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞、アフリカミドリザルの腎臓上皮由来のＶＥＲＯ細胞、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ヒト胎児正常肺組織由来のＭＲＣ－５細胞、ニワトリ胎児由来のＣＥＦ細胞、ハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞、マウス結合組織由来のＬ９２９細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３細胞、ウシ腎由来のＭＤＢＫ細胞、ネコ腎臓由来のＣＲＦＫ細胞、モルモット腎臓由来のＣＰＫ細胞、ヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞、更に生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞が挙げられる。また、上述の細胞種が不死化された細胞株などが挙げられる。これら以外でも、血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞や、体内あるいは環境中に存在する微生物、ウイルス、原虫等を例示できる。使用する培地の種類は特に限定はなく、血清培地であっても無血清培地であっても良く、細胞の種類に応じて適宜選択できる。
　本発明の培養で使用される基礎培地の種類は特に限定はなく、例えば、ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ－１２、Ｈａｍ’ｓＦ－１２、Ｈａｍ’ｓＦ－１０、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＲＰＭＩ１６４０などを用いることができる。また、血清培地であっても無血清培地であっても良いが、使用血清は特に限定はなく、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、児牛血清、成牛血清、ウマ血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ニワトリ血清、ウサギ血清、ヒト血清が使用できる。また、完成培地は抗生物質を含有してもしなくても良く、細胞の種類に応じて適宜選択できる。
　本発明の温度応答性マイクロキャリアを用いた細胞培養方法は特に限定はなく、静置条件で培養しても良いし、撹拌条件で培養しても良い。撹拌条件で培養する場合は撹拌速度に特に限定はなく、一例として１～１０００ｒｐｍである。培養時の培養温度は特に限定はないが、温度応答性ポリマー被覆されたマイクロキャリアの表面が疎水化し細胞が接着しやすい環境の提供ができるＬＣＳＴ以上で行うことが好ましい。培養後はＬＣＳＴ未満の温度に冷却することでマイクロキャリア上の細胞を回収できる。冷却方法は特に限定はなく、冷却器を使用して直接冷却しても良いし、培地を冷却液で交換しても良い。冷却液は基礎培地であっても、成長因子や血清等を含む完成培地であっても、リン酸緩衝液であっても良いが、リン酸緩衝液を選択することで細胞がマイクロキャリアから剥離しやすくなる。冷却用のリン酸緩衝液にＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤を導入すると細胞がさらにシングルセルとしてマイクロキャリアから剥離しやすくなる。ここでシングルセルとは、細胞同士が繋がっている状態から脱し、１細胞ごとに分離していることを意味している。リン酸緩衝液中のキレート剤の濃度は特に限定はなく、１μＭ～１ｍＭである。細胞を回収する際は、冷却液に流動があると温度応答性マイクロキャリアの冷却を促進できるため好ましく、一例として撹拌やピペッティングで流動を得ることができる。
　本発明の温度応答性マイクロキャリアを用いた細胞培養方法は、例えば、本発明のマイクロキャリアを含有する培地で、細胞を培養する工程を含むことを特徴とする方法であってもよい。本発明の温度応答性マイクロキャリアを用いた細胞培養方法は、キレート剤を導入した冷却液を用いて、細胞をマイクロキャリアから剥離する冷却細胞剥離工程を更に含んでいてもよい。
　本発明の温度応答性マイクロキャリアの培養性能は全細胞数と冷却剥離率で評価する。全細胞数が同じ培養面積の現行の汎用マイクロキャリアで培養した全細胞数と同等もしくは下回る場合は培養性能不良と判断する。現行の汎用マイクロキャリアは、Ｃｙｔｉｖａ社の表面がカチオン性であるＣｙｔｏｄｅｘ１又は／及びＣｏｒｎｉｎｇ社の表面がアニオン性であるＣｅｌｌｂｉｎｄとする。温度応答性冷却剥離率の評価方法は特に限定はないが、一例として（１）冷却で回収した細胞数を測定し、さらに（２）冷却で剥離しなかった細胞はタンパク質分解酵素を用いて回収した細胞数を測定し、（１）の細胞数を、（１）と（２）の細胞数の和で割り、１００を掛けた値で冷却剥離率として評価することができる。細胞数の計測方法は特に限定はないが、血球計算板などを用いて評価できる。
　以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
　＜ブロック共重合体の組成解析＞
　核磁気共鳴測定装置（日本電子製、商品名ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ／Ｌ１）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
　＜ブロック共重合体の分子量、分子量分布の解析＞
　重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製　ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー（株）製　ＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＡＷＭ－Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む２，２，２－トリフルオロエタノールを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた。
　＜温度応答性ポリマーＭＢＩの合成＞
　１００ｍＬ２口フラスコに２－メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）０．６５０ｇ（５ｍｍｏｌ）を加え、さらにシアノメチルドデシルカルボナトを３１．８ｍｇ（１００μｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）と１，４－ジオキサン１０ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で２４時間加熱撹拌した。
　１回目の加熱撹拌後、上記にｎ－ブチルアクリレート（ＢＡ）３．８４５ｇ（３０ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）と１，４－ジオキサン５ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で４８時間加熱撹拌した。
　２回目の加熱撹拌後、上記にＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ，ＬＣＳＴ＝３２℃）７．３５５ｇ（６５ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）と１，４－ジオキサン３５ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で４８時間加熱撹拌した。
　３回目の加熱撹拌後、反応液を水で再沈精製し、減圧乾燥することで黄色固体を得た。得られた黄色固体をクロロホルムに溶解し、分液ロートを用いクロロホルム相を回収した。回収したクロロホルム相をエバポレーターで濃縮し、ヘキサンで再沈精製した。沈殿物をろ過で回収し、減圧乾燥することで、ポリマーＭＢＩを５．８０５ｇ得た。得られたブロック共重合体ＭＢＩの組成比はＭＥＡ／ＢＡ／ＩＰＡＡｍ＝５／２６／６９（ｍｏｌ％）であり、数平均分子量Ｍｎは８．５万、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎは１．７８であった。
　＜負電荷を有するポリマーＣＳｔＳ＞
　１００ｍＬ２口フラスコにｐ－カルボキシスチレン（ＣＳｔ）１．１５６ｇ（８ｍｍｏｌ）とスチレン（Ｓｔ）１．２７１ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル３．３ｍｇ（２０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ－ブチルアルコール２０ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６４℃で２４時間加熱撹拌した。反応液をｎ－ヘプタンで再沈精製し、減圧乾燥することで、ポリマーＣＳｔＳを０．９２ｇ得た。ポリマーＣＳｔＳの組成比はＣＳｔ／Ｓｔ＝３３／６７（ｍｏｌ％）、数平均分子量Ｍｎは１０．６万、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎは１．８４であった。
　＜エバポレーターの設置＞
　ロータリーエバポレーターとして東京理化器械製のＮ－１３００、小型冷却水循環装置として東京理化器械製のＣＣＡ－１１１２Ａ、ダイヤフラム型真空ポンプとして東京理化器械製のＮＶＰ－２１００Ｖ、ウォーターバスとして東京理化器械製のＯＳＢ－２２００をそれぞれ設置した。小型冷却水循環装置の流体に水を使用し、温度は３℃にした。ウォーターバスの温度は５０℃にした。
　＜細胞数と細胞生存率の計測＞
　細胞懸濁液中から１０μＬを細胞数測定用スライド（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、商品名Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄ）に添加し自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、商品名ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩ）を用いて、細胞数を測定した。
　実施例１
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇと０．００２５ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が４．７６ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア１を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに２０４ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）の温度応答性マイクロキャリア１と３０ｍＬのＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製間葉系幹細胞増殖培地２を加えた。さらにロンザ製のヒト骨髄由来間葉系幹細胞（継代数２）を５×１０５ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で１００ｒｐｍの撹拌条件で６日間培養した。
　培養後、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを室温の安全キャビネットに移し、静置してマイクロキャリアを沈降させ、２２．５ｍＬの培地を抜取り、新たに２２．５ｍＬの１ｍＭのＥＤＴＡを含む４℃のカルシウムとマグネシウムが不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））を加え、１０分間静置した。静置後に室温で３分間、３００ｒｐｍで撹拌した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、さらにセルストレーナー上に５ｍＬのＰＢＳ（－）を２回加え、細胞をチューブ内に回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は７０．８×１０５個であった。さらにセルストレーナー上のマイクロキャリアを１５ｍＬのチューブに移し、５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を加え、３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気で５分間静置した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、さらにセルストレーナー上に５ｍＬのＰＢＳ（－）を２回加え、細胞をチューブ内に回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収できなかった細胞数は２２．１×１０５個であった。冷却剥離率は７６％だった。
　実施例２
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇと０．００１５ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が２．９１ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア２を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア２を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は７８．２×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１８．２×１０５個であった。冷却剥離率は８１％だった。
　実施例３
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇと０．０００５ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が０．９９ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア３を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア３を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は９６．４×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１９．１×１０５個であった。冷却剥離率は８３％だった。
　実施例４
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇと０．０００３８ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が０．７４ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア４を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア４を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は９３．４×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は３．６×１０５個であった。冷却剥離率は９６％だった。
　実施例５
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇと０．０００２５ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が０．５０ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア５を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア５を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は７３．２×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は２９．３×１０５個であった。冷却剥離率は７１％だった。
　実施例６
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１２ｇと０．０００３８ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１２ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が０．７４ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア６を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア６を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１０９．０×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１．６×１０５個であった。冷却剥離率は９８％だった。
　実施例７
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を８ｇと０．０００３８ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を８ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が０．７４ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア７を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア７を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は９４．７×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は２０．５×１０５個であった。冷却剥離率は８２％だった。
　実施例８
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を６ｇと０．０００３８ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を６ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が０．７４ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア８を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア８を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は８４．７×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は２８．６×１０５個であった。冷却剥離率は７５％だった。
　実施例９
　＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに３５６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）の温度応答性マイクロキャリア２と３０ｍＬの１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、バイオウエスト社製）と１％の抗生物質－抗真菌剤溶液（和光純薬社製）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ、和光純薬社製）を加えた。さらにＪＣＲＢ細胞バンク製のＶＥＲＯ細胞（継代数１６）を１×１０６ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で１２０ｒｐｍの撹拌条件で８日間培養した。
　培養後、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを室温の安全キャビネットに移し、細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、浮遊細胞を除去し、セルストレーナー上の細胞が接着されているマイクロキャリアのみ回収し、４℃のカルシウムとマグネシウムが不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））を加え、１０分間静置した。静置後に６０回ピペッティング操作を行い、剥離細胞を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通すことで回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１５．０×１０６個であった。さらにセルストレーナー上のマイクロキャリアを１５ｍＬのチューブに移し、５ｍＬのＣＴＳ　ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を加え、３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気で５分間静置した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、細胞を回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収できなかった細胞数は１．７×１０６個であった。冷却剥離率は８９％だった。
　実施例１０
　＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア３を用いたこと以外は実施例９の＜ＶＥＲＯ細胞培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１１．０×１０６個で、冷却で回収できなかった細胞数は１．８×１０６個であった。冷却剥離率は８６％だった。
　実施例１１
　＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア４を用いたこと以外は実施例９の＜ＶＥＲＯ細胞培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１２．８×１０６個で、冷却で回収できなかった細胞数は０．８×１０６個であった。冷却剥離率は９４％だった。
　比較例１
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇと０．０５０ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が５０．００ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア９を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア９を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は２２．３×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は８９．０×１０５個であった。冷却剥離率は２０％だった。
　比較例２
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が０．００ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア１０を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア１０を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は３９．３×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１０．７×１０５個であった。冷却剥離率は７９％だが、全細胞数が参考例１記載の現行の汎用マイクロキャリアで培養した全細胞数を下回った。
　比較例３
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１０ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が１００．００ｗｔ％であるマイクロキャリア１１を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア１１を用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は２．３×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は９８．５×１０５個であった。冷却剥離率は２％だった。
　比較例４
　＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア９を用いたこと以外は実施例９の＜ＶＥＲＯ細胞培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は６．７×１０６個で、冷却で回収できなかった細胞数は６．１×１０６個であった。冷却剥離率は５２％だった。
　比較例５
　＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア１０を用いたこと以外は実施例９の＜ＶＥＲＯ細胞培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は６．９×１０６個で、冷却で回収できなかった細胞数は１．２×１０６個であった。冷却剥離率は８５％だった。
　比較例６
　＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア１１を用いたこと以外は実施例９の＜ＶＥＲＯ細胞培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１．４×１０６個で、冷却で回収できなかった細胞数は１１．１×１０６個であった。冷却剥離率は８５％だった。
　参考例１
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに２０ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）のオートクレーブ滅菌したＣｙｔｏｄｅｘ１（表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を加えた。さらにロンザ製のヒト骨髄由来間葉系幹細胞（継代数２）を５×１０５ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で６０ｒｐｍの撹拌条件で６日間培養した。
　培養後、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを室温の安全キャビネットに移し、静置してＣｙｔｏｄｅｘ１を沈降させ、２７ｍＬの培地を抜取り、新たに２７ｍＬのＰＢＳ（－）を加えた。静置してＣｙｔｏｄｅｘ１を沈降させ、２７ｍＬの液を抜取り、５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を加え、３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気で５分間静置した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、さらにセルストレーナー上に５ｍＬのＰＢＳ（－）を２回加え、細胞をチューブ内に回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。細胞数は５１．７×１０５個であった。
　参考例２
　＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　参考例１のマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ１、表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を３４．１ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにしたこと以外は実施例９の＜ＶＥＲＯ細胞培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１．４×１０６個で、冷却で回収できなかった細胞数は８．７×１０６個であった。冷却剥離率は１４％だった。
　参考例３
　＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに４１６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）のオートクレーブ滅菌したＣｅｌｌｂｉｎｄ（表面：アニオン性、平均比重：１．０２６）を加えた。さらに３０ｍＬの１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、バイオウエスト社）と１％の抗生物質－抗真菌剤溶液（和光純薬社）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ、和光純薬社）を加えた。さらにＪＣＲＢ細胞バンク製のＶＥＲＯ細胞（継代数１６）を１×１０６ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で１２０ｒｐｍの撹拌条件で８日間培養した。Ｃｅｌｌｂｉｎｄマイクロキャリアを用いたこと以外は実施例９の＜ＶＥＲＯ細胞培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１．４×１０６個で、冷却で回収できなかった細胞数は１４．１×１０６個であった。冷却剥離率は９％だった。
　実施例１２
　２００ｍＬのフラスコに０．０５０ｗｔ％の温度応答性ブロック共重合体ＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１２ｇと０．０００３８ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１２ｇ加えた。さらに直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を１０ｇ加え、１分間静置した。フラスコをエバポレーターに設置し、撹拌速度６０ｒｐｍに設定の上、１２０００Ｐａで１分間定圧処理した。さらに１００００Ｐａで１分間定圧処理、８０００Ｐａで１分間定圧処理、６０００Ｐａで２分間定圧処理、４０００Ｐａで３分間定圧処理した。撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで１５００Ｐａまで減圧し真空含浸処理を行った。
　フラスコをエバポレーターから取り外し、イオン交換水を１５０ｍＬ加え、超音波を照射し１０分間静置した。ろ過で回収したビーズを２００ｍＬのフラスコに移し、エバポレーターで撹拌速度１２０ｒｐｍに設定の上、最終的に真空ポンプの出力を最大にして３０分間処理することで負電荷を有するポリマーの割合が０．７４ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア１２を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア１２を１９５ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は６１．３×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１．４×１０５個であった。冷却剥離率は９８％だった。
　実施例１３
　５００ｍＬのセパラブルフラスコをセットしＰＴＦＥ（ｐｏｌｙ（１，１，２，２－ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）製）撹拌翼を装着し、直径１３０μｍの乾燥したポリスチレンビーズ（表面：カチオン性、平均比重：１．０８）４０ｇを加え１００ｒｐｍで攪拌しながらフラスコ内窒素ガスでパージした。ポリスチレンビーズを８０℃まで予熱させた後、攪拌速度を３００ｒｐｍまで上げ、０．０１４ｗｔ％の温度応答性ブロックコポリマーＭＢＩの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を７ｇと０．０００１ｗｔ％のポリマーＣＳｔＳの１－メトキシ－２－プロパノール溶液を１ｇ加え４分間混合した。８０℃の熱風乾燥機で２０時間追加乾燥後、負電荷を有するポリマーの割合が４．７６ｗｔ％である温度応答性マイクロキャリア１３を得た。
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア１３を２０４ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）用いたこと以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１６．３×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は２．４×１０５個であった。冷却剥離率は８７％だった。
　参考例４
　＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｅｌｌｂｉｎｄ（表面：アニオン性、平均比重：１．０２６）を２３８ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は２０．０×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は２８．２×１０５個であった。冷却剥離率は５９％だった。
　参考例５
＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｙｔｏｄｅｘ１（表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を２０ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例１の＜ヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養＞と同じ方法でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は２１．１×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は２８．９×１０５個であった。冷却剥離率は４２％だった。
　実施例１４
＜ＶＥＲＯ細胞培養＞
　温度応答性マイクロキャリア１３を３４０ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例９の＜ＶＥＲＯ細胞培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１２２．０×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１２．０×１０５個であった。冷却剥離率は９１％だった。
　実施例１５
＜ＶＥＲＯ細胞の無血清培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに３５６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）の温度応答性マイクロキャリア１３とＶＰ－ＳＦＭ（１Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、製品番号：１１６８１０２０）１Ｌに２００ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｘ）（ＡＴＣＣ製、製品番号：３０－２２１４）２０ｍＬを加え最終濃度が２０ｍＭの完成培地３０ｍＬを加えた。さらに、Ｖｅｒｏ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）製、製品番号：ＣＣＬ－８１）を１×１０６ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で１００ｒｐｍの撹拌条件で８日間培養した。
　培養後、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを室温の安全キャビネットに移し、細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、浮遊細胞を除去し、セルストレーナー上の細胞が接着されているマイクロキャリアのみ回収し、４℃のカルシウムとマグネシウムが不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））を加え、１０分間静置した。静置後に６０回ピペッティング操作を行い、剥離細胞を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通すことで回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は４６．５×１０５個であった。さらにセルストレーナー上のマイクロキャリアを１５ｍＬのチューブに移し、５ｍＬのＣＴＳ　ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を加え、３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気で５分間静置した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、細胞を回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収できなかった細胞数は４．２×１０５個であった。冷却剥離率は９２％だった。
　参考例６
＜ＶＥＲＯ細胞の無血清培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｙｔｏｄｅｘ１（表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を３４．１ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例１５の＜ＶＥＲＯ細胞の無血清培養＞と同じ方法でＶＥＲＯ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は３．６×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は３６．４×１０５個であった。冷却剥離率は９％だった。
　実施例１６
＜ＢＨＫ－２１細胞培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに３４０ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）の温度応答性マイクロキャリア１２と１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、バイオウエスト社製）と１％の抗生物質－抗真菌剤溶液（和光純薬社製）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ、和光純薬社製）の完成培地３０ｍＬを加えた。さらに、ＢＨＫ－２１細胞（ＡＴＣＣ製、製品番号：ＣＣＬ－１０）を１×１０６ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で６０ｒｐｍの撹拌条件で７日間培養した。
　培養後、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを室温の安全キャビネットに移し、細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、浮遊細胞を除去し、セルストレーナー上の細胞が接着されているマイクロキャリアのみ回収し、４℃のカルシウムとマグネシウムが不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））を加え、１０分間静置した。静置後に６０回ピペッティング操作を行い、剥離細胞を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通すことで回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１４８．０×１０５個であった。さらにセルストレーナー上のマイクロキャリアを１５ｍＬのチューブに移し、５ｍＬのＣＴＳ　ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を加え、３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気で５分間静置した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、細胞を回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収できなかった細胞数は１９．０×１０５個であった。冷却剥離率は８９％だった。
　参考例７
＜ＢＨＫ－２１細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｅｌｌｂｉｎｄ（表面：アニオン性、平均比重：１．０２６）を４１６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと以外は実施例１６の＜ＢＨＫ－２１細胞培養＞と同じ方法でＢＨＫ－２１細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は６．０×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１１５．０×１０５個であった。冷却剥離率は５％だった。
　参考例８
＜ＢＨＫ－２１細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｙｔｏｄｅｘ１（表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を３４．１ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと以外は実施例１６の＜ＢＨＫ－２１細胞培養＞と同じ方法でＢＨＫ－２１細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１８．０×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１０４．０×１０５個であった。冷却剥離率は１５％だった。
　実施例１７
＜ＣＲＦＫ細胞培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに３５６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）の温度応答性マイクロキャリア４と１０％のウマ血清（ＨＳ、シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を含有するＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ－ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＡＴＣＣ製、製品番号：３０－２００３）の完成培地３０ｍＬを加えた。さらに、ＣＲＦＫ細胞（ＡＴＣＣ製、製品番号：ＣＣＬ－９４）を０．８×１０６ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で１００ｒｐｍの撹拌条件で７日間培養した。
　培養後、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを室温の安全キャビネットに移し、細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、浮遊細胞を除去し、セルストレーナー上の細胞が接着されているマイクロキャリアのみ回収し、４℃のカルシウムとマグネシウムが不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））を加え、１０分間静置した。静置後に６０回ピペッティング操作を行い、剥離細胞を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通すことで回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は２６．８．０×１０５個であった。さらにセルストレーナー上のマイクロキャリアを１５ｍＬのチューブに移し、５ｍＬのＣＴＳ　ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を加え、３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気で５分間静置した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、細胞を回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収できなかった細胞数は３．１×１０５個であった。冷却剥離率は９０％だった。
　実施例１８
＜ＣＲＦＫ細胞培養＞
　マイクロキャリア１２を３４０ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例１７の＜ＣＲＦＫ細胞培養＞と同じ方法でＣＲＦＫ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１３．８×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は３．８×１０５個であった。冷却剥離率は７８％だった。
　実施例１９
＜ＣＲＦＫ細胞培養＞
　マイクロキャリア１３を３５６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと以外は実施例１７の＜ＣＲＦＫ細胞培養＞と同じ方法でＣＲＦＫ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は２１．２×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は４．６×１０５個であった。冷却剥離率は８２％だった。
　参考例９
＜ＣＲＦＫ細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｅｌｌｂｉｎｄ（表面：アニオン性、平均比重：１．０２６）を４１６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例１７の＜ＣＲＦＫ細胞培養＞と同じ方法でＣＲＦＫ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は９．２×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１２．９×１０５個であった。冷却剥離率は４２％だった。
　参考例１０
＜ＣＲＦＫ細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｙｔｏｄｅｘ１（表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を３４．１ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例１７の＜ＣＲＦＫ細胞培養＞と同じ方法でＣＲＦＫ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は３．２×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１６．０×１０５個であった。冷却剥離率は１７％だった。
　実施例２０
＜ＭＤＣＫ細胞培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに３５６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）の温度応答性マイクロキャリア４と１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、バイオウエスト社製）と１％の抗生物質－抗真菌剤溶液（和光純薬社製）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ、和光純薬社製）の完成培地３０ｍＬを加えた。さらに、ＭＤＣＫ細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）製、製品番号：ＪＣＲＢ９０２９）を０．６×１０６ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で１００ｒｐｍの撹拌条件で７日間培養した。
　培養後、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを室温の安全キャビネットに移し、細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、浮遊細胞を除去し、セルストレーナー上の細胞が接着されているマイクロキャリアのみ回収し、４℃のカルシウムとマグネシウムが不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））を加え、１０分間静置した。静置後に６０回ピペッティング操作を行い、剥離細胞を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通すことで回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１３７．０×１０５個であった。さらにセルストレーナー上のマイクロキャリアを１５ｍＬのチューブに移し、５ｍＬのＣＴＳ　ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を加え、３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気で５分間静置した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、細胞を回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収できなかった細胞数は３７．０×１０５個であった。冷却剥離率は７９％だった。
　実施例２１
＜ＭＤＣＫ細胞培養＞
　マイクロキャリア１２を３４０ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例１９の＜ＭＤＣＫ細胞培養＞と同じ方法でＭＤＣＫ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１１２．０×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は３２．０×１０５個であった。冷却剥離率は７８％だった。
　参考例１１
＜ＭＤＣＫ細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｅｌｌｂｉｎｄ（表面：アニオン性、平均比重：１．０２６）を４１６ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例２０の＜ＭＤＣＫ細胞培養＞と同じ方法でＭＤＣＫ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は２．３×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は６８．８×１０５個であった。冷却剥離率は３％だった。
　参考例１２
＜ＭＤＣＫ細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｙｔｏｄｅｘ１（表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を３４．１ｍｇ（培養面積１５０ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例２０の＜ＭＤＣＫ細胞培養＞と同じ方法でＭＤＣＫ細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１６．７×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１５７．４×１０５個であった。冷却剥離率は１０％だった。
　実施例２２
＜ＭＲＣ－５細胞培養＞
　エイブル社製の３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに２０４ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）の温度応答性マイクロキャリア４と１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、バイオウエスト社製）と１％の抗生物質－抗真菌剤溶液（和光純薬社製）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ、和光純薬社製）の完成培地３０ｍＬを加えた。さらに、ＭＲＣ－５細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）製、製品番号：ＪＣＲＢ９００８）を０．５×１０６ｃｅｌｌｓ加えて３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で１００ｒｐｍの撹拌条件で６日間培養した。
　培養後、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを室温の安全キャビネットに移し、細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、浮遊細胞を除去し、セルストレーナー上の細胞が接着されているマイクロキャリアのみ回収し、４℃のカルシウムとマグネシウムが不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））を加え、１０分間静置した。静置後に６０回ピペッティング操作を行い、剥離細胞を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通すことで回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は９．８×１０５個であった。さらにセルストレーナー上のマイクロキャリアを１５ｍＬのチューブに移し、５ｍＬのＣＴＳ　ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を加え、３７℃の５ｖｏｌ％ＣＯ２雰囲気で５分間静置した。細胞懸濁液を目開き７０μｍのセルストレーナーをセットした５０ｍＬのチューブに通し、細胞を回収し、遠心分離で濃縮して細胞数を計測した。冷却で回収できなかった細胞数は４．１×１０５個であった。冷却剥離率は７１％だった。
　実施例２３
＜ＭＲＣ－５細胞培養＞
　マイクロキャリア１２を１９５ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例２２の＜ＭＲＣ－５細胞培養＞と同じ方法でＭＲＣ－５細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は１８．８×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は１．０×１０５個であった。冷却剥離率は９５％だった。
　参考例１３
＜ＭＲＣ－５細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｅｌｌｂｉｎｄ（表面：アニオン性、平均比重：１．０２６）を２３８ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例２２の＜ＭＲＣ－５細胞培養＞と同じ方法でＭＲＣ－５細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は３．４×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は８．８×１０５個であった。冷却剥離率は２８％だった。
　参考例１４
＜ＭＲＣ－５細胞培養＞
　マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌したＣｙｔｏｄｅｘ１（表面：カチオン性、平均比重：１．０３）を２０ｍｇ（培養面積８７ｃｍ２）用いたこと及び攪拌速度を６０ｒｐｍにした以外は実施例２２の＜ＭＲＣ－５細胞培養＞と同じ方法でＭＲＣ－５細胞を培養し、細胞数を計測した。冷却で回収した細胞数は４．２×１０５個で、冷却で回収できなかった細胞数は９．２×１０５個であった。冷却剥離率は３１％だった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (14)

  1. 　下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーを含むポリマーコート膜を被覆したビーズからなるマイクロキャリア。
  2. 　負電荷を有するポリマーの割合が０．１～２０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１記載のマイクロキャリア。
  3. 　負電荷を有するポリマー中にカルボキシ基が含まれることを特徴とする請求項２記載のマイクロキャリア。
  4. 　負電荷を有するポリマー中のカルボキシ基の割合が１０～５０ｗｔ％であることを特徴とする請求項３記載のマイクロキャリア。
  5. 　ビーズ表面がカチオン性であることを特徴とする請求項４記載のマイクロキャリア。
  6. 　ビーズに正電荷を有する官能基が修飾していることを特徴とする請求項４記載のマイクロキャリア。
  7. 　ビーズがトリメチルアンモニウムクロライド修飾ポリスチレンであることを特徴とする請求項６記載のマイクロキャリア。
  8. 　ビーズの粒径が２０μｍ～１０００μｍであることを特徴とする請求項７記載のマイクロキャリア。
  9. 　温度応答性ポリマーが下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体であることを特徴とする請求項８記載のマイクロキャリア。
    （Ａ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある重合体ブロック。
    （Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある重合体ブロック。
    （Ｃ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
  10. 　請求項１～９記載のマイクロキャリアの製造方法。
  11. 　ビーズを、下限臨界溶解温度を０℃～５０℃に有する温度応答性ポリマーと負電荷を有するポリマーとを含むポリマーコート膜で被覆する工程を備えることを特徴とする請求項１～９記載のマイクロキャリアの製造方法。
  12. 　請求項１～９記載のマイクロキャリアを用いた細胞培養方法。
  13. 　請求項１～９記載のマイクロキャリアを含有する培地で、細胞を培養する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
  14. 　キレート剤を含む冷却液を用いて、細胞をマイクロキャリアから剥離する冷却細胞剥離工程を含むことを特徴とする請求項１２記載の細胞培養方法。

     
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