WO2024256768A1 - Extrait de punica granatum variete cybele et ses utilisations en cosmetique - Google Patents

Extrait de punica granatum variete cybele et ses utilisations en cosmetique Download PDF

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cybele
composition
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Sandrine Lopis-Presle
Murielle ERISSON
Laura NATALONI
Boris VOGELGESANG
Nicolas Bechetoille
Chloé LORION
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Gattefosse SA
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    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
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Definitions

  • the present invention relates to an extract of Punica granatum variety Cybele and a cosmetic composition comprising said extract.
  • the invention also relates to the cosmetic and/or dermatological use of said extract or said composition for skin care, in particular for combating skin aging.
  • the pomegranate tree belonging to the species Punica granatum, is a shrub measuring on average 3 to 6m in height and classified in the Lythraceae family.
  • Pomegranates are globose berries with a leathery pericarp which, when ripe (i.e., from September to October), turns from yellow to red-orange or even purplish to black depending on the variety.
  • the fruit is topped with the remains of the flower calyx, forming a serrated crown and giving it an atypical shape that is easily identifiable.
  • the pomegranate is made up of 6 to 12 whitish membranous cells with a bitter taste containing numerous triangular seeds called arils. These seeds have a fleshy and gelatinous mesocarp, generally acidic and sweet, representing the edible part of the fruit.
  • Punica granatum varieties producing red fruits are preferred in cosmetic formulations or food supplements, etc.
  • the fruit constitutes the most commonly used source of extraction, but it is above all a specific part which is exploited, namely the peel or the seed, which requires additional separation steps which have direct effects on the cost of extraction.
  • documents FR 3 031 901, WO 2021/064034 or WO 2021/209593 describe extracts of Punica granatum producing red fruits and their cosmetic uses, in particular for the production of oral compositions or food supplements, sun prevention or to combat acne.
  • sebocytes participate in the pathophysiology of acne due to their role in producing sebum.
  • dysseborrhea makes the sebum of poor quality due to a deficiency in vitamin E, in particular.
  • the elements of sebum, and more particularly squalene, are oxidized.
  • Oxidized lipids are known for their pro-inflammatory and cytotoxic properties (ii) hyperseborrhea is an overproduction of sebum or excess sebum that induces skin problems such as acne. Hyperseborrhea contributes in particular to the proliferation of Cutibacterium acnes which contributes to the local inflammatory reaction.
  • the extracts described by the documents FR 3 031 901, WO 2021/064034 or WO 2021/209593, mentioned above, require different phases of concentration, or even purification of particular phytochemical families in order to increase their effectiveness. These processes therefore require additional manufacturing steps which have direct effects on energy consumption and therefore on the overall production cost.
  • Punica granatum var. Cybele is an ornamental variety, which also has agronomic advantages: it is effective in repelling insect pests and allows cultivation without the use of pesticides. It is a major asset for biodynamic or co-culture production.
  • the species Punica granatum has a long history of traditional and popular uses dating back to ancient Egypt.
  • the pomegranate is particularly described in traditional Chinese and Ayurvedic medicine, but it is also present in the Persian and Greco-Arabic medical systems.
  • All parts of the pomegranate tree are described as having therapeutic properties such as vermifuge properties, particularly recognized as effective against tapeworm; in the treatment of oral conditions, stomach aches, ulcers, to treat inflammations, bleeding gums or even to eliminate dental plaque. Some applications, more rarely cited, refer to skin conditions.
  • Traditional Chinese medicine in fact, describes the fruit as useful for treating furunculosis or bedsores.
  • antioxidant properties mainly carried by its content of polyphenolic compounds (flavonoids, tannins, anthocyanins); anti-inflammatory, anti-bacterial, anti-acne, healing, anti-aging properties or even a depigmenting activity.
  • Punica granatum extract in particular an alternative to existing extracts having cosmetic properties that are at least equivalent, or even improved, compared to the Punica granatum extracts of the state of the art, in particular to effectively combat skin ageing, which is free of toxic or irritant effects, effective for cosmetic skin care and the production of which is less costly, less energy-intensive and less water-consuming (e.g., eco-design approach) compared to the manufacturing processes of the state of the art.
  • Punica granatum variety Cybele whose fruits are not edible and which, as mentioned above, is an effective alternative to Punica granatum fruit extracts, in particular those from edible varieties such as Punica granatum var. Wonderful.
  • the phytochemical composition of the purple pomegranate variety Cybele differs from that of other red-fruited varieties of Punica granatum such as Punica granatum var. Wonderful.
  • the Applicant has in fact conducted studies comparing the phytochemical composition, which have made it possible to highlight phytochemical divergences between the fruits of Punica granatum var. Wonderful and Punica granatum var. Cybele (see example 4).
  • a first object of the invention relates to a cosmetic, i.e. non-therapeutic, and topical use of an extract of Punica granatum var. Cybele or of a composition comprising said extract.
  • the present invention offers various advantages, in particular the fact of having particular biological properties linked to the activities of the extract of the invention, namely antioxidant, anti-inflammatory, anti-aging, antibacterial, healing, depigmenting, sebum-regulating or even anti-acne cosmetic activities.
  • the use of Punica granatum var. Cybring makes it possible not to divert the varieties of Punica granatum producing edible fruits, for example Punica granatum var. Wonderful.
  • the expression “whole fruit” designates the whole consisting of the pericarp (rind), the rest of the calyx, the membranous lodges, the pulp and the seeds (arils).
  • extraction solvent designates the solvent used during the solid/liquid extraction step.
  • the cosmetic use of the extract of Punica granatum var. Cybele or of a composition comprising said extract according to the invention has the following additional technical characteristics, taken alone or in combination:
  • - cosmetic use is to soothe the skin
  • - cosmetic use is to combat the appearance of wrinkles and/or fine lines
  • - cosmetic use is to combat wrinkles and/or fine lines
  • - cosmetic use is as an antioxidant
  • - cosmetic use is as an anti-inflammatory
  • - cosmetic use is as a sebum regulator/sebum regulating agent/sebum regulation improving agent of the skin;
  • - cosmetic use is to reduce the size of skin pores
  • acne-prone skin is to be distinguished from acne-prone skin, which is pathological skin (i.e. proven inflammation).
  • Acne-prone skin is healthy skin that is generally oily due to excessive sebum secretion but which does not exhibit inflammation and/or excessive proliferation of commensal or pathogenic bacterial populations;
  • the cosmetic use is on healthy skin and/or on oily skin (shiny and shiny appearance) and/or combination skin and/or skin with non-inflammatory imperfections (e.g. blackheads, pimples, comedones).
  • oily, combination skin and/or skin with non-inflammatory imperfections is not pathological skin;
  • the extraction solvent used in the solid/liquid extraction process is selected from the following groups of substances used alone or in mixture: water; glycols such as 1.3-propanediol, 1,2-propanediol, 1.3-butanediol; polyols such as glycerin; alcohols such as ethanol; and Natural Deep Eutectic Solvents (NaDES) such as those described in FR3036618, in particular NaDES Fructose/Glycerin/Water in molar proportions 1:1:5 (denoted NaDES FGE115); advantageously consisting of a mixture of propanediol and water; a mixture of ethanol and water; and a mixture of fructose, glycerin and water; preferably a mixture of propanediol and water
  • the mass ratio of the mixture of propanediol and water is between 10/90 and 90/10, advantageously 60/40;
  • the mass ratio of the mixture of ethanol and water is between 10/90 and 90/10, advantageously 60/40;
  • the mass ratio of the mixture of fructose, glycerin and water during the extraction step is between 55/28/17 and 45/23/32, advantageously 50/25/25;
  • Cybaux/solvent is between 1:99 and 50:50, advantageously between 2:98 and 15:85;
  • Cybele used according to the invention is an extract obtained from the mature or immature fruit, advantageously from the mature fruit;
  • Cybele used according to the invention is an extract obtained from the whole fruit, fruit peel, fruit seed, trunk bark, roots, flowers, leaf stems, and/or leaves, advantageously a whole fruit extract;
  • Cybele plant used to obtain an extract used according to the invention is fresh, frozen, dried, whole, cut and/or crushed;
  • Cybele used according to the invention has a phytochemical composition/total polyphenol content greater than or equal to 0.5 g/100g; advantageously between 0.8 and 1.0 g/100g;
  • Cybele used according to the invention has a phytochemical composition/punicalagins a and P content greater than or equal to 0.3 g/100g; advantageously between 0.4 and 0.6 g/100g;
  • Cybele used according to the invention has a phytochemical composition/ellagic acid content greater than or equal to 30 mg/kg, advantageously between 100 and 150 mg/kg;
  • Cybame used according to the invention has a phytochemical composition/total anthocyanin content greater than or equal to 3 mg/kg, advantageously between 4 and 9 mg/kg;
  • Cybele used according to the invention has a phytochemical composition/myrtillin content greater than or equal to 1 mg/kg; advantageously between 2 and 4 mg/kg;
  • Cybele used according to the invention has a phytochemical composition/kuromanin content greater than or equal to 1 mg/kg; advantageously between 1.5 and 3 mg/kg;
  • Cybele used according to the invention has a higher phytochemical composition/content of anthocyanins other than kuromarin and myrtillin or equal to 0.5 mg/kg; advantageously between 1.0 and 2.5 mg/kg.;
  • Another subject of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele obtainable by a solid/liquid extraction process of ground Punica granatum var. Cybele using an extraction solvent, followed by a second solid/liquid separation step and finally a third liquid phase recovery step, characterized in that the extraction solvent is selected from the group consisting of a mixture of propanediol and water; a mixture of ethanol and water; and a mixture of fructose, glycerin and water.
  • the extract of Punica granatum var. Cybele of the invention has the following additional technical characteristics, taken alone or in combination:
  • the extraction solvent according to the invention is liquid at room temperature, which facilitates the implementation of the process leading to the extract of the invention
  • the solid/liquid extraction can be carried out by different techniques known in the field considered by the person skilled in the art, such as maceration, remaceration, digestion, dynamic maceration, decoction, fluid bed extraction, microwave-assisted extraction, ultrasound-assisted extraction, counter-current extraction, percolation, re-percolation, leaching, extraction under reduced pressure, diacolation;
  • Cybaux /extraction solvent applied for the extraction step is between 1:99 and 50:50, advantageously between 2:98 and 15:85;
  • the extraction step is carried out at a temperature between 2 and 100°C, advantageously between 20 and 80°C;
  • the extraction step can be maintained for a few minutes to several days;
  • the solid/liquid extraction step is carried out with stirring and/or under a nitrogen atmosphere so as to optimize the extraction of the active compounds while protecting these compounds from oxidation by atmospheric oxygen;
  • the solid/liquid extraction step is followed by a solid/liquid separation step, to recover the liquid phase (or solid/liquid separation filtrate), containing the active material;
  • the separation step can be carried out by any technique known in the field considered by the person skilled in the art, in particular draining, pressing, spinning, centrifugation or filtration;
  • the liquid/solid separation step can be followed by a concentration step, which makes it possible to obtain a concentrate, in liquid or semi-solid form depending on the concentration factor;
  • the concentration step is carried out by evaporation under reduced pressure or reverse osmosis
  • the clarification step implements any type of frontal and/or tangential filtration known in the field considered by the person skilled in the art;
  • the liquid/solid separation or concentration or clarification step can be followed of a fractionation step to obtain a fraction of one or more phytochemical families, in liquid or semi-solid form depending on the concentration factor;
  • the fractionation step can be carried out by any technique known in the field considered by the person skilled in the art, in particular by chromatography under reduced pressure, ultrafiltration or nanofiltration; and/or
  • the method of the invention may comprise a sterilizing filtration step
  • the sterilizing filtration step is carried out by filtering the product through a filter comprising pores with a diameter of 0.22 ⁇ m.
  • Another object of the present invention relates to a composition
  • a composition comprising the extract of Punica granatum var. Cybele as described above.
  • the composition according to the invention is a cosmetic and/or dermatological composition.
  • composition of the invention has the following additional technical characteristics, taken alone or in combination:
  • Cybame according to the invention represents between 0.1% and 20% by weight of the composition, advantageously between 0.5% and 5%;
  • composition of the invention is a skin care composition, in particular a composition for combating skin aging;
  • composition of the invention is an anti-aging composition
  • composition of the invention is a composition improving the sebum regulation of the skin
  • composition of the invention may be presented in all the galenic forms normally used for a rinsed or non-rinsed topical application, for example in anhydrous form, in the form of an oil-in-water emulsion, a water-in-oil emulsion, a multiple emulsion, a silicone emulsion, a microemulsion, a nanoemulsion, a gel, an aqueous solution or a hydroalcoholic solution;
  • the composition of the invention may be more or less fluid and may be in the form of a white or colored cream, an ointment, a milk, a lotion, a serum, a gel, a washing base, or a stick. It may be used in many treatments of the skin, lips and hair, including the scalp, in particular to protect and/or care for the skin, lips and/or hair, and/or to make up the skin and/or lips;
  • composition of the invention may contain excipients usually used in the cosmetic and dermatological fields, such as fatty substances, detergent and/or conditioning surfactants, emulsifiers and co-emulsifiers, hydrophilic or lipophilic gelling agents, preservatives, antioxidants, solvents, exfoliating agents, perfumes, fillers, hydrophilic and lipophilic filters, coloring materials, acidic or basic neutralizing agents, pro-penetrating agents, and polymers.
  • excipients usually used in the cosmetic and dermatological fields, such as fatty substances, detergent and/or conditioning surfactants, emulsifiers and co-emulsifiers, hydrophilic or lipophilic gelling agents, preservatives, antioxidants, solvents, exfoliating agents, perfumes, fillers, hydrophilic and lipophilic filters, coloring materials, acidic or basic neutralizing agents, pro-penetrating agents, and polymers.
  • - the quantities of the various excipients included in the composition of the invention are those known in the field considered by those skilled in the art, and the sum of the quantities of excipients represents 0.01% to 99.99% of the total weight of the composition;
  • suitable fats include mineral oils, oils of animal origin such as lanolin, vegetable oils, synthetic oils such as isopropyl myristate, octyldodecanol, isostearyl isostearate, decyl oleate and isopropyl palmitate, and silicone oils such as cyclomethicone and dimethicone.
  • Fatty alcohols, fatty acids, waxes and gums, and in particular silicone elastomers may be used as fats;
  • nonionic, anionic, cationic or amphoteric surfactants such as for example alkyl sulfates, alkyl ether sulfates such as sodium lauryl ether sulfate, alkyl betaines such as cocamidopropyl betaine, or quaternary ammonium salts;
  • emulsifiers and co-emulsifiers mention may be made, for example, of polyglycerol fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, oxyethylenated sorbitan fatty acid esters, fatty alcohol PEG ethers, glycerol fatty acid esters, alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkyl phosphates, alkyl polyglucosides, alkyl polypentosides, dimethicone copolyols;
  • suitable hydrophilic gelling agents include, for example, carboxyvinyl polymers, acrylic copolymers (carbomers) such as acrylate/alkylacrylate copolymers, polyacrylamides, polysaccharides such as xanthan gum, guar gum, natural gums such as cellulose gum and derivatives, starches and derivatives thereof, clays and 2-acrylamido-2-methylpropane acid copolymers;
  • carboxyvinyl polymers acrylic copolymers (carbomers) such as acrylate/alkylacrylate copolymers, polyacrylamides, polysaccharides such as xanthan gum, guar gum, natural gums such as cellulose gum and derivatives, starches and derivatives thereof, clays and 2-acrylamido-2-methylpropane acid copolymers;
  • suitable lipophilic gelling agents include, for example, modified clays such as bentones, metal salts of fatty acids, hydrophobic silica, ethylcellulose, dextrose esters, hydrogenated castor oil and its derivatives, polyurethanes and magnesium salts;
  • suitable preservatives include, for example, benzoic, sorbic, propionic, salicylic, dehydroacetic acids and their salts, benzyl alcohol, ethylhexylglycerin, parabens, their salts and esters, triclosan, imidazolidinyl urea, phenoxyethanol, DMDM hydantoin, diazolidinyl urea, chlorphenesin;
  • suitable antioxidants include, for example, chelating agents such as EDTA and its salts, sodium metabisulfite, salicylic, ascorbic and citric acids and their salts, sodium tartrate, sodium gluconate, carotenoids and tocopherols;
  • solvents which can be used in the composition we can cite for example water, ethanol, glycerin, propylene glycol, propanediol, butylene glycol, sorbitol;
  • exfoliating agents such as AHAs
  • suitable exfoliating agents mention may be made, for example, of chemical exfoliants such as AHAs, and physical exfoliants such as natural or synthetic powders;
  • talc kaolin
  • mica serecite, magnesium carbonate, aluminum silicate, magnesium silicate, organic powders such as nylon;
  • suitable dyes for example, of lipophilic dyes, hydrophilic dyes, pigments and nacres usually used in cosmetic or dermatological compositions, and their mixtures;
  • suitable neutralising agents include basic agents such as, for example, sodium hydroxide, triethanolamine, aminomethylpropanol and potassium hydroxide, and acidic agents such as, for example, citric acid and lactic acid;
  • suitable pro-penetrating agents include, for example, alcohols and glycols (ethanol, propylene glycol), ethoxydiglycol, alcohols and fatty acids (oleic acid), fatty acid esters, dimethyl isosorbide;
  • composition of the invention may also contain in addition one or more other active ingredients than the extract of Punica granatum var. Cybamate according to the invention;
  • the appropriate active agent according to the invention is chosen from anti-radicals or more generally antioxidants; whiteners; pigmentants; emollients; moisturizers; anti-seborrheic agents; anti-inflammatories; anti-acne agents; keratolytic and/or desquamating agents; anti-wrinkle and tightening agents; draining agents; anti-irritant agents; soothing agents; vitamins and their mixtures; notifying agents; anti-aging active agents such as retinol; healing agents; antiseptics and essential oils.
  • Another subject of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for use as a medicament, advantageously as a medicament for dermatological use, preferably as a topical medicament for dermatological use.
  • Another subject of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele or a composition comprising said extract for dermatological use in the prevention and treatment of inflammatory conditions.
  • Another object of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for use as an antioxidant.
  • Another object of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for use as an anti-inflammatory.
  • Another object of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for use as an antibacterial.
  • Another object of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for use as an anti-acne agent.
  • Another object of the present invention relates to the use, advantageously the cosmetic and/or non-therapeutic use, of an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract as an agent skin sebum regulator (or regulator of skin sebum production), advantageously for acne-prone skin and/or oily skin and/or combination skin and/or skin with non-inflammatory imperfections.
  • skin sebum regulator or regulator of skin sebum production
  • Another subject of the present invention relates to the use, advantageously the cosmetic and/or non-therapeutic use, of an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for preventing and/or reducing hyperseborrhea of the skin, preferably acne-prone skin.
  • Another subject of the present invention relates to the use, advantageously the cosmetic and/or non-therapeutic use, of an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for improving and/or correcting the size of the pores of the skin, advantageously of acne-prone skin and/or oily skin and/or combination skin and/or skin with non-inflammatory imperfections.
  • Another subject of the present invention relates to the use, advantageously the cosmetic and/or non-therapeutic use, of an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract as a sebum-regulating agent for hair, advantageously oily hair.
  • Another object of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for use as a healing agent.
  • Another object of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for use as an anti-aging agent.
  • Another object of the present invention relates to an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract for use as a depigmenting agent.
  • Another object of the present invention relates to the use, advantageously the cosmetic and/or non-therapeutic use, of an extract of Punica granatum var. Cybele as described above or a composition comprising said extract as an anti-aging or depigmenting agent.
  • Another subject of the present invention relates to a method for combating skin aging, the method comprising the topical application to the skin and/or mucous membranes and/or appendages of an extract of Punica granatum var. Cybele as described above.
  • microsatellite genetic markers used during the analysis allow the characterization of variety or ecotype (i.e., variety closely linked to its ecological environment) of the same species. These specific markers make it possible to differentiate varieties by targeting the genetic zones specific to each species while presenting a genetic motif repeated a certain number of times depending on the variety or ecotype.
  • Punica granatum out of the ten microsatellites identified through bibliographic references, 4 SSR markers (PG-2, 3, 4 and 6) were chosen on the basis of different criteria specific to genetic analysis, i.e., the percentage of heterozygosity, the conditions of use and the size of the targeted genetic fragment).
  • Markers PG-2, 4 and 6 are not differentiating: the size of the markers in base pairs is identical for the 2 varieties.
  • marker PG-3 shows a significant difference of 3 base pairs (bp): PG-3 has a size of 107bp for the variety “Cybblock”, and a size of 104bp for the variety Wonderful.
  • This difference present in the genome of the variety Cybblock is not a function of the growth stage, nor the result of a modification by an environmental change or by a cultivation method.
  • the presence of a supernumerary copy of marker PG-3 compared to the variety Wonderful clearly demonstrates the genetic difference between the varieties Cybblock and Wonderful.
  • Example 2 Preparation of fruit extracts of Punica granatum var. Cybele and var. Wonderful
  • the dried pomegranate ground material is extracted with the solvent Propanediol/Water with a mass composition of 60/40 (denoted PDo/Water), according to a mass ratio of ground material/solvent of 5:95 for 3 hours at 70°C with continuous mechanical stirring.
  • the extract and the vegetable cake are then separated by filtration on a 200um mesh nylon cloth.
  • the crude extract is then filtered under pressure on cellulose plates then on a cellulose acetate membrane with a cut-off threshold of 0.2iim.
  • Method 2 NaDES FGE115, extracts 2A and 2B
  • the dried pomegranate ground material is extracted by the NaDES solvent Fructose/Glycerin/Water with a mass composition of 50/25/25 (denoted FGE115), according to a mass ratio of ground material/solvent of 5:95 for 3 hours at 70°C with continuous mechanical stirring.
  • the extract and the vegetable cake are then separated by filtration on a 200 um mesh nylon cloth.
  • the crude extract is then filtered under pressure on cellulose plates then on a cellulose acetate membrane with a cut-off threshold of 0.2 um.
  • the dried pomegranate ground material is extracted with the Ethanol/Water solvent with a mass composition of 60/40 (denoted EtOH/Water), according to a ground material/solvent mass ratio of 5:95 for 3 hours at 70°C with continuous mechanical stirring.
  • the extract and the plant cake are then separated by filtration on a 200um mesh nylon cloth.
  • the crude extract is then filtered under pressure on cellulose plates and then on a cellulose acetate membrane with a cut-off threshold of 0.2um.
  • the dry extract concentration of the liquid extract is determined on a sample by drying at 105°C.
  • the ethanol in the extract can be substituted by a glycol, such as propanediol, in order to facilitate its use in the greatest number of cosmetic compositions.
  • the hydro-ethanolic extract is then concentrated under reduced pressure until a soft extract is obtained.
  • the soft extract is then completely solubilized in the hydro-glycolic solvent of process 1 (Propanediol/Water 60/40 m/m), at a dry extract concentration identical to the dry extract determined on the hydro-ethanolic extract.
  • the hydro-glycolic solution is then filtered under pressure on cellulose plates then on a cellulose acetate membrane at a cut-off threshold of 0.2 pm.
  • Example 3 Physicochemical characterization of purple and red pomegranate extracts
  • the visual appearance is determined for the pure extract placed in a colorless and transparent glass tube with a diameter of 1 cm.
  • the L*a*b* color indices are measured on the pure extract in a square PMMA plastic tank with a 10 mm optical path, with the 10° observer and the D65 illuminant (Konica Minolta equipment).
  • the dry extract is determined by halogen drying by applying a drying program at 125°C with preliminary stage (180°C - 5min) for a stopping criterion of 3, for a test sample of 3g of pure extract (Mettler Toledo equipment). This determination is not technically feasible for NaDES FGE115 extracts, given the non-volatility of the solvent.
  • Example 4 Characterization of the phytochemical composition of purple and red pomegranate extracts
  • the concentration of total polyphenols in the extracts is measured according to the Prussian blue method by absorption spectrophotometry at 725 nm after reaction of the extract with iron III chloride and potassium hexacyanoferrate III (Mettler Toledo UV-visible spectrophotometer). A calibration range is carried out with the punicalagin standard (Sigma, mixture a and P). The concentration of total polyphenols expressed in punicalagin equivalent is determined in g per 100 g of extract.
  • the concentration of total polyphenols, punicalagins a and P and ellagic acid is significantly higher in all purple pomegranate extracts according to the invention compared to that of red pomegranate extracts.
  • the PDo/Water solvent allows to obtain the highest concentration of total polyphenols, punicalagins a and P and ellagic acid and total anthocyanins.
  • the 2 other extraction solvents e.g., FGE115 and EtOH/Water
  • FGE115 and EtOH/Water also allow to extract these families but with different quantitative performances depending on the molecules.
  • Example 5 Evaluation of the antioxidant activity of purple and red pomegranate extracts
  • 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl is a free radical, stable at room temperature, which has a dark violet color in solution in ethanol and absorbs in the wavelengths between 510 and 530 nm.
  • DPPH Due to its structure, DPPH can be reduced by accepting a hydrogen atom from other compounds. This reduction is accompanied by a disappearance of the violet color of the solution and therefore a drop in absorbance directly proportional to the number of atoms captured.
  • the products to be tested are added to an ethanolic solution of DPPH, incubated for 30 minutes at room temperature (18-25°C) away from light, then an absorbance reading is taken at 518 nm using a spectrophotometer.
  • An experimental blank is carried out using an ethanol solution alone to which the products to be tested are added. The blank values are deduced from the experimental values to avoid any possible interference linked to the specific color of the products.
  • Example 6 Evaluation of the anti-inflammatory activity of purple and red pomegranate extracts
  • NHEKs normal human epidermal keratinocytes
  • the assay is performed using monolayer cultures of KEHN.
  • the cytokines IL-6 and IL-8 are assayed in the supernatants of KEHN cultures pre-incubated in the presence of the test products before being stimulated for 24 hours by a mixture of interferon gamma (IFN-y) and tumor necrosis factor alpha (T Fa) in the presence of the test products.
  • IFN-y interferon gamma
  • T Fa tumor necrosis factor alpha
  • Two assay methods are then used: an ELISA assay and a flow cytometry assay.
  • Example 7 Evaluation of the sebum-regulating activity of purple and red pomegranate extracts
  • sebocytes which are the specialized cells producing the lipids constituting the skin's sebum, were used in in vitro culture.
  • Sebocytes are incubated for 30 minutes with the BODIPYTM fluorescent probe, which stains lipids in fluorescent green. Lipids are then visualized by fluorescence (Ex493/Em503) and then quantified by image analysis with the Cytation 5 multimode plate reader (Agilent Biotek). Sebocyte cell nuclei are labeled with DAPI to normalize the amount of lipids per cell.
  • extract 1 A has sebum-regulating properties by reducing lipid synthesis in sebocytes.
  • the sebum-regulating effect of extract IA is stronger at 0.2% than at 0.1%.
  • the quantities of lipids measured in sebocytes treated with the IB extract are equivalent to the quantities measured in untreated sebocytes. In other words, the IB extract does not have sebum-regulating properties.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation cosmétique et/ou dermatologique d'un extrait de Punica granatum var. Cybèle ou d'une composition comprenant ledit extrait.

Description

Description
Titre de l’invention : Extrait de Punica granatum variété Cybèle et ses utilisations en cosmétique
Domaine de l’invention
[0001] La présente invention concerne un extrait de Punica granatum variété Cybèle et une composition cosmétique comprenant ledit extrait. L’invention concerne également l’utilisation cosmétique et/ou dermatologique dudit extrait ou de ladite composition pour les soins de la peau, notamment pour lutter contre le vieillissement cutané.
Etat de la technique
[0002] Le grenadier, appartenant à l’espèce Punica granatum, est un arbuste mesurant en moyenne 3 à 6m de hauteur et classée dans la famille des Lythracées.
[0003] Son aire de répartition géographique est très large. Les pays d’origine du grenadier s’étendent de la Turquie au Caucase, du Turkménistan à Test jusqu’en Iran, Afghanistan et Pakistan. Sur tout le pourtour méditerranéen et au proche orient, le grenadier est cultivé depuis des siècles, en particulier pour ses fruits, les grenades.
[0004] Les grenades sont des baies globuleuses, au péricarpe coriace qui, à maturité ( e., de septembre à octobre), vire du jaune au rouge-orangé voire violacé à noir en fonction des variétés. Le fruit est surmonté des restes du calice de la fleur, formant une couronne dentelée et lui donnant une forme atypique facilement identifiable. La grenade est constituée de 6 à 12 loges membraneuses blanchâtres de saveur âpre contenant de nombreuses graines triangulaires nommées arilles. Ces graines possèdent un mésocarpe charnu et gélatineux, généralement acidulé et sucré, représentant la partie comestible du fruit.
[0005] Il existe plus de 1200 variétés différentes de grenadier par le monde. Elles se distinguent en particulier pour ce qui concerne le fruit par l’acidité et le diamètre, la couleur du péricarpe, le nombre de graines et la précocité. On peut citer par exemple la variété Wonderful, grenade rouge d’Israël, réputée pour ses fruits doux et sucrés. Quelques variétés de grenadier ont été implantées dans les régions à hiver doux d’Europe centrale, en particulier en France où on le retrouve notamment dans les régions de la moitié sud.
[0006] La composition phytochimique des variétés donnant des fruits rouges de l’espèce Punica granatum est bien documentée et permet de mettre en évidence les familles majoritaires comme les acides hydroxycinnamiques et plus particulièrement les acides caféique, chloro- génique, férulique, quinique et p-coumarique très présents dans le péricarpe du fruit ; les flavonoïdes de type flavones et flavonols (glycosides de lutéoline, quercétine, apigénine, naringénine et isorhamnétine) en abondance également dans le péricarpe ; ou encore les tanins hydrolysables de type ellagitanins (punicalagines) et les sapogénines triterpéniques (acide ursolique) présents dans les graines, le péricarpe et les feuilles.
[0007] Compte tenu de leur composition phytochimique particulière et bien connue, les variétés de Punica granatum donnant des fruits rouges sont privilégiées dans les formulations cosmétiques ou de compléments alimentaires, etc. [0008] Le fruit constitue la source d’extraction la plus usitée mais c’est surtout une partie spécifique qui est exploitée à savoir l’écorce ou la graine, ce qui nécessite des étapes supplémentaires de séparation ayant des effets directs sur le coût de l’extraction.
[0009] A titre d’exemple, les documents FR 3 031 901, WO 2021/064034 ou encore WO 2021/209593 décrivent des extraits de Punica granatum donnant des fruits rouges et leurs utilisations cosmétiques, notamment pour la réalisation de compositions orales ou de compléments alimentaires, la prévention solaire ou pour lutter contre l’acné. A noter que les sé- bocytes participent à la physiopathologie de l’acné du fait de leur rôle de production du sébum. En effet, il apparait que (i) la dysséborrhée rend le sébum de mauvaise qualité de par un déficit en vitamine E, notamment. Les éléments du sébum, et plus particulièrement le squalène, sont oxydés. Les lipides oxydés sont connus pour leur propriétés pro-inflamma- toire et cytotoxique (ii) l’hyperséborrhée est une surproduction de sébum ou un excès de sébum qui induit des problèmes de peau comme l’acné. L’hyperséborrhée participe notamment à la prolifération de Cutibacterium acnés qui contribue à la réaction inflammatoire locale. Les extraits décrits par les documents FR 3 031 901, WO 2021/064034 ou encore WO 2021/209593, mentionnés précédemment, nécessitent différentes phases de concentration, voire de purification de familles phytochimiques particulières afin d'accroître leur efficacité. Ces procédés requièrent donc des étapes supplémentaires de fabrication ayant des effets directs sur la consommation énergétique et donc sur le coût global de production.
[0010] Certaines variétés considérées comme ornementales portent des fruits plus petits, et généralement plutôt acides et âpres, ce qui les rend impropres à la consommation.
[0011] C’est de ce type de variétés impropres à la consommation que sont issues les grenades violette de la variété Cybèle ou Punica granatum variété Cybèle (var. Cybèle). La peau de cette variété Cybèle est d’une couleur rare, violacée, presque noire. Cependant, contrairement à d’autres variétés dites noires, comme les variétés Asmar ou Nera del Salento dont les fruits aux arilles rouges sont doux et sucrés, le fruit de la variété Cybèle possède des arilles de couleur blanche à rose très pâle, à la saveur amère et extrêmement acide, les rendant impropres à la consommation.
[0012] Cette variété Cybèle n’a fait l’objet d’aucune publication scientifique, concernant notamment ses caractéristiques génétiques et phytochimiques.
[0013] Punica granatum var. Cybèle est une variété ornementale, qui présente aussi des avantages agronomiques : elle est efficace pour repousser les insectes ravageurs et permettre une culture sans utilisation de pesticide. C’est un atout majeur pour la production en biodynamie ou en coculture.
[0014] L’espèce Punica granatum est riche d’une longue histoire d’usages traditionnels et populaires qui remonte à l’Egypte antique. La grenade est particulièrement décrite dans les mé- décines traditionnelles chinoise et ayurvédique, mais elle est aussi présente dans les systèmes médicaux Perse et Greco-arabe.
[0015] Toutes les parties du grenadier sont décrites comme ayant des propriétés thérapeutiques telles que des propriétés vermifuges, notamment reconnues efficaces contre le ténia ; dans le traitement des affections buccales, des maux de ventre, des ulcères, pour traiter les inflammations, les saignements gingivaux ou encore pour éliminer la plaque dentaire. Certaines applications, plus rarement citées, font références à des affections de la peau. La médecine traditionnelle chinoise, décrit en effet le fruit, comme utile pour traiter les furonculoses, ou les escarres.
[0016] Des études basées sur différents modèles cellulaires ou tissulaires confirment les propriétés biologiques de différentes parties du grenadier. A titre d’exemple, on peut citer des propriétés antioxydantes portée majoritairement par son contenu en composés polyphénoliques (flavonoïdes, tannins, anthocyanes) ; des propriétés anti-inflammatoires, anti-bactériennes, anti-acnéiques, cicatrisantes, anti-âge ou encore une activité dépigmentante.
[0017] 11 existe de nombreux produits cosmétiques, notamment pour le soin de la peau, contenant des extraits de grenade. Toutefois, ces extraits proviennent essentiellement de variétés de grenade dont le fruit est comestible, notamment du fait de l’abondance de ces variétés rouges et de leur composition phytochimique spécifique et bien décrite, telle que Punica granatum var. Wonderful.
[0018] Il subsiste donc un besoin évident pour un extrait de Punica granatum, notamment une alternative aux extraits existants présentant des propriétés cosmétiques au moins équivalentes, voire améliorées par rapport aux extraits de Punica granatum de l’état de la technique, notamment pour lutter efficacement contre le vieillissement cutané, qui soit dépourvu d’effets toxiques ou irritants, efficace pour les soins cosmétiques de la peau et dont la production soit moins coûteuse, moins énergivore et moins consommatrice d’eau (z.e., démarche d’écoconception) par rapport aux procédés de fabrication de l’état de la technique.
Exposé de l’invention
[0019] La Demanderesse a pu identifier, de manière inattendue et surprenante, une variété particulière de Punica granatum, parfaitement adaptée à l’utilisation cosmétique et/ou dermatologique sur peau humaine, et qui répond aux besoins détaillés précédemment.
[0020] En particulier, elle a identifié l’espèce Punica granatum variété Cybèle dont les fruits ne sont pas comestibles et qui, comme mentionné précédemment, est une alternative efficace aux extraits de fruit de Punica granatum, notamment ceux issus de variétés comestibles telle que Punica granatum var. Wonderful.
[0021] La Demanderesse a conduit des études de comparaison variétale qui ont permis de mettre en évidence une divergence génétique entre Punica granatum var. Wonderful et Punica granatum var. Cybèle (voir l’exemple 1).
[0022] La composition phytochimique de la grenade violette variété Cybèle diffère de celle d’autres variétés à fruits rouges de Punica granatum telle que Punica granatum var. Wonderful. La Demanderesse a en effet conduit des études de comparaison de la composition phytochimique, qui ont permis de mettre en évidence des divergences phytochimiques entre les fruits de Punica granatum var. Wonderful et de Punica granatum var. Cybèle (voir l’exemple 4).
[0023] Ainsi, un premier objet de l’invention concerne une utilisation cosmétique, c’est-à-dire non thérapeutique, et topique d’un extrait de Punica granatum var. Cybèle ou d’une composition comprenant ledit extrait. [0024] La présente invention offre divers avantages, notamment le fait de présenter des propriétés biologiques particulières liées aux activités de l’extrait de l’invention, à savoir des activités cosmétiques antioxydantes, anti-inflammatoires, anti-âge, antibactériennes, cicatrisantes, dépigmentantes, séborégulatrices ou encore anti-acnéique. En outre Lutilisation de Punica granatum var. Cybèle permet de ne pas détourner les variétés de de Punica granatum produisant des fruits comestibles, par exemple de Punica granatum var. Wonderful.
[0025] Dans le cadre de l’invention, l’expression « fruit entier » désigne l'ensemble constitué du péricarpe (écorce), du reste du calice, des loges membraneuses, de la pulpe et des graines (arilles).
[0026] Dans le cadre de l’invention, l’expression « solvant d’extraction » désigne le solvant utilisé lors de l’étape d’extraction solide/liquide.
[0027] Avantageusement, l’utilisation cosmétique de l’extrait de Punica granatum var. Cybèle ou d’une composition comprenant ledit extrait selon l’invention présente les caractéristiques techniques additionnelles suivantes, prises seules ou en combinaisons :
- l’utilisation cosmétique est pour lutter contre le vieillissement cutané ;
- l’utilisation cosmétique est pour stimuler l’éclat du teint ;
- l’utilisation cosmétique est pour apaiser la peau ;
- l’utilisation cosmétique est pour lutter contre le relâchement de la peau ;
- l’utilisation cosmétique est pour lutter contre l’apparition des rides et/ou ridules ;
- l’utilisation cosmétique est pour lutter contre les rides et/ou ridules ;
- l’utilisation cosmétique est comme antioxydant ;
- l’utilisation cosmétique est comme anti-inflammatoire ;
- l’utilisation cosmétique est comme séborégulateur/agent séborégulateur/ agent améliorant la séborégulation, de la peau ;
- l’utilisation cosmétique est pour diminuer la taille des pores de la peau ;
- l’utilisation cosmétique est sur peau saine et/ou sur peau à tendance acnéique, c’est-à-dire d’un sujet présentant une peau saine. Au sens de l’invention, une peau à tendance acnéique est à distinguer d’une peau acnéique qui est une peau pathologique (i.e. inflammation avérée). La peau à tendance acnéique est une peau saine qui est généralement grasse en raison d’une sécrétion excessive de sébum mais qui ne présente pas d’inflammation et/ou de prolifération excessive de populations bactériennes commensales ou pathogènes ;
- l’utilisation cosmétique est sur peau saine et/ou sur peau grasse (aspect brillant et luisant) et/ou une peau mixte et/ou une peau présentant des imperfections non-inflammatoires (e.g. points noirs, boutons, comédons). Au sens de l’invention, une peau grasse, mixte et/ ou présentant des imperfections non-inflammatoires n’est pas une peau pathologique ;
- l’utilisation cosmétique est sur cheveux gras ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle est susceptible d’être obtenu par un procédé d’extraction solide/liquide mettant en œuvre un solvant d’extraction, suivi d’une seconde étape de séparation solide/liquide et enfin d’une troisième étape de récupération de la phase liquide ;
- le solvant d’extraction mis en œuvre dans le procédé d’extraction solide/liquide (ou solvant d’extraction) est sélectionné dans le groupes de substances suivantes utilisées seules ou en mélange : eau ; glycols tels que 1.3-propanediol, 1 ,2-propanediol, 1.3-butanediol ; des polyols tels que glycérine ; des alcools tels que éthanol ; et des Natural Deep Eutec- tiques Solvents (NaDES) tels que ceux décrits dans FR3036618, en particulier le NaDES Fructose/Glycérine/Eau en proportions molaires 1 :1 :5 (noté NaDES FGE115) ; avantageusement constitué par un mélange de propanediol et d’eau ; un mélange d’éthanol et d’eau ; et un mélange de fructose, de glycérine et d’eau ; de préférence un mélange de propanediol et d’eau
- le rapport massique du mélange de propanediol et d’eau est compris entre 10/90 et 90/10, avantageusement est de 60/40 ;
- le rapport massique du mélange d’éthanol, et d’eau est compris entre 10/90 et 90/10, avantageusement est de 60/40 ;
- le rapport massique du mélange de fructose, de glycérine et d’eau au cours de l’étape d’extraction est compris entre 55/28/17 et 45/23/32, avantageusement est de 50/25/25 ;
- le rapport massique du broyât de Punica granatum var. Cybèle/solvant est compris entre 1:99 et 50:50, avantageusement entre 2:98 et 15:85 ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention est un extrait obtenu à partir du fruit mature ou immature, avantageusement du fruit mature ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention est un extrait obtenu à partir du fruit entier, d’écorce de fruit, de graine du fruit, d’écorce du tronc, de racines, de fleurs, de tiges foliaires, et/ou de feuilles, avantageusement un extrait de fruit entier ;
- la partie de plante de Punica granatum var. Cybèle mise en œuvre pour obtenir un extrait utilisé selon l’invention est fraîche, congelée, séchée, entière, coupée et/ou broyée ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention a une composition phy- tochimique/teneur en polyphénols totaux supérieure ou égale à 0,5 g/lOOg ; avantageusement comprise entre 0,8 et 1,0 g/lOOg ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention a une composition phy- tochimique/teneur en punicalagines a et P supérieure ou égale à 0,3 g/lOOg ; avantageusement comprise entre 0,4 et 0,6 g/lOOg ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention a une composition phy- tochimique/teneur en acide ellagique supérieure ou égale à 30 mg/kg, avantageusement comprise entre 100 et 150 mg/kg ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention a une composition phy- tochimique/teneur en anthocyanes totaux supérieure ou égale à 3 mg/kg, avantageusement comprise entre 4 et 9 mg/kg ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention a une composition phy- tochimique/teneur en myrtilline supérieure ou égale à 1 mg/kg ; avantageusement comprise entre 2 et 4 mg/kg ;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention a mie composition phy- tochimique/teneur en kuromanine supérieure ou égale à 1 mg/kg ; avantageusement comprise entre 1.5 et 3 mg/kg;
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle utilisé selon l’invention a une composition phy- tochimique/teneur en anthocyanes autres que la kuromarine et la myrtilline supérieure ou égale à 0.5 mg/kg ; avantageusement comprise entre 1.0 et 2.5 mg/kg. ;
[0028] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cy- bèle susceptible d’être obtenu par un procédé d’extraction solide/liquide d’un broyât de Punica granatum var. Cybèle mettant en œuvre un solvant d’extraction, suivi d’une seconde étape de séparation solide/liquide et enfin d’une troisième étape de récupération de la phase liquide, caractérisée en ce que le solvant d’extraction est sélectionné dans le groupe constitué par un mélange de propanediol et d’eau ; un mélange d’éthanol et d’eau ; et un mélange de fructose, de glycérine et d’eau.
[0029] Avantageusement, l’extrait de Punica granatum var. Cybèle de l’invention présente les caractéristiques techniques additionnelles suivantes, prises seules ou en combinaisons :
- le solvant d’extraction selon l’invention est liquide à température ambiante, ce qui facilite la mise en œuvre du procédé conduisant à l’extrait de l’invention ;
- l’extraction solide/liquide peut être effectuée par différentes techniques connue dans le domaine considéré par l’ Homme du métier, telles que macération, remacération, digestion, macération dynamique, décoction, extraction en lit fluide, extraction assistée par microondes, extraction assistée par ultra-sons, extraction à contre -courant, percolation, re-perco- lation, lixiviation, extraction sous pression réduite, diacolation ;
- le rapport massique partie(s) de plante de Punica granatum var. Cybèle /solvant d’extraction appliqué pour l’étape d’extraction est compris entre 1 :99 et 50:50, avantageusement entre 2:98 et 15:85 ;
- l’étape d’extraction est effectuée à une température comprise entre 2 et 100°C, avantageusement entre 20 et 80°C ;
- l’étape d’extraction peut être maintenue pendant quelques minutes à plusieurs jours ;
- l’étape d’extraction solide/liquide est réalisée sous agitation et/ou sous atmosphère d’azote de manière à optimiser l’extraction des composés actifs tout en protégeant ces composés de l’oxydation par l’oxygène de l’air ;
- l’étape d’extraction solide/liquide est suivie d’une étape de séparation solide/liquide, pour récupérer la phase liquide (ou filtrat de séparation solide/liquide), contenant la matière active ;
- l’étape de séparation peut être effectuée par toute technique connue dans le domaine considéré par l’Homme du métier, en particulier l’égouttage, le pressage, l’essorage, la centrifugation ou la filtration ;
- l’étape de séparation liquide/solide peut être suivie d’une étape de concentration, laquelle permet d’obtenir un concentré, sous forme liquide ou semi-solide selon le facteur de concentration ;
- l’étape de concentration est effectuée par évaporation sous pression réduite ou osmose inverse ;
- le filtrat de séparation solide/liquide ou le concentré subissent en outre une ou plusieurs étapes de clarification ;
- l’étape de clarification met en œuvre tout type de filtration frontale et/ou tangentielle connue dans le domaine considéré par l’Homme du métier ;
- l’étape de séparation liquide/solide ou de concentration ou de clarification peut être suivie d’une étape de fractionnement pour obtenir une fraction d’une ou plusieurs familles phytochimiques, sous forme liquide ou semi-solide selon le facteur de concentration ;
- l’étape de fractionnement peut être effectuée par toute technique connue dans le domaine considéré par l’Homme du métier, en particulier par chromatographie sous pression réduite, ultrafiltration ou nanofiltration ; et/ou
- le procédé de l’invention peut comprendre une étape de filtration stérilisante ;
- l’étape de filtration stérilisante est réalisée en filtrant le produit à travers un filtre comprenant des pores d’un diamètre de 0,22 iim.
[0030] Un autre objet de la présente invention concerne une composition comprenant l’extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment.
[0031] Avantageusement, la composition selon l’invention est une composition cosmétique et/ou dermatologique.
[0032] Avantageusement, la composition de l’invention présente les caractéristiques techniques additionnelles suivantes, prises seules ou en combinaisons :
- l’extrait de Punica granatum var. Cybèle selon l’invention représente entre 0,1% et 20% en poids de la composition, avantageusement entre 0,5% et 5% ;
- la composition de l’invention est une composition de soin de la peau, en particulier une composition pour lutter contre le vieillissement cutané ;
- la composition de l’invention est une composition anti-âge ;
- la composition de l’invention est une composition améliorant la séborégulation de la peau ;
- la composition de l’invention peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique rincée ou non rincée, par exemple sous forme anhydre, sous forme d’une émulsion huile-dans-eau, d’une émulsion eau-dans-huile, d’une émulsion multiple, d’une émulsion siliconée, d’une microémulsion, d’une nanoémulsion, d’un gel, d’une solution aqueuse ou d’une solution hydroalcoolique ;
- la composition de l’invention peut être plus ou moins fluide et se présenter sous forme d’une crème blanche ou colorée, d’une pommade, d’un lait, d’une lotion, d’un sérum, d’un gel, d’une base lavante, ou d’un stick. Elle peut être utilisée dans de nombreux traitements de la peau, des lèvres et des cheveux, y compris du cuir chevelu, notamment pour protéger et/ou soigner la peau, les lèvres et/ou les cheveux, et/ou pour maquiller la peau et/ou ou les lèvres ;
- la composition de l’invention peut contenir les excipients habituellement utilisés dans les domaines cosmétique et dermatologique, tels que les matières grasses, les tensioactifs détergents et/ou conditionnants, les émulsionnants et co-émulsionnants, les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les agents exfoliants, les parfums, les charges, les filtres hydrophiles et lipophiles, les matières colorantes, les agents neutralisants acides ou basiques, les agents pro-pénétrants, et les polymères. Ces types d’excipients sont tous bien connus de l’homme du métier ;
- les quantités des différents excipients compris dans la composition de l’invention sont celles connues dans le domaine considéré par l’Homme du métier, et la somme des quantités d’excipients représente 0,01% à 99,99% du poids total de la composition ; - comme matières grasses appropriées, on peut citer les huiles minérales, les huiles d’origine animale telles que la lanoline, les huiles végétales, les huiles de synthèse telles que le myristate d’isopropyle, l’octyldodécanol, l’isostéarate d’isostéaryle, l’oléate de décyle et le palmitate d’isopropyle, et les huiles siliconées telles que la cyclomethicone et la dimethi- cone. On peut utiliser comme matières grasses des alcools gras, des acides gras, des cires et des gommes, et en particulier des élastomères de silicone ;
- comme tensioactifs détergents et/ou conditionnants appropriés, on peut citer les tensioac- tifs non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères, et leurs mélanges, tels que par exemple les alkylsulfates, les alkyléthersulfates tels que le lauryl éther sulfate de sodium, les alkyl bétaïnes telles que la cocamidopropylbetaïne, ou les sels d’ammonium quaternaires ;
- comme émulsionnants et co-émulsionnants appropriés, on peut citer par exemple les esters de polyglycérols et d’acide gras, les esters de sucrose et d’acide gras, les esters de sor- bitane et d’acide gras, les esters d’acide gras et de sorbitane oxyéthylénés, les ethers d’alcool gras et de PEG, les esters de glycérol et d’acide gras, les alkyl sulfates, les alkyl ether sulfates, les alkyl phosphates, les alkyl polyglucosides, les alkyl polypentosides, les di- methicone copolyols ;
- comme gélifiants hydrophiles appropriés, on peut citer par exemple les polymères car- boxyvinyliques, les copolymères acryliques (carbomers) tels que les copolymères d’acry- lates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que la gomme xanthane, la gomme guar, les gommes naturelles telles que la gomme de cellulose et dérivés, les amidons et leurs dérivés, les argiles et les copolymères d’acide 2-acrylamido-2-méthylpro- pane ;
- comme gélifiants lipophiles appropriés, on peut citer par exemple les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d’acides gras, la silice hydrophobe, l’éthylcellu- lose, les esters de dextrose, l’huile de ricin hydrogénée et ses dérivés, les polyuréthanes et les sels de magnésium ;
- comme conservateurs appropriés, on peut citer par exemple les acides benzoïque, sor- bique, propionique, salicylique, dehydroacétique et leurs sels, l’alcool benzylique, l’éthyl- hexylglycérine, les parabens, leurs sels et esters, le triclosan, l’imidazolidinyl urée, le phenoxyethanol, la DMDM hydantoïne, le diazolidinyl urée, la chlorphénésine;
- comme antioxydants appropriés, on peut citer par exemple les agents chelatants tels que l’EDTA et ses sels, le metabisulfite de sodium, les acides salicylique, ascorbique et citrique et leurs sels, le tartrate de sodium, le gluconate de sodium, les caroténoïdes et les tocophé- rols ;
- comme solvants utilisables dans la composition (distinct du solvant d’extraction), on peut citer par exemple l’eau, l’éthanol, la glycérine, le propylène glycol, le propanediol, le butylène glycol, le sorbitol ;
- comme agents exfoliants appropriés selon l’invention, on peut citer par exemple les exfoliants chimiques tels que les AHA, et les exfoliants physiques tels que les poudres naturelles ou synthétiques ;
- comme charges appropriées selon l’invention, on peut citer par exemple le talc, le kaolin, le mica, la serecite, le magnesium carbonate, l’aluminium silicate, le magnesium silicate, les poudres organiques telles que le nylon ;
- comme colorants appropriés selon l’invention, on peut citer par exemple les colorants li- pophiles, les colorants hydrophiles, les pigments et les nacres habituellement utilisés dans les compositions cosmétiques ou dermatologiques, et leurs mélanges ;
- comme agents neutralisants appropriés, on peut citer les agents basiques tels que par exemple la soude, la triethanolamine, l’aminomethyl propanol et l’hydroxyde de potassium, et les agents acides tels que par exemple l’acide citrique et l’acide lactique ;
- comme agents pro-pénétrants appropriés, on peut citer par exemple les alcools et glycols (éthanol, propylène glycol), l’éthoxydiglycol, les alcools et acides gras (acide oléique), les esters d’acides gras, le dimethyl isosorbide ;
- la composition de l’invention peut également contenir en outre un ou plusieurs autres actifs que l’extrait de Punica granatum var. Cybèle selon l’invention ;
- l’actif approprié selon l’invention est choisi parmi les anti-radicalaires ou plus généralement les antioxydants ; les blanchissants ; les pigmentants ; les émollients ; les hydratants ;les anti-séborrhéiques ; les anti-inflammatoires ; les anti-acnéiques ; les agents kéra- tolytiques et/ou desquamants ;les agents antirides et tenseurs ; les agents drainants ; les agents anti-irritants ; les agents apaisants ; les vitamines et leurs mélanges ; les agents notifiants ; les actifs anti-âge tel que le rétinol ; les cicatrisants ; les antiseptiques et les huiles essentielles.
[0033] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation comme médicament, avantageusement comme médicament à usage dermatologique, de préférence comme médicament topique à usage dermatologique.
[0034] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation dermatologique dans la prévention et le traitement des états inflammatoires.
[0035] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation comme antioxydant.
[0036] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation comme anti-inflammatoire.
[0037] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation comme antibactérien.
[0038] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation comme anti-acnéique.
[0039] Un autre objet de la présente invention concerne l’utilisation, avantageusement l’utilisation cosmétique et/ou non-thérapeutique, d’un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait comme agent séborégulateur de la peau (ou régulateur de la production de sébum de la peau), avantageusement de la peau à tendance acnéique et/ou de la peau grasse et/ou de la peau mixte et/ou de la peau présentant des imperfections non-inflammatoires.
[0040] Un autre objet de la présente invention concerne l’utilisation, avantageusement l’utilisation cosmétique et/ou non-thérapeutique, d’un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour prévenir et/ou diminuer l’hyperséborrhée de la peau, de préférence de la peau à tendance acnéique.
[0041] Un autre objet de la présente invention concerne l’utilisation, avantageusement l’utilisation cosmétique et/ou non-thérapeutique, d’un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour améliorer et/ou corriger la taille des pores de la peau, avantageusement de la peau à tendance acnéique et/ou de la peau grasse et/ou de la peau mixte et/ou de la peau présentant des imperfections non- inflammatoires.
[0042] Un autre objet de la présente invention concerne l’utilisation, avantageusement l’utilisation cosmétique et/ou non-thérapeutique, d’un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait comme agent séborégulateur des cheveux, avantageusement des cheveux gras.
[0043] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation comme cicatrisant.
[0044] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation comme anti-âge.
[0045] Un autre objet de la présente invention concerne un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait pour utilisation comme dépigmentant.
[0046] Un autre objet de la présente invention concerne l’utilisation, avantageusement l’utilisation cosmétique et/ou non-thérapeutique, d’un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment ou une composition comprenant ledit extrait comme anti-âge ou dépigmentant.
[0047] Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de lutte contre le vieillissement cutané, le procédé comprenant l’application topique sur la peau et/ou les muqueuses et/ou les phanères d’un extrait de Punica granatum var. Cybèle tel que décrit précédemment.
[0048] La manière dont l’invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif et non limitatif, à l’appui des figures annexées.
Brève description des dessins
[Fig 1] Evaluation de l’activité antioxydante des extraits de fruit entier de Punica granatum var. Wonderful et Punica granatum var. Cybèle.
[Fig 2] Evaluation de l’effet des extraits de fruit entier de Punica granatum var. Wonderful et Punica granatum var. Cybèle sur la sécrétion d’IL-6.
[Fig 3] Evaluation de l’effet des extraits de fruit entier de Punica granatum var. Wonderful et Punica granatum var. Cybèle sur la sécrétion d’IL-8.
Exemples
[0049] Exemple 1 - Etude de la divergence génétique entre les variétés de grenadier Cybèle et Wonderful
[0050] Des études de comparaison variétale ont été réalisées sur des échantillons de fruit entier de Punica granatum var. Wonderful et Punica granatum var. Cybèle.
[0051] Les marqueurs génétiques microsatellites (ou Short Sequence Repeat ou SSR) utilisés lors de l’analyse permettent la caractérisation de variété ou d’écotype (i.e., variété étroitement liée à son environnement écologique) d’une même espèce. Ces marqueurs spécifiques permettent de différencier des variétés en ciblant les zones génétiques propres à chaque espèce tout en présentant un motif génétique répété un certain nombre de fois selon la variété ou l’écotype.
[0052] Pour l’espèce Punica granatum, sur la dizaine de microsatellites identifiés au travers de références bibliographiques, 4 marqueurs SSR (PG-2, 3, 4 et 6) ont été choisis sur la base de différents critères propre à l’analyse génétique i.e., le pourcentage d’hétérozygotie, les conditions d’utilisation et la taille du fragment génétique ciblé).
[0053] Les marqueurs PG-2, 4 et 6 ne sont pas différenciant : la taille des marqueurs en paire de bases est identique pour les 2 variétés. En revanche, le marqueur PG-3 présente une différence significative de 3 paires de base (pb) : PG-3 a une taille de 107pb pour la variété « Cybèle », et une taille de 104pb pour la variété Wonderful. Cette différence présente dans le génome de la variété Cybèle n’est pas fonction du stade de croissance, ni la résultante d’une modification par un changement environnemental ou par un mode de culture. La présence d’une copie surnuméraire du marqueur PG-3 par rapport à la variété Wonderful démontre clairement la différence génétique entre les variétés Cybèle et Wonderful.
[0054] Cette étude de comparaison variétale met en évidence une divergence génétique entre les variétés Punica granatum var. Wonderful et Punica granatum var. Cybèle.
[0055] Exemple 2 - Préparation d’extraits de fruit de Punica granatum var. Cybèle et var. Wonderful
[0056] Les fruits entiers frais (i.e., grenade) des variétés Punica granatum var. Cybèle (notée grenade violette) et Punica granatum var. Wonderful (notée grenade rouge) de l’exemple 1, ont été récoltés, tranchés puis séchés dans une étuve ventilée à 70°C avant d’être broyés au moyen d’un broyeur à couteaux afin d’obtenir une poudre de granulométrie moyenne.
[0057] 3 procédés d’extraction utilisant 3 solvants d’extraction différents ont été appliqués à chaque broyât de grenade séchée pour obtenir 6 extraits identifiés dans le tableau 1 ci-dessous.
[Table 1]
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
[0058] Procédé 1 : PDo/Eau. extraits lA et IB
Le broyât de grenade séchée est extrait par le solvant Propanediol/Eau de composition massique 60/40 (noté PDo/Eau), selon un ratio massique broyat/solvant de 5:95 pendant 3h à 70°C sous agitation mécanique continue. L’extrait et le tourteaux végétal sont ensuite séparés par filtration sur une toile nylon de maille 200um. L’extrait brut est alors filtré sous pression sur plaques de cellulose puis sur membrane en acétate de cellulose au seuil de coupure de 0.2iim.
[0059] Procédé 2 : NaDES FGE115, extraits 2A et 2B
Le broyât de grenade séchée est extrait par le solvant NaDES Fructose/Glycérine/Eau de composition massique 50/25/25 (noté FGE115), selon un ratio massique broyat/solvant de 5:95 pendant 3h à 70°C sous agitation mécanique continue. L’extrait et le tourteaux végétal sont ensuite séparés par filtration sur une toile nylon de maille 200 um. L’extrait brut est alors filtré sous pression sur plaques de cellulose puis sur membrane en acétate de cellulose au seuil de coupure de 0,2um.
[0060] Procédé 3 : EtOH/Eau, extraits 3A et 3B
Le broyât de grenade séchée est extrait par le solvant Ethanol/Eau de composition massique 60/40 (noté EtOH/Eau), selon un ratio massique broyat/solvant de 5:95 pendant 3h à 70°C sous agitation mécanique continue. L’extrait et le tourteaux végétal sont ensuite séparés par filtration sur une toile nylon de maille 200um. L’extrait brut est alors filtré sous pression sur plaques de cellulose puis sur membrane en acétate de cellulose au seuil de coupure de 0.2um. La concentration en extrait sec de l’extrait liquide est déterminée sur un échantillon par dessiccation à 105°C. De manière optionnelle, l’éthanol de l’extrait peut être substitué par un glycol, tel que le propanediol afin de faciliter son utilisation dans le plus grand nombre de compositions cosmétiques. Pour cela l’extrait hydro-éthanolique est ensuite concentré sous pression réduite jusqu’à l’obtention d’un extrait mou. L’extrait mou est ensuite totalement solubilisé dans le solvant hydro-glycolique du procédé 1 (Propanediol/Eau 60/40 m/m), à une concentration d’extrait sec identique à l’extrait sec déterminé sur l’extrait hydro-éthanolique. La solution hydro-glycolique est alors filtrée sous pression sur plaques de cellulose puis sur membrane en acétate de cellulose au seuil de coupure de 0,2pm.
[0061 ] Exemple 3 : Caractérisation physico-chimique des extraits de grenade violette et rouge
[0062] L’aspect visuel, les paramètres de couleur L*a*b* et la concentration en extrait sec des 6 extraits obtenus à l’exemple 2 sont déterminés selon les méthodes suivantes.
[0063] L’aspect visuel est déterminé pour l’extrait pur placé dans un tube en verre incolore et transparent de diamètre 1 cm.
[0064] Les indices de couleur L*a*b* sont mesurés sur l’extrait pur en cuve plastique PMMA carrée de 10mm de trajet optique, avec l’observateur 10° et l’illuminant D65 (Equipement Ko- nica Minolta). [0065] L’extrait sec est déterminé par dessiccation halogène en appliquant un programme de dessiccation à 125°C avec palier préliminaire (180°C - 5min) pour un critère d’arrêt de 3, pour une prise d’essai de 3g d’extrait pur (Equipement Mettler Toledo). Cette détermination n’est techniquement pas réalisable pour les extraits NaDES FGE115, compte tenu de la non-volatilité du solvant.
[0066] Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.
[Table 2]
Figure imgf000014_0001
[0067] Ces résultats montrent que pour un même procédé les caractéristiques physico-chimiques des extraits de grenade violette et rouge sont différentes. Pour une même variété de grenade des différences de caractéristiques en fonction du solvant d’extraction sont également observées. En particulier la couleur des extraits de grenade violette présente une teinte dominante rouge, alors que celle des extraits de grenade rouge présente une teinte dominante jaune orangé
[0068] Exemple 4 : Caractérisation de la composition phytochimique des extraits de grenade violette et rouge
[0069] Le dosage des polyphénols totaux ainsi que l’analyse qualitative et quantitative des ellagi- tanins, de l’acide ellagique et des anthocyanes sont réalisés pour les 6 extraits obtenus à l’exemple 2 selon les méthodes suivantes.
[0070] La concentration en polyphénols totaux dans les extraits est mesurée selon la méthode au bleu de Prusse par spectrophotométrie d’absorption à 725nm après réaction de l’extrait avec du chlorure de fer III et de l’hexacyanoferrate III de potassium (spectrophotomètre UV-visible Mettler Toledo). Une gamme de calibration est réalisée avec l’étalon punicala- gine (Sigma, mélange a et P). La concentration en polyphénols totaux exprimée en équivalent punicalagine est déterminée en g pour 100g d’extrait.
[0071] La recherche de la présence des punicalagines a et P (ellagitanins) et de l’acide ellagique dans les extraits ainsi que leur quantification, s’ils sont détectés, sont réalisées par HPLC- UV à la longueur d’onde de 255nm (équipement Shimadzu, colonne SymmetryShield RP 18). Deux droites de calibration sont réalisées avec l’étalon punicalagine (Sigma, mélange a et P) et l’étalon acide ellagique. La concentration en punicalagines a et P est exprimée en g pour 100g d’extrait, et la concentration en acide ellagique en mg/kg d’extrait.
[0072] La recherche de la présence d’anthocyanes et leur quantification dans les extraits est réalisée par HPLC-DAD (équipement Shimadzu, colonne Kinetex 40A). La kuromanine est détectée et quantifiée à la longueur d’onde de 515nm, selon une droite de calibration réalisée avec la molécule étalon correspondante. La myrtilline est détectée et quantifiée à la longueur d’onde de 525nm, selon une droite de calibration réalisée avec la molécule étalon correspondante. Les autres anthocyanes détectés en regard de leur spectre d’absorption UV-visible sont quantifiés par rapport à la droite de calibration de la kuromanine à 515nm. Les concentrations en kuromanine, myrtilline, autres anthocyanes et anthocyanes totaux (somme des 3 concentrations précédentes) sont exprimées en mg/kg d’extrait.
[0073] L’ensemble des résultats figure dans le tableau 3 ci-dessous (NQ : non quantifiable).
[Table 3]
Figure imgf000015_0001
0074] La concentration en polyphénols totaux, punicalagines a et P et acide ellagique est nettement plus élevée dans tous les extraits de grenade violette selon l’invention comparativement à celle des extraits de grenade rouge.
[0075] Les résultats montrent également des différences importantes de composition des anthocyanes entre les extraits de grenade violette et rouge. Il apparait que la concentration en anthocyanes totaux est 3 à 4 fois plus élevée dans les extraits de grenade violette que dans ceux de grenade rouge. La myrtilline et la kuromanine sont les anthocyanes prédominants dans les extraits de grenade violette selon l’invention, ce qui n’est pas observé dans les extraits de grenade rouge dans lesquels ces composés apparaissent à l’état de traces. Dans les extraits de grenade rouge, la proportion des autres anthocyanes est prédominante. La prédominance de 2 anthocyanes particuliers que sont la myrtilline et la kuromanine dans les extraits de grenade violette permet d’expliquer les différences de couleur des extraits observées dans l’exemple 3.
[0076] Pour chacune des 2 variétés de grenade, le solvant PDo/Eau permet d’obtenir la concentration la plus élevée en polyphénols totaux, punicalagines a et P et acide ellagique et anthocyanes totaux. Les 2 autres solvants d’extraction (z.e., FGE115 et EtOH/Eau) permettent également d’extraire ces familles mais avec des performances quantitatives différentes selon les molécules.
[0077] Exemple 5 : Evaluation de l’activité antioxydante des extraits de grenade violette et rouge
[0078] L’activité antioxydante a été étudiée pour les 6 extraits obtenus à l’exemple 2 selon la méthode suivante qui permet de mesurer l’activité anti-radicalaire.
[0079] 3.1. Principe de la mesure
[0080] Le l,l-diphényl-2-picrylhydrazyl (DPPH) est un radical libre, stable à température ambiante, qui présente une couleur violet foncé en solution dans l’éthanol et absorbe dans les longueurs d’ondes comprises entre 510 et 530 nm.
[0081 ] Du fait de sa structure, le DPPH peut être réduit en acceptant un atome d’hydrogène provenant d’autres composés. Cette réduction s’accompagne d’une disparition de la couleur violette de la solution et donc d’une chute de l’absorbance directement proportionnelle au nombre d’atomes captés.
[0082] 3.2, Protocole expérimental
[0083] Les produits à tester sont ajoutés à une solution éthanolique de DPPH, incubés 30 minutes à température ambiante (18-25°C) à l’abri de la lumière puis une lecture de l’absorbance est réalisée à 518 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Un blanc d’expérience est réalisé à l’aide d’une solution d’éthanol seule à laquelle sont ajoutés les produits à tester. Les valeurs du blanc sont déduites des valeurs expérimentales pour s’affranchir d’une éventuelle interférence liée à la couleur propre des produits.
[0084] 3.3. Résultats
[0085] Les résultats sont décrits dans le tableau 4 ci-dessous et la figure 1.
[Table 4]
Figure imgf000016_0001
0086] 3.4, Conclusion
[0087] Les résultats expérimentaux montrent que tous les échantillons testés possèdent une activité antioxydante dès la concentration 0,01%.
[0088] Les résultats montrent également que tous les extraits de grenade violette (z.e., extraits 1- 3A) possèdent une efficacité antioxydante supérieure à celle des extraits correspondants de grenade rouge (z.e., extraits 1-3B). Ces résultats montrent que, quel que soit le solvant d’extraction et le procédé mis en œuvre, les extraits de grenade violette possèdent une activité antioxydante supérieure aux extraits de grenade rouge.
[0089] Exemple 6 : Evaluation de l’activité anti-inflammatoire des extraits de grenade violette et rouge
[0090] L’activité anti-inflammatoire (diminution de la synthèse d’IL-6 et IL-8) des 6 extraits de grenade violette et rouge décrits dans l’exemple 2 a été étudiée.
[0091] Pour démontrer un effet anti-inflammatoire au niveau de la peau, il est connu de l’Homme du métier d’utiliser un modèle permettant le dosage de cytokines pro-inflammatoires dans les kératinocytes épidermiques humains normaux (KEHN). En effet, sous l’effet d’un stimulus pro-inflammatoire physique ou chimique, les KEHN sécrètent plusieurs cytokines pro-inflammatoires, notamment les interleukines 6 et 8 (IL-6 et -8) qui jouent un rôle majeur dans la phase aiguë de l’inflammation tissulaire.
[0092] 4, 1 , Principe de la mesure
[0093] Le dosage est réalisé à partir de cultures en monocouches de KEHN. Les cytokines IL-6 et IL-8 sont dosées dans les surnageants de cultures des KEHN pré-incubées en présence des produits à tester avant d’être stimulées pendant 24h par un mélange d’interféron gamma (IFN-y) et tumor necrosis factor alpha (T F-a) en présence des produits à tester. [0094] 4,2, Protocole expérimental
[0095] Deux méthodes de dosage sont ensuite utilisées : un dosage ELISA et un dosage par cytométrie de flux.
[0096] Pour le dosage ELISA, les kits LEGEND MAX™ de chez Biolegend sont utilisés suivant les instructions du fabricant.
[0097] Pour le dosage en cytométrie de flux, le kit LEGENDplex™ Human Thrombosis Panel (3- plex) de chez Biolegend est utilisé suivant les instructions du fabricant.
[0098] 4,3. Résultats
[0099] Les résultats de sécrétion dTL-6 et IL-8 sont respectivement illustrés dans les tableaux 5-6 et les figures 2-3.
[Table 5]
Figure imgf000018_0001
[Table 6]
Figure imgf000019_0001
[0100] 4.4. Conclusion
[0101] Les résultats obtenus par les deux techniques (ELISA et cytométrie de flux) montrent des tendances identiques.
[0102] Les trois types d’extraits obtenus avec les deux variétés de Punica granatum montrent de puissants effets anti-inflammatoires dans le modèle des KEHN stimulés par un stress proinflammatoire pour des concentrations comprises entre 0,001 et 0,005%.
[0103] A concentrations identiques, les extraits de grenade violette montrent une activité anti-inflammatoire plus puissante que celle des extraits correspondants de grenade rouge vis-à-vis des deux cytokines pro-inflammatoires évaluées, à savoir IL-6 et -8.
[0104] Ces résultats montrent que, quel que soit le solvant d’extraction et le procédé, les extraits de grenade violette possèdent une activité anti-inflammatoire supérieure aux extraits de grenade rouge.
[0105] Exemple 7 : Evaluation de l’activité séborégulatrice des extraits de grenade violette et rouge
[0106] Les 2 extraits de grenade violette et rouge préparés avec le procédé 1 (PDo/Eau), tel que décrit dans l’exemple 2, ont été évalués pour leur capacité séborégulatrice.
[0107] Pour démontrer l’effet séborégulateur des extraits IA (grenade violette) et IB (grenade rouge) au niveau de la peau, des sébocytes, qui sont les cellules spécialisées productrices des lipides constituant le sébum de la peau, ont été utilisées en culture in vitro.
[0108] 7.1. Protocole expérimental
[0109] Des sébocytes humains normaux sont cultivés in vitro en monocouche (en présence d’acide linoléique à 50uM). Les cellules sont traitées pendant 5 jours avec les extraits de grenade violette (extrait IA) et rouge (extrait IB) à 0,1% et à 0,2%. Pour valider l’effet séborégulateur des extraits 1A-1B, l’épigallocatéchine gallate/EGCG (lOOpM) à été utilisé, lequel inhibe la synthèse des lipides dans les sébocytes. Les sébocytes sont ensuite fixées avec le produit Antigenfix et préparées pour le dosage des lipides.
[0110] 7.2, Dosage des lipides
[OU I] Les sébocytes sont incubés pendant 30 minutes avec la sonde fluorescente BODIPY™ qui colore les lipides en vert fluorescent. Les lipides sont ensuite visualisés par fluorescence (Ex493/Em503) puis quantifiés par une analyse d’image avec le lecteur de plaque multimodes Cytation 5 (Agilent Biotek). Les noyaux cellulaires des sébocytes sont marqués avec le DAPI pour normaliser la quantité de lipides par cellules.
[0112] 7.3. Résultats
[0113] Les résultats du dosage des lipides sont illustrés dans la figure 4 et le tableau 7. [0114] [Table ?]
Figure imgf000021_0001
[0115] 7.4, Conclusion
[0116] Les quantités de lipides dosées dans les sébocytes traités avec l’extrait IA (grenade violette) sont significativement plus faibles que celles dosées dans les sébocytes non traités. Autrement dit, l’extrait 1 A présente des propriétés séborégulatrices en diminuant la synthèse lipidique dans les sébocytes. L’effet séborégulateur de Textrait IA est plus fort à 0,2% qu’à 0,1%.
[0117] Les quantités de lipides dosées dans les sébocytes traités avec l’extrait IB (grenade rouge) sont équivalentes aux quantités dosées dans les sébocytes non traités. Autrement dit, l’extrait IB ne présente pas de propriétés séborégulatrices.
Ces résultats montrent que les deux variétés de Punica granatum sont différentes sur le critère d’une activité de séborégulation ; seule la grenade violette a la capacité de diminuer la synthèse de lipides dans les sébocytes humains normaux. En d’autres termes, ces données démontrent clairement une diminution de la production de sébum avec l’extrait de Punica granatum var. Cybèle (i.e. grenade violette) de l’invention, lequel présente donc des capacités à prévenir une hyperséborrhée sur une peau saine, notamment une peau à tendance acnéique, grasse ou encore mixte.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Utilisation cosmétique topique d’un extrait de Pimica granatum var. Cybèle ou d’une composition comprenant ledit extrait.
[Revendication 2] Utilisation selon la revendication 1, pour lutter contre le vieillissement cutané.
[Revendication 3] Utilisation selon l’une des revendications 1 ou 2, pour stimuler l’éclat du teint.
[Revendication 4] Utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, pour apaiser la peau.
[Revendication 5] Utilisation selon la revendication 1, pour améliorer la séborégulation de la peau.
[Revendication 6] Utilisation selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’extrait de Punica granatum var. Cybèle est susceptible d’être obtenu par un procédé d’extraction solide/liquide mettant en œuvre un solvant d’extraction, suivi d’une seconde étape de séparation solide/liquide et enfin d’une troisième étape de récupération de la phase liquide, caractérisée en ce que ledit solvant d’extraction est un mélange de propanediol et d’eau.
[Revendication 7] Extrait de Punica granatum var. Cybèle susceptible d’être obtenu par un procédé d’extraction solide/liquide d’un broyât de Punica granatum var. Cybèle mettant en œuvre un solvant d’extraction, suivi d’une seconde étape de séparation solide/liquide et enfin d’une troisième étape de récupération de la phase liquide, caractérisée en ce que ledit solvant d’extraction est un mélange de propanediol et d’eau.
[Revendication 8] Extrait selon la revendication 7, caractérisé en ce qu’il s’agit de fruit entier, avantageusement de fruit entier séché broyé.
[Revendication 9] Extrait selon l’une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que l’extraction met en œuvre un rapport massique de broyât de Punica granatum var. Cybèle/solvant compris entre 1:99 et 50:50, avantageusement entre 2:98 et 15:85.
[Revendication 10] Extrait selon l’une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que sa composition phytochimique :
- en polyphénols totaux est supérieure ou égale à 0,5 g/100g ; et/ou
- en myrtilline est supérieure ou égale à 1 mg/kg ; et/ou
- en kuromanine est supérieure ou égale à 1 mg/kg.
[Revendication 11] Composition comprenant l’extrait selon l’une des revendications 7 à 10.
[Revendication 12] Extrait selon l’une des revendications 7 ou 10 ou composition selon la revendication 11 pour utilisation comme médicament, avantageusement comme médicament à usage dermatologique.
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