WO2024257764A1 - 免疫反応の評価方法 - Google Patents

免疫反応の評価方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024257764A1
WO2024257764A1 PCT/JP2024/021195 JP2024021195W WO2024257764A1 WO 2024257764 A1 WO2024257764 A1 WO 2024257764A1 JP 2024021195 W JP2024021195 W JP 2024021195W WO 2024257764 A1 WO2024257764 A1 WO 2024257764A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequences
antigen
vaccine
cov
immune
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/021195
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
洋平 船越
公和 薬師神
剛 大路
博信 南
隆治 松谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kobe University NUC
Original Assignee
Kobe University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kobe University NUC filed Critical Kobe University NUC
Priority to JP2025527941A priority Critical patent/JPWO2024257764A1/ja
Publication of WO2024257764A1 publication Critical patent/WO2024257764A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating immune responses.
  • Non-Patent Documents 1, 2 Since COVID-19, caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), is life-threatening for patients with hematological malignancies, hematologists generally recommend vaccination with mRNA SARS-CoV-2 vaccines (Non-Patent Documents 1, 2). However, it has been reported that some patients with hematological malignancies, such as those who have undergone hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) or B cell depletion therapy, may not achieve sufficient humoral responses after vaccination (Non-Patent Documents 3-6).
  • HSCT hematopoietic stem cell transplantation
  • B cell depletion therapy may not achieve sufficient humoral responses after vaccination.
  • Non-Patent Document 7 Even after the emergence of the omicron variant of SARS-CoV-2, which is considered to have low pathogenicity (Non-Patent Document 7), it has been reported that hospitalization and mortality rates in immunocompromised patients remain high, especially in patients who respond poorly to vaccination (Non-Patent Documents 8, 9).
  • tixagevimab/silgavimab For such patients, the US Food and Drug Administration (FDA) issued an emergency use authorization for tixagevimab/silgavimab in December 2021.
  • the drug contains neutralizing monoclonal antibodies against different epitopes in the receptor-binding domain of the SARS-CoV-2 spike protein and is used as a pre-exposure prophylaxis.
  • tixagevimab/silgavimab is considered to be effective in preventing severe disease and shortening hospitalization in immunocompromised patients (Non-Patent Documents 10, 11).
  • Non-Patent Documents 12 tixagevimab/silgavimab
  • tixagevimab/silgavimab has low activity against certain omicron subspecies such as BQ.1 and XBB (Non-Patent Documents 13, 14).
  • Tixagevimab/silgavimab which was developed before the emergence of the Omicron subspecies, has reduced activity against the currently dominant strains in certain countries (Non-Patent Documents 13, 14).
  • Non-Patent Document 1 One study reported favorable outcomes of COVID-19 caused by the omicron variant as well as previous strains in a cohort of highly vaccinated hematopoietic stem cell transplant patients (Non-Patent Document 15).
  • Non-Patent Document 16 Immunogenicity, especially humoral immunity, after SARS-CoV-2 vaccination is generally evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-SARS-CoV-2 spike IgG antibodies.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • tixagevimab/silgavimab is itself an anti-spike IgG antibody
  • the antibody titer by ELISA is maintained at a fairly high level for a long period of time in all patients who received tixagevimab/silgavimab. Therefore, administration of tixagevimab/silgavimab masks the appearance of anti-spike antibodies after vaccination. In other words, there is a problem that the response to vaccination in these patients cannot be evaluated, even though vaccination is recommended.
  • This problem of being unable to selectively evaluate only the targeted immune response is not unique to the situation after administration of tixagevimab/silgavimab, but is common to the situation after administration of all antibody drugs against SARS-CoV-2, such as casirivimab/imdevimab and sotrovimab, as well as other antibody drugs that may be clinically approved in the future.
  • this problem occurs not only after administration of antibody drugs, but also in situations where antibody titers are maintained at a high level due to previous vaccination or infection, etc.
  • this problem is not limited to vaccines against SARS-CoV-2, but is a universal problem that applies to the evaluation of any vaccine and, ultimately, any response to any antigen (e.g., infection, cancer immune response, autoimmune response, etc.).
  • any antigen e.g., infection, cancer immune response, autoimmune response, etc.
  • none of the currently used techniques can selectively evaluate only the targeted immune response.
  • a new analytical method is needed that can evaluate immune responses at the level of mRNA expression, rather than at the level of protein expression, as in the case of conventional antibody titer measurement using ELISA.
  • repertoire analysis cannot be simply applied to evaluate the post-vaccination response at the mRNA level is that repertoire analysis is a means essentially for evaluating the degree and changes in immune diversity, and is naturally not envisioned as a means for selectively identifying immune responses to specific antigens at the antibody sequence level.
  • the object of the present invention is to provide a method for selectively identifying immune responses to specific antigens at the mRNA level using immune cell receptor repertoire data.
  • the present invention was completed through further investigation based on this knowledge.
  • Item 1 A step A of preparing repertoire data including a group of sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors obtained from a sample of a subject; and B. comparing the repertoire data with a database including a group of sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors for specific antigens, and detecting from the repertoire data a sequence that is identical to the sequence included in the database at the amino acid sequence level or that is identical in a portion other than two or less amino acid residues. This makes it possible to identify the sequence that immunologically reacted in the subject's body at the time the sample was collected.
  • the method according to Item 1 further comprising a step C of deriving the number and/or frequency in the repertoire data of the sequences detected by the step B.
  • Item 3. The method according to Item 2, further comprising a step D of confirming a change in the number and/or frequency over time.
  • Item 4. The method according to Item 3, wherein in the step D, it is confirmed whether the time when the increase is observed as the change over time corresponds to 11 to 20 days or 3 to 10 days after stimulation with the specific antigen.
  • Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the subject is a subject that has been exposed to the specific antigen.
  • Item 6. The method according to Item 5, wherein the exposure to a specific antigen is vaccination. Clause 7.
  • the method of clause 6, wherein the vaccine is a nucleic acid vaccine.
  • Clause 8. The method of clause 6, wherein the vaccine is a coronavirus vaccine or an influenza vaccine.
  • the method further comprises a step E of evaluating the scientific validity of the nucleic acid vaccine by checking additional information included in the database for the sequence whose number and/or frequency has been confirmed to increase over time, the additional information is selected from the group consisting of: [1] information on the presence or absence of neutralizing activity against an antigen, [2] information on the species or strain of the antigen, and [3] information on an epitope; Item 9.
  • the specific antigen is a vaccine, 14.
  • Item 15. The method according to any one of Items 5 to 14, wherein the sample is collected at the time of activation of mRNA of an immune cell receptor for the specific antigen.
  • Item 16 The method according to Item 15, wherein the activation time is 11 to 20 days or 3 to 10 days after the exposure.
  • Item 17 The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the subject has undergone cancer immunotherapy.
  • the method according to Item 16 wherein the sample is collected at the time of activation of the mRNA of an immune cell receptor for the specific antigen.
  • Item 19 The method according to Item 17, wherein the activation period is 11 to 20 days or 3 to 10 days after the cancer immunotherapy.
  • Item 20 The method according to any one of Items 1 to 16, wherein the subject is a subject receiving immunosuppressive treatment.
  • Clause 21 The method of clause 20, wherein the immunosuppressive treatment is hematopoietic stem cell transplantation or administration of B cell depletion therapy.
  • Item 23. The method according to any one of Items 1 to 16, wherein the subject is a patient with an autoimmune disease.
  • the repertoire data is obtained from samples of subjects who have been vaccinated against a previously emerged virus strain ST1, the specific antigen is a virus strain ST2, the efficacy of which by the vaccine is unknown; Item 3.
  • the method of item 1 or 2 further comprising step H of evaluating the vaccine as effective against the virus strain ST2 if the detected sequence is present.
  • Item 25 The method according to any one of items 1 to 24, wherein the database comprises sequences of antigen recognition sites of the immune cell receptors for the specific antigens collected from a population of survey subjects in which an immune response to the specific antigen has occurred, and is obtained by the following steps: A process of acquiring repertoire data including a group of sequences of antigen recognition sites of the immune cell receptor from samples of each of the survey subjects, the repertoire data being in chronological order at the activation time T ex of the mRNA of the immune cell receptor for the specific antigen, T bf before the activation time, and T af after the activation time; and a process of selecting, as information to be collected in the database, sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors that are observed to proliferate at the activation time T ex .
  • Item 26 The method according to Item 25, wherein the activation time T ex is 11 to 20 days or 3 to 10 days after stimulation with the specific antigen.
  • Item 27 The method according to any one of items 1 to 26, wherein the immune cells are T cells or B cells.
  • the present invention provides a method for selectively identifying immune responses to specific antigens at the mRNA level using immune cell receptor repertoire data.
  • FIG. 1 shows an outline of an example of a method for evaluating an immune response according to the present invention.
  • FIG. 1 shows a conceptual diagram of an example of creating a database to be applied to the immune response evaluation method of the present invention.
  • FIG. 1 shows a conceptual diagram of an example in which a large-scale data set group is applied as a comprehensive biosensor to the immune response evaluation method of the present invention.
  • FIG. 1 shows a conceptual diagram of an example of the scientific validity of a vaccine that can be evaluated by the immune response evaluation method of the present invention (the ability of a healthy subject to produce, through vaccination, antibodies that completely match the antibodies acquired by a patient through infection with an antigen). Anti-spike antibody titers over time.
  • Numbers indicate number of sequences used. Number and frequency of SARS-CoV-2-specific sequences over time in three patients infected with COVID-19. NGS analysis was performed on PBMCs collected over time after SARS-CoV-2 infection. Clone numbers (top) and frequencies (bottom) of SARS-CoV-2-specific sequences with identical V and J genes to the CoV-AbDab sequence and Levenshtein distances of 0 (left), 1 (middle) or 2 (right) for the CDR3 amino acid sequence are shown. The bottom circle plot shows a cluster plot of SARS-CoV-2-specific sequences. An igraph network of up to 1000 SARS-CoV-2-specific sequences is shown.
  • Each node represents a single unique read with identical IGHV, IGHJ and complementarity determining region 3 (CDR3) amino acid sequences. Nodes were connected by edges defined by a Levenshtein distance of ⁇ 1 for the CDR3 amino acid sequence. The size of the node was the percent frequency of each unique read. Changes in number, frequency and clusters of SARS-CoV-2-specific sequences over time following primary and booster vaccination. Healthy volunteer 1 received a primary dose of mRNA SARS-CoV-2 vaccine (monovalent BNT162b2) followed by a second dose 21 days later. After Figure 7A, the fifth dose of the bivalent BNT162b2 vaccine was administered.
  • SARS-CoV-2-specific sequences were searched for SARS-CoV-2-specific sequences in the BCR repertoire data. Time course of number, frequency and clustering of SARS-CoV-2-specific sequences after primary and booster vaccination. Healthy volunteer 2 received the fourth dose of monovalent mRNA-1273 and then SARS-CoV-2-specific sequences were measured 2, 6 and 9 days after the booster vaccination. Time course of SARS-CoV-2 specific sequence numbers, frequency and clusters after mRNA vaccination in hematopoietic stem cell transplant recipients receiving tixagevimab/silgavimab.
  • the recipient (T/C patient 1) was administered tixagevimab/silgavimab (T/C) 338 days after cord blood transplantation and then the mRNA vaccine (time indicated by the Vaccination arrow).
  • Immune cell reconstitution of helper T cells CD3+CD4+
  • class-switched B cells CD19+CD27+IgD-
  • plasmablasts CD19+CD27+CD38+
  • Anti-SARS-CoV-2 antibody titers were measured using the Abbott SARS-CoV-2 IgG II Quant kit (Abbott) and the Roche Elecsys anti-SARS-CoV-2 S kit (Roche).
  • T/C tixagevimab/silgavimab. Number, frequency and clusters of SARS-CoV-2-specific sequences over time following mRNA vaccination in hematopoietic stem cell transplant recipients receiving tixagevimab/silgavimab. In T/C patient 2, the recipient received tixagevimab/silgavimab 212 days after unrelated bone marrow transplant and then the mRNA vaccine (time indicated by the Vaccination arrow).
  • Distribution of CDR3 amino acid lengths of SARS-CoV-2-specific sequences with different CDR3 amino acid distances Percent frequency of SARS-CoV-2-specific sequences with different CDR3 lengths detected in this study is shown. VJ usage frequency of SARS-CoV-2 specific sequences with different CDR3 amino acid distances.
  • the percentage of VJ usage frequency of SARS-CoV-2 specific sequences detected in this study is shown in a bubble chart.
  • the X-axis shows IGHV genes
  • the Y-axis shows IGHJ genes
  • the size of the bubble indicates the frequency of usage.
  • Characteristics of SARS-CoV-2-specific sequences induced by SARS-CoV-2 infection or vaccination Alignment of SARS-CoV-2-specific sequences from infected and vaccinated individuals.
  • the CDR3 amino acid sequences of IGHV4-59, IGHV3-33, IGHV3-53, IGHV3-66, and IGHV3-9, which frequently appear in infected and vaccinated individuals (Table 3A and Table 3B, SARS-COV-2-specific sequences (perfect match) from infected and vaccinated individuals), were aligned using ClustalOmega, and sequence logos were drawn using the ggseqlogo package. Characteristics of SARS-CoV-2-specific sequences induced by SARS-CoV-2 infection or vaccination. Probability of generation (pGen) values were compared.
  • a histogram of pGen values for 8,977 SARS-CoV-2-specific sequences in the CoV-AbDab database and 86 perfectly matched SARS-CoV-2-specific sequences (FoundCoV) detected in infected and vaccinated individuals is shown.
  • pGen values were calculated from the CDR3 amino acid sequence of each sequence using the OLGA package. Sequences with high pGen values have a high occurrence probability, and sequences with low pGen values occur rarely. Occupancy frequency of the dominant individual clones and the top 10 clones in vaccinated healthy volunteers. Individual clones with an occupancy frequency above 0.1% in vaccinated healthy volunteers are indicated by dots.
  • the X-axis shows IGHV genes
  • the Y-axis shows IGHJ genes
  • the size of the bubble shows the percentage frequency of usage.
  • Characteristics of SARS-CoV-2-specific sequences Distribution of CDR3 amino acid lengths of SARS-CoV-2-specific sequences with different CDR3 amino acid distances in the OAS database. The read abundance of SARS-CoV-2-specific sequences with different CDR3 amino acid lengths reported in the OAS database from 2011 to 2020 is shown.
  • SARS-CoV-2-specific sequences with different CDR3 edit distances (LV0, LV1, LV2) are shown in separate bar graphs. Alignment of SARS-CoV-2 specific sequences with IGHV4-59, 8 amino acid CDR3 sequences.
  • Sequence logos were generated with the ggseqlogo package. Comparison of probability of generation (pGen) values of SARS-CoV-2-specific sequences. Histograms show the pGen values of 8,977 SARS-CoV-2-specific sequences in the CoV-Ab database (CoV-AbDab) and 372 exact matches found in the OAS database (FoundCoV (OAS)). The X-axis shows density, and the Y-axis shows the logarithmic value (log10) of pGen. It was confirmed that vaccination with an mRNA vaccine against SARS-CoV-2 increased antibody sequences that bind to various strains (mutated strains, Omicron strain variants) in the same test subject.
  • sequences matching the database in the BCR repertoire (antibody sequences with a Levenshtein distance of 0 amino acid difference in CDR3, and antibody sequences with a Levenshtein distance of 1 or less) increased within about two weeks.
  • sequences matching the database in the BCR repertoire (antibody sequences with a Levenshtein distance of 0 amino acid difference in CDR3 and antibody sequences with a Levenshtein distance of 1 or less) increased within about one week.
  • 1 shows an illustration of B cell subset classification. After cancer immunotherapy (booster vaccination), activated B cells increased within about a week. After cancer immunotherapy (booster vaccination), activated B cells increased within about a week.
  • activated B cells increased within about one week, and a greater increase was observed in patients who developed irAE (patients 1, 2, 6, 10, and 11).
  • the first antigen stimulation (vaccination) after hematopoietic stem cell transplantation increased sequences matching the database in the BCR repertoire (antibody sequences with a Levenshtein distance of 0 amino acid difference in CDR3, and antibody sequences with a Levenshtein distance of 1 or less) within two weeks after the first antigen stimulation.
  • the number of sequences matching the database in the BCR repertoire (antibody sequences with a Levenshtein distance of 0 amino acid difference in CDR3, and antibody sequences with a Levenshtein distance of 1 or less) increased within one week after the second or subsequent antigen stimulation.
  • the number of sequences that matched the BCR repertoire database (containing approximately 1,300 sequences independently collected from citations from research papers) increased within about a week.
  • Figure 23A shows an in vitro experiment for collecting sequences to expand the database used.
  • the immune response evaluation method of the present invention is a method for evaluating immune responses to specific antigens using antigen receptor repertoire analysis.
  • the immune response evaluation method of the present invention may be referred to as the "Quantification of Antigen-specific Antibody Sequence (QASAS) method.”
  • QASAS Quality of Antigen-specific Antibody Sequence
  • An example of the immune response evaluation method of the present invention is outlined in Figure 1.
  • the method for evaluating an immune response of the present invention includes a step A of preparing repertoire data [corresponding to FIG. 1(ii)] containing a group of sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors (antigen receptors) obtained from a sample of a subject [corresponding to FIG. 1(i)], and a step B of comparing a database [corresponding to FIG. 1(iii)] containing a group of sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors for specific antigens with the repertoire data [corresponding to FIG. 1(ii)], and detecting, from the repertoire data [corresponding to FIG. 1(ii)], a sequence that is identical to the sequence contained in the database [corresponding to FIG.
  • the method of the present invention can identify sequences that show an immunologically appropriate reaction, that is, sequences that can truly react to antigens, from the many sequences contained in the repertoire data (ii) and database (iii), and therefore can evaluate immune responses at the level of mRNA expression, rather than at the level of protein expression as in conventional antibody titer measurements by ELISA.
  • the immune response evaluation method of the present invention can further include a step C of deriving the number (corresponding to the "number of matching sequences (clones)" in FIG. 1) and/or frequency (corresponding to the "proportion of matching sequences” in FIG. 1) in the repertoire data of the sequences detected in the step B. This makes it possible to determine the degree of the immune response.
  • the immune response evaluation method of the present invention may further include a step D of confirming the change over time in the number and/or frequency of sequences matching the database (i.e., the change in the "number of matching sequences (clones)” or the “percentage of matching sequences” on the "Day” axis in FIG. 1).
  • This allows the change in the immune response for each collection time of the sample to be investigated. Note that while antibody proteins take time to reach a detectable level after an immune response and remain in the body for a long time due to their long half-life, mRNAs reach a detectable level quickly after an immune response and do not remain in the body for a long time due to their short half-life.
  • the immune response can be quickly detected based on the mRNA level, and humoral immune activity can be grasped in real time.
  • Step A repertoire data of sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors obtained from a subject's sample (corresponding to FIG. 1(i)) is prepared.
  • a repertoire is the totality of time-varying adaptive immune receptors possessed by a subject (immune repertoire).
  • the biological sample that is the source of repertoire data is not particularly limited as long as it contains immune cells, and examples include body fluid samples such as blood and lymph, and tissue homogenates, and the like, preferably body fluid samples, more preferably blood (even more preferably peripheral blood mononuclear cells).
  • the repertoire data includes sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors.
  • B cells or T cells can be selected as immune cells.
  • preferred examples include shapes [a] to [c], [e], and [f].
  • preferred examples include shapes [d] and [f].
  • the immune cells from which the antigen recognition site sequences are derived include immune cells specific to a particular antigen, but also randomly include immune cells that are not specific to a particular antigen, with no distinction being made between them.
  • the immune cells from which the antigen recognition site sequences are derived are not immune cells specific to a particular antigen narrowed down from all immune cells obtained from the above biological sample, but can typically include all immune cells identifiable from the above biological sample (for example, all B cells or all T cells identifiable from peripheral blood mononuclear cells).
  • the repertoire data may include information obtained from a single subject, or may include information obtained from multiple subjects with common subject attributes.
  • the sequence of the antigen recognition site of the immune cell receptor includes a gene sequence that determines the clonotype of the immune cell.
  • the gene sequence may be any sequence that forms a complementarity determining region by rearrangement.
  • the gene sequence may be the V and J segments of the TCR ⁇ chain, TCR ⁇ chain, and immunoglobulin L chain, as well as the V, D, and J segments of the TCR ⁇ chain, TCR ⁇ chain, and immunoglobulin H chain.
  • the complementarity determining region may be at least one of CDR1, CDR2, and CDR3, but preferably includes at least CDR3.
  • the repertoire data may be obtained by a repertoire analysis method.
  • the repertoire analysis method is known, and involves determining the sequence (gene sequence) of the antigen recognition site of an immune cell receptor from a biological sample of a subject by next-generation sequencing.
  • the repertoire data can be obtained by extracting total RNA from the biological sample of the subject, synthesizing cDNA, amplifying the gene sequence of the immune cell receptor, determining the sequence on a large scale by next-generation sequencing, and assigning the sequence (gene sequence) region of the antigen recognition site.
  • nucleic acid amplification it is preferable to uniformly amplify the gene sequence of the immune cell receptor without bias (non-biased gene amplification), and the design of a multiplex primer panel for such non-biased gene amplification can also be selected based on known techniques.
  • the number of sequences included in the repertoire data is not particularly limited, and may be determined according to the scale of one analysis of the next-generation sequencing used and the number of subjects who provided the repertoire data. Specifically, the number of sequences included in the repertoire data may be, for example, 100,000 to 10 million, 300,000 to 5 million, or 500,000 to 3 million immune cell receptors.
  • the repertoire analysis method applicable to the present invention includes not only bulk analysis, which analyzes gene expression in immune cells at the cell population level, but also single-cell analysis, which analyzes gene expression in immune cells at the individual cell level.
  • Subject is not particularly limited as long as it is a subject for which an immune response needs to be evaluated, and can be set according to the purpose of application of the method of the present invention.
  • Specific examples of subjects include subjects exposed to a specific antigen, subjects receiving cancer immunotherapy, and subjects suffering from an autoimmune disease.
  • biological species of subjects include humans and non-human animals (including, but not limited to, mice, rats, zebrafish, etc.).
  • Subjects exposed to a specific antigen is not particularly limited as long as it is an event that leads to activation of an immune response, and examples thereof include vaccination and infection.
  • subjects vaccinated with a specific antigen As subjects exposed to a specific antigen, subjects vaccinated with a specific antigen can be selected.
  • the immune response of the vaccine can be evaluated not only by identifying the sequence that reacted with the vaccine in the subject's body at the time of sample collection, but also by evaluating (including predicting) the scientific validity of the vaccine (e.g., whether the vaccine exerts a predetermined function in accordance with its design). Examples of cases in which the subject is selected include form [a], form [b], and form [f].
  • the method of the present invention is highly useful in that it can selectively identify immune responses to specific antigens from repertoire data, and therefore can effectively identify immune responses to specific antigens even in the case of immune responses to a vaccine.
  • the type of vaccine is not particularly limited, and specific examples include nucleic acid vaccines (mRNA vaccines, DNA vaccines), viral vector vaccines, recombinant protein vaccines, inactivated vaccines, and live vaccines.
  • the vaccine is preferably a vaccine designed against a pathogen described below, and preferably a vaccine designed against a virus described below, more preferably a coronavirus or influenza virus (coronavirus vaccine or influenza virus vaccine).
  • the method of the present invention is capable of identifying an immune response to a specific antigen at the sequence level of the antibody's complementarity determining region, and is also capable of identifying antigen information such as the type of strain (mutant, variant) or epitope (antibody binding site) from the sequence information of the antibody's complementarity determining region. Therefore, it is possible to confirm the type of strain (mutant, variant) and the ability to recognize epitopes of antibodies produced by vaccines that use the blueprint (genetic information) of a specific antigen as an active ingredient, particularly nucleic acid vaccines, from antigen information such as epitopes linked to the sequence of the complementarity determining region in the database. From this perspective, preferred examples of vaccine types include nucleic acid vaccines (mRNA vaccines, DNA vaccines), and more preferably RNA vaccines (mRNA vaccines).
  • subjects infected with a specific antigen As subjects exposed to a specific antigen, subjects infected with a specific antigen can be selected. In this case, the immune response in a specific infectious disease can be evaluated. Examples of cases in which such subjects are selected include form [c] and form [f].
  • the infection is not particularly limited as long as it is an infection caused by a specific antigen, and specific examples include infections caused by antigenic organisms such as viruses, bacteria, and fungi.
  • Viruses are not particularly limited, and examples include coronaviruses, influenza viruses, cytomegaloviruses, rotaviruses, herpes viruses, human immunodeficiency viruses, dengue viruses, etc.
  • Coronaviruses include cold coronaviruses (HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), and novel coronavirus (SARS-CoV-2).
  • Influenza viruses include type A (including any combination of 16 types of hemagglutinin (HA) H1-H16 and 9 types of neuraminidase (NA) N1-N9), type B, and type C.
  • Bacteria are not particularly limited, but examples include Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Yersinia spp., Escherichia coli, Vibrio bacillus, Haemophilus influenzae, gram-negative bacillus, Mycobacterium tuberculosis, etc.
  • Fungi are not particularly limited, but examples include Candida and Aspergillus.
  • antigens that are pathogens include not only antigens for which infection has been confirmed and the species and strains have been identified, but also pathogens such as mutant strains that may newly emerge in the future.
  • antigen information can be identified from sequence information related to the repertoire data via an existing database, so that in the diagnosis of infectious diseases, not only can it be determined what type of pathogen is causing the infection, but it can also be determined whether or not an existing vaccine can be applied to the newly emerging pathogen.
  • Subjects with high levels of other antibodies Subjects exposed to a specific antigen (subjects described in the above items "1-2-1-1" and "1-2-1-2") may also have high levels of other antibodies at the time of specimen collection.
  • the other antibodies refer to antibodies different from those produced by exposure to the specific antigen. Examples of cases in which such subjects are selected include forms [a] to [c] and [f].
  • Subjects who have high levels of other antibodies include subjects who have been administered an antibody drug, vaccinated, and/or infected. Below, subjects who have been administered an antibody drug are also referred to as “subject (S1),” subjects who have been vaccinated are also referred to as “subject (S2),” and subjects who have been infected are also referred to as “subject (S3).”
  • the subject (S1) is not particularly limited, but specific examples include subjects who have undergone immunosuppressive treatment or patients suffering from autoimmune diseases.
  • immunosuppressive treatment include the treatments described in section 1-2-3 below.
  • autoimmune diseases include the diseases described in section 1-2-4 below.
  • An example of an antibody drug is an antibody drug administered to a subject who has undergone immunosuppressive treatment, for example, to counter exposure to a specific antigen.
  • examples of antibody drugs when the specific antigen is the new coronavirus include tixagevimab/silgavimab, casirivimab/imdevimab, sotrovimab, etc.
  • Other examples of antibody drugs include antibody drugs used to treat autoimmune diseases. This antibody drug can be appropriately selected by a person skilled in the art depending on the type of autoimmune disease.
  • the vaccine that satisfies the condition for subject (S2) is a different vaccine from the vaccine that satisfies the condition for the subject in the above item "1-2-1-1".
  • the other vaccine include a vaccine that produces antibodies different from the antibodies produced by the vaccine that satisfies the condition for the subject in the above item "1-2-1-1” (i.e., a specific antigen), a vaccine designed to target another antigen (an antigen other than the specific antigen), etc.
  • the pathogen in the subject (S3) is not particularly limited. However, when the subject in the above item "1-2-1-2" further becomes the subject (S3), the pathogen that satisfies the condition of the subject (S3) is another pathogen that is different (at least at the strain class level) from the pathogen (i.e., the specific antigen) that satisfies the condition of the subject in the above item "1-2-1-2". Specifically, the other pathogen can be appropriately selected from the pathogens listed in the above item "1-2-1-2".
  • the method of the present invention can selectively identify an immune response to a specific antigen from repertoire data without being affected by the amount of antibody protein in the body, so that if an immune response to a specific antigen occurs, it can be identified even in subjects who have high levels of other antibodies.
  • the relationship between the timing of administration of the antibody drug and the timing of antigen exposure is not particularly limited, as long as the biological sample related to the repertoire data is obtained while the antibody related to the antibody drug is retained in the body. Therefore, within the above limits, the timing of administration of the antibody drug may be before antigen exposure, simultaneously with antigen exposure, or after antigen exposure, and is preferably before antigen exposure.
  • Subjects who have undergone cancer immunotherapy In the body of a subject who has undergone cancer immunotherapy (a treatment that strengthens the body's inherent immune response to cancer), immune cells re-recognize cancer antigens that were previously tolerant. In principle, this re-recognition of immune cells to cancer antigens (neoantigens) is accompanied by a change in the immune environment (activation of immune response) similar to that of antigen exposure.
  • the method of the present invention can evaluate immune responses activated by antigen exposure, and therefore immune responses activated by cancer immunotherapy can also be evaluated by the same mechanism. Therefore, subjects who have undergone cancer immunotherapy can be selected as subjects. Examples of cases in which such subjects are selected include form [d] and form [f].
  • a cancer antigen can be selected as the specific antigen.
  • Cancer immunotherapy involves treatments that release the brakes placed on the immune system by cancer, such as the administration of immune checkpoint inhibitors, which activate cancer immunity by inhibiting immunosuppressive signal transduction.
  • immune checkpoint inhibitors include anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, and anti-CTLA4 antibodies.
  • the immune response of a subject who has undergone cancer immunotherapy it is possible to determine whether the prescribed function of cancer immunotherapy is being exerted (i.e., the effectiveness of cancer immunotherapy). Furthermore, according to the method of the present invention in the case where the subject is selected, it is possible to identify an antigen that matches the T cell receptor database as a clinically significant T cell receptor sequence from sequence information related to the T cell receptor repertoire data of a sample collected after cancer immunotherapy, and therefore an antigen (typically a peptide) that binds to the T cell receptor sequence can be identified as a true neoantigen.
  • an antigen typically a peptide
  • subjects who have received immunosuppressive treatment can be selected. Examples of cases in which such subjects are selected include case b4 of form [b] and form [f]. As the specific antigen, a vaccine can be selected.
  • Immunosuppressive treatments include, but are not limited to, hematopoietic stem cell transplantation, administration of B cell depletion therapy (chemotherapy), etc.
  • chemotherapy B cell depletion therapy
  • When used to evaluate the immune response of a subject who has undergone immunosuppressive treatment for example, it can be determined whether or not the immune response weakened by immunosuppressive treatment has recovered due to antigen stimulation (vaccination, etc.) after immunosuppressive treatment.
  • the subject When the subject is selected, it is sufficient that the subject receives antigen stimulation with a specific antigen after the immunosuppressive treatment, and the subject may or may not receive stimulation with an antigen (this antigen may be the same as the specific antigen or may be an antigen different from the specific antigen) before the immunosuppressive treatment. Even if the subject receives stimulation with the same antigen as the specific antigen before the immunosuppressive treatment, the immune system is reset by the immunosuppressive treatment. For this reason, in the method of the present invention, even if the subject receives stimulation with the same antigen as the specific antigen before the immunosuppressive treatment, the reaction due to stimulation with the specific antigen received after the immunosuppressive treatment is considered to be the primary immune reaction (see Figure 22A).
  • Subjects suffering from an autoimmune disease As subjects, subjects suffering from an autoimmune disease can be selected. Examples of cases in which such subjects are selected include form [e] and form [f]. As the specific antigen, an autoantigen can be selected.
  • Autoimmune diseases are not particularly limited, but examples include myasthenia gravis (autoantigen: acetylcholine receptor), immune thrombocytopenia (ITP) (autoantigen: platelets), and type 1 diabetes (autoantigen: ⁇ cells).
  • autoantigen acetylcholine receptor
  • ITP immune thrombocytopenia
  • ⁇ cells type 1 diabetes
  • the method of the present invention allows for the onset or progression of an autoimmune disease to be evaluated by identifying sequences from sequence information related to immune cell receptor repertoire data obtained from the subject that match a database of immune cell receptors for autoantigens that cause the autoimmune disease.
  • the method of the present invention can also be used to evaluate side effects after drug administration.
  • a database group for autoantigens is constructed, and the off-target effect of the drug can be evaluated by confirming that administration of the drug increases the number of matching sequences in the database for a target other than the designed target of the drug.
  • a SARS-CoV-2 vaccine is administered, if repertoire analysis shows an increase in matching sequences in the myocardial database, rather than in the SARS-CoV-2 database, among the countless databases that make up the database group, it can be evaluated that myocarditis occurs as a side effect. This makes it possible to screen for new drugs to predict the appearance of unexpected side effects (antibodies that react to autoantigens), making it possible to develop new drugs that are safer.
  • Time of Acquisition of Repertoire Data There is no particular limitation on the time of acquisition of the subject's repertoire data (i.e., the time of collection of the biological sample that is the source of the repertoire data), and it can be selected from any time when an immune response needs to be evaluated. Preferably, a time is selected that coincides with the activation time of the mRNA of the immune cell receptor for a specific antigen (i.e., the time of clonal proliferation of immune cells that have responded to a specific antigen in the repertoire).
  • a specific activation time of the mRNA does not depend on the type of specific antigen, and can be, for example, 4 to 18 days after immune stimulation by a specific antigen.
  • the time period may be, for example, 11 to 20 days or 11 to 18 days, preferably 12 to 16 days, and more preferably 13 to 15 days, after antigen stimulation for the primary response; and in the case of evaluating a secondary, tertiary, ..., or n-th response (n is an integer representing the number of immune responses.
  • secondary and subsequent responses are collectively also referred to as “secondary and subsequent responses" (e.g., when evaluating booster vaccination of a vaccine or cancer immunotherapy), the time period may be, for example, 3 to 10 days or 4 to 10 days, preferably 5 to 9 days, and more preferably 6 to 8 days, after antigen stimulation for the secondary, tertiary, ..., or n-th response, respectively.
  • step B a database of sequences of antigen recognition sites for specific antigens [corresponding to FIG. 1(iii)] is collated with the repertoire data [corresponding to FIG. 1(ii)], and sequences that are identical to the sequences included in the database at the amino acid sequence level or that are identical except for two or less amino acid residues [corresponding to "sequences matching the database" in FIG. 1] are detected from the repertoire data.
  • the database contains sequences of antigen recognition sites for specific antigens.
  • the specific antigens are the same as the specific antigens described above in "1-2. Subjects.”
  • the sequences of the antigen recognition sites are as described above as the sequences of the antigen recognition sites in "1-1. Repertoire data.”
  • the database may also contain additional information (hereinafter simply referred to as "additional information") such as antibody sequences, nanobody sequences, and variable region sequences for a specific antigen, the presence or absence of neutralizing activity of the antibody, epitope regions in a specific antigen, and species and strains (mutants, variants) of the antigenic organism.
  • additional information such as antibody sequences, nanobody sequences, and variable region sequences for a specific antigen, the presence or absence of neutralizing activity of the antibody, epitope regions in a specific antigen, and species and strains (mutants, variants) of the antigenic organism.
  • CoV-AbDab a database managed by the Oxford Protein Informatics Group at the Department of Statistics, University of Oxford
  • CoV-AbDab contains information on ⁇ -coronaviruses such as SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, and MERS-CoV, and includes information on the sequences of antibodies that can bind to each ⁇ -coronavirus, nanobody sequences, variable region sequences, the presence or absence of neutralizing activity of the antibodies, epitope regions, species and strains (mutations, variants) of each ⁇ -coronavirus, etc.
  • the database may be a publicly available database as long as it contains the above information, or may be a database created by collecting data for each specific antigen.
  • the sequence of the antigen recognition site for a specific antigen to be included in the database can be appropriately obtained using a known method. Examples of the method for collecting data include the following methods [1] to [3]. To collect the database, any of the methods [1] to [3] may be used, or two or more of the methods may be used in combination. [1] Collection from existing literature and/or public databases [2] Collection of sequences through in vitro experiments [3] Collection of sequences through in silico
  • sequences of known antigen recognition sites for a specific antigen are selected from existing literature and/or public databases, and information to be included in the database can be compiled by associating additional known information as necessary.
  • the method of [2] above includes, for example, a step of preparing a labeled protein by labeling a protein synthesized from an antigen sequence, a step of sorting cells that bind to the labeled protein from among a population of immune cells, and a step of acquiring the sequences of the sorted cells as information to be collected in a database.
  • the sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors can be collected using machine learning to predict antigen/antigen receptor binding.
  • binding prediction include antigen/epitope binding analysis using a protein language model (e.g., Bioinformatics, Volume 37, Issue Supplement_1, July 2021, Pages i237-i244, and Bioinformatics, Volume 39, Issue 1, January 2023, btac820), protein structure analysis using a diffusion model (e.g., Nature. 2024 May 8. doi: 10.1038/s41586-024-07487-w), and binding analysis thereof.
  • a protein language model e.g., Bioinformatics, Volume 37, Issue Supplement_1, July 2021, Pages i237-i244, and Bioinformatics, Volume 39, Issue 1, January 2023, btac820
  • protein structure analysis e.g., Nature. 2024 May 8. doi: 10.1038/s41586-024-07487-w
  • immune cells capable of binding to a specific antigen are obtained from a group of subjects in which an immune reaction has occurred due to the specific antigen, and sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors can be collected by repertoire analysis.
  • the method combining the above-mentioned [2] and [3] preferably includes the following steps.
  • FIG. 2 A conceptual diagram of an example of creating a database by this method is shown in FIG. 2.
  • the activation time of immune cell receptor mRNA i.e., the time of clonal proliferation of immune cells reacting to a specific antigen in the repertoire
  • clonal proliferation period based on the predetermined period after antigen stimulation (clonal proliferation period) described above in "1-3.
  • Time of acquiring repertoire data it is possible to acquire time-series immune cell receptor repertoire data including before the activation (T bf : before clonal proliferation), the activation period (T ex : clonal proliferation period), and after the activation (T af : after clonal proliferation: reduction of the proliferated clone).
  • T bf before clonal proliferation
  • T ex clonal proliferation period
  • T af after clonal proliferation: reduction of the proliferated clone.
  • huge amounts of data for example, about 200,000 reads each
  • a sequence that is identical to the sequences contained in the database at the amino acid sequence level or is identical to the sequences contained in the database in a portion other than two or less amino acid residues is, in other words, a sequence that is a completely identical amino acid sequence or an amino acid sequence with a mismatch of one to two residues (preferably one residue) with respect to the sequence in the database (similar sequence).
  • Levenshtein distance method Any method capable of comparing amino acid sequences can be used to detect matching sequences.
  • Levenshtein distance method can detect amino acid sequences whose Levenshtein distance (edit distance, i.e., the minimum number of single-character substitutions, insertions, and deletions required to make one string match another) is 0 to 2 (preferably 0 to 1). Therefore, among matching sequences, the Levenshtein distance of a completely identical sequence is 0, and the Levenshtein distance of a similar sequence is 1 to 2 (preferably 1).
  • step C the number (corresponding to "number of matching sequences (clones)" in FIG. 1) and/or frequency (corresponding to "proportion of matching sequences” in FIG. 1) in the repertoire data of the sequences identified in step B is derived.
  • step C can be optionally included regardless of the purpose of application of the method of the present invention.
  • step C the number of sequences detected as being identical or similar to sequences in the database (matching sequences) contained in the repertoire data and/or the frequency at which they appear are derived.
  • the number and/or frequency can be derived appropriately based on known methods. The greater the number and/or frequency of sequences identified as being identical or similar to sequences in the database (matching sequences) in the repertoire data, the stronger and/or more frequently an immune response to a specific antigen occurs.
  • step D the change over time in the number and/or frequency of sequences matching the database obtained in step C is confirmed.
  • Examples of cases in which the present invention includes step D include form [a], form [b], form [d], form [e] case e2 and case e3, and form [f].
  • step D is not required.
  • the activation period of immune cell receptor mRNA i.e., the clonal proliferation period of immune cells that have responded to a specific antigen in the repertoire
  • the activation period after antigen stimulation for a primary response is, for example, 11-20 days or 11-18 days, preferably 12-16 days, and more preferably 13-15 days
  • the activation period after antigen stimulation for a secondary or subsequent response is, for example, 3-10 days or 4-10 days, preferably 5-9 days, and more preferably 6-8 days.
  • the period when an increase in the number and/or frequency of sequences matching the database is observed corresponds to either the activation period after antigen stimulation for a primary response or the activation period after antigen stimulation for a secondary or subsequent response, it is possible to determine whether stimulation with a specific antigen caused a primary response or a secondary response. Specifically, if an increase in the number and/or frequency of sequences matching the database is observed 11 to 20 days or 11 to 18 days (preferably 12 to 16 days, more preferably 13 to 15 days) after stimulation with a specific antigen, the immune response caused by the stimulation can be determined to be a primary response.
  • the immune response caused by the stimulation can be determined to be a secondary or subsequent response.
  • Process E Process E', Process F, Process G
  • the method of the present invention may further include other steps as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the other steps may be selected depending on the application purpose of the method of the present invention. The decision can be made based on the above.
  • Step E and Step E' When an immune response is evaluated for repertoire data of a subject vaccinated with a nucleic acid vaccine, the method of the present invention may further include step E and/or step E'.
  • the case including step E include case a1 to case a3 of form [a] and form [f].
  • Examples of the case including step E' include case a4 of form [a] and form [f].
  • step E the scientific validity of the nucleic acid vaccine is evaluated by checking the information contained in the database for sequences confirmed to have an increase over time in the number and/or frequency of sequences matching the database.
  • the information contained in the database is selected from the group consisting of: [1] information on the presence or absence of neutralizing activity against an antigen, [2] information on the species or strain of the antigen, and [3] information on the epitope.
  • the evaluation of scientific validity is selected from the group consisting of: [1] evaluating the nucleic acid vaccine as having clinical efficacy in producing antibodies with neutralizing activity when it is confirmed that the neutralizing activity is present; [2] evaluating the nucleic acid vaccine as being compatible with the target antigen when it is confirmed that the species or strain is the same as the species or strain of the target antigen for which the nucleic acid vaccine was designed; and [3] evaluating the nucleic acid vaccine as being compatible with the target epitope when it is confirmed that the epitope is the same as the target epitope for which the nucleic acid vaccine was designed.
  • the above case [1] corresponds to case a1 of form [a]
  • the above case [2] corresponds to case a2 of form [a]
  • the above case [3] corresponds to case a3 of form [a].
  • Process E allows for confirmation of the scientific validity of a nucleic acid vaccine that contains the blueprint (genetic information) of a specific antigen as an active ingredient, that it can produce antibodies with neutralizing activity in the body, that it can produce antibodies that can recognize the target antigen (species or strain) as designed, or that it can produce antibodies that can recognize the target epitope as designed.
  • step E' if the sequence confirmed to have an increase over time in the number and/or frequency of sequences matching the database is identical (i.e., a perfect match) to the sequence contained in the database at the amino acid sequence level, the scientific validity of the nucleic acid vaccine is evaluated as having the ability to produce antibodies whose antigen recognition site perfectly matches that of antibodies acquired through infection. According to the present invention, it is possible to detect many sequences that perfectly match the antigen recognition site of an immune cell receptor.
  • amino acid sequence of the antigen recognition site sequence is, for example, a sequence consisting of 10 amino acids, there are 20 types of amino acids, so theoretically 20 ⁇ 10 types of sequences are required to find a perfect match, and considering this, it is recognized that the ability of the present invention to detect many perfect matches is surprisingly efficient.
  • step E' makes it possible to confirm the scientific validity that a nucleic acid vaccine administered to a healthy subject can produce antibodies in the body of the healthy subject that completely match antibodies (having sequences included in the database) acquired by a patient as a result of infection with an antigen such as a virus.
  • Step F When evaluating immune responses to repertoire data of a subject who has been inoculated with a vaccine (i.e., a specific antigen) and who has a high level of other antibodies (i.e., antibodies different from the antibodies produced by inoculation of the vaccine as the specific antigen) in his/her body at the time of specimen collection, the method of the present invention may further include step F.
  • cases including step F include cases b1 to b3 of form [b] and form [f].
  • the subject in this case can be selected from subjects (S1) to (S3) described above in "1-2-1-3.
  • Subjects with high levels of other antibodies Specifically, this includes subjects who have been vaccinated with a specific antigen, who have been administered an antibody drug, who have been vaccinated with another vaccine, and/or who have been infected.
  • the vaccine is determined to be functional if the number and/or frequency of sequences matching the database increases over time.
  • other antibodies specifically, antibodies related to antibody drugs, antibodies produced in an immune response to other vaccines, or antibodies produced in an immune response to pathogens
  • S1 to S3 due to administration of antibody drugs, inoculation with other vaccines, or infection.
  • these other antibodies are maintained at high levels in the bodies of subjects (S1) to (S3).
  • the method of the present invention can selectively identify immune responses to specific antigens from repertoire data without being affected by the amount of antibody protein in the body, so even if a subject has high levels of other antibodies, if an immune response occurs to the vaccine as a specific antigen, that immune response can be selectively identified.
  • Process G When an immune response is evaluated for repertoire data of a subject who has undergone immunosuppressive treatment such as hematopoietic stem cell transplantation or B cell depletion therapy, the method of the present invention may further include step G.
  • the case including step G include case b4 of form [b] and form [f].
  • Step F may further include step G of judging whether or not immune function has been restored based on whether or not there has been an increase over time in the number and/or frequency of sequences matching the database. For example, when an increase in the number and/or frequency of sequences matching the database is observed in the repertoire data of a subject who has been vaccinated with a specific antigen after undergoing immunosuppressive treatment, it is possible to confirm that immune function that had been weakened by the immunosuppressive treatment has been restored.
  • Step H In the case where the repertoire data prepared in step A is obtained from a specimen of a subject who was inoculated with a vaccine (existing vaccine) against a virus strain ST1 that has previously emerged, and the database used for collation in step B includes a group of sequences of antigen recognition sites of immune cell receptors against a virus strain ST2 (e.g., a mutant strain of the virus strain ST1) for which the effectiveness of the vaccine (existing vaccine) is unknown, the present invention can further include a step H of evaluating that the vaccine (existing vaccine) is also effective against the virus strain ST2 when a sequence detected in step B is present. In this case, it becomes possible to determine that the existing vaccine is effectively used against the newly emerged virus strain. Conversely, when no sequence is detected in step B, it becomes possible to determine that a new vaccine needs to be developed.
  • the vaccine existing vaccine
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC samples were stored at ⁇ 80°C until analysis using CELLBANKER (ZENOGEN PHARMA, Fukushima, Japan).
  • Total RNA was extracted with TRIzol LS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) and purified using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's protocol.
  • RNA quantity and purity were measured using an Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Serum samples were obtained by centrifuging blood samples at 1000 xg for 10 min at room temperature and immediately transferring to a freezer kept at -80°C.
  • SARS-CoV-2-specific immunoglobulin antibody assays Three fully automated commercially available immunoassays were used.
  • the Abbott SARS-CoV-2 IgG II Quant (Abbott Laboratories, Sligo, Ireland) is a chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) designed for the quantitative measurement of IgG antibodies against the receptor-binding domain (RBD) of the S1 subunit of the spike protein of SARS-CoV-2. Tests were performed on an Abbott Architect i2000SR system (Abbott Laboratories).
  • the Roche Elecsys anti-SARS-CoV-2 S (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) is an electrochemiluminescent immunoassay (ECLIA) for the quantitative measurement of total Ig antibodies against the RBD of the spike protein of SARS-CoV-2. Tests were performed on a Roche Cobas e601 system (Roche Diagnostics).
  • the Atellica IM SARS CoV-2 IgG (Siemens Healthcare Diagnostics, Er Weg, Germany) is a chemiluminescent immunoassay (CLIA) designed to quantitatively measure IgG antibodies against the RBD of the S1 subunit of the spike protein of SARS-CoV-2. The test was performed on an Atellica IM automated analyzer (Siemens Healthcare Diagnostics).
  • Antibody titers against nucleocapsid protein were measured using the QuaResearch COVID-19 Human IgM IgG ELISA Kit (nucleocapsid protein) (Cellspect, Inc., RCOEL961-N, Iwate, Japan). This kit detects antibody titers based on the indirect ELISA method and comes with different antigenic proteins immobilized.
  • the ELISA kit (nucleocapsid protein) plate has SARS-CoV-2 recombinant nucleocapsid protein (full-length) expressed in E. coli immobilized on it. Nucleocapsid protein in serum samples was measured according to the manufacturer's measurement protocol.
  • PBMCs were stained for 20 min at 4°C with the following anti-human antibodies for T cell lines: CD3 APC, CD4 BV510, and CD8 BV711 (all BD Biosciences, San Diego, CA, USA), and for B cell lines: CD19 BV510, CD27 BV421, IgD BV711, and CD38 BV510 (all Biolegend, San Diego, CA, USA). Isotype-matched antibodies were used as controls.
  • Flow cytometry analysis was performed using a BD FACSAria III instrument (BD Biosciences).
  • CD3+CD4+ cells were defined as helper T cells.
  • CD19+CD27+IgD- were defined as class-switched B cells.
  • CD19+CD27+CD38+ were defined as plasmablasts.
  • B cell receptor repertoire analysis was performed using a non-biased next-generation sequencer developed by Repertoire Genesis Co., Ltd. Briefly, cDNA was synthesized from total RNA using polyT18 primer (BSL-18E) and Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, California, USA). After double-stranded (ds)-cDNA was synthesized, P10EA/P20EA dsDNA adapters were ligated and cut with NotI restriction enzyme. Nested PCR was performed with IgG constant region-specific primers (CG1 and CG2) and P20EA using KAPA HiFi DNA Polymerase (Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA).
  • Amplicon libraries were prepared by amplifying the second PCR products using P22EA-ST1 and CG-ST1-R. Index (barcode) sequences were added by amplification using the Nextera XT Index Kit v2 Set A (Illumina, San Diego, CA, USA). Sequencing was performed using an Illumina MiSeq paired-end platform (2 ⁇ 300 bp). BCR sequences were assigned based on identity to reference sequences in the international ImMunoGeneTics information system® (IMGT) database (http://www.imgt.org) using repertoire analysis software developed in-house by Repertoire Genesis Co., Ltd. (Osaka, Japan).
  • IMGT international ImMunoGeneTics information system®
  • COVID-19-specific antibody sequences were downloaded from CoV-AbDab (http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/covabdab/). Data updated on December 20, 2022, containing 12,004 entries, were used as reference. Unpaired antibody sequences reported from 2011 to 2021 were downloaded from The Observed Antibody Space database (OAS, http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/oas/) based on the "heavy chain” and "IGHG” attributes. A total of 260,856,092 sequences were used to validate the method.
  • sequences with the "Binds to" or “Neutralizing Vs” attribute of SARS-CoV2 were considered to be SARS-CoV-2 specific sequences regardless of the mutant.
  • sequences with the "Neutralizing Vs” attribute of SARS-CoV2 were classified as neutralizing antibodies (Neut+), and sequences that did not include SARS-CoV-2 in the "Neutralising Vs” attribute and included SARS-CoV-2 in the "Not Neutralising Vs” attribute were classified as non-neutralizing antibodies (Neut-).
  • CoV-AbDab Analysis of OAS public databases using CoV-AbDab The usefulness of CoV-AbDab was verified using previously reported repertoire data before and after the COVID-19 pandemic. From the obtained 12,004 CoV-AbDab data, a reference table with 8,977 identical V and J gene names and CDR3 amino acids of human sequences was used to search for SARS-CoV-2-specific sequences in public databases and the data of the above patient cohort ( Figure 2A). First, a total of 260,856,092 sequences published between 2011 and 2021 from the OAS public database were analyzed using CoV-AbDab.
  • BCR repertoire data from healthy volunteers who received the mRNA SARS-CoV-2 vaccine using CoV-AbDab was analyzed BCR repertoires from blood samples from healthy volunteers who received the first and second doses of the mRNA SARS-CoV-2 vaccine (monovalent BNT162b2 [B.1.1.529], Pfizer).
  • Case 1 (T/C patient 1): A 63-year-old woman with acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes underwent cord blood transplantation (CBT). She was administered tixagevimab/silgavimab 338 days after CBT, and received the fourth dose (second dose after CBT) of mRNA vaccine (bivalent BNT162b2) 348 days after CBT.
  • Case 2 (T/C patient 2): A 40-year-old man with B-cell acute lymphoblastic leukemia underwent unrelated bone marrow transplantation (u-BMT). Tixagevimab/silgavimab was administered 212 days after u-BMT, and the first mRNA vaccine (monovalent BNT162b2) was administered 218 days after u-BMT.
  • Vaccination responses after hematopoietic stem cell transplantation depend on T and B cell reconstitution.
  • flow cytometry analysis was performed to evaluate T and B cell reconstitution.
  • the presence of helper T cells (CD3+CD4+), class-switched B cells (CD19+CD27+IgD-), and plasmablasts (CD19+CD27+CD38+) was confirmed ( Figure 4A, Figure 4B).
  • BCR repertoire analysis using CoV-AbDab clearly detected responses to mRNA SARS-CoV-2 vaccination even after tixagevimab/silgavimab administration ( Figure 4A, Figure 4B, Figure 8).
  • SARS-CoV-2-specific sequences frequently contained IGHV4-59 and short CDR3 amino acids. These sequences were also detected most frequently in multiple individuals and post-pandemic samples in the results of this experiment, but some were also detected in pre-pandemic samples in 2019, albeit at a much lower frequency. IGHV4-59 sequences pair with the light chain of IGKV3-20/IGKJ1 and have not been reported to have neutralizing activity. There are also reports that public IGHV4-59/IGKV3 antibodies bind to the S2 domain and cross-react with SARS-CoV-1. This sequence has the potential to react with a wide range of coronavirus strains.
  • SARS-CoV-2-specific sequences are characterized by short CDR3 sequences and high pGen values. Since sequences with high pGen values among known SARS-CoV-2-specific sequences increase significantly after infection or vaccination, it is believed that the initial immune response upon exposure to unknown COVID-19 antigens is often mediated by more abundant, common SARS-CoV-2-specific sequences. According to the method of this example, early infection immune responses can be reliably detected using known SARS-CoV-2-specific sequences with abundant high pGen values in any individual.
  • the method of this embodiment has the following advantages:
  • the antibodies that are measured using conventional methods have a long half-life, remaining in the blood for several months after production.
  • the activity of the mRNA that is measured in the present invention is short-lived, making it possible to monitor activity on an ongoing basis without being affected by SARS-CoV-2 vaccination, infection, antibody therapy, etc.
  • B cells were activated approximately two weeks after the initial vaccination or initial exposure by infection as a primary immune response. Furthermore, B cells were activated approximately one week after booster vaccination as a secondary immune response.
  • the method of this embodiment can provide useful information about individual antibodies.
  • the method of this embodiment can obtain useful information about the characteristics of multiple antibodies with neutralizing/non-neutralizing activity.
  • the frequency of occurrence of neutralizing antibody sequences varies depending on the sample, and is expected to be an indicator of the immune defense of infected individuals.
  • the detection of non-neutralizing antibodies is also a noteworthy indicator.
  • an ELISpot assay has been developed to measure human IgG-secreting B cells stimulated with R-848 and IL-2 in vitro as a method for evaluating B cell responses after infection or to vaccines, but such ELISpot assays cannot report immune responses in real time or provide additional information.
  • the usefulness of the method of this embodiment is not limited to confirmation of vaccine response after administration of antibody drugs, and it can be inferred that it is useful, for example, for estimating the degree of immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation.
  • Immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation has been evaluated by total lymphocyte count, lymphocyte subset analysis, and cytokine profile analysis, but these assays are not accurate biomarkers.
  • almost all hematopoietic stem cell transplant patients receive mRNA SARS-CoV-2 vaccination 3-6 months after transplantation.
  • the method of this embodiment makes it possible to evaluate humoral immune reconstitution at the time of vaccination without being affected by prior infection, vaccination, or antibody therapy.
  • the method of this embodiment can be used to evaluate humoral immune reconstitution after B cell depletion therapy.
  • antigen-specific antibody sequences can be quantified by BCR repertoire analysis using CoV-AbDab to evaluate the response to SARS-CoV-2 vaccination.
  • This example reveals that there is reactivity to mRNA SARS-CoV-2 vaccination even after administration of tixagevimab/silgavimab.
  • the method of this example can be applied to clarifying disease mechanisms in the field of antigen-antibody reactions and to developing therapeutic drugs.
  • Test Example 3 The same subject was vaccinated multiple times with the mRNA vaccine against SARS-CoV-2.
  • the first and second doses were the original strain vaccine, the fifth dose was the original strain and BA.4/5 bivalent vaccine, and the sixth dose was the Omicron XBB vaccine.
  • the spike protein which is the target of the vaccine, is composed of the S1 and S2 portions, and it is known that the RBD region in S1 is important for infection.
  • BNT-162b2 (Pfizer) and mRNA-1273 (Moderna) are mRNA vaccines that target the entire S1 and S2 spike proteins of SARS-CoV-2, while MAFB-7256a (Daiichi Sankyo Vaccine), approved in Japan in 2024, is an mRNA vaccine against RBD. Information on epitopes is linked to the BCR/antibody sequence in CoV-AbDab.
  • the matching sequences that increased 7 days after vaccination with BNT162b2 were for various regions of the spike protein, such as S1, RBD, and S2, while the sequences that increased 7 days after vaccination with MAFB-7256a were for RBD. Therefore, the scientific validity of the mRNA vaccine (validity for the type of target epitope) was confirmed.
  • activated B cells CD21low B cells, class-switched B cells, plasmablasts, plasma cells
  • activated B cells 7 days after cancer immunotherapy (booster immunization).
  • activated B cells increased 7 days after cancer immunotherapy (booster immunization)
  • a greater increase was observed in cases that developed irAE (side effect: autoimmune disease after administration of immune checkpoint inhibitors) (specifically, patients 1, 2, 6, 10, and 11).
  • Patient 1 underwent hematopoietic stem cell transplantation after one SARS-CoV-2 infection, and then received a vaccine (specific antigen) against SARS-CoV-2.
  • Patient 2 underwent hematopoietic stem cell transplantation after two SARS-CoV-2 infections, and then received a vaccine (specific antigen) against SARS-CoV-2.
  • Patient 3 underwent hematopoietic stem cell transplantation after two SARS-CoV-2 infections, and then received a vaccine (specific antigen) against SARS-CoV-2 after three SARS-CoV-2 infections.
  • the first antigen stimulation (vaccination) after hematopoietic stem cell transplantation increased the number of matching sequences two weeks after the first antigen stimulation.
  • the second or subsequent antigen stimulation (vaccination) after hematopoietic stem cell transplantation increased the number of matching sequences one week after the second or subsequent antigen stimulation. In other words, it was confirmed that the immunity acquired by antigen stimulation before hematopoietic stem cell transplantation was reset by hematopoietic stem cell transplantation.
  • the timing is about two weeks after the antigen stimulation after hematopoietic stem cell transplantation, it can be determined that the immune response to be analyzed is due to the first antigen stimulation after hematopoietic stem cell transplantation, and if the timing is about one week after the antigen stimulation after hematopoietic stem cell transplantation, it can be determined that the immune response to be analyzed is due to the second or subsequent antigen stimulation after hematopoietic stem cell transplantation.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明の目的は、免疫細胞レセプターのレパトアデータから、特定の抗原に対する免疫反応を抗体配列のレベルで選択的に特定する方法を提供することにある。被験者の検体から取得した、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列のレパトアデータを用意する工程Ａと、特定の抗原に対する抗原認識部位の配列のデータベースと、前記レパトアデータとを照合し、前記データベース中に含まれる前記配列と、アミノ酸配列レベルで同一又は２個以下のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列を特定する工程Ｂとを含む、免疫反応の評価方法により、特定の抗原に対する免疫反応を抗体配列のレベルで選択的に特定することができる。

Description

免疫反応の評価方法
　本発明は、免疫反応の評価方法に関する。
　重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）による新型コロナウイルス感染症（COVID-19）は、血液悪性腫瘍患者の生命を脅かすため、一般的に血液内科医によりmRNA SARS-CoV-2のワクチン接種が推奨されている（非特許文献１，２）。しかし、造血幹細胞移植（HSCT）を受けた患者やB細胞枯渇療法を受けた患者など、血液悪性腫瘍患者の中には、ワクチン接種後に十分な体液性反応が得られない場合があることが報告されている（非特許文献３－６）。病原性が低いとされるSARS-CoV-2のオミクロン変種の発生後も（非特許文献７）、免疫不全患者の入院や死亡率は依然として高く、特にワクチン接種による反応が悪い患者で高いという報告がある（非特許文献８，９）。
　このような患者に対して、米国食品医薬品局（FDA）は、2021年12月に、チキサゲビマブ／シルガビマブの緊急使用認可を出した。本剤は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの異なるエピトープに対する中和モノクローナル抗体を含み、曝露前予防薬として使用される。PROVENT試験の結果に基づき、チキサゲビマブ/シルガビマブは免疫不全患者に対して、重症化予防や入院期間の短縮に有効と考えられている（非特許文献１０，１１）。しかし、ある研究グループでは、血液悪性腫瘍患者、特にB細胞枯渇療法や造血幹細胞移植を受けている患者はチキサゲビマブ/シルガビマブを使用してもブレークスルー感染のリスクがあることを報告している（非特許文献１２）。最新の情報では、チキサゲビマブ／シルガビマブが、BQ.1やXBBなどの特定のオミクロン亜種に対する活性が低いことが示されている（非特許文献１３，１４）。オミクロン亜種の出現前に開発されたチキサゲビマブ／シルガビマブは、特定の国における現在の優勢株に対する活性が低下している（非特許文献１３，１４）。
　したがって、FDAは、チキサゲビマブ／シルガビマブはワクチン接種に代わるものではなく、チキサゲビマブ／シルガビマブを投与された患者であっても、定期接種を受けるよう推奨すべきことを強調している。血液専門医は、これらの患者が感染予防行動、ワクチン接種、抗ウイルス抗体薬などの多面的な予防を維持することを提案している（非特許文献１）。ある研究では、高度にワクチン接種を受けた造血幹細胞移植患者のコホートにおいて、以前の株と同様にオミクロン変異体によるCOVID-19の良好な転帰を報告している（非特許文献１５）。
　SARS-CoV-2ワクチン接種後の免疫原性、特に液性免疫は、一般に抗SARS-CoV-2スパイクIgG抗体を用いた酵素結合免疫吸着法（ELISA）により評価される（非特許文献１６）。これまで、ワクチン接種の反応性は、健常人およびがん患者など様々な免疫状態を有する患者において、接種後の抗体価の測定により評価されてきた（非特許文献１７，１８）。
Vijenthira A, Gong IY, Fox TA, et al. Outcomes of patients with hematologic malignancies and COVID-19: a systematic review and meta-analysis of 3377 patients. Blood. 2020;136(25):2881-2892. Xhaard A, Xhaard C, D'Aveni M, et al. Risk factors for a severe form of COVID-19 after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation: a Societe Francophone de Greffe de Moelle et de Therapie cellulaire (SFGM-TC) multicentre cohort study. Br J Haematol. 2021;192(5):e121-e124. Dhakal B, Abedin S, Fenske T, et al. Response to SARS-CoV-2 vaccination in patients after hematopoietic cell transplantation and CAR T-cell therapy. Blood. 2021;138(14):1278-1281. Watanabe M, Yakushijin K, Funakoshi Y, et al. The Safety and Immunogenicity of the BNT162b2 mRNA COVID-19 Vaccine in Japanese Patients after Allogeneic Stem Cell Transplantation. Vaccines (Basel). 2022;10(2). Funakoshi Y, Yakushijin K, Ohji G, et al. Limited increase in antibody titers following mRNA SARS-CoV-2 vaccination for more than 3 years after final dose of anti-CD20 antibody. Int J Hematol. 2022;115(1):7-10. Einarsdottir S, Martner A, Nicklasson M, et al. Reduced immunogenicity of a third COVID-19 vaccination among recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 2022;107(6):1479-1482. Malahe SRK, Hoek RAS, Dalm V, et al. Clinical Characteristics and Outcomes of Immunocompromised Patients With Coronavirus Disease 2019 Caused by the Omicron Variant: A Prospective, Observational Study. Clin Infect Dis. 2023;76(3):e172-e178. Taenaka R, Obara T, Kohno K, Aoki K, Ogawa R. Infections with the SARS-CoV-2 Omicron variant show a similar outcome as infections with the previous variants in patients with hematologic malignancies. Ann Hematol. 2022;101(8):1877-1878. Bahremand T, Yao JA, Mill C, Piszczek J, Grant JM, Smolina K. COVID-19 hospitalisations in immunocompromised individuals in the Omicron era: a population-based observational study using surveillance data in British Columbia, Canada. Lancet Reg Health Am. 2023;20:100461. Levin MJ, Ustianowski A, De Wit S, et al. Intramuscular AZD7442 (Tixagevimab-Cilgavimab) for Prevention of Covid-19. N Engl J Med. 2022;386(23):2188-2200. Jondreville L, D'Aveni M, Labussiere-Wallet H, et al. Pre-exposure prophylaxis with tixagevimab/cilgavimab (AZD7442) prevents severe SARS-CoV-2 infection in recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation during the Omicron wave: a multicentric retrospective study of SFGM-TC. J Hematol Oncol. 2022;15(1):169. Davis JA, Granger K, Roubal K, et al. Efficacy of tixagevimab-cilgavimab in preventing SARS-CoV-2 for patients with B-cell malignancies. Blood. 2023;141(2):200-203. Imai M, Ito M, Kiso M, et al. Efficacy of Antiviral Agents against Omicron Subvariants BQ.1.1 and XBB. N Engl J Med. 2023;388(1):89-91. Stuver R, Shah GL, Korde NS, et al. Activity of AZD7442 (tixagevimab-cilgavimab) against Omicron SARS-CoV-2 in patients with hematologic malignancies. Cancer Cell. 2022;40(6):590-591. Tan JY, Wee LE, Tan YH, et al. Favorable outcomes of COVID-19 in vaccinated hematopoietic stem cell transplant recipients: A single-center experience. Transpl Infect Dis. 2023:e14024. Jung K, Shin S, Nam M, et al. Performance evaluation of three automated quantitative immunoassays and their correlation with a surrogate virus neutralization test in coronavirus disease 19 patients and pre-pandemic controls. J Clin Lab Anal. 2021;35(9):e23921. Massarweh A, Eliakim-Raz N, Stemmer A, et al. Evaluation of Seropositivity Following BNT162b2 Messenger RNA Vaccination for SARS-CoV-2 in Patients Undergoing Treatment for Cancer. JAMA Oncol. 2021;7(8):1133-1140. Funakoshi Y, Yakushijin K, Ohji G, et al. Safety and immunogenicity of the COVID-19 vaccine BNT162b2 in patients undergoing chemotherapy for solid cancer. J Infect Chemother. 2022;28(4):516-520.
　重要なことに、チキサゲビマブ／シルガビマブは、それ自体が抗スパイクIgG抗体であるため、チキサゲビマブ／シルガビマブの投与を受けたすべての患者において、長期間にわたってELISA法による抗体価がかなり高いレベルで保持される。したがって、チキサゲビマブ／シルガビマブの投与は、ワクチン接種後の抗スパイク抗体の発現をマスキングすることになる。つまり、ワクチン接種が推奨されているにもかかわらず、これらの患者のワクチン接種に対する反応を評価することができない問題がある。このように狙った免疫反応のみを選択的に評価できない問題は、チキサゲビマブ／シルガビマブの投与後の状況下における特有のものではなく、カシリビマブ／イムデビマブ及びソトロビマブ、並びに今後臨床承認され得る他の抗体医薬品など、SARS-CoV-2に対するすべての抗体医薬品の投与後の状況下でも共通する。また、この問題は、抗体薬投与後のみならず、直前のワクチン接種又は感染などによって抗体価が高いレベルで保持される状況下でも同様に生じる。さらに、この問題は、SARS-CoV-2に対するワクチンに限らず、あらゆるワクチン、ひいてはあらゆる抗原に対する反応（例えば、感染、がん免疫反応、自己免疫反応等）の評価に通じる普遍的な問題である。しかしながら、現在用いられているいかなる技術も、狙った免疫反応のみを選択的に評価することが出来ない。このような状況から、免疫反応を、従来のＥＬＩＳＡでの抗体価測定のような蛋白質発現のレベルではなく、mRNA発現のレベルで評価できる新たな解析方法が必要である。
　上記の如くmRNAレベルでワクチン接種後の反応を評価出来る方法が必要である。昨今、次世代シーケンサーを利用することで、免疫細胞レセプター（抗原受容体）の抗原認識部位の遺伝子配列を一度に大量に決定するレパトア解析が可能となっていることに鑑み、本発明者は、上記の方法にレパトア解析が利用可能と考えた。しかしながら、免疫細胞レセプターは膨大な多様性を持つため、単独で特定の抗原に対する免疫反応評価することは極めて困難であった。その困難性は、免疫介入後に、免疫細胞レセプターのうちどれが拡大したことの確認を行うことすら不能であるほどに顕著であり、特に、免疫介入がワクチンのように比較的緩やかな免疫反応を生じさせる場合にあっては、上記の確認を行うことは事実上不可能であった。このように、mRNAレベルでワクチン接種後の反応を評価するためにレパトア解析が単純に適用できないのは、レパトア解析が、免疫多様性の程度や変化を評価することを本質とする手段であり、当然に、特定の抗原に対する免疫反応を抗体配列のレベルで選択的に特定するものとして想定されていないところにある。
　本発明の目的は、免疫細胞レセプターのレパトアデータから、特定の抗原に対する免疫反応をmRNAレベルで選択的に特定する方法を提供することにある。
　本発明者は、昨今のCOVID-19パンデミックを背景に、SARS-CoV-2抗体の配列などの膨大な情報が蓄積しデータベース化されていることに着眼し、このデータベースを、免疫細胞レセプターのレパトアデータに照会するクエリ情報として利用することで、免疫細胞レセプターのレパトアデータから、特定の抗原に対する免疫反応を抗体配列のレベルで選択的に特定するという斬新な着想に至った。つまり、本発明者は、免疫細胞レセプターのレパトアデータと、特定の抗原に対する抗原認識部位の配列のデータベースとを照合することで、特定の抗原に対する免疫反応を抗体配列のレベルで選択的に特定できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　被験者の検体から取得した、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むレパトアデータを用意する工程Ａと、
　特定の抗原に対する免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むデータベースと、前記レパトアデータとを照合し、前記レパトアデータの中から、前記データベースに含まれる前記配列とアミノ酸配列レベルで同一又は２個以下のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列を検出する工程Ｂと、を含む、免疫反応の評価方法。
　これにより、前記検体の採取時期において前記被験者の生体内で免疫学的に反応した配列を特定できる。
項２．　前記工程Ｂにより検出される配列の、前記レパトアデータにおける数及び／又は頻度を導出する工程Ｃをさらに含む、項１に記載の方法。
項３．　前記数及び／又は頻度の経時変化を確認する工程Ｄをさらに含む、項２に記載の方法。
項４．　前記工程Ｄにおいて、前記経時変化として増大が認められた時期が、前記特定の抗原による刺激後１１～２０日及び３～１０日のいずれに該当するかを確認する、項３に記載の方法。
項５．　前記被験者が、前記特定の抗原の暴露を受けた被験者である、項１～４のいずれかに記載の方法。
項６．　前記特定の抗原の暴露がワクチンの接種である、項５に記載の方法。
項７．　前記ワクチンが核酸ワクチンである、項６に記載の方法。
項８．　前記ワクチンがコロナウイルスワクチン又はインフルエンザワクチンである、項６に記載の方法。
項９．　前記数及び／又は頻度の経時変化として増大が確認された前記配列について、前記データベースに収載された付加情報を確認することで、前記核酸ワクチンの科学的妥当性を評価する工程Ｅをさらに含み、
　前記付加情報が、［１］抗原に対する中和活性の有無の情報、［２］抗原の種又は株の情報、及び［３］エピトープの情報からなる群より選択され、
　前記科学的妥当性の評価が、［１］前記中和活性が有ることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが中和活性を持つ抗体を産生する臨床的有効性を持つと評価すること、［２］前記種又は前記株が、前記核酸ワクチンの設計上の標的抗原の種又は株と同じであることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが前記標的抗原に適合していると評価すること、及び［３］前記エピトープが、前記核酸ワクチンの設計上の標的エピトープと同じであることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが前記標的エピトープに適合していると評価すること、からなる群より選択される、項７又は８に記載の方法。
項１０．　前記数及び／又は頻度の経時変化として増大が確認された前記配列が、前記データベースに含まれる前記配列とアミノ酸配列レベルで同一である場合に、前記核酸ワクチンの科学的妥当性として、感染による獲得免疫による抗体と抗原認識部位が完全一致する抗体の産生能を有すると評価する工程Ｅ’をさらに含む、項７～９のいずれかに記載の方法。
項１１．　前記特定の抗原の暴露が感染である、項５に記載の方法。
項１２．　前記特定の抗原がコロナウイルス又はインフルエンザウイルスである、項１１に記載の方法。
項１３．　前記被験者が、抗体薬を投与された、ワクチンを接種された、並びに／若しくは、感染を受けた被験者であり、
　前記抗体薬、前記ワクチン、及び前記感染の病原体が、前記特定の抗原の暴露により生じる抗体とは異なる他の抗体を前記被験者の体内に保有させる、項５～１２のいずれかに記載の方法。
項１４．　前記特定の抗原がワクチンであり、
　前記数及び／又は頻度が経時的に増大する場合に、前記ワクチンが機能すると判断する工程Ｆをさらに含む、項１３に記載の方法。
項１５．　前記検体が、前記特定の抗原に対する免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期に採取されたものである、項５～１４のいずれかに記載の方法。
項１６．　前記活性化時期が、前記暴露後１１～２０日又は３～１０日である、項１５に記載の方法。
項１７．　前記被験者ががん免疫療法を受けた被験者である、項１～３のいずれかに記載の方法。
項１８．　前記検体が、前記特定の抗原に対する免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期に採取されたものである、項１６に記載の方法。
項１９．　前記活性化時期が、前記がん免疫療法後１１～２０日又は３～１０日である、項１７に記載の方法。
項２０．　前記被験者が、免疫抑制処置を受けた被験者である、項１～１６のいずれかに記載の方法。
項２１．　前記免疫抑制処置が、造血幹細胞移植又はＢ細胞枯渇療法の投与である、項２０に記載の方法。
項２２．　前記免疫抑制処置が、造血幹細胞移植又はＢ細胞枯渇療法であり、前記数及び／又は頻度の経時変化が増大したか否かに基づいて、免疫機能の回復の有無を判定する工程Ｇをさらに含む、項２１に記載の方法。
項２３．　前記被験者が自己免疫疾患患者である、項１～１６のいずれかに記載の方法。
項２４．　前記レパトアデータが、過去に出現したウイルス株ＳＴ１に対するワクチンの接種を受けた被験者の検体から取得したものであり、
　前記特定の抗原が、前記ワクチンによる有効性が未知であるウイルス株ＳＴ２であり、
　前記検出される配列が存在する場合に、前記ワクチンが前記ウイルス株ＳＴ２にも有効と評価する工程Ｈをさらに含む、項１又は２に記載の方法。
項２５．　前記データベースが、前記特定の抗原による免疫反応が起きた調査対象からなる集団から収集した、前記特定の抗原に対する前記免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列を含み、以下の工程により得られるものである、請求項１～２４のいずれかに記載の方法：
　　前記調査対象それぞれの検体から、前記免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むレパトアデータであって、前記特定の抗原に対する免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期Ｔex、前記活性化時期の前Ｔbf、及び前記活性化時期の後Ｔafにおけるレパトアデータを時系列で取得する工程、及び
　　前記活性化時期Ｔexにおいて増殖が認められる免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列を、前記データベースに収集すべき情報として選定する工程。
項２６．　活性化時期Ｔexが、前記特定の抗原による刺激後１１～２０日又は３～１０日である、項２５に記載の方法。
項２７．　前記免疫細胞が、Ｔ細胞又はＢ細胞である、項１～２６のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、免疫細胞レセプターのレパトアデータから、特定の抗原に対する免疫反応をmRNAレベルで選択的に特定する方法が提供される。
本発明の免疫反応の評価方法の例の概要を示す。 本発明の免疫反応の評価方法に適用されるデータベースを作成する例の概念図を示す。 本発明の免疫反応の評価方法に、大規模データセット群を網羅的バイオセンサとして適用する例の概念図を示す。 本発明の免疫反応の評価方法により評価できる、ワクチンの科学的妥当性の例（抗原の感染により患者が獲得する抗体と完全に一致する抗体を、ワクチン接種により健常者である被験者の体内で産生できること）の概念図を示す。 抗スパイク抗体価の変遷。チキサゲビマブ/シルガビマブ投与前後の抗スパイク抗体価を、17名の患者を対象に3種類の全自動市販イムノアッセイで測定した： A) Abbott SARS-CoV-2 IgG II Quant、B) Roche Elecsys anti-SARS-CoV-2 S、C) Atellica IM SARS CoV-2 IgG。 研究デザインおよびサンプルの詳細。CoV-AbDabデータベースの配列は、OAS公開データベース、健常者（n = 12）、COVID-19患者（n = 3）、ワクチン接種した健常者ボランティア（n = 2）、チキサゲビマブ／シルガビマブで治療したワクチン接種造血幹細胞移植患者（n = 2）で SARS-CoV-2 特有の配列が検索された。数字は使用した配列の数を示す。 COVID-19に感染した3人の患者におけるSARS-CoV-2に特異的な配列の数および頻度の経時変化。SARS-CoV-2感染後に経時的に採取したPBMCに対してNGS解析を実施した。CoV-AbDab配列と同一のVおよびJ遺伝子を有し、CDR3アミノ酸配列のレーベンシュタイン距離が0（左）、1（中央）または2（右）のSARS-CoV-2特異的配列のクローン番号（上）および頻度（下）を示す。下円のプロットはSARS-CoV-2特異的配列のクラスター・プロットを示す。最大1000個のSARS-CoV-2特異的配列のigraphによるネットワークを示す。各ノードは、同一のIGHV、IGHJおよび相補性決定領域3（CDR3）アミノ酸配列を有する単一のユニークリードを示す。ノードは、CDR3アミノ酸配列の1未満のレーベンシュタイン距離で定義されるエッジによって接続されていた。ノードのサイズは、各ユニークリードのパーセント頻度であった。 初回およびブースターワクチン接種後のSARS-CoV-2特異的配列の数、頻度およびクラスターの経時変化。健康ボランティア1は、mRNA SARS-CoV-2ワクチン（1価BNT162b2）の初回接種を受け、21日後に2回目の接種を受けた。 図７Ａの後、2価のBNT162b2ワクチンの5回目を接種した。これらのワクチン接種後、BCRレパトアデータからSARS-CoV-2特異的な配列を検索した。 初回およびブースターワクチン接種後のSARS-CoV-2特異的配列の数、頻度およびクラスターの経時変化。健康ボランティア2では、4回目に一価のmRNA-1273を投与し、その後、ブースターワクチン接種の2、6、9日後にSARS-CoV-2特異的な配列を測定した。 チキサゲビマブ/シルガビマブを投与された造血幹細胞移植レシピエントにおけるmRNAワクチン接種後のSARS-CoV-2特異的配列の数、頻度、クラスターの経時変化。臍帯血移植後338日目のレシピエント（T/C患者1）にチキサゲビマブ／シルガビマブ（T/C）を投与し、その後mRNAワクチン（Vaccinationの矢印が指す時点）を投与した。ヘルパーT細胞（CD3+CD4+）、クラススイッチB細胞（CD19+CD27+IgD-）、プラズマブラスト（CD19+CD27+CD38+）の免疫細胞再構成はワクチン接種時のFACS解析により確認された。抗SARS-CoV-2抗体価は、Abbott SARS-CoV-2 IgG II Quant kit（Abbott）およびRoche Elecsys anti-SARS-CoV-2 S kit（Roche）を用いて測定した。SARS-CoV-2特異的配列は、ワクチン接種前および接種後4、9、11日目に測定した。三角ドットのグラフはクローン数（CDR3 AA Distance <= 1）を示す。T/C: チキサゲビマブ／シルガビマブ。 チキサゲビマブ/シルガビマブを投与された造血幹細胞移植レシピエントにおけるmRNAワクチン接種後のSARS-CoV-2特異的配列の数、頻度、クラスターの経時変化。T/C患者2では、非血縁者骨髄移植後212日目にレシピエントにチキサゲビマブ／シルガビマブを投与し、その後mRNAワクチン（Vaccinationの矢印が指す時点）を接種した。SARS-CoV-2特異的配列をワクチン接種前と接種後3、6、15日目に測定した。三角ドットのグラフはクローン数（CDR3 AA Distance <= 1）を示す。T/C: チキサゲビマブ／シルガビマブ。 COVID-19感染またはワクチン接種によって誘導されたSARS-CoV-2特異的配列の特徴。健常者、COVID-19患者、ワクチン接種した健常者ボランティアで検出されたSARS-CoV-2特異的配列の中和機能および非中和機能。健常者（HI1～HI12）、COVID-19患者（Pt1、Pt2、Pt3）、ワクチン接種した健常者ボランティア（HV1）、ブースター接種した健常者ボランティア（HV1、HV2）、チキサゲビマブ／シルガビマブを接種した造血幹細胞移植患者（TC1、TC2）の接種で検出した、中和活性あり（Neut+）またはなし（Neut-） SARS-CoV-2 固有の配列の周波数を示す。CDR3アミノ酸距離の異なるSARS-CoV-2特異的配列（それぞれLV＝0、1、2）の頻度を示す。 CDR3アミノ酸距離の異なるSARS-CoV-2特異的配列のローカルサンプルにおける頻度。各ドットは、ワクチン接種した健康なボランティア（n = 2）、COVID-19患者（n = 3）、ブースターワクチン接種ボランティア（n = 2）、ワクチン接種した移植レシピエント（n = 2）の各サンプルで検出されたSARS-CoV-2特異的配列を示す。***: p < 0.001, NS: 有意ではない, Kruskal-WallisテストとDunn-Bonferroniポストホックテストによる。 CDR3アミノ酸距離の異なるSARS-CoV-2特異的配列のCDR3アミノ酸長の分布。本研究で検出されたCDR3長さの異なるSARS-CoV-2特異的配列の頻度パーセントを示す。 異なるCDR3アミノ酸距離を有するSARS-CoV-2特異的配列のVJ使用頻度。本研究で検出されたSARS-CoV-2特異的配列のVJ使用頻度のパーセントをバブルチャートで示す。X軸はIGHV遺伝子、Y軸はIGHJ遺伝子を示し、バブルの大きさは使用頻度を示している。 SARS-CoV-2感染またはワクチン接種により誘導されるSARS-CoV-2特異的な配列の特徴。感染者とワクチン接種者のSARS-CoV-2特異的配列のアライメント。感染者およびワクチン接種者に頻出するIGHV4-59、IGHV3-33、IGHV3-53、IGHV3-66、IGHV3-9とのCDR3アミノ酸配列（表３Ａ及び表３Ｂ、感染者とワクチン接種者のSARS-COV-2特異的配列（完全一致）。）をClustalOmegaでアラインし、配列ロゴはggseqlogoパッケージで描画した。 SARS-CoV-2感染またはワクチン接種により誘導されるSARS-CoV-2特異的な配列の特徴。生成確率(pGen)の値を比較した。CoV-AbDabデータベースの8,977個のSARS-CoV-2特異的配列と、感染者およびワクチン接種者から検出された完全に一致した86個のSARS-CoV-2特異的配列（FoundCoV）に対するpGen値のヒストグラムを示す。pGen値は、各配列のCDR3アミノ酸配列からOLGAパッケージを用いて算出した。pGen値が高い配列は発生確率が高く、pGen値が低い配列は稀に発生する配列である。 ワクチン接種した健康なボランティアにおける支配的な個々のクローンおよび上位10個のクローンの占有頻度。ワクチン接種した健康なボランティアにおいて、占有頻度が0.1％を超える個々のクローンをドットで示す。上位10個のクローンの占有頻度の合計は折れ線で示されている。 SARS-CoV-2抗体を投与された造血幹細胞移植レシピエントにおけるmRNAワクチン接種後のSARS-CoV-2特異的配列の数および頻度の経時変化。SARS-CoV-2特異的配列のクローン数（上）およびパーセント頻度（下）をワクチン接種後の時間（日）に対してプロットしている。 OASデータベースにおけるSARS-CoV-2特異的な配列の頻度。2011年から2020年にかけて報告されたOASデータベースのIGHG配列のうち、CoV-AbDabのSARS-CoV-2特異的配列と同じVおよびJ遺伝子を持ち、CDR3のアミノ酸配列編集距離が0（LV0）、1（LV1）または2（LV2）と異なっている個々のサンプルにおける頻度割合を示した。各ドットは、OASデータベースで検出された各SARS-CoV-2特異的な配列を示す。***p < 0.001, NS: 有意ではない、Kruskal-WallisテストとDunn-Bonferroniポストホックテストによる。 OASデータベースのSARS-CoV-2特異的配列のVJ使用率。CDR3アミノ酸編集距離が異なるSARS-CoV-2特異的配列のパーセンテージ頻度を異なるバブルチャートで表示した。X軸はIGHV遺伝子、Y軸はIGHJ遺伝子を示し、バブルの大きさは使用頻度のパーセンテージを示す。 SARS-CoV-2特異的な配列の特徴。OASデータベースにおけるCDR3アミノ酸距離の異なるSARS-CoV-2特異的配列のCDR3アミノ酸長さの分布。 2011年から2020年にかけてOASデータベースで報告されたCDR3アミノ酸の長さが異なるSARS-CoV-2特異的配列の割合頻度（read abundancy）を示す。CDR3の編集距離が異なる（LV0、LV1、LV2）SARS-CoV-2特異的配列を別々の棒グラフで示した。 SARS-CoV-2特異的配列とIGHV4-59、8アミノ酸のCDR3配列のアライメント。配列ロゴはggseqlogoパッケージで生成した。 SARS-CoV-2特異的配列の生成確率(pGen)値の比較。CoV-Abデータベース（CoV-AbDab）の8,977個のSARS-CoV-2特異的配列とOASデータベース（FoundCoV（OAS））で検出された完全一致した372個のSARS-CoV-2特異的配列のpGen値をヒストグラムで示す。X軸は密度を、Y軸はpGenの対数値（log10）を示している。 SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの接種により、同一被験被験者の体内で様々な株（変異株、オミクロン株のバリアント）に結合する抗体配列が増加していることを確認した。 SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの接種により、同一被験被験者の体内で様々な株（変異株、オミクロン株のバリアント）に結合する抗体配列が増加していることを確認した。 SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの接種により、同一被験被験者の体内で様々な株（変異株、オミクロン株のバリアント）に結合する抗体配列が増加していることを確認した。 同一被験者に、標的株が異なる設計のSARS-CoV-2のmRNAワクチンを接種することで、ワクチンに応じて異なる株に結合する抗体配列が増加していることを確認した。 標的エピトープが異なる設計のSARS-CoV-2のmRNAワクチンを接種することで、ワクチンに応じて異なるエピトープに結合する抗体配列が増加していることを確認した。 感染又はワクチン初回接種後において、BCRレパトア中のデータベースと一致する配列（CDR3のアミノ酸差が0のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列、及び1以下のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列）が２週間程度で増大した。 ブースター接種後において、BCRレパトア中のデータベースと一致する配列（CDR3のアミノ酸差が0のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列、及び1以下のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列）が１週間程度で増大した。 B細胞のサブセット分類の説明を示す。 がん免疫療法（追加免疫）後において、活性化B細胞が１週間程度で増大した。 がん免疫療法（追加免疫）後において、活性化B細胞が１週間程度で増大した。 がん免疫療法（追加免疫）後において、活性化B細胞が１週間程度で増大し、さらにirAEを発症した症例(patient1,2,6,10,11)で、より大きな増加を認めた。 造血幹細胞移植後１回目の抗原刺激（ワクチン接種）により、当該１回目の抗原刺激から２週間で、BCRレパトア中のデータベースと一致する配列（CDR3のアミノ酸差が0のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列、及び1以下のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列）が増大した。 造血幹細胞移植後２回目以降の抗原刺激（ワクチン接種）により、当該２回目以降の抗原刺激から１週間で、BCRレパトア中のデータベースと一致する配列（CDR3のアミノ酸差が0のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列、及び1以下のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列）が増大した。 インフルエンザ不活化ワクチン接種後において、BCRレパトア中のデータベース（論文からの引用で独自に集めた約1300配列を収載）と一致する配列が１週間程度で増大した。 図２３Ａで用いたデータベースの拡充のための配列収集に係るin vitro実験を示す。
　本発明の免疫反応の評価方法は、特定の抗原に対する免疫反応を、抗原受容体レパトア解析を用いて評価する方法である。以下において、本発明の免疫反応の評価方法を、“Quantification of Antigen-specific Antibody Sequence(QASAS)法”と記載する場合がある。本発明の免疫反応の評価方法の例の概要を、図１に示す。
　本発明の免疫反応の評価方法は、被験者の検体〔図１（i）に相当〕から取得した、免疫細胞レセプター（抗原受容体）の抗原認識部位の配列の群を含むレパトアデータ〔図１（ii）に相当〕を用意する工程Ａと、特定の抗原に対する免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むデータベース〔図１（iii）に相当〕と、前記レパトアデータ〔図１（ii）に相当〕とを照合し、前記レパトアデータ〔図１（ii）に相当〕の中から、前記データベース〔図１（iii）に相当〕に含まれる前記配列とアミノ酸配列レベルで同一又は２個以下のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列〔図１の「データベースと一致する配列」に相当；以下において、アミノ酸配列レベルで同一の配列（つまり完全同一の配列）又は２個以下のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列（１個又は２個のミスマッチを含む類似配列）を、単に「一致する配列」とも記載する。〕を検出する工程Ｂと、を含む。これにより、前記レパトアデータ(ii)に含まれる数多くの配列から、前記検体の採取時期において前記被験者の生体内で免疫学的に反応した（つまり図１の「抗原刺激」に対して反応した）配列〔図１の「データベースと一致する配列」に相当〕を特定できる。このように、本発明の方法は、レパトアデータ(ii)およびデータベース(iii)に数多く収載されている配列の中から、免疫学的に妥当な反応を示す配列、つまり真に抗原に反応可能な配列を特定することができるため、免疫反応を、従来のＥＬＩＳＡでの抗体価測定のような蛋白質発現のレベルではなく、mRNA発現のレベルで評価できる。
　本発明の免疫反応の評価方法は、さらに、前記工程Ｂにより検出される配列の、前記レパトアデータにおける数〔図１の「一致する配列の数（クローン）」に相当〕及び／又は頻度〔図１の「一致する配列の割合」に相当〕を導出する工程Ｃを含むことができる。これにより、免疫反応の程度を判定できる。
　また、本発明の免疫反応の評価方法は、さらに、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の経時変化〔つまり、図１の「Day」軸に対する「一致する配列の数（クローン）」又は「一致する配列の割合」の推移に相当〕を確認する工程Ｄを含むことができる。これにより、前記検体の採取時期ごとの免疫反応の推移を調査できる。なお、抗体タンパク質は、免疫反応から検出可能なレベルに達するまで時間がかかり、且つ、半減期も長いため体内に長期間残存する一方、mRNAは、免疫反応後速やかに検出可能なレベルに達し、且つ、半減期も短いため体内に長期間残存しない。このため、図１の「一致する配列の数（クローン）」又は「一致する配列の割合」の推移に示される通り、免疫反応をmRNAレベルに基づき俊敏に検出でき、液性免疫活性をリアルタイムに把握できる。
　本発明の方法の適用目的に応じた形態としては、以下が挙げられる。
形態［ａ］ワクチンの科学的妥当性の評価
　　　　　　事例ａ１：中和活性を持つ抗体の産生能
　　　　　　事例ａ２：標的抗原の株（変異株、バリアント）の種類
　　　　　　事例ａ３：標的エピトープの種類
　　　　　　事例ａ４：獲得免疫による抗体と抗原認識部位が完全一致する抗体の産生能
形態［ｂ］ワクチンの免疫反応の評価
　　　　　　事例ｂ１：抗体薬投与による抗体保有中のワクチンの免疫反応の評価
　　　　　　事例ｂ２：他のワクチン接種による抗体保有中のワクチンの免疫反応の評価
　　　　　　事例ｂ３：感染による抗体保有中のワクチンの免疫反応の評価
　　　　　　事例ｂ４：免疫抑制処理後のワクチン接種による免疫反応の回復評価
形態［ｃ］感染症の診断
　　　　　　事例ｃ１：病原体の特定
　　　　　　事例ｃ２：新たな病原体に適合する既存ワクチンの適合性判定
形態［ｄ］がん免疫の評価
　　　　　　事例ｄ１：がん免疫療法の奏功性の判断
　　　　　　事例ｄ２：真のネオアンチゲンの同定
形態［ｅ］自己抗原に対する反応評価
　　　　　　事例ｅ１：自己免疫疾患の発症診断
　　　　　　事例ｅ２：自己免疫疾患の病勢診断
　　　　　　事例ｅ３：投薬後の副作用評価
形態［ｆ］網羅的バイオセンサとしての利用
　以下、本発明の免疫反応の評価方法を詳述する。
１．工程Ａ
　工程Ａでは、被験者の検体から取得した、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列のレパトアデータ〔図１（i）に相当〕を用意する。
１－１．レパトアデータ
　レパトアは、被験者が有している経時変化性の獲得免疫受容体の総体（免疫レパトア）である。
　レパトアデータ源となる生体試料としては、免疫細胞が含まれる試料であれば特に限定されず、血液、リンパ液等の体液試料、及び組織のホモジェネート液等が挙げられ、好ましくは体液試料が挙げられ、より好ましくは血液（さらに好ましくは末梢血単核球）が挙げられる。
　レパトアデータには、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列が含まれる。免疫細胞としては、Ｂ細胞又はＴ細胞を選択することができる。免疫細胞としてＢ細胞を選択する場合の好ましい例として、形態［ａ］～［ｃ］，［ｅ］，［ｆ］が挙げられる。免疫細胞としてＴ細胞を選択する場合の好ましい例として、形態［ｄ］，［ｆ］が挙げられる。
　本発明で用いられるレパトアデータにおいて、抗原認識部位の配列に由来元となる免疫細胞は、特定の抗原に対して特異的な免疫細胞を含むが、特定の抗原に対して特異的でない免疫細胞も無作為に含み、それらの区別はなされていない。つまり、本発明で用いられるレパトアデータにおいて、抗原認識部位の配列に由来元となる免疫細胞は、上記の生体試料から得られるすべての免疫細胞から、特定の抗原に対して特異的な免疫細胞が絞り込まれたものではなく、典型的には、上記の生体試料から特定可能なすべての免疫細胞（例えば、末梢血単核球から特定できるすべてのＢ細胞又は全てのＴ細胞）を含むことができる。
　レパトアデータには、被験者１人から取得された情報が含まれていてもよいし、被験者属性が共通した複数の被験者から取得された情報が含まれていてもよい。
　免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列は、免疫細胞のクロノタイプを決定する遺伝子配列を含む。当該遺伝子配列としては、再編成により相補性決定領域を形成する配列であればよい。具体的には、当該遺伝子配列としては、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲγ鎖、免疫グロブリンＬ鎖のＶセグメント及びＪセグメントの配列、並びに、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲδ鎖、免疫グロブリンＨ鎖の、Ｖセグメント、Ｄセグメント、及びＪセグメントの配列が挙げられる。また、当該相補性決定領域としては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のうち少なくともいずれかであればよいが、好ましくは、少なくともＣＤＲ３を含む。
　レパトアデータは、レパトア解析方法により取得されたものであってよい。レパトア解析方法は公知であり、被験者の生体試料から、次世代シーケンシングにより、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列（遺伝子配列）を決定する。典型的には、被験者の生体試料から全RNAを抽出してｃＤＮＡを合成し、免疫細胞受容体の遺伝子配列を核酸増幅し、次世代シーケンシングにより大規模に配列決定し、抗原認識部位の配列（遺伝子配列）領域のアサインメントを行うことにより取得することができる。核酸増幅においては、免疫細胞受容体の遺伝子配列を、バイアスをかけることなく均一に増幅する（非バイアス遺伝子増幅）ことが好ましく、このような非バイアス遺伝子増幅のためのマルチプレックスプライマーパネルの設計も、公知技術に基づいて選択することができる。
　レパトアデータに含まれる配列の数については特に限定されず、使用した次世代シーケンシングの１回の解析規模及びレパトアデータを提供した被験者の数等に応じて決定すればよい。具体的には、レパトアデータに含まれる配列の数としては、免疫細胞受容体の数で、例えば１０万～１０００万、３０万～５００万、又は５０万～３００万となる数が挙げられる。
　なお、本発明において適用できるレパトア解析方法には、免疫細胞の遺伝子発現を細胞集団レベルで解析するバルク解析だけでなく、免疫細胞の遺伝子発現を個別の細胞単位で解析するシングルセル解析も包含される。
１－２．被験者
　被験者としては、免疫反応の評価を要する被験者であれば特に限定されず、本発明の方法の適用目的に応じて設定することができる。被験者の具体例としては、特定の抗原の暴露を受けた被験者、がん免疫療法を受けた被験者、及び自己免疫疾患に罹患した被験者等が挙げられる。また、被験者の生物種としては、ヒト及び非ヒト動物（特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ等）が挙げられる。
１－２－１．特定の抗原の暴露を受けた被験者
　特定の抗原の暴露としては、免疫反応の活性化をもたらすイベントであれば特に限定されず、例えば、ワクチンの接種及び感染が挙げられる。
１－２－１－１．特定の抗原としてワクチンの接種を受けた被験者
　特定の抗原の暴露を受けた被験者として、特定の抗原としてワクチンの接種を受けた被験者を選択することができる。この場合、ワクチンの免疫反応の評価としては、検体の採取時期において被験者の生体内でワクチンに対して免疫反応した配列を特定することにより、当該ワクチンに対する免疫反応性を確認するだけでなく、当該ワクチンの科学的妥当性（例えば、当該ワクチンが、その設計に適った所定の機能を発揮しているか等）を評価（予測を含む）することも挙げられる。当該被験者が選択される場合の例として、形態［ａ］、形態［ｂ］、形態［ｆ］が挙げられる。
　ワクチンによる免疫反応は感染と比べて緩やかであるため、従来のレパトア解析を用いても、特定の抗原に対する免疫反応を確認できない。本発明の方法は、レパトアデータから特定の抗原に対する免疫反応を選択的に特定できるため、ワクチンによる免疫反応であっても、効果的に、特定の抗原に対する免疫反応を特定できる点で、有用性が高い。
　ワクチンの種類としては特に限定されず、具体的には、核酸ワクチン（mRNAワクチン、ＤＮＡワクチン）、ウイルスベクターワクチン、組み換えタンパク質ワクチン、不活化ワクチン、及び生ワクチンが挙げられる。また、ワクチンとしては、好ましくは、後述の病原体に対して設計されたワクチンが挙げられ、好ましくは後述のウイルス、より好ましくはコロナウイルス又はインフルエンザウイルスに対して設計されたワクチン（コロナウイルスワクチン又はインフルエンザウイルスワクチン）が挙げられる。
　本発明の方法は、特定の抗原に対する免疫反応を、抗体の相補性決定領域の配列のレベルで特定することが可能であるとともに、抗体の相補性決定領域の配列情報から、株（変異株、バリアント）の種類、若しくはエピトープ（抗体結合部位）などの抗原情報を特定することも可能である。このため、特に核酸ワクチンのように、特定の抗原の設計図（遺伝情報）を有効成分とするワクチンにより産生される抗体が、どのような株（変異株、バリアント）の種類、エピトープを認識できる性能を持つものかを、データベース中の相補性決定領域の配列に紐付けられたエピトープ等の抗原情報から確認することができる。このような観点から、ワクチンの種類の好適な例として、核酸ワクチン（mRNAワクチン、DNAワクチン）が挙げられ、より好ましくはＲＮＡワクチン（mRNAワクチン）が挙げられる。
１－２－１－２．特定の抗原の感染を受けた被験者
　特定の抗原の暴露を受けた被験者として、特定の抗原の感染を受けた被験者を選択することができる。この場合、特定の感染症における免疫反応を評価できる。当該被験者が選択される場合の例として、形態［ｃ］、形態［ｆ］が挙げられる。
　感染としては、特定の抗原を病原体とする感染であれば、特に限定されず、具体的には、ウイルス、細菌、真菌等の抗原生物を病原体とする感染が挙げられる。
　ウイルスとしては特に限定されず、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、等が挙げられる。コロナウイルスには、風邪コロナウイルス（HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）等が挙げられる。インフルエンザウイルスとしては、Ａ型（１６種のヘマグルチニン（HA）H1～H16と９種のノイラミニダーゼ（NA）N1～N9との任意の組み合わせのものを含む）、Ｂ型、Ｃ型が挙げられる。
　細菌としては特に限定されず、緑膿菌、レジオネラ菌、エルシニア菌、大腸菌、ビブリオ菌、インフルエンザ菌、グラム陰性桿菌、結核菌等が挙げられる。
　真菌としては特に限定されず、カンジダ菌、アスペルギルス菌等が挙げられる。
　なお、本発明において、病原体（病原体微生物を指す。）となる特定の抗原としては、現在、感染が確認され、種及び株が特定されている抗原のみならず、今後新たに発生する変異株等の病原体も包含される。当該被験者が選択される場合の本発明の方法によれば、レパトアデータに係る配列情報から、既存のデータベースを介して抗原情報を特定できるため、感染症の診断において、どのような病原体による感染症であるかの特定だけでなく、新たな発生病原体に対して、既存のワクチンが適用できるか否かの判定もできる。
１－２－１－３．他の抗体を高いレベルで保有する被験者
　特定の抗原の暴露を受けた被験者（上記項目「１－２－１－１」及び上記項目「１－２－１－２」に記載の被験者）は、検体採取時に、さらに、他の抗体を高いレベルで保持してもよい。他の抗体とは、当該特定の抗原の暴露により生じる抗体とは異なる抗体をいう。当該被験者が選択される場合の例として、形態［ａ］～形態［ｃ］、形態［ｆ］が挙げられる。
　他の抗体を高いレベルで保有する被験者としては、抗体薬を投与された、ワクチンを接種され、及び／又は感染を受けた被験者が挙げられる。以下において、抗体薬を投与された被験者を「被験者（Ｓ１）」とも記載し、ワクチンを接種された被験者を「被験者（Ｓ２）」とも記載し、感染を受けた被験者を「被験者（Ｓ３）」とも記載する。
　被験者（Ｓ１）としては特に限定されないが、具体例として、免疫抑制処置を受けた被験者、又は自己免疫疾患に罹患した患者が挙げられる。免疫抑制処置としては、後述項目１－２－３に述べる処置が挙げられる。自己免疫疾患としては、後述項目１－２－４に述べる疾患が挙げられる。抗体薬としては特に限定されず、あらゆる抗体医薬品を使用することができる。抗体薬の一例としては、免疫抑制処置を受けた被験者において、例えば特定の抗原による暴露への対抗のために投与される抗体医薬品が挙げられる。例えば、特定の抗原が新型コロナウイルスである場合の抗体医薬品としては、チキサゲビマブ／シルガビマブ、カシリビマブ／イムデビマブ、ソトロビマブ等が挙げられる。抗体薬の他の例としては、自己免疫疾患の治療に用いられる抗体医薬品等が挙げられる。この抗体医薬品は、自己免疫疾患の種類に応じて当業者が適宜選択できる。
　被験者（Ｓ２）に接種されるワクチンとしては特に限定されない。但し、上記項目「１－２－１－１」の被験者がさらに被験者（Ｓ２）となる場合にあっては、被験者（Ｓ２）の条件となるワクチンは、上記項目「１－２－１－１」の被験者の条件となるワクチンとは異なる他のワクチンである。当該他のワクチンの具体例としては、上記項目「１－２－１－１」の被験者の条件となるワクチン（すなわち特定の抗原）が産生する抗体と異なる抗体を産生するワクチン、他の抗原（特定の抗原以外の抗原）を標的として設計されたワクチン等が挙げられる。
　被験者（Ｓ３）における病原体としては特に限定されない。但し、上記項目「１－２－１－２」の被験者がさらに被験者（Ｓ３）となる場合にあっては、被験者（Ｓ３）の条件となる病原体は、上記項目「１－２－１－２」の被験者の条件となる病原体（すなわち特定の抗原）と異なる（少なくとも株（Strain）の階級レベルで異なる）他の病原体である。他の病原体は、具体的には、上記項目「１－２－１－２」に挙げた病原体から適宜選択できる。
　抗体薬の投与、ワクチンの接種、又は感染により、被験者（Ｓ１）～被験者（Ｓ３）の体内では、他の抗体（具体的には、抗体薬に係る抗体、ワクチンに対する免疫反応で産生される抗体、又は病原体に対する免疫反応で産生される抗体）が高いレベルで存在する。さらに、抗体タンパク質の半減期が長いことから、被験者（Ｓ１）～被験者（Ｓ３）の体内では、これらの他の抗体が高いレベルのまま保持される。この状態で、別途並行し、特定の抗原に対する免疫反応で抗体が生じても、そのような抗体は、共存する大量の他の抗体によりマスキングされるため、従来のレパトア解析やＥＬＩＳＡなどの免疫学的測定法では確認できない。本発明の方法は、体内の抗体タンパク質の量に影響を受けることなく、レパトアデータから特定の抗原に対する免疫反応を選択的に特定できるため、他の抗体を高いレベルで保有する被験者であっても、特定の抗原に対する免疫反応が生じていれば当該免疫反応を特定できる。
　また、抗体薬の投与時期と抗原暴露の時期との関係性については、抗体薬に係る抗体が体内で保持されている間にレパトアデータに係る生体試料が取得されることを限度として特に限定されない。従って、抗体薬の投与時期は、上記限度において、抗原暴露の前、抗原暴露と同時、及び抗原暴露の後のいずれであってもよく、好ましくは、抗原暴露の前である。
１－２－２．がん免疫療法を受けた被験者
　がん免疫療法（本来身体に備わっているがんに対する免疫の反応を強化する治療法）を受けた被験者の体内では、それまで寛容であったがん抗原に対して免疫細胞の再認識が行われる。このがん抗原（ネオアンチゲン）に対する免疫細胞の再認識は、原理的に、抗原暴露と同様の免疫環境の変化（免疫反応の活性化）を伴う。上記のとおり、本発明の方法は、抗原の暴露により活性化した免疫反応を評価できるため、がん免疫療法により活性化した免疫反応も同様の機序で評価することができる。従って、被験者として、がん免疫療法を受けた被験者を選択できる。当該被験者が選択される場合の例として、形態［ｄ］、形態［ｆ］が挙げられる。特定の抗原としては、がん抗原を選択できる。
　がん免疫療法としては、がんによる免疫のブレーキを外す治療法が挙げられ、具体的には、免疫抑制のシグナル伝達を阻害することでがん免疫を活性化させる、免疫チェックポイント阻害剤の投与などが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤としては、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体等が挙げられる。
　がん免疫療法を受けた被験者について免疫反応を評価することで、がん免疫療法の所定の機能が発揮されているか否か（つまり、がん免疫療法の奏功性）の判断ができる。また、当該被験者が選択される場合の本発明の方法によれば、がん免疫療法後に採取した検体のＴ細胞受容体レパトアデータに係る配列情報から、Ｔ細胞受容体データベースに一致する抗原を臨床的に意義のあるＴ細胞受容体配列として特定できるため、当該Ｔ細胞受容体配列に結合する抗原（典型的にはペプチド）を真のネオアンチゲンとして同定できる。
１－２－３．免疫抑制処置を受けた被験者
　被験者として、免疫抑制処置を受けた被験者を選択できる。当該被験者が選択される場合の例として、形態［ｂ］の事例ｂ４、形態［ｆ］が挙げられる。特定の抗原としては、ワクチンを選択できる。
　免疫抑制処置としては、特に限定されないが、造血幹細胞移植、Ｂ細胞枯渇療法等の投与（化学療法）等が挙げられる。免疫抑制処置を受けた被験者の免疫反応の評価に使用される場合、例えば、免疫抑制処置後の抗原刺激（ワクチン接種等）による、免疫抑制処置で低下した免疫反応の回復の有無の判断ができる。
　なお、当該被験者が選択される場合、被験者は、免疫抑制処理の後に特定の抗原による抗原刺激を受ければよく、免疫抑制処理の前に、抗原（この抗原は、特定の抗原と同じ抗原であってもよいし、特定の抗原とは異なる抗原であってもよい。）の刺激を受けていてもよいし、受けていなくてもよい。なお、免疫抑制処理の前に、特定の抗原と同じ抗原の刺激を受けていたとしても、免疫抑制処理により免疫がリセットされる。このため、本発明の方法においては、免疫抑制処理の前に、特定の抗原と同じ抗原の刺激を受けていたとしても、免疫抑制処理の後に受ける特定の抗原の刺激による反応を、免疫反応の一次反応と位置付ける(図２２Ａ参照)。
１－２－４．自己免疫疾患に罹患した被験者
　被験者として、自己免疫疾患に罹患した被験者を選択できる。当該被験者が選択される場合の例として、形態［ｅ］、形態［ｆ］が挙げられる。特定の抗原としては、自己抗原を選択できる。
　自己免疫疾患としては特に限定されず、例えば、重症筋無力症（自己抗原：アセチルコリンレセプター）、免疫性血小板減少症（ITP）（自己抗原：血小板）、1型糖尿病（自己抗原：β細胞）等が挙げられる。
　当該被験者が選択される場合の本発明の方法によれば、当該被験被験者から取得した免疫細胞受容体レパトアデータに係る配列情報から、自己免疫疾患の原因となる自己抗原に対する免疫細胞レセプターに関するデータベースと一致する配列を特定することで、自己免疫疾患の発症又は病勢の評価ができる。
　また、当該被験者が選択される場合の本発明の方法によれば、薬剤投与後の副作用の評価を行うこともできる。この場合、自己抗原に対するデータベース群を構築しておき、薬剤投与により、当該薬剤の設計上の標的とは異なる標的についてのデータベースで一致する配列が増加することを確認することで、当該薬剤のオフターゲット効果を評価できる。例えば、たとえばSARS-CoV-2ワクチンを投与した場合、レパトア解析によって、データベース群を構成する無数のデータベースのうち、SARS-CoV-2についてのデータベースの配列でなく、心筋のデータベースについて一致する配列の増加が認められた場合、副作用として心筋炎が起こると評価できる。これにより、新薬に対して、予期せぬ副作用(自己抗原に反応する抗体)の出現を予測するスクリーニングが可能となるため、より安全性の高い新薬の開発が可能になる。
１－３．レパトアデータの取得時期
　被験者のレパトアデータの取得時期（つまり、レパトアデータ源となる生体試料の採取時期）については特に限定されず、免疫反応の評価を要する任意の時期から選択できる。好ましくは、特定の抗原に対する免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期（つまり、レパトアにおいて特定の抗原に反応した免疫細胞のクローン性増殖の時期）と合致する時期が選択される。具体的なmRNAの活性化時期としては、特定の抗原の種類に依存せず、例えば、特定の抗原による免疫刺激後４～１８日が挙げられる。より具体的には、免疫反応のうち一次反応を評価する場合（例えば、感染、ワクチンの初回接種、又はがん免疫療法の免疫を評価する場合）で、一次反応のための抗原刺激後例えば１１～２０日又は１１～１８日、好ましくは１２～１６日、より好ましくは１３～１５日が挙げられ、二次反応、三次反応、・・・、又はｎ次反応（ｎは免疫反応の回数を表す整数である。これら二次以降の反応をまとめて「二次以降反応」とも記載する。）を評価する場合（例えば、ワクチンのブースター接種、又はがん免疫療法を評価する場合）で、それぞれ、二次反応、三次反応、・・・、又はｎ次反応のための抗原刺激後、例えば３～１０日、又は４～１０日、好ましくは５～９日、より好ましくは６～８日が挙げられる。
２．工程Ｂ
　工程Ｂでは、特定の抗原に対する抗原認識部位の配列のデータベース〔図１（iii）に相当〕と、前記レパトアデータ〔図１（ii）に相当〕とを照合し、前記レパトアデータの中から、前記データベースに含まれる前記配列と、アミノ酸配列レベルで同一又は２個以下のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列〔図１の「データベースと一致する配列」に相当〕を検出する。
２－１．データベース
　データベースには、特定の抗原に対する抗原認識部位の配列が収載されている。特定の抗原については、上記「１－２．被験者」において述べた特定の抗原と同じである。抗原認識部位の配列については、上記「１－１．レパトアデータ」において抗原認識部位の配列として説明した通りである。
　データベースには、特定の抗原に対する抗原認識部位の配列の情報に加え、特定の抗原に対する抗体配列・ナノボディ配列・可変領域配列、当該抗体の中和活性の有無、特定の抗原におけるエピトープ領域、抗原生物の種・株（変異株、バリアント）、等の付加的情報（以下において、単に「付加的情報」とも記載する。）が含まれていてもよい。
２－１－１．公共データベース
　このようなデータベースの例としては、公開されているものとして、CoV-AbDab（オックスフォード大学統計学部のオックスフォード・プロテイン・インフォーマティクスグループにより管理されるデータベース）が挙げられる。ＣｏＶ－ＡｂＤａｂは、SARS-CoV-2、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶなどのβコロナウイルスに関する情報が収載されており、各βコロナウイルスに結合可能な抗体の配列・ナノボディ配列・可変領域配列、当該抗体の中和活性の有無、エピトープ領域、各βコロナウイルスの種・株（変異株、バリアント）、等の情報が含まれる。
２－１－２．独自に作成されたデータベース
　本発明において、データベースとしては、上記の情報が含まれていれば、公開されているものされているものを用いてもよいし、特定の抗原ごとに、独自にデータ収集して作成されたものであってもよい。データベースに収載すべき特定の抗原に対する抗原認識部位の配列は公知の方法を用いて適宜取得することができる。データ収集の方法としては、以下の〔１〕～〔３〕に示す方法が挙げられる。データベースの収集のために、これら〔１〕～〔３〕に示す方法のうちいずれかの方法を用いてもよいし、２以上の方法を組み合わせて用いてもよい。
　　〔１〕既存の文献及び／又は公共データベースからの収集
　　〔２〕in vitro実験による配列収集
　　〔３〕in silicoによる配列収集
　上記〔１〕の方法では、既存の文献及び／又は公共データベースから、特定の抗原に対する公知の抗原認識部位の配列を取捨選択し、必要に応じて更に公知の付加的情報を関連付けることにより、データベースに収載する情報を編集できる。
　上記〔２〕の方法は、例えば、抗原配列から合成したタンパク質に標識を付した標識タンパク質を用意する工程と、免疫細胞集団のうち当該標識タンパク質に結合する細胞をソーティングする工程と、ソートした細胞の配列を、データベースに収集すべき情報として取得する工程とを含む。
　上記〔３〕の方法では、機械学習を用いた抗原/抗原受容体の結合予測を利用して、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列を収集できる。当該結合予測としては、タンパク質言語モデル（例えば、Bioinformatics, Volume 37, Issue Supplement_1, July 2021, Pages i237-i244、及びBioinformatics, Volume 39, Issue 1, January 2023, btac820）を利用した抗原/エピトープ結合解析、ディフュージョンモデル（例えば、Nature. 2024 May 8. doi: 10.1038/s41586-024-07487-w）を利用した蛋白構造解析及びそれらの結合解析等が知られている。
　また、上記〔２〕及び〔３〕を組み合わせた方法では、前記特定の抗原による免疫反応が起きた調査対象からなる集団から、特定の抗原に結合可能な免疫細胞を取得し、レパトア解析にて、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列を収集できる。上記〔２〕及び〔３〕を組み合わせた方法は、好ましくは以下の工程を含む。
・前記調査対象それぞれの検体から、前記免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むレパトアデータであって、前記特定の抗原に対する免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期Ｔex、前記活性化時期の前Ｔbf、及び前記活性化時期の後Ｔafにおけるレパトアデータを時系列で取得する工程、及び
・前記活性化時期Ｔexにおいて増殖が認められる免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列を、前記データベースに収集すべき情報として選定する工程。
　当該方法でデータベースを作成する例の概念図を、図２に示す。上記「１－３．レパトアデータの取得時期」で述べた通り、特定の抗原による刺激後の所定の期間に、免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期（つまり、レパトアにおいて特定の抗原に反応した免疫細胞のクローン性増殖の時期）が到来することが見出されている。従って、上記「１－３．レパトアデータの取得時期」で述べた、抗原刺激後の所定の期間（クローン性増殖期）を基準に、当該活性化の前（Ｔbf：クローン性増殖前）、当該活性化時期（Ｔex：クローン性増殖期）、及び当該活性化後（Ｔaf：クローン性増殖後：増殖したクローンの縮小）を含む時系列の免疫細胞レセプターのレパトアデータを取得できる。バルクでのレパトア解析では、各検体から莫大なデータ（例えば２０万リード程度ずつ）が得られる。これら時系列データにおけるリード数の増減又は類似配列のクラスター解析などを、機械学習を含めた情報科学的手法を用いて解析することで、特定の抗原に対する抗原認識部位の配列群を選定できる。
２－１－３．網羅的データベース
　上述の公共データベース及び独自に作成されたデータベースを、あらゆる免疫反応（感染、がん免疫療法、自己免疫反応等）に係る抗原に対する抗原認識部位の配列の情報及び付加的情報を網羅するように収集することで、図３に模式的に示すような大規模なデータセット群を構築できる。このような大規模データセット群を準備しておくことで、抗原受容体レパトアをバイオセンサとして使用することで、生体内で起きている、あらゆる免疫反応（感染、がん免疫療法、自己免疫反応等）を網羅的に、少量の検体でとらえることが可能となる。当該大規模データセット群を使用する例として、形態［ｆ］が挙げられる。
２－２．アミノ酸配列レベルで同一又は２個以下のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列（一致する配列）
　特定の抗原に対する抗原認識部位の配列のデータベース〔図１（iii）に相当〕と、前記レパトアデータ〔図１（ii）に相当〕との照合により、データベースに含まれる配列と、アミノ酸配列レベルで同一又は２個以下（好ましくは１以下）のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列〔図１の「データベースと一致する配列」に相当〕を、レパトアデータから検出する。データベースに含まれる配列と、アミノ酸配列レベルで同一又は２個以下のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列とは、言い換えれば、データベース中の配列に対し、完全同一のアミノ酸配列又はミスマッチが１～２残基（好ましくは１残基）であるアミノ酸配列（類似配列）に該当する配列である。
　一致する配列の検出には、アミノ酸配列同士の比較が可能な任意の方法を用いることができる。このような方法の具体例としては、レーベンシュタイン距離法が挙げられる。レーベンシュタイン距離法では、レーベンシュタイン距離（編集距離、つまり、一方の文字列をもう一方の文字列に一致させるために必要な一文字の置換、挿入、削除の最小回数）が０～２（好ましくは０～１）となるアミノ酸配列を検出することができる。従って、一致する配列のうち、完全同一の配列のレーベンシュタイン距離は０、類似配列のレーベンシュタイン距離は１～２（好ましくは１）である。
３．工程Ｃ
　工程Ｃでは、工程Ｂにより特定される配列の、前記レパトアデータにおける数〔図１の「一致する配列の数（クローン）」に相当〕及び／又は頻度〔図１の「一致する配列の割合」に相当〕を導出する。本発明において、工程Ｃは、本発明の方法の適用の目的に依存せず任意で含むことができる。
　つまり、工程Ｃでは、データベース中の配列と同一又は類似の配列として検出された配列（一致する配列）が、レパトアデータにどの程度の数含まれているか、及び／又はどの程度の頻度で出現するかを導出する。当該数及び／又は頻度の導出は、公知の方法に基づいて適宜行うことができる。データベース中の配列と同一又は類似の配列として特定された配列（一致する配列）が、レパトアデータにおいて多数及び／又は高頻度であるほど、特定の抗原に対する免疫反応が強く及び／又は高頻度で生じているといえる。
　当該一致する配列について、特定の抗原による免疫反応が生じていない場合の数及び／又は頻度が、技術常識により、又はデータベースの収載情報から既知である場合は、当該免疫反応が起こっているか否かを判断できる。つまりこの場合、１個のデータポイントのみでも免疫反応の評価ができる。このような場合の好ましい例としては、形態［ｂ］、形態［ｃ］、形態［ｅ］の事例ｅ１、形態［ｆ］等が挙げられる。
４．工程Ｄ
　工程Ｄでは、工程Ｃで得られた、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の経時変化を確認する。本発明が工程Ｄを含む場合の例として、形態［ａ］、形態［ｂ］、形態［ｄ］、形態［ｅ］の事例ｅ２及び事例ｅ３、形態［ｆ］が挙げられる。本発明の方法が形態［ｃ］又は形態［ｅ］の事例ｅ１に適用される場合は、工程Ｄは要しない。
　特定の抗原の暴露を受けた被験者のレパトアデータについて免疫反応を評価する場合（例えば形態［ａ］、形態［ｂ］、形態［ｆ］等）、工程Ｃで得られた数及び／又は頻度のレベルが、抗原の暴露の前における当該数及び／又は頻度のレベルよりも増大したか否かを確認する。がん免疫療法を受けた被験者のレパトアデータについて免疫反応を評価する場合（例えば形態［ｄ］、形態［ｆ］等）、工程Ｃで得られた数及び／又は頻度のレベルが、がん免疫療法前における当該数及び／又は頻度のレベルよりも増大したか否かを確認する。また、免疫抑制処置を受けた被験者のレパトアデータについてワクチン接種による免疫反応を評価する場合（例えば形態［ｂ］の事例ｂ４、形態［ｆ］等）、工程Ｃで得られた数及び／又は頻度のレベルが、免疫抑制処置の前における当該数及び／又は頻度のレベルよりも増大又は減少したか否かを確認する。自己免疫疾患に罹患した被験者のレパトアデータについて免疫反応を評価する場合（例えば形態［ｅ］の事例ｅ１、事例ｅ２、形態［ｆ］等）、工程Ｃで得られた数及び／又は頻度のレベルが、同一被験者の別のタイミングで採取した検体における当該数及び／又は頻度のレベルよりも増大したか否かを確認する。
　上記「１－３．レパトアデータの取得時期」で述べた通り、特定の抗原による刺激後の所定の期間に、免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期（つまり、レパトアにおいて特定の抗原に反応した免疫細胞のクローン性増殖の時期）が到来することが見出されている。具体的には、一次反応のための抗原刺激後の活性化時期は、例えば１１～２０日又は１１～１８日、好ましくは１２～１６日、より好ましくは１３～１５日であり、二次以降反応のための抗原刺激後の活性化時期は、例えば３～１０日、又は４～１０日、好ましくは５～９日、より好ましくは６～８日である。このため、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の増大が認められた時期が、一次反応のための抗原刺激後の活性化時期と二次以降反応のための抗原刺激後の活性化時期とのいずれかに該当するかを確認することで、特定の抗原による刺激が一次反応及び二次事項反応のいずれを生じさせたものかを判断できる。具体的には、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の増大が、特定の抗原による刺激後１１～２０日又は１１～１８日（好ましくは１２～１６日、より好ましくは１３～１５日）に認められた場合、当該刺激による免疫反応は一次反応であると判断できる。データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の増大が、特定の抗原による刺激後３～１０日（好ましくは５～９日、より好ましくは６～８日）に認められた場合、当該刺激による免疫反応は二次以降反応と判断できる。
５．工程Ｅ、工程Ｅ’、工程Ｆ、工程Ｇ
　本発明の方法は、上記工程Ａ～工程Ｄを含む場合、さらに、本発明の効果を損なわない限り、他の工程を含むことができる。他の工程は、本発明の方法の適用目的に応じて決定することができる。
５－１．工程Ｅ及び工程Ｅ’
　核酸ワクチンの接種を受けた被験者のレパトアデータについて免疫反応を評価する場合、本発明の方法は、さらに工程Ｅ及び／又は工程Ｅ’を含むことができる。当該工程Ｅを含む場合の例として、形態［ａ］の事例ａ１～事例ａ３、形態［ｆ］が挙げられる。工程Ｅ’を含む場合の例として、形態［ａ］の事例ａ４、形態［ｆ］が挙げられる。
　工程Ｅでは、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の経時変化として増大が確認された配列について、前記データベースに収載された情報を確認することで、前記核酸ワクチンの科学的妥当性を評価する。データベースに収載された情報は、［１］抗原に対する中和活性の有無の情報、［２］抗原の種又は株の情報、及び［３］エピトープの情報からなる群より選択される。また、科学的妥当性の評価は、［１］前記中和活性が有ることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが中和活性を持つ抗体を産生する臨床的有効性を持つと評価すること、［２］前記種又は前記株が、前記核酸ワクチンの設計上の標的抗原の種又は株と同じであることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが前記標的抗原に適合していると評価すること、及び［３］前記エピトープが、前記核酸ワクチンの設計上の標的エピトープと同じであることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが前記標的エピトープに適合していると評価すること、からなる群より選択される。上記［１］の場合は、形態［ａ］の事例ａ１に該当し、上記［２］の場合は、形態［ａ］の事例ａ２に該当し、上記［３］の場合は、形態［ａ］の事例ａ３に該当する。
　工程Ｅによって、特定の抗原の設計図（遺伝情報）を有効成分とする核酸ワクチンについて、生体内で、中和活性を持つ抗体を産生できる、設計通りの標的抗原（種又は株）を認識できる抗体を産生できる、又は、設計通りの標的エピトープを認識できる抗体を産生できるという科学的妥当性を確認できる。
　工程Ｅ’では、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の経時変化として増大が確認された前記配列が、前記データベースに含まれる前記配列とアミノ酸配列レベルで同一（つまり完全一致）である場合に、前記核酸ワクチンの科学的妥当性として、感染による獲得免疫による抗体と抗原認識部位が完全一致する抗体の産生能を有すると評価する。本発明によれば、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列が完全一致する配列を数多く検出できる。抗原認識部位の配列のアミノ酸配列を例えば１０アミノ酸からなる配列とした場合、アミノ酸が２０種類あるため、完全一致配列を見出すためには理論上２０の１０乗種類の配列が必要であることに鑑みると、本発明により完全一致配列を多数検出できることは驚くべき効率であると認められる。
　工程Ｅ’によって、図４に示すように、健常者である被験者が接種された核酸ワクチンについて、ウイルスなどの抗原の感染により患者が獲得する抗体（データベースに含まれる配列を持つ）と完全に一致する抗体を、ワクチン接種により健常者である被験者の体内で産生できるという科学的妥当性を確認できる。
５－２．工程Ｆ
　ワクチン（すなわち特定の抗原）の接種を受けた被験者であって、且つ検体採取時に他の抗体（すなわち特定の抗原としてのワクチンの接種により産生される抗体とは異なる抗体）を体内に高いレベルで保有する被験者のレパトアデータについて免疫反応を評価する場合、本発明の方法は、さらに工程Ｆを含むことができる。工程Ｆを含む場合の例として、形態［ｂ］の事例ｂ１～事例ｂ３、形態［ｆ］が挙げられる。
　この場合の被験者は、上記「１－２－１－３．他の抗体を高いレベルで保有する被験者」で述べた被験者（Ｓ１）～被験者（Ｓ３）から選択でき、具体的には、特定の抗原としてワクチンを接種された被験者であって、抗体薬を投与された、他のワクチンを接種された、並びに／若しくは、感染を受けた被験者が挙げられる。
　工程Ｆでは、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度が経時的に増大する場合に、前記ワクチンが機能すると判断する。ここで、上記「１－２－１－３．他の抗体を高いレベルで保有する被験者」で述べたのと同様、抗体薬の投与、他のワクチンの接種、又は感染により、被験者（Ｓ１）～被験者（Ｓ３）の体内では、他の抗体（具体的には、抗体薬に係る抗体、他のワクチンに対する免疫反応で産生される抗体、又は病原体に対する免疫反応で産生される抗体）が高いレベルで存在する。さらに、抗体タンパク質の半減期が長いことから、被験者（Ｓ１）～被験者（Ｓ３）の体内では、これらの他の抗体が高いレベルのまま保持される。この状態で、別途並行し、特定の抗原としてのワクチンに対する免疫反応で抗体が生じても、そのような抗体は、共存する大量の他の抗体によりマスキングされるため、従来のレパトア解析やＥＬＩＳＡなどの免疫学的測定法では確認できない。本発明の方法は、体内の抗体タンパク質の量に影響を受けることなく、レパトアデータから特定の抗原に対する免疫反応を選択的に特定できるため、他の抗体を高いレベルで保有する被験者であっても、特定の抗原としてのワクチンに対する免疫反応が生じていれば、当該免疫反応を選択的に特定できる。
５－３．工程Ｇ
　造血幹細胞移植又はＢ細胞枯渇療法等の免疫抑制処理を受けた被験者のレパトアデータについて免疫反応を評価する場合、本発明の方法は、さらに工程Ｇを含むことができる。工程Ｇを含む場合の例として、形態［ｂ］の事例ｂ４、形態［ｆ］が挙げられる。
　工程Ｆでは、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の経時変化が増大したか否かに基づいて、免疫機能の回復の有無を判定する工程Ｇをさらに含むことができる。例えば、免疫抑制処置を受けた後に特定の抗原としてワクチンの接種を受けた被験者のレパトアデータについて、データベースと一致する配列の数及び／又は頻度の増大を認めた場合、免疫抑制処理により低下していた免疫機能の回復を確認できる。
６．工程Ｈ
　工程Ａで用意するレパトアデータが、過去に出現したウイルス株ＳＴ１に対するワクチン（既存のワクチン）の接種を受けた被験者の検体から取得したものであり、工程Ｂで照合に用いるデータベースが、当該ワクチン（既存のワクチン）による有効性が未知であるウイルス株ＳＴ２（例えば、ウイルス株ＳＴ１の変異株等）に対する免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むものである場合、本発明は、工程Ｂにより検出される配列が存在する場合に、当該ワクチン（既存のワクチン）がウイルス株ＳＴ２にも有効と評価する工程Ｈをさらに含むことができる。この場合、新たに出現したウイルス株に対して、既存のワクチンを有効利用するという判断が可能になる。反対に、工程Ｂにより配列が検出されなかった場合は、新たなワクチンの開発が必要であることを判断することが可能になる。
　以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［試験例１］
［材料及び方法］
患者
　SARS-CoV-2感染後の免疫反応を評価するため、2020年8月から2020年12月にかけて神戸大学医学部附属病院にてCOVID-19患者3名から末梢血サンプルを時系列的に採取した。すべての患者は軽症と分類され、免疫抑制剤は投与されていなかった。COVID-19は、SARS-CoV-2の定量的逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（rtPCR）により確認された。
　mRNA SARS-CoV-2ワクチン接種後の免疫反応を評価するため、2021年5月から2022年12月の間に健康なボランティアを登録した。すべての参加者に使用されたSARS-CoV-2 mRNAワクチンは、一価のBNT162b2 [B.1.1.529]、二価のBNT162b2 [WT/OMI BA.4-5]、または一価のmRNA-1273である。これらの参加者がSARS-CoV-2の未感染者であることは、ワクチン接種前に抗SARS-CoV-2ヌクレオカプシド蛋白IgG抗体を測定することにより確認した。血液サンプルは、ワクチン接種の前後で時系列に採取した。
　COVID-19予防のための中和抗体薬チキサゲビマブ／シルガビマブ投与後の血清サンプルにおける抗SARS-CoV-2スパイク抗体価を調べるため、チキサゲビマブ／シルガビマブが適応となる血液悪性腫瘍患者19名（図1の17名と図4A、図4BでBCRレパトアが解析されている造血幹細胞移植患者2名）を登録した。血液サンプルは、チキサゲビマブ／シルガビマブ投与前と投与後に時系列的に採取した。
サンプル採取及び処理
　末梢血サンプルは、ヘパリン含有チューブを用いて採取した。末梢血単核細胞（PBMC）は、Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare, Little Chalfont, UK）およびSepMate-50チューブ（STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada）を用いて密度勾配遠心分離により血液から製造者のプロトコル（STEMCELL Technologies）に従って分離された。PBMCサンプルは、CELLBANKER（ZENOGEN PHARMA、福島、日本）を用いて、分析まで-80℃で保存した。Total RNAは、TRIzol LS（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で抽出し、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて製造者のプロトコルに従って精製した。RNA量及び純度は、Agilent 2200 TapeStation（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて測定した。血清サンプルは、血液サンプルを室温で1000×gで10分間遠心分離し、直ちに-80℃に保たれたフリーザーに移すことによって得た。
SARS-CoV-2特異的免疫グロブリン抗体アッセイ
　3種類の完全自動化された市販のイムノアッセイを使用した。Abbott SARS-CoV-2 IgG II Quant (Abbott Laboratories, Sligo, Ireland) は、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のS1サブユニットの受容体結合ドメイン（RBD）に対するIgG抗体の定量測定のためにデザインされた化学発光微粒子免疫測定法（CMIA）である。検査はAbbott Architect i2000SR system (Abbott Laboratories)で行われた。Roche Elecsys anti-SARS-CoV-2 S（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）は、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のRBDに対する総Ig抗体を定量的に測定するための電気化学発光免疫測定法（ECLIA）である。検査はRoche Cobas e601システム（Roche Diagnostics社製）で実施した。Atellica IM SARS CoV-2 IgG (Siemens Healthcare Diagnostics, Erlangen, Germany) は、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のS1サブユニットのRBDに対するIgG抗体を定量的に測定するために設計された化学発光免疫測定法（CLIA）である。検査はAtellica IM自動分析装置（Siemens Healthcare Diagnostics）で行われた。
　ヌクレオカプシド蛋白質に対する抗体価に関しては、QuaResearch COVID-19 Human IgM IgG ELISA Kit (nucleocapsid protein) (Cellspect, Inc., RCOEL961-N, Iwate, Japan)により測定された。本キットは、間接法 ELISA 法に基づき抗体価を検出するもので、異なる抗原性タンパク質を固定化したものが付属している。ELISAキット（ヌクレオカプシド蛋白）のプレートには、大腸菌で発現させたSARS-CoV-2の組換えヌクレオカプシド蛋白（全長）が固定化されている。血清サンプル中のヌクレオカプシドタンパク質は、メーカーの測定プロトコルにしたがって測定した。
フローサイトメトリー解析
　PBMCを、T細胞系については以下の抗ヒト抗体、すなわちCD3 APC、CD4 BV510およびCD8 BV711（all BD Biosciences, San Diego, CA, USA）、B細胞系についてはCD19 BV510、CD27 BV421, IgD BV711およびCD38 BV510（all Biolegend, San Diego, CA, USA）を使って4℃で20分間染色した。アイソタイプマッチ抗体をコントロールとして使用した。フローサイトメトリー解析は、BD FACSAria III装置（BD Biosciences）を用いて行った。CD3+CD4+細胞はヘルパーT細胞として定義した。CD19+CD27+IgD-はクラススイッチB細胞として定義した。CD19+CD27+CD38+はプラズマブラストと定義した。
B細胞受容体レパトア解析
　BCR レパトア解析は、Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社が開発した非バイアス次世代シーケンサーを用いて行った。要すれば、polyT18 プライマー（BSL-18E）と Superscript III 逆転写酵素（Invitrogen、カリフォルニア、米国）を用いて全RNAからcDNAを合成した。二本鎖（ds）-cDNAを合成した後、P10EA/P20EA dsDNAアダプターをライゲーションし、NotI制限酵素で切断した。KAPA HiFi DNA Polymerase（Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA）を用いて、IgG定常領域特異的プライマー（CG1およびCG2）およびP20EAを用いてネステッドPCRを実施した。P22EA-ST1およびCG-ST1-Rを用いて第2PCR産物を増幅することにより、アンプリコンライブラリーを調製した。インデックス（バーコード）配列は、Nextera XT Index Kit v2 Set A（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いた増幅により追加した。配列決定は、Illumina MiSeqペアエンドプラットフォーム（2×300 bp）を用いて実施した。BCR配列は、Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社（大阪、日本）が独自に開発したレパトア解析ソフトウェアを用いて、国際ImMunoGeneTics information system(R) (IMGT) データベース（http://www.imgt.org）の参照配列との同一性に基づいて割り当てられた。
指標の算出とネットワーク分析
　データ解析とグラフ化は、Rソフトウェア（バージョン4.0.2）に実装されているパッケージを使用した。レーベンシュタイン距離（編集距離）はstringdist 0.9.10パッケージを用いて算出した。ネットワーク解析は、Rに実装されたigraph 1.2.6 (https://igraph.org/r/)を用いて行った。1,000番目に頻度の高いBCRクローンタイプ（ノード）は、CDR3の1アミノ酸配列以下または1アミノ酸配列以下のLevenshtein距離で定義されるエッジで接続された。ネットワークはFruchtermanとReingoldによるforce-directed layoutアルゴリズムを用いて作成した。グラフィックスはggplot2バージョン3.3.2を用いて描画した。ヒトIGH配列の生成確率（pGen）値は、OLGAパッケージを使用して計算された（Sethna Z, Elhanati Y, Callan CG, Walczak AM, Mora T. OLGA: fast computation of generation probabilities of B- and T-cell receptor amino acid sequences and motifs. Bioinformatics. 2019;35(17):2974-2981.）。
データベースとCOVID-19に特異的な配列の検索
　COVID-19に特異的な抗体配列は、CoV-AbDab（http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/covabdab/）からダウンロードした。12,004件のエントリーを含む2022年12月20日に更新されたデータを参照として使用した。2011年から2021年に報告された対にならない抗体配列は、「重鎖」と「IGHG」属性に基づいてThe Observed Antibody Spaceデータベース（OAS、http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/oas/）からダウンロードされた。合計260,856,092の配列が本方法の検証に使用された。COVID-19パンデミック前の健康なボランティア12人からの合計1,259,140個のIgG抗体配列はすでに報告されている（Kitaura K, Yamashita H, Ayabe H, Shini T, Matsutani T, Suzuki R. Different Somatic Hypermutation Levels among Antibody Subclasses Disclosed by a New Next-Generation Sequencing-Based Antibody Repertoire Analysis. Front Immunol. 2017;8:389.）。クエリー配列と同一のVおよびJ遺伝子名で、CDR3のアミノ酸配列の違い（レーベンシュタイン距離、「CDR3AA Distance」）が0～2の配列（一致する配列）をデータベースから取得した。CoV-AbDabのうち、SARS-CoV2の「Binds to」または「Neutralizing Vs」属性を持つ配列は、変異体に関わらずSARS-CoV-2特異的な配列とした。また、SARS-CoV2の「Neutralizing Vs」属性を持つ配列を中和抗体（Neut+）とし、「Neutralising Vs」属性にSARS-CoV-2を含まず、「Not Neutralising Vs」属性にSARS-CoV-2含む配列を非中和抗体（Neut-）と分類した。
［結果］
ELISA法による抗SARS-CoV-2スパイクIgG抗体測定におけるチキサゲビマブ/シルガビマブ投与による影響
　抗SARS-CoV-2スパイク抗体測定に対するチキサゲビマブ/シルガビマブの影響を検討するため、異なるELISA法を用いた代表的な自動定量抗SARS-CoV-2スパイク免疫測定器3種類（Abbott Laboratories、Roche Diagnostics、Siemens Healthcare Diagnostics）により投与前後の時系列で抗体測定が行われた。チキサゲビマブ／シルガビマブの適応となる血液悪性腫瘍患者17名（B細胞枯渇療法n＝8、造血幹細胞移植n＝6、化学療法n＝3）が登録された。予想通り、投与後の抗体価は全例で極めて高く、長期にわたって高い値が維持された（図1）。
CoV-AbDabを用いたOAS公開データベースの解析
　COVID-19パンデミック前後の既報のレパトアデータを用いて、CoV-AbDabの有用性を検証した。得られた12,004個のCoV-AbDabデータから、8,977個の同一のVおよびJ遺伝子名とヒト配列のCDR3アミノ酸を持つ参照テーブルを用い、公開データベースと上記患者のコホートのデータからSARS-CoV-2特異的配列を検索した（図2A）。まず、OAS公開データベースから2011年から2021年の間に公開された合計260,856,092個の配列をCoV-AbDabを用いて解析した。V及びJ遺伝子名、CDR3アミノ酸配列の完全な配列一致は、パンデミック前のデータでは2019年以前の67,856,692配列中わずか132配列（0.00019%）とほとんど検出されなかった一方、2020年以降はより多くの配列（0.022%, 8,441,259配列中 の 1,817配列）が検出された（表１、OASデータベースにおけるSARS-CoV-2特異的配列の出現頻度（％）、括弧内の数字は、Disease属性がSARS-CoV-2に分類されたサンプルのデータを示す。）。SARS-CoV-2特異的配列に類似した配列を検出するため、CDR3のアミノ酸差が1または2のレーベンシュタイン（LV）距離を持つ抗体配列を検索した。LV距離が1の類似配列は2019年以前に4,641個（0.0068％）、2020年以降に12,251個（0.15％）検出された。LV距離が2の類似配列は、2019年以前は59,356個（0.087％）、2020年以降は27,484個（0.33％）検出された。2019年以前に対する2020年以降の検出率をS/N比とすると、最も良いS/N比は完全に一致した配列（LV0）で110.6、LV1で21.2、LV2で3.7であった。CDR3配列の距離によって、感度やS/N比は変化する。これらの結果から、抗体レパトアデータからSARS-CoV-2特異的な抗体配列を検出するためには、CoV-AbDab参照配列を用いた計算機的アプローチが有効であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、COVID-19パンデミック前の健常者のデータも独自に解析した。健常者12名（年齢：37±11.7［平均±SD］、性別：11：1［男性：女性］）の合計125万9140個のインフレーム配列をCoV-AbDabを用いて解析した。各サンプルにおけるこれらの配列の割合頻度は、0.000075 ± 0.00026% (LV = 0)、0.00043 ± 0.00076% (LV = 1) および 0.0065 ± 0.0032% (LV = 2) でした。これらの結果から、SARS-CoV-2特異的な配列は、未感染の健常者ではほとんど検出されず、検出されたとしても頻度はかなり低いと考えられる（表２、パンデミック前の健常者におけるSARS-CoV-2特異的な配列の頻度（％）。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
CoV-AbDabを用いたCOVID-19患者のBCRレパトアデータの解析
　SARS-CoV-2感染後の免疫応答が、CoV-AbDabを用いたBCRレパトア解析で検査できるかどうかを試みた。原発性COVID-19患者3名から採取した17の血液サンプルについて、BCRレパトアの解析を行った。合計4,768,753個の配列が得られ、そのうちVおよびJ遺伝子とCDR3のアミノ酸割り当てを持つ2,858,278個のインフレーム配列が使用された。次に、CDR3配列の中にCoV-AbDabのCDR3配列と同一のものがあるかどうかを解析した（図2B）。予想通り、患者のサンプルからは、CoV-AbDabのCDR3配列と一致する配列がいくつか検出された。発症直後は一致する配列は検出されなかったが、発症後徐々に増加し、2週間前後でピークに達した（図2B）。
　また、SARS-CoV-2特異的BCRクローン型が形成するネットワークについても解析を行った。類似したSARS-CoV-2特異的な配列は互いに結合し、クラスターを形成していた。また、BCRクラスターは急速に形成、成長し、症状発現後2週間程度で最大サイズに達した。その後、クラスターは急速に消失した（図2B）。
CoV-AbDab を用いたmRNA SARS-CoV-2 ワクチン接種を受けた健康なボランティアのBCR レパトアデータの解析
　CoV-AbDabを用いたBCRレパトア解析によりワクチン接種後の免疫応答が検出できるかどうかを検証するため、mRNA SARS-CoV-2ワクチン（一価BNT162b2 [B.1.1.529], Pfizer）を1回目と2回目に接種した健康ボランティアの血液サンプルについてBCRレパトアを解析した。
　まず、CoV-AbDabを使用しないBCRレパトアデータによりドミナントクローンタイプに着目したものの、ワクチン接種前後で大きな変化は検出されなかった（図7）。
　次に、CoV-AbDabを用いたBCRレパトア解析において、マッチした配列の数と割合頻度を解析した。その結果、1回目のワクチン接種から2週間後にマッチした配列数が増加し、すぐに減少することがわかった（図3A）。一方、2回目のワクチン接種後、一致する配列数はより急速に（1週間）増加した（図3A）。また、他のmRNAワクチン接種（2価のBNT162b2［WT/OMI BA.4-5、ファイザー］および1価のmRNA-1273［モデルナ］）のブースターショットについても同様の結果が観察された（図3Bおよび図3C）。このように、CoV-AbDabを用いたBCRレパトア解析によって、COVID-19患者と同様に、ワクチン接種後の健康なボランティアでワクチン接種後の免疫応答が検出された。
チキサゲビマブ/シルガビマブ投与後の患者におけるmRNA SARS-CoV-2ワクチン接種に対する反応性
　同種造血幹細胞移植を受けた血液悪性腫瘍患者2名を対象に、チキサゲビマブ/シルガビマブ（T/C）投与後のmRNA SARS-CoV-2ワクチン接種に対する反応性を、CoV-AbDabによるBCRレパトア解析により評価した。
　症例1（T/C患者1）：骨髄異形成関連変化を伴う急性骨髄性白血病を発症した63歳女性が、臍帯血移植（CBT）を受けた。CBT後338日目にチキサゲビマブ／シルガビマブを投与し、CBT後348日目に4回目（CBT後2回目）のmRNAワクチン（2価のBNT162b2）を接種した。
　症例2（T/C患者2）：B細胞性急性リンパ芽球性白血病を発症した40歳男性が、非血縁者間骨髄移植（u-BMT）を受けた。u-BMTから212日後にチキサゲビマブ/シルガビマブを投与し、u-BMTから218日後に最初のmRNAワクチン（1価のBNT162b2）を接種した。
　造血幹細胞移植後のワクチン接種反応は、T細胞およびB細胞の再構成に依存する。ワクチン接種時に、フローサイトメトリー解析を行い、T細胞およびB細胞の再構成を評価した。ヘルパーT細胞（CD3+CD4+）、クラススイッチB細胞（CD19+CD27+IgD-）、プラズマブラスト（CD19+CD27+CD38+）の存在を確認した（図4A、図4B）。CoV-AbDabを用いたBCRレパトア解析により、チキサゲビマブ/シルガビマブ投与後もmRNA SARS-CoV-2ワクチン接種に対する反応が明確に検出された（図4A、図4B、図8）。
感染者とワクチン接種者におけるSARS-CoV-2特異的配列の特徴
　最後に、SARS-CoV-2特異的配列の特徴を明らかにした。まず、参照配列の属性から、中和能または非中和能を決定した（図5A）。誘導された抗体の中和能はグループ間で異なり、ワクチン接種者では中和抗体が多く誘導され、少数の感染者では非中和抗体が多く誘導された。各サンプルに含まれる個々のSARS-CoV-2特異的配列の頻度を調べたところ、完全に一致した配列の頻度割合は、1～2個のアミノ酸が不一致の配列よりも有意に高かった（平均±SD： 0. LV0では029±0.088、LV1では0.0079±0.034、LV2では0.0074±0.041、Kruskal-WallisテストとDunn-Bonferroniポストホックテスト、LV0 vs. LV1: p<0.0001、LV0 vs. LV2: p<0.0001, LV2 vs. LV3: not significant）（図5B）。さらに、一致した抗体配列のCDR3長とVとJの組み合わせの使用率を調べた（図5C、図5D）。最も完全一致した配列はIGHV4-59/IGHJ4で、次いでIGHV3-33/IGHJ4であった。1アミノ酸のミスマッチがある配列は、IGHV1-8/IGHJ4、IGHV3-30-3/IGHJ4またはIGHJ6、IGHV3-9/IGHJ4またはIGHV3-33/IGHJ4を高い頻度で持っていた。これらのSARS-CoV-2特異的な配列は、複数の個体で検出され、公的な抗体特性を示していた（表３Ａ及び表３Ｂ、感染者とワクチン接種者のSARS-CoV-2特異的配列（完全一致）。）。SARS-CoV-2特異的な配列として検出されたのは86配列種のみであった。完全に一致した配列の大半は、8アミノ酸の短いCDR3とIGHV4-59/IGHJ4配列であることが判明した（図6A）。既知のSARS-CoV-2特異的配列のうち、生成確率（pGen）が高いものは、感染者やワクチン接種者に多く見られた（図6B）。これらのパターンは、OASデータベースの検索結果と類似していたことから、本実施例の方法の妥当性が証明された（図9～図12）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［本発明の効果について］
　今回、「BCRレパトアデータ」と「標的抗原に結合するBCR配列のデータベース」を用いて、タンパク質発現ではなくmRNA発現のレベルでmRNA SARS-CoV-2ワクチン反応を評価した。実際には、この抗原特異的抗体配列の定量化方法により、チキサゲビマブ/シルガビマブ投与後にもmRNA SARS-CoV-2ワクチン接種に対する反応があることが明確に示された（図4A及び図4B）。循環型バリアントは、個々の地域で経時的に変化する。米国では現在循環している亜種の90％以上に対してチキサゲビマブ/シルガビマブが無効であることが確認されたため、FDAは2023年1月にチキサゲビマブ/シルガビマブの緊急使用認可を改訂している。現在、チキサゲビマブ/シルガビマブ以外のオミクロン株を含む新型亜種に対する様々な抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体が開発中である。各国で適応となる抗体製剤の種類はウイルス変異により異なるが、どのタイプの抗SARS-CoV-2抗体投与後にも本実施例の方法は適用可能であると類推できる。
　抗体投与後のワクチン反応を検出するこの方法が確立されたことは、臨床的意義が大きい。また、mRNAワクチンで開発された抗原には、多量の抗体が占める可能性があるため、既存の抗体の存在によってワクチン接種に対する反応が阻害される懸念を示す専門家もいます。しかしながら、本実施例の方法によれば、チキサゲビマブ/シルガビマブ投与後にもワクチン反応があることが明確に確認できた（図4A及び図4B）。
　以前、本発明者は、COVID-19患者において、発症2週間後に複数のBCRクロノタイプのmRNA発現が急増し、1週間以内に減少したことを報告した（Funakoshi Y, Ohji G, Yakushijin K, et al. Massive surge of mRNA expression of clonal B-cell receptor in patients with COVID-19. Heliyon. 2021;7(8):e07748.）。この報告では、BCRレパトア解析法を用いて液性免疫の活動全体を測定するには、SARS-CoV-2感染後すぐに解析することが重要であるとの考えを示していた。しかし、本実施例の方法により、SARS-CoV-2特異的配列に関しては、発症後2週間前後の頻度はわずか0.1～2%であることが判明した（図2B）。つまり、この結果は、従来のレパトア解析によってBCR総レパトアのデータからSARS-CoV-2に対する特異的な免疫反応を判断することが事実上不可能であることを証明している。
　感染者における総レパトアの初期変化の大部分は、感染に伴う炎症、あるいは二次的な免疫応答の結果である可能性がある。一方、ワクチン接種を受けたボランティアでは、総BCRレパトアデータに基づく有意な変化は観察されない（図7）。しかしながら、本実施例の方法によれば、第一に、一次あるいは二次免疫反応における液性免疫の活性化時期（抗原曝露後数日～2週間）に着目し、短期間に複数の血液サンプルを採取したこと、及び、第二に、「標的抗原に結合するBCR配列のデータベース」を用いて「BCRレパトアデータ」の解析を行ったことにより、BCRレパトアによるワクチン接種の反応を、固体別に明らかにすることに初めて成功した。
　また、SARS-CoV-2特異的な配列の特徴を、本実施例による結果および公開データベースから調査した。SARS-CoV-2特異的な配列には、IGHV4-59及び短いCDR3アミノ酸が頻繁に含まれていた。これらの配列は、本実施例の結果でも、複数の個人とパンデミック後のサンプルで最も頻繁に検出されたが、一部は、はるかに低い頻度ではあるが、2019年パンデミック前のサンプルでも検出された。IGHV4-59の配列はIGKV3-20/IGKJ1の軽鎖とペアを形成し、中和活性は報告されていない。また、パブリックIGHV4-59/IGKV3抗体がS2ドメインに結合してSARS-CoV-1と交差反応すると論じた報告もある。この配列には幅広いコロナウイルス株と反応する可能性を持っている。既知のSARS-CoV-2特異的配列は、CDR3配列が短く、pGen値が高いことが特徴である。感染やワクチン接種後に既知のSARS-CoV-2特異的配列の中でpGen値の高い配列が大きく増加することから、未知のCOVID-19抗原に曝露した際の初期免疫応答は、より豊富な共通のSARS-CoV-2特異的配列によってなされることが多いと考えられる。本実施例の方法によれば、あらゆる個体における豊富な高pGen値の既知のSARS-CoV-2特異的配列を利用して、初期感染免疫応答を確実に検出することができる。
　ワクチン反応をELISAによる抗体価の測定により評価する従来の方法と比較すると、本実施例の方法には次の利点がある。
　まず、従来の方法で測定対象となる抗体は半減期が長いため、産生されてから数ヶ月間、血中に留まる。一方、本発明の測定対象となるmRNAの活性は短命であるため、SARS-CoV-2のワクチン接種、感染、抗体治療などの影響を受けず、都度活性をモニターすることが可能である。
　また、従来の方法では、体液性免疫としてB細胞が活性化し、抗体が血清中に検出可能なレベルまで増加するまでにタイムラグがあるが、本実施例の方法では、体液性免疫反応におけるB細胞の活性をリアルタイムで直接見ることができる。これらの特徴により、本実施例の方法は、一次および二次応答を含む体液性免疫を正確に評価することができる。本実施例によれば、一次免疫反応として、初回ワクチン接種または感染による初回曝露から約2週間後にB細胞が活性化された。さらに、二次免疫反応として、ブースターワクチン接種後1週間程度でB細胞が活性化された。
　また、従来法の血清学的検査では、感染後に誘導される個々の特異的な抗体を評価することができないことに対し、本実施例の方法は、個々の抗体に関する有用な情報を提供することができる。例えば、本実施例の方法によれば、中和/非中和活性を持つ複数の抗体の特徴について有用な情報を得ることができる。中和抗体配列の出現頻度は検体によって異なり、感染者の免疫防御の指標となることが期待される。また、非中和活性を有する抗体の出現が感染症患者の感染症の重症度と関連していることから、非中和抗体の検出も注目すべき指標である。近年、感染後やワクチンのB細胞応答を評価する方法として、R-848とIL-2で刺激したヒトIgG分泌B細胞をin vitroで測定するELISpotアッセイが開発されているが、このようなELISpotアッセイはリアルタイムでの免疫応答の報告や付加情報を提供することができない。
　本実施例の方法の有用性は、抗体医薬投与後のワクチン反応の確認に限定されるものではなく、例えば、造血幹細胞移植後の免疫再構築の程度を推定するために有用であることが推認できる。造血幹細胞移植後の免疫再構築は、総リンパ球数、リンパ球サブセット解析、サイトカインプロファイル解析によって評価されているが、これらのアッセイは正確なバイオマーカーではない。一般に、ほぼ全ての造血幹細胞移植患者は、移植後3-6ヶ月でmRNA SARS-CoV-2ワクチン接種を受ける。本実施例の方法は、先行感染、ワクチン接種、抗体治療の影響を受けずに、ワクチン接種のタイミングで液性免疫の再構成を評価することが可能である。また、本実施例の方法は、B細胞枯渇療法後の体液性免疫の再構成を評価するために使用することができる。
　以上、SARS-CoV-2ワクチン接種に対する反応を評価するために、CoV-AbDabを用いたBCRレパトア解析により抗原特異的抗体配列を定量化できることが証明された。本実施例によれば、チキサゲビマブ/シルガビマブ投与後もmRNA SARS-CoV-2ワクチン接種に対する反応性があることが明らかになった。本実施例の方法は、抗原抗体反応分野における疾患メカニズムの解明や治療薬の開発に応用できる。
［試験例２］
　CoV-AbDab内のBCR/抗体配列には、株（変異株及びバリアント）に関する情報が紐づけられている。健常ボランティア１～３のBCRレパトアについて、SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの接種直前及び接種後７日，１４日でのデータベースと一致する配列（CDR3のアミノ酸差が0のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列、及び1以下のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列）について試験例１と同様にして解析を行い、ワクチンにより産生される抗体が結合する株（変異株及びオミクロン株のバリアント）を特定した。結果を図１７Ａ～図１７Ｃに示す。
　図１７Ａ～図１７Ｃに示すように、ワクチンにより産生される抗体が結合する株（変異株及びオミクロン株のバリアント）を特定が可能であった。本試験例で用いられたワクチンに代えて、新たな変異株又はバリアントを標的として設計開発した新たなワクチンを用いて同様に解析すれば、当該新たなワクチンが公知の変異株又はバリアントに結合するか否かの機能評価にも用いることができる。
［試験例３］
　同一被験者にSARS-CoV-2に対するmRNAワクチンを複数回接種した。1回目、2回目は起源株ワクチンを、5回目は起源株及びBA.4/5の2価ワクチンを、6回目にオミクロンXBBワクチンを接種した。１回目接種直前、１回目接種後７日，１４日、２回目接種直前（１回目接種後２１日）、２回目接種後３日，７日（１回目接種後２４日，２８日）、５回目接種直前、５回目接種後３日，７日、６回目接種直前、及び６回目接種後７日，１２日でのBCRレパトアにおいて、データベースと一致する配列について試験例１と同様にして解析を行い、ワクチンにより産生される抗体が結合する株（変異株及びオミクロン株のバリアント）を特定した。結果を図１８に示す。
　図１８に示すように、それぞれのワクチン接種後に、一致する配列の増大が認められた。結合可能な変異株毎に解析を行うと、オミクロンXBBワクチン(６回目)接種後に、オミクロン株に結合可能な抗体配列の数が増大（図中、「Strains」における実線矢印で示される増大）し、且つ、オミクロン株のXBBバリアントに結合可能な抗体配列の数が増大（図中、「Omicron sublineages」における実線矢印で示される増大）していることが明らかになった。これにより、接種したオミクロンXBBワクチンの科学的妥当性（標的抗原の株（具体的には、変異株・バリアント）の種類に対する妥当性）が確認できた。
　また、図１８に示すように、起源株ワクチンの接種によっても、その後に出現するオミクロン株に結合可能な抗体配列の数が増大（図中、「Strains」における点線矢印で示される増大）し、且つ、オミクロン株のXBBバリアントに結合可能な抗体配列の数が増大（図中、「Omicron sublineages」における点線矢印で示される増大）していたことも明らかになった。これにより、過去に接種したワクチンが、その後に出現する株（変異株又はバリアント）に結合可能な抗体も産生できていたことを確認できた。つまり、過去のワクチンの有効性が、その後に初めて出現する変異株にもある程度当てはまることの確認ができた。さらに、起源株ワクチンを接種した場合よりも、オミクロンXBBワクチンを接種した場合の方が、オミクロン株XBBバリアントについて一致する配列の数が多いことから、オミクロンXBBワクチンの方がオミクロン株XBBバリアントに対する有効性が高いことも確認できた。
［試験例４］
　ワクチンの標的であるスパイク蛋白はS1及びS2部分から構成されており、感染にはS1内のRBD領域が重要であることが知られている。BNT-162b2(ファイザー)、mRNA-1273(モデルナ)は、SARS-CoV-2のS1及びS2のスパイク蛋白全体を標的にするmRNAワクチンである一方、2024年日本で承認されたMAFB-7256a（第一三共ワクチン）は、RBDに対するmRNAワクチンである。CoV-AbDab内のBCR/抗体配列にはエピトープに関する情報が紐づけられている。ワクチン接種直前及びワクチン接種後７日，１４日でのBCRレパトアについて、データベースと一致する配列について試験例１と同様に解析し、エピトープの特定を行った。結果を図１９に示す。図１９中、実線矢印は、エピトープがRBD（BNT-162b2、MAFB-7256aの標的）である配列を示し、点線矢印はエピトープがＳ２（BNT-162b2の標的）である配列を示し、破線矢印はエピトープが他の部位（RBDの可能性もある部位）である配列を示す。
　図１９に示す通り、BNT162b2の接種後７日目に増大した一致する配列は、S1、RBD、S2等の、スパイク蛋白の様々な領域に対するものであった一方、MAFB-7256aの接種後７日目に増大した配列は、RBDに対するものであった。従って、mRNAワクチンの科学的妥当性（標的エピトープの種類に対する妥当性）が確認できた。
［試験例５］
［１］感染、ワクチン初回接種、又はワクチンブースター接種による免疫細胞のクローン性増殖の時期
　感染による特定の抗原（SARS-CoV-2）の暴露、ワクチンの初回接種による特定の抗原（SARS-CoV-2に対するワクチン）の暴露、及びワクチンの２回目以降の接種（ブースター接種）による特定の抗原（SARS-CoV-2に対する様々なワクチン）の暴露それぞれについて、BCRレパトア中のデータベースと一致する配列（CDR3のアミノ酸差が0のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列、及び1以下のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列）を、時系列で、試験例１と同様に解析した。結果を図２０Ａ（感染又は初回接種による一次反応）及び図２０Ｂ（ブースター接種による二次以降反応）に示す。
［２］がん免疫療法による免疫細胞のクローン性増殖の時期
　B細胞のサブセット分類を行い、抗体産生に繋がる活性化B細胞(CD21lowB細胞、クラススイッチB細胞、プラズマブラスト、形質細胞)が、同様のタイミングで増加していることの確認を行った。
　図２１Ａ（B細胞のサブセット分類の説明）に示す通り、抗体産生に繋がる活性化B細胞(CD21lowB細胞、クラススイッチB細胞、プラズマブラスト、形質細胞)を解析した。図２１Ｂ及び図２１Ｃに示す通り、がん免疫療法（追加免疫）後、7日で活性化B細胞が増加することを確認した。図２１Ｄに示す通り、がん免疫療法（追加免疫）後、7日で活性化B細胞が増加し、さらにirAE(副作用：免疫チェックポイント阻害剤投与後の自己免疫疾患)を発症した症例（具体的には、patient1,2,6,10,11）で、より大きな増加を認めた。
［３］結果
　図２０Ａに示すように、感染又はワクチン初回接種後においては、BCRレパトア中のデータベースと一致する配列は２週間程度で増大し、図２０Ｂに示すように、ブースター接種後においては、BCRレパトア中のデータベースと一致する配列は１週間程度で増大した。また、図２１Ｂ、図２１Ｄに示すように、がん免疫療法（追加免疫）後においても、活性化B細胞は１週間程度で増大した。つまり、免疫細胞のクローン性増殖の時期は、共通して、免疫反応の一次反応の場合には抗原刺激後２週間程度、免疫反応の二次反応の場合には抗原刺激後１週間程度であることが確認できた。
［試験例６］
　造血幹細胞移植後の患者１～３へのワクチン接種による免疫反応を評価した。図２２Ａ及び図２２Ｂに、患者１～３の背景及び解析結果を示す。
　患者１は、SARS-CoV-2の１度の感染後に造血幹細胞移植を受け、その後、SARS-CoV-2に対するワクチン（特定の抗原）を接種した。患者２は、SARS-CoV-2の２度の感染後に造血幹細胞移植を受け、その後、SARS-CoV-2に対するワクチン（特定の抗原）を接種した。患者３は、SARS-CoV-2の２度の感染後に造血幹細胞移植を受け、その後、SARS-CoV-2の３度の感染を経て、SARS-CoV-2に対するワクチン（特定の抗原）を接種した。図２２Ａ及び図２２Ｂ中の「*」の時点で採取した検体から得られたBCRレパトアにおいて、データベースと一致する配列（CDR3のアミノ酸差が0のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列、及び1以下のレーベンシュタイン距離を持つ抗体配列）を、試験例１と同様に解析した。
　図２２Ａに示すように、造血幹細胞移植前の抗原刺激及びその回数に関わらず、造血幹細胞移植後１回目の抗原刺激（ワクチン接種）により、当該１回目の抗原刺激から２週間で、一致する配列が増大した。また、図２２Ｂに示すように、造血幹細胞移植前の抗原刺激に関わらず、造血幹細胞移植後２回目以降の抗原刺激（ワクチン接種）により、当該２回目以降の抗原刺激から１週間で、一致する配列が増大した。つまり、造血幹細胞移植前の抗原刺激により獲得した免疫が、造血幹細胞移植によりリセットされていることも確認できた。このため、造血幹細胞移植後の抗原刺激による免疫細胞のクローン性増殖（一致する配列の増大）のタイミングにより、解析対象の免疫反応が、造血幹細胞移植後の１回目の抗原刺激及び２回以降の抗原刺激のいずれによるものかの判断もできる。つまり、当該タイミングが造血幹細胞移植後の抗原刺激から約２週間後であれば、解析対象の免疫反応が、造血幹細胞移植後の１回目の抗原刺激によるものと判断でき、当該タイミングが造血幹細胞移植後の抗原刺激から約１週間後であれば、解析対象の免疫反応が、造血幹細胞移植後の２回目以降の抗原刺激によるものと判断できる。
［試験例７］
　論文からの引用により、インフルエンザHA抗原に結合可能なＢ細胞レセプターの抗原認識部位の約1300配列を独自に収集し、データベースを作成した。このデータベースを用い、インフルエンザ不活化ワクチン接種後における免疫反応（被験者はインフルエンザに既感染であるため、当該ワクチン接種による免疫反応は二次以降反応である。）BCRレパトアの解析を行った結果、図２３Ａに示す通り、一致する配列が接種１週間後に増大（インフルエンザHA抗原の刺激による免疫反応）を確認できた。さらに、図２３Ｂに示すin vitro実験により配列を収集し、このデータベースをさらに拡充した。配列収集を継続することによりさらに拡充されるデータベースは、同様に、当該免疫反応の評価に用いることができる。

Claims (27)

  1. 　被験者の検体から取得した、免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むレパトアデータを用意する工程Ａと、
    　特定の抗原に対する免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むデータベースと、前記レパトアデータとを照合し、前記レパトアデータの中から、前記データベースに含まれる前記配列とアミノ酸配列レベルで同一又は２個以下のアミノ酸残基以外の部分で同一である配列を検出する工程Ｂと、を含む、免疫反応の評価方法。
  2. 　前記工程Ｂにより検出される配列の、前記レパトアデータにおける数及び／又は頻度を導出する工程Ｃをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記数及び／又は頻度の経時変化を確認する工程Ｄをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記工程Ｄにおいて、前記経時変化として増大が認められた時期が、前記特定の抗原による刺激後１１～２０日及び３～１０日のいずれに該当するかを確認する、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記被験者が、前記特定の抗原の暴露を受けた被験者である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記特定の抗原の暴露がワクチンの接種である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記ワクチンが核酸ワクチンである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記ワクチンがコロナウイルスワクチン又はインフルエンザワクチンである、請求項６に記載の方法。
  9. 　前記数及び／又は頻度の経時変化として増大が確認された前記配列について、前記データベースに収載された付加情報を確認することで、前記核酸ワクチンの科学的妥当性を評価する工程Ｅをさらに含み、
    　前記付加情報が、［１］抗原に対する中和活性の有無の情報、［２］抗原の種又は株の情報、及び［３］エピトープの情報からなる群より選択され、
    　前記科学的妥当性の評価が、［１］前記中和活性が有ることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが中和活性を持つ抗体を産生する臨床的有効性を持つと評価すること、［２］前記種又は前記株が、前記核酸ワクチンの設計上の標的抗原の種又は株と同じであることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが前記標的抗原に適合していると評価すること、及び［３］前記エピトープが、前記核酸ワクチンの設計上の標的エピトープと同じであることを確認した場合に、前記核酸ワクチンが前記標的エピトープに適合していると評価すること、からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
  10. 　前記数及び／又は頻度の経時変化として増大が確認された前記配列が、前記データベースに含まれる前記配列とアミノ酸配列レベルで同一である場合に、前記核酸ワクチンの科学的妥当性として、感染による獲得免疫による抗体と抗原認識部位が完全一致する抗体の産生能を有すると評価する工程Ｅ’をさらに含む、請求項７に記載の方法。
  11. 　前記特定の抗原の暴露が感染である、請求項５に記載の方法。
  12. 　前記特定の抗原がコロナウイルス又はインフルエンザウイルスである、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記被験者が、抗体薬を投与された、ワクチンを接種された、並びに／若しくは、感染を受けた被験者であり、
    　前記抗体薬、前記ワクチン、及び前記感染の病原体が、前記特定の抗原の暴露により生じる抗体とは異なる他の抗体を前記被験者の体内に保有させる、請求項５に記載の方法。
  14. 　前記特定の抗原がワクチンであり、
    　前記数及び／又は頻度が経時的に増大する場合に、前記ワクチンが機能すると判断する工程Ｆをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記検体が、前記特定の抗原に対する免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期に採取されたものである、請求項５に記載の方法。
  16. 　前記活性化時期が、前記暴露後１１～２０日又は３～１０日である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記被験者ががん免疫療法を受けた被験者である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  18. 　前記検体が、前記特定の抗原に対する免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期に採取されたものである、請求項１６に記載の方法。
  19. 　前記活性化時期が、前記がん免疫療法後１１～２０日又は３～１０日である、請求項１７に記載の方法。
  20. 　前記被験者が、免疫抑制処置を受けた被験者である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  21. 　前記免疫抑制処置が、造血幹細胞移植又はＢ細胞枯渇療法の投与である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記免疫抑制処置が、造血幹細胞移植又はＢ細胞枯渇療法であり、前記数及び／又は頻度の経時変化が増大したか否かに基づいて、免疫機能の回復の有無を判定する工程Ｇをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 　前記被験者が自己免疫疾患患者である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  24. 　前記レパトアデータが、過去に出現したウイルス株ＳＴ１に対するワクチンの接種を受けた被験者の検体から取得したものであり、
    　前記特定の抗原が、前記ワクチンによる有効性が未知であるウイルス株ＳＴ２であり、
    　前記検出される配列が存在する場合に、前記ワクチンが前記ウイルス株ＳＴ２にも有効と評価する工程Ｈをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  25. 　前記データベースが、前記特定の抗原による免疫反応が起きた調査対象からなる集団から収集した、前記特定の抗原に対する前記免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列を含み、以下の工程により得られるものである、請求項１に記載の方法：
    　　前記調査対象それぞれの検体から、前記免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列の群を含むレパトアデータであって、前記特定の抗原に対する免疫細胞レセプターのmRNAの活性化時期Ｔex、前記活性化時期の前Ｔbf、及び前記活性化時期の後Ｔafにおけるレパトアデータを時系列で取得する工程、及び
    　　前記活性化時期Ｔexにおいて増殖が認められる免疫細胞レセプターの抗原認識部位の配列を、前記データベースに収集すべき情報として選定する工程。
  26. 　活性化時期Ｔexが、前記特定の抗原による刺激後１１～２０日又は３～１０日である、請求項２５に記載の方法。
  27. 　前記免疫細胞が、Ｔ細胞又はＢ細胞である、請求項１に記載の方法。
PCT/JP2024/021195 2023-06-12 2024-06-11 免疫反応の評価方法 Pending WO2024257764A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2025527941A JPWO2024257764A1 (ja) 2023-06-12 2024-06-11

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023-096200 2023-06-12
JP2023096200 2023-06-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024257764A1 true WO2024257764A1 (ja) 2024-12-19

Family

ID=93851993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/021195 Pending WO2024257764A1 (ja) 2023-06-12 2024-06-11 免疫反応の評価方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2024257764A1 (ja)
WO (1) WO2024257764A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013524848A (ja) * 2010-05-06 2013-06-20 シーケンタ インコーポレイテッド クロノタイププロファイルを用いた健康状態および疾患状態のモニタリング
WO2022270631A1 (ja) * 2021-06-25 2022-12-29 Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社 Ｔ細胞エピトープ配列を同定する方法およびその応用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013524848A (ja) * 2010-05-06 2013-06-20 シーケンタ インコーポレイテッド クロノタイププロファイルを用いた健康状態および疾患状態のモニタリング
WO2022270631A1 (ja) * 2021-06-25 2022-12-29 Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社 Ｔ細胞エピトープ配列を同定する方法およびその応用

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS YOHEI, YAKUSHIJIN KIMIKAZU, OHJI GOH, MATSUTANI TAKAJI, HOJO WATARU, SAKAI HIRONORI, MATSUMOTO SAKUYA, WATANABE MARIKA, : " Response to mRNA SARS-CoV-2 vaccination evaluated by B-cell receptor repertoire after tixagevimab/cilgavimab administration", BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, JOHN WILEY, HOBOKEN, USA, vol. 202, no. 3, 1 August 2023 (2023-08-01), Hoboken, USA, pages 504 - 516, XP093247834, ISSN: 0007-1048, DOI: 10.1111/bjh.18932 *
BAHREMAND TYAO JAMILL CPISZCZEK JGRANT JMSMOLINA K.: "COVID-19 hospitalisations in immunocompromised individuals in the Omicron era: a population-based observational study using surveillance data in British Columbia, Canada.", LANCET REG HEALTH AM., vol. 20, 2023, pages 100461
BIOINFORMATICS., vol. 35, no. 17, 2019, pages 2974 - 2981
DAVIS JAGRANGER KROUBAL K ET AL.: "Efficacy of tixagevimab-cilgavimab in preventing SARS-CoV-2 for patients with B-cell malignancies.", BLOOD., vol. 141, no. 2, 2023, pages 200 - 203
DHAKAL BABEDIN SFENSKE T ET AL.: "Response to SARS-CoV-2 vaccination in patients after hematopoietic cell transplantation and CAR T-cell therapy.", BLOOD., vol. 138, no. 14, 2021, pages 1278 - 1281
EINARSDOTTIR SMARTNER ANICKLASSON M ET AL.: "Reduced immunogenicity of a third COVID-19 vaccination among recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.", HAEMATOLOGICA., vol. 107, no. 6, 2022, pages 1479 - 1482
FUNAKOSHI YOHEI, OHJI GOH, YAKUSHIJIN KIMIKAZU, EBISAWA KEI, ARAKAWA YU, SAEGUSA JUN, MATSUMOTO HISAYUKI, IMANISHI TAKAMITSU, FUKU: "Massive surge of mRNA expression of clonal B-cell receptor in patients with COVID-19", HELIYON, ELSEVIER LTD, GB, vol. 7, no. 8, 1 August 2021 (2021-08-01), GB , pages e07748, XP093247821, ISSN: 2405-8440, DOI: 10.1016/j.heliyon.2021.e07748 *
FUNAKOSHI YYAKUSHIJIN KOHJI G ET AL.: "Limited increase in antibody titers following mRNA SARS-CoV-2 vaccination for more than 3 years after final dose of anti-CD20 antibody.", INT J HEMATOL., vol. 115, no. 1, 2022, pages 7 - 10
FUNAKOSHI YYAKUSHIJIN KOHJI G ET AL.: "Safety and immunogenicity of the COVID-19 vaccine BNT162b2 in patients undergoing chemotherapy for solid cancer.", J INFECT CHEMOTHER., vol. 28, no. 4, 2022, pages 516 - 520
IMAI MITO MKISO M ET AL.: "Efficacy of Antiviral Agents against Omicron Subvariants BQ.1.1 and XBB.", N ENGL J MED., vol. 388, no. 1, 2023, pages 89 - 91
JONDREVILLE LD'AVENI MLABUSSIERE-WALLET H ET AL.: "Pre-exposure prophylaxis with tixagevimab/cilgavimab (AZD7442) prevents severe SARS-CoV-2 infection in recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation during the Omicron wave: a multicentric retrospective study of SFGM-TC.", J HEMATOL ONCOL., vol. 15, no. 1, 2022, pages 169
JUNG KSHIN SNAM M ET AL.: "Performance evaluation of three automated quantitative immunoassays and their correlation with a surrogate virus neutralization test in coronavirus disease 19 patients and pre-pandemic controls.", J CLIN LAB ANAL., vol. 35, no. 9, 2021, pages e23921
KITAURA KYAMASHITA HAYABE HSHINI TMATSUTANI TSUZUKI R: "Different Somatic Hypermutation Levels among Antibody Subclasses Disclosed by a New Next-Generation Sequencing-Based Antibody Repertoire Analysis", FRONT IMMUNOL., vol. 8, 2017, pages 389
KOTAGIRI PRASANTI, MESCIA FEDERICA, RAE WILLIAM M., BERGAMASCHI LAURA, TUONG ZEWEN K., TURNER LORINDA, HUNTER KELVIN, GERBER PEHUÉ: "B cell receptor repertoire kinetics after SARS-CoV-2 infection and vaccination", CELL REPORTS, ELSEVIER INC, US, vol. 38, no. 7, 1 February 2022 (2022-02-01), US , pages 110393, XP093247825, ISSN: 2211-1247, DOI: 10.1016/j.celrep.2022.110393 *
LEVIN MJUSTIANOWSKI ADE WIT S ET AL.: "Intramuscular AZD7442 (Tixagevimab-Cilgavimab) for Prevention of Covid-19.", N ENGL J MED., vol. 386, no. 23, 2022, pages 2188 - 2200
MALAHE SRKHOEK RASDALM V ET AL.: "Clinical Characteristics and Outcomes of Immunocompromised Patients With Coronavirus Disease 2019 Caused by the Omicron Variant: A Prospective", OBSERVATIONAL STUDY. CLIN INFECT DIS, vol. 76, no. 3, 2023, pages 172 - 178
MASSARWEH AELIAKIM-RAZ NSTEMMER A ET AL.: "Evaluation of Seropositivity Following BNT162b2 Messenger RNA Vaccination for SARS-CoV-2 in Patients Undergoing Treatment for Cancer.", JAMA ONCOL., vol. 7, no. 8, 2021, pages 1133 - 1140
SATO, Kayoko et al. Evaluation of immune responses induced by influenza vaccines using anti body repertoire analysis. 日本免疫学会総会・学術集会記録, 2021, 2-C-WS14-13-P, (Proceedings of the Japanese Society for Immunology) entire text, see abstract *
STUVER RSHAH GLKORDE NS ET AL.: "Activity of AZD7442 (tixagevimab-cilgavimab) against Omicron SARS-CoV-2 in patients with hematologic malignancies.", CANCER CELL, vol. 40, no. 6, 2022, pages 590 - 591
TAENAKA ROBARA TKOHNO KAOKI KOGAWA R.: "Infections with the SARS-CoV-2 Omicron variant show a similar outcome as infections with the previous variants in patients with hematologic malignancies.", ANN HEMATOL., vol. 101, no. 8, 2022, pages 1877 - 1878
TAN JYWEE LETAN YH ET AL.: "Favorable outcomes of COVID-19 in vaccinated hematopoietic stem cell transplant recipients: A single-center experience.", TRANSPL INFECT DIS., 2023, pages e14024
VIJENTHIRA AGONG IYFOX TA ET AL.: "Outcomes of patients with hematologic malignancies and COVID-19: a systematic review and meta-analysis of 3377 patients.", BLOOD., vol. 136, no. 25, 2020, pages 2881 - 2892
WATANABE MYAKUSHIJIN KFUNAKOSHI Y ET AL.: "The Safety and Immunogenicity of the BNT162b2 mRNA COVID-19 Vaccine in Japanese Patients after Allogeneic Stem Cell Transplantation.", VACCINES (BASEL)., vol. 2, 2022, pages 10
XHAARD AXHAARD CD'AVENI M ET AL.: "Risk factors for a severe form of COVID-19 after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation: a Societe Francophone de Greffe de Moelle et de Therapie cellulaire (SFGM-TC) multicentre cohort study", BR J HAEMATOL., vol. 192, no. 5, 2021, pages e121 - e124

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2024257764A1 (ja) 2024-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sureshchandra et al. Single-cell profiling of T and B cell repertoires following SARS-CoV-2 mRNA vaccine
Uzzan et al. Ulcerative colitis is characterized by a plasmablast-skewed humoral response associated with disease activity
Elyanow et al. T cell receptor sequencing identifies prior SARS-CoV-2 infection and correlates with neutralizing antibodies and disease severity
JP7430136B2 (ja) 疲弊したｔ細胞に関連する疾患を治療するための方法および組成物
Mysore et al. Protective heterologous T cell immunity in COVID-19 induced by the trivalent MMR and Tdap vaccine antigens
Kuri-Cervantes et al. Immunologic perturbations in severe COVID-19/SARS-CoV-2 infection
Zheng et al. TCR repertoire and CDR3 motif analyses depict the role of αβ T cells in Ankylosing spondylitis
Dalai et al. Clinical validation of a novel T-cell receptor sequencing assay for identification of recent or prior severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 infection
Malipiero et al. Assessment of humoral and cellular immunity induced by the BNT162b2 SARS-CoV-2 vaccine in healthcare workers, elderly people, and immunosuppressed patients with autoimmune disease
Strauli et al. Statistical inference of a convergent antibody repertoire response to influenza vaccine
Tian et al. Dengue-specific CD8+ T cell subsets display specialized transcriptomic and TCR profiles
Chaisawangwong et al. Cross-reactivity of SARS-CoV-2–and influenza A–specific T cells in individuals exposed to SARS-CoV-2
Satti et al. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis
Hellgren et al. Modulation of innate immune response to mRNA vaccination after SARS-CoV-2 infection or sequential vaccination in humans
Staub et al. Case series of four re-infections with a SARS-CoV-2 B. 1.351 variant, Luxembourg, February 2021
Ozer et al. Coincident rapid expansion of two SARS-CoV-2 lineages with enhanced infectivity in Nigeria
Rha et al. SARS-CoV-2 spike-specific nasal-resident CD49a+ CD8+ memory T cells exert immediate effector functions with enhanced IFN-γ production
Lee et al. Robust immune response to the BNT162b mRNA vaccine in an elderly population vaccinated 15 months after recovery from COVID-19
Mayer-Blackwell et al. mRNA vaccination boosts S-specific T cell memory and promotes expansion of CD45RAint TEMRA-like CD8+ T cells in COVID-19 recovered individuals
WO2022049600A1 (en) Methods for assessing t cell-specific immune response against sars-cov-2, and implementations thereof
Thompson et al. Heterologous versus homologous boosting elicits qualitatively distinct, BA. 5–cross-reactive T cells in transplant recipients
Gittelman et al. Diagnosis and tracking of SARS-CoV-2 infection by T-cell receptor sequencing
Kenfack et al. Comparative evaluation of SARS-CoV-2 serological tests shows significant variability in performance across different years of infection and between the tests
CA3013119A1 (en) Tb biomarkers
WO2024257764A1 (ja) 免疫反応の評価方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24823379

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2025527941

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2025527941

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024823379

Country of ref document: EP

Effective date: 20260112

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024823379

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024823379

Country of ref document: EP

Effective date: 20260112

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024823379

Country of ref document: EP

Effective date: 20260112

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024823379

Country of ref document: EP

Effective date: 20260112

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024823379

Country of ref document: EP

Effective date: 20260112