WO2024253424A1 - 인간 trem2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인간 trem2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024253424A1
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heavy chain
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임현호
황준모
박소라
최소영
이세라
김상길
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Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology
Osong Medical Innovation Foundation
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Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology
Osong Medical Innovation Foundation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a humanized antibody that specifically binds to human TREM2 (Triggering receptor expressed on myeloid cells 2) protein and uses thereof.
  • human TREM2 Triggering receptor expressed on myeloid cells 2
  • TREM2 Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 is a receptor that transmits signals through an adapter protein called DAP12. It is known to regulate myeloid cell function and suppresses inflammatory responses by inhibiting the expression of cytokines, confirming that TREM2 is involved in immune regulation.
  • the TREM2 protein is mainly present in microglia and has been found to play an important role in phagocytosis of dementia target factors, amyloid-beta, processing of damaged neurons, and maintaining immune cell homeostasis.
  • TREM2 is a cell membrane protein, so it is difficult to purify it in its original intact form within the cell while maintaining its original function within the cell as much as possible, and antibodies that can specifically detect TREM2 protein are also insufficiently developed.
  • mice used to produce monoclonal antibodies.
  • non-human antibodies such as mouse-derived monoclonal antibodies are considered foreign antigens in the human body, so they induce an immune response and have a short half-life, which limits their therapeutic effect.
  • humanized antibodies have been developed in which only the antigen-binding portion of the antibody is replaced with a human antibody.
  • the currently used method of replacing a mouse antibody with a humanized antibody is to select the most similar human antibody gene for the antibody to be replaced, and replace only the CDR portion of the mouse antibody with the human antibody CDR position using a method called CDR grafting.
  • Such humanized antibodies have the advantage of reducing the immune response in the human body because most of the genes are humanized.
  • the purpose of the present invention is to provide a humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human TREM2 protein.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof, a recombinant expression vector comprising the nucleic acid molecule, and an isolated cell transformed with the recombinant expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for detecting human TREM2 antigen comprising the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof as an effective ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof as an effective ingredient.
  • the present invention provides a heavy chain variable region comprising any one heavy chain FR1 selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, a heavy chain CDR1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a heavy chain FR2 selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a heavy chain FR3 selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a heavy chain CDR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and a heavy chain FR1 selected from the group consisting
  • the present invention provides a humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human TREM2 protein, comprising: a light chain variable region comprising a light chain FR1 selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, a light chain CDR1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a light chain FR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, a light chain CDR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, a light chain FR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 23, a light chain CDR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, and a light chain FR4 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • a light chain variable region comprising a light chain FR1 selected from the group consisting of an amino acid
  • the present invention also provides a nucleic acid molecule encoding the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising the nucleic acid molecule.
  • the present invention provides an isolated cell transformed with the recombinant expression vector.
  • the present invention provides a composition for detecting human TREM2 antigen comprising the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to a humanized antibody that specifically binds to human TREM2 protein and a use thereof, and a humanized antibody was produced by grafting complementarity determining regions (CDRs) corresponding to antigen-binding sites of a variable region of a mouse antibody onto a human germline-derived sequence using a CDR grafting technique, thereby securing a humanized antibody that specifically binds to TREM2.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the obtained humanized antibody was confirmed to have antigen-binding ability and biological activity, and an IgG1-type chimeric antibody was produced by converting it into IgG2 and IgG4 types, and its antigen-binding ability and biological activity were confirmed.
  • the present invention has high affinity for TREM2, it is possible to develop an antibody-based diagnostic system capable of diagnosing TREM2 as a biomarker for various Alzheimer's dementias.
  • the existing Alzheimer's treatment drugs are symptom-relieving drugs that temporarily regulate neurotransmitters, it is thought that the development of an antibody targeting TREM2 will lead to the development of a promising new drug with a practical therapeutic effect.
  • Figure 1 shows the SE-HPLC analysis results of chimeric antibody proteins.
  • Figure 2 shows the results of SDS-PAGE gel analysis and SE-HPLC analysis of humanized antibody proteins.
  • Figure 3 shows the results of evaluating the binding affinity of TREM2-binding antibodies to human TREM2.
  • Figure 4 shows the results of the Humanness score analysis of humanized antibodies.
  • Figure 5 shows the results of in silico immunogenicity prediction analysis of humanized antibodies.
  • Figure 6 shows the results of efficacy verification of chimeric and humanized antibodies.
  • Figure 7 shows the results of efficacy verification of chimeric antibodies converted to IgG2 and IgG4 forms.
  • the present invention relates to a heavy chain variable region comprising: a heavy chain FR1 selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, a heavy chain CDR1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a heavy chain FR2 selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a heavy chain FR3 selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a heavy chain CDR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and a heavy chain FR4 comprising an
  • the present invention provides a humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human TREM2 (Triggering receptor expressed on myeloid cells 2) protein, wherein the light chain variable region comprises: a light chain FR1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, a light chain CDR1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a light chain FR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, a light chain CDR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, a light chain FR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 23, a light chain CDR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, and a light chain FR4 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • the light chain variable region comprises: a light chain FR1 comprising an amino acid sequence
  • the humanized antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the human TREM2 protein comprises: 1) a heavy chain variable region comprising a heavy chain FR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a heavy chain FR2 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a heavy chain CDR2 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a heavy chain FR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, a heavy chain CDR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and a heavy chain FR4 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 2) a heavy chain FR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, a heavy chain CDR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a heavy chain FR2 consisting of an amino acid sequence represented by an amino acid
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain FR4 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 3) a heavy chain FR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a heavy chain FR2 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, a heavy chain CDR2 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a heavy chain FR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, a heavy chain CDR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and a heavy chain FR4 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and 4) a heavy chain variable region comprising a heavy chain FR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, a heavy chain CDR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a heavy chain FR2 consisting of an amino
  • a humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof characterized in that it comprises any one light chain variable region selected from the group consisting of a light chain FR4 comprising a sequence and 3) a light chain FR1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, a light chain CDR1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a light chain FR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, a light chain CDR2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, a light chain FR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, a light chain CDR3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, and a light chain FR4 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, but is not limited thereto.
  • the term “antibody” refers to a protein molecule that acts as a receptor that specifically recognizes an antigen, including an immunoglobulin molecule that immunologically has reactivity with a specific antigen, and examples thereof may include a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a full-length antibody, and an antibody fragment.
  • the term “antibody” may include a bivalent or dual specific molecule (e.g., a bispecific antibody), a diabody, a triabody, or a tetrabody.
  • the term “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from a substantially identical antibody population, and such monoclonal antibodies exhibit single binding affinity and binding specificity for a specific epitope, unlike polyclonal antibodies that can bind to multiple epitopes.
  • the term “full-length antibody” has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain being connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types and has gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1), and alpha 2 ( ⁇ 2) as subclasses.
  • the light chain constant region has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • IgG has subtypes, including IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • chimeric antibody in the present invention is an antibody obtained by recombining the variable region of a mouse antibody and the constant region of a human antibody, and is an antibody with a greatly improved immune response compared to a mouse antibody.
  • humanized antibody means an antibody in which all or part of the CDR sequence of a mouse monoclonal antibody is grafted onto a human antibody, and for example, the CDRs of a mouse monoclonal antibody are recombined with FRs derived from a human antibody to produce a humanized variable region, which is then recombined with the constant region of a desired human antibody to produce the antibody.
  • FRs derived from a human antibody
  • humanized variable region which is then recombined with the constant region of a desired human antibody to produce the antibody.
  • a humanized antibody is an antibody whose amino acid sequence is altered, and the amino acid sequence of the antibody can be reconstructed according to the desired purpose.
  • variable region modifications in the variable region are performed to increase the binding ability and affinity of the antigen, whereas modifications in the constant region are performed to increase intracellular functions such as fixation of complement, interaction with the membrane, and functions of other effectors.
  • the term “heavy chain” may include both a full-length heavy chain and fragments thereof, comprising a variable region VH and three constant regions CH1, CH2 and CH3, which include an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen.
  • the term “light chain” in the present invention may include both a full-length light chain and fragments thereof, comprising a variable region VL and a constant region CL, which include an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen.
  • fragment In the present invention, the terms “fragment,” “antibody fragment,” and “antigen-binding fragment” are used interchangeably to refer to any fragment of an antibody of the present invention that retains the antigen-binding function of the antibody.
  • exemplary antigen-binding fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', F(ab')2, and Fv.
  • the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention may include not only the sequences of the antibodies described herein, but also biological equivalents thereof, to the extent that they can exhibit the ability to specifically bind to human TREM2.
  • additional changes may be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the antibody.
  • Such changes may include, for example, deletions, insertions, and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • Such amino acid mutations are made based on the relative similarity of the amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • arginine, lysine, and histidine are all positively charged residues; alanine, glycine, and serine have similar sizes; and phenylalanine, tryptophan, and tyrosine have similar shapes. Accordingly, based on this advantage, arginine, lysine, and histidine; alanine, glycine, and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • the present invention also provides a nucleic acid molecule encoding the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • nucleic acid molecule has a comprehensive meaning including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic structural units in nucleic acid molecules, include not only natural nucleotides but also analogues in which sugar or base moieties are modified.
  • sequence of a nucleic acid molecule encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may be modified, and the modifications include addition, deletion, or non-conservative or conservative substitution of nucleotides.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising the nucleic acid molecule.
  • vector means a self-replicating DNA molecule used to carry a clone gene (or other piece of clone DNA).
  • the “expression vector” means a recombinant DNA molecule including a target coding sequence and an appropriate nucleic acid sequence essential for expressing the coding sequence operably linked in a specific host organism.
  • the expression vector may preferably include one or more selectable markers.
  • the markers are nucleic acid sequences having characteristics that can be selected, typically by a chemical method, and include all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples thereof include, but are not limited to, antibiotic resistance genes such as Ampicillin, Kanamycin, Geneticin (G418), Bleomycin, Hygromycin, and Chloramphenicol, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • any of a wide variety of expression control sequences may be used in the vector to express the DNA sequence of the present invention.
  • useful expression control sequences include, for example, the early and late promoters of SV40 or adenovirus, the promoter and enhancer of CMV, the LTR of retroviruses, the lac system, the trp system, the TAC or TRC systems, the T3 and T7 promoters, the major operator and promoter region of phage lambda, the regulatory region of the fd encoded protein, the promoter for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, the promoters of such phosphatases, e.g. Pho5, the promoter of the yeast alpha-mating system, and any other sequence of structure and inducibility known to control the expression of genes of prokaryotes or eukaryotes or their viruses, and various combinations thereof.
  • the vector expressing the antibody of the present invention can be a vector system in which the light chain and the heavy chain are simultaneously expressed from a single vector, or a system in which the light chain and the heavy chain are each expressed from separate vectors. In the latter case, the two vectors are introduced into a host cell through co-transformation and targeted transformation.
  • Co-transformation is a method in which each vector DNA encoding the light chain and the heavy chain is simultaneously introduced into a host cell, and then cells expressing both the light chain and the heavy chain are selected.
  • Targeted transformation is a method in which cells transformed with a vector containing a light chain (or heavy chain) are selected, and the selected cells expressing the light chain are transformed again with a vector containing a heavy chain (or light chain), to finally select cells expressing both the light chain and the heavy chain.
  • the present invention provides an isolated cell transformed with a recombinant expression vector.
  • the cell capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention can be any host cell known in the art, including but not limited to, prokaryotic host cells such as strains of the genus Bacillus, such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g., Pseudomonas putida), Proteus mirabilis or Staphylococcus (e.g., Staphylocus carnosus).
  • prokaryotic host cells such as strains of the genus Bacillus, such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g., Pseudomonas putida), Proteus mirabilis or Staphylococcus (e.g., Staphylocus carnosus).
  • the culture of transformed cells can be carried out according to appropriate media and culture conditions known in the relevant technical field.
  • Such culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art according to the selected strain.
  • Cell culture is divided into suspension culture and attachment culture according to the cell growth method, and batch, fed-batch, and continuous culture methods according to the culture method.
  • the medium used for culture must appropriately satisfy the requirements of a specific strain.
  • the present invention provides a composition for detecting human TREM2 antigen comprising the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising the humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • variable regions of the heavy and light chains of mouse antibodies C2 and F2 were cloned into the animal cell expression vector pcDNATM 3.4 TOPO vector (ThermoFisher Scientific) together with the human IgG1 heavy chain constant region (P01857), IgG2 heavy chain constant region (P01859), IgG4 heavy chain constant region introducing the S228P mutation (P01861), and human kappa light chain constant region (P01834).
  • each plasmid DNA was transfected into Expi293 as described in the Thermo Fisher manufacturer's protocol (ExpiFectamine 293 transfection kit, ThermoFisher Scientific). Briefly, 6x106 cells/ml Expi293 cells were transfected with DNA and ExpiFectamine complexes and cultured at 37°C, 8% CO2 , and the expression enhancer was added 24 h later. On the second day after transfection, the cells were cultured at 32°C for 6 days, and the culture supernatant containing TREM2-binding antibody proteins was collected.
  • a Protein A affinity chromatography column (GE Healthcare) was equilibrated with PBS (pH 7.4). The culture supernatant containing each TREM2-binding antibody protein was filtered through a 0.2 ⁇ m filter and loaded onto the Protein A affinity chromatography column. After washing the column with PBS (pH 7.4), the TREM2-binding antibody protein was eluted with a 100 mM glycine (pH 3.4) solution. The eluate was neutralized by adding 1 M Tris solution and the buffer was exchanged with PBS.
  • the purified TREM2-binding antibody was confirmed by SDS-PAGE gel analysis (Invitrogen) and SE-HPLC analysis, and the protein concentration was quantified using a Nanodrop 2000C spectrophotometer (Thermo Scientific).
  • the SE-HPLC analysis results confirmed that the C2 IgG1, IgG2, and IgG4 chimeric antibodies were each more than 90% pure (Fig. 1).
  • the amino acid sequences of the heavy and light chain variable regions of the mouse monoclonal antibody C2 were compared and analyzed with the amino acid sequences of human germline antibodies in the IMGT database, and the heavy chain genes IGHV3-33, IGHV3-30, IGHV4-34, IGHV4-4, IGHJ4 and the light chain genes IGKV2-18, IGKV2-28, IGKV2-29 of the human antibody variable regions with high similarity were selected.
  • the CDR of the mouse antibody was grafted onto an IgG1 human antibody, and some amino acid residues of the humanized heavy chain FR (Framework) were substituted with the sequence of the mouse antibody.
  • a total of 12 humanized antibodies were produced by combining four heavy chains and three light chains (Tables 1 and 2).
  • humanized antibodies Twelve types were produced using human germline-based CDR grafting technology and transiently expressed in Expi293 cells.
  • the production method of humanized antibody proteins was performed in the same manner as the production method of chimeric antibodies.
  • the humanized antibodies were confirmed to have a purity of more than 95% (Fig. 2).
  • the binding affinity to the antigen was measured as the K D value for each antibody using Biacore.
  • the system and sample buffer used were HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Polysorbate 20 (v/v)).
  • the antibody was immobilized on the surface of the CM5 chip using the amine coupling procedure according to the manufacturer's protocol of the human antibody capture kit (Cytiva).
  • the antigen protein diluted in HBS-EP buffer was flowed through the CM5 chip with the antibody immobilized at a flow rate of 30 ⁇ L/min for 2 minutes for binding and 5 minutes for dissociation.
  • the antigen protein bound to the antibody was washed by reacting with 3 M magnesium chloride for 60 seconds.
  • the sensorgram of the antibody was analyzed using Biacore evaluation software. As a result, humanized antibodies showing a similar level of binding ability compared to the binding ability of the chimeric antibody chiC2 (K D : 6.28E-10 M) were selected (Fig. 3).
  • the humanness scores of the light and heavy chains of mouse antibodies and the light and heavy chains of humanized antibodies were confirmed through the T20 score.
  • the humanized sequence increased both the T20 score and the humanness score was improved compared to the heavy and light chains of the mouse antibodies (Fig. 4).
  • TREM2 loses its function when the outer part of the cell membrane is cleaved by sheddase such as ADAM10/17, and at the same time, the amount of cleaved soluble TREM2 (sTREM2) present in the cell culture medium increases.
  • the antibody specified in the present invention can inhibit shedding by binding to TREM2 exposed to the outer part of the cell membrane, and this protective effect was evaluated as a decrease in the amount of sTREM2 present in the culture medium and internal TREM2 (iTREM2) present in the cell, and an increase in the protein amount of membrane TREM2 (mTREM2) (Fig. 6).
  • HEK2393T cells cultured in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) were transfected with polyethylenimine (PEI) to express human TREM2-His and DAP12-V5. After culturing for 8 hours, the cells were replaced with fresh culture medium containing the control (C2 and human IgG produced from mouse) or each human antibody at a concentration of 20 ug/mL and further cultured for 16 hours.
  • pure culture medium and cell fraction samples total, internal, membrane fraction
  • the whole cell fraction was prepared by dissolving the cells obtained by centrifugation in the lysate (1% Triton X-100, 1X phosphate buffered saline (PBS), 1X protease inhibitor cocktail (PIC)), rotating them in a refrigerator (4°C) for 1 hour, and then centrifuging them to remove the remaining debris to secure all the intracellular and cell membrane fraction proteins.
  • lysate 1% Triton X-100, 1X phosphate buffered saline (PBS), 1X protease inhibitor cocktail (PIC)
  • the intracellular fraction was prepared by dissolving the cells obtained by centrifugation in a storage solution (20 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA/EGTA, 1X PIC), keeping them on ice for 30 minutes to fill the inside of the cells with the buffer, and then freezing them in an ultra-low temperature freezer (-80°C) and thawing them to rupture the cells, followed by centrifugation to separate the intracellular fraction from the cell membrane fraction.
  • the proteins of the remaining cell membrane fraction were eluted from the cell membrane using the lysate, and then separated/secured from the debris through centrifugation.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the humanized antibodies ChiC2, HuC2-2, HuC2-5, and HuC2-9 described in the present invention showed excellent inhibitory effects compared to the shedding inhibition of mouse-derived antibody C2, and HuC2-6, HuC2-8, HuC2-10, and HuC2-10 showed effects at a similar level to the shedding inhibition of mouse-derived antibody C2 (One-Way ANOVA, Fisher test) (Table 3).
  • Antibody - IgG ChiC2 _ IgG1 ChiC2 _ IgG2 ChiC2 _ IgG4 C2 average 0.54 0.55 2.26 2.13 2.27 1.00 Standard error 0.10 0.09 0.22 0.03 0.24 0.01

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Abstract

본 발명은 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 마우스 항체 가변영역의 항원 결합부위에 해당하는 상보성 결정 영역 (CDRs)을 인간 germline 유래 서열에 이식하는 CDR grafting 기술을 이용한 인간화 항체를 제조하여, TREM2에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 확보하였다. 확보한 인간화 항체는 항원과의 결합능과 생물학적 활성을 확인하였고, IgG1 형태의 키메릭 항체를 IgG2와 IgG4 형태로 전환하여 생산하였으며, 항원과의 결합능과 생물학적 활성을 확인하였다. 본 발명은 TREM2에 대한 고친화도를 가지고 있어 다양한 알츠하이머성 치매의 바이오마커로서 TREM2를 진단할 수 있는 항체 기반 진단 시스템 개발이 가능하다. 또한, 기존 알츠하이머 치료제 개발이 신경전달 물질의 일시적 조절로 인한 증상 완화제가 대부분이므로, TREM2를 타겟팅하는 항체를 개발함으로써 실질적으로 치료효과를 갖는 유망한 신약개발로 이어질 수 있을 것이라고 사료된다.

Description

인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 이의 용도
본 발명은 인간 TREM2(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2) 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 이의 용도에 대한 것이다.
TREM2(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2)는 DAP12라는 어댑터 단백질을 통해 신호전달을 수행하는 수용체로서 골수 세포(myeloid cell) 기능을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 사이토카인의 발현을 억제하여 염증반응을 억제하는 것으로 나타나 TREM2가 면역조절에 관여하는 것으로 확인되었다. TREM2 단백질은 주로 신경아교세포(microglia)에 존재하며 치매 표적인자, 아밀로이드- 베타의 식세포작용과 손상된 신경세포 처리 및 면역세포 항상성 유지와 같은 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다.
최근에는 TREM2의 돌연변이체가 알츠하이머 발병율을 3배 증진시킨다는 연구 보고가 발표되면서 알츠하이머성 치매와 같은 뇌질환 연구를 위한 바이오 마커 또는 새로운 뇌질환 치료제 타겟으로 더욱 부각되고 있다. 그러나 TREM2는 세포막 단백질로서 세포 내 고유의 기능을 최대한 그대로 유지하면서 세포 내 고유의 온전한 형태로의 정제가 어려울 뿐만 아니라 TREM2 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 항체 또한 개발이 미비한 실정이다.
한편, 질환 치료를 위한 항체의 생산은 주로 마우스를 이용하여 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 생산하고 있다. 하지만 마우스 유래 단일클론 항체와 같은 비인간 항체들은 인체 내에서 외래 항원으로 간주되기 때문에 면역반응을 유발하고 반감기가 짧기 때문에 치료효과가 제한적인 문제점이 있다. 이러한 문제점를 해결하기 위해 항체의 항원과 결합하는 부위만을 제외한 나머지 부분을 인간 항체로 치환한 인간화 항체가 개발되었다. 현재 사용되고 있는 마우스 항체의 인간화 항체로의 치환방법으로는 치환할 항체에 대한 가장 유사한 인간 항체 유전자를 선정하고, CDR 이식이라 불리는 방법으로 마우스 항체의 CDR 부위만을 인간 항체 CDR 위치로 치환하는 것이다. 이와 같은 인간화 항체는 유전자의 대부분을 인간화 하였으므로 인체 내에서의 면역반응을 줄일 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 목적은 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환되어 분리된 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간화 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 인간 TREM2 항원 검출용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 10로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환되어 분리된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 인간 TREM2 항원 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 마우스 항체 가변영역의 항원 결합부위에 해당하는 상보성 결정 영역 (CDRs)을 인간 germline 유래 서열에 이식하는 CDR grafting 기술을 이용한 인간화 항체를 제조하여, TREM2에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 확보하였다. 확보한 인간화 항체는 항원과의 결합능과 생물학적 활성을 확인하였고, IgG1 형태의 키메릭 항체를 IgG2와 IgG4 형태로 전환하여 생산하였으며, 항원과의 결합능과 생물학적 활성을 확인하였다. 본 발명은 TREM2에 대한 고친화도를 가지고 있어 다양한 알츠하이머성 치매의 바이오마커로서 TREM2를 진단할 수 있는 항체 기반 진단 시스템 개발이 가능하다. 또한, 기존 알츠하이머 치료제 개발이 신경전달 물질의 일시적 조절로 인한 증상 완화제가 대부분이므로, TREM2를 타겟팅하는 항체를 개발함으로써 실질적으로 치료효과를 갖는 유망한 신약개발로 이어질 수 있을 것이라고 사료된다.
도 1은 키메릭 항체 단백질의 SE-HPLC 분석 결과를 나타낸다
도 2는 인간화 항체 단백질의 SDS-PAGE gel 분석 및 SE-HPLC 분석 결과를 나타낸다
도 3은 TREM2 결합 항체의 인간 TREM2에 대한 결합력 평가 결과를 나타낸다.
도 4는 인간화 항체의 Humanness score 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 인간화 항체의 in silico 면역원성 예측 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 키메릭 및 인간화 항체의 효능 검증 결과를 나타낸다.
도 7은 IgG2, IgG4 형태로 전환된 키메릭 항체의 효능 검증 결과를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 10로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TREM2(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2) 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
바람직하게는, 상기 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 1) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역, 2) 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역, 3) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 4) 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 가변 영역; 및 1) 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역, 2) 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 3) 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 서브타입(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어, “키메릭 항체”는 마우스 항체의 가변영역 및 인간 항체의 불변영역을 재조합시킨 항체로서, 마우스 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
본 발명에서 용어, "인간화 항체(humanized antibody)"란, 마우스 단일클론항체의 CDR 서열의 전부 또는 일부를 인간 항체에 이식시킨 형태의 항체를 의미하며, 그 예로 생쥐 단일클론항체의 CDRs를 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변영역을 제조하고 이를 바람직한 인간 항체의 불변영역과 재조합시켜 제조할 수 있다. 즉, 인간에게 비-면역원성(nonimmunogenic)이거나 또는 면역원성이 감소된 항체를 총칭한다. 인간화 항체는 아미노산 서열이 변형된 항체(altered antibody)이고, 항체의 아미노산 서열은 원하는 목적에 맞게 재구성할 수 있다. 이러한 가능한 변화는 수없이 많고 하나 또는 몇 가지 아미노산을 변화시키는 것부터 항체의 가변 및/ 또는 불변 영역의 완전한 재구성까지 가능하다. 일반적으로 가변영역의 변형이 항원의 결합능과 친화도를 증대시키기 위하여 행하여지는데 비하여 불변영역에서의 변형은 보체(complement)의 고정, 막과의 상호작용 및 기타 효과제의 기능과 같은 세포내 작용을 증대시키기 위하여 행하여진다.
본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.
또한, 본 발명은 재조합 발현벡터로 형질전환되어 분리된 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
또한, 본 발명은 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 인간 TREM2 항원 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 키메릭 항체의 제조
1. 키메릭 항체 발현벡터 제작
마우스 항체 C2와 F2의 중쇄와 경쇄의 가변영역을 각각 인간의 IgG1 의 중쇄 불변영역(P01857), IgG2 중쇄 불변영역(P01859), S228P 변이를 도입한 IgG4 중쇄불변영역 (P01861), 인간 kappa 경쇄 불변영역 (P01834)과 함께 동물세포 발현벡터인 pcDNA™ 3.4 TOPO vector (ThermoFisher Scientific)에 클로닝하였다.
2. 키메릭 항체 단백질의 생산
항체 단백질을 발현시키기 위하여 각 플라스미드 DNA를 Thermo Fisher 제조업체의 프로토콜 (ExpiFectamine 293 transfection kit, ThermoFisher Scientific)에 설명된 대로 Expi293에 형질도입하였다. 간단하게, 6x106 cells/ml Expi293 세포를 DNA 및 ExpiFectamine 복합체로 형질감염 후 37℃, 8% CO2 조건에서 배양하였고, 24시간 후에 발현 증강제 (Enhancer)를 첨가하였다. 형질감염 후 2 일차에 세포를 32℃에서 6일간 배양한 후, TREM2 결합 항체 단백질을 포함하는 배양 상등액을 회수하였다.
Protein A 친화크로마토그래피 칼럼 (GE Healthcare)을 PBS (pH 7.4)로 평형화하였다. 각 TREM2 결합 항체 단백질을 포함하는 배양 상등액을 0.2 μm 필터로 여과한 후, Protein A 친화크로마토그래피 칼럼에 로딩하였다. PBS (pH 7.4)로 칼럼을 세척한 후 100 mM 글리신 (pH 3.4) 용액으로 TREM2 결합 항체 단백질을 용출하였다. 용출 액에 1 M Tris 용액을 첨가하여 중화한 다음 PBS로 버퍼를 교환하였다. 정제된 TREM2 결합 항체는 SDS-PAGE gel (Invitrogen) 분석과 SE-HPLC 분석을 통해 확인하였으며, 단백질 농도는 Nanodrop 2000C 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 정량화하였다. SE-HPLC 분석 결과, C2 IgG1, IgG2, IgG4 키메릭 항체는 각각 90% 이상의 순도임을 확인하였다(도 1).
<실시예 2> 인간화 항체의 제조
1. 인간화 항체의 고안
인간화 항체를 제작하기 위하여, 마우스 단일클론항체 C2의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 IMGT 데이터베이스의 인간 생식선 항체의 아미노산 서열과 비교 분석하여 유사성이 높은 인간 항체 가변영역의 중쇄 유전자 IGHV3-33, IGHV3-30, IGHV4-34, IGHV4-4, IGHJ4와 경쇄 유전자 IGKV2-18, IGKV2-28, IGKV2-29를 선별하였다. 마우스 항체 C2를 인간화하기 위하여 마우스 항체의 CDR을 IgG1 인간항체에 이식하고, 일부 인간화 중쇄 FR (Framework)의 아미노산 잔기를 마우스 항체의 서열로 치환하였다. 중쇄 4종, 경쇄 3종을 조합하여 총 12개의 인간화 항체를 제작하였다(표 1 및 표 2).
ID FHR1 CDR -H1 FHR2 CDR -H2 FHR3 CDR -H3 FHR4
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(서열번호 45)
인간화 항체 중쇄 ID 경쇄 ID
huC2-01 KBIO-H01 KBIO-L01
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2. 인간화 항체 단백질의 생산
Human germline-based CDR grafting 기술을 이용하여 인간화 항체 12종을 제작하여 Expi293 세포주에 일시발현 하였다. 인간화 항체 단백질의 생산방법은 키메릭 항체의 생산 방법과 동일하게 수행하였다. SE-HPLC 분석 결과, 인간화 항체는 95% 이상의 순도로 확인되었다(도 2).
<실시예 3> TREM2 결합 항체의 인간 TREM2에 대한 결합력 평가
실시예 2에서 제조한 TREM2 결합 인간화 항체의 항원에 대한 결합력을 정량적으로 분석하기 위해 Biacore를 통해 각 항체에 대한 KD 값으로 항원에 대한 결합친화도 (affinity)를 측정하였다. 시스템 및 샘플 버퍼는 HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Polysorbate 20 (v/v))를 사용하였다. Human antibody capture kit (Cytiva)의 제조업체 프로토콜에 따라 아민 커플링 절차를 수행한 CM5칩 표면에 항체를 고정화하였다. HBS-EP 완충액에 희석된 항원 단백질을 30 μL/min의 유속으로 결합을 위해 2분 동안, 해리를 위해 5분 동안 항체가 고정화된 CM5 칩에 흘려주었다. 다음으로, 3M 마그네슘 클로라이드를 60초 동안 반응시켜 항체에 결합된 항원 단백질을 세척하였다. Biacore 평가 소프트웨어를 사용하여 항체의 센서그램을 분석하였다. 그 결과, 키메릭 항체 chiC2의 결합능(KD: 6.28E-10 M)과 비교하여 유사한 수준의 결합능을 나타내는 인간화 항체를 선별하였다(도 3).
<실시예 4> 인간화 항체의 Humanness score 분석
Public data base를 이용하여 마우스 항체의 경쇄와 중쇄, 인간화 항체의 경쇄와 중쇄의 Humanness score을 T20 score를 통해 확인하였다. 분석 결과, 마우스 항체의 중쇄와 경쇄 보다 인간화 서열이 T20 score 모두 증가하여 Humanness score가 개선되었음을 확인하였다(도 4).
<실시예 5> 인간화 항체의 in silico 면역원성 예측 분석
T cell epitope를 예측하기 위하여 빈도가 높은 26개의 HLA type에 대해 IEDB 기반의 in silico 면역원성 예측을 수행하였다. 9개의 아미노산 서열에 대한 in vitro IC50실험값에 기반하여 예측 성능이 검증된 in silico 방법들의 조합인 Consensus method (NN-align, SMM-align, CombLi, NetMHCIIpan 조합)를 사용하였다. 분석 결과, T cell epitope 예측 개수가 임상에서 면역원성이 0%인 Omalizumab, 0.1%인 Trastuzumab의 예측 개수 범위에서 벗어나지 않음을 확인하였다(도 5).
<실시예 6> 키메릭 및 인간화 항체의 효능 검증
TREM2는 ADAM10/17과 같은 sheddase에 의해 세포막외부가 잘려지게 되어 그 기능을 잃게 되고 이와 동시에 세포배양액에 존재하는 잘려진 soluble TREM2 (sTREM2)의 양이 증가하게 된다. 본 발명에 명시된 항체는 세포막 외부에 노출된 TREM2에 결합함으로써 shedding을 억제할 수 있는데 이러한 보호 효과를 배양액에 존재하는 sTREM2의 양과 세포내에 존재하는 internal TREM2 (iTREM2)는 줄어들고, membrane TREM2 (mTREM2)의 단백질 양은 증가하는 것으로 평가하였다(도 6).
본 발명에서 명시된 인간화 항체에 의한 TREM2 shedding 억제 효과를 평가하기 위하여 10% fetal bovine serum (FBS)가 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양된 HEK2393T 세포주를 polyethylenimine (PEI)를 이용하여 인간 TREM2-His와 DAP12-V5 발현하도록 형질전환시켰다. 8시간 동안 배양한 후 대조군 (마우스에서 생산된 C2 및 인간 IgG) 혹은 인간 항체 각각이 20 ug/mL의 농도로 포함된 새로운 배양액으로 바꿔주고 16 시간 동안 추가 배양하였다. 배양액에 포함된 sTREM2의 양을 확인하여 위하여 원심분리로 세포를 제거한 순수 배양액과 세포 분획 (전체 세포 용출액 (total), 세포내 분획 (internal), 세포막 분획 (membrane)) 샘플을 확보하였다. 전체 세포 분획은 원심분리로 획득한 세포를 용출액 (1% Triton X-100, 1X phosphate buffered saline (PBS), 1X protease inhibitor cocktail (PIC))에 풀고 1 시간 동안 냉장 (4℃)에서 회전시키며 반응한 후 원심분리를 통해 용출되고 남은 찌꺼기를 제거함으로써 세포내 및 세포막 분획 단백질 전체를 확보하였다. 세포내 분획은 원심분리로 획득한 세포를 저장액 (20 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA/EGTA, 1X PIC)에 풀고 얼음에서 30 분 동안 유지하여 세포 내부를 버퍼로 가득 채운 후 초저온 냉동고 (-80℃)에서 동결시켰다가 녹이는 방법으로 세포를 터뜨린 후 원심분리하여 세포내 분획을 세포막 분획으로부터 분리하였다. 남은 세포막 분획의 단백질들은 용출액을 사용하여 세포막으로부터 용출시킨 후 원심분리를 통해 찌꺼기로부터 분리/확보하였다. 확보된 각 분획은 환원제가 포함된 lithium dodecyl sulfate (LDS) 버퍼와 섞어주어 단백질 3차 구조를 풀어준 후, Bolt™ 4-12% Bis-Tris Plus Gels (ThermoFisher 사)에서 크기별로 분리하고 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 옮겨주었다. PVDF 막은 TREM2 항체 (Abcam #ab209814, 0.4 ug/mL)와 이에 결합하는 2차 항체 (Rockland #18-8816-31, 1 ug/mL, horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 형태)가 포함된 버퍼에 차례로 반응시킨 후 루미놀 용액을 처리하여 인간 TREM2의 양을 확인하였다. 단백질 양에 따른 루미놀 신호의 강도를 ImageJ 프로그램을 이용하여 분석하여 단백질의 양을 수치화한 후, shedding 억제 효과를 다음의 수식으로 평가하였다.
[membrane TREM2 ÷ (soluble TREM2 × internal TREM2)]
본 발명에 명기된 인간화 항체 ChiC2, HuC2-2, HuC2-5, HuC2-9은 마우스 유래 항체 C2의 Shedding 억제 대비 우수한 억제효과를 보였으며, HuC2-6, HuC2-8, HuC2-10, HuC2-10은 마우스 유래항체 C2의 Shedding 억제와 유사한 수준의 효과를 보였다(One-Way ANOVA, Fisher test)(표 3).
항체 - IgG C2 ChiC2 HuC2-2 HuC2-5 HuC2-6 HuC2-8 HuC2-9 HuC2-10 HuC2-12
평균 0.56 0.49 1.00 2.08 1.34 1.48 1.14 0.83 1.58 1.21 0.78
표준오차 0.12 0.16 0.02 0.03 0.24 0.04 0.11 0.02 0.17 0.03 0.06
< 실시예 7> IgG2 , IgG4 형태로 전환된 키메릭 항체의 효능 검증
상기의 인간화 항체 중 Shedding 억제력이 가장 우수한 ChiC2의 IgG subtype 최적화를 위하여 기존의 IgG1에서 IgG2 그리고 IgG4로 subtype을 변형하여 억제력의 변화를 상기 방법을 이용하여 검증하였다. Subtype 간의 억제력에 큰 차이 없이 효과적으로 shedding을 억제하는 것을 확인하였다(표 4 및 도 7).
항체 - IgG ChiC2 _ IgG1 ChiC2 _ IgG2 ChiC2 _ IgG4 C2
평균 0.54 0.55 2.26 2.13 2.27 1.00
표준오차 0.10 0.09 0.22 0.03 0.24 0.01
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 10로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TREM2(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2) 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    1) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역, 2) 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역, 3) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 4) 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 중쇄 가변 영역; 및
    1) 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역, 2) 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 3) 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항의 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  4. 제3항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  5. 제4항의 재조합 발현벡터로 형질전환되어 분리된 세포.
  6. 제1항 또는 제2항의 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 인간 TREM2 항원 검출용 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항의 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물.
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