WO2024253084A1 - α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法 - Google Patents

α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法 Download PDF

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valine
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駿 遠藤
和貴 中村
智惇 杉田
彩花 釜井
史 山▲崎▼
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals

Definitions

  • the present invention relates to a protein having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity and a method for producing lacto-N-fucopentaose I (LNFPI).
  • Non-Patent Document 1 The oligosaccharides contained in human breast milk (Human Milk Oligosaccharides, HMOs) have been attracting attention as prebiotic materials, and have been shown to be effective in improving cognitive function development, infection prevention, and intestinal environment in infants (Non-Patent Document 1).
  • Lacto-N-fucopentaose I (hereafter referred to as LNFPI) is a type of HMO, a pentasaccharide HMO in which fucose is ⁇ 1,2-linked to the 2-position of galactose in lacto-N-tetraose (hereafter referred to as LNT).
  • LNFPI is the third most abundant sugar in breast milk after 2'-fucosyllactose (hereafter referred to as 2'FL) and lacto-N-difucohexaose (hereafter referred to as LNDFHI), and is known to be present in a higher amount in breast milk than lacto-N-fucopentaose II (hereafter referred to as LNFPII) and lacto-N-fucopentaose III (hereafter referred to as LNFPIII), which are also pentasaccharides and are known to be isomers of LNFPI (Non-Patent Document 2).
  • LNFPI is known to have functions such as an inhibitory effect against meningitis-causing group B Streptococcus (GBS) and norovirus (Non-Patent Documents 3 and 4).
  • GFS meningitis-causing group B Streptococcus
  • Non-Patent Documents 3 and 4 Bifidobacterium infantis, which has a high occupancy rate in the intestines of newborns, has been found to grow preferentially in LNFPI, and its prebiotic function has also attracted attention (Non-Patent Document 5).
  • Non-patent documents 4, 5, and 6 disclose a method for producing oligosaccharides such as LNFPI by overexpressing ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from microorganisms such as Thermosynechococcus elongatus, Sideroxydans lithotrophicus, or Helicobacter pylori in Escherichia coli and using LNT and GDP-fucose as substrates through fermentation or continuous enzyme reaction.
  • Methods for reducing by-products include an enzyme reaction method that uses highly purified LNT as a substrate (Non-Patent Document 5) and a method for producing LNFPI by inducing the expression of ⁇ 1,2-fucosyltransferase when the initial raw material lactose is depleted (Non-Patent Document 6).
  • the present invention therefore aims to provide a protein having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity with excellent LNFPI productivity and a method for producing LNFPI.
  • LNFPI lipoprotein kinase
  • a microorganism capable of producing a protein with ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity consisting of a specific amino acid sequence LNFPI can be produced more efficiently than by conventional methods, and thus completed the present invention.
  • the present invention is as follows. 1. A protein having a fucosyl transfer activity to lacto-N-tetraose (LNT), A protein into which at least one of the following mutations [1] and [2] has been introduced (excluding those in which the amino acid sequence constituting the protein before and after the mutation is identical): [1] A mutation in which an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98 is inserted. [2] A mutation in which an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 is inserted. 2.
  • LNT lacto-N-tetraose
  • the protein according to 1 which is a protein in which at least one of the mutations described in [1] and [2] above is introduced into an amino acid sequence having a full-length sequence identity of 50% or more to at least any one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 63, 94, and 95. 3.
  • the mutation of [1] above is a mutation introduced at a site corresponding to a region contributing to interaction with a substrate in a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101;
  • the mutation of [2] is a mutation introduced at a site corresponding to a region contributing to interaction with a substrate in a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131.
  • 4. The protein according to 3 above, wherein the region contributing to the interaction with the substrate is an amino acid sequence corresponding to positions 162 to 176 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:101 when aligned therewith. 5.
  • the mutation of [1] above is a mutation in which, when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101, the amino acid sequence corresponding to positions 162 to 176 is replaced with an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98;
  • the mutation of [2] is a mutation in which, when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131, the amino acid sequence corresponding to positions 168 to 184 is replaced with an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99. 5.
  • the mutation of [1] is at least one mutation selected from the following [1a] to [1o] at a position corresponding to positions 162 to 176 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101:
  • the mutation of [2] is at least one mutation selected from the following [2a] to [2q] at positions corresponding to positions 168 to 184 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131: 6.
  • the protein according to any one of 1 to 5.
  • [2b] is lanine; at position 170, [2c] is valine; at position 170, [2d] is glutamine; at position 171, [2e] is aspartic acid; at position 172, [2f] is proline; at position 173, [2g] is valine; at position 174, [2h] is valine; at position 175, [2i] is arginine; at position 176, [2i] is arginine.
  • a protein having fucosyl transfer activity to LNT A protein in which at least one mutation selected from the following (1) to (31) has been introduced at each of the positions corresponding to positions 7, 42, 94, 95, 159 to 173, 259, 260, and 262 to 270 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:63, and which has a higher fucosyl group transfer activity to LNT than the protein before the introduction of the mutation.
  • the protein according to 7 above which is an amino acid sequence having a full-length sequence identity of 50% or more with at least any one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO:63, 94, and 95, in which at least one mutation selected from (1) to (31) above has been introduced at a position corresponding to each of positions 7, 42, 94, 95, 159 to 173, 259, 260, and 262 to 270 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:63 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:63. 9.
  • the protein according to 7 or 8, wherein the mutations introduced at positions corresponding to positions 7, 42, 94, 95, 159 to 173, 259, 260, and 262 to 270 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:63 are any one of the following [3] to [12]: [3] a phenylalanine at the position corresponding to position 159; At position 160, there is a valine. At the position corresponding to position 161, it is glutamine; At the position corresponding to position 162, it is aspartic acid; At position 164, it is a valine. At position 165, there is a valine.
  • the transformant according to 13 above, wherein the microorganism is Escherichia coli.
  • a method for producing a fucose-containing saccharide comprising preparing the transformant according to any one of 13 to 14 above, and producing the fucose-containing saccharide in a culture using the transformant.
  • the protein of the present invention is composed of a specific amino acid sequence and has ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity that allows sugar transfer to the non-reducing terminal galactose site of LNT.
  • FIG. 1 shows the biosynthetic pathway of LNFPI in one embodiment of the present invention.
  • 2 shows the amino acid sequences of FucT (FsFucT) derived from Francisella sp. FSC1006 strain, ⁇ 1,2-fucosyltransferase of S3, and ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Amphritea japonica.
  • FIG. 3 is a graph showing the total amount of LNFP1 (g/L).
  • FIG. 4 is a graph showing the total amount of LNFP1 (g/L).
  • FIG. 5 is a graph showing the total amount of LNFP1 (g/L).
  • the present invention will be described below with reference to the following embodiments.
  • the embodiments include embodiment 1 and embodiment 2.
  • the identity of amino acid sequences and base sequences can be determined using the algorithm BLAST by Karlin and Altschul [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)].
  • BLAST Altschul
  • FASTA Method Enzymol., 183, 63 (1990)
  • programs called BLASTN and BLASTX have been developed [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)].
  • the default parameters of each program are used. The specific techniques for these analysis methods are publicly known.
  • the alignment of amino acid sequences can be created using known alignment programs such as ClustalW [Nucleic Acids Research 22, 4673, (1994)], MAFTT [Nucleic Acids Research 30, 3059, (2002)], Clustal Omega, etc.
  • ClustalW Nucleic Acids Research 22, 4673, (1994)
  • MAFTT Nucleic Acids Research 30, 3059, (2002)
  • Clustal Omega etc.
  • These alignment programs are available from http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ (European Bioinformatics Institute). For example, default values are used as parameters when creating an alignment using these alignment programs.
  • the fucosyl transfer activity to LNT refers to the activity of transferring a fucose residue from the donor substrate GDP-fucose to the galactose hydroxyl group of the acceptor substrate carbohydrate (hereinafter referred to as the "acceptor carbohydrate"), LNT.
  • ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity refers to the activity of transferring a fucose residue from the donor substrate GDP-fucose to the galactose hydroxyl group of an acceptor saccharide via an ⁇ 1,2-bond to generate a fucose-containing saccharide.
  • the acceptor saccharide is preferably LNT.
  • the fucose-containing saccharide is preferably LNFPI.
  • the protein having the activity of transferring a fucosyl group to LNT is not particularly limited as long as it has the activity of transferring a fucose residue from the donor substrate GDP-fucose to the galactose hydroxyl group of LNT, and examples of such proteins include ⁇ 1,2-fucosyltransferase. Specific examples of such proteins include ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Francisella sp.
  • FSC1006 strain ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Sideroxydans lithotrophicus ES-11, ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Neisseriaceae bacterium DSM 100970 strain, and ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Gramella sp.
  • ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from MAR_2010_147 strain ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Methylobacter tundripaludum strain, ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Amphritea japonica strain, ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Sterolibacteriaceae bacterium J5B strain -ase, ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Neisseriales bacterium strain, ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Helicobacter mustelae ATCC43772 strain, ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Pseudohalocynthiibacter aestuariivvens strain, Pedobacter sp.
  • Examples include ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from the CF074 strain, ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from the Candidatus Methylobacter favarea strain, ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from the Escherichia coli O86 strain, and ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from the Escherichia coli O127 strain.
  • each mutation may be substituted with the amino acids which can be substituted for each other as shown below.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G phenylalanine, tyrosine
  • LNFPI Biosynthetic pathway of LNFPI> The biosynthetic pathway of LNFPI in this embodiment is shown in Figure 1.
  • LNFPI is produced by the transfer of a fucose residue from GDP-fucose to the galactose hydroxyl group.
  • the present inventors have confirmed that by replacing a portion of the base sequence encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Francisella sp. FSC1006 with at least one of the corresponding portions of the base sequence encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Amphritea japonica and the corresponding portion of the base sequence encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Sterolibacteriaceae bacterium J5B, the by-production of 2'FL can be reduced compared to the enzyme before replacement. In other words, they have newly discovered an ⁇ 1,2-fucosyltransferase protein that has higher substrate selectivity for LNT.
  • the inventors also confirmed that the production of 2'FL by-product was reduced by replacing a portion of the base sequence encoding the ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Sideroxydans lithotrophicus ES-11 (WO 2019/008133) and the ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Neisseriaceae bacterium DSM 100970 with the corresponding base sequence of the base sequence encoding the ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Amphritea japonica.
  • amino acid sequences encoded by the base sequences used for the above-mentioned substitutions in the ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Amphritea japonica and the ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Sterolibacteriaceae bacterium J5B contribute to the reduction of 2'FL as a by-product in the ⁇ 1,2-fucosyltransferase homologs, i.e., to the improvement of substrate selectivity for LNT.
  • the protein of embodiment 1 is a protein having fucosyl transfer activity to LNT (hereinafter also simply referred to as "fucosyl transfer activity"), and is a protein into which at least one of the following mutations [1] and [2] has been introduced.
  • [1] A mutation that inserts an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:98.
  • [2] A mutation that inserts an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:99.
  • mutations do not include those in which the amino acid sequence constituting the protein is identical before and after the mutation.
  • Examples of the insertion include mutations by insertion and mutations by substitution.
  • the protein of embodiment 1 is preferably a protein in which the substrate selectivity for LNT of the protein after the mutation is improved compared to the protein before the mutation is introduced. It is more preferable that the protein of embodiment 1 is a protein in which, in addition to improved substrate selectivity for LNT, the fucosyl transfer activity of the protein after the mutation is improved compared to the protein before the mutation is introduced.
  • the substrate selectivity of a protein for LNT can be confirmed, for example, by the following procedures (A1) to (A3).
  • A1 A recombinant DNA is prepared having a DNA encoding a protein whose activity is to be confirmed.
  • A2 A parent strain is transformed with the recombinant DNA to produce a transformant, and the amounts of LNFPI and 2'FL produced and accumulated in the culture medium of the transformant are measured.
  • A3 It is determined that the smaller the ratio of the amount of 2'FL to the amount of LNFPI, the higher the substrate selectivity for LNT.
  • the transfucosylation activity of a protein can be confirmed, for example, by the following procedures (B1) to (B3).
  • B1 A recombinant DNA is prepared having a DNA encoding a protein whose activity is to be confirmed.
  • B2 A parent strain is transformed with the recombinant DNA to produce a transformant, and the amount of fucose-containing carbohydrate produced and accumulated in the culture medium of the transformant is measured.
  • the transfucosylation activity is evaluated based on the amount of the fucose-containing saccharide.
  • a specific example of the fucose-containing saccharide is LNFPI.
  • the protein of embodiment 1 is preferably a protein in which at least one of the mutations [1] and [2] has been introduced into an amino acid sequence having a full-length sequence identity of 50% or more with at least one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 63, 94, and 95.
  • the full-length sequence identity is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 100%.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:63 is the amino acid sequence of FucT derived from Francisella sp. FSC1006 (hereinafter also abbreviated as FsFucT).
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:94 is the amino acid sequence of FucT derived from Sideroxydans lithotrophicus ES-11 (hereinafter also abbreviated as FucT54).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 95 is the amino acid sequence of FucT derived from Neisseriaceae bacterium DSM 100970 (hereinafter also abbreviated as NbFucT1).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO:98 is a partial sequence of the amino acid sequence constituting the amino acid sequence of ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Amphritea japonica (SEQ ID NO:101), and is an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence from positions 162 to 176 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:101.
  • the amino acid sequence inserted in [1] has an identity of 80% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 93% or more, even more preferably 95%, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more.
  • the mutation in [1] is preferably a mutation introduced at a position corresponding to a region that contributes to interaction with a substrate in a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101.
  • the region that contributes to interaction with the substrate consists of a binding site with the substrate by hydrogen bonds or the like and a region in the vicinity thereof.
  • An example of a region that contributes to interaction with the substrate is a region that forms a helix structure.
  • the region that contributes to interaction with the substrate is preferably a region that corresponds to positions 140 to 280 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101, more preferably a region that corresponds to positions 150 to 200, even more preferably a region that corresponds to positions 160 to 180, and particularly preferably a region that corresponds to positions 162 to 176.
  • the mutation in [1] is preferably a mutation in which, when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:101, the amino acid sequence corresponding to positions 140 to 280, more preferably positions 150 to 200, even more preferably positions 160 to 180, and particularly preferably positions 162 to 176, is replaced with an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:98.
  • the mutation [1] is preferably at least one selected from the following mutations [1a] to [1o] at positions corresponding to positions 162 to 176 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101.
  • [1e] At position 166 it is alanine;
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 is a partial sequence of the amino acid sequence constituting the amino acid sequence of SbFucT derived from Sterolibacteriaceae bacterium J5B (SEQ ID NO: 131), and is an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence from positions 168 to 184 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131.
  • the amino acid sequence inserted in [2] has an identity of 80% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99.
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 93% or more, even more preferably 95%, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more.
  • the mutation [2] is preferably a mutation introduced at a position corresponding to a region that contributes to interaction with a substrate in a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131.
  • the region that contributes to interaction with the substrate can be a region that forms a helix structure.
  • the region that contributes to interaction with the substrate is preferably a region that corresponds to positions 168 to 184 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131, more preferably a region that corresponds to positions 150 to 200, even more preferably positions 160 to 190, and particularly preferably positions 168 to 184.
  • the mutation in [2] is preferably a mutation in which, when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:131, the amino acid sequence corresponding to positions 140 to 280, more preferably positions 150 to 200, even more preferably positions 160 to 190, and particularly preferably positions 168 to 184, is replaced with an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:99.
  • the mutation [2] is preferably at least one selected from the following mutations [2a] to [2q] at positions corresponding to positions 168 to 184 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 131.
  • [2a] At the position corresponding to position 168, it is phenylalanine;
  • [2b] At the position corresponding to position 169, it is valine;
  • [2c] At the position corresponding to position 170, it is glutamine;
  • [2d] At the position corresponding to position 171, it is aspartic acid;
  • [2e] At the position corresponding to position 172, it is proline;
  • [2f] At the position corresponding to position 173, it is valine;
  • [2g] At the position corresponding to position 174, it is valine;
  • [2h] At the position corresponding to position 175, it is arginine;
  • [2i] At the position corresponding to position 176 In terms of position, [2j] is
  • amino acid sequences constituting the protein of embodiment 1 include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 66, 96, and 97.
  • the second embodiment is a protein having fucosyl transfer activity to LNT, in which at least one mutation selected from the following (1) to (31) has been introduced at each of positions 7, 42, 94, 95, 159 to 173, 259, 260, and 262 to 270 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63, and which has higher fucosyl transfer activity to LNT than the protein before the introduction of the mutation.
  • the protein has the mutation introduced at a position corresponding to at least one position selected from the group consisting of positions 7, 42, 94, 95, 159 to 173, 259, 260, and 262 to 270 when aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63.
  • the full-length sequence identity is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 100%.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 63, 94, and 95 are the same as those described above in the section entitled "Embodiment 1: Protein having fucosyl transfer activity to LNT.”
  • Each mutation in embodiment 2 is preferably any one of the following [3] to [12].
  • At the position corresponding to position 169 it is a histidine; At the position corresponding to position 170, it is glycine; At position 171, there is a valine. At the position corresponding to position 172, it is aspartic acid; At the position corresponding to position 173, it is a tyrosine; Between the positions corresponding to positions 172 and 173, leucine, tyrosine and alanine are inserted. [4] a histidine at the position corresponding to position 94; At the position corresponding to position 95, it is a tyrosine; At the position corresponding to position 159, it is a phenylalanine; At position 160, there is a valine.
  • amino acid sequences constituting the protein of embodiment 2 include the amino acid sequences represented by any one of SEQ ID NOs: 64 to 78. Among these, the amino acid sequences represented by any one of SEQ ID NOs: 64 to 66, 68, and 72 to 77 are particularly preferred.
  • the DNA of this embodiment is a DNA encoding the above-mentioned protein of this embodiment.
  • Examples of the DNA encoding the protein of embodiment 1 include DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 49, 92, or 93.
  • Examples of the DNA encoding the protein of embodiment 2 include DNA having the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 47 to 61.
  • the DNA of this embodiment can be used as is or after cleavage with an appropriate restriction enzyme or the like, incorporated into a vector by standard methods, and the resulting recombinant DNA can be introduced into a host cell.
  • the DNA can then be analyzed using a standard base sequence analysis method, such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or a base sequence analyzer such as an Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer or an Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (both manufactured by Thermo Fisher Scientific), to determine the base sequence of the DNA.
  • a standard base sequence analysis method such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or a base sequence analyzer such as an Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer or an Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (both manufactured by Thermo Fisher Scientific), to determine the base sequence of the DNA.
  • Any host cell can be used when determining the base sequence of the DNA, so long as it can grow after the vector is introduced into it.
  • Examples of such cells include Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli HST08Premium, Escherichia coli HST02, Escherichia coli HST04 dam-/dcm-, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli CJ236, Escherichia coli BMH71-18 mutS,
  • Examples of such strains include Escherichia coli MV1184, Escherichia coli TH2 (both manufactured by Takara Bio Inc.), Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue (both manufactured by Agilent Technologies), Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli W1485, Escherichia coli W31
  • Examples of the vector include pBluescriptII KS(+), pPCR-Script Amp SK(+) (both manufactured by Agilent Technologies), pT7Blue (manufactured by Merck Millipore), pCRII (manufactured by Thermo Fisher Scientific), pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter), and pDIRECT (Nucleic Acids Res., 18, 6069, 1990).
  • Any method for introducing recombinant DNA into a host cell can be used, such as the calcium ion method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (JP Patent Publication 63-248394), and the electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)].
  • full-length DNA can be obtained by Southern hybridization or other methods using the partial length DNA as a probe against a chromosomal DNA library.
  • the desired DNA can be prepared by chemical synthesis using a Nippon Techno Service Co., Ltd. NTS M Series DNA synthesizer or similar.
  • the recombinant DNA containing the DNA encoding the protein of this embodiment refers to recombinant DNA that is capable of autonomous replication in a parent strain or of being integrated into a chromosome, and that is integrated into an expression vector that contains a promoter at a position where the DNA can be transcribed.
  • the recombinant DNA is capable of being integrated into a chromosome, it does not need to contain a promoter.
  • a microorganism having an increased copy number of the gene compared to the parent strain, obtained by transforming a parent strain microorganism with recombinant DNA containing DNA encoding the protein of this embodiment, can be obtained by the following method.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared as necessary.
  • a transformant with improved productivity can be obtained.
  • the DNA fragment is inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector to produce recombinant DNA.
  • a microorganism By transforming a parent strain with the recombinant DNA, a microorganism can be obtained in which the copy number of the gene encoding the protein is increased compared to the parent strain.
  • the recombinant DNA is preferably a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome binding sequence, DNA encoding the protein of this embodiment, and a transcription termination sequence.
  • a gene that controls the promoter may also be included.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately downstream of the structural gene.
  • the expression level of the protein having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity can be improved.
  • Information on the codon usage frequency in the parent strain used in this embodiment can be obtained through public databases.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is an appropriate nucleic acid molecule for introducing the target DNA into a host and allowing it to grow and express.
  • plasmids for example, artificial chromosomes, vectors using transposons, and cosmids may also be used.
  • examples of the expression vector include pColdI, pSTV28, pSTV29, pUC118 (all manufactured by Takara Bio Inc.), pMW118, pMW119 (all manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), pET21a, pCOLADuet-1, pCDFDuet-1, pCDF-1b, pRSF-1b (all manufactured by Merck Millipore), pMAL-c5x (manufactured by New England Biolabs), pGEX-4T-1, and pTrc99A (all manufactured by GE Healthcare Biosciences, Inc.).
  • pTrcHis pSE280 (all manufactured by Thermo Fisher Scientific), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30, pQE80L (all manufactured by Qiagen), pET-3, pBluescriptII SK(+), pBluescriptII KS(-) (all manufactured by Agilent Technologies), pUAKQE31 (Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73: 6378-6385), pKYP10 (JP Patent Publication 1983-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem.
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 82, 4306 (1985)]
  • pBluescript II SK(+), pBluescript II KS(-) (Stratagene)
  • pTrS30 prepared from Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)
  • pTrS32 prepared from Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)
  • pTK31 [APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2007, Vol. 73, No. 20, p. 6378-6385]
  • pPAC31 International Publication No.
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of a microorganism belonging to the genus Escherichia.
  • promoters of genes involved in amino acid biosynthesis such as the trp promoter and ilv promoter, and promoters derived from Escherichia coli or phages, such as the uspA promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, and PSE promoter, can be used.
  • Other examples include artificially designed and modified promoters, such as a promoter with two trp promoters in series, the tac promoter, the trc promoter, the lacT7 promoter, and the letI promoter.
  • examples of the expression vector include pCG1 (JP Patent Publication No. 57-134500), pCG2 (JP Patent Publication No. 58-35197), pCG4 (JP Patent Publication No. 57-183799), pCG11 (JP Patent Publication No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all JP Patent Publication No. 58-105999), pCE51, pCE52, and pCE53 (all Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)).
  • any promoter that functions in the cells of a microorganism belonging to the genus Corynebacterium may be used, and an example of such a promoter is the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)].
  • examples of the expression vector include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, etc.
  • any promoter that functions in the cells of a yeast strain may be used, and examples include the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, CUP1 promoter, etc.
  • the transformant of this embodiment can be obtained by transforming a host cell with the recombinant DNA of this embodiment.
  • the term "parent strain” refers to the original strain to be transformed.
  • the parent strain is preferably a prokaryote or a yeast strain, more preferably a prokaryote belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, or Pseudomonas, or a yeast strain belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, or Candida, and most preferably Escherichia coli.
  • yeast strains such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris, or Candida utilis.
  • the parent strain may be a wild-type strain, so long as it is a microorganism that produces GDP-fucose and/or LNT. If the wild-type strain does not have the ability to produce GDP-fucose and/or LNT, the parent strain may be a bred strain that has been artificially endowed with the ability to supply GDP-fucose and/or LNT.
  • microorganisms that can be used as parent strains include the following 1) and 2).
  • 1) and 2) are described below.
  • Microorganisms used as parent strains in which the ability to supply GDP-fucose, which is a reaction substrate for ⁇ 1,2-fucosyltransferase, has been artificially imparted or enhanced.
  • the parent strain is preferably a microorganism in which the ability to supply GDP-fucose, which is a reaction substrate for ⁇ 1,2-fucosyltransferase, has been artificially imparted or enhanced.
  • Specific examples of methods for imparting or enhancing the ability to supply GDP-fucose in a microorganism used as a parent strain include known methods such as various genetic engineering methods (Metabolic Engineering (2017) 41: 23-38).
  • An example of the ability to supply GDP-fucose is the ability to produce GDP-fucose from sugar.
  • Methods for artificially imparting or enhancing the ability to produce GDP-fucose from sugar to a microorganism used as a parent strain include, for example, the following methods (1a) to (1d). These methods may be used alone or in combination.
  • mechanisms that control the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugars include known mechanisms, such as a control mechanism by a transcriptional regulatory factor (e.g., RcsA) involved in the control of the biosynthetic pathway.
  • RcsA is a regulatory factor that upregulates the entire colanic acid biosynthetic pathway, which uses GDP-fucose as an intermediate.
  • RcsA is a regulatory factor that upregulates the entire colanic acid biosynthetic pathway, which uses GDP-fucose as an intermediate.
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugars include known enzymes such as mannose-6-phosphate isomerase, phosphomannomutase, mannose-1-phosphate guanylyltransferase, GDP mannose-4,6-dehydratase, and GDP-L-fucose synthase.
  • WcaJ, WzxC, WcaK, WcaL, or WcaM which are pathways downstream of GDP-fucose in the colanic acid biosynthetic pathway, the supply of GDP-fucose can be increased.
  • the microorganism used as the parent strain may be modified to promote the transfer of exogenous L-fucose across its cell membrane. For example, by expressing or overexpressing a base sequence encoding FucP (accession number AIZ90162), the uptake of exogenous L-fucose across the cell membrane can be improved, thereby increasing the amount of fucose for producing GDP-fucose.
  • FucP accession number AIZ90162
  • the microorganism used as the parent strain may be deleted in the genes fucI and/or fucK encoding L-fucose isomerase and L-fuculose kinase, respectively, and the nucleotide sequences of fucI and/or fucK may be altered so as to irreversibly inactivate the enzymatic activity of the corresponding polypeptide, or may be modified so as to impair the expression of fucI and/or fucK. Eliminating the intracellular synthesis of FucI and/or FucK eliminates fucose metabolism in the cell, thereby enabling an increase in the amount of fucose for producing GDP-fucose.
  • a microorganism used as a parent strain to which the ability to supply LNT, a reaction substrate of ⁇ 1,2-fucosyltransferase, has been artificially imparted or enhanced.
  • methods for artificially imparting the ability to supply LNT to a microorganism used as a parent strain include the following methods (2a) to (2h), and these methods may be used alone or in combination.
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces LNT from sugar include known enzymes such as enzymes with ⁇ 1,4-galactosyltransferase (hereinafter referred to as galT) activity and enzymes with ⁇ 1,3-N-acetylglucosaminetransferase (hereinafter referred to as lgtA) activity, which are involved in the biosynthetic pathway that produces LNT from glucose and lactose.
  • galT ⁇ 1,4-galactosyltransferase
  • lgtA enzymes with ⁇ 1,3-N-acetylglucosaminetransferase
  • Mechanisms for decomposing LNT or its substrate sugars include known enzymes such as ⁇ -galactosidase, which catalyzes the hydrolysis of lactose, the substrate of LNT, to produce glucose and galactose.
  • ⁇ -galactosidase which catalyzes the hydrolysis of lactose, the substrate of LNT, to produce glucose and galactose.
  • lacZ ⁇ -galactosidase
  • enzymes involved in the cellular uptake of LNT or its substrate sugar include known enzymes such as lactose permease, which is involved in the cellular uptake of lactose, which is a substrate for LNT.
  • lacY lactose permease
  • galT ⁇ 1,4-galactosyltransferase
  • glmA glutamine fructose-6-phosphate transaminase
  • glmM phosphoglucosamine mutase
  • the enzyme has at least one activity selected from the group consisting of phosphate acetyltransferase (hereinafter referred to as glmU) activity, phosphoglucomutase (hereinafter referred to as pgm) activity, UTP glucose-1-phosphate uridylyltransferase (hereinafter referred to as galU) activity, UDP glucose-4-epimerase (hereinafter referred to as galE) activity, UTP glucose-1-phosphate uridylyltransferase (hereinafter referred to as galF) activity, and glucose-6-phosphate isomerase (hereinafter referred to as pgi) activity, and it is more preferable that the activity is enhanced.
  • glmU phosphate acetyltransferase
  • pgm phosphoglucomutase
  • galU UTP glucose-1-phosphate uridylyltransferase
  • galF UDP glucose-4-epime
  • lacY, galT and lgtA activities are present, and it is even more preferable that these activities are enhanced.
  • lacY is a membrane protein that takes up lactose, the substrate for LNT, into the cell.
  • galT is an enzyme involved in the production of LNT from lacto-N-triose II (LNTII).
  • LNT is the precursor of LNFPI.
  • LgtA is an enzyme involved in the production of LNTII from lactose and uridine diphosphate-N-acetylglucosamine (hereafter referred to as UDP-GlcNAc).
  • LNTII is the precursor of LNT.
  • glmS, glmM, and glmU are enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces LNTII.
  • Pgm, galU, galE, and galF are enzymes involved in the pathway that produces uridine diphosphate galactose (hereafter referred to as UDP-Gal).
  • Pgi is an enzyme involved in the pathway that produces LNTII.
  • Whether a microorganism is capable of producing GDP-fucose and/or LNT can be confirmed by culturing the microorganism in a medium and detecting the GDP-fucose and/or LNT accumulated in the culture using a general method such as a sugar analyzer or high performance liquid chromatograph mass spectrometer described below.
  • a general method such as a sugar analyzer or high performance liquid chromatograph mass spectrometer described below.
  • commercially available samples can be used as appropriate as standard samples.
  • the microorganism used as the parent strain of the present invention is preferably a microorganism to which the ability to supply GDP-fucose and/or LNT, which are reaction substrates for ⁇ 1,2-fucosyltransferase, has been artificially imparted or enhanced. Therefore, in one embodiment of the present invention, a nucleotide sequence encoding rcsA (Accession No. BAA15776.1), a nucleotide sequence encoding mannose-6-phosphate isomerase (Accession No. BAA15361.1), a nucleotide sequence encoding phosphomannomutase (Accession No.
  • BAA15901.1 a nucleotide sequence encoding mannose-1-phosphate guanylyltransferase (Accession No. BAA15905.1), a nucleotide sequence encoding GDP mannose-4,6-dehydratase (Accession No. BAA15909.1), a nucleotide sequence encoding GDP-L-fucose synthase (Accession No. BAA15908.1), a nucleotide sequence encoding lacY (Accession No. BAE76125.1), a nucleotide sequence encoding galT (Accession No. BAE76125.1), a nucleotide sequence encoding galT (Accession No.
  • BAE76125.1 a nucleotide sequence encoding galT (Accession No. BAE76125.1), a nucleotide sequence encoding galT (Accession No. BAA1590 ... 29), a base sequence encoding lgtA (SEQ ID NO: 31), a base sequence encoding glmS (accession number BAE77559.1), a base sequence encoding glmM (accession number BAE77220.1), a base sequence encoding glmU (accession number BAE77558.1), a base sequence encoding Pgm (accession number BAA35337.1), a base sequence encoding galU (accession number BAA36104.1), a base sequence encoding galE (accession number BAA35421.1), a base sequence encoding galF (accession number BAA15896.1), and a base sequence encoding pgi (accession number BAE78027.1) are
  • a genetically modified microorganism as the parent strain, the genetically modified microorganism preferably including a base sequence encoding lacY, a base sequence encoding rcsA, a base sequence encoding galT, and a base sequence encoding lgtA.
  • the genetically modified microorganism has an increased ability to produce GDP-fucose and/or LNT compared to a parent strain that has not been genetically modified.
  • a method for producing a microorganism having at least one activity selected from lacY activity, rcsA activity, galT activity, lgtA activity, glmS activity, glmM activity, glmU activity, pgm activity, galU activity, galE activity, galF activity, and pgi activity, or having enhanced activity may be used by using a known method. Specific examples include methods using various genetic manipulations (Syst Microbiol Biomanufact, 2021, 1, 291), etc.
  • the parent strain has reduced or absent lacZ activity and/or colanic acid synthesis activity.
  • a genetically modified microorganism as a parent strain, which preferably has reduced or absent lacZ activity and/or colanic acid synthesis activity, and more preferably does not contain a base sequence encoding lacZ and/or a base sequence encoding the wcaJ, wzxC, wcaK, wcaL or wcaM genes, which are base sequences encoding proteins related to colanic acid production.
  • a method for producing E. coli with reduced or lost ⁇ -galactosidase activity and/or colanic acid synthesis activity may be used that is publicly known. Specific examples include methods using various genetic manipulations (Metabolic Engineering, 2017, 41: 23-38), etc.
  • An example of a microorganism in which the activity of the protein of this embodiment is enhanced compared to a parent strain of a microorganism is a microorganism obtained by transforming a parent strain of a microorganism with recombinant DNA containing DNA encoding the protein, and in which the copy number of the recombinant DNA is increased compared to the parent strain.
  • Microorganisms in which the copy number of recombinant DNA is increased compared to the parent strain, obtained by transforming a parent strain microorganism with recombinant DNA containing DNA encoding the protein of this embodiment include microorganisms in which the copy number of recombinant DNA on the chromosomal DNA is increased by transforming a parent strain microorganism with recombinant DNA containing DNA encoding the protein of this embodiment, and microorganisms in which the gene is carried outside the chromosomal DNA as plasmid DNA.
  • Methods for introducing recombinant DNA into a parent strain as an autonomously replicable plasmid include, for example, the calcium ion method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (JP Patent Publication 63-248394), and the electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)].
  • Methods for incorporating recombinant DNA into the chromosome of a host cell include, for example, homologous recombination.
  • homologous recombination include a method using a plasmid for homologous recombination that can be produced by linking with plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host cell to be introduced.
  • An example of a method using homologous recombination that is frequently used in Escherichia coli is a method that uses the homologous recombination system of lambda phage to introduce recombinant DNA [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645 (2000)].
  • E. coli in which a target region on the chromosomal DNA of a host cell has been replaced with recombinant DNA using a selection method that utilizes the fact that E. coli becomes sucrose sensitive due to Bacillus subtilis levan sucrase that has been incorporated on the chromosome together with recombinant DNA, or a selection method that utilizes the fact that E. coli becomes streptomycin sensitive by incorporating a wild-type rpsL gene into E. coli that has a mutant rpsL gene that is resistant to streptomycin [Mol. Microbiol., 55, 137 (2005); Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)], etc.
  • That the recombinant DNA has been introduced into the parent strain as an autonomously replicable plasmid or incorporated into the chromosome of the parent strain can be confirmed, for example, by a method in which a gene that is originally present on the chromosomal DNA of a microorganism cannot be amplified, but an amplified product is confirmed by PCR using a primer set that can amplify the gene introduced by transformation.
  • an increase in the amount of transcription of the DNA or the amount of production of the protein encoded by the DNA can be confirmed by a method in which the amount of transcription of the gene in the microorganism is compared with that of the parent strain by Northern blotting, or the amount of production of the protein in the microorganism is compared with that of the parent strain by Western blotting.
  • the microorganism created by the above method is a microorganism in which the activity of the protein of this embodiment is enhanced and the productivity of LNFPI is improved compared to the parent strain
  • culturing the microorganism diluting the culture solution appropriately, centrifuging it, and analyzing the LNFPI contained in the supernatant or the cells using a sugar analyzer or high-performance liquid chromatograph mass spectrometer described below, and comparing it with that of the parent strain.
  • a commercially available sample can be used as the standard sample.
  • the method for producing the fucose-containing saccharide of this embodiment includes a method for producing the fucose-containing saccharide, which includes preparing the transformant of this embodiment described above and producing oligosaccharides in a culture using the transformant.
  • the fucose-containing saccharide is preferably LNFPI.
  • the above-mentioned transformants can be cultured according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the transformants either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and allows the transformants to be cultured efficiently.
  • the carbon source may be anything that can be assimilated by the microorganism, and examples of such carbon sources include sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch, and starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as glycerol, ethanol, and propanol.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch, and starch hydrolysates
  • organic acids such as acetic acid and propionic acid
  • alcohols such as glycerol, ethanol, and propanol.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium salts of inorganic or organic acids, as well as other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, soybean meal, soybean meal hydrolysate, various fermentation bacteria and their digested products, etc.
  • inorganic salts include potassium dibasic phosphate, potassium dibasic phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc.
  • the transformant used in this production method may be a microorganism capable of producing glucose, lactose, lactose monohydrate, or the like.
  • glucose, lactose, lactose monohydrate, etc. may be added to the medium during cultivation.
  • GDP-fucose and/or LNT may be added to the medium.
  • a microorganism capable of producing glucose, lactose, lactose monohydrate, LNT, or the like from sugar may be simultaneously cultured with the transformant of the present invention, thereby supplying glucose, lactose, lactose monohydrate, LNT, or the like to the transformant of the present invention.
  • ⁇ -galactosidase and WcaJ are not present in the medium.
  • Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as by shaking culture, deep aeration stirring culture, or jar fermenter.
  • the culture temperature is usually 30 to 37°C, and the culture time is usually 24 hours to 3 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 6.0 to 8.0.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • fucose-containing carbohydrates can be produced in the culture by generating fucose-containing carbohydrates.
  • fucose-containing carbohydrates can be collected from the supernatant. If fucose-containing carbohydrates accumulate within the cells, the cells can be disrupted, for example, by ultrasonication, and the cells can be removed by centrifugation. The fucose-containing carbohydrates can then be collected from the resulting supernatant by an ion exchange resin method or the like.
  • the desired fucose-containing carbohydrate can also be produced by adding other sugars to the fucose-containing carbohydrate in the culture or to the collected fucose-containing carbohydrate.
  • Example 1 Construction of microorganisms expressing various ⁇ 1,2-fucosyltransferases (1) Construction of host strain ⁇ Obtaining DNA fragments to be used as markers for gene deletion> PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 102 and 103 as a primer set and pCatSac (Appl Environ Microbiol (2013) 79, 3033-3039) as a template to obtain a cat-sacB fragment containing a chloramphenicol-resistant cat gene and a sucrose-sensitive sacB gene.
  • lacZ and lacY (hereinafter referred to as lacZY), and wcaJ, wzxC, wcaK, wcaL, and wcaM (hereinafter referred to as wcaJ-wzxC-wcaKLM) each form an operon on the Escherichia coli genome.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in "Primer Set" in Table 1 as a primer set to amplify each DNA fragment.
  • lacZ upstream 1 and lacZ upstream 2 include the region from the start codon of the lacZ gene to approximately 1000 bp upstream of the start codon.
  • lacY downstream 1 and lacY downstream 2 include the region from approximately 50 bp downstream of the stop codon of the lacY gene to approximately 1000 bp downstream.
  • a PCR was performed using an equimolar mixture of lacZ upstream 1, lacY downstream 1, and cat-sacB fragments as a template and DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 105 and 107 as a primer set to obtain a DNA fragment (hereinafter referred to as lacZY::cat-sacB) consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequence of the region surrounding the lacZ and lacY genes.
  • a PCR was performed using an equimolar mixture of lacZ upstream 2 and lacY downstream 2 as a template and DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 105 and 107 as a primer set to obtain a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ lacZY) that does not contain lacZY and consists of a sequence in which the upstream of lacZ and the downstream of lacY are directly linked.
  • ⁇ lacZY DNA fragment that does not contain lacZY and consists of a sequence in which the upstream of lacZ and the downstream of lacY are directly linked.
  • the lacZY::cat-sacB fragment was introduced by electroporation into the W3110S3GK strain (NBRC114657) carrying the plasmid pKD46 [Datsenko, K. A., Warner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 97, 6640-6645 (2000)], which contains a gene encoding ⁇ recombinase, to obtain a transformant that exhibited chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (a transformant in which the lacZY gene was replaced with lacZY::cat-sacB).
  • the ⁇ lacZY fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant that was sensitive to chloramphenicol and resistant to sucrose (a transformant in which lacZY::cat-sacB was replaced by ⁇ lacZY). From these, a transformant that was sensitive to ampicillin (a transformant from which pKD46 had been lost) was further obtained.
  • the transformant was named W3110S3GK ⁇ lacZY.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the W3110 strain as a template and DNA consisting of the base sequence shown in "Primer set" in Table 2 as a primer set, to obtain each amplified DNA fragment.
  • wcaJ upstream 1 and wcaJ upstream 2 include the region from the start codon of the wcaJ gene to approximately 1000 bp upstream of the start codon.
  • wcaM downstream 1 and wcaM downstream 2 include the region from the stop codon of the wcaM gene to approximately 1000 bp downstream of the stop codon.
  • wcaJ upstream 1, wcaM downstream 1 and cat-sacB fragments was used as a template, and PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 111 and 113 as a primer set to obtain a DNA fragment consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequence of the region surrounding the wcaJ-wzxC-wcaKLM operon (hereinafter referred to as wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB).
  • ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 111 and 113 as a primer set to obtain a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM) that does not contain wcaJ-wzxC-wcaKLM and consists of a sequence in which the upstream of wcaJ and the downstream of wcaM are directly linked.
  • the wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB fragment was introduced into the W3110S3GK ⁇ lacZY constructed above by electroporation, and a transformant that showed chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (a transformant in which wcaJ-wzxC-wcaKLM was replaced with wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB) was obtained.
  • the ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant that was sensitive to chloramphenicol and resistant to sucrose (a transformant in which wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB had been replaced with ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM).
  • a transformant that was sensitive to ampicillin was obtained.
  • the transformant was named W3110S3GK ⁇ lacZY ⁇ wcaJM.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in “Primer set” in Table 3 as a primer set and DNA shown in “Template” in Table 3 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:122 is a codon-optimized DNA for expressing in Escherichia coli the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,3-galactosyltransferase Cv ⁇ 3GalT derived from Chromobacterium violaceum ATCC553 strain, described in ACS Catal. 2019, 9(12), 10721-10726, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:123 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase NpLgtA derived from Neisseria polysaccharea ATCC43768 strain represented by SEQ ID NO:125 has been codon-optimized for expression in Escherichia coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs:117 and 118, and SEQ ID NOs:119 and 120 each contain a complementary sequence at the 5' end.
  • Cv ⁇ 3galT fragment, NplgtA fragment and lacY fragment were mixed in an equimolar ratio as a template, and PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 116 and 121 as a primer set to obtain a DNA fragment in which the three fragments were linked (hereinafter referred to as Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY).
  • PCR was performed to obtain a vector fragment of approximately 4.7 kb.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 116 and 126, and SEQ ID NOs: 121 and 127 each contain a complementary sequence at the 5' end.
  • the Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY fragment and vector fragment obtained above were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) to obtain the expression plasmid pUAKQE-Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY.
  • the expression plasmid pUAKQE-Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY was used to transform the W3110S3GK ⁇ lacZY ⁇ wcaJM strain constructed above to construct an E. coli strain carrying pUAKQE-Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY, which was named the NNN strain.
  • PCR was performed using the plasmid pSTV29 (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template and DNA represented by SEQ ID NOs: 134 and 135 as a primer set to obtain a vector fragment of about 2.9 kb.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 132 and 134, and SEQ ID NOs: 133 and 135 each contain a complementary sequence at their 5' ends.
  • the rcsA fragment and vector fragment obtained above were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain an expression vector pSTV-rcsA.
  • FsFucT ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Francisella sp. FSC1006 strain.
  • the expression vector pFsFucT serving as a template was prepared as follows: PCR was performed using DNA consisting of the base sequences shown in "Primer set” in Table 4 as a primer set and DNA shown in "Template” in Table 4 as a template to obtain an amplified DNA fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:46 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase FsFucT derived from Francisella sp. FSC1006 strain represented by SEQ ID NO:63 has been codon-optimized for expression in Escherichia coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 128 and 129 each contain a complementary sequence at the 5' end.
  • the amplified DNA fragment and vector fragment were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to create the plasmid pFsFucT expressing ⁇ 1,2-fucosyltransferase.
  • the DNA consisting of the base sequences shown in the various primer sets in Table 5 was used as a primer set to perform PCR using pFsFucT as a template.
  • the resulting vector fragments were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain the various constructed plasmids shown in Table 5 in which point mutations were introduced into the gene sequence of FsFucT, i.e., various plasmids expressing ⁇ 1,2-fucosyltransferase.
  • Y159F This indicates that Y at the position corresponding to position 159 is replaced with F. Mutations at other positions are represented in the same manner.
  • D172_Y173insLTA D at position corresponding to position 172 and Y at position corresponding to position 173, indicating that L, T and A are inserted between positions corresponding to positions 172 and 173. Mutations at other positions are represented similarly.
  • D167_I168insIHG D at the position corresponding to position 167 and I at the position corresponding to position 168, indicating that I, H and G are inserted between the positions corresponding to positions 167 and 168.
  • I267del This indicates that I at the position corresponding to position 267 is deleted.
  • 0.2 mL of the obtained culture solution was inoculated into a large test tube containing 4 mL of production medium containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol [glucose 30 g/L, lactose monohydrate 10 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 2 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 16 g/L, potassium dihydrogen phosphate 14 g/L, ammonium sulfate 2 g/L, citric acid 1 g/L, casamino acids 5 g/L, thiamine hydrochloride 10 mg/L, ferrous sulfate heptahydrate 50 mg/L, manganese sulfate pentahydrate 10 mg/L (pH was adjusted to 7.2 with aqueous sodium hydroxide solution for all components except glucose, lactose monohydrate, and magnesium sulfate heptahydrate, and then autoclaved) (aqueous solutions
  • the S3 and S9 strains which showed significant inhibition of 2'FL production and had LNFPI production equivalent to that of the NNN/pFsFucT strain, were selected as candidates for ⁇ 1,2-fucosyltransferase effective in LNFPI production.
  • Example 2 Jar evaluation The S3 and S9 strains selected in ⁇ Productivity evaluation of LNFPI and 2'FL (test tube)> in Example 1 and the control strain NNN/pFsFucT strain were each cultured on an LB plate containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol at 30°C for 24 hours, and then inoculated into a 300 mL baffled Erlenmeyer flask containing 65 mL of a medium [yeast extract 5 g/L, peptone 10 g/L, sodium chloride 5 g/L] containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol, and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • a medium containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol
  • both the S3 and S9 strains suppressed 2'FL production and increased LNFPI production.
  • the S3 strain produced 0.2% of the amount of 2'FL produced relative to the amount of LNFPI produced, significantly reducing the by-production of 2'FL, suggesting that LNT can be used preferentially as a substrate.
  • Figure 2 shows the amino acid sequences of Francisella sp. FSC1006-derived FucT (FsFucT), S3 ⁇ 1,2-fucosyltransferase, and Amphritea japonica-derived ⁇ 1,2-fucosyltransferase.
  • the amino acid sequence of S3 ⁇ 1,2-fucosyltransferase is one in which the 161st to 172nd amino acid residues of FsFucT have been replaced with the sequence motif of Amphritea japonica-derived ⁇ 1,2-fucosyltransferase (shown in shaded areas in Figure 2) ( Figure 2). From this, it was found that the sequence motif of Amphritea japonica-derived ⁇ 1,2-fucosyltransferase contributes to improved LNT selectivity.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:91 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase (NbFucT1) derived from Neisseriaceae bacterium DSM 100970 represented by SEQ ID NO:95 has been codon-optimized for expression in Escherichia coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • NbFucT1 ⁇ 1,2-fucosyltransferase
  • each of the obtained amplified DNA fragments was linked to a vector fragment amplified using the expression vector pSTV29-rcsA as a template using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) to construct plasmids pNbFucT1 and pFucT54 expressing various ⁇ 1,2-fucosyltransferases.
  • the obtained amplified DNA fragment and linearized vector fragment were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) to obtain plasmids expressing each ⁇ 1,2-fucosyltransferase shown in "Constructed Plasmid” in Table 11.
  • N170T indicates that N at position 170 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:94 is substituted with T. Mutations at other positions are represented similarly.
  • F_H helix indicates that N at position 160 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:95 is substituted with T. Mutations at other positions are represented similarly.
  • F_H helix N160_H161insDLSA indicates that DLSA has been inserted between N160 and H161.
  • G165del indicates that G165 has been deleted.
  • the A_H helix strain, the F_H helix strain, the S3 strain constructed in Example 1, and the control strains NNN/pFsFucT strain, NNN/pNbFucT1 strain, and NNN/pFucT54 strain were each cultured on an LB plate containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol at 30° C.
  • IPTG final concentration 1 mM
  • 480 g/L glucose solution and 40 g/L lactose monohydrate were added at a rate of 5 to 7 mL/h.
  • the culture medium was centrifuged and appropriately diluted, and the 2'FL and LNFP1 contained in the supernatant and the cells were analyzed. The results are shown in Table 13. The total amount of LNFP1 (g/L) is shown in a graph in Figure 5.
  • SEQ ID NOs: 1 to 37 Base sequences of primers SEQ ID NO:38: Base sequence of No. 1 SEQ ID NO:39: Base sequence of No. 2 SEQ ID NO:40: Base sequence of No. 3 SEQ ID NO:41: Base sequence of No. 4 SEQ ID NO:42: Base sequence of No. 5 SEQ ID NO:43: Base sequence of No. 6 SEQ ID NO:44: Base sequence of No. 7 SEQ ID NO:45: Base sequence of No.

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Abstract

ＬＮＦＰＩの生産性に優れるα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びＬＮＦＰＩの製造法の提供を目的とする。ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）へのフコシル基転移活性を有する蛋白質であって、特定の変異が導入された蛋白質（変異導入前後の蛋白質を構成するアミノ酸配列が同一となるものは除く）。

Description

α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法
　本発明は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法に関する。
　ヒトの母乳中に含まれるオリゴ糖（Ｈｕｍａｎ　Ｍｉｌｋ　Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＨＭＯ）はプレバイオティクス素材として注目されており、乳幼児の認知機能発達や感染防御、腸内環境の改善などに有効であることが示されている（非特許文献１）。
　ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（以下、ＬＮＦＰＩという。）はＨＭＯの一種であり、ラクト－Ｎ－テトラオース（以下、ＬＮＴという。）のガラクトース２位にフコースがα１，２－結合した５糖ＨＭＯである。
　ＬＮＦＰＩは、２’－フコシルラクトース（以下、２’ＦＬという。）やラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース（以下、ＬＮＤＦＨＩという。）に次いで母乳中に多く含まれ、同じく５糖で、ＬＮＦＰＩの異性体として知られるラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（以下、ＬＮＦＰＩＩという。）やラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（以下、ＬＮＦＰＩＩＩという。）と比較して、母乳中の含量が高いことが知られている（非特許文献２）。
　ＬＮＦＰＩの機能性としては、髄膜炎起因菌グループＢストレプトコッカス（ＧＢＳ）に対する阻害効果やノロウイルス阻害効果などが知られている（非特許文献３、４）。また、新生児の腸内において占有率の高いＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｆａｎｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・インファンティス）は、ＬＮＦＰＩ選択的に優位に生育が認められるという結果から、プレバイオティクスとしての機能も注目されている（非特許文献５）。
　ＬＮＦＰＩの製造方法としては、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦｕｃＴとも略す。）を使用した微生物発酵法や酵素反応法［Ｏｎｅ－ｐｏｔ　ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ（ＯＰＭＥ）　ｓｙｓｔｅｍ］が広く使用されている。非特許文献４、５および６には、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ（サーモシネココッカス・エロンゲータス）、Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（シデロキシダンス・リトトロピクス）又はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ（ヘリコバクター・ピロリ）などの微生物に由来するα１，２－フコシルトランスフェラーゼを大腸菌で過剰発現させ、ＬＮＴおよびＧＤＰ－フコースを基質として、発酵法または連続酵素反応法によりＬＮＦＰＩなどのオリゴ糖を生産する方法が開示されている。
　しかしながら、前記発酵法または連続酵素反応法では、ＬＮＦＰＩ生産において、α１，２－フコシルトランスフェラーゼが所望の基質であるＬＮＴだけではなく共存するラクトースにも反応し副生物として２’ＦＬが生成することが課題となっている。
　副生物を低減させる方法としては、精製された高純度のＬＮＴを基質として用いる酵素反応法（非特許文献５）や、初発原料のラクトースが枯渇したタイミングでα１，２－フコシルトランスフェラーゼの発現を誘導することでＬＮＦＰＩを生産させる方法が開示されている（非特許文献６）。
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１９），Ａｒｔｉｃｌｅ　ＩＤ　２３９０２４０ Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．（２０１７）７５，９２０－９３３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１７）２９２（２７）１１２４３－１１２４９ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）３１８，３１－３８ Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１６）５２，３８９９－３９０２ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３（２０１５）６７９９－６８０６
　上述のように、α１，２－フコシルトランスフェラーゼを使用した微生物発酵法や酵素反応法が知られている。しかしながら、特許文献１、２および非特許文献４、５、６に記載の微生物由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼは広範な糖基質を許容しうるため、ＬＮＦＰＩ生産において副生物として２’ＦＬが生成することが課題となる。
　一方で、より効率的にラクトースを初発原料としてＬＮＦＰＩを生産させるためには、
ラクトースには糖転移せず、ＬＮＴの非還元末端ガラクトース部位に対し選択的に糖転移可能なα１，２－フコシルトランスフェラーゼが求められる。
　したがって、本発明は、ＬＮＦＰＩの生産性に優れるα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びＬＮＦＰＩの製造方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、特定のアミノ酸配列からなるα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、従来の方法と比して、効率的にＬＮＦＰＩを製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
１．ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）へのフコシル基転移活性を有する蛋白質であって、
　以下の［１］及び［２］の少なくとも一方の変異が導入された蛋白質（変異導入前後の蛋白質を構成するアミノ酸配列が同一となるものは除く）。
［１］配列番号９８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挿入される変異
［２］配列番号９９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挿入される変異
２．配列番号６３、９４及び９５の少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の全長配列同一性を有するアミノ酸配列において、前記［１］及び［２］の少なくとも一方の変異が導入された蛋白質である、前記１に記載の蛋白質。
３．前記［１］の変異は、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質において基質との相互作用に寄与する領域に対応する箇所に導入された変異であり、
　前記［２］の変異は、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質において基質との相互作用に寄与する領域に対応する箇所に導入された変異である、
前記１又は２に記載の蛋白質。
４．前記基質との相互作用に寄与する領域が、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６２位から１７６位に対応するアミノ酸配列である、前記３に記載の蛋白質。
５．前記［１］の変異は、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６２位から１７６位に対応するアミノ酸配列が配列番号９８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列に置換される変異であり、
　前記［２］の変異は、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６８位から１８４位に対応するアミノ酸配列が配列番号９９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列に置換される変異である、
前記１～４のいずれか１に記載の蛋白質。
６．前記［１］の変異は、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６２位から１７６位に相当する位置における下記［１ａ］～［１о］から選ばれる少なくとも１の変異であり、
　前記［２］の変異は、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６８位から１８４位に相当する位置における下記［２ａ］～［２ｑ］から選ばれる少なくとも１の変異である、
前記１～５のいずれか１に記載の蛋白質。
［１ａ］１６２位相当位置では、スレオニンである
［１ｂ］１６３位相当位置では、アスパラギン酸である
［１ｃ］１６４位相当位置では、ロイシンである
［１ｄ］１６５位相当位置では、セリンである
［１ｅ］１６６位相当位置では、アラニンである
［１ｆ］１６７位相当位置では、アスパラギンである
［１ｇ］１６８位相当位置では、アスパラギンである
［１ｈ］１６９位相当位置では、イソロイシンである
［１ｉ］１７０位相当位置では、ヒスチジンである
［１ｊ］１７１位相当位置では、グリシンである
［１ｋ］１７２位相当位置では、イソロイシンである
［１ｌ］１７３位相当位置では、システインである
［１ｍ］１７４位相当位置では、セリンである
［１ｎ］１７５位相当位置では、グルタミン酸である
［１о］１７６位相当位置では、グルタミン酸である
［２ａ］１６８位相当位置では、フェニルアラニンである
［２ｂ］１６９位相当位置では、バリンである
［２ｃ］１７０位相当位置では、グルタミンである
［２ｄ］１７１位相当位置では、アスパラギン酸である
［２ｅ］１７２位相当位置では、プロリンである
［２ｆ］１７３位相当位置では、バリンである
［２ｇ］１７４位相当位置では、バリンである
［２ｈ］１７５位相当位置では、アルギニンである
［２ｉ］１７６位相当位置では、アルギニンである
［２ｊ］１７７位相当位置では、バリンである
［２ｋ］１７８位相当位置では、ヒスチジンである
［２ｌ］１７９位相当位置では、グリシンである
［２ｍ］１８０位相当位置では、バリンである
［２ｎ］１８１位相当位置では、アスパラギン酸である
［２о］１８２位相当位置では、ロイシンである
［２ｐ］１８３位相当位置では、スレオニンである
［２ｑ］１８４位相当位置では、アラニンである
７．ＬＮＴへのフコシル基転移活性を有する蛋白質であって、
　配列番号６３で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その７位、４２位、９４位、９５位、１５９から１７３位、２５９位、２６０位及び２６２位から２７０位に相当する各位置における下記（１）～（３１）から選ばれる少なくとも１の変異が導入され、且つ前記変異導入前の蛋白質に比べてＬＮＴへのフコシル基転移活性が高い、蛋白質。
（１）７位相当位置では、アラニン又はセリンである
（２）４２位相当位置では、イソロイシンである
（３）９４位相当位置では、ヒスチジンである
（４）９５位相当位置では、チロシンである
（５）１５９位相当位置では、フェニルアラニンである
（６）１６０位相当位置では、バリンである
（７）１６１位相当位置では、グルタミン又はスレオニンである
（８）１６２位相当位置では、アスパラギン酸又はアスパラギンである
（９）１６３位相当位置では、ロイシンである
（１０）１６４位相当位置では、イソロイシン、リシン、セリン又はバリンである
（１１）１６５位相当位置では、アラニン又はバリンである
（１２）１６６位相当位置では、アルギニン又はアスパラギンである
（１３）１６７位相当位置では、アルギニン又はアスパラギンである
（１４）１６８位相当位置では、バリンである
（１５）１６７位相当位置ではアスパラギン酸、１６８位相当位置ではイソロイシンであり、且つ１６７位相当位置と１６８位相当位置との間において、イソロイシン、ヒスチジン及びグリシンが挿入されている
（１６）１６９位相当位置では、ヒスチジンである
（１７）１７０位相当位置では、ロイシン、グリシン又はセリンである
（１８）１７１位相当位置では、スレオニン、バリン又はグルタミン酸である
（１９）１７２位相当位置では、グルタミン酸又はアラニンである
（２０）１７２位相当位置ではアスパラギン酸、１７３位相当位置ではチロシンであり、且つ１７２位相当位置と１７３位相当位置との間において、ロイシン、スレオニン及びアラニンが挿入されている
（２１）２５９位相当位置では、リシンである
（２２）２６０位相当位置では、グルタミンである
（２３）２６２位相当位置では、ヒスチジンである
（２４）２６３位相当位置では、リシンである
（２５）２６４位相当位置では、バリンである
（２６）２６５位相当位置では、アルギニンである
（２７）２６６位相当位置では、アスパラギン酸である
（２８）２６７位相当位置では、フェニルアラニンである
（２９）２６８位相当位置では、アスパラギン酸である
（３０）２６９位相当位置では、スレオニンである
（３１）２７０位相当位置では、アルギニンである
８．配列番号６３、９４及び９５の少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の全長配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号６３で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その７位、４２位、９４位、９５位、１５９から１７３位、２５９位、２６０位及び２６２位から２７０位の各位置に相当する位置に前記（１）～（３１）から選ばれる少なくとも１の変異が導入された蛋白質である、前記７に記載の蛋白質。
９．配列番号６３で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その７位、４２位、９４位、９５位、１５９から１７３位、２５９位、２６０位及び２６２位から２７０位の各位置に相当する位置に導入された前記変異が、下記［３］～［１２］のいずれか１である、前記７又は８に記載の蛋白質。
［３］１５９位相当位置では、フェニルアラニンであり、
　１６０位相当位置では、バリンであり、
　１６１位相当位置では、グルタミンであり、
　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６４位相当位置では、バリンであり、
　１６５位相当位置では、バリンであり、
　１６６位相当位置では、アルギニンであり、
　１６７位相当位置では、アルギニンであり、
　１６８位相当位置では、バリンであり、
　１６９位相当位置では、ヒスチジンであり、
　１７０位相当位置では、グリシンであり、
　１７１位相当位置では、バリンであり、
　１７２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１７３位相当位置では、チロシンであり、
　１７２位相当位置と１７３位相当位置との間に、ロイシン、チロシン及びアラニンが挿入されている。
［４］９４位相当位置ではヒスチジンであり、
　９５位相当位置では、チロシンであり、
　１５９位相当位置では、フェニルアラニンであり、
　１６０位相当位置では、バリンであり、
　１６１位相当位置では、グルタミンであり、
　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６４位相当位置では、バリンであり、
　１６５位相当位置では、バリンであり、
　１６６位相当位置では、アルギニンであり、
　１６７位相当位置では、アルギニンであり、
　１６８位相当位置では、バリンであり、
　１６９位相当位置では、ヒスチジンであり、
　１７０位相当位置では、グリシンであり、
　１７１位相当位置では、バリンであり、
　１７２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１７３位相当位置では、チロシンであり、
　１７２位相当位置と１７３位相当位置との間に、ロイシン、チロシン及びアラニンが挿入されており、
　２５９位相当位置では、リシンであり、
　２６０位相当位置では、グルタミンであり、
　２６３位相当位置では、リシンであり、
　２６４位相当位置では、バリンであり、
　２６５位相当位置では、アルギニンであり、
　２６６位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　２６７位相当位置では、フェニルアラニンであり、
　２６８位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　２６９位相当位置では、スレオニンであり、
　２７０位相当位置では、アルギニンである。
［５］１６１位相当位置では、スレオニンであり、
　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６３位相当位置では、ロイシンであり、
　１６４位相当位置では、セリンであり、
　１６５位相当位置では、アラニンであり、
　１６６位相当位置では、アスパラギンであり、
　１６７位相当位置では、アスパラギンであり、
　１６７位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６８位相当位置では、イソロイシンであり、
　１６７位相当位置と１６８位相当位置との間にイソロイシン、ヒスチジン及びグリシンが挿入されており、
　１７０位相当位置では、セリンであり、
　１７１位相当位置では、グルタミン酸であり、
　１７２位相当位置では、グルタミン酸である。
［６］１６４位相当位置では、イソロイシンである。
［７］１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６４位相当位置では、リシンである。
［８］２６２位相当位置では、ヒスチジンである。
［９］４２位相当位置では、イソロイシンである。
［１０］１６２位相当位置では、アスパラギンである。
［１１］７位相当位置では、セリンである。
［１２］７位相当位置では、アラニンである。
１０．前記１～９のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
１１．前記１０に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
１２．前記１１に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
１３．前記１～９のいずれか１に記載の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、前記１２に記載の形質転換体。
１４．前記微生物が大腸菌である、前記１３に記載の形質転換体。
１５．前記１３～１４のいずれか１に記載の形質転換体を調製すること、及び該形質転換体を用いて培養物中にフコース含有糖質を生成することを含む、フコース含有糖質の製造方法。
１６．前記フコース含有糖質がラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）である、前記１５に記載の製造方法。
　本発明の蛋白質は、特定のアミノ酸配列からなることにより、ＬＮＴの非還元末端ガラクトース部位に対し糖転移可能なα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する。本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、従来と比して、副生物の生成を抑制し、効率的にＬＮＦＰＩを製造できる。
図１は、本発明の一実施形態におけるＬＮＦＰＩの生合成経路を示す。 図２は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．ＦＳＣ１００６株由来ＦｕｃＴ（ＦｓＦｕｃＴ）、Ｓ３のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（アンフリテア・ジャポニカ）由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す。 図３は、ＬＮＦＰ１の合計量（ｇ／Ｌ）を表すグラフである。 図４は、ＬＮＦＰ１の合計量（ｇ／Ｌ）を表すグラフである。 図５は、ＬＮＦＰ１の合計量（ｇ／Ｌ）を表すグラフである。
　以下、実施形態により本発明を説明する。実施形態は、実施形態１及び実施形態２を含むものとする。
　本実施形態において、アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８３，　６３　（１９９０）］を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　本実施形態において、アミノ酸配列のアライメントは、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２，４６７３，（１９９４）］、ＭＡＦＴＴ［Ｎｕｃｅｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３０，３０５９，（２００２）］、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｏｍｅｇａ等を用いて作成し得る。これらのアライメントプログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用できる。これらのアライメントプログラムを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いる。
　本実施形態において、ＬＮＴへのフコシル基転移活性とは、ドナー基質であるＧＤＰ－フコースから、受容体基質である糖質（以下、「受容体糖質」という。）であるＬＮＴのガラクトース水酸基にフコース残基を転移する活性をいう。
　本実施形態において、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性とは、ドナー基質であるＧＤＰ－フコースから、受容体糖質のガラクトース水酸基にα１，２－結合でフコース残基を転移し、フコース含有糖質を生成する活性をいう。本実施形態において、受容体糖質としては、ＬＮＴが好ましい。本実施形態において、フコース含有糖質としては、ＬＮＦＰＩが好ましい。
　本実施形態において、ＬＮＴへのフコシル基転移活性を有する蛋白質とは、ドナー基質であるＧＤＰ－フコースから、ＬＮＴのガラクトース水酸基にフコース残基を転移する活性を有する蛋白質であれば特に限定されないが、例えば、α１，２－フコシルトランスフェラーゼが挙げられる。具体的には例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．ＦＳＣ１００６株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ　ＥＳ－１１由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｇｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．ＭＡＲ＿２０１０＿１４７株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｓｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｈａｌｏｃｙｎｔｈｉｉｂａｃｔｅｒ　ａｅｓｔｕａｒｉｉｖｉｖｅｎｓ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．ＣＦ０７４株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆａｖａｒｅａ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　Ｏ８６株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　Ｏ１２７株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
　本実施形態において、各変異は、下記に示す相互に置換可能なアミノ酸に置換されていてもよい。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リシン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
＜ＬＮＦＰＩの生合成経路＞
　本実施形態におけるＬＮＦＰＩの生合成経路を図１に示す。ＧＤＰ－フコースからガラクトース水酸基にフコース残基が転移することにより、ＬＮＦＰＩが生成する。
　本発明者らは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．ＦＳＣ１００６（フランシセラｓｐ．ＦＳＣ１００６）由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする塩基配列の一部をＡｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（アンフリテア・ジャポニカ）由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする塩基配列の相当する部位及びＳｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする塩基配列の相当する部位の少なくとも一方に置換することで、２’ＦＬの副生を置換前の酵素より低減できることを確認した。すなわち、ＬＮＴに対してより高い基質選択性を有するα１，２－フコシルトランスフェラーゼ蛋白質を新たに見出した。
　また、本発明者らは、Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ　ＥＳ－１１（シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ－１１）由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ（国際公開第２０１９／００８１３３号）、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼについても同様に、これらをコードする塩基配列の一部をＡｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（アンフリテア・ジャポニカ）由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする塩基配列の相当する部位の塩基配列を置換することで、２’ＦＬ副生の低減を確認した。
　このことから、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（アンフリテア・ジャポニカ）由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びＳｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼの前記置換に用いた塩基配列によりコードされるアミノ酸配列は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼホモログにおいて副生としての２’ＦＬの低減、すなわちＬＮＴに対する基質選択性の向上に寄与すると考えられる。
＜実施形態１：ＬＮＴへのフコシル基転移活性を有する蛋白質＞
　実施形態１の蛋白質は、ＬＮＴへのフコシル基転移活性（以下、単に「フコシル基転移活性」とも略す。）を有する蛋白質であって、以下の［１］及び［２］の少なくとも一方の変異が導入された蛋白質である。
［１］配列番号９８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を挿入する変異
［２］配列番号９９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を挿入する変異
　実施形態１において、変異とは、変異前後の蛋白質を構成するアミノ酸配列が同一となるものは除く。また、前記挿入としては、例えば、挿入による変異及び置換による変異が挙げられる。実施形態１の蛋白質は、変異導入後の蛋白質のＬＮＴに対する基質選択性が変異導入前の蛋白質に比較して向上した蛋白質であることが好ましい。また、実施形態１の蛋白質は、ＬＮＴに対する基質選択性の向上に加え、変異導入後の蛋白質のフコシル基転移活性が変異導入前の蛋白質に比較して向上した蛋白質であることがより好ましい。
　蛋白質のＬＮＴに対する基質選択性は、例えば以下の（Ａ１）～（Ａ３）の手順により確認できる。　
（Ａ１）活性を確認しようとする蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。
（Ａ２）前記組換え体ＤＮＡで、親株を形質転換することにより形質転換体を作製し、該形質転換体の培養液中に生成、蓄積したＬＮＦＰＩの量及び２’ＦＬの量を測定する。
（Ａ３）ＬＮＦＰＩの量に対する２’ＦＬの量の比が、小さい程、ＬＮＴに対する基質選択性が高い、と判断する。
　蛋白質のフコシル基転移活性は、例えば以下の（Ｂ１）～（Ｂ３）の手順により確認できる。
（Ｂ１）活性を確認しようとする蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。
（Ｂ２）前記組換え体ＤＮＡで、親株を形質転換することにより形質転換体を作製し、該形質転換体の培養液中に生成、蓄積したフコース含有糖質の量を測定する。
（Ｂ３）前記フコース含有糖質の量により、フコシル基転移活性を評価する。フコース含有糖質としては、具体的には、ＬＮＦＰＩが挙げられる。
　実施形態１の蛋白質は、配列番号６３、９４及び９５の少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の全長配列同一性を有するアミノ酸配列において、前記［１］及び［２］の少なくとも一方の変異が導入された蛋白質であることが好ましい。前記全長配列同一性は、好ましくは５０％以上、より好ましくは、以下順に、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは１００％である。
　配列番号６３で表されるアミノ酸配列は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．ＦＳＣ１００６由来ＦｕｃＴ（以下、ＦｓＦｕｃＴとも略す）のアミノ酸配列である。
　配列番号９４で表されるアミノ酸配列は、Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ　ＥＳ－１１由来のＦｕｃＴ（以下、ＦｕｃＴ５４とも略す。）のアミノ酸配列である。
　配列番号９５で表されるアミノ酸配列は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０由来のＦｕｃＴ（以下、ＮｂＦｕｃＴ１とも略す。）のアミノ酸配列である。
　実施形態１における前記［１］及び［２］について下記に説明する。
＜＜［１］配列番号９８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挿入された変異＞＞
　［１］において、配列番号９８のアミノ酸配列は、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０１）を構成するアミノ酸配列の部分配列であり、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列の１６２位から１７６位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列である。
　［１］において挿入されるアミノ酸配列は、配列番号９８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する。該同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　［１］の変異は、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質において基質との相互作用に寄与する領域に対応する箇所に、導入された変異であることが好ましい。該基質との相互作用に寄与する領域とは、水素結合等による該基質との結合部位及びその近傍の領域からなる。該基質との相互作用に寄与する領域としては、ヘリックス構造を形成する領域が挙げられる。該基質との相互作用に寄与する領域としては、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１４０位から２８０位に対応する領域であることが好ましく、より好ましくはその１５０位から２００位に対応する領域、さらに好ましくはその１６０位から１８０位に対応する領域、特に好ましくはその１６２位から１７６位に対応する領域である。
　［１］の変異は、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、好ましくはその１４０位から２８０位、より好ましくはその１５０位から２００位、さらに好ましくはその１６０位から１８０位、特に好ましくはその１６２位から１７６位に対応するアミノ酸配列が、配列番号９８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列に置換される変異であることが好ましい。
　［１］の変異は、具体的には例えば、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６２位から１７６位に相当する位置における下記［１ａ］～［１о］から選ばれる少なくとも１であることが好ましい。
［１ａ］１６２位相当位置では、スレオニンである
［１ｂ］１６３位相当位置では、アスパラギン酸である
［１ｃ］１６４位相当位置では、ロイシンである
［１ｄ］１６５位相当位置では、セリンである
［１ｅ］１６６位相当位置では、アラニンである
［１ｆ］１６７位相当位置では、アスパラギンである
［１ｇ］１６８位相当位置では、アスパラギンである
［１ｈ］１６９位相当位置では、イソロイシンである
［１ｉ］１７０位相当位置では、ヒスチジンである
［１ｊ］１７１位相当位置では、グリシンである
［１ｋ］１７２位相当位置では、イソロイシンである
［１ｌ］１７３位相当位置では、システインである
［１ｍ］１７４位相当位置では、セリンである
［１ｎ］１７５位相当位置では、グルタミン酸である
［１о］１７６位相当位置では、グルタミン酸である
＜＜［２］配列番号９９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挿入された変異＞＞
　［２］において、配列番号９９のアミノ酸配列は、Ｓｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ由来ＳｂＦｕｃＴのアミノ酸配列（配列番号１３１）を構成するアミノ酸配列の部分配列であり、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列の１６８位から１８４位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列である。
　［２］において挿入されるアミノ酸配列は、配列番号９９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する。該同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　［２］の変異は、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質において基質との相互作用に寄与する領域に対応する箇所に、導入された変異であることが好ましい。該基質との相互作用に寄与する領域としては、ヘリックス構造を形成する領域が挙げられる。該基質との相互作用に寄与する領域としては、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６８位から１８４位に対応する領域であることが好ましく、より好ましくはその１５０位から２００位、さらに好ましくはその１６０位から１９０位、特に好ましくはその１６８位から１８４位に対応する領域である。
　［２］の変異は、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、好ましくはその１４０位から２８０位、より好ましくはその１５０位から２００位、さらに好ましくはその１６０位から１９０位、特に好ましくはその１６８位から１８４位に対応するアミノ酸配列が配列番号９９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列に置換される変異であることが好ましい。
　［２］の変異は、具体的には例えば、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６８位から１８４位に相当する位置における下記［２ａ］～［２ｑ］から選ばれる少なくとも１であることが好ましい。
［２ａ］１６８位相当位置では、フェニルアラニンである
［２ｂ］１６９位相当位置では、バリンである
［２ｃ］１７０位相当位置では、グルタミンである
［２ｄ］１７１位相当位置では、アスパラギン酸である
［２ｅ］１７２位相当位置では、プロリンである
［２ｆ］１７３位相当位置では、バリンである
［２ｇ］１７４位相当位置では、バリンである
［２ｈ］１７５位相当位置では、アルギニンである
［２ｉ］１７６位相当位置では、アルギニンである
［２ｊ］１７７位相当位置では、バリンである
［２ｋ］１７８位相当位置では、ヒスチジンである
［２ｌ］１７９位相当位置では、グリシンである
［２ｍ］１８０位相当位置では、バリンである
［２ｎ］１８１位相当位置では、アスパラギン酸である
［２о］１８２位相当位置では、ロイシンである
［２ｐ］１８３位相当位置では、スレオニンである
［２ｑ］１８４位相当位置では、アラニンである
　実施形態１の蛋白質を構成するアミノ酸配列としては、具体的には例えば、配列番号６６、９６又は９７で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
＜実施形態２：ＬＮＴへのフコシル基転移活性を有する蛋白質＞
　実施形態２は、ＬＮＴへのフコシル基転移活性を有する蛋白質であって、配列番号６３で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その７位、４２位、９４位、９５位、１５９から１７３位、２５９位、２６０位及び２６２位から２７０位各位置における下記（１）～（３１）から選ばれる少なくとも１の変異が導入され、且つ前記変異導入前の蛋白質に比べてＬＮＴへのフコシル基転移活性が高い、蛋白質である。
（１）７位相当位置では、アラニン又はセリンである
（２）４２位相当位置では、イソロイシンである
（３）９４位相当位置では、ヒスチジンである
（４）９５位相当位置では、チロシンである
（５）１５９位相当位置では、フェニルアラニンである
（６）１６０位相当位置では、バリンである
（７）１６１位相当位置では、グルタミン又はスレオニンである
（８）１６２位相当位置では、アスパラギン酸又はアスパラギンである
（９）１６３位相当位置では、ロイシンである
（１０）１６４位相当位置では、イソロイシン、リシン、セリン又はバリンである
（１１）１６５位相当位置では、アラニン又はバリンである
（１２）１６６位相当位置では、アルギニン又はアスパラギンである
（１３）１６７位相当位置では、アルギニン又はアスパラギンである
（１４）１６８位相当位置では、バリンである
（１５）１６７位相当位置ではアスパラギン酸、１６８位相当位置ではイソロイシンであり、且つ１６７位相当位置と１６８位相当位置との間において、イソロイシン、ヒスチジン及びグリシンが挿入されている
（１６）１６９位相当位置では、ヒスチジンである
（１７）１７０位相当位置では、ロイシン、グリシン又はセリンである
（１８）１７１位相当位置では、スレオニン、バリン又はグルタミン酸である
（１９）１７２位相当位置では、グルタミン酸又はアラニンである
（２０）１７２位相当位置ではアスパラギン酸、１７３位相当位置ではチロシンであり、且つ１７２位相当位置と１７３位相当位置との間において、ロイシン、スレオニン及びアラニンが挿入されている
（２１）２５９位相当位置では、リシンである
（２２）２６０位相当位置では、グルタミンである
（２３）２６２位相当位置では、ヒスチジンである
（２４）２６３位相当位置では、リシンである
（２５）２６４位相当位置では、バリンである
（２６）２６５位相当位置では、アルギニンである
（２７）２６６位相当位置では、アスパラギン酸である
（２８）２６７位相当位置では、フェニルアラニンである
（２９）２６８位相当位置では、アスパラギン酸である
（３０）２６９位相当位置では、スレオニンである
（３１）２７０位相当位置では、アルギニンである
　配列番号６３、９４及び９５の少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の全長配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号６３で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その７位、４２位、９４位、９５位、１５９から１７３位、２５９位、２６０位及び２６２位から２７０位からなる群から選択される少なくとも１個以上の位置に相当する位置に前記変異が導入された蛋白質であることが好ましい。前記全長配列同一性は、好ましくは５０％以上、より好ましくは、以下順に、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは１００％である。
　配列番号６３、９４及び９５で表されるアミノ酸配列に関し、＜実施形態１：ＬＮＴへのフコシル基転移活性を有する蛋白質＞の項において上記したものと同様である。
　実施形態２における各変異は、下記［３］～［１２］のいずれか１であることが好ましい。
（Ａ）［３］～［６］からなる群より選ばれる少なくとも１の変異
［３］１５９位相当位置では、フェニルアラニンであり、
　１６０位相当位置では、バリンであり、
　１６１位相当位置では、グルタミンであり、
　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６４位相当位置では、バリンであり、
　１６５位相当位置では、バリンであり、
　１６６位相当位置では、アルギニンであり、
　１６７位相当位置では、アルギニンであり、
　１６８位相当位置では、バリンであり、
　１６９位相当位置では、ヒスチジンであり、
　１７０位相当位置では、グリシンであり、
　１７１位相当位置では、バリンであり、
　１７２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１７３位相当位置では、チロシンであり、
　１７２位相当位置と１７３位相当位置との間に、ロイシン、チロシン及びアラニンが挿入されている。
［４］９４位相当位置ではヒスチジンであり、
　９５位相当位置では、チロシンであり、
　１５９位相当位置では、フェニルアラニンであり、
　１６０位相当位置では、バリンであり、
　１６１位相当位置では、グルタミンであり、
　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６４位相当位置では、バリンであり、
　１６５位相当位置では、バリンであり、
　１６６位相当位置では、アルギニンであり、
　１６７位相当位置では、アルギニンであり、
　１６８位相当位置では、バリンであり、
　１６９位相当位置では、ヒスチジンであり、
　１７０位相当位置では、グリシンであり、
　１７１位相当位置では、バリンであり、
　１７２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１７３位相当位置では、チロシンであり、
　１７２位相当位置と１７３位相当位置との間に、ロイシン、チロシン及びアラニンが挿入されており、
　２５９位相当位置では、リシンであり、
　２６０位相当位置では、グルタミンであり、
　２６３位相当位置では、リシンであり、
　２６４位相当位置では、バリンであり、
　２６５位相当位置では、アルギニンであり、
　２６６位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　２６７位相当位置では、フェニルアラニンであり、
　２６８位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　２６９位相当位置では、スレオニンであり、
　２７０位相当位置では、アルギニンである。
［５］１６１位相当位置では、スレオニンであり、
　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６３位相当位置では、ロイシンであり、
　１６４位相当位置では、セリンであり、
　１６５位相当位置では、アラニンであり、
　１６６位相当位置では、アスパラギンであり、
　１６７位相当位置では、アスパラギンであり、
　１６７位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６８位相当位置では、イソロイシンであり、
　１６７位相当位置と１６８位相当位置との間にイソロイシン、ヒスチジン及びグリシンが挿入されており、
　１７０位相当位置では、セリンであり、
　１７１位相当位置では、グルタミン酸であり、
　１７２位相当位置では、グルタミン酸である。
［６］１６４位相当位置では、イソロイシンである。
［７］１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
　１６４位相当位置では、リシンである。
［８］２６２位相当位置では、ヒスチジンである。
［９］４２位相当位置では、イソロイシンである。
［１０］１６２位相当位置では、アスパラギンである。
［１１］７位相当位置では、セリンである。
［１２］７位相当位置では、アラニンである。
　実施形態２の蛋白質を構成するアミノ酸配列としては、具体的には例えば、配列番号６４～７８のいずれか１で表されるアミノ酸配列が挙げられる。これらの中でも、特に配列番号６４～６６、６８及び７２～７７のいずれか１で表されるアミノ酸配列が好ましい。
＜ＤＮＡ＞　
　本実施形態のＤＮＡは、上記した本実施形態の蛋白質をコードするＤＮＡである。実施形態１の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号４９、９２又は９３で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。実施形態２の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号４７～６１のいずれか１で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
　本実施形態のＤＮＡは、そのまま、または適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７４，　５４６３　（１９７７）］またはアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
　前記ＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができる宿主細胞としては、前記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２等が挙げられる。
　前記ベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，６０６９，１９９０）等が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］等が挙げられる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
　本実施形態の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。
　組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
　本実施形態の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得できる。
　上記の方法で得られる本実施形態の蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得できる。
　前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得できる。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、本実施形態の蛋白質をコードするＤＮＡ、および転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　また、本実施形態の蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の発現量を向上し得る。本実施形態に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
　発現ベクターとしては、目的ＤＮＡを宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９（いずれもニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＵＡＫＱＥ３１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４８，　６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５３，　２７７　（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８２，　４３０６　（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、　２００７、　Ｖｏｌ．　７３、Ｎｏ．　２０、ｐ．６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３　（１９８５）］、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）ｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］等が挙げられる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｕｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、例えば、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターが挙げられる。
　親株にコリネバクテリウム属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１９６，　１７５　（１９８４）〕等が挙げられる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネバクテリウム属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５３，　６７４－６７９　（２０００）］が挙げられる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
＜形質転換体＞
　本実施形態の形質転換体は、上記した本実施形態の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換することにより得られる。本実施形態において、「親株」とは、形質転換の対象となる元株をいう。
　本実施形態において、親株としては、好ましくは原核生物または酵母菌株、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０Ｓ３ＧＫ（ＮＢＲＣ１１４６５７）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｄ－０１１０等の原核生物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株が挙げられる。
　親株は、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを生成する微生物であれば、野生株であってもよい。野生株がＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを生成する能力を有しない場合は、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを供給する能力を人工的に付与した育種株であってもよい。
　親株として用いる微生物としては、例えば、以下の１）及び２）が挙げられる。
１）α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを供給する能力が人工的に付与又は増強された微生物２）α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＬＮＴを供給する能力を人工的に付与又は増強された微生物
　１）及び２）について下記に説明する。
１）α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを供給する能力が人工的に付与又は増強された、親株として用いる微生物
　親株としては、好ましくは、α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを供給する能力を人工的に付与又は増強された微生物が挙げられる。親株として用いる微生物において、ＧＤＰ－フコースを供給する能力を付与又は増強する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
　ＧＤＰ－フコースを供給する能力としては、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力が挙げられる。親株として用いる微生物に、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（１ａ）～（１ｄ）の方法が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（１ａ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（１ｂ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（１ｃ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（１ｄ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の具体例としては、例えば、当該生合成経路の制御に関わる転写調節因子（例えば、ＲｃｓＡ等）による制御機構等、公知の機構が挙げられる。ＲｃｓＡは、ＧＤＰ－フコースを中間体とするコラン酸生合成経路全体をアップレギュレートする調節因子である。後述のようにコラン酸生合成経路のうちＧＤＰ－フコースより下流の経路を遮断した状態でｒｃｓＡを強化することで、ＧＤＰ－フコースを多く蓄積させることができる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の具体例としては、例えば、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への代謝経路等、公知の代謝経路が挙げられる。特にコラン酸生合成経路のうちＧＤＰ－フコースより下流の経路であるＷｃａＪ、ＷｚｘＣ、ＷｃａＫ、ＷｃａＬ又はＷｃａＭを遮断することで、ＧＤＰ－フコースの供給を高め得る。
　親株として用いる微生物は、その細胞膜を横断する外因性Ｌ－フコースの移入を促進するように改変されていてもよい。例えば、ＦｕｃＰをコードする塩基配列（アクセッション番号ＡＩＺ９０１６２）を発現又は過剰発現させることにより、細胞膜を横断する外因性Ｌ－フコースの細胞への取り込みを向上し、これによりＧＤＰ－フコースを生産するためのフコース量を高め得る。
　親株として用いる微生物は、それぞれＬ－フコースイソメラーゼ及びＬ－フクロースキナーゼをコードする遺伝子ｆｕｃＩ及び／又はｆｕｃＫが欠失していて、ｆｕｃＩ及び／又はｆｕｃＫのヌクレオチド配列が対応するポリペプチドの酵素活性を不可逆的に不活性化するように変更されているか、又はｆｕｃＩ及び／又はｆｕｃＫの発現が損なわれているように改変されていてもよい。ＦｕｃＩ及び／又はＦｕｃＫの細胞内合成を消失させると、該細胞におけるフコース代謝が消失し、これによりＧＤＰ－フコースを生産するためのフコースの量を高め得る。
２）α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＬＮＴを供給する能力を人工的に付与又は増強された、親株として用いる微生物
　親株として用いる微生物に、ＬＮＴを供給する能力を人工的に付与する方法としては、例えば、下記（２ａ）～（２ｈ）などの方法を挙げることができ、これらの方法は単独又は組み合わせて用い得る。
（２ａ）糖からＬＮＴを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｂ）糖からＬＮＴを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（２ｃ）糖からＬＮＴを生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｄ）ＬＮＴ又はその基質となる糖を分解する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｅ）ＬＮＴ又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｆ）ＬＮＴ又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｇ）糖からＬＮＴを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
（２ｈ）野生株に比べ、ＬＮＴのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
　糖からＬＮＴを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、グルコース及びラクトースからＬＮＴを生成する生合成経路に関与する、β１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＴという）活性を有する酵素や、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（以下、ｌｇｔＡという）活性を有する酵素等、公知の酵素が挙げられる。
　ＬＮＴ又はその基質となる糖を分解する機構の具体例としては、例えば、ＬＮＴの基質であるラクトースの加水分解を触媒しグルコース及びガラクトースを生成するβ－ガラクトシダーゼ等、公知の酵素が挙げられる。具体的には例えば、ＬＮＴの基質であるラクトースを加水分解するβ－ガラクトシダーゼ（以下、ｌａｃＺという）が挙げられ、ｌａｃＺの活性を喪失させることで、ラクトース供給の低下を抑制できる。
　ＬＮＴ又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素の具体例としては、例えば、ＬＮＴの基質であるラクトースの細胞内取り込みに関与するラクトースパーミアーゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　上記、ＬＮＴを供給する能力を付与又は増強された微生物は、具体的には例えばＬＮＴを供給するために、ラクトースパーミアーゼ（以下、ｌａｃＹという）活性、β１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌＴ）活性、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ｌｇｔＡ）活性、グルタミン・フルクトース－６－リン酸トランスアミナーゼ（以下、ｇｌｍＳという）活性、ホスホグルコサミンムターゼ（以下、ｇｌｍＭという）活性およびＮ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ（以下、ｇｌｍＵという）活性、ホスホグルコムターゼ（以下、ｐｇｍという）活性、ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＵという）活性、ＵＤＰグルコース－４－エピメラーゼ（以下、ｇａｌＥという）活性、ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＦという）活性、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（以下、ｐｇｉという）活性から選ばれる少なくとも１の活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがより好ましい。
　このうち、ｌａｃＹ、ｇａｌＴおよびｌｇｔＡの活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがさらに好ましい。
　ｌａｃＹは、ＬＮＴの基質であるラクトースを細胞内に取り込む膜タンパク質である。ｇａｌＴは、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴＩＩ）からのＬＮＴの生成に関与する酵素である。ＬＮＴはＬＮＦＰＩの前駆体である。ＬｇｔＡは、ラクトースおよびウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃという）からのＬＮＴＩＩの生成に関与する酵素である。ＬＮＴＩＩはＬＮＴの前駆体である。
　ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵは、ＬＮＴＩＩを生成する生合成経路に関与する酵素である。Ｐｇｍ、ｇａｌＵ、ｇａｌＥ、ｇａｌＦは、ウリジン二リン酸ガラクトース（以下、ＵＤＰ－Ｇａｌという）を生成する経路に関与する酵素である。Ｐｇｉは、ＬＮＴＩＩを生成する経路に関与する酵素である。
　微生物がＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを生成し得る微生物であることは、該微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを、後述の糖分析装置または高速液体クロマトグラフ質量分析計等の一般的な手法を用いて検出することにより確認できる。また、標準試料には適宜市販の試料を用い得る。
　本発明の親株として用いる微生物は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを供給する能力が人工的に付与又は増強された微生物であることが好ましい。従って、本発明における１実施形態では、好ましくはｒｃｓＡをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５７７６．１）、マンノース－６－リン酸イソメラーゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５３６１．１）、ホスホマンノムターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０１．１）、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０５．１）、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０９．１）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０８．１）、ｌａｃＹをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７６１２５．１）、ｇａｌＴをコードする塩基配列（配列番号２９）、ｌｇｔＡをコードする塩基配列（配列番号３１）、ｇｌｍＳをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７５５９．１）、ｇｌｍＭをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７２２０．１）、ｇｌｍＵをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７５５８．１）、Ｐｇｍをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３５３３７．１）、ｇａｌＵをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３６１０４．１）、ｇａｌＥをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３５４２１．１）、ｇａｌＦをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５８９６．１）、およびｐｇｉをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７８０２７．１）から選ばれる少なくとも１の塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。
　特に、好ましくはｌａｃＹをコードする塩基配列、ｒｃｓＡをコードする塩基配列、ｇａｌＴをコードする塩基配列およびｌｇｔＡをコードする塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることがより好ましい。本発明の１実施形態において、前記遺伝的に改変された微生物は、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴの産生能が、遺伝的に改変されていない親株に比較して上昇していることが好ましい。
　ｌａｃＹ活性、ｒｃｓＡ活性、ｇａｌＴ活性、ｌｇｔＡ活性、ｇｌｍＳ活性、ｇｌｍＭ活性およびｇｌｍＵ活性、ｐｇｍ活性、ｇａｌＵ活性、ｇａｌＥ活性、ｇａｌＦ活性、ｐｇｉ活性から選ばれる少なくとも１の活性を有している、またはその活性が強化されている微生物を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｓｙｓｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔ，２０２１，１，２９１）等が挙げられる。
　また、親株ではさらに、前述のようにｌａｃＺ活性および／またはコラン酸合成活性が低下又は欠失していることが好ましい。
　従って、本発明の一実施態様では、好ましくはｌａｃＺ活性および／またはコラン酸合成活性が低下または欠失しており、より好ましくはｌａｃＺをコードする塩基配列および／またはコラン酸生成関連蛋白質をコードする塩基配列であるｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子をコードする塩基配列を含まない、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。
　本発明の一実施形態において、前記遺伝的に改変された微生物は、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴの産生能が、遺伝的に改変されていない親株に比較して上昇していることが好ましい。
　β－ガラクトシダーゼ活性および／またはコラン酸合成活性が低下または喪失した大腸菌を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，４１：２３－３８）等が挙げられる。
　親株の微生物に比べ本実施形態の蛋白質の活性が増強された微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該組換え体ＤＮＡのコピー数が増大した微生物が挙げられる。
　本実施形態の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該組換え体ＤＮＡのコピー数が増大した微生物としては、本実施形態の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において該組換え体ＤＮＡのコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）およびエレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］等の方法が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］が挙げられる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
　該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されたこと、または親株の染色体中に組み込まれたことは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法等により確認できる。また、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことは、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較する方法等により確認できる。
　上記の方法で造成した微生物が、本実施形態の蛋白質の活性が増強され、かつ親株に比べてＬＮＦＰＩの生産性が向上した微生物であることは、該微生物の培養後、培養液を適宜希釈後に遠心分離し、上清又は菌体内に含まれるＬＮＦＰＩを後述の糖分析装置または高速液体クロマトグラフ質量分析計にて分析することにより、親株のそれと比較することにより確認できる。また、標準試料には適宜市販の試料を用いることができる。
＜フコース含有糖質の製造方法＞
　本実施形態のフコース含有糖質の製造方法（以下、本製造方法とも略す）としては、上記した本実施形態の形質転換体を調製すること、および該形質転換体を用いて培養物中にオリゴ糖を生成することを含む、フコース含有糖質の製造方法が挙げられる。本製造方法において、フコース含有糖質は、ＬＮＦＰＩであることが好ましい。
　上記した形質転換体を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　本製造方法に用いる形質転換体として、グルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等を生成する能力を有する微生物を用いてもよい。
　本製造方法において、培養中に、グルコース、ラクトースまたはラクトース一水和物等を培地に添加してもよい。
　本製造方法に用いる形質転換体が、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを生成する能力を有していない場合は、ＧＤＰ－フコースやＬＮＴを培地に添加してもよい。
　また、本製造方法において、培養中に、グルコース、ラクトース、ラクトース一水和物、またはＬＮＴ等を培地に添加する代わりに、糖からグルコース、ラクトース、ラクトース一水和物、またはＬＮＴ等を生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にグルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物、またはＬＮＴ等を供給してもよい。
　本製造方法において、培地中にはβ－ガラクトシダーゼおよびＷｃａＪが存在しないことが好ましい。
　培養は、通常、振盪培養、深部通気撹拌培養またはジャーファーメンター等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常３０～３７℃であり、培養時間は、通常２４時間～３日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常６．０～８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　上記の培養により、培養物中にフコース含有糖質を生成することにより、フコース含有糖質を製造できる。
　通常、該培養物の遠心分離後、上清よりフコース含有糖質を採取できる。なお、菌体内にフコース含有糖質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、フコース含有糖質を採取できる。
　また、培養物中のフコース含有糖質又は採取したフコース含有糖質に、さらに他の糖を付加することによっても、所望のフコース含有糖質を製造できる。
［分析例］
　実施例において、ＬＮＦＰＩ及び２’ＦＬの分析、定量は以下に示す手順で行った。培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、培養液上清を回収した。また、沈殿菌体を元培養液と同量の水で懸濁し、さらに等量のクロロホルムを加えて菌体破砕した後に遠心分離し、上清水相を菌体内画分とした。該培養上清と菌体内画分に含まれるＬＮＦＰＩ及び２’ＦＬを糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ　ＰＡ１
カラム温度：２５℃
移動相：　　　　（移動相Ａ）水
　　　　　　　　（移動相Ｂ）５００ｍｍｏｌ／Ｌ　水酸化ナトリウム
　　　　　　　　（移動相Ｃ）３００ｍｍｏｌ／Ｌ　酢酸ナトリウム
移動相Ａ、移動相Ｂ及び移動相Ｃ混合比：
　　　　　　　　（０～１０分）８０：２０：０
　　　　　　　　（１０分～１５分）８０：２０：０から７０：２０：１０の勾配
　　　　　　　　（１５～１７分）７０：２０：１０から０：２０：８０の勾配
　　　　　　　　（１７～２５分）０：２０：８０
　　　　　　　　（２５～３５分）８０：２０：０
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
　以下に発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］各種α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する微生物の造成　
（１）宿主株の造成
＜遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得＞
　配列番号１０２及び１０３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ｐＣａｔＳａｃ（Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１３）７９，３０３３－３０３９）を鋳型としてＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性ｃａｔ遺伝子およびスクロース感受性ｓａｃＢ遺伝子を含む、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を得た。
＜β－ガラクトシダーゼ活性、ラクトースパーミアーゼ活性、及びコラン酸合成活性が喪失した大腸菌の造成＞
　β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＺ遺伝子という。）、ラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＹ遺伝子という。）、及びコラン酸生成関連蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。なお、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ（以下、ｌａｃＺＹという。）、ならびに、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ及びｗｃａＭ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）は大腸菌ゲノム上でそれぞれオペロンを形成している。
　常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｌａｃＺ上流１およびｌａｃＺ上流２は、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ｌａｃＹ下流１およびｌａｃＹ下流２は、ｌａｃＹ遺伝子の終止コドン下流約５０ｂｐから約１０００ｂｐまでの領域を含む。
　ｌａｃＺ上流１、ｌａｃＹ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１０５及び１０７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｌａｃＺ上流２およびｌａｃＹ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１０５及び１０７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺＹを含まず、ｌａｃＺ上流とｌａｃＹ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｌａｃＺＹという。）断片を得た。
　ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＷ３１１０Ｓ３ＧＫ株（ＮＢＲＣ１１４６５７）に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつスクロース感受性を示した形質転換体（ｌａｃＺＹ遺伝子がｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｌａｃＺＹ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつスクロース耐性を示す形質転換体（ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｌａｃＺＹに置換した形質転換体）を得た。それらのうちからさらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０Ｓ３ＧＫΔｌａｃＺＹと命名した。
　同様に、Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｗｃａＪ上流１およびｗｃａＪ上流２は、ｗｃａＪ遺伝子の開始コドンから開始コドン上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ｗｃａＭ下流１およびｗｃａＭ下流２は、ｗｃａＭ遺伝子の終止コドンから終止コドン下流約１０００ｂｐまでの領域を含む。
　ｗｃａＪ上流１、ｗｃａＭ下流１およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１１１及び１１３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭオペロン周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ上流２およびｗｃａＭ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１１１及び１１３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭを含まず、ｗｃａＪ上流とｗｃａＭ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、上記で造成したＷ３１１０Ｓ３ＧＫΔｌａｃＺＹに、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつスクロース感受性を示した形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭがｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつスクロース耐性を示す形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭに置換した形質転換体）を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０Ｓ３ＧＫΔｌａｃＺＹΔｗｃａＪＭと命名した。
＜β１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼの発現を強化した微生物の造成＞
　ｕｓｐＡプロモーター下に、配列番号１２４で表されるアミノ酸配列からなるＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ５５３株由来のβ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、Ｃｖβ３ＧａｌＴという。）をコードする遺伝子、配列番号１２５で表されるＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８由来のβ１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（以下、ＮｐＬｇｔＡという。）をコードする遺伝子及びＷ３１１０株由来のｌａｃＹ遺伝子を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
　表３の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表３の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　配列番号１２２で表されるＤＮＡは、ＡＣＳ　Ｃａｔａｌ．２０１９，９（１２），１０７２１－１０７２６に記載された、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ５５３株由来β１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼＣｖβ３ＧａｌＴをコードする遺伝子の塩基配列を大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号１２３で表されるＤＮＡは、配列番号１２５で表されるＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８株由来β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼＮｐＬｇｔＡをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号１１７及び１１８、配列番号１１９及び１２０で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　Ｃｖβ３ｇａｌＴ断片、ＮｐｌｇｔＡ断片およびｌａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１１６及び１２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、Ｃｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹという。）断片を得た。
　配列番号１２６及び１２７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、プラスミドｐＵＡＫＱＥ３１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．７ｋｂのベクター断片を得た。配列番号１１６及び１２６、配列番号１２１及び１２７で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたＣｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＵＡＫＱＥ－Ｃｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹを得た。上記、発現プラスミドｐＵＡＫＱＥ－Ｃｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹを用いて、上記で造成したＷ３１１０Ｓ３ＧＫΔｌａｃＺＹΔｗｃａＪＭ株を形質転換することで、ｐＵＡＫＱＥ－Ｃｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹを有する大腸菌を造成し、ＮＮＮ株と命名した。
（２）α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する微生物の造成
＜発現ベクターの造成＞
　上記（１）で造成したＮＮＮ株を用いて、ｌａｃプロモーター下に各種α１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Ｗ３１１０株由来のｒｃｓＡを配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
　配列番号１３２及び１３３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして常法により調製したＷ３１１０株を鋳型としてＰＣＲを行い、ｒｃｓＡ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）を鋳型に、配列番号１３４及び１３５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、約２．９ｋｂのベクター断片を得た。このとき、配列番号１３２及び１３４、配列番号１３３及び１３５で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。上記で得られたｒｃｓＡ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現ベクターｐＳＴＶ－ｒｃｓＡを得た。
＜点変異の導入によるα１，２－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミドの造成＞
　ＦｓＦｕｃＴ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．　ＦＳＣ１００６株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼ）に点変異を導入した。
鋳型となる発現ベクターｐＦｓＦｕｃＴの作製方法は次の通りとした。表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　配列番号４６で表されるＤＮＡは、配列番号６３で表されるＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．　ＦＳＣ１００６株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｓＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　上記で造成した発現ベクターｐＳＴＶ２９－ｒｃｓＡを鋳型として、配列番号１３６及び１３７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、約３．５ｋｂのベクター断片を得た。
　配列番号１２８及び１２９で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　得られた増幅ＤＮＡ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミドｐＦｓＦｕｃＴを造成した。
　ｐＦｓＦｕｃＴを鋳型とし、表５の各種プライマーセットで表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲに供した。得られたベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、ＦｓＦｕｃＴの遺伝子配列に点変異を導入した表５に記載の各種造成プラスミド、すなわち、α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する各種プラスミドを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜＜合成ＤＮＡを用いたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミドの造成＞＞
　表６の「合成ＤＮＡ」で表されるＤＮＡを鋳型、「プライマーセット１」の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲに供し、増幅ＤＮＡ断片を得た。表６の「テンプレートプラスミド」で表されるプラスミドを鋳型、「プライマーセット２」の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲに供し、線状化ベクター断片を得た。得られた増幅ＤＮＡ断片及び線状化ベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）により連結することで、表６に記載の各種造成プラスミド、すなわち、α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する各種プラスミドを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　＜＜α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する大腸菌の造成＞＞
　上記（１）で造成したＮＮＮ株を、表５及び表６に示される各種「造成プラスミド」及びｐＦｓＦｕｃＴで形質転換することで、各種α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する組換え大腸菌及び対照株ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株を得た。各組換え大腸菌が発現するα１，２－フコシルトランスフェラーゼについて、配列番号６３で表されるアミノ酸配列からの変異点について、表７に示す。
　表７における表記について、下記に説明する。
Ｙ１５９Ｆ：１５９位相当位置におけるＹがＦに置換されていることを示す。その他の位置の変異についても同様に表す。
Ｄ１７２＿Ｙ１７３ｉｎｓＬＴＡ：１７２位相当位置ではＤ、１７３位相当位置ではＹであり、１７２位相当位置と１７３位相当位置との間にＬ、Ｔ及びＡが挿入されていることを示す。その他の位置の変異についても同様に表す。
Ｄ１６７＿Ｉ１６８ｉｎｓＩＨＧ：１６７位相当位置ではＤ、１６８位相当位置ではＩであり、１６７位相当位置と１６８位相当位置との間にＩ、Ｈ及びＧが挿入されていることを示す。
Ｉ２６７ｄｅｌ：２６７位相当位置のＩが欠失していることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜ＬＮＦＰＩ、２’ＦＬの生産性評価（試験管）＞
　実施例１で得られたα１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する組換え大腸菌及び対照株ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地２ｍＬが入ったプラスチック製試験管に植菌して３０℃、１４～１７時間、振盪培養した。
　その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物１０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物、硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が４ｍＬ入った大型試験管に０．２ｍＬ植菌し、３０℃で震盪培養した。植菌から５時間後にＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加し、さらに２４時間（計２９時間）震盪培養した。
　培養終了後、培養液を遠心分離後適宜希釈し、上清及び菌体内に含まれる２’ＦＬ及びＬＮＦＰ１を分析した。その結果を表８に示す。表８において、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株は単にＦｓＦｕｃＴと表す。また、ＬＮＦＰ１の合計量（ｇ／Ｌ）を表すグラフを図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８及び図３に示すように、ＬＮＦＰの生産が見られたすべての株において、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株と比較して２’ＦＬ生産が低下した。また、Ｓ１～Ｓ３、Ｓ５及びＳ９～１４について、ＬＮＦＰの生産量が０．４ｇ／Ｌ以上であり、且つＬＮＦＰＩの生産量に対する２’ＦＬの生産量の比が低下していた。特に、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ９、Ｓ１０及びＳ１４株においてはＬＮＦＰＩの生産量に対する２’ＦＬの生産量の比が顕著に低下していることから、これらの株で発現されるα１，２－フコシルトランスフェラーゼのＬＮＴに対する基質選択性が特に向上していることが示された。
　このうち、顕著な２’ＦＬ生産の抑制がみられ、かつＬＮＦＰＩ生産がＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株と同等であったＳ３及びＳ９株を、ＬＮＦＰＩ生産に有効なα１，２－フコシルトランスフェラーゼ候補として選定した。
［実施例２］Ｊａｒ評価
　実施例１の＜ＬＮＦＰＩ、２’ＦＬの生産性評価（試験管）＞で選定したＳ３株及びＳ９株並びに対照株ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株を、それぞれ１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上にて３０℃で２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む培地［酵母エキス５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ］が６５ｍＬ入った３００ｍＬバッフル付き三角フラスコに植菌して３０℃で１６時間、振盪培養した。
　その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む生産培地［グルコース一水和物２２ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物０．２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、（グルコース、硫酸第一鉄七水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が７６０ｍＬ入った３Ｌジャーファーメンター（ミツワフロンテック社製）に４０ｍＬ植菌し、３０℃、８００ｒｐｍで計７２時間撹拌培養した。２０％アンモニア水を添加して培養中ｐＨを６．９に調整した。
　植菌から２４時間後にＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加し、以降の培養においては、４８０ｇ／Ｌグルコース一水和物及び４０ｇ／Ｌのラクトース一水和物溶液を５～７ｍＬ／ｈの速度で添加した。
　培養終了後、培養液を遠心分離後適宜希釈し、上清及び菌体内に含まれる２’ＦＬ及びＬＮＦＰ１を分析した。その結果を表９に示す。表９において、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株は単にＦｓＦｕｃＴと表す。また、ＬＮＦＰ１の合計量（ｇ／Ｌ）を表すグラフを図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９及び図４に示すように、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株と比較して、Ｓ３株、Ｓ９株ともに２’ＦＬの生産が抑制され、ＬＮＦＰＩ生産が増加した。特に、Ｓ３株はＬＮＦＰＩの生産量に対する２’ＦＬの生産量が０．２％と２’ＦＬの副生が大幅に低減されていたことから、ＬＮＴを基質として優先的に使用できることが示唆された。
　図２は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．ＦＳＣ１００６由来ＦｕｃＴ（ＦｓＦｕｃＴ）、Ｓ３のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。Ｓ３のα１，２－フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、ＦｓＦｕｃＴの１６１～１７２番目のアミノ酸残基をＡｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（アンフリテア・ジャポニカ）由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼの配列モチーフ（図２中網掛けで表示）に置換したものである（図２）。このことから、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（アンフリテア・ジャポニカ）由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼの配列モチーフがＬＮＴ選択性向上に寄与していることを見出した。
［実施例３］ＦｕｃＴホモログにおけるＡｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ由来配列モチーフの評価
（１）ＦｕｃＴホモログ発現ベクターの造成
　表１０の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１０の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　配列番号９０で表されるＤＮＡは、配列番号９４で表されるＳｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ　ＥＳ－１１（シデロキシダンス・リトトロピクスＥＳ－１１）由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ（国際公開第２０１９／００８１３３号）（ＦｕｃＴ５４）をコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号９１で表されるＤＮＡは、配列番号９５で表されるＮｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ＮｂＦｕｃＴ１）をコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　実施例１と同様に、得られた各増幅ＤＮＡ断片と発現ベクターｐＳＴＶ２９－ｒｃｓＡを鋳型として増幅したベクター断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミドｐＮｂＦｕｃＴ１及びｐＦｕｃＴ５４を造成した。
（２）配列モチーフを有するＦｕｃＴホモログ発現ベクターの造成
　ＦｕｃＴ５４及びＮｂＦｕｃＴ１に配列モチーフを導入したＦｕｃＴを発現するベクターをそれぞれ造成した。
　表１１の「合成ＤＮＡ」で表されるＤＮＡを鋳型、「プライマーセット１」の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲに供し、増幅ＤＮＡ断片を得た。表１１の「テンプレートプラスミド」で表されるプラスミドを鋳型、「プライマーセット２」の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲに供し、線状化ベクター断片を得た。得られた増幅ＤＮＡ断片及び線状化ベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）により連結することで、表１１の「造成プラスミド」に示される、各α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミドを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（２）α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する大腸菌の造成
　上記で得られた各α１，２－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミドを用い、実施例１（１）で造成したＮＮＮ株を形質転換することで、各プラスミドを有する組換え大腸菌を造成し、Ａ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘ株、Ｆ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ１株及びＮＮＮ／ｐＦｕｃＴ５４株と命名した。各組換え大腸菌が発現するα１，２－フコシルトランスフェラーゼについて、配列番号９４または配列番号９５で表されるアミノ酸配列からの変異点について、表１２に示す。
　表１２における表記について、下記に説明する。
クローン名Ａ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘにおける、Ｎ１７０Ｔ：配列番号９４で表されるアミノ酸配列における１７０位のＮがＴに置換されていることを示す。その他の位置の変異についても同様に表す。
クローン名Ｆ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘにおける、Ｎ１６０Ｔ：配列番号９５で表されるアミノ酸配列における１６０位のＮがＴに置換されていることを示す。その他の位置の変異についても同様に表す。
クローン名Ｆ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘにおける、Ｎ１６０＿Ｈ１６１ｉｎｓＤＬＳＡ：Ｎ１６０とＨ１６１の間にＤＬＳＡが挿入されていることを示す。　クローン名Ｆ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘにおける、Ｇ１６５ｄｅｌ：Ｇ１６５が欠失していることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（３）生産性評価
　Ａ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘ株、Ｆ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘ株、実施例１で造成したＳ３株、対照株ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ１株及びＮＮＮ／ｐＦｕｃＴ５４株を、それぞれ１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上にて３０℃で２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む培地［酵母エキス５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ］が６５ｍＬ入った３００ｍＬバッフル付き三角フラスコに植菌して３０℃で１６．５時間、振盪培養した。
　その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む生産培地［グルコース一水和物２２ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物０．２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、（グルコース、硫酸第一鉄七水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が７６０ｍＬ入った３Ｌジャーファーメンター（ミツワフロンテック社製）に４０ｍＬ植菌し、３０℃、８００ｒｐｍで計７２時間撹拌培養した。２０％アンモニア水を添加して培養中ｐＨを６．９に調整した。
　植菌から２４時間後にＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加し、以降の培養においては、４８０ｇ／Ｌグルコース溶液及び４０ｇ／Ｌのラクトース一水和物を５～７ｍＬ／ｈの速度で添加した。
　培養終了後、培養液を遠心分離後に適宜希釈し、上清及び菌体内に含まれる２’ＦＬ及びＬＮＦＰ１を分析した。その結果を表１３に示す。また、ＬＮＦＰ１の合計量（ｇ／Ｌ）を表すグラフを図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１３及び図５に示すように、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ１株及びＮＮＮ／ｐＦｕｃＴ５４株と比較して、Ｓ３株、Ａ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘ株及びＦ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘ株では２’ＦＬ生産が著しく抑制され、ＬＮＦＰＩ生産が増加した。
　このことから、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（アンフリテア・ジャポニカ）由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼの配列モチーフは、α１，２－フコシルトランスフェラーゼの由来によらず、ＬＮＴに対する基質選択性の向上に広く有効であることが見出された。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２３年６月５日付けで出願された日本特許出願（特願２０２３－０９２６４２）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号１～３７：プライマーの塩基配列　
配列番号３８：Ｎｏ．１の塩基配列
配列番号３９：Ｎｏ．２の塩基配列
配列番号４０：Ｎｏ．３の塩基配列
配列番号４１：Ｎｏ．４の塩基配列
配列番号４２：Ｎｏ．５の塩基配列
配列番号４３：Ｎｏ．６の塩基配列
配列番号４４：Ｎｏ．７の塩基配列
配列番号４５：Ｎｏ．２７の塩基配列
配列番号４６：ＦｓＦｕｃＴの塩基配列
配列番号４７：Ｓ１の塩基配列
配列番号４８：Ｓ２の塩基配列
配列番号４９：Ｓ３の塩基配列
配列番号５０：Ｓ４の塩基配列
配列番号５１：Ｓ５の塩基配列
配列番号５２：Ｓ６の塩基配列
配列番号５３：Ｓ７の塩基配列
配列番号５４：Ｓ８の塩基配列
配列番号５５：Ｓ９の塩基配列
配列番号５６：Ｓ１０の塩基配列
配列番号５７：Ｓ１１の塩基配列
配列番号５８：Ｓ１２の塩基配列
配列番号５９：Ｓ１３の塩基配列
配列番号６０：Ｓ１４の塩基配列
配列番号６１：Ｓ１５の塩基配列
配列番号６２：ｒｃｓＡの塩基配列　
配列番号６３：ＦｓＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号６４：Ｓ１のアミノ酸配列
配列番号６５：Ｓ２のアミノ酸配列
配列番号６６：Ｓ３のアミノ酸配列
配列番号６７：Ｓ４のアミノ酸配列
配列番号６８：Ｓ５のアミノ酸配列
配列番号６９：Ｓ６のアミノ酸配列
配列番号７０：Ｓ７のアミノ酸配列
配列番号７１：Ｓ８のアミノ酸配列
配列番号７２：Ｓ９のアミノ酸配列
配列番号７３：Ｓ１０のアミノ酸配列
配列番号７４：Ｓ１１のアミノ酸配列
配列番号７５：Ｓ１２のアミノ酸配列
配列番号７６：Ｓ１３のアミノ酸配列
配列番号７７：Ｓ１４のアミノ酸配列
配列番号７８：Ｓ１５のアミノ酸配列
配列番号７９：ｒｃｓＡのアミノ酸配列
配列番号８０～８７：プライマーの塩基配列
配列番号８８：ＳＡ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘの塩基配列
配列番号８９：ＳＦ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘの塩基配列
配列番号９０：ＦｕｃＴ５４の塩基配列
配列番号９１：ＮｂＦｕｃＴ１の塩基配列
配列番号９２：Ａ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘの塩基配列
配列番号９３：Ｆ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘの塩基配列
配列番号９４：ＦｕｃＴ５４の塩基配列
配列番号９５：ＮｂＦｕｃＴ１の塩基配列
配列番号９６：Ａ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘのアミノ酸配列
配列番号９７：Ｆ＿Ｈ　ｈｅｌｉｘのアミノ酸配列
配列番号９８：Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ由来ＡｊＦｕｃＴの部分配列であるアミノ酸配列
配列番号９９：Ｓｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ由来ＳｂＦｕｃＴの部分配列であるアミノ酸配列
配列番号１００：ＡｊＦｕｃＴの塩基配列
配列番号１０１：ＡｊＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号１０２～１２１：プライマーの塩基配列
配列番号１２２：Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ５５３由来Ｃｖβ３ｇａｌＴの塩基配列
配列番号１２３：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８由来ＮｐｌｇｔＡの塩基配列
配列番号１２４：Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ５５３由来Ｃｖβ３ｇａｌＴのアミノ酸配列
配列番号１２５：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８由来ＮｐｌｇｔＡのアミノ酸配列
配列番号１２６：ｒｃｓＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１２７：ｒｃｓＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１２８、１２９：プライマーの塩基配列
配列番号１３０：Ｓ５’の塩基配列
配列番号１３１：Ｓｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ由来ＳｂＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号１３２～１４１：プライマーの塩基配列

Claims (16)

  1. 　ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）へのフコシル基転移活性を有する蛋白質であって、
    　以下の［１］及び［２］の少なくとも一方の変異が導入された蛋白質（変異導入前後の蛋白質を構成するアミノ酸配列が同一となるものは除く）。
    ［１］配列番号９８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挿入される変異
    ［２］配列番号９９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挿入される変異
  2. 　配列番号６３、９４及び９５の少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の全長配列同一性を有するアミノ酸配列において、前記［１］及び［２］の少なくとも一方の変異が導入された蛋白質である、請求項１に記載の蛋白質。
  3. 　前記［１］の変異は、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質において基質との相互作用に寄与する領域に対応する箇所に導入された変異であり、
    　前記［２］の変異は、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質において基質との相互作用に寄与する領域に対応する箇所に導入された変異である、
    請求項１又は２に記載の蛋白質。
  4. 　前記基質との相互作用に寄与する領域が、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６２位から１７６位に対応するアミノ酸配列である、請求項３に記載の蛋白質。
  5. 　前記［１］の変異は、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６２位から１７６位に対応するアミノ酸配列が配列番号９８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列に置換される変異であり、
    　前記［２］の変異は、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６８位から１８４位に対応するアミノ酸配列が配列番号９９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列に置換される変異である、
    請求項１～４のいずれか１項に記載の蛋白質。
  6. 　前記［１］の変異は、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６２位から１７６位に相当する位置における下記［１ａ］～［１о］から選ばれる少なくとも１の変異であり、
    　前記［２］の変異は、配列番号１３１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１６８位から１８４位に相当する位置における下記［２ａ］～［２ｑ］から選ばれる少なくとも１の変異である、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の蛋白質。
    ［１ａ］１６２位相当位置では、スレオニンである
    ［１ｂ］１６３位相当位置では、アスパラギン酸である
    ［１ｃ］１６４位相当位置では、ロイシンである
    ［１ｄ］１６５位相当位置では、セリンである
    ［１ｅ］１６６位相当位置では、アラニンである
    ［１ｆ］１６７位相当位置では、アスパラギンである
    ［１ｇ］１６８位相当位置では、アスパラギンである
    ［１ｈ］１６９位相当位置では、イソロイシンである
    ［１ｉ］１７０位相当位置では、ヒスチジンである
    ［１ｊ］１７１位相当位置では、グリシンである
    ［１ｋ］１７２位相当位置では、イソロイシンである
    ［１ｌ］１７３位相当位置では、システインである
    ［１ｍ］１７４位相当位置では、セリンである
    ［１ｎ］１７５位相当位置では、グルタミン酸である
    ［１о］１７６位相当位置では、グルタミン酸である
    ［２ａ］１６８位相当位置では、フェニルアラニンである
    ［２ｂ］１６９位相当位置では、バリンである
    ［２ｃ］１７０位相当位置では、グルタミンである
    ［２ｄ］１７１位相当位置では、アスパラギン酸である
    ［２ｅ］１７２位相当位置では、プロリンである
    ［２ｆ］１７３位相当位置では、バリンである
    ［２ｇ］１７４位相当位置では、バリンである
    ［２ｈ］１７５位相当位置では、アルギニンである
    ［２ｉ］１７６位相当位置では、アルギニンである
    ［２ｊ］１７７位相当位置では、バリンである
    ［２ｋ］１７８位相当位置では、ヒスチジンである
    ［２ｌ］１７９位相当位置では、グリシンである
    ［２ｍ］１８０位相当位置では、バリンである
    ［２ｎ］１８１位相当位置では、アスパラギン酸である
    ［２о］１８２位相当位置では、ロイシンである
    ［２ｐ］１８３位相当位置では、スレオニンである
    ［２ｑ］１８４位相当位置では、アラニンである
  7. 　ＬＮＴへのフコシル基転移活性を有する蛋白質であって、
    　配列番号６３で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その７位、４２位、９４位、９５位、１５９から１７３位、２５９位、２６０位及び２６２位から２７０位に相当する各位置における下記（１）～（３１）から選ばれる少なくとも１の変異が導入され、且つ前記変異導入前の蛋白質に比べてＬＮＴへのフコシル基転移活性が高い、蛋白質。
    （１）７位相当位置では、アラニン又はセリンである
    （２）４２位相当位置では、イソロイシンである
    （３）９４位相当位置では、ヒスチジンである
    （４）９５位相当位置では、チロシンである
    （５）１５９位相当位置では、フェニルアラニンである
    （６）１６０位相当位置では、バリンである
    （７）１６１位相当位置では、グルタミン又はスレオニンである
    （８）１６２位相当位置では、アスパラギン酸又はアスパラギンである
    （９）１６３位相当位置では、ロイシンである
    （１０）１６４位相当位置では、イソロイシン、リシン、セリン又はバリンである
    （１１）１６５位相当位置では、アラニン又はバリンである
    （１２）１６６位相当位置では、アルギニン又はアスパラギンである
    （１３）１６７位相当位置では、アルギニン又はアスパラギンである
    （１４）１６８位相当位置では、バリンである
    （１５）１６７位相当位置ではアスパラギン酸、１６８位相当位置ではイソロイシンであり、且つ１６７位相当位置と１６８位相当位置との間において、イソロイシン、ヒスチジン及びグリシンが挿入されている
    （１６）１６９位相当位置では、ヒスチジンである
    （１７）１７０位相当位置では、ロイシン、グリシン又はセリンである
    （１８）１７１位相当位置では、スレオニン、バリン又はグルタミン酸である
    （１９）１７２位相当位置では、グルタミン酸又はアラニンである
    （２０）１７２位相当位置ではアスパラギン酸、１７３位相当位置ではチロシンであり、且つ１７２位相当位置と１７３位相当位置との間において、ロイシン、スレオニン及びアラニンが挿入されている
    （２１）２５９位相当位置では、リシンである
    （２２）２６０位相当位置では、グルタミンである
    （２３）２６２位相当位置では、ヒスチジンである
    （２４）２６３位相当位置では、リシンである
    （２５）２６４位相当位置では、バリンである
    （２６）２６５位相当位置では、アルギニンである
    （２７）２６６位相当位置では、アスパラギン酸である
    （２８）２６７位相当位置では、フェニルアラニンである
    （２９）２６８位相当位置では、アスパラギン酸である
    （３０）２６９位相当位置では、スレオニンである
    （３１）２７０位相当位置では、アルギニンである
  8. 　配列番号６３、９４及び９５の少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の全長配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号６３で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その７位、４２位、９４位、９５位、１５９から１７３位、２５９位、２６０位及び２６２位から２７０位の各位置に相当する位置に前記（１）～（３１）から選ばれる少なくとも１の変異が導入された蛋白質である、請求項７に記載の蛋白質。
  9. 　配列番号６３で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その７位、４２位、９４位、９５位、１５９から１７３位、２５９位、２６０位及び２６２位から２７０位の各位置に相当する位置に導入された前記変異が、下記［３］～［１２］のいずれか１である、請求項７又は８に記載の蛋白質。
    ［３］１５９位相当位置では、フェニルアラニンであり、
    　１６０位相当位置では、バリンであり、
    　１６１位相当位置では、グルタミンであり、
    　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　１６４位相当位置では、バリンであり、
    　１６５位相当位置では、バリンであり、
    　１６６位相当位置では、アルギニンであり、
    　１６７位相当位置では、アルギニンであり、
    　１６８位相当位置では、バリンであり、
    　１６９位相当位置では、ヒスチジンであり、
    　１７０位相当位置では、グリシンであり、
    　１７１位相当位置では、バリンであり、
    　１７２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　１７３位相当位置では、チロシンであり、
    　１７２位相当位置と１７３位相当位置との間に、ロイシン、チロシン及びアラニンが挿入されている。
    ［４］９４位相当位置ではヒスチジンであり、
    　９５位相当位置では、チロシンであり、
    　１５９位相当位置では、フェニルアラニンであり、
    　１６０位相当位置では、バリンであり、
    　１６１位相当位置では、グルタミンであり、
    　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　１６４位相当位置では、バリンであり、
    　１６５位相当位置では、バリンであり、
    　１６６位相当位置では、アルギニンであり、
    　１６７位相当位置では、アルギニンであり、
    　１６８位相当位置では、バリンであり、
    　１６９位相当位置では、ヒスチジンであり、
    　１７０位相当位置では、グリシンであり、
    　１７１位相当位置では、バリンであり、
    　１７２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　１７３位相当位置では、チロシンであり、
    　１７２位相当位置と１７３位相当位置との間に、ロイシン、チロシン及びアラニンが挿入されており、
    　２５９位相当位置では、リシンであり、
    　２６０位相当位置では、グルタミンであり、
    　２６３位相当位置では、リシンであり、
    　２６４位相当位置では、バリンであり、
    　２６５位相当位置では、アルギニンであり、
    　２６６位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　２６７位相当位置では、フェニルアラニンであり、
    　２６８位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　２６９位相当位置では、スレオニンであり、
    　２７０位相当位置では、アルギニンである。
    ［５］１６１位相当位置では、スレオニンであり、
    　１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　１６３位相当位置では、ロイシンであり、
    　１６４位相当位置では、セリンであり、
    　１６５位相当位置では、アラニンであり、
    　１６６位相当位置では、アスパラギンであり、
    　１６７位相当位置では、アスパラギンであり、
    　１６７位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　１６８位相当位置では、イソロイシンであり、
    　１６７位相当位置と１６８位相当位置との間にイソロイシン、ヒスチジン及びグリシンが挿入されており、
    　１７０位相当位置では、セリンであり、
    　１７１位相当位置では、グルタミン酸であり、
    　１７２位相当位置では、グルタミン酸である。
    ［６］１６４位相当位置では、イソロイシンである。
    ［７］１６２位相当位置では、アスパラギン酸であり、
    　１６４位相当位置では、リシンである。
    ［８］２６２位相当位置では、ヒスチジンである。
    ［９］４２位相当位置では、イソロイシンである。
    ［１０］１６２位相当位置では、アスパラギンである。
    ［１１］７位相当位置では、セリンである。
    ［１２］７位相当位置では、アラニンである。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
  11. 　請求項１０に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
  12. 　請求項１１に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  13. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、請求項１２に記載の形質転換体。
  14. 　前記微生物が大腸菌である、請求項１３に記載の形質転換体。
  15. 　請求項１３～１４のいずれか１項に記載の形質転換体を調製すること、及び該形質転換体を用いて培養物中にフコース含有糖質を生成することを含む、フコース含有糖質の製造方法。
  16. 　前記フコース含有糖質がラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）である、請求項１５に記載の製造方法。
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