WO2024257843A1 - ジンクフィンガータンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ベクター並びにこれらを用いたゲノム編集方法 - Google Patents

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding

Definitions

  • the present disclosure relates to zinc finger proteins, zinc finger nucleases, vectors, and genome editing methods using these. More specifically, the disclosure relates to zinc finger proteins having three or more nuclear localization signals added to the N-terminus.
  • Zinc finger nuclease consists of FokI-ND, a nucleic acid cleavage domain, zinc finger protein (ZFP), a nucleic acid binding domain, and a linker connecting them.
  • Patent Document 1 discloses ZFN that contains nucleic acid cleavage domains called nuclease domain 1 (ND1) and nuclease domain 2 (ND2) instead of FokI-ND.
  • ND1 is said to be a nuclease domain derived from Bacillus SGD-V-76
  • ND2 is said to be a nuclease domain derived from Clostridium botulinum.
  • ND1 and ND2 are said to be superior to the conventional FokI-ND in terms of functionality such as cleavage activity, specificity, and target sequence selectivity.
  • Non-Patent Document 1 reports that genome editing efficiency is improved in cultured cells (dividing cells) by adding multiple nuclear localization signals (NLS) to ZF-FokI-ND.
  • Non-Patent Document 2 reports that adding one NLS each to the N-terminus and C-terminus of Cas nuclease enables efficient implementation of the HITI (Homology-independent Targeted Integration) method in non-dividing cells.
  • HITI Homology-independent Targeted Integration
  • the primary objective of this disclosure is to provide technology that can be used to improve the efficiency of genome editing using ZFNs, particularly in non-dividing cells.
  • the present disclosure provides the following [1] to [13].
  • ZFP Zinc finger protein
  • NLS nuclear localization signals
  • a zinc finger nuclease comprising any one of the ZFPs [1] to [4] and a nucleic acid cleavage domain.
  • the ZFN of [6] wherein the nucleic acid cleavage domain is ND1.
  • the nucleic acid cleavage domain comprises: The amino acid sequence of positions 391 to 585 of SEQ ID NO:9; The amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or The amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, The ZFN of [7], comprising:
  • a genome editing method comprising the step of introducing the vector of [9] into a cell.
  • the genome editing method of [10] which is an in vitro method.
  • the genome editing method of [10] or [11], wherein the cell is a non-dividing cell.
  • the method according to [12], wherein the non-dividing cells are photoreceptor cells.
  • the present disclosure provides techniques that can be used to improve the efficiency of genome editing using ZFNs, particularly in non-dividing cells.
  • the upstream sequence of the start codon of exon 1 of the mouse Rho gene and the recognition sequence of ZFP (ZF-5057S, ZF5057AS) contained in ZF-ND1 expressed by the ZF-ND1 expression vector are shown.
  • the structure of the ZF-ND1 expression vector (pRho2k-ZF-ND1DDD, pRho2k-ZF-ND1RRR) is shown.
  • the configuration of the donor gene vector (mRho-ZF-HITI-Donor) is shown.
  • the top panel shows a fluorescent image of retinal tissue (eyecup) harvested on P21 after a fluorescent protein (AcGFP) gene was introduced into the rhodopsin locus of rod photoreceptors in a mouse retina immediately after birth (P0-2).
  • the bottom panel shows a fluorescent stained image of the retinal tissue using an anti-GFP antibody. Green indicates AcGFP fluorescence, and red indicates the fluorescence of the positive control mCherry.
  • the ZFP according to the present disclosure comprises a nucleic acid binding domain and has three or more nuclear localization signals (NLS) at the N-terminus of the nucleic acid binding domain.
  • the ZFP according to the present disclosure has three or more NLSs at the N-terminus, and can be combined with an effector domain to show improved genome editing efficiency.
  • the improved genome editing efficiency can be achieved particularly in non-dividing cells.
  • the nucleic acid binding domain of the ZFP disclosed herein comprises a zinc finger array that recognizes a specific nucleic acid sequence.
  • the zinc finger array is composed of multiple zinc fingers (ZFs) that recognize a three-base sequence.
  • the zinc finger array may include two or more ZFs, for example, 3-9, preferably 4-8, more preferably 5-7, typically 6 ZFs.
  • the nucleic acid sequence recognized by the zinc finger array can be appropriately set depending on the nucleic acid sequence of the target nucleic acid strand to be subjected to genome editing and the nucleic acid sequence of the editing target site in the target nucleic acid strand.
  • the relationship between the amino acid sequence of the ZF and the three-base sequence recognized by the ZF is publicly known, and the amino acid sequence of the ZF can be, for example, the amino acid sequence described in Supplementary Table 1 of Non-Patent Document 1 depending on the three-base sequence to be recognized. Since there are multiple amino acid sequences of ZFs that recognize the same three-base sequence, these ZFs that recognize the same three-base sequence can be used interchangeably.
  • a ZFP of the present disclosure may have three or more NLSs, preferably 3-5, and particularly 3 or 5 NLSs.
  • the NLS possessed by the ZFP of the present disclosure can be any conventionally known NLS, such as the SV40 T antigen NLS (PKKKRKV: SEQ ID NO: 6), c-myc NLS (PAAKRVKLD: SEQ ID NO: 7), Nucleoplasmin NLS (KRXXXXXXXXXXKKKLD: SEQ ID NO: 8, where X represents any amino acid), and NLSs having amino acid sequences derived from these sequences, without any particular limitation.
  • the NLS is preferably the SV40 T antigen NLS or the c-myc NLS, more preferably the SV40 T antigen NLS and the c-myc NLS.
  • the NLSs are the SV40 T antigen NLS and the c-myc NLS, they may be arranged alternately, and in particular, the three NLSs may be arranged in the order of "SV40 T antigen NLS, c-myc NLS, SV40 T antigen NLS.”
  • Each NLS may be directly linked or linked by a peptide linker.
  • the amino acid sequence of the peptide linker is arbitrary, but can be, for example, AAA and GSG.
  • the effector domain to which the ZFP of the present disclosure is bound may be, but is not limited to, a nucleic acid cleavage domain.
  • Other effector domains include cytosine base editors (UGI, APOBEC), adenine base editors (TadA), transcriptional activators (VP16)/repressors (SID), epigenomic editors (DNMT3A, TET1), imaging proteins (Dye, fluorescent proteins), transposases (PiggyBac), recombinases (Flippase), and the like.
  • the effector domain may be one that functions alone (monomeric type) or one that functions as a polymer (split type).
  • the ZFP and the effector domain may be linked directly or via a linker.
  • the linker may, for example, consist of two or more amino acid residues and may be, for example, 2 to 20 amino acids long, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, or 20 amino acids long, although the length is not particularly limited.
  • the type of linker is also not particularly limited, but an example of the linker is TGGS (SEQ ID NO: 13). The presence or absence of a linker and the length and type of the linker are appropriately selected by those skilled in the art, taking into consideration the type of effector domain, etc.
  • the ZFP of the present disclosure is preferably combined with a nucleic acid cleavage domain to form a zinc finger nuclease (ZFN).
  • ZFN of the present disclosure recognizes and binds to a specific nucleic acid sequence with a zinc finger array, resulting in a DNA double-strand break (DSB) by the nucleic acid cleavage domain.
  • DSB DNA double-strand break
  • the nucleic acid cleavage domain is not particularly limited, and may be FokI-ND, ND1 and ND2 described in Patent Document 2, or modified versions thereof.
  • the amino acid sequence of a full-length protein (derived from Bacillus SGD-V-76) containing ND1 is shown in SEQ ID NO: 9, and its nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence of a full-length protein (derived from Clostridium botulinum) containing ND2 is shown in SEQ ID NO: 11, and its nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • ND1 is typically a partial peptide corresponding to positions 391 to 585 of SEQ ID NO: 9
  • ND2 is typically a partial peptide corresponding to positions 389 to 579 of SEQ ID NO: 11.
  • the nucleic acid cleavage domain is preferably ND1.
  • the ND1 and ND2 variants may be polypeptides comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in positions 391 to 585 of SEQ ID NO: 9 or positions 389 to 579 of SEQ ID NO: 11, and having nuclease activity.
  • “one or several” means, for example, 1 to 10, preferably 1 to 6, e.g., 1, 2, 3, 4 or 5.
  • the ND1 and ND2 variants may be polypeptides that contain an amino acid sequence that has at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence shown at positions 391 to 585 of SEQ ID NO:9 or positions 389 to 579 of SEQ ID NO:11, and have nuclease activity.
  • sequence identity of an amino acid sequence is determined by comparing two sequences aligned in a state in which the sequence match is maximized. Methods for determining the numerical value (%) of sequence identity are known to those skilled in the art.
  • any algorithm known to those skilled in the art e.g., BLAST algorithm, FASTA algorithm, etc.
  • the sequence identity of an amino acid sequence is determined, for example, using sequence analysis software such as BLASTP and FASTA.
  • ND1 and ND2 variants include variants (DDD type variants) containing aspartic acid (D483, D487, and D496) at positions corresponding to positions 483, 487, and 496 in the amino acid sequence of FokI, and variants (RRR type variants) containing arginine (R483, R487, and R537) at positions corresponding to positions 483, 487, and 537 in the amino acid sequence of FokI.
  • DDD type variant of ND1 (ND1DDD) has an amino acid sequence in which the 103rd and 113th amino acids in the partial peptide corresponding to positions 391 to 585 of SEQ ID NO: 9 are replaced with aspartic acid (SEQ ID NO: 14).
  • the RRR type variant of ND1 (ND1RRR) has an amino acid sequence in which the 100th and 154th amino acids in the partial peptide corresponding to positions 391 to 585 of SEQ ID NO: 9 are replaced with arginine (SEQ ID NO: 15).
  • the nucleic acid cleavage domain of the ZFN of the present disclosure may be a polypeptide that includes modified amino acids and/or unnatural amino acids.
  • Modified amino acids include, but are not limited to, methylation, esterification, amidation, acetylation, alkylation, halogenation, and the like.
  • the modified amino acids and unnatural amino acids can be introduced by known methods.
  • the ZFPs and ZFNs disclosed herein can be produced in vitro or in vivo by methods known in the art. Examples include artificial synthesis based on amino acid sequence information, and artificial synthesis of nucleic acid encoding ZFN, insertion into an appropriate expression vector, and then introduction into an appropriate host cell to express ZFN in the cell.
  • Vectors comprising a nucleic acid sequence encoding the ZFPs or ZFNs described above.
  • the vector may contain elements of a conventional gene expression vector, such as a promoter (e.g., CMV promoter or human Elongation Factor alpha-1 (EF1a) promoter) and a polyA addition sequence (e.g., SV40 pA, HGH pA, rabbit globin pA).
  • a promoter e.g., CMV promoter or human Elongation Factor alpha-1 (EF1a) promoter
  • a polyA addition sequence e.g., SV40 pA, HGH pA, rabbit globin pA.
  • the vector is not particularly limited and may be selected from vectors used in the field.
  • vectors include phage vectors, plasmid vectors, viral vectors, retroviral vectors, chromosomal vectors, episomal vectors, virus-derived vectors (bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, etc.), yeast chromosomal elements, viruses (baculoviruses, papovaviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, avian poxviruses, pseudorabies viruses, herpes viruses, lentiviruses, retroviruses, etc.), and vectors derived from combinations of these (cosmids, phagemids, etc.).
  • plasmid vectors are preferred from the viewpoint of their versatility.
  • viral vectors are preferred, and adeno-associated virus vectors (AAV vectors) are more preferred.
  • AAV vectors adeno-associated virus vectors
  • Genome Editing Method The present disclosure also provides a genome editing method comprising the step of introducing the above-mentioned vector into a cell in vivo or in vitro, preferably in vitro.
  • Introduction of a vector into a cell can be carried out by a conventionally known method.
  • the introduction method include, but are not limited to, electroporation, particle gun, microinjection, lipofection, protein transduction, etc.
  • donor DNA may be introduced into the cell together with the vector.
  • the donor DNA may be, for example, donor DNA encoding a normal gene.
  • the donor DNA may be configured to be capable of introducing a normal gene into a gene locus by utilizing a repair mechanism such as nonhomologous end joining (NHEJ) or homologous recombination (HR) at the site of DNA double-strand break caused by ZFN.
  • NHEJ nonhomologous end joining
  • HR homologous recombination
  • the break site is primarily repaired by NHEJ. Because NHEJ is error-prone, deletion, insertion, or substitution of at least one nucleotide, or a combination thereof, may occur during repair of the break. In this way, the locus of interest is modified at the break site.
  • the cells may be from humans or non-human animals.
  • Non-human animals include ungulates (e.g., cattle, wild boars, pigs, sheep, goats), perissodactyls (e.g., horses), rodents (e.g., mice, rats, hamsters, squirrels), lagomorphs (e.g., rabbits), and carnivores (e.g., dogs, cats, ferrets).
  • the cells may be dividing or non-dividing cells, but in the present disclosure, non-dividing cells may be particularly preferably selected.
  • non-dividing cells include photoreceptors, lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, endothelial cells, epithelial cells, hepatocytes, bone cells, platelets, adipocytes, cardiac muscle cells, neurons, retinal cells, smooth muscle cells, skeletal muscle cells, spermatocytes, oocytes, and pancreatic ⁇ cells.
  • Example 1 Verification of the effect of NLS in the insertion of foreign genes into non-dividing cells by HITI method using ZF-ND1
  • the Homology-independent Targeted Integration (HITI) method is a technique for inserting a foreign gene (donor gene) into the genome of non-dividing cells with high efficiency and in a precise direction.
  • HITI Homology-independent Targeted Integration
  • mice rod photoreceptors non-dividing cells
  • ZF-ND1 expression vector ND1 used for genomic DNA cleavage shows cleavage activity as a dimer, so two ZFPs (a pair of ZFPs) corresponding to the sense strand and antisense strand of the cleavage target sequence were designed. Specifically, a ZFP pair was designed that recognizes an 18-base sequence located upstream of the start codon of exon 1 of the mouse Rho gene. The sequence upstream of the start codon of exon 1 of the mouse Rho gene and the recognition sequence of the ZFP pair are shown in Figure 1.
  • a sense strand ZFP (ZF-5057 S) having a zinc finger array that recognizes and binds to the sense strand sequence CTACGAAGAGCCCGTGGG (SEQ ID NO: 1) was linked to a DDD-type mutant of ND1 (ND1DDD, SEQ ID NO: 14) to give ZF-5057S-ND1DDD.
  • the amino acid sequence of ZF-5057S-ND1DDD is shown in SEQ ID NO: 16 .
  • An antisense strand ZFP (ZF-5057AS) having a zinc finger array that recognizes and binds to the antisense strand sequence ACCAAGGCTGCTTGGCGA (SEQ ID NO: 2) was linked to an RRR type mutant of ND1 (ND1RRR, SEQ ID NO: 15) to obtain ZF-5057AS-ND1RRR.
  • the amino acid sequence of ZF-5057AS-ND1RRR is shown in SEQ ID NO: 17.
  • a peptide linker (sequence Thr-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO: 13) was used to link ND1 and ZFP.
  • the nucleic acid sequences encoding ZF-5057AS-ND1RRR and ZF-5057S-ND1DDD were each inserted into a plasmid vector to prepare expression vectors pRho2k-ZF-ND1DDD and pRho2k-ZF-ND1RRR.
  • the promoter used was the bovine Rho promoter (2174 bp), and the polyA addition sequence was rabbit beta-globin polyA.
  • the structure of the expression vector is shown in Figure 2.
  • Each expression vector had one of the following three nuclear localization signal sequences inserted at the N-terminus of ZF.
  • SV40 NLS 1 sequence (1xSV40NLS): PKKKRKV (SEQ ID NO:3)
  • B) SV40 NLS 3 sequence (3xSV40NLS): PKKKRKV AAA PKKKRKV GSG PKKKRKV (SEQ ID NO: 4)
  • the donor gene was prepared by adding a nucleic acid sequence encoding the fluorescent protein GFP to the cDNA of mouse Rho gene.
  • a construct in which a chimeric intron sequence, mouse rhodopsin cDNA (Rho cDNA), an autolytic peptide sequence (Furin+Spacer+P2A), AcGFP, and a 3'UTR sequence derived from the mouse Rho locus were linked in that order was introduced into the pLeaklessIII plasmid, and a sequence in which the ZF recognition sequence was reversed (ZF-ND1 target) was inserted into both ends of this construct.
  • the resulting gene cassette was named mRho-ZF-HITI-Donor (see Figure 3).
  • 0.3-0.4 ⁇ L of vector solution adjusted to a concentration of 5-7ug/ ⁇ L was injected subretinally into mice immediately after birth (P0-2).
  • the head was clamped with tweezers (Nepagene CUY650-7) with the retina side as the anode, and an electric pulse was applied to transfer the gene.
  • the mixing ratio of the vector solution was as follows in percentage. pRho2k-ZF-ND1DDD 15% pRho2k-ZF-ND1RRR 15% mRho-ZF-HITI-Donor 60% pCAG-mCherry 10%
  • Rho promoters of pRho2k-ZF-ND1DDD and pRho2k-ZF-ND1RRR are activated from P7 to P10 onwards after rod photoreceptor differentiation, so ZF-ND1DDD and ZF-ND1RRR begin to be expressed in rod photoreceptors after differentiation (i.e., after cell division stops).
  • Eyeballs were harvested on P21, when retinal cell differentiation was almost complete.
  • the outer sclera was peeled off and removed, and the remaining tissue (eyecup) was fixed in 4% paraformaldehyde solution (Nacalai), and fluorescent images of GFP and mCherry were photographed under a fluorescent stereo microscope. Tissue sections were also prepared and subjected to fluorescent immunostaining with anti-GFP antibodies.
  • the upper panel of Figure 4 shows fluorescent images of the eyecup when pRho2k-ZF-ND1DDD and pRho2k-ZF-ND1RRR, into which three types of nuclear localization signal sequences (1xSV40NLS, 3xSV40NLS, and 3xMultiNLS) were inserted, respectively (green indicates AcGFP fluorescence, and red indicates mCherry fluorescence).
  • the construct with one NLS sequence introduced (1xSV40NLS) barely showed any green fluorescence, and it was at the same level as the negative control group (No ZF) without the ZF-ND1 vector introduced.
  • the constructs with three NLS sequences introduced showed an increase in green fluorescence in the order 3xSV40NLS, 3xMulti40NLS.
  • the lower panel of Figure 4 shows fluorescent staining images using an anti-GFP antibody when pRho2k-ZF-ND1DDD and pRho2k-ZF-ND1RRR, into which three types of nuclear localization signal sequences (1xSV40NLS, 3xSV40NLS, and 3xMultiNLS) were inserted, were used.
  • AcGFP-positive cells were found only in the outer nuclear layer (ONL) where photoreceptors are located, and mCherry-positive cells were found in the inner nuclear layer (INL) where horizontal cells, bipolar cells, and amacrine cells are located, confirming that the knock-in of the mRho-ZF-HITI-Donor cassette occurred exclusively in photoreceptors.
  • the number of AcGFP-positive photoreceptors increased in the following order: 1xSV40NLS, 3xSV40NLS, 3xMulti40NLS.
  • SEQ ID NO: 1 Recognition sequence of ZF-5057S
  • SEQ ID NO: 2 Recognition sequence of ZF-5057AS
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence of SV40 NLS 1 sequence (1xSV40NLS)
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of SV40 NLS 3 sequence (3xSV40NLS)
  • SEQ ID NO: 5 Amino acid sequence of sequence (3xMultiNLS) in which SV40 NLS, c-Myc NLS, and SV40 NLS are arranged in this order
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of SV40 T antigen NLS
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of c-myc NLS
  • SEQ ID NO: 8 Nucleoplasmin
  • SEQ ID NO:9 Amino acid sequence of full-length protein containing ND1 (derived from Bacillus SGD-V-76)
  • SEQ ID NO:10 Nucleotide sequence of full-length protein containing ND1 (derived from

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Abstract

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）によるゲノム編集の効率を特に非分裂細胞において向上させるために利用可能な技術として、N末端に３以上の核移行シグナル（NLS）を有する、ZFNが提供される。

Description

ジンクフィンガータンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ベクター並びにこれらを用いたゲノム編集方法
　本開示は、ジンクフィンガータンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ベクター並びにこれらを用いたゲノム編集方法に関する。より詳しくは、N末端に３以上の核移行シグナルが付加されたジンクフィンガータンパク質等に関する。
　ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、核酸切断ドメインであるFokI-ND、核酸結合ドメインであるジンクフィンガータンパク質（Zinc-finger protein；ZFP）及びそれらをつなぐリンカーからなる。特許文献１には、FokI-NDに替えてヌクレアーゼドメイン１（ND1）及びヌクレアーゼドメイン２（ND２）と称される核酸切断ドメインを含むZFNが開示されている。ND1はバチルス属SGD-V-76由来のヌクレアーゼドメイン、ND2はボツリヌス菌由来のヌクレアーゼドメインとされている。ND1及びND2は、従来のFokI-NDよりも、切断活性や特異性、標的配列の選択性等の機能性において優れるとされている。
　本開示に関連して、非特許文献１には、培養細胞（分裂細胞）において、ZF-FokI-NDに核移行シグナル（NLS）を複数付加することで、ゲノム編集効率が向上することが報告されている。また、非特許文献２は、CasヌクレアーゼのN末端及びC末端にNLSを1つずつ付加することで、非分裂細胞におけるHITI（Homology-independent Targeted Integration）法の効率的な実施が可能となることを報告している。
国際公開第２０２０／０４５２８１号
　本開示は、ZFNによるゲノム編集の効率を特に非分裂細胞において向上させるために利用可能な技術を提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本開示は、以下の［１］－［１３］を提供する。
［１］　N末端に３以上の核移行シグナル（NLS）を有する、ジンクフィンガータンパク質（ZFP）。
［２］　NLSがSV40 T抗原NLS及び／又はc-myc NLSである、［１］のZFP。
［３］　交互に配列した、SV40 T抗原NLS及びc-myc NLSを有する［２］のZFP。
［４］　SV40 T抗原NLSを２つ、c-myc NLSを１つ有する、［３］のZFP。
［５］　［１］－［４］のいずれかのZFPをコードする核酸配列を含むベクター。
［６］　［１］－［４］のいずれかのZFPと核酸切断ドメインとからなるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）。
［７］　核酸切断ドメインが、ND1である、［６］のZFN。
［８］　核酸切断ドメインが、
配列番号９の391～585位のアミノ酸配列、
配列番号１４のアミノ酸配列、又は、
配列番号１５のアミノ酸配列、
を含んでなる、［７］のZFN。
［９］　［６］－［８」のいずれかのZFNをコードする核酸配列を含むベクター。
［１０］　［９］のベクターを細胞に導入する手順を含む、ゲノム編集方法。
［１１］　in vitro方法である、［１０］のゲノム編集方法。
［１２］　前記細胞が、非分裂細胞である、［１０］又は［１１］のゲノム編集方法。
［１３］　前記非分裂細胞が、視細胞である、［１２］の方法。
　本開示により、ZFNによるゲノム編集の効率を特に非分裂細胞において向上させるために利用可能な技術が提供される。
マウスRho遺伝子のエキソン1開始コドンの上流配列と、ZF-ND1発現ベクターにより発現されるZF-ND１に含まれるZFP（ZF-5057S、ZF5057AS）の認識配列を示す。 ZF-ND1発現ベクター（pRho2k-ZF-ND1DDD、pRho2k-ZF-ND1RRR）の構成を示す。 ドナー遺伝子ベクター（mRho-ZF-HITI-Donor）の構成を示す。 3種類の核移行シグナル配列（1xSV40NLS、3xSV40NLS、3xMultiNLS）を挿入したZF-ND1発現ベクターを用いたHITI（Homology-independent Targeted Integration）法により杆体視細胞のゲノム編集を行った結果を示す。上段は、出生直後（P0～2）のマウス網膜の杆体視細胞のロドプシン遺伝子座に蛍光タンパク質（AcGFP）遺伝子を導入し、P21に回収した網膜組織（eyecup）の蛍光像である。下段は、網膜組織の抗GFP抗体による蛍光染色像である。緑はAcGFP、赤はポジティブコントロールのmCherryの蛍光を示す。
１．ジンクフィンガータンパク質（ZFP）
　本開示に係るZFPは、核酸結合ドメインを含んでなり、核酸結合ドメインのN末端に３以上の核移行シグナル（NLS）を有することを特徴とする。本開示に係るZFPは、N末端に3以上のNLSを有することにより、エフェクタードメインと結合されて向上されたゲノム編集効率を示し得る。ゲノム編集効率の向上は、特に非分裂細胞において奏され得る。
　本開示に係るZFPの核酸結合ドメインは、特定の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを含んでなる。ジンクフィンガーアレイは、３塩基配列を認識する１つのジンクフィンガー（ZF)が複数配列されてなる。ジンクフィンガーアレイは、２個以上のZFを含んでいてよく、例えば3-9個、好ましくは4-8個、より好ましくは5-7個、典型的には6個のZFからなるものであってよい。ジンクフィンガーアレイが認識する核酸配列は、ゲノム編集の対象となる目的核酸鎖の核酸配列、及び該目的核酸鎖中の編集標的部位の核酸配列に応じて適宜設定され得る。ZFのアミノ酸配列とZFが認識する３塩基配列との関係は公知であり、ZFのアミノ酸配列には、認識対象とする３塩基配列に応じて例えば非特許文献１のSupplemental Table 1に記載のアミノ酸配列を用いることができる。同一の３塩基配列に対して当該配列を認識するZFのアミノ酸配列は複数存在するため、同一の３塩基配列を認識するこれらのZFは互換的に用いられ得る。
　本開示に係るZFPが有するNLSは、3以上であればよく、好ましくは3－5個、特には3又は5個とされ得る。
　本開示に係るZFPが有するNLSには、SV40 T抗原NLS（PKKKRKV：配列番号６）、c-myc NLS（PAAKRVKLD：配列番号７）、Nucleoplasmin NLS（KRXXXXXXXXXXKKKLD：配列番号８。Xは任意のアミノ酸を示す）及びこれらの配列から誘導されるアミノ酸配列を有するNLS等の従来公知のNLSを特に限定されずに用いることができる。
　NLSは、SV40 T抗原NLS又はc-myc NLSであることが好ましく、SV40 T抗原NLS及びc-myc NLSであることがより好ましい。
　NLSがSV40 T抗原NLS及びc-myc NLSである場合、それらは交互に配列していてよく、特には「SV40 T抗原NLS、c-myc NLS、SV40 T抗原NLS」の順に3つのNLSが配列していてよい。
　各NLSは、直接配列していてよく、あるいはペプチドリンカーにより連結され配列していてもよい。ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、任意であるが、例えばAAA及びGSGとすることができる。
２．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）
　本開示に係るZFPが結合されるエフェクタードメインは、特に限定されないが、例えば、核酸切断ドメインであってよい。他のエフェクタードメインとしては、Cytosine base editor (UGI, APOBEC), Adenine base editor (TadA), transcriptional activator (VP16)/repressor (SID), epigenomic editor (DNMT3A, TET1), imaging protein (Dye, fluorescent protein)、transposase (PiggyBac)、recombinase (Flippase)等が挙げられる。
　エフェクタードメインは、単独で機能するもの（モノマー型）であっても、多量体により機能するもの（スプリット型）であってもよい。
　ZFPとエフェクタードメインは、直接連結されていてもよく、またはリンカーを介して連結されていてもよい。リンカーは、例えば、２以上のアミノ酸残基からなり、長さは特に限定されないが、例えば、2～20アミノ酸長、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12戸、13個、14個、14個、16個、17個、18個、19個または20個のアミノ酸長であってよい。リンカーの種類もまた特に限定されないが、例えば、TGGS（配列番号１３）が挙げられる。リンカーの有無およびリンカーの長さおよび種類は、エフェクタードメインの種類等を考慮して当業者によって適宜選択される。
　本開示に係るZFPは核酸切断ドメインと結合されて、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）として構成されることが好ましい。本開示に係るZFNは、特定の核酸配列をジンクフィンガーアレイにて認識して結合し、核酸切断ドメインによるDNA二本鎖の切断（DNA double-strand break；DSB）をもたらす。
　核酸切断ドメインは、特に限定されず、FokI-NDや、特許文献２に記載されるND1及びND2並びにこれらの改変体であってよい。ND1を含む全長タンパク質（バチルス属SGD-V-76由来）のアミノ酸配列を配列番号９に、その塩基配列を配列番号１０に示す。ND２を含む全長タンパク質（ボツリヌス菌由来）のアミノ酸配列を配列番号１１に、その塩基配列を配列番号１２に示す。ND１は、典型的には、配列番号９の391～585位に相当する部分ペプチドであり、ND２は、典型的には、配列番号１１の389～579位に相当する部分ペプチドであ
る。核酸切断ドメインは、ND1とされることが好ましい。
　ND1及びND2の改変体は、配列番号９の391～585位または配列番号１１の389～579位に示されるアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列を含み、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。ここで、「１ないし数個」とは、例えば1～10個、好ましくは1～6個であり、例えば
、１個、２個、３個、４個または５個である。
　ND1及びND2の改変体は、配列番号９の391～585位または配列番号１１の389～579位に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「配列同一性」とは、配列の一致が最大となる状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）を求める方法は、当業者に公知である。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者に既知のいずれかのアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズム等）を利用すればよい。アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、BLASTP、FASTA等の配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
　ND1及びND2の改変体として、具体的には、FokIのアミノ酸配列における483位、487位及び496位に相当する位置にアスパラギン酸（D483、D487及びD496）を含む改変体（DDD型変異体）、又はFokIのアミノ酸配列における483位、487位及び537位に相当する位置にアルギニン（R483、R487及びR537）を含む改変体（RRR型変異体）が挙げられる。ND1のDDD型変異体（ND1DDD）は、配列番号９の391～585位に相当する部分ペプチドにおいて103番目及び113番目のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を有する（配列番号１４）。また、ND1のRRR型変異体（ND1RRR）は、配列番号９の391～585位に相当する部分ペプチドにおいて100番目及び154番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列を有する（配列番号１５）。
　本開示に係るZFNの核酸切断ドメインは、修飾アミノ酸および／または非天然アミノ酸を含むポリペプチドであってもよい。修飾アミノ酸としては、限定するものではないが、例えば、メチル化、エステル化、アミド化、アセチル化、アルキル化、ハロゲン化等が挙げられる。該修飾アミノ酸および非天然アミノ酸は、公知の方法によって導入することができる。
　本開示に係るZFP及びZFNは、当該分野で既知の方法によってin vitro又はin vivoで製造することができる。例えば、アミノ酸配列情報を基に人工合成する方法や、ZFNをコードする核酸を人工合成し、適当な発現ベクター中に挿入し、次いで適当な宿主細胞中に導入して、該細胞内でZFNを発現させる方法が挙げられる。
３．ベクター
　本開示は、上述のZFP又はZFNをコードする核酸配列を含むベクターをも提供する。
　ベクターは、ZFP又はZFNをコードする核酸配列に加えて、従来の遺伝子発現ベクターが備える要素を含んでいてもよい。このような要素として、例えばプロモーター（CMVプロモーターやヒトEF1a（Elongation Factor alpha-1）プロモーター等）、polyA付加配列（SV40 pA, HGH pA、ウサギグロビン pA等）が挙げられる。
　ベクターとしては、特に限定されず、当該分野で使用されるベクターから選択すればよい。ベクターの具体例としては、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクター（細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソームなど）、酵母染色体エレメント、ウイルス（バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなど）、これらの組み合わせに由来するベクター（コスミド、ファージミドなど）などが挙げられる。上述した中でも、汎用性の高さと言う観点からはプラスミドベクターが好ましい。また、臨床応用が進んでいるという観点からは、ウイルスベクターが好ましく、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）がより好ましい。
４．ゲノム編集方法
　本開示は、上述のベクターをin vivo又はin vitroで、好ましくはin vitroで、細胞に導入する手順を含むゲノム編集方法をも提供する。
　細胞へのベクターの導入は、従来公知の手法によって行うことができる。導入方法としては、限定するものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、パーティンクルガン法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、プロテイントランスダクション法等が挙げられる。
　ゲノム編集の目的に応じて、ベクターとともに、ドナーDNAが細胞に導入されてもよい。ドナーDNAは、例えば、正常な遺伝子をコードするドナーDNAであってよい。ドナーDNAは、ZFNによるDNA二本鎖の切断部位における非相同末端連結修復（nonhomologous end joining；NHEJ）あるいは相同組換え修復（homologous recombination；HR）等の修復機構を利用して正常遺伝子を遺伝子座に導入し得るように構成されたものとできる。
　ドナーDNAを用いないゲノム編集の場合、切断部位は、主にNHEJにより修復される。NHEJはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。このようにして、目的の遺伝子座が切断部位において改変される。
　細胞は、ヒト又は非ヒト動物由来のものであってよい。非ヒト動物は、偶蹄類（ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、奇蹄類（ウマなど）、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、リスなど）、ウサギ目（ウサギなど）、食肉類（イヌ、ネコ、フェレットなど）などが挙げられる。
　細胞は、分裂細胞であっても非分裂細胞であってもよいが、本開示においては特に非分裂細胞を好適に選択し得る。非分裂細胞としては、例えば視細胞、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞等が挙げられる。
［実施例１：ZF-ND1を用いたHITI法による非分裂細胞への外来遺伝子挿入におけるNLSの効果検証］
　HITI（Homology-independent Targeted Integration）法は、非分裂細胞において、外来遺伝子（ドナー遺伝子）を高効率にかつ正確な方向でゲノムに挿入する技術である。本実施例ではゲノム編集因子にZF-ND1を用いたHITI法におけるNLSの有効性を検討した。
　以下のプラスミドベクターを作製し、in vivoエレクトロポレーション法によるマウス杆体視細胞（非分裂細胞）への遺伝子導入を行った。
（１）ZF-ND1発現ベクター
　ゲノムDNA切断に用いるND1は2量体で切断活性を示すため、切断標的となる配列に対してセンス鎖とアンチセンス鎖に対応する2つのZFP（ペアのZFP）を設計した。具体的には、マウスRho遺伝子のエキソン1開始コドンより上流に位置する18塩基の配列をそれぞれ認識するZFPペアを設計した。マウスRho遺伝子のエキソン1開始コドン上流の配列と、ZFPペアの認識配列を図１に示す。ND1のDDD型変異体（ND1DDD、配列番号１４）に、センス鎖の配列CTACGAAGAGCCCGTGGG（配列番号１）を認識して結合するジンクフィンガーアレイを有するセンス鎖ZFP（ZF-5057 S）を連結し、ZF-5057S-ND1DDDとした。ZF-5057S-ND1DDDのアミノ酸配列を配列番号１６に示す。ND1のRRR型変異体(ND1RRR、配列番号１５）に、アンチセンス鎖の配列ACCAAGGCT GCTTGGCGA（配列番号２）を認識して結合するジンクフィンガーアレイを有するアンチセ ンス鎖ZFP（ZF-5057AS）を連結し、ZF-5057AS-ND1RRRとした。ZF-5057AS-ND1RRRのアミノ酸配列を配列番号１７に示す。ND1とZFPとの間の連結にはペプチドリンカー（配列Thr-Gl y-Gly-Ser：配列番号１３）を用いた。
　ZF-5057AS-ND1RRR及びZF-5057S-ND1DDDをコードする核酸配列をそれぞれプラスミドベクターに組み込んで、発現ベクターpRho2k-ZF-ND1DDD及びpRho2k-ZF-ND1RRRを作製した。
　プロモーターにはウシ由来のRhoプロモーター（2174bp）を用い、polyA付加配列にはウサギbeta-globin polyAを用いた。発現ベクターの構成を図２に示す。各発現ベクターには、ZFのＮ末端に以下の3種類のいずれかの核移行シグナル配列を挿入した。
Ａ）SV40 NLS 1配列（1xSV40NLS）：PKKKRKV（配列番号３）
Ｂ）SV40 NLS 3配列（3xSV40NLS）：PKKKRKV AAA PKKKRKV GSG PKKKRKV（配列番号４）
Ｃ）SV40 NLS, c-Myc NLS, SV40 NLSの順に並べた配列（3xMultiNLS）：PKKKRKV AAA PAA KRVKLD GSG PKKKRKV（配列番号５）
（下線アミノ酸配列がNLS配列、AAA及びGSGはリンカー配列を示す）
（２）ドナー遺伝子ベクター
　ドナー遺伝子には、マウスRho遺伝子のcDNAに蛍光タンパク質GFPをコードする核酸配列を付加したものとした。キメライントロン配列、マウスロドプシンcDNA（Rho cDNA）、自己消化ペプチド配列（Furin+Spacer+P2A）、AcGFP、及びマウスRho遺伝子座由来の3'UTR 配列を順に連結したコンストラクトをpLeaklessIIIプラスミドに導入し、さらにこのコンストラクトの両端にZFの認識配列を逆転させた配列（ZF-ND1 target）を挿入した。得られた遺伝子カセットをmRho-ZF-HITI-Donorと命名した（図３参照）。
（３）mCherry発現ベクター
　CAGプロモーターの制御下でmCherry赤色蛍光蛋白質を発現させるプラスミドを作製した。
　5～7ug/μLの濃度に調整したベクター溶液0.3～0.4μLを出生直後（P0～2）のマウス網 膜下に注入した。ピンセット電極（Nepagene CUY650-7）で網膜側を陽極側して頭部を挟み、電気パルスを与えることにより遺伝子導入を行った。ベクター溶液の混合比率は百分 率で下記のとおりとした。
pRho2k-ZF-ND1DDD 15%
pRho2k-ZF-ND1RRR 15%
mRho-ZF-HITI-Donor 60%
pCAG-mCherry 10%
　pRho2k-ZF-ND1DDD及びpRho2k-ZF-ND1RRRのRhoプロモーターは杆体視細胞が分化した後
のP7～10以降から活性化するため、ZF-ND1DDD, ZF-ND1RRRは分化後（すなわち細胞分裂停止後）の杆体視細胞で発現が開始される。網膜の細胞分化が概ね完了したP21に眼球を回収した。外側の強膜部分を剥がして除去し、残存組織（eyecup）を4%パラホルムアルデヒ ド溶液（Nacalai）で固定し、蛍光実態顕微鏡でGFPとmCherryの蛍光像を撮影した。また、組織切片を作製して、抗GFP抗体で蛍光免疫染色を行った。
　3種類の核移行シグナル配列（1xSV40NLS、3xSV40NLS、3xMultiNLS）を挿入したpRho2k-ZF-ND1DDD及びpRho2k-ZF-ND1RRRを用いた場合のeyecupの蛍光像を図４上段（緑はAcGFP、赤はmCherryの蛍光を示す）に示す。
　NLSを１配列導入したコンストラクト（1xSV40NLS）では緑色蛍光をほとんど認めず、ZF-ND1ベクターを導入しないネガティブコントロール群（No ZF）と同程度であった。NLSを3配列導入したコンストラクトでは、3xSV40NLS、3xMulti40NLSの順で緑色蛍光の増加を認めた。
　3種類の核移行シグナル配列（1xSV40NLS、3xSV40NLS、3xMultiNLS）を挿入したpRho2k-ZF-ND1DDD及びpRho2k-ZF-ND1RRRを用いた場合の抗GFP抗体による蛍光染色像を図４下段に示す。
　AcGFP陽性細胞は視細胞が局在する網膜外顆粒層（ONL)のみに認められ、mCherry陽性細胞は水平細胞、双極細胞及びアマクリン細胞が局在する網膜内顆粒層（INL）にも認められることから、mRho-ZF-HITI-Donorカセットのノックインは視細胞限定的に起きていることが確認できる。AcGFP陽性視細胞は、1xSV40NLS, 3xSV40NLS, 3xMulti40NLSの順で増加を認めた。
　以上の結果から、ZFPに複数個（3個）のNLSを付加することにより、視細胞（非分裂細胞）での効率的なゲノム編集が可能であることが示された。
配列番号１：ZF-5057Sの認識配列
配列番号２：ZF-5057ASの認識配列
配列番号３：SV40 NLS 1配列（1xSV40NLS）のアミノ酸配列
配列番号４：SV40 NLS 3配列（3xSV40NLS）のアミノ酸配列
配列番号５：SV40 NLS, c-Myc NLS, SV40 NLSの順に並べた配列（3xMultiNLS）のアミノ酸配列
配列番号６：SV40 T抗原NLSのアミノ酸配列
配列番号７：c-myc NLSのアミノ酸配列
配列番号8：Nucleoplasmin NLSのアミノ酸配列
配列番号９：ND1を含む全長タンパク質（バチルス属SGD-V-76由来）のアミノ酸配列
配列番号１０：ND1を含む全長タンパク質（バチルス属SGD-V-76由来）のヌクレオチド配列
配列番号１１：ND２を含む全長タンパク質（ボツリヌス菌由来）のアミノ酸配列
配列番号１２：ND２を含む全長タンパク質（ボツリヌス菌由来）のアミノ酸配列のヌクレオチド配列
配列番号１３：ペプチドリンカーのアミノ酸配列
配列番号１４：ND1DDDのアミノ酸配列
配列番号１５：ND1RRRのアミノ酸配列
配列番号１６：ZF-5057S-ND1DDDのアミノ酸配列
配列番号１７：ZF-5057AS-ND1RRRのアミノ酸配列

Claims (11)

  1. 　N末端に３以上の核移行シグナル（NLS）を有する、ジンクフィンガータンパク質（ZFP）。
  2. 　NLSがSV40 T抗原NLS及び／又はc-myc NLSである、請求項１に記載のZFP。
  3. 　交互に配列した、SV40 T抗原NLS及びc-myc NLSを有する、請求項２に記載のZFP。
  4. 　SV40 T抗原NLSを２つ、c-myc NLSを１つ有する、請求項３に記載のZFP。
  5. 　請求項１－４のいずれか一項に記載のZFPをコードする核酸配列を含むベクター。
  6. 　請求項１－４のいずれか一項に記載のZFPと核酸切断ドメインとからなるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）。
  7. 　核酸切断ドメインが、ND1である、請求項６に記載のZFN。
  8. 　請求項６に記載のZFNをコードする核酸配列を含むベクター。
  9. 　請求項８に記載のベクターを細胞に導入する手順を含む、ゲノム編集方法。
  10. 　前記細胞が、非分裂細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記非分裂細胞が、視細胞である、請求項１０に記載の方法。
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