WO2024258216A1 - 신규 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2024258216A1
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tau
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김상재
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GemVax and Kael Co Ltd
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides and uses thereof.
  • Tau is abundant in neurons of the central nervous system (CNS) and plays a role in maintaining the stability of microtubules in axons.
  • tau When hyperphosphorylation occurs, in which excessive phosphate is attached to the tau protein, tau detaches from microtubules and forms insoluble aggregates called neurofibrillary tangles (NFTs). Neurodegenerative diseases associated with such abnormal tau aggregation are collectively called tauopathies.
  • NFTs neurofibrillary tangles
  • Tauopathies are classified into 3R tauopathy and 4R tauopathy depending on the isoform of the tau protein that causes them.
  • 4R tauopathies include progressive supranuclear palsy (PSP), corticobasal degeneration (CBD), argyrophilic grain disease (AGD), globular glial tauopathy (GGT), and age-related tau astrogliopathy (ARTAG).
  • PSP progressive supranuclear palsy
  • CBD corticobasal degeneration
  • ATD argyrophilic grain disease
  • GTT globular glial tauopathy
  • ARTAG age-related tau astrogliopathy
  • LMTM known as a tau aggregation inhibitor
  • GI 50 6.4 ⁇ 0.3 ⁇ M
  • EC 50 2.2 ⁇ 0.2 ⁇ M
  • the inventors of the present invention completed the present invention as a result of extensive research to treat 4R tauopathy by inhibiting tau hyperphosphorylation and aggregation.
  • the present invention aims to provide a novel peptide having a preventive or therapeutic effect on 4R tauopathy.
  • the present invention aims to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating 4R tauopathy.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating 4R tauopathy comprising the peptide of the above 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating 4R tauopathy wherein in the above 2, the 4R tauopathy is any one selected from the group consisting of progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, arginine affinity tauopathy, globular astrocytopathy, and age-related tauoastrogliopathy.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating 4R tauopathy wherein the prevention or treatment of 4R tauopathy in the above 3 is achieved by inhibiting hyperphosphorylation and aggregation of tau protein.
  • a health functional food for preventing or improving 4R tauopathy comprising a peptide of the following chemical formula 1 or a food-based salt thereof:
  • the 4R tauopathy is any one selected from the group consisting of progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, arginine affinity tauopathy, globular astrocytopathy, and age-related tauoastrocytopathy, a health functional food for preventing or improving 4R tauopathy.
  • a health functional food for preventing or improving 4R tauopathy wherein the prevention or improvement of 4R tauopathy in the above 6 is achieved by inhibiting hyperphosphorylation and aggregation of tau protein.
  • the peptide of chemical formula 1 of the present invention and its pharmaceutically acceptable salt have an excellent effect of inhibiting tau protein hyperphosphorylation.
  • the peptide of chemical formula 1 of the present invention and its pharmaceutically acceptable salt have an excellent tau protein aggregation inhibitory effect.
  • compositions and health functional foods containing the peptide of chemical formula 1 of the present invention or a salt thereof can exhibit effects of preventing, improving, and/or treating 4R tauopathy by inhibiting tau protein hyperphosphorylation and aggregation.
  • the peptide, pharmaceutical composition and health functional food of the present invention can stably exert a medicinal effect in a living body for a long time.
  • Figure 1 shows the results of an experiment confirming the stability of GV2002 in human plasma.
  • Figure 2 shows the results of confirming the pharmacokinetic profile (PK profile) of GV2002 after intravenous administration to rats.
  • Figure 3 shows the results of confirming the pharmacokinetic profile of GV2002 after subcutaneous administration to rats.
  • Figure 4 shows the mouse groups used in the in vivo experiment to verify the efficacy of GV2002.
  • Figure 5 shows the schedule of the efficacy evaluation experiment of GV2002 performed on a 4R tauopathy mouse model.
  • Figures 6 and 7 show the results of experiments evaluating improvement in motor ability in a 4R tauopathy mouse model.
  • Figure 8 shows the experimental method and results for evaluating improvement in cognitive ability in a 4R tauopathy mouse model.
  • Figure 9 shows the experimental method and results for evaluating improvement in spatial memory ability in a 4R tauopathy mouse model.
  • Figure 10 shows the results of an experiment evaluating the inhibitory efficacy of GV2002 on tau hyperphosphorylation through brain tissue immunofluorescence staining.
  • Figure 11 shows the results of an experiment evaluating the inhibitory efficacy of GV2002 on tau oligomer formation through brain tissue Tau-BiFC imaging.
  • Figure 12 shows the results of an experiment evaluating the inhibitory efficacy of GV2002 on tau hyperphosphorylation and aggregation through brain lysate analysis.
  • the present invention provides a peptide of the following chemical formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • the peptide of chemical formula 1 includes its functional equivalent.
  • the term “functional equivalent” means a peptide that exhibits substantially the same physiological activity as the peptide of chemical formula 1.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating 4R tauopathy, comprising a peptide of chemical formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • “pharmaceutically acceptable” means that the composition exhibits the property of being non-toxic to cells or organisms exposed to it.
  • 4R tauopathy is a general term for neurodegenerative diseases caused by the aggregation of 4R tau protein, and includes progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, arginine affinity tauopathy, globular cell tauopathy, and age-related tauoastrogliopathy.
  • prevention means any act of inhibiting or delaying 4R tauopathy.
  • “improvement” and “treatment” mean any action that improves or beneficially changes the symptoms of a subject suspected of having or suffering from 4R tauopathy.
  • prevention, improvement and/or treatment may be achieved by inhibiting hyperphosphorylation of tau protein.
  • prevention, improvement and/or treatment may be achieved by inhibiting tau protein aggregation.
  • the prevention, improvement and/or treatment may be to improve the motor skills of a subject suspected of having or having a 4R tauopathy.
  • the prevention, improvement and/or treatment may be to improve cognitive abilities in an individual suspected of having or having developed a 4R tauopathy.
  • the prevention, improvement and/or treatment may be to improve spatial memory abilities in an individual suspected of having or having developed a 4R tauopathy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the active ingredient alone, or may further contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the carrier, excipient or diluent that may be included in the pharmaceutical composition of the present invention may be, but is not limited to, lactose, dextrose, sucrose, dextrin, maltodextrin, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be provided by administration to a subject.
  • “administration” means introducing a predetermined substance to an individual by an appropriate method
  • “individual” means any animal, such as livestock and mice, that has developed or may develop 4R tauopathy, and may be a mammal, including a human.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally.
  • an injection method such as external skin application, intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be provided in the form of a solid preparation for oral administration, such as a tablet, pill, powder, granule or capsule.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be provided as a liquid preparation for oral administration, such as a suspension, a solution, an emulsion or a syrup.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be provided as a preparation for parenteral administration, such as a sterile aqueous solution, non-aqueous solution, suspension, emulsion, lyophilized preparation or suppository.
  • composition of the present invention can be administered to a subject in a pharmaceutically effective amount, whereby a “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat 4R tauopathy at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment.
  • a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined based on factors including the severity of 4R tauopathy, activity of the pharmaceutical composition, sensitivity of the subject or patient to the pharmaceutical composition, time of administration, route of administration, excretion rate, duration of treatment, and concomitant medications, and other factors well known in the medical field, and can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other conventional therapeutic agents, and when administered in combination, may be administered sequentially or simultaneously, and may be administered singly or in multiple doses, which can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving 4R tauopathy, comprising a peptide of chemical formula 1 or a food-wise acceptable salt thereof.
  • the health functional food of the present invention refers to a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functionality useful to the human body according to the Health Functional Food Act, and functionality refers to consumption for the purpose of obtaining a useful effect for health purposes such as regulating nutrients for the structure and function of the human body or physiological effects.
  • the food composition of the present invention may include conventional food additives, and the suitability of the food additives is determined by the specifications and standards for the relevant items according to the general provisions and general test methods of the Food Additive Code approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified.
  • Items listed in the Food Additives Codex include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, high-molecular-weight pigment, and guar gum; and mixed preparations such as sodium glutamate preparations, alkaline agents added to noodles, preservative preparations, and tar color preparations.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
  • natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, high-molecular-weight pigment, and guar gum
  • mixed preparations such as sodium glutamate preparations, alkaline agents added to noodles, preservative preparations, and tar color preparations.
  • the health functional food of the present invention may contain 0.01 to 95 wt%, preferably 1 to 80 wt%, of the peptide of chemical formula 1 based on the total weight of the health functional food for the purpose of preventing and/or improving 4R tauopathy.
  • the health functional food may be manufactured and processed in the form of a tablet, capsule, powder, granule, liquid, pill, etc. for the purpose of preventing and/or improving 4R tauopathy.
  • GV2002 A peptide having the structural formula of the following chemical formula 1 (hereinafter referred to as GV2002) was prepared.
  • GV2002 was synthesized by coupling amino acids one by one from the C-terminus according to the known Fmoc solid phase peptide synthesis (SPPS) method.
  • SPPS Fmoc solid phase peptide synthesis
  • amino acid starting materials used for peptide synthesis were protected at the N-terminus with Fmoc, and all residues were protected with Boc, t-Bu (t-butylester), or Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl), which can be removed by acid.
  • the amino acid starting materials used for peptide synthesis are as follows:
  • DIC Diisopropylcarbodiimide
  • DMF Dimethylforamide
  • Oxyma Ethyl(hydroxyamino)Cyanoacetate
  • IPA Isopropyl alcohol
  • 20% piperidine in DMF was used for Fmoc removal.
  • Cleavage Cocktail [95% trifluoroacetic acid (TFA) / 5% H 2 O / 50 mg/mL dithiothreitol (DTT)] was used to detach the synthesized peptide from the resin and remove the protecting group of the residue.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • DTT dithiothreitol
  • N-terminal capping of the peptide the N-terminus was acetylated using Ac2O (Acetic anhydride)/DIEA(Diisopropylethylamine)/DMF(Dimethylformamide).
  • the C-terminus of the peptide was aminolated.
  • the peptide was synthesized by sequentially reacting each amino acid, washing with a solvent, and deprotecting the starting amino acid with an amino acid protecting group attached to the solid support, and repeating the process.
  • the synthesized peptide was cleaved from the resin, purified by HPLC, confirmed to be synthesized by MS, and freeze-dried.
  • GV2002 dissolved in water in the form of HOAc salt was replaced with a chloride form using AmberChrom ion exchange resin.
  • the replaced GV2002 was filtered through a PVDF filter and freeze-dried.
  • Amino acids were coupled by adding each amino acid from the C-terminus to the N-terminus and coupling reagents DIC/Oxyma/IPA dissolved in DMF to the Fmoc-Rink Methylbenzhydrylamine resin, which was then washed with DMF.
  • the peptide was separated from the resin by treating the resin with a cleavage cocktail to which the synthesized peptide was bound.
  • the resulting mixture was concentrated and precipitated with MTBE/hexane. The precipitate was then filtered and dried.
  • AmberChrom resin was used to replace chloride, filtered through PVDF, and then freeze-dried to produce a powder.
  • the peptides were added to 100% human plasma, diluted to 5 ⁇ M, and stirred at 37°C for 10, 60, and 240 minutes, then collected and pretreated by plasma protein precipitation using methanol containing 0.1% formic acid. The supernatant was collected and analyzed by LC-MS under the conditions in Table 1 below to measure the ratio (%) of residual peptide to the amount of peptide before the reaction.
  • the ratio of residual peptide to the total peptide amount before the reaction of GV2002 was 57.23% at 60 minutes and 46.54% at 240 minutes. This confirmed the stability of GV2002 in plasma.
  • GV2002 was administered intravenously (IV) to three Sprague Dawley rats per group. Blood samples were collected at 0.033, 0.083, 0.17, 0.25, 0.5, 1, and 2 hours after administration. Blood samples were centrifuged to separate plasma, and analyzed using LC-MS after pretreatment. Pharmacokinetic parameters were calculated using the Non-compartmental analysis model of the Phoenix WinNonlin (Pharsight ver. 6.4, USA) program.
  • the AUC t value of GV2002 was 0.438 ug ⁇ h/mL. This confirmed that GV2002 remains stable in vivo without being decomposed for a long time.
  • GV2002 was administered subcutaneously (SC) to three Sprague Dawley rats per group. Blood samples were collected at 0.033, 0.083, 0.17, 0.25, 0.5, 1, and 2 hours after administration. Blood samples were centrifuged to separate plasma, and analyzed using LC-MS after pretreatment. Pharmacokinetic parameters were calculated using the Non-compartmental analysis model of the Phoenix WinNonlin (Pharsight ver. 6.4, USA) program.
  • GV2002 remains in a stable state in the body for a long time without being decomposed.
  • GV2002 efficacy of GV2002 in improving motor ability was evaluated by conducting a rota-rod experiment on a 4R tauopathy mouse model administered the drug for 5 months from 7.5 to 12.5 months of age.
  • Adaptation training was conducted on the first day, and a behavioral experiment was conducted on the second day.
  • the mice were allowed 1 hour to adapt to the space.
  • the mice were made to walk on a treadmill at a speed of 5 to 25 rpm for 300 seconds, and mice that lost their balance and fell to the floor were made to walk again.
  • the behavioral experiment the mice were made to walk on a treadmill at a speed that gradually increased from 5 to 40 rpm for 300 seconds, and the time (in seconds) until the mice lost their balance and fell to the floor was measured.
  • the measured values were analyzed by Two-way ANOVA using Dunnett's multiple comparisons test.
  • the GV2002 administration group showed significantly improved exercise ability compared to the vehicle administration group, and showed relatively improved exercise ability compared to the reference compound LMTM administration group.
  • mice To prevent changes in the behavioral responses of the mice, handling was performed for 5 days (days 1 to 5) before the experiment. Handling was performed for 2 minutes per session. On the 6th day, the mice were placed in a 40 cm x 40 cm enclosure and an open space experiment was conducted for 10 minutes. The mice were allowed 1 hour to adapt to the space before the experiment. In the open space experiment, the movement trajectory, movement distance, and movement speed of the mice were recorded. A constant illumination level was maintained throughout the experiment. The recorded values were analyzed by One-way ANOVA using Dunnett's multiple comparisons test.
  • GV2002 in improving cognitive ability was evaluated by conducting a novel object recognition experiment on a 4R tauopathy mouse model administered the drug for 5 months from 7.5 to 12.5 months of age.
  • a novel object recognition experiment was performed on mice that had been subjected to the experiment from day 1 to day 6 according to the experimental method of Example 4-2 on the 7th and 8th days.
  • the mouse On the 7th day, the mouse was placed in a 40 cm x 40 cm partition with two similar objects placed as shown in Fig. 8a and allowed to learn for 10 minutes.
  • the mouse On the 8th day, one of the two objects was replaced with a novel one, the mouse was placed in the partition, and its behavior was observed for 10 minutes to measure the time it spent on the novel object.
  • the mouse was allowed 1 hour to adapt to the space. A constant level of illumination was maintained throughout the experiment. The recorded values were analyzed by Two-way ANOVA using Sidak's multiple comparisons test.
  • the vehicle-administered group failed to significantly distinguish between learned objects and novel objects, whereas the GV2002-administered group showed improved cognitive ability for novel objects, as the time spent exploring novel objects significantly increased compared to the time spent exploring learned objects.
  • GV2002 efficacy of GV2002 in improving spatial memory was evaluated by conducting a Y-maze experiment on a 4R tauopathy mouse model administered the drug for 5 months from 7.5 to 12.5 months of age.
  • the mouse was allowed 1 hour to adapt to the space. Then, the mouse was placed at the starting point A of the Y-shaped platform as shown in Fig. 9a. The mouse's behavior was recorded for 8 minutes.
  • the GV2002-administered group showed a significantly increased rate of spontaneous alternation behavior, which involves exploring a new area rather than a previously explored area, compared to the vehicle-administered group, indicating improved spatial memory ability.
  • the brains of a 4R tauopathy mouse model that was administered drugs for 5 months from 7.5 to 12.5 months of age were extracted and brain tissues were analyzed using immunofluorescence staining.
  • the mouse model was anesthetized, saline was injected into the heart, and blood was removed from the body using a perfusion pump machine. Then, the brain was removed and weighed.
  • the brain to be used for tissue staining experiments was fixed in a 4% PFA solution for 24 hours.
  • the fixed brain tissue was immersed in a 20% sucrose solution for 24 hours, and then in a 30% sucrose solution for 48 hours to remove moisture.
  • the dehydrated brain tissue was taken out, excess moisture was removed, and the brain tissue and frozen tissue embedding agent (OCT compound) were placed together in a mold to protect the tissue and freeze the brain tissue as quickly as possible using dry ice.
  • the frozen brain tissue mold was stored in a -80°C freezer. After that, the brain tissue was cut into 30 ⁇ m thick sections using a cryostat for frozen sections and stored in a 0.05% sodium azide solution.
  • Brain tissue samples were permeabilized in 0.3% PBS-T solution. Brain tissue samples were blocked in 5% BSA solution in PBS for 1 h. Brain tissues were placed in a solution of 3% BSA and 0.1% Tween-20 in PBS containing 1:200 dilution of AT8 (phospho-Tau S202/T205), a tau hyperphosphorylation antibody, and bound overnight. Brain tissues were washed three times for 10 min in PBS solution.
  • the brain tissues were placed in a solution of 3% BSA and 0.1% Tween-20 in PBS, diluted 1:500 with the secondary antibody, and bound for 1 hour at room temperature.
  • the brain tissues were soaked in the PBS solution and washed once for 10 minutes.
  • the nuclei were stained by soaking the brain tissues in a solution of Hoechst (stock conc. 1 mg/mL) in PBS, diluted 1:2000.
  • the brain tissues were soaked in the PBS solution and washed three times for 10 minutes. Fluorescence imaging of the brain tissues was performed using a slide scanner.
  • tau hyperphosphorylation was significantly suppressed in all brain regions of the GV2002 administration group compared to the vehicle administration group.
  • the AT8 fluorescence intensity in the sensorimotor cortex area of the GV2002-administered group was significantly reduced by 57% compared to the vehicle-administered group.
  • the AT8 fluorescence intensity in the hippocampus region of the GV2002-administered group was significantly reduced by 62% compared to the vehicle-administered group.
  • the AT8 fluorescence intensity in the motor cortex area of the GV2002-administered group was significantly reduced by 65% compared to the vehicle-administered group.
  • the AT8 fluorescence intensity in the substantia nigra region of the GV2002-administered group was significantly reduced by 69% compared to the vehicle-administered group.
  • the brains of a 4R tauopathy mouse model that was administered drugs for 5 months from 7.5 to 12.5 months of age were extracted and brain tissues were analyzed using lipid staining.
  • Brain tissue sampling of the mouse model was performed using the same method as in Example 4-5.
  • Brain tissue slides were scanned using Zeiss Axio Scan to obtain fluorescence images of stained brain tissues.
  • tau oligomer formation was significantly inhibited in all brain regions of the GV2002 administration group compared to the vehicle administration group.
  • the Tau-BiFC fluorescence intensity in the sensorimotor cortex area of the GV2002-administered group was significantly reduced by 58% compared to the vehicle-administered group.
  • the Tau-BiFC fluorescence intensity in the hippocampus region of the GV2002-administered group was significantly reduced by 63% compared to the vehicle-administered group.
  • the Tau-BiFC fluorescence intensity in the motor cortex area of the GV2002-administered group was significantly reduced by 56% compared to the vehicle-administered group.
  • the Tau-BiFC fluorescence intensity in the substantia nigra region of the GV2002-administered group was significantly reduced by 56% compared to the vehicle-administered group.
  • the mouse model was anesthetized, saline was injected into the heart, and blood was removed from the body using a perfusion pump machine. The brain was then removed and weighed. The removed brain was homogenized with 1 mL RIPA buffer (containing protease and phosphatase inhibitor cocktail).
  • the homogenized brain lysate was transferred to an EP tube and incubated for 2 h in an orbital shaker at 4°C. After centrifugation at 13,000 rpm for 20 min at 4°C, the supernatant (soluble fraction) was collected in a new EP tube and stored at -80°C.
  • the concentration of fractionated samples was quantified by the Bradford protein quantification method.
  • RIPA buffer and 4X SDS Laemmli sample buffer (containing 2.5% ⁇ -mercaptoethanol for reducing conditions) were added to each sample to a final concentration of 2 mg/mL. The samples were then boiled at 97°C for 5 minutes.
  • the supernatant was transferred and the remaining pellet was dissolved in RIPA buffer containing 1 mL of 1 M sucrose and DNase I (1 mg/mL concentration). After centrifugation at 13,000 rpm for 20 min at 4°C, the supernatant was removed, and the remaining pellet was resuspended in 2% SDS solution (1 mL per 1 g of tissue) and incubated at room temperature for 1 h.
  • Centrifugation was performed at 13,000 rpm for 1 min at room temperature, and the supernatant (insoluble fraction) was collected and transferred to a new ep-tube, and an equal volume of 2x SDS Laemmli sample buffer (2.5% ⁇ -mercaptoethanol for reducing conditions) was added. The sample was boiled at 97°C for 5 min.
  • the membrane was blocked in 5% BSA solution in TBS-T (containing 0.1% Tween-20) for 1 hour at room temperature.
  • the membrane was incubated in 2.5% BSA solution in TBS-T (containing 0.1% Tween-20) containing primary antibodies (Anti-Tau (Tau5) antibody (ab80579, 1:5000), Anti-Tau (phospho S199) antibody (ab109390, 1:5000), and Anti-Tau (phospho S396) antibody (ab81268, 1:5000)) overnight at 4°C in an orbital shaker.
  • the membrane was washed three times for 10 minutes in TBS-T (containing 0.1% Tween-20).
  • the membrane was incubated in 2.5% BSA solution in TBS-T (containing 0.1% Tween-20) containing secondary antibodies (Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) secondary antibody (ab6789, 1:10000) and Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) secondary antibody (ab6721, 1:10000)) for 1 hour at room temperature.
  • the membrane was washed three times for 10 minutes in TBS-T (containing 0.1% Tween-20).
  • the bands on the membrane were detected using ChemiDoc using ECL solution, a HRP substrate.
  • the intensities of the detected bands were quantified using Image J software (NIH).
  • GV2002 has the effect of inhibiting phosphorylated tau formation and insoluble tau aggregation.

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Abstract

본 발명은 4R 타우병증에 대한 예방, 개선 및/또는 치료 효능을 갖고, 생체에 안전하여 이상반응을 포함하는 부작용이 적은 펩티드, 이를 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

신규 펩티드 및 이의 용도
본 발명은 신규 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
타우(tau)는 중추 신경계(CNS)의 신경세포에 풍부하게 존재하여 주로 축삭(axon)의 미세소관의 안정성을 유지하는 역할을 한다.
타우 단백질에 인(phosphate)이 과도하게 부착되는 과인산화(hyperphosphorylation)가 일어나면 타우는 미세소관으로부터 분리되어 불용성 응집체인 신경원섬유 농축체(neurofibrillary tangle, NFT)를 형성한다. 이러한 비정상적인 타우의 응집과 관련된 신경퇴행성 질환을 총칭하여 타우병증(tauopathy)이라고 한다.
타우병증은 이의 병인이 되는 타우 단백질의 아이소폼에 따라 3R 타우병증 및 4R 타우병증으로 구분된다.
4R 타우병증은 진행성핵상마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration, CBD), 은친화입자병(Argyrophilic grain disease, AGD), 구상교세포 타우병증(Globular glial tauopathy, GGT) 및 연령관련 타우 성상교세포병증(Aging-related tau astrogliopathy, ARTAG) 등을 포함한다.
고령화에 따라 4R 타우병증 환자 수가 증가하고 있지만, 현재 이를 효과적으로 치료하거나 예방할 수 있는 약물은 없다.
타우 응집 저해제로 알려진 LMTM에 대해 임상3상이 진행하고 있으나 LMTM의 4R 타우병증에 대한 구체적인 효능에 대해서는 보고된 바가 없다. 또한 LMTM은 타우 응집 저해구간(EC50　= 2.2±0.2 μM)에서 세포 독성(GI50　= 6.4±0.3 μM)이 나타난다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 타우 과인산화 및 응집화를 억제함으로써 4R 타우병증을 치료하고자 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 4R 타우병증의 예방 또는 치료 효능을 갖는 신규 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 하기 화학식 1의 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 1]
Figure PCTKR2024008142-appb-img-000001
2. 위 1의 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 위 2에 있어서, 4R 타우병증은 진행성핵상마비, 피질기저핵변성, 은친화입자병, 구상교세포 타우병증 및 연령관련 타우 성상교세포병증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 위 3에 있어서, 4R 타우병증의 예방 또는 치료는 타우 단백질의 과인산화 및 응집화 억제에 의한 것인, 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 하기 화학식 1의 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는, 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품:
[화학식 1]
Figure PCTKR2024008142-appb-img-000002
6. 위 5에 있어서, 4R 타우병증은 진행성핵상마비, 피질기저핵변성, 은친화입자병, 구상교세포 타우병증 및 연령관련 타우 성상교세포병증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
7. 위 6에 있어서, 4R 타우병증의 예방 또는 개선은 타우 단백질의 과인산화 및 응집화 억제에 의한 것인, 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
본 발명의 화학식 1의 펩티드 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 우수한 타우 단백질 과인산화 억제 효과를 갖는다.
본 발명의 화학식 1의 펩티드 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 우수한 타우 단백질 응집화 억제 효과를 갖는다.
본 발명의 화학식 1의 펩티드 또는 이의 염을 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식품은 타우 단백질 과인산화 및 응집화를 억제함으로써 4R 타우병증의 예방, 개선 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 펩티드, 약학 조성물 및 건강기능식품은 생체내에서 안정적으로 오랫동안 약효를 낼 수 있다.
도 1은 GV2002의 인간 혈장내 안정성을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 랫드에게 GV2002를 정맥투여한 후 이의 약동학적 프로파일(pharmacokinetic profile, PK profile)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 랫드에게 GV2002를 피하투여한 후 이의 약동학적 프로파일을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 GV2002의 효능을 검증하기 위한 생체내 실험에 사용한 마우스 그룹을 나타낸 것이다.
도 5는 4R 타우병증 마우스 모델을 대상으로 수행한 GV2002의 효능 평가 실험 일정을 나타낸다.
도 6 및 7은 4R 타우병증 마우스 모델의 운동 능력 개선 평가 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 4R 타우병증 마우스 모델의 인지 능력 개선 평가 실험 방법 및 결과를 나타낸다.
도 9는 4R 타우병증 마우스 모델의 공간 기억 능력 개선 평가 실험 방법 및 결과를 나타낸다.
도 10은 뇌조직 면역형광염색을 통한 GV2002의 타우 과인산화 억제 효능 평가 실험 결과를 나타낸다.
도 11은 뇌조직 Tau-BiFC 이미징을 통한 GV2002의 타우 올리고머 형성 억제 효능 평가 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 뇌 용해물 분석을 통한 GV2002의 타우 과인산화 및 응집화 억제 효능 평가 실험 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 화학식 1의 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2024008142-appb-img-000003
본 발명에서 화학식 1의 펩티드는 이의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 화학식 1의 펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩티드를 의미한다.
본 발명은 화학식 1의 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "약학적으로 허용되는"이란 조성물에 노출되는 세포나 개체에 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명에서 4R 타우병증은 4R 타우 단백질의 응집화에 기인하는 신경퇴행성 질환을 총칭하는 것으로서, 진행성핵상마비, 피질기저핵변성, 은친화입자병, 구상교세포 타우병증 및 연령관련 타우 성상교세포병증 등을 포함한다.
본 발명에서 "예방"은 4R 타우병증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "개선" 및 "치료"는 4R 타우병증이 발병한 것으로 의심되거나, 발병한 개체의 증상을 호전시키거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
일 실시예에서 예방, 개선 및/또는 치료는 타우 단백질의 과인산화를 억제함으로써 이루어질 수 있다.
일 실시예에서 예방, 개선 및/또는 치료는 타우 단백질 응집화를 억제함으로써 이루어질 수 있다.
일 실시예서 예방, 개선 및/또는 치료는 4R 타우병증이 발병한 것으로 의심되거나, 발병한 개체의 운동 능력을 향상시키는 것일 수 있다.
일 실시예서 예방, 개선 및/또는 치료는 4R 타우병증이 발병한 것으로 의심되거나, 발병한 개체의 인지 능력을 향상시키는 것일 수 있다.
일 실시예서 예방, 개선 및/또는 치료는 4R 타우병증이 발병한 것으로 의심되거나, 발병한 개체의 공간 기억 능력을 향상시키는 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 포함할 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에게 투여하여 제공될 수 있다.
본 발명에서 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 4R 타우병증이 발병하였거나 발병할 수 있는 가축 및 마우스 등의 모든 동물을 의미하며, 예컨대 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물을 비경구 투여하는 경우, 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제, 예컨대 정제, 환제, 산제, 과립제 또는 캡슐제로 제공될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 투여를 위한 액상 제제, 예컨대 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제로 제공될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제, 예컨대 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 또는 좌제로 제공될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있으며, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 4R 타우병증을 치료하기에 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물의 약학적으로 유효한 양은 4R 타우병증의 중증도, 약학 조성물의 활성도, 개체 또는 환자의 약학 조성물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간 및 병용 약물을 포함한 요소, 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 종래의 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있으며, 병용 투여되는 경우 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있고, 단일 또는 다중 투여될 수 있으며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 화학식 1의 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에서 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 4R 타우병증의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 건강기능식품 총 중량에 대하여 화학식 1의 펩티드를 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 4R 타우병증의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] GV2002의 제조
하기 화학식 1의 구조식을 갖는 펩티드(이하 GV2002)를 제조하였다.
Figure PCTKR2024008142-appb-img-000004
[화학식 1]
GV2002를 공지된 Fmoc 고상 펩티드 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)에 따라 C-말단부터 아미노산을 하나씩 커플링함으로써 합성하였다.
펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Boc, t-Bu(t-butylester) 또는 Pbf(2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 펩티드 합성에 사용한 아미노산 원료는 예컨대 다음과 같다:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH.
커플링 시약(Coupling reagent)으로는 DIC(Diisopropylcarbodiimide), DMF(Dimethylforamide), Oxyma(Ethyl(hydroxyamino)Cyanoacetate) 및 IPA(Isopropyl alcohol)를 사용하였다. Fmoc 제거에는 DMF 중 20% 피페리딘(20% piperidine in DMF)을 사용하였다. 합성된 펩티드를 수지에서 분리하고 잔기의 보호기를 제거하는데 절단 칵테일(Cleavage Cocktail)[95% TFA(trifluoroacetic acid) / 5% H2O / 50 mg/mL DTT(Dithiothreitol)]을 사용하였다.
펩티드의 N-말단 캡핑(capping)을 위해 Ac2O(Acetic anhydride) / DIEA(Diisopropylethylamine) / DMF(Dimethylformamide)를 사용하여 N-말단을 아세틸화하였다. 펩티드의 C-말단은 아미노화하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태에서 순차적으로 각각의 아미노산들을 반응시키고 용매로 세척하고 탈보호하는 과정을 반복함으로써 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
카운터 이온 교환(counter ion exchange)과정으로는 HOAc 염 형태로 물에 용해되어 있는 GV2002를 AmberChrom 이온교환 수지를 사용하여 염화물 형태로 치환하였다. 치환된 GV2002는 PVDF 필터로 여과하여 동결건조하였다.
GV2002의 구체적인 합성 과정은 다음과 같다:
(1) 커플링
Fmoc-Rink Methylbenzhydrylamine 수지에 C-말단부터 N-말단까지의 각각의 아미노산과 DMF에 녹여진 커플링 시약 DIC/Oxyma/IPA를 첨가함으로써 아미노산들을 커플링화 하였다. 그런 다음 DMF로 세척하였다.
(2) Fmoc 탈보호 및 N-말단 캡핑
DMF 중 20%의 피페리딘을 처리하여 Fmoc 탈보호화 한 후, N-말단을 아세틸화 하였다.
(3) 절단
합성이 완료된 펩티드가 결합된 수지에 절단 칵테일을 처리하여 펩티드를 수지에서 분리하였다.
(4) 여과
수득한 혼합물을 농축하고 MTBE/hexane으로 침전시켰다. 그런 다음 침전물을 여과한 후 건조시켰다.
(5) 정제
수득한 건조 여과물을 Prep-HPLC로 정제 후 LC/MS로 분자량을 확인하고 동결건조 하였다.
(6) 분말 제조
AmberChrom 수지를 이용해 염화물로 치환하고 PVDF에 여과시킨 후 동결건조하여 분말로 제조하였다.
[실시예 2] GV2002의 인간 혈장내 안정성 확인
펩티드를 100% 인간 혈장에 첨가하여 5 μM 희석하고 37℃에서 10, 60 및 240분 동안 교반 반응시킨 후 수집하여 0.1% 포름산이 함유된 메탄올을 이용하여 혈장 단백질 침전법으로 전처리하였다. 상등액을 수집하고 아래 표 1의 조건으로 LC-MS 분석을 진행하여 반응 전 펩티드 량 대비 잔여 펩티드 비율(%)을 측정하였다.
Figure PCTKR2024008142-appb-img-000005
도 1에 나타낸 바와 같이 GV2002의 반응 전 펩티드 량 대비 잔여 펩티드 비율이 60분에서 57.23%로 나타났고, 240분에서는 46.54%로 나타났다. 이를 통해 GV2002의 혈장내 안정성을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] GV2002의 약동학적 프로파일 확인
실시예 1에서 제조한 GV2002의 약동학적 프로파일을 확인하기 위하여 GV2002를 투여한 랫드의 혈장을 채취하고 9배의 0.1% 포름산이 함유된 메탄올을 가해 단백질 침전법으로 전처리하고 16,100 g에서 10분간 원심분리 후 상층액을 취해 아래 표 2의 조건으로 LC-MS 분석을 실시하였다.
Figure PCTKR2024008142-appb-img-000006
3-1. 정맥투여를 통한 GV2002의 약동학적 프로파일 확인
그룹당 3마리의 Sprague Dawley Rats에 GV2002를 정맥(IV) 경로로 투여하였다. 투여 후 0.033, 0.083, 0.17, 0.25, 0.5, 1 및 2시간에 혈액을 수득하였다. 혈액 샘플은 원심분리하여 혈장을 분리하고 전처리후 LC-MS를 이용한 분석을 수행하고 Phoenix WinNonlin(Pharsight ver 6.4, USA)프로그램의 Non-compartmental analysis 모델을 이용하여 약동학적 파라미터를 산출하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, GV2002의 AUCt 값이 0.438 ug·h/mL으로 나타났다. 이를 통해 생체내에서도 GV2002가 안정한 상태로 분해되지 않고 오래 남아 있음을 확인하였다.
3-2. 피하투여를 통한 GV2002의 약동학적 프로파일 확인
그룹당 3마리의 Sprague Dawley Rats에 GV2002를 피하(SC) 경로로 투여하였다. 투여 후 0.033, 0.083, 0.17, 0.25, 0.5, 1 및 2시간에 혈액을 수득하였다. 혈액 샘플은 원심분리하여 혈장을 분리하고 전처리후 LC-MS를 이용한 분석을 수행하고 Phoenix WinNonlin(Pharsight ver 6.4, USA)프로그램의 Non-compartmental analysis 모델을 이용하여 약동학적 파라미터를 산출하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 피하투여를 진행하였을 때에도 생체내에서 GV2002가 안정한 상태로 분해되지 않고 오래 남아 있음을 알 수 있다.
[실시예 4] 4R 타우병증 동물 모델기반 GV2002 효능 평가
도 4에 나타낸 4R 타우병증 마우스 그룹을 대상으로 도 5에 나타낸 일정 및 하기 표 3의 개요에 따라 생체내(in vivo) 실험을 수행하였다.
Figure PCTKR2024008142-appb-img-000007
4-1. Rota-rod 실험을 통한 운동 능력 개선 평가
7.5개월령부터 12.5개월령까지 5개월간 약물을 투여한 4R 타우병증 마우스 모델을 대상으로 Rota-rod 실험을 진행하여 GV2002의 운동 능력 개선 효능을 평가하였다.
(1) 실험 방법
1일차에 적응훈련을 진행하고, 2일차에 행동 실험을 진행하였다. 적응훈련 및 행동실험 수행 전에 마우스가 공간에 적응할 수 있도록 1시간 동안 시간을 주었다. 적응훈련에서 마우스를 5 rpm에서 25 rpm의 속도의 트레드밀 위에서 300초 동안 걷게 하였으며, 균형을 잃고 바닥에 떨어지는 마우스를 다시 걷게 하였다. 행동실험에서 마우스를 5 rpm에서 40 rpm까지 점차적으로 증가되는 속도의 트레드밀 위에서 300초 동안 걷게 하였으며, 마우스가 균형을 잃고 바닥에 떨어질 때까지의 시간(초)을 측정하였다. 측정한 값을 Dunnett's multiple comparisons test를 이용한 Two-way ANOVA로 분석하였다.
(2) 실험 결과
도 6에 나타난 바와 같이, GV2002 투여군이 비히클 투여군에 비해 유의미하게 개선된 운동 능력을 보였으며, 참조 화합물 LMTM 투여군보다 상대적으로 향상된 운동 능력을 보였다.
4-2. 개방 공간 실험을 통한 운동 능력 개선 평가
7.5개월령부터 12.5개월령까지 5개월간 약물을 투여한 4R 타우병증 마우스 모델을 대상으로 개방 공간 실험을 진행하여 GV2002의 운동 능력 개선 효능을 평가하였다.
(1) 실험 방법
마우스의 행동 반응이 변하는 것을 방지하기 위해 실험 전 5일간(1일 내지 5일차) 핸들링을 진행하였다. 핸들링은 매 세션마다 2분씩 수행되었다. 6일차에 40 cm x 40 cm 크기의 칸막이에 마우스를 넣고 10분간 개방 공간 실험을 진행하였다. 실험 수행 전에 마우스가 공간에 적응할 수 있도록 1시간 동안 시간을 주었다. 개방 공간 실험에서 마우스의 이동 궤적, 이동 거리 및 운동 속도를 기록하였다. 실험을 진행하는 동안 일정한 조도를 유지하였다. 기록한 값을 Dunnett's multiple comparisons test를 이용한 One-way ANOVA로 분석하였다.
(2) 실험 결과
도 7에 나타난 바와 같이, 개방 공간에서의 총 이동 거리 및 운동 속도는 비히클 투여군에 비해 GV2002 투여군에서 유의미하게 높았으며, 이는 GV2002 투여군의 운동 능력이 개선되었음을 의미한다.
4-3. 신규 물체 인식 실험을 통한 인지 능력 개선 평가
7.5개월령부터 12.5개월령까지 5개월간 약물을 투여한 4R 타우병증 마우스 모델을 대상으로 신규 물체 인식 실험을 진행하여 GV2002의 인지 능력 개선 효능을 평가하였다.
(1) 실험 방법
실시예 4-2의 실험 방법에 따라 1일 내지 6일차까지 실험을 진행한 마우스를 대상으로 7일차 및 8일차에 걸쳐 신규 물체 인식 실험을 수행하였다. 7일차에는 도 8a에 도시된 바와 같이 유사한 두 물체가 배치되어 있는 40 cm x 40 cm 크기의 칸막이에 마우스를 넣고 10분간 학습하도록 하고, 8일차에는 두 물체 중 하나를 신규한 것으로 교체한 후 칸막이에 마우스를 넣고 10분간 행동을 관찰하면서 신규한 물체에 머무는 시간을 측정하였다. 7일차 및 8일차 실험 수행 전에 마우스가 공간에 적응할 수 있도록 1시간 동안 시간을 주었다. 실험을 진행하는 동안 일정한 조도를 유지하였다. 기록한 값을 Sidak's multiple comparisons test를 이용한 Two-way ANOVA로 분석하였다.
(2) 실험 결과
도 8b에 나타난 바와 같이, 비히클 투여군이 학습된 물체와 신규한 물체를 유의미하게 구분하지 못한 반면 GV2002 투여군은 신규한 물체를 탐색한 시간이 학습된 물체를 탐색한 시간에 비해 유의미하게 증가하여 신규한 물체에 대한 인지 능력 개선을 보였다.
4-4. Y-maze 실험 통한 공간 기억 능력 개선 평가
7.5개월령부터 12.5개월령까지 5개월간 약물을 투여한 4R 타우병증 마우스 모델을 대상으로 Y-maze 실험을 진행하여 GV2002의 공간 기억 능력 개선 효능을 평가하였다.
(1) 실험 방법
실험 수행 전에 마우스가 공간에 적응할 수 있도록 1시간 동안 시간을 주었다. 그럼 다음, 도 9a에 도시된 바와 같은 Y 모양 플랫폼의 시작점 A에 마우스를 두었다. 8분 동안 마우스의 행동을 기록하였다.
(2) 실험 결과
도 9b에 나타난 바와 같이, GV2002 투여군은 비히클 투여군에 비해 이전에 탐구했던 구역이 아닌 새로운 구역을 탐구하는 spontaneous alternation 행동 비율이 유의미하게 증가하였으며, 이는 공간 기억 능력이 개선되었음을 의미한다.
4-5. 뇌조직 면역형광염색을 통한 타우 과인산화 억제 평가
7.5개월령부터 12.5개월령까지 5개월간 약물을 투여한 4R 타우병증 마우스 모델의 뇌를 적출하여 면역형광염색을 통해 뇌조직을 분석하였다.
(1) 실험 방법
뇌조직 샘플링을 위해 마우스 모델을 마취하고 심장으로 식염수를 주입한 후 관류 펌프 기계를 사용해 체내 혈액을 제거하였다. 그럼 다음 뇌를 적출한 뒤, 무게를 측정하였다. 조직 염색 실험에 사용할 뇌를 4% PFA 용액에 담가 24시간 동안 고정시켰다. 고정된 뇌조직을 20% 수크로스 용액에 24시간 동안 담근 후 30% 수크로스 용액에 48시간 동안 담가 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 뇌조직을 꺼내서 여분의 수분을 제거해준 뒤, 몰드에 뇌조직과 동결조직 포매제(OCT compound)를 함께 넣어 조직을 보호하면서 드라이아이스로 뇌조직을 최대한 빠르게 얼렸다. 얼린 뇌조직 몰드를 -80℃의 냉동기에 보관하였다. 이후, 동결 절편용 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 30 μm 두께로 뇌조직을 자르고 0.05% 아자이드화 나트륨 용액에 보관하였다.
뇌조직 면역형광염색을 위해 30 μm 두께의 뇌조직 동결 절편을 뇌 영역별로 선별한 뒤, PBS 용액에 담가 10분간 3회 세척하였다. 3.7% 포름알데히드로 5분간 고정시켰다. PBS 용액에 10분간 3회 세척하였다. 뇌조직 샘플을 0.3% PBS-T 용액에서 투과화(permeabilization) 시켰다. 뇌조직 샘플을 PBS 중 5% BSA 용액에 담가 1시간 동안 블로킹(blocking) 시켰다. 1차 항체로서 타우 과인산화 항체인 AT8(phospho-Tau S202/T205)을 1:200 비율로 희석시킨 PBS 중 3% BSA 및 0.1% Tween-20 용액에 뇌조직을 넣어 하룻밤 결합시켰다. 뇌조직을 PBS 용액에 담가 10분간 3회 세척하였다. 2차 항체를 1:500으로 희석시킨 PBS 중 3% BSA 및 0.1% Tween-20 용액에 뇌조직을 넣어 1시간 동안 실온에서 결합시켰다. 뇌조직을 PBS 용액에 담가 10분간 1회 세척하였다. 1:2000 비율로 희석된 PBS 중 Hoechst(stock conc. 1 mg/mL) 용액에 뇌조직을 담가 핵을 염색하였다. 뇌조직을 PBS 용액에 담가 10분간 3회 세척하였다. 슬라이드 스캐너를 사용해서 뇌조직 형광 이미징을 진행하였다.
염색된 뇌조직의 형광 이미지를 얻기 위해 Zeiss Axio Scan(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 뇌조직 슬라이드를 스캔하였다. 형광 이미징을 통해 얻은 부위별 뇌조직, 즉, 감각운동피질(somatosensory cortex), 해마(hippocampus, CA1), 운동피질(motor cortex) 및 흑색질(substantia nigra)에서 AT8 형광 수치를 Image J software(NIH)를 통해 계산하였다. 계산된 값을 Dunnett's multiple-comparisons test을 이용한 One-way ANOVA로 분석하였다.
(2) 실험 결과
도 10에 나타난 바와 같이, GV2002 투여군의 모든 뇌영역에서 타우 과인산화가 비히클 투여군 대비 유의미하게 억제되었다.
도 10a에 나타난 바와 같이, 감각운동피질영역에서 GV2002 투여군의 AT8 형광 강도는 비히클 투여군에 비해 57%로 유의미하게 감소하였다.
도 10b에 나타난 바와 같이, 해마영역에서 GV2002 투여군의 AT8 형광 강도는 비히클 투여군에 비해 62%로 유의미하게 감소하였다.
도 10c에 나타난 바와 같이, 운동피질영역에서 GV2002 투여군의 AT8 형광 강도는 비히클 투여군에 비해 65%로 유의미하게 감소하였다.
도 10d에 나타난 바와 같이, 흑색질영역에서 GV2002 투여군의 AT8 형광 강도는 비히클 투여군에 비해 69%로 유의미하게 감소하였다.
이로써 GV2002의 4R 타우 과인산화 억제 효능을 확인하였다.
4-6. 뇌조직 Tau-BiFC 이미징을 통한 타우 올리고머 형성 억제 평가
7.5개월령부터 12.5개월령까지 5개월간 약물을 투여한 4R 타우병증 마우스 모델의 뇌를 적출하여 지질염색을 통해 뇌조직을 분석하였다.
(1) 실험 방법
실시예 4-5와 동일한 방법으로 마우스 모델의 뇌조직 샘플링을 수행했다.
뇌조직 지질염색을 통한 자가 형광 제거를 위해 70% 에탄올 중 0.05% Sudan Black B 용액을 밤새 저어준 다음 0.22 μm 필터를 통해서 입자를 걸렀다. 30 μm 두께의 영역별 뇌조직 동결 절편을 탈이온수에 담가 5분간 3회 세척하였다. 준비한 0.05% Sudan Black B 용액에 뇌조직을 담가 10분간 염색을 진행하였다. Sudan Black B에 염색된 뇌조직을 0.1% PBS-T 용액에 담가 30초 간격으로 세척하며 염색 정도를 조절하였다. 탈이온수에서 5분간 3회 세척하였다. 탈이온수 중 0.2 μg/mL Hoechst 용액에 뇌조직을 담가 20분 동안 핵 염색을 진행하였다. 탈이온수에서 5분간 3회 세척하였다. 슬라이드 스캐너를 사용해서 Tau-BiFC 이미징을 진행하였다.
염색된 뇌조직의 형광 이미지를 얻기 위해 Zeiss Axio Scan을 사용하여 뇌조직 슬라이드를 스캔하였다. 형광 이미징을 통해 얻은 부위별 뇌조직, 즉, 감각운동피질, 해마, 운동피질 및 흑색질에서 Tau-BiFC 형광 수치를 Image J software를 통해 계산하였다. 계산된 값을 Dunnett's multiple-comparisons test을 이용한 One-way ANOVA로 분석하였다.
(2) 실험 결과
도 11에 나타난 바와 같이, GV2002 투여군의 모든 뇌영역에서 타우 올리고머 형성이 비히클 투여군 대비 유의미하게 억제되었다.
도 11a에 나타난 바와 같이, 감각운동피질영역에서 GV2002 투여군의 Tau-BiFC 형광 강도는 비히클 투여군에 비해 58%로 유의미하게 가 감소하였다.
도 11b에 나타난 바와 같이, 해마영역에서 GV2002 투여군의 Tau-BiFC 형광 강도는 비히클 투여군에 비해 63%로 유의미하게 감소하였다.
도 11c에 나타난 바와 같이, 운동피질영역에서 GV2002 투여군의 Tau-BiFC 형광 강도는 비히클 투여군에 비해 56%로 유의미하게 감소하였다.
도 11c에 나타난 바와 같이, 흑색질영역에서 GV2002 투여군의 Tau-BiFC 형광 강도는 비히클 투여군에 비해 56%로 유의미하게 감소하였다.
이로써 GV2002의 타우 올리고머 형성 억제 효능을 확인하였다.
4-7. 뇌 용해물 분석을 통한 타우 과인산화 및 응집화 억제 평가
7.5개월령부터 12.5개월령까지 5개월 간 약물을 투여한 4R 타우병증 마우스 모델의 뇌용해물을 얻어 가용성 분획(soluble fraction) 샘플 및 불용성 분획(insoluble fraction) 샘플을 가지고 전체 타우(Tau5) 및 인산화 타우(pS199, pS396) 항체를 이용한 면역블롯을 진행하고 전체 타우 및 인산화 타우 정도를 정량 분석하였다.
(1) 실험 방법
마우스 모델을 마취하고 심장으로 식염수를 주입한 후 관류 펌프 기계를 사용하여 체내 혈액을 제거하였다. 그런 다음 뇌를 적출한 뒤, 무게를 측정하였다. 적출한 뇌에 1 mL RIPA 완충액(프로테아제 및 포스파타제 억제 칵테일 함유)을 넣고 균질화시켰다.
균질화된 뇌 용해물을 ep-튜브에 옮긴 다음 4℃ 오비탈 셰이커(orbital shaker)에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 20분 동안 13,000 rpm으로 원심분리한 후 상층액(가용성 분획)을 새 ep-튜브에 모아 -80℃에 보관하였다.
면역블롯 샘플 준비를 위해, 브래드포드(Bradford) 단백질 정량 방법으로 용해서 분획 샘플의 농도를 정량화하였다. 각 샘플에 RIPA 완충액 및 4X SDS Laemmli 샘플 완충액(환원 조건을 위한 2.5% β-머캅토에탄올 함유)을 첨가하여 최종 농도가 2 mg/mL이 되도록 만들었다. 그런 다음 샘플을 97℃에서 5분 동안 끓여주었다.
한편, 불용성 분획을 샘플링하기 위해 상층액을 옮기고 남은 펠렛을 1 mL의 1 M 수크로스 및 DNaseⅠ(1 mg/mL 농도)을 함유하는 RIPA 완충액으로 풀어주었다. 4℃에서 20분 동안 13,000 rpm으로 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 남은 펠렛을 2% SDS 용액(조직 1 g 당 1 mL)으로 재현탁한 후 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 1분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고, 상층액(불용성 분획)을 모아 새 ep-튜브에 옮기고 동량의 2x SDS Laemmli 샘플 완충액(환원 조건을 위한 2.5% β-머캅토에탄올)을 첨가하였다. 샘플을 97℃에서 5분 동안 끓여주었다.
가용성 분획 및 불용성 분획의 뇌 용해물 샘플 20 μg을 각각 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다(SDS-PAGE running buffer: 1X Tris/Glycine/SDS buffer in 3'D.W). 80 V에서 30분 그리고 90 V로 바꾸어서 1시간 동안 전기영동을 진행했다. Transfer tray 사이즈에 맞게 잘라 둔 PVDF 멤브레인을 100% 메탄올에 1분, 오토클레이브 3’DW에 3분 그리고 차갑게 둔 1X Transfer buffer(Transfer buffer: 1X Tris/Glycine buffer w/ 20% Methanol in 3'D.W.)에 10분 동안 담가 두었다. 100 V에서 1시간 20분 동안 Wet-Transfer를 진행했다. TBS-T(0.1% Tween-20 함유) 중 5% BSA 용액에 멤브레인을 담가 상온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 1차 항체(Anti-Tau(Tau5) antibody(ab80579, 1:5000), Anti-Tau(phospho S199) antibody(ab109390, 1:5000) 및 Anti-Tau(phospho S396) antibody(ab81268, 1:5000))가 포함된 TBS-T(0.1% Tween-20 함유) 중 2.5% BSA 용액에 멤브레인을 담가 4℃, 오비탈 셰이커에서 하룻밤동안 결합시켰다. 멤브레인을 TBS-T(0.1% Tween-20 함유) 용액에 담가 10분간 3회 세척하였다. 2차 항체(Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) secondary antibody (ab6789, 1:10000) 및 Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) secondary antibody (ab6721, 1:10000))가 포함된 TBS-T(0.1% Tween-20 함유) 중 2.5% BSA 용액에 멤브레인을 담가 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. 멤브레인을 TBS-T(0.1% Tween-20 함유) 용액에 담가 10분간 3회 세척하였다. HRP substrate인 ECL 용액을 사용하여 ChemiDoc을 통해 멤브레인의 밴드를 검출하였다. 검출된 밴드의 강도는 Image J software (NIH)를 통해 정량화하였다.
(2) 실험 결과
도 12에 나타난 바와 같이, 가용성 분획을 이용한 타우 면역블롯 결과, GV2002 투여군에서 인산화 타우 pS199 및 pS396 정도가 비히클 투여군 대비 유의미하게 감소하였으며, 불용성 분획을 이용한 타우 면역블롯 결과에서도 GV2002 투여군에서 전체 타우가 비히클 투여군 대비 유의미하게 감소하였다.
도 12a에 나타난 바와 같이, GV2002 투여군에서 인산화 타우 pS199가 비히클 투여군 대비 66%로 유의미하게 감소하였다.
도 12b에 나타난 바와 같이, GV2002 투여군에서 인산화 타우 pS396가 비히클 투여군 대비 56%로 유의미하게 감소하였다.
도 12c에 나타난 바와 같이, GV2002 투여군에서 불용성 타우 수준이 비히클 투여군 대비 57%로 유의미하게 감소하였다.
이로써 GV2002가 인산화 타우 형성 억제 효능 및 불용성 타우 응집 억제 효능을 갖는 것을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1의 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2024008142-appb-img-000008
  2. 청구항 1의 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 4R 타우병증(tauopathy)의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 4R 타우병증은 진행성핵상마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration, CBD), 은친화입자병(Argyrophilic grain disease, AGD), 구상교세포 타우병증(Globular glial tauopathy, GGT) 및 연령관련 타우 성상교세포병증(Aging-related tau astrogliopathy, ARTAG)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 4R 타우병증의 예방 또는 치료는 타우 단백질의 과인산화 및 응집화 억제에 의한 것인, 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 하기 화학식 1의 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는, 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2024008142-appb-img-000009
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 4R 타우병증은 진행성핵상마비, 피질기저핵변성, 은친화입자병, 구상교세포 타우병증 및 연령관련 타우 성상교세포병증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 4R 타우병증의 예방 또는 개선은 타우 단백질의 과인산화 및 응집화 억제에 의한 것인, 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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