WO2024257513A1 - 細胞培養方法 - Google Patents

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WO2024257513A1
WO2024257513A1 PCT/JP2024/017243 JP2024017243W WO2024257513A1 WO 2024257513 A1 WO2024257513 A1 WO 2024257513A1 JP 2024017243 W JP2024017243 W JP 2024017243W WO 2024257513 A1 WO2024257513 A1 WO 2024257513A1
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medium
culture
cell culture
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culture medium
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豊之 橋本
実花子 高橋
和弘 園村
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Shimadzu Corp
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    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M25/02—Membranes; Filters
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • This disclosure relates to a cell culture method.
  • Patent Document 1 discloses a system that uses a co-culture vessel in which an anaerobic medium and an aerobic medium are separated by a porous membrane, and co-cultures intestinal epithelial cells and bacteria contained in the medium in the anaerobic medium.
  • each medium is removed into a separate container such as an Eppendorf tube, and analysis of metabolites, etc. is performed in the subsequent processing process such as analysis. If the removed medium is mixed up at this time, the analysis results will be erroneous, and accurate analysis and evaluation will not be possible.
  • the present disclosure has been made to solve such problems, and its purpose is to prevent the mixing of media after culture in a cell culture method in which cells and bacteria are co-cultured using two different media.
  • the method disclosed herein relates to a method for co-culturing a first biological element and a second biological element using a co-cultivation device.
  • the co-cultivation device includes a first chamber and a second chamber capable of storing a culture medium therein.
  • the second chamber separates the first chamber from the second chamber and includes a membrane having oxygen permeability.
  • the method includes the steps of (a) disposing the first biological element inside the second chamber so as to cover the membrane, (b) introducing a first culture medium having a first color into the first chamber, (c) introducing a second culture medium including the second biological element and having a second color different from the first color into the second chamber, and (d) culturing the first biological element and the second biological element with the membrane disposed in contact with the first culture medium.
  • media of different colors are used as the two media used in the co-culture. This makes it easy to distinguish which medium is which when each medium is removed after the culture is completed. Therefore, in a cell culture method in which different biological elements are co-cultured using two different media, it is possible to prevent the media from being mixed up after culture.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a cell culture system used in a cell culture method according to a first embodiment.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a culture step in a cell culture method.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining the state in which the medium is collected after the end of culture.
  • FIG. 1 shows an example of the state of a medium when cells are damaged during culture. 13 is a flow chart illustrating an example of a sample processing step after completion of culture.
  • FIG. 11 is a configuration diagram of a cell culture system used in the cell culture method of embodiment 2.
  • FIG. 7 is an exploded perspective view of a co-culture device used in the cell culture system of FIG. 6.
  • biological cells and microorganisms are collectively referred to as biological elements.
  • An example of a biological cell is an organ-forming cell (specifically, an organ-forming cell such as an organoid).
  • An example of a microorganism is a fungus or a bacterium.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a cell culture system 10 used in the cell culture method of embodiment 1.
  • the cell culture system 10 includes a cell culture device 100, a pump 60, culture medium containers 70 and 75, and a measuring device 180.
  • the cell culture system 10 is disposed, for example, in an anaerobic chamber, and the surroundings are maintained in an anaerobic environment.
  • the cell culture device 100 includes a container body 110, a cell culture insert 120, cover members 130 and 140, and an electrode 150.
  • the container body 110 is a container having a substantially cylindrical shape, and has an upper wall 111, a bottom wall 112, and a side wall 113. The side wall 113 connects the upper wall 111 and the bottom wall 112.
  • the container body 110 is formed of, for example, a resin material.
  • a culture medium 161 (first culture medium) is stored inside the container body 110.
  • the inside of the container body 110 is maintained in an atmospheric environment (aerobic environment) by attaching a cell culture insert 120 in which cells (organ-constituting cells) 170 are cultured in a sheet form to the container body 110 in an atmospheric environment.
  • the "container body 110" in the embodiment corresponds to the "first chamber” in this disclosure
  • the "cell culture insert 120" corresponds to the "second chamber” in this disclosure.
  • FIG. 1 shows an example of a configuration in which the upper wall 111 is formed integrally with the side wall 113, the upper wall 111 may be formed as a separate member from the side wall 113.
  • An electrode 151 is embedded in the bottom wall 112 of the container body 110.
  • the electrode 151 is exposed on the inner and outer surfaces of the bottom wall 112. Inside the container body 110, the electrode 151 is in contact with the culture medium 161, and the electrode 151 and the culture medium 161 can be electrically connected.
  • the cell culture insert 120 is a container having a generally cylindrical shape, and has a cylindrical portion 121 forming the side wall of the container, a membrane 122 forming the bottom wall of the container, and a flange portion 123. The lower end of the cylindrical portion 121 is closed by the membrane 122.
  • the membrane 122 is formed of an oxygen-permeable material, such as a track-etched membrane made of polycarbonate.
  • the membrane 122 may be a porous membrane formed of other materials such as PET (polyethylene terephthalate) or a collagen vitrigel membrane.
  • the upper end of the cylindrical portion 121 is open and is sealed by a removable lid member 130.
  • a flange portion 123 that protrudes in the outer circumferential direction is provided at the upper end of the cylindrical portion 121.
  • the cell culture insert 120 is inserted into the opening 114 of the upper wall 111 of the container body 110. At this time, the flange portion 123 of the cell culture insert 120 is supported by the upper wall 111. The cell culture insert 120 is then fixed to the container body 110 by a removable lid member 140. When the cell culture insert 120 is fixed, the membrane 122 on the underside of the cell culture insert 120 is immersed in the culture medium 161.
  • the culture medium 162 is stored inside the cell culture insert 120.
  • the dissolved oxygen concentration of the culture medium 162 is lower than the dissolved oxygen concentration of the culture medium 161 in the container body 110. That is, the culture medium 161 is an aerobic culture medium, and the culture medium 162 is an anaerobic culture medium.
  • the culture medium 162 contains biological elements.
  • the biological elements contained in the culture medium 162 are anaerobic bacteria.
  • the anaerobic bacteria may be facultative anaerobes such as lactic acid bacteria, or may be obligate anaerobes such as bifidobacteria.
  • the anaerobic bacteria correspond to the "second biological element" in this disclosure.
  • Pipes 50 and 55 pass through the cover member 130.
  • a pump 60 disposed on pipe 50 introduces culture medium 162 (second culture medium) stored in a culture medium container 70 outside the device into the cell culture insert 120.
  • Pipe 55 is a pipe for discharging the culture medium 162 in the cell culture insert 120. Pipe 55 continues to a culture medium container 75 for storing culture medium for disposal. Culture medium 162 that overflows from the cell culture insert 120 is discharged through pipe 55 into the culture medium container 75.
  • the biological element is cultured on the inner surface of the membrane 122.
  • the biological element is a cell (organ-constituting cell) 170.
  • the cell 170 is, for example, an intestinal epithelial cell that forms a tight junction on the membrane 122.
  • a specific example of the cell 170 is a Caco-2 cell.
  • the membrane 122 is oxygen permeable. Oxygen in the medium 161 is supplied to the cell 170 through the membrane 122. In this way, by co-culturing the cell and bacteria in the anaerobic medium 162, the intestinal environment in a living organism can be simulated.
  • the "cell 170" corresponds to the "first biological element" in this disclosure.
  • An electrode 150 is further disposed on the cover member 130. Although not shown in FIG. 1, one end of the electrode 150 contacts the culture medium 162 stored in the cell culture insert 120 and is electrically connected to the culture medium 162.
  • the electrode 150 disposed on the lid member 130 of the cell culture insert 120 and the electrode 151 embedded in the bottom wall 112 of the container body 110 are connected to a measuring device 180 provided outside the device.
  • the measuring device 180 measures the electrical resistance between the electrodes 150 and 151 by applying a voltage between the electrodes 150 and 151.
  • the electrical resistance is measured by the measuring device 180, for example, using a four-terminal method.
  • the resistance between the electrodes changes depending on whether or not tight junctions are formed in the cells 170 cultured on the membrane 122. Therefore, by monitoring the electrical resistance during culture, it is possible to determine whether or not the tight junctions of the cells 170 are formed normally.
  • an oxygen sensor may be provided to detect the dissolved oxygen concentration in culture medium 161 and culture medium 162. By detecting the dissolved oxygen concentration in each culture medium using the oxygen sensor, the growth status of the bacteria during co-culture can be monitored.
  • each medium is collected into another container such as an Eppendorf tube and stored for a specified period in a freezer or for subsequent analysis.
  • another container such as an Eppendorf tube
  • the media collected in the containers have a similar appearance (color)
  • the cells and part of the membrane may be damaged, causing one medium to penetrate into the other medium, resulting in the mixing of the aerobic medium and the anaerobic medium.
  • the culture process itself will fail.
  • the colors of the media during culture are similar, it may not be possible to detect the state in which the media are mixed, and the medium in the failed culture state may end up being analyzed.
  • the analytical process is carried out with the medium collected being mixed up and/or the medium being mixed during cultivation, it may lead to erroneous results, which may lead to incorrect judgment of the experimental results and evaluation.
  • the aerobic culture medium 161 and the anaerobic culture medium 162 are different colors that can be visually distinguished by the user. This makes it possible to easily determine whether the culture medium is an aerobic culture medium or an anaerobic culture medium after the culture medium is collected in a container such as an Eppendorf tube. Furthermore, by making each culture medium a different color even during cultivation, it is possible to easily detect the mixing of the culture media during cultivation.
  • At least one of the two media is colored, and the other may be colorless.
  • the media can be colored, for example, using a coloring agent that has little effect on the culture process.
  • the color of the medium may be a fixed color that does not change before and after cultivation, or it may change color depending on the condition of the medium. For example, if an indicator that changes color depending on the pH, such as methyl orange, phenolphthalein (PP), or bromothymol blue (BTB), is added to the medium, the color of the medium may change due to changes in the pH of the medium as the cultivation progresses.
  • an indicator that changes color depending on the pH such as methyl orange, phenolphthalein (PP), or bromothymol blue (BTB)
  • the two media are different in color from the beginning of the culture process; it is sufficient that the two media are different in color at the completion of culture due to the passage of time or changes in the state of the media.
  • the media are different in color from the early stages of culture.
  • FIG. 2 is a flow chart showing an example of a culture process performed using the cell culture system 10 of FIG. 1. Each process of the flow chart of FIG. 2 may be performed manually by a user, or some or all of the processes may be performed automatically using a handling device (not shown).
  • step (hereinafter, step is abbreviated as S) 100 cells are cultured over the entire surface of the membrane 122 in the cell culture insert 120. Then, in S110, the cell culture insert 120 is placed in the opening 114 of the container body 110.
  • a first color culture medium 161 is introduced into the container body 110.
  • the culture medium 161 is introduced to a height where the membrane 122 on the lower surface of the cell culture insert 120 is immersed in the culture medium 161.
  • a second color culture medium 162 containing bacteria is introduced into the cell culture insert 120.
  • fresh culture medium 162 is supplied from the culture medium container 70 by the pump 60 into the cell culture insert 120 even during cultivation.
  • the culture media 161, 162 used in S120, S130 may be commercially available and already colored. Alternatively, prior to S120, S130, a step of coloring a colorless culture medium using a coloring agent and/or an indicator, etc. may be included.
  • the culture medium is introduced into the container body 110 and the cell culture insert 120, in S140, the cells and bacteria are cultured for a predetermined period of time while the electrical resistance and dissolved oxygen concentration are monitored by the measuring device 180.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the state in which culture media 161 and 162 are collected after the end of culture.
  • FIG. 3 shows the state in which culture media 161 and 162 are different colors at the stage when culture is completed.
  • culture medium 161 is shown in a light color
  • culture medium 162 is shown in a dark color. Even when culture media 161 and 162 are collected in Eppendorf tubes 210 and 220, respectively, it is possible to distinguish between culture medium 161 and culture medium 162 based on the difference in the color of each culture medium.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of the state of the medium when the cell 170 and the membrane 122 are damaged during culture.
  • the pressure of the medium 162 is higher than the pressure of the medium 161
  • a part of the medium 162 in the cell culture insert 120 leaks into the medium 161 from the damaged area, as shown in region RG in FIG. 4.
  • the color of the medium 161 is different from the color of the medium 162
  • the medium 162 that has leaked into the medium 161 can be easily detected. Note that when the pressure of the medium 161 is higher than the pressure of the medium 162, if the cell 170 and the membrane 122 are damaged during culture, the medium 161 leaks into the medium 162.
  • FIG. 5 is a flow chart for explaining an example of the sample processing process after the end of the culture.
  • the processes of S200 to S240 are performed in an anaerobic environment, and the processes of S250 to S280 are performed in an aerobic environment.
  • a specific amount of medium 162 which is an anaerobic medium, is collected in a container in an anaerobic environment.
  • a specific amount of medium 161 which is an aerobic medium, is collected in a separate container. If necessary, each medium collected in the anaerobic environment is left to stand for a predetermined period of time.
  • medium 161 is inoculated onto an agar medium without dilution (S220).
  • medium 162 is a medium co-cultured with bacteria, and since it is necessary to count the bacteria, it is diluted and then inoculated onto an agar medium (S230).
  • the dilution ratio differs depending on conditions such as the type of bacteria and/or the turbidity of the medium.
  • each medium is centrifuged using a centrifuge.
  • the supernatant of each medium after centrifugation is transferred to a separate container such as an Eppendorf tube and stored in a specified environment.
  • the two culture media are mixed up or mixed during the culture during the sample processing step as shown in FIG. 5, not only will the work up to that point be wasted, but the desired analysis results will not be obtained.
  • the culture media can be easily identified after collection, preventing the two culture media from being mixed up. Furthermore, even if the culture media leaks due to cell damage during culture, the leakage state of the culture media can be easily detected, allowing early detection of experimental failures.
  • FIG. 6 is a configuration diagram of a cell culture system 10A used in the cell culture method of the second embodiment.
  • the cell culture system 10A includes a cell culture device 100A, pumps 60A, 60B, culture medium containers 70A, 70B, 75A, 75B, a measuring device 180, and a sealed container 400.
  • the cell culture system 10A is placed, for example, in an anaerobic chamber, and the surroundings are maintained in an anaerobic environment.
  • the cell culture device 100A includes a co-culture device 300.
  • the co-culture device 300 has two adjacent flow paths 320, 330 formed through a membrane 310.
  • the flow path 320 is a path through which an aerobic medium (medium 161) flows
  • the flow path 330 is a path through which an anaerobic medium (medium 162) flows.
  • Cells 170 are cultured on the surface of the membrane 310 facing the flow channel 320. Oxygen is supplied to the cells 170 from the culture medium 161 flowing through the flow channel 320 via the membrane 310.
  • the sealed container 400 is a container whose internal space can be sealed.
  • the sealed container 400 includes a main body 410 and a lid member 420.
  • the main body 410 has a cylindrical shape with one end closed by a bottom wall and the other end open.
  • a removable lid member 420 is attached to the open end of the main body 410.
  • the internal space of the sealed container 400 is maintained in an atmospheric environment, i.e., an aerobic environment.
  • a medium container 70A in which medium 161 is stored Inside the sealed container 400, there are arranged a medium container 70A in which medium 161 is stored, a pipe 50A, and a pump 60A attached to the pipe 50A.
  • the pipe 50A connects the medium container 70A to a flow path 320 of the co-culture device 300.
  • the pump 60A By driving the pump 60A, the medium 161 in the medium container 70A is supplied to the flow path 320 through the pipe 50A.
  • the medium 161 that has passed through the flow path 320 is discharged through the pipe 55A into the medium container 75A for waste liquid.
  • Culture medium 162 is stored in culture medium container 70B, which is placed in the anaerobic environment.
  • Culture medium container 70B is connected to flow path 330 of co-culture device 300 by piping 50B.
  • By driving pump 60B provided on piping 50B culture medium 162 in culture medium container 70B is supplied to flow path 330 through piping 50B.
  • Culture medium 162 that has passed through flow path 330 is discharged through piping 55B to waste culture medium container 75B.
  • an electrode 350 is arranged so as to be exposed in the flow path 320, and an electrode 355 is arranged so as to be exposed in the flow path 330.
  • the electrode 350 can be electrically connected to the culture medium 161 flowing in the flow path 320, and the electrode 355 can be electrically connected to the culture medium 162 flowing in the flow path 330.
  • the electrodes 350 and 355 are connected to a measuring device 180. By applying a voltage to the electrodes 350 and 355 from the measuring device 180, the electrical resistance value between the electrodes 350 and 355 can be monitored.
  • an oxygen sensor may be provided to detect the dissolved oxygen concentration in the culture media 161, 162 flowing through each flow path.
  • FIG. 7 is an exploded perspective view of the co-culture device 300 used in the cell culture system 10A in FIG. 6.
  • the co-culture device 300 includes flat glass plates 301, 302 and flat resin sheets 305, 306 arranged between the glass plates 301, 302.
  • the glass plates 301, 302 and the resin sheets 305, 306 are layered in the following order: glass plate 301, resin sheet 305, resin sheet 306, and glass plate 302.
  • An example of the resin sheets 305 and 306 is silicone rubber.
  • the glass plate and the resin sheet, and the resin sheets are bonded together, for example, by applying pressure to the bonding surfaces in a state where the bonding surfaces are activated by oxygen plasma.
  • a through hole 361 is formed in the glass plate 301, penetrating it in the thickness direction.
  • a pipe 50A is connected to the through hole 361.
  • the through hole 361 serves as the inlet of the flow path 320 through which the culture medium 161 flows.
  • a groove 340 is formed on the surface of the resin sheet 305 facing the glass plate 301.
  • the flow path 320 in FIG. 6 is formed by this groove 340 and the surface of the glass plate 301.
  • One end of the groove 340 is connected to a through hole 361 in the glass plate 301.
  • a through hole 362 is formed at the other end of the groove 340, penetrating the resin sheet 305 in the thickness direction.
  • Through holes 363, 364 are formed in the resin sheet 306 and the glass plate 302 at positions corresponding to the through hole 362 in the resin sheet 305.
  • Pipe 55A is connected to the through hole 364 in the glass plate 302.
  • the through hole 364 in the glass plate 302 serves as the outlet of the flow path 320 through which the culture medium 161 flows.
  • a groove 380 is formed on the surface of the resin sheet 306 that faces the glass plate 302.
  • the groove 380 and the surface of the glass plate 302 form the flow path 330 in FIG. 6.
  • a through hole 371 is formed at a position corresponding to one end of the groove portion 380, penetrating in the thickness direction
  • a through hole 372 is formed at a position corresponding to the other end of the groove portion 380, penetrating in the thickness direction.
  • Pipe 50B is connected to through hole 371 in the glass plate 302.
  • Pipe 55B is connected to through hole 372 in the glass plate 302. That is, through holes 371, 372 in the glass plate 302 respectively serve as the inlet and outlet of flow path 330 through which culture medium 162 flows.
  • a portion of groove portion 340 formed in resin sheet 305 overlaps in parallel with groove portion 380 formed in resin sheet 306.
  • a slit 341 penetrating in the thickness direction is formed in the overlapping portion of resin sheet 305.
  • a slit 381 is formed in groove portion 380 of resin sheet 306 at a position opposite slit 341.
  • a membrane 310 is disposed between slit 341 and slit 381.
  • This configuration realizes a configuration in which two adjacent flow paths 320, 330 are connected via the membrane 310. That is, in the cell culture system 10A used in the cell culture method of embodiment 2, the flow path 320 in FIG. 6 corresponds to the container body 110 of the cell culture system 10 in embodiment 1, and the flow path 330 corresponds to the cell culture insert 120 of the cell culture system 10. That is, the "flow path 320" and the “flow path 330" in embodiment 2 correspond to the "first chamber” and the "second chamber” in the present disclosure, respectively.
  • a cell culture method relates to a method for co-culturing a first biological element and a second biological element using a co-culture device.
  • the co-culture device includes a first chamber and a second chamber capable of storing a culture medium therein.
  • the second chamber separates the first chamber from the second chamber and includes a membrane having oxygen permeability.
  • the cell culture method includes the steps of (a) culturing the first biological element inside the second chamber so as to cover the membrane, (b) introducing a first culture medium having a first color into the first chamber, (c) introducing a second culture medium having a second color different from the first color and including a second biological element into the second chamber, and (d) co-culturing the first biological element and the second biological element with the membrane disposed in contact with the first culture medium.
  • the second color is a color that can be visually distinguished from the first color by a user.
  • the colors of the culture media are made visually distinguishable by the user, so that the two culture media can be easily distinguished.
  • the cell culture method described in 1 or 2 further includes a step of coloring the first culture medium a first color and a step of coloring the second culture medium a second color.
  • the two media can be easily distinguished by coloring the medium with a coloring agent or the like.
  • At least one of the first culture medium and the second culture medium contains an indicator that changes color depending on the state of the medium.
  • an indicator that changes color depending on the state of the medium can be used to confirm the change in state of the medium and to easily distinguish the medium after culture by the difference in color.
  • the dissolved oxygen concentration of the first culture medium is higher than the dissolved oxygen concentration of the second culture medium.
  • the first medium can be used as an aerobic medium
  • the second medium can be used as an anaerobic medium
  • the second chamber is a cell culture insert that further includes a cylindrical portion and has a membrane disposed so as to close the lower end of the cylindrical portion.
  • a cell culture insert that is widely used in general can be used as the second chamber.
  • the first biological element is an organ-constituting cell
  • the second biological element is a microorganism
  • the cell culture method of the present disclosure can be applied to co-culture of organ-constituting cells and microorganisms.

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Abstract

共培養装置（１００）は、内部に培地を貯留可能な容器本体（１１０）およびセルカルチャインサート（１２０）とを含む。セルカルチャインサート（１２０）は、容器本体（１１０）とセルカルチャインサート（１２０）とを分離するとともに、酸素透過性を有するメンブレン（１２２）とを含む。細胞培養方法は、（ａ）セルカルチャインサート（１２０）の内部においてメンブレン（１２２）を覆うように細胞を培養するステップと、（ｂ）第１色を呈する第１培地（１６１）を容器本体（１１０）内に導入するステップと、（ｃ）細菌を含み、第１色とは異なる第２色を呈する第２培地（１６２）をセルカルチャインサート（１２０）内に導入するステップと、（ｄ）メンブレン（１２２）が第１培地に接するように配置された状態で、細胞および細菌を共培養するステップとを含む。

Description

細胞培養方法
　本開示は、細胞培養方法に関する。
　生物の腸内環境を模擬した細胞培養システムの開発が進められている。国際公開第２０２２／００９６７２号（特許文献１）には、嫌気培地と好気培地とを多孔質膜（メンブレン）で分離した共培養容器を用い、嫌気培地内において腸管上皮細胞と培地中に含まれる細菌とを共培養するシステムが開示されている。
国際公開第２０２２／００９６７２号
　上記のような細胞培養システムにおいては、培養工程の終了後に各培地をエッペンチューブなどの別の容器に取り出し、後続の分析等の処理工程において代謝物等の分析が行なわれる。このとき、取り出した培地を取り違えてしまうと、誤った分析結果となってしまい、正確な分析および評価ができなくなる。
　本開示は、このような課題を解決するためになされたものであって、その目的は、２つの異なる培地を用いて細胞と細菌を共培養する細胞培養方法において、培養後の各培地の取り違えを防止することである。
　本開示に係る方法は、共培養装置を用いて第１生物学的要素および第２生物学的要素を共培養する方法に関する。共培養装置は、内部に培地を貯留可能な第１チャンバおよび第２チャンバを含む。第２チャンバは、第１チャンバと第２チャンバとを分離するとともに、酸素透過性を有するメンブレンを含む。方法は、（ａ）第２チャンバの内部においてメンブレンを覆うように第１生物学的要素を配置するステップと、（ｂ）第１色を呈する第１培地を第１チャンバに導入するステップと、（ｃ）第２生物学的要素を含み、第１色とは異なる第２色を呈する第２培地を第２チャンバ内に導入するステップと、（ｄ）メンブレンが第１培地に接するように配置された状態で、第１生物学的要素および第２生物学的要素を培養するステップとを含む。
　本開示に係る細胞培養方法においては、共培養に用いられる２つの培地として、互いに異なる色を呈する培地が用いられる。これにより、培養終了後に各培地を取り出した場合に、どちらの培地であるかを容易に区別することができる。したがって、２つの異なる培地を用いて異なる生物学的要素を共培養する細胞培養方法において、培養後の各培地の取り違えを防止することができる。
実施の形態１の細胞培養方法に用いられる細胞培養システムの構成図である。 細胞培養方法における培養工程を示すフローチャートである。 培養終了後に培地を回収した状態を説明するための図である。 培養中に細胞が損傷した場合の培地の状態の一例を示す図である。 培養終了後のサンプル処理工程の一例を説明するためのフローチャートである。 実施の形態２の細胞培養方法に用いられる細胞培養システムの構成図である。 図６の細胞培養システムに用いられる共培養デバイスの分解斜視図である。
　以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、図中同一または相当部分には同一符号を付してその説明は繰り返さない。
　本明細書では、生体細胞および微生物を生物学的要素と総称する。生体細胞の例は、器官構成細胞（具体例は、オルガノイドのような臓器構成細胞）である。また、微生物の例は、菌または細菌である。
　［実施の形態１］
　（細胞培養システムの構成）
　図１は、実施の形態１の細胞培養方法に用いられる細胞培養システム１０の構成図である。細胞培養システム１０は、細胞培養装置１００と、ポンプ６０と、培地容器７０，７５と、測定装置１８０とを備える。細胞培養システム１０は、たとえば、嫌気チャンバ内に配置されており、周囲が嫌気環境に保たれている。
　細胞培養装置１００は、容器本体１１０と、セルカルチャインサート１２０と、蓋部材１３０，１４０と、電極１５０とを含む。容器本体１１０は、略筒形状を有する容器であり、上壁１１１と、底壁１１２と、側壁１１３とを有している。側壁１１３は、上壁１１１と底壁１１２とを連結している。容器本体１１０は、たとえば樹脂材料により形成されている。容器本体１１０の内部には、培地１６１（第１培地）が貯留されている。なお、大気環境下で容器本体１１０に細胞（器官構成細胞）１７０をシート状に培養したセルカルチャインサート１２０を取り付けることで、容器本体１１０の内部は大気環境（好気環境）に保たれている。なお、実施の形態の「容器本体１１０」は本開示における「第１チャンバ」に対応し、「セルカルチャインサート１２０」は本開示における「第２チャンバ」に対応する。
　容器本体１１０の上壁１１１には、上壁１１１の厚さ方向に沿って貫通する開口部１１４が形成されている。後述するように、この開口部１１４にセルカルチャインサート１２０が配置される。なお、図１においては、上壁１１１は側壁１１３と一体的に形成された構成例が示されているが、上壁１１１は側壁１１３とは別体の部材として形成されていてもよい。
　容器本体１１０の底壁１１２には、電極１５１が埋設されている。電極１５１は、底壁１１２の内面および外面に露出している。容器本体１１０の内部において、電極１５１は培地１６１に接しており、電極１５１と培地１６１とが電気的に接続可能とされている。
　セルカルチャインサート１２０は、略筒形状を有する容器であり、容器の側壁を形成する筒状部１２１と、容器の底壁を形成するメンブレン１２２と、フランジ部１２３とを有している。筒状部１２１の下端は、メンブレン１２２により閉塞されている。メンブレン１２２は、たとえば、ポリカーボネート製のトラックエッチ膜のような、酸素透過性を有する部材で形成されている。メンブレン１２２は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）等の他の材料により形成された多孔質膜あるいはコラーゲンビトリゲル膜であってもよい。
　筒状部１２１の上端は開口しており、取り外し可能な蓋部材１３０により密閉されている。また、筒状部１２１の上端には外周方向に張り出したフランジ部１２３が設けられている。
　セルカルチャインサート１２０は、容器本体１１０における上壁１１１の開口部１１４内に挿入される。このとき、セルカルチャインサート１２０のフランジ部１２３が上壁１１１により支持される。そして、着脱可能な蓋部材１４０によってセルカルチャインサート１２０が容器本体１１０に固定される。セルカルチャインサート１２０が固定された状態においては、セルカルチャインサート１２０の下面のメンブレン１２２は、培地１６１内に浸された状態となる。
　セルカルチャインサート１２０の内部には、培地１６２が貯留されている。培地１６２の溶存酸素濃度は、容器本体１１０内の培地１６１の溶存酸素濃度よりも低い。すなわち、培地１６１は好気培地であり、培地１６２は嫌気培地である。培地１６２には、生物学的要素が含まれる。実施の形態１の例において、培地１６２に含まれる生物学的要素は、嫌気性細菌である。嫌気性細菌は、乳酸菌のような通性嫌気性菌でもよいし、ビフィズス菌のような偏性嫌気性菌であってもよい。なお、当該嫌気性細菌は、本開示における「第２生物学的要素」に対応する。
　蓋部材１３０には、配管５０，５５が貫通している。配管５０に配置されたポンプ６０によって、装置外部の培地容器７０に貯留されている培地１６２（第２培地）が、セルカルチャインサート１２０内に導入される。配管５５は、セルカルチャインサート１２０内の培地１６２を排出するための配管である。配管５５は、廃棄用の培地を貯留するための培地容器７５へと続いている。セルカルチャインサート１２０からオーバーフローした培地１６２は、配管５５を通って培地容器７５へと排出される。
　メンブレン１２２における内面において、生物学的要素が培養される。実施の形態１の例においては、当該生物学的要素は、細胞（器官構成細胞）１７０である。当該細胞１７０は、たとえば、メンブレン１２２上においてタイトジャンクション（密着結合）を形成する腸管上皮細胞である。細胞１７０の具体例としては、Ｃａｃｏ－２細胞が挙げられる。メンブレン１２２は、上述のように酸素透過性を有している。メンブレン１２２を通して培地１６１中の酸素が細胞１７０に供給される。このように嫌気性の培地１６２内において、細胞および細菌を共培養することによって、生体内の腸内環境を模擬することができる。なお「細胞１７０」は、本開示における「第１生物学的要素」に対応する。
　蓋部材１３０には、電極１５０がさらに配置されている。図１には示されていないが、電極１５０の一方の端部は、セルカルチャインサート１２０内に貯留された培地１６２に接しており、培地１６２と電気的に接続されている。
　セルカルチャインサート１２０の蓋部材１３０に配置された電極１５０、および、容器本体１１０の底壁１１２に埋設された電極１５１は、装置外部に設けられる測定装置１８０に接続されている。測定装置１８０は、電極１５０と電極１５１との間に電圧を印加することによって、電極１５０と電極１５１との間の電気抵抗値を測定する。測定装置１８０における電気抵抗値の測定は、たとえば四端子法により行なわれる。
　メンブレン１２２上に培養される細胞１７０のタイトジャンクションの形成の有無によって、電極間の抵抗値が変化する。そのため、培養中の電気抵抗値をモニタすることによって、細胞１７０のタイトジャンクションが正常に形成されているか否かの判定を行なうことができる。
　また、図１には示されていないが、培地１６１および培地１６２の溶存酸素濃度を検出するための酸素センサが設けられていてもよい。当該酸素センサによって、各培地の溶存酸素濃度を検出することによって、共培養時の細菌の増殖状況をモニタリングすることができる。
　上記のような細胞培養システムを用いた細胞および細菌の共培養工程が完了すると、各培地はエッペンチューブなどの他の容器に回収され、冷凍保管装置内で所定期間保管されたり、あるいは後続の分析工程が実行される。このとき、容器に回収された培地の見た目（色）が類似していると、容器のハンドリングの際にユーザが好気培地と嫌気培地を取り違えてしまう可能性がある。
　また、細胞の培養中に、細胞およびメンブレンの一部が破損し、一方の培地が他方の培地内に浸入して、好気培地と嫌気培地とが混合してしまう可能性がある。すなわち、このような場合には、培養処理自体が失敗した状態となる。しかしながら、培養中の培地の色が類似していると、培地同士が混合している状態を検出することができず、失敗した培養状態の培地が分析されることになり得る。
　このような、回収後の培地の取り違え、および／または、培養中の培地の混合が生じたまま分析処理が行なわれると誤った結果となってしまい、実験結果および評価の判断を誤ってしまう可能性がある。
　そこで、本実施の形態１においては、好気側の培地１６１および嫌気側の培地１６２の色を、ユーザが目視によって区別可能な、互いに異なる色とする。これによって、エッペンチューブなどの容器に培地が回収された後おいて、好気培地および嫌気培地のいずれの培地であるかを容易に判別することが可能となる。また、培養中においても各培地の色を異なる色とすることによって、培養中に培地同士が混合したことを容易に検出することができる。
　なお、２つの培地のうちの少なくとも一方が着色されていればよく、いずれか一方は無色であってもよい。培地の着色は、たとえば培養処理への影響が少ない着色材を用いて行なうことができる。
　また、培地の色は培養の前後において変化しない固定色であってもよいし、培地の状態によって色が変化するものであってもよい。たとえば、メチルオレンジ、フェノールフタレイン（ＰＰ：phenolphthalein）、および、ブロモチモールブルー（ＢＴＢ：bromothymol　blue）のようなｐＨによって色が変化する指示薬が培地に添加される場合には、培養の進行に伴う培地のｐＨの変化よって培地の色が変化し得る。
　回収後の培地の取り違えの防止のためには、培養処理の当初から２つの培地の色が異なっていることは必須ではなく、経過時間あるいは培地の状態の変化によって、培養完了時点において２つの培地の色が異なっていればよい。一方で、培養中の培地の混合状態を検出するためには、培養の初期段階から培地の色が異なっていることが好ましい。
　図２は、図１の細胞培養システム１０を用いて行なわれる培養工程の一例を示すフローチャートである。図２のフローチャートの各工程は、ユーザの手作業によって行なわれてもよいし、一部あるいは全ての工程が、図示しないハンドリング装置などを用いて自動で行なわれてもよい。
　図２を参照して、ステップ（以下、ステップをＳと略す。）１００にて、セルカルチャインサート１２０内のメンブレン１２２上の全面にわたって細胞が培養される。その後、Ｓ１１０にて、容器本体１１０の開口部１１４に、セルカルチャインサート１２０が配置される。
　Ｓ１２０にて、容器本体１１０内に第１色の培地１６１が導入される。このとき、セルカルチャインサート１２０の下面のメンブレン１２２が培地１６１に浸される高さまで、培地１６１が導入される。そして、Ｓ１３０にて、セルカルチャインサート１２０内に、細菌を含む第２色の培地１６２が導入される。なお、図１で説明したように、セルカルチャインサート１２０内には、培養中もポンプ６０にて培地容器７０から新たな培地１６２が供給される。
　なお、Ｓ１２０，Ｓ１３０において用いられる培地１６１，１６２は、市販されている状態ですでに着色されたものであってもよい。あるいは、Ｓ１２０，Ｓ１３０に先立って、着色料および／または指示薬等を用いて無色の培地を着色するステップを含んでもよい。
　容器本体１１０およびセルカルチャインサート１２０に培地が導入されると、Ｓ１４０にて、測定装置１８０で電気抵抗および溶存酸素濃度をモニタしながら、所定時間、細胞および細菌が培養を行なわれる。
　図３は、培養終了後に培地１６１，１６２を回収した状態を説明するための図である。図３においては、培養が終了した段階で、培地１６１の色と培地１６２の色が異なっている状態が示されている。図３の例では、培地１６１の色が薄く示されており、培地１６２の色が濃く示されている。培地１６１，１６２をそれぞれエッペンチューブ２１０，２２０に回収した場合にも、各培地の色の違いによって、培地１６１であるか培地１６２であるかを判別することができる。
　図４は、培養中に細胞１７０およびメンブレン１２２が損傷した場合の培地の状態の一例を示す図である。たとえば、培地１６２の圧力が培地１６１の圧力よりも高い場合には、培養中に細胞１７０およびメンブレン１２２が損傷すると、図４の領域ＲＧのように、セルカルチャインサート１２０内の培地１６２の一部が損傷箇所から培地１６１内に漏れ出す。このとき、培地１６１の色と培地１６２の色とが異なっていると、培地１６１内に漏れ出した培地１６２を容易に検出することができる。なお、培地１６１の圧力が培地１６２の圧力よりも高い場合には、培養中に細胞１７０およびメンブレン１２２が損傷すると、培地１６２内に培地１６１が漏れ出す。
　図５は、培養終了後のサンプル処理工程の一例を説明するためのフローチャートである。図５のフローチャートにおけるＳ２００～Ｓ２４０の処理については嫌気環境で実行され、Ｓ２５０～Ｓ２８０の処理については好気環境で実行される。
　図５を参照して、培養終了後、Ｓ２００にて、嫌気環境において、嫌気培地である培地１６２を容器に特定量回収する。また、Ｓ２１０にて、好気培地である培地１６１を別の容器に特定量回収する。なお、必要に応じて、嫌気環境において回収した各培地を所定時間静置する。
　その後、培地１６１については、好気環境に細菌が存在しないことを確認するために、希釈せずに寒天培地に接種する（Ｓ２２０）。一方、培地１６２については、細菌と共培養した培地であり、細菌を計数することが必要であるため、希釈した上で寒天培地に接種する（Ｓ２３０）。なお、希釈倍率については、細菌の種類および／または培地の濁度などの条件によって異なる。
　寒天培地への接種が完了すると、残りの培地が入った容器を好気環境に取り出し、Ｓ２４０にて遠心分離器を用いて各培地を遠心分離する。Ｓ２５０にて、遠心分離後の各培地の上清をエッペンチューブ等の別容器に移し替えて、所定の環境で保管する。
　その後、Ｓ２６０にて、各培地の残液を回収し、各培地のｐＨを測定する。また、Ｓ２７０にて、沈殿した培地１６２のペレットについて、適量の蒸留水に懸濁し、濁度を測定する。
　図５に示したようなサンプル処理工程を行なう際に、２つの培地を取り違えてしまったり、培養中に培地同士が混合されてしまった場合には、それまでの作業が無駄になるだけでなく、所望の分析結果を得ることができなくなる。本実施の形態１のように、２つの培地を、ユーザが目視で区別可能な互いに異なる色とすることによって、回収後の培地を容易に判別することができるので、２つの培地を取り違えることが防止できる。さらに、培養中に細胞の破損等で培地が漏れ出した場合にも、培地の漏れ状態を容易に検出することができ、実験の失敗を早期に発見することができる。
　［実施の形態２］
　実施の形態２においては、細胞培養装置の他の構成の例について説明する。図６は、実施の形態２の細胞培養方法に用いられる細胞培養システム１０Ａの構成図である。
　図６を参照して、細胞培養システム１０Ａは、細胞培養装置１００Ａと、ポンプ６０Ａ，６０Ｂと、培地容器７０Ａ，７０Ｂ，７５Ａ，７５Ｂと、測定装置１８０と、密閉容器４００とを備える。細胞培養システム１０Ａは、たとえば、嫌気チャンバ内に配置されており、周囲が嫌気環境に保たれている。
　細胞培養装置１００Ａは、共培養デバイス３００を含む。共培養デバイス３００には、メンブレン３１０を介して隣接した２つの流路３２０，３３０が形成されている。流路３２０は好気培地（培地１６１）が流通する経路であり、流路３３０は嫌気培地（培地１６２）が流通する経路である。
　メンブレン３１０における流路３２０側の表面において細胞１７０が培養される。細胞１７０には、メンブレン３１０を介して、流路３２０を流れる培地１６１から酸素が供給される。
　密閉容器４００は、内部空間が密閉可能な容器である。密閉容器４００は、本体部４１０と、蓋部材４２０とを含む。本体部４１０は、一方の端部が底壁で閉塞され、他方の端部が開放された筒形状を有している。本体部４１０の開放された端部には、着脱可能な蓋部材４２０が取り付けられている。密閉容器４００の内部空間は、大気環境すなわち好気環境に保たれている。
　密閉容器４００の内部には、培地１６１が貯留された培地容器７０Ａと、配管５０Ａと、配管５０Ａに設けられたポンプ６０Ａとが配置されている。配管５０Ａは、培地容器７０Ａから共培養デバイス３００の流路３２０に繋がっている。ポンプ６０Ａを駆動することによって、培地容器７０Ａの培地１６１が、配管５０Ａを通って流路３２０へ供給される。流路３２０を通過した培地１６１は、配管５５Ａを通って、廃液用の培地容器７５Ａへと排出される。
　嫌気環境内に配置された培地容器７０Ｂには、培地１６２が貯留されている。培地容器７０Ｂは、配管５０Ｂによって共培養デバイス３００の流路３３０に繋がっている。配管５０Ｂに設けられたポンプ６０Ｂを駆動することによって、培地容器７０Ｂの培地１６２が、配管５０Ｂを通って流路３３０へ供給される。流路３３０を通過した培地１６２は、配管５５Ｂを通って、廃液用の培地容器７５Ｂへと排出される。
　共培養デバイス３００において、流路３２０内に露出するように電極３５０が配置されており、流路３３０内に露出するように電極３５５が配置されている。電極３５０は流路３２０内を流れる培地１６１と電気的に接続可能であり、電極３５５は流路３３０内を流れる培地１６２と電気的に接続可能である。電極３５０，３５５は、測定装置１８０に接続されている。測定装置１８０から電極３５０，３５５に電圧を印加することによって、電極３５０と電極３５５との間の電気抵抗値をモニタリングすることができる。
　また、実施の形態１の場合と同様に、各流路を流れる培地１６１，１６２の溶存酸素濃度を検出するための酸素センサが設けられていてもよい。
　次に図６における共培養デバイス３００の詳細な構成について説明する。図７は、図６の細胞培養システム１０Ａに用いられる共培養デバイス３００の分解斜視図である。
　図７を参照して、共培養デバイス３００は、平板形状のガラス板３０１，３０２と、当該ガラス板３０１，３０２の間に配置された平板形状の樹脂シート３０５，３０６とを含む。ガラス板３０１，３０２および樹脂シート３０５，３０６は、ガラス板３０１、樹脂シート３０５、樹脂シート３０６およびガラス板３０２の順に積層されている。
　なお、樹脂シート３０５，３０６の具体例は、たとえばシリコーンゴムである。またガラス板と樹脂シートとの接合、および、樹脂シート同士の接合は、たとえば、酸素プラズマにより接合面が活性化された状態で当該接合面を加圧することにより行われる。
　ガラス板３０１には、厚み方向に貫通した貫通孔３６１が形成されている。貫通孔３６１には、配管５０Ａが接続される。すなわち、貫通孔３６１は、培地１６１が流れる流路３２０の流入口となる。
　樹脂シート３０５の、ガラス板３０１に面する表面には溝部３４０が形成されている。この溝部３４０とガラス板３０１の表面とによって、図６における流路３２０が形成される。溝部３４０の一方端は、ガラス板３０１の貫通孔３６１と連通している。溝部３４０の他方端には、樹脂シート３０５の厚さ方向に貫通する貫通孔３６２が形成されている。
　樹脂シート３０６およびガラス板３０２において、樹脂シート３０５の貫通孔３６２に対応する位置には、それぞれ貫通孔３６３，３６４が形成されている。ガラス板３０２の貫通孔３６４には、配管５５Ａが接続される。すなわちガラス板３０２の貫通孔３６４は、培地１６１が流れる流路３２０の排出口となる。
　樹脂シート３０６において、ガラス板３０２に面する表面には溝部３８０が形成されている。この溝部３８０とガラス板３０２の表面とによって、図６における流路３３０が形成される。
　ガラス板３０２において、溝部３８０の一方端に対する位置には厚み方向に貫通した貫通孔３７１が形成されており、溝部３８０の他方端に対する位置には厚み方向に貫通した貫通孔３７２が形成されている。ガラス板３０２の貫通孔３７１には、配管５０Ｂが接続される。また、ガラス板３０２の貫通孔３７２には、配管５５Ｂが接続される。すなわち、ガラス板３０２の貫通孔３７１，３７２は、それぞれ培地１６２が流れる流路３３０の流入口および排出口となる。
　樹脂シート３０５の法線方向から平面視した場合に、樹脂シート３０５に形成される溝部３４０の一部は、樹脂シート３０６に形成される溝部３８０と平行に重なっている。樹脂シート３０５における当該重なった部分には、厚さ方向に貫通するスリット３４１が形成されている。また、樹脂シート３０６の溝部３８０において、スリット３４１に対向する位置に、スリット３８１が形成されている。そして、当該スリット３４１とスリット３８１との間に、メンブレン３１０が配置されている。
　このような構成によって、メンブレン３１０を介して隣接した２つの流路３２０，３３０が接続された構成が実現される。すなわち、実施の形態２の細胞培養方法に用いられる細胞培養システム１０Ａにおいては、図６における流路３２０が実施の形態１における細胞培養システム１０の容器本体１１０に対応し、流路３３０が細胞培養システム１０のセルカルチャインサート１２０に対応する。すなわち、実施の形態２における「流路３２０」および「流路３３０」は、本開示における「第１チャンバ」および「第２チャンバ」のそれぞれ対応する。
　そして、当該細胞培養システム１０Ａを用いる場合においても、好気培地の色を嫌気培地の色と異なる色とすることによって、培養終了後の処理において、２つの培地を取り違えることを防止することができる。また、培養中の培地の混合を容易に検出することができる。
　［付記］
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
　（第１項）一態様に係る細胞培養方法は、共培養装置を用いて第１生物学的要素および第２生物学的要素を共培養する方法に関する。共培養装置は、内部に培地を貯留可能な第１チャンバおよび第２チャンバを含む。第２チャンバは、第１チャンバと第２チャンバとを分離するとともに、酸素透過性を有するメンブレンを含む。細胞培養方法は、（ａ）第２チャンバの内部においてメンブレンを覆うようにて第１生物学的要素を培養するステップと、（ｂ）第１色を呈する第１培地を第１チャンバ内に導入するステップと、（ｃ）第２生物学的要素を含み、第１色とは異なる第２色を呈する第２培地を第２チャンバ内に導入するステップと、（ｄ）メンブレンが第１培地に接するように配置された状態で、第１生物学的要素および第２生物学的要素を共培養するステップとを含む。
　第１項に係る細胞培養方法によれば、共培養装置において、２つの培地（好気培地および嫌気培地）として、互いに異なる色を呈する培地を用いて共培養を行なうことによって、共培養終了後に各培地を別の容器に回収した際に、２つの培地を取り違えることを防止することができる。また、細胞の破損等によって培地同士が培養中に混ざり合った状態となった場合に、当該異常状態を容易に発見することが可能となる。
　（第２項）第１項に記載の細胞培養方法において、第２色はユーザが目視により第１色と区別可能な色である。
　第２項に係る細胞培養方法によれば、各培地の色をユーザが目視によって区別可能な色とすることによって、２つの培地を容易に区別することができる。
　（第３項）第１項または第２項に記載の細胞培養方法は、第１培地を第１色に着色するステップと、第２培地を第２色に着色するステップとをさらに含む。
　第３項に係る方法によれば、もとの培地が無色の場合に、着色材等によって培地を着色することによって、２つの培地を区別しやすくすることができる。
　（第４項）第１項または第２項に記載の細胞培養方法において、第１培地および第２培地の少なくとも一方は、培地の状態によって色が変化する指示薬を含む。
　第４項に係る細胞培養方法によれば、培養過程おいて培地の状態（たとえば、ｐＨ）が変化する場合には、培地の状態によって色が変化する指示薬を用いることで、培地の状態の変化を確認することができるとともに、培養後の培地を色の違いによって容易に区別することができる。
　（第５項）第１項～第４項のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、第１培地の溶存酸素濃度は、第２培地の溶存酸素濃度よりも高い。
　第５項に係る細胞培養方法によれば、第１培地を好気培地として用い、第２培地を嫌気培地として用いることができる。
　（第６項）第１項～第５項のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、第２チャンバは、筒状部をさらに含み、当該筒状部の下端を閉塞するようにメンブレンが配置されたセルカルチャインサートである。
　第５項に係る細胞培養方法によれば、第２チャンバとして、一般に広く利用されているセルカルチャインサートを用いることができる。
　（第７項）第１項～第６項のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、第１生物学的要素は器官構成細胞であり、第２生物学的要素は微生物である。
　第７項に係る細胞培養方法によれば、器官構成細胞と微生物との共培養に、本開示の細胞培養方法を適用することができる。
　今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　１０，１０Ａ　細胞培養システム、５０，５０Ａ，５０Ｂ，５５，５５Ａ，５５Ｂ　配管、６０，６０Ａ，６０Ｂ　ポンプ、７０，７０Ａ，７０Ｂ，７５，７５Ａ，７５Ｂ　培地容器、１００，１００Ａ　細胞培養装置、１１０　容器本体、１１１　上壁、１１２　底壁、１１３　側壁、１１４　開口部、１２０　セルカルチャインサート、１２１　筒状部、１２２，３１０　メンブレン、１２３　フランジ部、１３０，１４０，４２０　蓋部材、１５０，１５１，３５０，３５５　電極、１６１，１６２　培地、１７０　細胞、１８０　測定装置、２１０，２２０　エッペンチューブ、３００　共培養デバイス、３０１，３０２　ガラス板、３０５，３０６　樹脂シート、３２０，３３０　流路、３４０，３８０　溝部、３４１，３８１　スリット、３６１～３６４，３７１，３７２　貫通孔、４００　密閉容器、４１０　本体部、ＲＧ　領域。

Claims (7)

  1. 　共培養装置を用いて第１生物学的要素および第２生物学的要素を共培養する細胞培養方法であって、
    　前記共培養装置は、内部に培地を貯留可能な第１チャンバおよび第２チャンバを含み、
    　前記第２チャンバは、前記第１チャンバと前記第２チャンバとを分離するとともに、酸素透過性を有するメンブレンを含み、
    　前記細胞培養方法は、
    　　前記第２チャンバの内部において前記メンブレンを覆うように前記第１生物学的要素を培養するステップと、
    　　第１色を呈する第１培地を前記第１チャンバ内に導入するステップと、
    　　前記第２生物学的要素を含み、前記第１色とは異なる第２色を呈する第２培地を前記第２チャンバ内に導入するステップと、
    　　前記メンブレンが前記第１培地に接するように配置された状態で、前記第１生物学的要素および前記第２生物学的要素を共培養するステップとを含む、細胞培養方法。
  2. 　前記第２色はユーザが目視により前記第１色と区別可能な色である、請求項１に記載の細胞培養方法。
  3. 　前記第１培地を前記第１色に着色するステップと、
    　前記第２培地を前記第２色に着色するステップとをさらに含む、請求項１に記載の細胞培養方法。
  4. 　前記第１培地および前記第２培地の少なくとも一方は、培地の状態によって色が変化する指示薬を含む、請求項１に記載の細胞培養方法。
  5. 　前記第１培地の溶存酸素濃度は、前記第２培地の溶存酸素濃度よりも高い、請求項１に記載の細胞培養方法。
  6. 　前記第２チャンバは、筒状部をさらに含み、前記筒状部の下端を閉塞するように前記メンブレンが配置されたセルカルチャインサートである、請求項１に記載の細胞培養方法。
  7. 　前記第１生物学的要素は、器官構成細胞であり、
    　前記第２生物学的要素は、微生物である、請求項１に記載の細胞培養方法。
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