WO2025005231A1 - トバモウイルス属ウイルスに抵抗性のトマト植物、トマト植物細胞及びその作出方法 - Google Patents

トバモウイルス属ウイルスに抵抗性のトマト植物、トマト植物細胞及びその作出方法 Download PDF

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    • C12N9/10—Transferases (2.)

Definitions

  • the present invention relates to tomato plants and tomato plant cells that are resistant to Tobamovirus viruses, and methods for producing the same.
  • tomatoes are the second most produced horticultural vegetable crop in the world after potatoes, with annual production exceeding 180 million tons, accounting for more than 10% of total vegetable production.
  • tomatoes during cultivation can become infected with various pathogens such as bacteria and viruses, often causing significant damage.
  • Tobamovirus viruses are a collective name for the Tobacco Mosaic Virus (TMV), which was the first virus discovered in the world. They are highly infectious, highly resistant to inactivation, and stable.
  • TMV Tobacco Mosaic Virus
  • Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) is one of the emerging viruses that suddenly appeared in recent years and has spread rapidly around the world (Non-Patent Document 1). Currently, its occurrence is mainly noticeable in tomatoes and peppers.
  • ToBRFV was first discovered in Israel in the Middle East in 2014, but in the following years outbreaks have been found in Europe, including Jordan, Italy, Germany, and Turkey, as well as across the ocean in the United States, Canada, and China.
  • the source of the outbreak is likely to be around the Middle East, and because it is a highly contagious virus, it is speculated to be spreading rapidly around the world because trace amounts of the virus can adhere to or remain on seeds and materials, which can become sources of infection.
  • ToBRFV has not yet been discovered in Japan, and the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries and the Plant Protection Station have designated it as a significant virus in the "Pest Risk Analysis for Quarantine Pests.” They are taking border control measures to prevent its entry and are issuing maximum warnings, but it is highly likely that it will invade the country in the near future.
  • ToBRFV tomato caused by ToBRFV
  • the symptoms of tomato caused by ToBRFV are similar to those of previous tobamoviruses, with mosaic, silky leaves, yellowing, necrotic stems, and discoloration, necrotic and ring-shaped leaves on the leaves, but the symptoms such as mosaic on the leaves are weaker, while the necrotic fruit symptoms are stronger than those of other tobamoviruses.
  • Tobamoviruses are primarily transmitted by contaminated seeds, mechanical contact (conventional agricultural work), or contaminated soil, water, or tools (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Tm-2 and Tm-2a also known as Tm-2 2
  • ToBRFV Tobamovirus resistance genes
  • Non-Patent Document 5 In light of these circumstances, attempts have been made to develop new resistance genes, but so far there have been few conclusively good resistance gene candidates, as there are often many resistance-related genes or loci, the effects are insufficient, or there are many conditions that make them difficult to use in breeding.
  • Non-Patent Document 6 Another example is the report in Non-Patent Document 6.
  • the description in this document indicates that resistance can be obtained for the first time in plants by introducing four gene mutations through gene editing, and there are a large number of related genes.
  • Non-Patent Document 7 published in 2021 reports that the BAM gene, a tomato receptor-like kinase, interacts with the TMV movement protein (MP). This suggests that tobamoviruses may use the BAM gene for infection or movement within plants after infection.
  • MP TMV movement protein
  • Tobamovirus viruses particularly ToBRFV
  • the inventors have discovered a new resistance gene that is effective in preventing tomato diseases caused by Tobamovirus viruses, and have developed a plant variety that carries this gene, thereby providing a method for controlling Tobamovirus viruses and a plant that is resistant to Tobamovirus viruses.
  • the present invention provides the following tomatoes (i.e., tomato plants), parts thereof, and processed products thereof.
  • a tomato having resistance to Tobamovirus viruses wherein at least one gene selected from the group consisting of receptor-like kinase RLK genes and genes homologous thereto has a mutation, and expression of the gene having the mutation is suppressed due to the mutation, or a protein encoded by the gene having the mutation is non-functional against Tobamovirus viruses.
  • the tomato according to [1], wherein the mutation is introduced into a gene in the genome by genome editing technology.
  • [4] The tomato according to any one of [1] to [3], wherein the receptor-like kinase RLK gene is an RLK1 gene (Solyc02g091840) whose cDNA sequence comprises the base sequence shown in SEQ ID NO:1, and the homologous gene of the receptor-like kinase RLK gene is a homologous gene of the RLK1 gene whose cDNA sequence comprises a base sequence having 85% or more sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • [5] The tomato according to [4], which has a mutation in a region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO:3 in the RLK1 gene or a gene homologous thereto.
  • [6] The tomato according to [5], wherein a region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is mutated to a base sequence shown in one type selected from SEQ ID NOs: 4 to 7.
  • [7] The tomato according to any one of [1] to [3], wherein the receptor-like kinase RLK gene is the RLK2 gene (Solyc03g043770) and its cDNA sequence comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, and the homologous gene of the receptor-like kinase RLK gene is a homologous gene of the RLK2 gene and its cDNA sequence comprises a base sequence having 85% or more sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • [8] The tomato according to [7], having a mutation in a region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the RLK2 gene or a gene homologous thereto. [9] The tomato according to [8], wherein a region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 is mutated to a base sequence shown in one type selected from SEQ ID NOs: 19 to 24. [10] The tomato according to any one of [1] to [9], wherein the Tobamovirus is at least one selected from the group consisting of Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV), Tomato mosaic virus (TMV), Tomato mosaic virus (ToMV), and Tomato mottle mosaic virus (ToMMV).
  • ToBRFV Tomato brown rugose fruit virus
  • TMV Tomato mosaic virus
  • ToMV Tomato mosaic virus
  • ToMMV Tomato mottle mosaic virus
  • [11] A part of a tomato according to any one of [1] to [10].
  • [12] A part of the tomato according to [11], which is a fruit.
  • [13] A part of the tomato according to [11], which is a seed.
  • [14] A processed product of the tomato part according to any one of [11] to [13].
  • [15] The processed product according to [14], which is edible.
  • the present invention further provides the following tomato cells, as well as tomato plants and parts thereof having the same: [16] A tomato cell having resistance to Tobamovirus viruses, wherein at least one gene selected from the group consisting of receptor-like kinase RLK genes and genes homologous thereto has a mutation, and expression of the gene having the mutation is suppressed due to the mutation, or a protein encoded by the gene having the mutation is non-functional against Tobamovirus viruses. [17] The tomato cell according to [16], wherein the mutation is introduced into a gene in the genome by genome editing technology.
  • the tomato cell according to [19] which has a mutation in a region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO:3 in the RLK1 gene or a gene homologous thereto.
  • ToBRFV Tomato brown rugose fruit virus
  • TMV Tomato mosaic virus
  • ToMV Tomato mosaic virus
  • ToMMV Tomato mottle mosaic virus
  • a tomato or a part thereof comprising the tomato cell according to any one of [16] to [25] and having resistance to Tobamovirus.
  • a part of the tomato according to [26] which is a fruit.
  • the processed product according to [29] which is edible.
  • the present invention further provides the following tomato production method and tomato plant obtained by said production method.
  • a method for producing a tomato that is resistant to a tobamovirus virus comprising the steps of: selecting at least one gene selected from the group consisting of receptor-like kinase RLK genes and genes homologous thereto; introducing into the selected gene in the genome of the tomato a mutation that suppresses expression of the selected gene, or a mutation that renders a protein encoded by the selected gene non-functional against Tobamovirus viruses; and selecting a tomato that is resistant to Tobamovirus viruses.
  • the method for producing a tobamovirus-resistant tomato according to [31] wherein the mutation is introduced into a gene in the genome by genome editing technology.
  • [34] The method for producing a tobamovirus-resistant tomato according to any one of [31] to [33], wherein the receptor-like kinase RLK gene is the RLK1 gene (Solyc02g091840) and its cDNA sequence comprises the base sequence shown in SEQ ID NO:1, and the homologous gene of the receptor-like kinase RLK gene is a homologous gene of the RLK1 gene and its cDNA sequence comprises a base sequence having 85% or more sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • [37] The method for producing a tobamovirus-resistant tomato according to any one of [31] to [33], wherein the receptor-like kinase RLK gene is the RLK2 gene (Solyc03g043770) and its cDNA sequence comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, and the homologous gene of the receptor-like kinase RLK gene is a homologous gene of the RLK2 gene and its cDNA sequence comprises a base sequence having 85% or more sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the receptor-like kinase RLK gene is the RLK2 gene (Solyc03g043770) and its cDNA sequence comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 16
  • the homologous gene of the receptor-like kinase RLK gene is a homologous gene of the RLK2 gene and its cDNA sequence comprises a base sequence having 85% or more sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the method for producing a tobamovirus-resistant tomato according to any one of [31] to [39], wherein the tobamovirus is at least one selected from the group consisting of tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV), tobacco mosaic virus (TMV), tomato mosaic virus (ToMV), and tomato mottle mosaic virus (ToMMV).
  • ToBRFV tomato brown rugose fruit virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • ToMV tomato mosaic virus
  • ToMMV tomato mottle mosaic virus
  • the present invention further provides the following method for producing a tomato breeding progeny and a tomato plant obtained by said method.
  • a method for producing a breeding progeny of a Tobamovirus virus-resistant tomato comprising a step of self-pollinating or cross-pollinating the Tobamovirus virus-resistant tomato or its progeny obtained by the method according to any one of [31] to [40].
  • the present invention provides a method for producing a tomato plant, tomato cell, and tomato plant resistant to tobamovirus viruses, which have the property of inhibiting infection with tobamovirus viruses, the property of suppressing the proliferation and movement of tobamovirus viruses after infection, and/or the property of suppressing the manifestation of symptoms of infection with tobamovirus viruses.
  • FIG. 1 shows the cDNA sequence of the tomato receptor-like kinase RLK1 gene (Solyc02g091840).
  • the underlined part is exon 1, the wavy underlined part is the guide RNA recognition portion in exon 1 (bases 790 to 809 of exon 1), and the boxed part is the PAM sequence.
  • FIG. 2 shows the cDNA sequence of the tomato receptor-like kinase RLK2 gene (Solyc03g043770).
  • the underlined part is exon 1, the wavy underlined part is the guide RNA recognition portion in exon 1 (bases 277 to 296 of exon 1), and the boxed part is the PAM sequence.
  • FIG. 1 shows the cDNA sequence of the tomato receptor-like kinase RLK1 gene (Solyc02g091840).
  • the underlined part is exon 1
  • the wavy underlined part is the guide RNA recognition portion in exon 1 (bases 277 to
  • FIG. 3 is an electrophoretic photograph showing the results of RT-PCR analysis of the ToBRFV inoculation test.
  • FIG. 4 is a diagram showing the mutation pattern in the tomato receptor-like kinase RLK1 gene. The wavy underlined portion in the wild-type sequence corresponds to the guide RNA recognition site in exon 1, while a - symbol indicates a base deletion, a box indicates a base insertion, and an underline indicates a base substitution.
  • FIG. 5 is a diagram showing the mutation pattern in the tomato receptor-like kinase RLK2 gene. The wavy underlined portion in the wild-type sequence corresponds to the guide RNA recognition site in exon 1, and - indicates a deletion of a base.
  • the present embodiment relates to a tomato that is resistant to a Tobamovirus virus.
  • the virus-resistant tomato is, for example, a tomato that has a property of inhibiting infection with a Tobamovirus virus, a property of suppressing proliferation and movement of the virus even if infected, and/or a property of suppressing the manifestation of an infection symptom of the virus.
  • the virus-resistant tomato is preferably a tomato that has a property of inhibiting infection with the virus or a property of suppressing proliferation and movement of the virus even if infected.
  • tobamovirus is a general term for viruses that have single-stranded RNA and are related to the tobacco mosaic virus (TMV), which was the first virus discovered in the world. Tobamovirus viruses are known to be highly infectious, highly resistant to inactivation, and are stable, causing leaf mosaics, silky leaves, yellowing symptoms, stem necrosis, and fruit discoloration, necrosis, ring spots, etc. in infected plants.
  • TMV tobacco mosaic virus
  • the Tobamovirus genus virus targeted for infection and control is not particularly limited as long as it is a Tobamovirus genus virus that infects tomatoes, and specific examples include Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV), Tomato mosaic virus (TMV), Tomato mosaic virus (ToMV), and Tomato mottle mosaic virus (ToMMV).
  • Tobamovirus genus viruses may be abbreviated to "tobamovirus.”
  • tomato refers to Solanum lycopersicum, and refers to the entire plant, not just the fruit.
  • the tobamovirus-resistant tomato of this embodiment has a mutation in at least one gene selected from the group consisting of the receptor-like kinase RLK gene and its homologous genes.
  • RLK gene is a tomato gene that codes for a "Receptor-Like Kinase.”
  • BAM1 Barley Any Meristem 1
  • CLAVATA1-related receptor-like kinase protein that is necessary for shoot and floral meristem functions involved in leaf and gamete formation.
  • BAM2 which is highly homologous to BAM1 in Arabidopsis, has also been confirmed, and recent research has revealed the existence of highly homologous homologs in tomato.
  • Such homologs include the tomato "RLK1 gene” (Solyc02g091840, on chromosome 2) and "RLK2 gene” (Solyc03g043770, on chromosome 3).
  • RLK gene refers collectively to the "RLK1 gene” (Solyc02g091840) or the “RLK2 gene” (Solyc03g043770), or even both, and the individual genes are referred to as the "RLK1 gene” or "RLK2 gene.”
  • homologous genes of the RLK gene may include both “homologous genes of the RLK1 gene” and “homologous genes of the RLK2 gene” described below.
  • the "RLK1 gene” has a cDNA sequence that includes the base sequence shown in SEQ ID NO:1 or consists of the base sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • a "homologous gene of the RLK1 gene” preferably has a cDNA sequence that includes a base sequence having sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or is composed of a base sequence having sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • sequence homology means sequence identity. There is no particular limit to the homology with the base sequence of SEQ ID NO: 1, but it is preferably 85% or more and less than 100%. The lower limit of the homology may be any value as long as it is 85% or more, such as 87% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 99.5% or more.
  • the "RLK2 gene” has a cDNA sequence that includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the "homologous gene of the RLK2 gene” preferably has a cDNA sequence that includes a base sequence having sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, or is composed of a base sequence having sequence homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • sequence homology means sequence identity. There is no particular limit to the homology with the base sequence of SEQ ID NO: 16, but it is preferably 85% or more and less than 100%. The lower limit of the homology may be any value as long as it is 85% or more, such as 87% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 99.5% or more.
  • the homology (i.e., identity) between a specific base sequence and the cDNA sequence of a homologous gene can be determined by known methods.
  • the homology of base sequences can be determined using a known homology search program such as BLAST.
  • the tomato has a mutation in at least one gene selected from the group consisting of RLK gene or its homologous genes (hereinafter, the gene having the mutation is also referred to as a "virus resistance gene” or a "tobamovirus resistance gene”).
  • the mutation suppresses the expression of the gene having the mutation, or makes a protein encoded by the mutated gene or a mutually related gene non-functional against a tobamovirus.
  • a protein non-functional against the virus refers to a protein that cannot be used by the virus when the virus infects, grows, and moves in a plant, or that reduces the infection and growth of the virus.
  • the tobamovirus resistance gene may be mutated so as not to encode a protein.
  • tobamovirus when tobamovirus infects tomatoes, it interacts with a specific RLK among the multiple RLK isoforms present in tomatoes. At this time, if a gene encoding the specific isoform used by tobamovirus (i.e., an RLK functional against tobamovirus) mutates and the specific RLK protein used by tobamovirus is no longer produced, or if the RLK protein produced is non-functional against tobamovirus, it is believed that translation of the protein encoded on the viral genome and necessary for infection and proliferation does not proceed. Alternatively, it is believed that tobamovirus proteins that require interaction with RLK are no longer able to function, inhibiting tobamovirus infection and proliferation, resulting in tomato acquiring resistance to tobamovirus.
  • the tomato itself can utilize other homologs, or the tomato itself can utilize a non-functional RLK protein for tobamoviruses, so it is thought that it is possible to confer resistance to tobamoviruses without affecting the growth of the host tomato.
  • tomatoes having a tobamovirus resistance gene acquire tobamovirus resistance. For example, if the amount of tobamovirus accumulated in the plant body is equal to or less than that of a non-tobamovirus inoculated strain even after 18 days or more have passed since inoculation with tobamovirus, and/or if no tobamovirus infection symptoms are visually observed, the plant can be judged to have "tobamovirus resistance". Specifically, the tobamovirus resistance of a plant can be judged by infecting the plant with tobamovirus in a conventional manner and confirming the accumulation of tobamovirus in the plant body by a known method such as ELISA or PCR.
  • the tobamovirus resistance of a tomato can also be judged by confirming the presence or absence of tobamovirus infection symptoms (mosaic leaves, silky leaves, yellowing symptoms, necrotic symptoms of stems, and further discoloration, necrotic and ring-shaped symptoms of fruits, etc.) in a plant infected with tobamovirus.
  • tobamovirus infection symptoms mosaic leaves, silky leaves, yellowing symptoms, necrotic symptoms of stems, and further discoloration, necrotic and ring-shaped symptoms of fruits, etc.
  • tobamoviruses can infect plants not only in the form of virus particles but also with the genomic RNA alone, and as described in Non-Patent Document 6, it is also possible to test ToBRFV resistance by using a synthetic infectious RNA (e.g., SEQ ID NO: 45) equivalent to the ToBRFV genomic RNA instead of the virus.
  • a synthetic infectious RNA e.g., SEQ ID NO: 45
  • the genetic mutation may be present in at least one gene selected from the group consisting of the RLK1 gene and its homologous genes, and the RLK2 gene and its homologous genes.
  • the tobamovirus-resistant tomato in this embodiment has a mutation in the RLK1 gene, it may have mutations in all of the genes encoding RLK1 proteins functional against tobamoviruses.
  • the gene encoding the RLK1 protein functional against tobamoviruses is mutated, such a tobamovirus-resistant tomato may have another normal RLK1 gene.
  • it may be a tomato in which all endogenous genes encoding RLK1 proteins functional against tobamoviruses have been deleted, destroyed, or otherwise rendered nonfunctional, and an exogenous RLK1 gene has been introduced instead.
  • the tobamovirus-resistant tomato has a mutation in the RLK2 gene. That is, so long as the gene encoding any protein functional against the tobamovirus of the present invention is mutated, it may have other normal genes. It may also be one in which all endogenous genes encoding any RLK2 protein functional against the tobamovirus have been deleted, destroyed, or otherwise rendered nonfunctional, and an exogenous homologous gene has been introduced instead.
  • the tobamovirus-resistant tomato of this embodiment has a mutation in a gene in its genome. There are no particular limitations on the genetic mutation, so long as it confers virus resistance.
  • mutations in the RLK gene include the following (a) to (d).
  • (c) a consecutive or non-consecutive deletion of 3n bases (n 1 to 5); and
  • a frameshift mutation is a mutation in which the reading frame of a codon is shifted due to the deletion or insertion of bases, resulting in the coding of a different amino acid sequence. By changing the encoded amino acid sequence, the mutated gene becomes a tobamovirus resistance gene.
  • a nonsense mutation is a mutation that changes a codon that normally codes for an amino acid into a stop codon, resulting in a tobamovirus resistance gene.
  • the insertion or substitution of 1 to 10 bases changes the reading frame of the amino acid sequence encoded by the base sequence downstream of the mutated region.
  • the change in reading frame alters the originally encoded amino acid sequence, resulting in a change in the protein structure, etc., resulting in a tobamovirus resistance gene.
  • this mutation is preferably a mutation in a base other than the third base of the codon.
  • the number of bases inserted or substituted is not particularly limited as long as a tobamovirus resistance gene is obtained, but can be, for example, 1 to 5, 1 to 3, or 1 to 2.
  • the mutation in the tobamovirus resistance gene is preferably at least one selected from the group consisting of (a) to (d) above. Note that the mutations (a) to (d) above are not alternative; for example, mutations (a) and (b) may occur as a result of mutations (c) and (d).
  • the mutation when tomato has a mutation in the RLK1 gene, the mutation is preferably present in exon 1 (SEQ ID NO: 2) of the RLK1 gene, and more preferably present in a region including bases 790 to 809 of exon 1, i.e., a region including TCTCTAGAGTACCTTGCAGT shown in SEQ ID NO: 3.
  • the mutation is preferably present in a region in the homologous gene corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and more preferably present in a region in the region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the mutation may also be present in a portion of exon 1 other than the region.
  • the mutation is preferably a 7-base deletion, a 5-base deletion, a 1-base insertion, or a base substitution.
  • Such mutations include a 7-base deletion at positions 793-799 of exon 1, a 5-base deletion at positions 793-797, an insertion of a 1-base between positions 795 and 796, and a substitution of a 806-808 base.
  • the mutations include a 5-base deletion at positions 793-797 (mutation C1), a 7-base deletion at positions 793-799 (mutation C2), an insertion of a 1-base (adenine) between positions 795 and 796 (mutation C3), and a 5-base deletion at positions 793-797 and a substitution of a 806-808 base (substitution of CAG to ACG) (mutation C4) (see Figure 4).
  • the base sequences of the mutated regions are shown in SEQ ID NOs:4-7.
  • the mutation when tomato has a mutation in the RLK2 gene, the mutation is preferably present in exon 1 (SEQ ID NO: 17) of the RLK2 gene, and more preferably in a region including bases 790 to 809 of exon 1, i.e., a region including GAGGTGTCACGTGTGACCGGTATCGTCACGTGACTTCTCTC as shown in SEQ ID NO: 18.
  • the mutation is preferably present in a region in the gene corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 17, and more preferably in a region in the gene corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 18. Note that when a mutation is present in the region shown in SEQ ID NO: 18 or a corresponding region, the mutation may also be present in a portion of exon 1 other than the region.
  • the mutation is preferably a 12-base deletion, a 6-base deletion, a 5-base deletion, a 3-base deletion, or a 1-base deletion.
  • Specific examples of such mutations include a 12-base deletion at positions 269-280 of exon 1 (mutation P1), a 12-base deletion at positions 272-283 (mutation P2), a 6-base deletion at positions 279-285 (mutation P3), a 5-base deletion at positions 279-284 (mutation P4), a 3-base deletion at positions 279-281 (mutation P5), and a 1-base deletion at position 279 (mutation P6) (see Figure 5).
  • the base sequences of the mutated regions are shown in SEQ ID NOs:19-24.
  • the present embodiment relates to a mutant RLK1 gene itself having a mutated exon 1 as shown in any one of SEQ ID NOs:8 to 11, which is a tobamovirus resistance gene, and a mutant RLK2 gene itself having a mutated exon 1 as shown in any one of SEQ ID NOs:25 to 30.
  • the present embodiment also relates to the use of the mutant RLK1 gene and/or mutant RLK2 gene for imparting tobamovirus resistance to tomatoes.
  • the mutations in tomatoes are not limited to the above-mentioned regions, and mutations may exist in other regions of the RLK1 gene and/or the RLK2 gene, or in other genes, as long as tobamovirus resistance is not impaired.
  • the mutation in the tomato gene is preferably introduced into a gene in the genome by genome editing technology such as the CRISPR system described below.
  • the mutated gene in the genome may be homozygous, present in both alleles, or heterozygous, present in only one allele; however, homozygous is preferable. This is because the homozygous type, in which the two alleles are characterized by the same mutated sequence, is thought to more strongly reflect the properties brought about by the mutated gene.
  • the tobamovirus-resistant tomato in this embodiment may be a multiple-resistant tomato that exhibits resistance to other viruses and bacteria, so long as it exhibits resistance to Tobamovirus viruses.
  • the present embodiment relates to a part of a tomato plant having tobamovirus resistance.
  • the part includes a part taken from the tomato plant and its progeny or clones having the above characteristics, or a derivative obtained from the plant or part.
  • Parts include organs such as fruits, shoots, stems, roots, shoots, anthers, as well as plant tissues and cells.
  • Such parts may be in any form, including suspension cultures, protoplasts, embryos, callus tissue, leaf pieces, gametophytes, sporophytes, pollen, and microspores.
  • Derivatives of tomatoes include seeds.
  • the tobamovirus-resistant tomato portion of this embodiment may be a scion, rootstock, etc., used for grafting.
  • this embodiment also relates to plant cells (including callus) etc. that can regenerate the above-mentioned virus-resistant tomato, and the tobamovirus-resistant tomato of this embodiment also includes plants obtained from such plant cells.
  • the part of the tomato that has virus resistance is preferably the fruit, which is useful for eating raw or processing. It is also preferable that the part is the seed, since this is useful for producing progeny.
  • the present embodiment relates to a processed product of tomatoes or parts thereof.
  • the processed product is not particularly limited, and may be for edible, industrial, or medical use, and is particularly preferably for edible use.
  • examples of edible processed tomato products include canned tomatoes, tomato paste, ketchup, tomato sauce, tomato soup, dried tomatoes, tomato juice, tomato powder, and tomato concentrate.
  • Nutritional supplements made from tomatoes are also examples of processed products.
  • Tomato Cells Having Resistance to Tobamoviruses In one aspect, the present embodiment relates to tomato cells having resistance to tobamoviruses.
  • the tomato cells of this embodiment have a mutation in at least one gene selected from the group consisting of the receptor-like kinase RLK gene and its homologous genes. These genes and their mutations are as described above in relation to tobamovirus-resistant tomatoes.
  • the tobamovirus resistance of tomato cells can be confirmed by the methods described above.
  • the presence or absence of virus resistance can be confirmed by infecting plant cells with a tobamovirus using standard methods and detecting the accumulation of the virus in the cells using known methods such as ELISA and PCR.
  • the tobamovirus-resistant tomato cells of this embodiment may be isolated from the plant body or parts of the above-mentioned tobamovirus-resistant tomato and its progeny or clone, or may be plant cells into which a genetic mutation has been introduced, obtained by the method for producing a tobamovirus-resistant tomato described below. Furthermore, there are no particular limitations on the form of the tobamovirus-resistant tomato cells, and they may be suspension cultures or protoplasts.
  • the present embodiment relates to a tomato plant or a part thereof that has the above-mentioned tomato cell and has tobamovirus resistance.
  • the tomato plant or part thereof includes a plant or a part such as a tissue or organ regenerated from a tomato plant cell into which a genetic mutation has been introduced.
  • the part of the plant regenerated from the tomato plant cell is also a part that has the above-mentioned tomato cell. Details of the part are as described above in relation to the virus-resistant tomato.
  • the tomato part is preferably the fruit, which is useful for eating raw or processing. It is also preferable that the tomato part be the seed, since this is useful for producing progeny.
  • the present embodiment relates to a processed product of tomatoes or parts thereof.
  • the processed product is not particularly limited, and examples include processed products for edible, industrial, and medical purposes, and is particularly preferably an edible processed product.
  • the present embodiment relates to a method for producing a virus-resistant tomato of the present invention, specifically, the method includes the following steps: Selecting at least one gene from the group consisting of receptor-like ligase RLK genes and their homologous genes; introducing into a selected gene in the genome of a tomato a mutation that suppresses expression of the selected gene or that renders a protein encoded by the selected gene non-functional against a Tobamovirus that causes yellow leaf curl symptoms in tomato; A process for selecting tomatoes having resistance to Tobamovirus.
  • a target gene to be mutated is selected from the group consisting of the RLK gene and its homologous genes.
  • the selected gene may be one kind or a combination of two or more different kinds of genes. These genes are as described above in relation to the virus-resistant tomato. Next, a method for producing a virus-resistant tomato will be specifically described.
  • a mutation is introduced into the selected gene.
  • Methods for introducing a mutation into a gene in a genome can be roughly classified into the following two methods.
  • Direct genome editing This method involves directly editing the genome of a plant that has a functional RLK gene against tobamovirus, thereby introducing mutations into targeted locations and producing a plant that has a tobamovirus resistance gene.
  • Mutant gene introduction This method combines the following procedures (A) and (B).
  • a tobamovirus resistance gene is prepared and introduced into a plant using an appropriate promoter.
  • B Among the endogenous genes possessed by the plant that correspond to the tobamovirus resistance gene prepared in (A) above, a gene functional against tobamovirus is made non-functional against tobamovirus. Each method will be explained below.
  • Direct genome editing can be performed using known genome editing techniques using site-specific nucleases such as CRISPR and TALEN.
  • site-specific nucleases such as CRISPR and TALEN.
  • a double-strand break is introduced using a restriction enzyme capable of cleaving a specific site in the genome, various mutations are introduced due to repair errors when the break is repaired.
  • a mutation is introduced into the target gene (in this embodiment, a gene encoding RLK functional against tobamovirus).
  • the CRISPR system is preferably used, and the CRISPR/Cas9 system is particularly preferred, since it allows mutations to be introduced with particularly high specificity and efficiency.
  • a guide RNA sgRNA
  • sgRNA guide RNA
  • the Cas9 protein cuts the double strand.
  • NHEJ non-homologous end joining
  • the Cas protein and sgRNA can be delivered to plants via vectors encoding them using methods known to those skilled in the art, such as the Agrobacterium method, standard transfection methods, electroporation, particle bombardment, etc.
  • a binary vector incorporating the Cas gene and sgRNA can be constructed, used to transform Agrobacterium, and then used to transform a plant, thereby delivering the Cas protein and sgRNA to the plant (see Friedrich Fauser et al., "The Plant Journal," 2014, 79: 348-359, and Osawa Ryo and Ezura Hiroshi, "Understanding New Plant Breeding Techniques - NBT (New plant breeding techniques),” Kokusai Bunkensha, 2013, etc.).
  • the form of the plant transformed with Agrobacterium is not particularly limited as long as it is capable of regenerating the plant body, and examples include suspension culture cells, protoplasts, leaf slices, callus, etc. After removing the Agrobacterium, the plant is cultured in a medium containing a drug appropriate to the vector used, and the slices into which the target gene has been incorporated can be selectively cultured using drug resistance as an indicator.
  • Guide RNA can be designed to allow highly efficient introduction of mutations into the target site.
  • cleavage generally occurs three bases before a three-base sequence called the PAM sequence (NGG when using the most common S. pyogenes-derived Cas9). Since the PAM sequence must be present immediately after the target sequence, guide RNA can be designed with the upstream of the PAM sequence as the target sequence.
  • guide RNA In the design of guide RNA, it is preferable to consider the GC content because the higher the GC content of the base sequence, the higher the cleavage efficiency. In addition, it can be designed to minimize non-specific cleavage due to off-target effects.
  • FIG. 1 showing the cDNA sequence (SEQ ID NO: 1) of the RLK1 gene present on chromosome 2 of tomato
  • the squared portion present in exon 1 is used as the PAM sequence
  • the guide RNA can be designed targeting the usual 20 bases upstream from this 3 bases (wavy underlined portion in FIG. 1, SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 2 showing the cDNA sequence (SEQ ID NO: 16) of the RLK2 gene present on tomato chromosome 3, the boxed portion present in exon 1 (single underlined portion in FIG. 2, SEQ ID NO: 17) is used as the PAM sequence, and a guide RNA can be designed targeting usually 20 bases (wavy underlined portion in FIG. 2, bases 20 to 39 of SEQ ID NO: 18) three bases upstream from this PAM sequence.
  • the tobamovirus resistance gene of this embodiment has a variety of mutations.
  • the mutation introduced does not necessarily have to be limited to the target site.
  • the mutation may exist in a region other than the target site, for example, in a region adjacent to the target site.
  • the mutation introduced into the RLK1 gene was limited to the target site (see Figure 4), but the mutation introduced into the RLK2 gene was also present in a region adjacent to the target site (see Figure 5).
  • this embodiment also relates to the guide RNA and the vector containing the guide RNA used to create the tobamovirus-resistant tomato.
  • the sequence of the guide RNA is as described above.
  • This embodiment also relates to a kit containing the guide RNA.
  • the kit may contain a site-specific nuclease, etc., necessary for performing genome editing using the CRISPR system, and can be used to create a tobamovirus-resistant tomato.
  • Mutant gene introduction is a method that combines the following procedures (A) and (B).
  • A) A tobamovirus resistance gene is constructed and introduced into a plant using an appropriate promoter.
  • B) Among the endogenous genes contained in a plant and corresponding to the tobamovirus resistance gene prepared in (A) above, a gene functional against a tobamovirus is made non-functional against a tobamovirus.
  • the order of carrying out the above steps (A) and (B) is not particularly limited as long as the plant does not die, and (B) may be carried out first. Note that the method of carrying out only (B) at a specific site is the above-mentioned (1) direct genome editing.
  • step (A) a mutant gene encoding a RLK protein that is non-functional against tobamovirus is prepared and introduced into a plant using an appropriate promoter.
  • the mutant gene can be prepared using a method known to those skilled in the art. For example, a base sequence having the desired mutation can be synthesized and amplified by PCR or the like. The mutation introduced here is as described above in relation to tobamovirus-resistant tomatoes.
  • the mutant gene thus created can also be introduced into a plant using methods known to those skilled in the art. Conveniently, this can be done using a vector carrying the mutant gene, for example, the polyethylene glycol method, electroporation method, the Agrobacterium method, the particle gun method, etc.
  • the mutant gene introduced here is a tobamovirus resistance gene obtained by mutating the RLK gene (or a homologous gene) derived from tomato, but it may also be a tobamovirus resistance gene from another type of plant.
  • the form of the plant into which the vector is introduced is not particularly limited as long as it is capable of regenerating the plant body, and examples include suspension culture cells, protoplasts, leaf slices, callus, etc.
  • step (B) endogenous RLK genes (or homologous genes) possessed by the plant that are functional against tobamoviruses are changed to non-functional against tobamoviruses.
  • known methods for introducing mutations into plants can be used. For example, mutagen treatment such as ion beams or EMS can be used. It can also be carried out using genome editing techniques such as the above-mentioned CRISPR and TALEN. It is desirable to make all endogenous RLK genes that are functional against tobamoviruses non-functional against tobamoviruses.
  • a plant body is regenerated from a part of the plant (such as a leaf piece or a plant cell) that has the tobamovirus resistance gene.
  • Regeneration of the plant body can be carried out by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant. For example, in the case of tomato, regeneration can be carried out by referring to Sun H.J. et al., "Plant Cell Physiol.," 2006, 47: 426, etc.
  • tomatoes resistant to tobamovirus are selected from the regenerated plants.
  • the selection can be performed by the above-mentioned method for confirming tobamovirus resistance.
  • a plant resistant to tobamovirus can be selected by infecting a plant with tobamovirus in a conventional manner and confirming the accumulation of tobamovirus in the plant body by a known method such as ELISA or PCR.
  • Tomatoes resistant to tobamovirus can also be selected by confirming the presence or absence of tobamovirus infection symptoms (mosaic leaves, silky leaves, yellowing symptoms, necrotic symptoms of stems, and further discoloration, necrotic symptoms and ring spots of fruits, etc.) in the plants infected with tobamovirus.
  • RNA corresponding to the genomic RNA of ToBRFV e.g., SEQ ID NO: 45
  • SEQ ID NO: 45 a synthetic infectious RNA corresponding to the genomic RNA of ToBRFV
  • the present embodiment relates to a tomato produced by the method described above.
  • the tomato is similar to the tobamovirus-resistant tomato described above.
  • the tobamovirus-resistant tomato plant of this embodiment includes these progeny and clones.
  • the present embodiment relates to a method for producing a breeding progeny of a tobamovirus-resistant tomato, comprising a step of self-pollinating or cross-pollinating a tobamovirus-resistant tomato (first generation) obtained by the above-mentioned production method or a progeny thereof.
  • Self-pollination or cross-pollination of a plant can be carried out by a method known in the art, and may be carried out naturally or artificially.
  • the progeny thus obtained can be further self-pollinated or cross-pollinated to produce further progeny.
  • the tomatoes crossed with the primary or progeny in cross-pollination may be tomatoes with the same mutation in the same gene, tomatoes with different mutations in the same gene, or tomatoes with mutations in different genes.
  • Example 1 Preparation of recombinant Agrobacterium A for introducing a mutation into the RLK1 gene
  • a site recognized by a guide RNA was arbitrarily designed within exon 1 of the RLK1 gene (Solyc02g091840) (SEQ ID NO: 1), which is believed to be present on chromosome 2 of tomato.
  • a double-stranded DNA corresponding to the set 20-base length site (SEQ ID NO: 3: TCTCTAGAGTACCTTGCAGT) was synthesized and inserted into the restriction enzyme BbsI site in the vector pUC19_AtU6oligo (obtained from the National Institute of Agrobiological Sciences, currently the National Agriculture and Food Research Organization) to construct a recombinant binary vector.
  • the cDNA sequence of the RLK1 gene present on chromosome 2 of wild-type tomato is shown in FIG. 1 and SEQ ID NO: 1.
  • the cassette portion containing the guide RNA sequence region was excised from each of the constructed recombinant vectors and inserted into the restriction enzyme I-SceI site in the binary vector pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII to obtain a recombinant binary vector.
  • These binary vectors were used to transform Agrobacterium LBA4404 (Takara Bio Inc.) by a conventional method to obtain recombinant Agrobacterium A.
  • the cassette portion containing the guide RNA sequence region was excised from each of the constructed recombinant vectors and inserted into the restriction enzyme I-SceI site in the binary vector pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII to obtain a recombinant binary vector.
  • These binary vectors were used to transform Agrobacterium LBA4404 (Takara Bio) using standard methods to obtain recombinant Agrobacterium B.
  • Tomato transformation was performed using the known fixed variety Manymaker (hereinafter abbreviated as "MM”) or our own fixed variety S.
  • Tomato transformation using Agrobacterium was performed according to the method described in a general textbook (e.g., "Protocols for plant transformation” edited by Yutaka Tabei, Kagaku Dojinsha, 2012). Specifically, cotyledon pieces obtained by germinating tomato seeds in a sterile medium, or sterilized cotyledon pieces or primary leaf pieces of seedlings sown normally, were prepared.
  • a culture solution was prepared by culturing the recombinant Agrobacterium A obtained in Example 1 or the recombinant Agrobacterium B obtained in Example 2 until the turbidity reached 0.5 to 2.0. Tomato leaf pieces were immersed in the culture solution for about 10 minutes to be infected with Agrobacterium A or B.
  • Tomato leaf pieces were transferred onto Murashige and Skoog medium (sometimes abbreviated as MS basal medium; MS basal medium supplemented with 3% sucrose, 1.5 mg/L zeatin, and 1% agar) supplemented with carbenicillin (100-500 mg/ml) and kanamycin (20-100 mg/ml) and subjected to selective culture under illumination at 25°C (16 hours light/8 hours darkness). Callus formation from the leaf pieces was promoted by replacing the medium and subculturing every 10 days to 2 weeks from the start of culture. Adventitious buds were induced by subsequent repeated subculture.
  • MS basal medium sometimes abbreviated as MS basal medium; MS basal medium supplemented with 3% sucrose, 1.5 mg/L zeatin, and 1% agar
  • carbenicillin 100-500 mg/ml
  • kanamycin 20-100 mg/ml
  • rooting medium MS basic medium with 1.5% sucrose, 1% agar, 50-250 mg/ml carbenicillin, 20-100 mg/ml kanamycin, and sometimes naphthalene acetic acid (NAA) added
  • NAA naphthalene acetic acid
  • T0 transgenic current generation
  • Example 4 Selection of gene-edited lines To confirm whether or not genetic recombination and editing sites (base deletion, insertion, or substitution) were present in the target gene of the transgenic generation, T0 tomato leaves were crushed and genomic DNA was extracted using a NucleoSpin Plant II kit (Takara Bio Inc.) or the like according to the method attached to the kit.
  • primer 1 (5'-TTAACACGTCTGCGTAACCTC-3', SEQ ID NO: 37) and primer 2 (5'-CCGGTGAAGGTATTGTAGTATCC-3', SEQ ID NO: 38) were used for the region in the RLK1 gene (Solyc02g091840), and primer 3 (5'-CTCCACTTCACCACCGCAAA-3', SEQ ID NO: 39) and primer 4 (5'-TACCGGAGATGGGTAAGCTG-3', SEQ ID NO: 40) were used for the region in the RLK2 gene (Solyc03g043770).
  • PCR was performed using a T100 thermal cycler (BIORAD) and KOD One (Toyobo) according to the attached manual to amplify DNA.
  • the amplified DNA was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) according to the kit's instructions, and the base sequence of the amplified site was sequenced using the Sanger method with the forward primer (primer 1 or primer 3 mentioned above) of the primers used in PCR for the gene in question to confirm the presence or absence of editing.
  • the edited part differs depending on the allele, i.e., it may be a heterozygote. In that case, when DNA amplification products of the same region are sequenced, different base signals will be detected overlapping, making it impossible to decipher.
  • the amplified fragment obtained by PCR of the relevant region was cloned into a TA vector using the TArget Clone-Plus (Toyobo) kit, and then sequencing was performed using the Sanger method (when cloning, the amplified DNA is cloned molecule by molecule, so the sequence can be confirmed for each clone.
  • sequencing multiple clones if they all have the same editing pattern sequence, it can be inferred that the allele is homozygous, and if there are two patterns, the allele is heterozygous).
  • Example 5 Generation of transgenic progeny Furthermore, these edited lines were self-pollinated, and seeds of the progeny (the generation next to the TO generation was designated T1, and the subsequent generation was designated T2) were collected. Genomic DNA was extracted from the sown seedlings using the method of [Example 4], the base sequence near the edited site was amplified by PCR, and the editing pattern was confirmed by sequencing.
  • Example 6 Preparation of ToBRFV inoculum (infectious RNA) Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) was used as a Tobamovirus virus. Due to quarantine issues, it is very difficult to bring the ToBRFV virus or virus-infected leaves into Japan. Therefore, following the report in Non-Patent Document 6, an infectious RNA (SEQ ID NO: 45) was synthesized in vitro by linking the genome sequence (6388 bases long, with the 6th to 9th bases deleted) of the Jordan strain of ToBRFV (Genbank: KT383474) under the T7 promoter (17 bases long). Note that ToBRFV is an RNA virus, and its genome sequence is an RNA sequence. SEQ ID NO: 45 shows the DNA sequence in which U (uracil) of RNA is converted to T (thymine) of DNA.
  • PCR was performed using primer 5 (5'-AGCTTGCATGCCTGCAGGTCT-3', SEQ ID NO:41), primer 6 (5'-TGGGCCCCTCCGGGGTTCCGGGGAATTCGAATC-3', SEQ ID NO:42), and KOD One (Toyobo Co., Ltd.) under the conditions attached to KOD One to amplify a full-length viral fragment beginning with the T7 promoter sequence.
  • the primers were removed from the PCR amplified fragment using NucleoSpin (registered trademark) Gel and PCR Clean-up (Takara Bio Inc.) according to the kit's instructions.
  • RNA was transcribed and synthesized at 37°C for 4 hours using T7 polymerase (HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit; New England Biolabs) according to the method attached to the reagent.
  • T7 polymerase HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit; New England Biolabs
  • Example 6 Inoculation of ToBRFV One-tenth to one-half of the 20 ⁇ L of RNA synthesized in Example 6 was inoculated into the true leaves (compound leaves) at approximately the middle position of test tomato seedlings (3- to 5-leaf stage) by mechanical inoculation (rubbing inoculation) using the carborundum method.
  • Example 7 Extraction of total RNA
  • leaves inoculated with RNA (infectious RNA instead of the virus) inoculated leaves
  • upper leaves not inoculated upper leaves
  • about 100 mg were frozen with liquid nitrogen, ground, and dissolved in 1 mL of TRIsol Reagent (Ambion) heated to 50 ° C.
  • the leaves were transferred to a microtube and heated in a thermostatic bath at 50 ° C for 10 minutes to extract RNA. Then, 1/5 volume of chloroform was added, stirred, and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes.
  • RNA analysis of ToBRFV Using 5-10 ⁇ L of the RNA sample obtained in Example 7, first strand cDNA was synthesized using SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) according to the conditions of the kit's instructions. Furthermore, PCR was performed using 2 ⁇ L of this cDNA sample, primer 7 (5'-GAGACTTACGTCGCCGATTC-3', SEQ ID NO: 43) and primer 8 (5'-GTACCACGTGTGTTTGCAGAC-3', SEQ ID NO: 44) with GoTaq Green Master Mix (Promega). PCR was carried out under the conditions of 95° C. for 2 minutes, 30 cycles of "95° C. for 30 seconds, 53° C. for 30 seconds, and 72° C. for 30 seconds", and 72° C. for 5 minutes. After PCR, 1/10 of the PCR product was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis to confirm the presence or absence of ToBRFV.
  • SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Invitrogen
  • FIG. 3 An electrophoretic photograph showing the results of the RT-PCR analysis of the ToBRFV inoculation test is shown in Figure 3.
  • M represents the ladder marker
  • WT represents the wild type cultivar (Many Maker)
  • R1 represents a mutant with a frameshift mutation in the RLK1 gene
  • R2 represents a mutant with a frameshift mutation in the RLK2 gene
  • PC represents the positive control.
  • ToBRFV was detected in both the inoculated leaves and upper leaves of the control cultivar Many Maker, but in the RLK1 and RLK2 mutants, ToBRFV was detected in the inoculated leaves but not in the upper leaves. This result indicated that the movement of the virus within the plant body was restricted or inhibited in the RLK1 and RLK2 mutants, and the mutants were resistant.
  • Figure 4 shows the mutations C1 to C4 found in the RLK1 gene together with the wild-type sequence
  • Figure 5 shows the mutations P1 to P6 found in the RLK2 gene together with the wild-type sequence.
  • the present invention provides a method for producing tomatoes, tomato cells, and tomatoes resistant to tobamovirus viruses, which have the property of inhibiting infection with tobamovirus viruses, the property of suppressing the proliferation and migration of tobamovirus viruses after infection, and/or the property of suppressing the manifestation of symptoms of infection with tobamovirus viruses.
  • the present invention can solve problems mainly in the agricultural field, such as reduced tomato yields due to infection with tobamovirus viruses.
  • SEQ ID NO: 1 cDNA sequence of RLK1 gene, bases 1 to 2818 are exon 1, bases 790 to 809 are target sequence.
  • SEQ ID NO: 2 Exon 1 of RLK1 gene, bases 790 to 809 are target sequence.
  • SEQ ID NO: 3 Wild-type target sequence in exon 1 of RLK1 gene.
  • SEQ ID NO: 4 Mutation region C1 of RLK1 gene.
  • SEQ ID NO: 5 Mutation region C2 of the RLK1 gene
  • SEQ ID NO: 6 Mutation region C3 of the RLK1 gene
  • SEQ ID NO: 7 Mutation region C4 of the RLK1 gene
  • SEQ ID NO: 8 Exon 1 of the RLK1 gene containing the mutated region C1
  • SEQ ID NO: 9 Exon 1 of the RLK1 gene containing the mutated region C2
  • SEQ ID NO: 10 Exon 1 of the RLK1 gene containing the mutated region C3
  • SEQ ID NO: 11 Exon 1 of the RLK1 gene containing the mutated region C4
  • 12 cDNA sequence of mutant RLK1 gene having mutated region C1
  • SEQ ID NO: 13 cDNA sequence of mutant RLK1 gene having mutated region C2
  • 14 cDNA sequence of mutant RLK1 gene having mutated region C3
  • 15 cDNA sequence of mutant RLK1 gene having mutated region C4 SEQ ID NO:

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Abstract

本発明の課題は、トバモウイルス属ウイルスの感染を阻害する性質、感染後のトバモウイルス属ウイルスの増殖を抑制する性質及び／又はトバモウイルス属ウイルスの感染症状の発現を抑制する性質を有する、トバモウイルス属ウイルス抵抗性のトマト、トマト細胞及びその作出方法を提供することである。受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、この変異によって、変異を有する遺伝子の発現が抑制されているか、又は変異を有する遺伝子のコードするタンパク質がトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、トバモウイルス属ウイルス抵抗性を有する、トマトを提供することによって、上記課題を解決する。

Description

トバモウイルス属ウイルスに抵抗性のトマト植物、トマト植物細胞及びその作出方法
　本発明は、トバモウイルス属ウイルスに抵抗性のトマト植物、トマト植物細胞およびその作出方法に関する。
　国際連合食糧農業機関統計データベース（ＦＡＯＳＴＡＴ　２０１８）等によると、トマトは、世界中でジャガイモに次ぎ多く生産されている園芸野菜作物であり、その生産量は年間１億８０００万トンを超え、全野菜の生産量の１割以上を占めている。しかし、栽培中のトマトは、他の野菜作物と同様に、菌やウイルスなど様々な病原体に感染し、大きな被害を出すこともしばしばある。
　トマトに感染するウイルスの１種として、１本鎖のＲＮＡを持つトバモウイルス属に属するウイルス（即ち、トバモウイルス属ウイルス）が挙げられる。トバモウイルス属ウイルスは、世界で初めて見つかったウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の仲間の総称であり、非常に失活しにくく安定的で、感染力の強いウイルスである。
　植物ウイルスに対する直接的且つ効果的な抗ウイルス薬剤は、未だ存在しない。これまでの一般的な植物ウイルスの防除方法は、虫媒性のウイルスに対しては伝染する媒介虫への殺虫剤散布、虫の侵入を物理的に防ぐ防虫ネットの利用、ウイルス抵抗性の育種などであり、接触伝染及び種子伝染するトバモウイルス属ウイルスに対する場合は、土壌及び栽培管理機具の消毒、種子消毒、および抵抗性の育種などが中心である。
　トバモウイルス属ウイルスの中でも、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｂｒｏｗｎ　ｒｕｇｏｓｅ　ｆｒｕｉｔ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＢＲＦＶ）は、近年突如出現し、急速に世界中に広がっている新興ウイルスの一つである（非特許文献１）。現在では、主にトマトとトウガラシ類で発生が目立っている。
　ＴｏＢＲＦＶは、２０１４年に中東イスラエルで初めて発見されたが、その後数年でヨルダン、イタリア、ドイツ、トルコなどのヨーロッパ、さらには海を超えてアメリカ、カナダ、そして中国でも発生が見つかった。発生源は、おそらく中東周辺と思われ、感染力の強いウイルスのため、種子や資材に微量に付着したり残存したりして、感染源になり得ることから、急速に世界中に広がっていると推測されている。
　ＴｏＢＲＦＶは、日本ではまだ未発見で、農水省、植物防疫所は「検疫有害動植物に関する病害虫リスクアナリシス」に重要ウイルスとして指定し、侵入防止水際対策と最大限の注意喚起を行っているが、国内に侵入するのは近い将来である可能性が高い。
　ＴｏＢＲＦＶによるトマトの病症はこれまでのトバモウイルスの症状に似ていて、葉のモザイク、糸葉、黄化症状、茎のえそ症状、さらに果実の退色、えそおよび輪紋症状を呈するものの、葉でのモザイク等の症状は弱く、一方で果実のえそ症状は他のトバモウイルスのものより強いという特徴がある。トバモウイルスの仲間は、主に汚染された種子や機械的接触（慣行的な農業作業）または汚染された土壌や水、器具を介して伝染する（非特許文献２および非特許文献３）。
　トマトでは、これまで長らく育種に利用してきたトバモウイルス抵抗性遺伝子Ｔｍ－２、Ｔｍ－２ａ（別名Ｔｍ－２２）がＴｏＢＲＦＶには打破されることがわかっており、Ｔｍ－２ａ等をもつ品種の使用が危ぶまれている（非特許文献４）。
　このような状況から、新たな抵抗性遺伝子の開発が試みられているが、これまでのところ、抵抗性に関連する遺伝子もしくは遺伝子座が多数存在する場合が多かったり、効果が不十分であったり、育種に利用しにくい条件が多く（非特許文献５）、未だ決定的に良い抵抗性遺伝子候補は少ない。
　例えば、他の例として、非特許文献６の報告が挙げられる。当該文献の記載においては、遺伝子編集により４つの遺伝子変異を持たせることで、植物は初めて抵抗性が得られると示されており、関連遺伝子数が多い。２０２２年時点で、まだ、ＴｏＢＲＦＶに有効な抵抗性品種は市場に出ていない。
　一方、２０２１年に発行された非特許文献７は、トマトの受容体様キナーゼの１つであるＢＡＭ遺伝子がＴＭＶの移行タンパク（ＭＰ）と相互作用することを報告している。つまりトバモウイルスは感染もしくは感染後の植物内移動にＢＡＭ遺伝子を利用している可能性が示唆された。
Salem, et al. "A new tobamovirus infecting tomato crops in Jordan," Arch. Viol., 2015 Creager, et al., "Tobacco Mosaic Virus: Pioneering Research for a Century," The Plant Cell, March 1999, 301-308 Zhang, et al., "Tomato brown rugose fruit virus: An emerging and rapidly spreading plant RNA virus that threatens tomato production worldwide," Mol. Plant Pathol. 2022; 23:1262-1277 Luria, et al., "A New Israeli Tobamovirus Isolate Infects Tomato Plants Harboring Tm-22Resistance Genes," PLoS ONE 2017, 12(1) Zinger et al., "Identification and Mapping of Tomato Genome Loci Controlling Tolerance and Resistance to Tomato Brown Rugose Fruit Virus," Plants 2021, 10, 179 Ishikawa, et al. "Tomato brown rugose fruit virus resistance generated by quadruple knockout of homologs of TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION1 in tomato," Plant Physiology, 2022: 00:1-8 Tran, "Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus," Communications Biology, 2021, 4:511
　現在、トバモウイルス属ウイルス、特に近年突如出現したＴｏＢＲＦＶの感染を防除するための抵抗性遺伝子候補は数種しか見出されていない。本発明者らは、トバモウイルス属ウイルスによるトマトの病害を防除する上で有効な新たな抵抗性遺伝子を発見し、この遺伝子を保有する植物を品種として開発することで、トバモウイルス属ウイルスの防除法及びトバモウイルス属ウイルス抵抗性植物を提供することを課題とする。
　本発明は、以下のトマト（即ち、トマト植物）、その部分及びそれらの加工品を提供する。
　［１］　受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、又は前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、トバモウイルス属ウイルスに対する抵抗性を有する、トマト。
　［２］　前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、［１］に記載のトマト。
　［３］　前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［２］に記載のトマト。
　（ａ）フレームシフト変異、
　（ｂ）ナンセンス変異、
　（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～５）の欠損、及び
　（ｄ）１～１０塩基の挿入又は置換。
　［４］　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ１遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［１］～［３］のいずれか一項に記載のトマト。
　［５］　前記ＲＬＫ１遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［４］に記載のトマト。
　［６］　前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４～７から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［５］に記載のトマト。
　［７］　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ２遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［１］～［３］のいずれか一項に記載のトマト。
　［８］　前記ＲＬＫ２遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［７］に記載のトマト。
　［９］　前記配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２４から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［８］に記載のトマト。
　［１０］　前記トバモウイルス属ウイルスが、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｂｒｏｗｎ　ｒｕｇｏｓｅ　ｆｒｕｉｔ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＢＲＦＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、及びトマトモットルモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｍｏｔｔｌｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＭＭＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］～［９］のいずれか一項に記載のトマト。
　［１１］　［１］～［１０］のいずれか一項に記載のトマトの部分。
　［１２］　果実である、［１１］に記載のトマトの部分。
　［１３］　種子である、［１１］に記載のトマトの部分。
　［１４］　［１１］～［１３］のいずれか一項に記載のトマトの部分の加工品。
　［１５］　食用である、［１４］に記載の加工品。
　さらに本発明は、以下のトマト細胞、ならびにそれを有するトマト植物及びその部分を提供する。
　［１６］　受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、又は前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、トバモウイルス属ウイルスに対する抵抗性を有する、トマト細胞。
　［１７］　前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、［１６］に記載のトマト細胞。
　［１８］　前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［１７］に記載のトマト細胞。
　（ａ）フレームシフト変異、
　（ｂ）ナンセンス変異、
　（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～５）の欠損、及び
　（ｄ）１～１０塩基の挿入又は置換。
　［１９］　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ１遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［１６］～［１８］のいずれか一項に記載のトマト細胞。
　［２０］　前記ＲＬＫ１遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［１９］に記載のトマト細胞。
　［２１］　前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４～７から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［２０］に記載のトマト細胞。
　［２２］　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ２遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［１６］～［１８］のいずれか一項に記載のトマト細胞。
　［２３］　前記ＲＬＫ２遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［２２］に記載のトマト細胞。
　［２４］　前記配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２４から選ばれる１種に示される塩基配列変異している、［２３］に記載のトマト細胞。
　［２５］　前記トバモウイルス属ウイルスが、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｂｒｏｗｎ　ｒｕｇｏｓｅ　ｆｒｕｉｔ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＢＲＦＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、及びトマトモットルモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｍｏｔｔｌｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＭＭＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１６］～［２４］のいずれか一項に記載のトマト細胞。
　［２６］　［１６］～［２５］のいずれか一項に記載のトマト細胞を有し、トバモウイルス属ウイルスに対する抵抗性を有する、トマト及びその部分。
　［２７］　果実である、［２６］に記載のトマトの部分。
　［２８］　種子である、［２６］に記載のトマトの部分。
　［２９］　［２６］～［２８］のいずれか一項に記載のトマトの部分の加工品。
　［３０］　食用である、［２９］に記載の加工品。
　さらに本発明は、以下のトマトの作出方法、及び当該作出方法によって得られたトマト植物を提供する。
　［３１］　受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子を選択する工程と、トマトのゲノム内の選択した遺伝子に対して、前記選択した遺伝子の発現が抑制される変異、又は前記選択した遺伝子のコードするタンパク質がトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的になる変異を導入する工程と、トバモウイルス属ウイルスに対して抵抗性を有するトマトを選別する工程とを含む、トバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［３２］　前記変異を、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入する、［３１］に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［３３］　前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［３１］又は［３２］に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　（ａ）フレームシフト変異、
　（ｂ）ナンセンス変異、
　（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～５）の欠損、及び
　（ｄ）１～１０塩基の挿入又は置換。
　［３４］　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ１遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［３１］～［３３］のいずれか一項に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［３５］　前記ＲＬＫ１遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［３４］に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［３６］　前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４～７から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、［３５］に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［３７］　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ２遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［３１］～［３３］のいずれか一項に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［３８］　前記ＲＬＫ２遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［３７］に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［３９］　前記配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２４から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、［３８］に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［４０］　前記トバモウイルス属ウイルスが、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｂｒｏｗｎ　ｒｕｇｏｓｅ　ｆｒｕｉｔ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＢＲＦＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、及びトマトモットルモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｍｏｔｔｌｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＭＭＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［３１］～［３９］のいずれか一項に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
　［４１］　［３１］～［４０］のいずれか一項に記載の作出方法によって得られた、トバモウイルス属ウイルス抵抗性トマト。
　さらに本発明は、以下のトマト育種後代の作出方法及び当該作出方法によって得られたトマト植物を提供する。
　［４２］　［３１］～［４０］のいずれか一項に記載の作出方法によって得られたトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマト又はその後代を、自家受粉又は他家受粉させる工程を含む、トバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの育種後代の作出方法。
　［４３］　［４２］に記載の作出方法によって得られた、トバモウイルス属ウイルス抵抗性トマト。
　本発明によれば、トバモウイルス属ウイルスの感染を阻害する性質、感染後のトバモウイルス属ウイルスの増殖、移行を抑制する性質及び／又はトバモウイルス属ウイルスの感染症状の発現を抑制する性質を有する、トバモウイルス属ウイルス抵抗性のトマト植物、トマト細胞、及びトマト植物の作出方法が提供される。
図１は、トマトの受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）のｃＤＮＡ配列であり、下線部がエクソン１であり、波下線部がエクソン１内のガイドＲＮＡ認識部分（エクソン１の７９０番塩基～８０９番塩基）であり、四角で囲った部分がＰＡＭ配列である。 図２は、トマトの受容体様キナーゼＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）のｃＤＮＡ配列であり、下線部がエクソン１であり、波下線部がエクソン１内のガイドＲＮＡ認識部分（エクソン１の２７７番塩基～２９６番塩基）であり、四角で囲った部分がＰＡＭ配列である。 図３は、ＴｏＢＲＦＶ接種試験のＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す電気泳動写真である。 図４は、トマトの受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子内の変異パターンを示す図であり、野性型配列中の波下線部がエクソン１内のガイドＲＮＡ認識部分に相当し、－は塩基の欠損、四角は塩基の挿入、下線は塩基の置換を表す。 図５は、トマトの受容体様キナーゼＲＬＫ２遺伝子内の変異パターンを示す図であり、野性型配列中の波下線部がエクソン１内のガイドＲＮＡ認識部分に相当し、－は塩基の欠損を表す。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、トマトの受容体様リガーゼＲＬＫ遺伝子及びそのホモログ遺伝子の機能喪失はＴＭＶもしくはその仲間であるトバモウイルス属ウイルスの感染や増殖に影響を与える可能性があると考えた。そこで、トマトのＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）及びＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）について、それぞれのアレルがホモ接合型に変異している株を作製し、ＴｏＢＲＦＶを接種して、ウイルス抵抗性の有無について検証した。その結果、トマトが受容体様リガーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有し、当該変異によって変異を有する遺伝子の発現が抑制されているか、または変異を有する遺伝子のコードするタンパク質がトマトに感染するトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的であると、トバモウイルス属ウイルスの感染率が低下し、トマトが当該ウイルスに対して抵抗性を有することを見出した。受容体様リガーゼＲＬＫ遺伝子を変異させたトバモウイルス属ウイルス抵抗性のトマトは、本願が初めての報告である。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」とも言う。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施形態および図面に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
　［Ｉ］ウイルス抵抗性を有するトマト
　一態様において、本実施形態は、トバモウイルス属ウイルス抵抗性を有するトマトに関する。本実施形態において、ウイルス抵抗性を有するトマトとは、例えば、トバモウイルス属ウイルスの感染を阻害する性質、感染しても当該ウイルスの増殖、移行を抑制する性質および／または当該ウイルスの感染症状の発現を抑制する性質を有するトマトである。ウイルス抵抗性を有するトマトは、当該ウイルスの感染を阻害するか、感染しても当該ウイルスの増殖、移行を抑制する性質を有するトマトであることが好ましい。
　本実施形態において「トバモウイルス属ウイルス」とは、１本鎖のＲＮＡを持つウイルスであって、世界で初めて見つかったウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の仲間の総称である。トバモウイルス属ウイルスは、非常に失活しにくく安定的で、感染力の強いウイルスであることが知られており、感染植物に葉のモザイク、糸葉、黄化症状、茎のえそ症状、さらに果実の退色、えそおよび輪紋症状等をもたらす。
　本発明において、感染防除の標的とするトバモウイルス属ウイルスはトマトに感染するトバモウイルス属ウイルスである限り特に限定は無く、具体例としては、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｂｒｏｗｎ　ｒｕｇｏｓｅ　ｆｒｕｉｔ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＢＲＦＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、及びトマトモットルモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｍｏｔｔｌｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＭＭＶ）が挙げられる。
　尚、以下の説明においては、「トバモウイルス属ウイルス」を「トバモウイルス」と略す場合もある。
　本実施形態においてトマトとは、Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであり、その果実のみではなく、植物体全体を意味する。
　一態様において、本実施形態のトバモウイルス抵抗性のトマトは、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有する。
　ＲＬＫ遺伝子とは、“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｋｉｎａｓｅ”、即ち、受容体様キナーゼをコードするトマトの遺伝子である。ＲＬＫは、シロイヌナズナではＢＡＭ１（Ｂａｒｅｌｙ　Ａｎｙ　Ｍｅｒｉｓｔｅｍ　１）と呼ばれ、葉や配偶子形成に関わる、シュートと花分裂組織機能に必要なＣＬＡＶＡＴＡ１関連レセプター様キナーゼタンパク質をコードしている。また、シロイヌナズナのＢＡＭ１にはかなり相同性の高いＢＡＭ２の存在が認められており、トマトにおいても、近年の研究から、相同性の高い相同体の存在がわかってきた。このような相同体としては、トマトの「ＲＬＫ１遺伝子」（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０、２番染色体上）や、「ＲＬＫ２遺伝子」（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０、３番染色体上）が知られている。本発明においては、後述するように、トマトのＲＬＫ１遺伝子及びＲＬＫ２遺伝子のそれぞれについて、トバモウイルスの防除に有効な遺伝子変異を見出した。よって、「ＲＬＫ遺伝子」という用語は、「ＲＬＫ１遺伝子」（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）または「ＲＬＫ２遺伝子」（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）、さらにはその両方を包括的に表し、個別の遺伝子については、「ＲＬＫ１遺伝子」又は「ＲＬＫ２遺伝子」と称する。
　本実施形態において、「ＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子」とは、後述する「ＲＬＫ１遺伝子の相同遺伝子」及び「ＲＬＫ２遺伝子の相同遺伝子」の両方を含み得ることを理解されたい。
　本実施形態において、「ＲＬＫ１遺伝子」は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むもの、または配列番号１に示される塩基配列からなるものであることが好ましい。
　本実施形態において「ＲＬＫ１遺伝子の相同遺伝子」とは、そのｃＤＮＡ配列が、配列番号１に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列を含むもの、あるいは配列番号１に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列からなるものであることが好ましい。なお、本発明において「配列相同性」とは、配列の同一性を意味する。配列番号１の塩基配列との相同性に特に限定はないが、８５％以上、１００％未満であることが好ましい。また、相同性の下限値は、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、９９．５％以上など、８５％以上であれば、どのような値でもかまわない。
　本実施形態において、「ＲＬＫ２遺伝子」は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列を含むもの、または配列番号１６に示される塩基配列からなるものであることが好ましい。
　本実施形態において「ＲＬＫ２遺伝子の相同遺伝子」とは、そのｃＤＮＡ配列が、配列番号１６に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列を含むもの、あるいは配列番号１６に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列からなるものであることが好ましい。なお、本発明において「配列相同性」とは、配列の同一性を意味する。配列番号１６の塩基配列との相同性に特に限定はないが、８５％以上、１００％未満であることが好ましい。また、相同性の下限値は、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、９９．５％以上など、８５％以上であれば、どのような値でもかまわない。
　尚、特定の塩基配列と、相同遺伝子のｃＤＮＡ配列との相同性（即ち、同一性）は、公知の方法で決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴといった公知の相同性検索プログラムを使用して、塩基配列の相同性を決定することができる。
（トバモウイルス抵抗性遺伝子）
　本実施形態において、トマトは、ＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子に変異を有する（以下、変異を有する遺伝子を「ウイルス抵抗性遺伝子」または「トバモウイルス抵抗性遺伝子」ともいう）。当該変異とは、変異を有する遺伝子の発現を抑制するか、または変異遺伝子若しくは相互に関連する遺伝子がコードするタンパク質をトバモウイルスに対して非機能的とするものである。当該ウイルスに対して非機能的なタンパク質とは、当該ウイルスが植物に感染し、増殖、移行する際に利用できないか、当該ウイルスの感染および増殖を低減させるタンパク質を指す。一態様において、トバモウイルス抵抗性遺伝子は、タンパク質をコードしないように変異したものであってもよい。
　理論に束縛されるものではないが、トバモウイルスがトマトに感染する際には、トマトに存在する複数のＲＬＫのアイソフォームのうち、特定のＲＬＫと相互作用すると考えられる。このとき、トバモウイルスの使用する特定のアイソフォーム（即ち、トバモウイルスに対して機能的なＲＬＫ）をコードする遺伝子が変異し、トバモウイルスが使用する特定のＲＬＫタンパク質が産生されなくなるか、又は産生されたＲＬＫタンパク質がトバモウイルスに対して非機能的なものであると、ウイルスゲノム上にコードされる、感染増殖に必要なタンパク質の翻訳が進行しなくなると考えられる。もしくはＲＬＫとの相互作用を必要とするトバモウイルスタンパク質がその機能を果たせなくなり、トバモウイルスの感染及び増殖が阻害されることで、トマトがトバモウイルス抵抗性を獲得すると考えられる。
　一方、トマトに存在する複数のＲＬＫ相同体のうちの１つが変異しても、トマト自体は他の相同体を利用可能であるか、又はトマト自体はトバモウイルスに非機能的なＲＬＫタンパク質を利用可能であるため、宿主であるトマトの生育に影響を与えることなく、トバモウイルス抵抗性を付与することが可能であると考えられる。
　上述したようにトバモウイルス抵抗性遺伝子を有するトマトは、トバモウイルス抵抗性を獲得する。例えば、トバモウイルス接種から１８日以上経っても、植物体中のトバモウイルスの蓄積量が、トバモウイルス非接種株と同程度またはそれ以下であること、および／またはトバモウイルス感染症状が目視により確認できないことをもって、植物が「トバモウイルス抵抗性」を有すると判定することができる。具体的には、常法により植物にトバモウイルスを感染させ、植物体中のトバモウイルスの蓄積をＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法等の公知の手法で確認することにより、植物のトバモウイルス抵抗性を判断することができる。また、トバモウイルスを感染させた植物のトバモウイルス感染症状（葉のモザイク、糸葉、黄化症状、茎のえそ症状、さらに果実の退色、えそおよび輪紋症状等）の有無を確認することによっても、トマトのトバモウイルス抵抗性を判断することができる。
　尚、ＴｏＢＲＦＶは、検疫上の問題から、ウイルスやウイルス感染葉を国内に持ち込むことが非常に困難であるため、ＴｏＢＲＦＶそのものを用いた試験は困難である。しかし、多くのトバモウイルスはウイルス粒子の状態だけでなくゲノムＲＮＡ単体でも植物に感染することが可能であり、非特許文献６の記載のように、ＴｏＢＲＦＶのゲノムＲＮＡに相当する合成感染性ＲＮＡ（例えば、配列番号４５）をウイルスの代わりに使用して、ＴｏＢＲＦＶ抵抗性を試験することもできる。
　トマトが上述したトバモウイルス抵抗性を有する限り、遺伝子変異は、ＲＬＫ１遺伝子およびその相同遺伝子、並びにＲＬＫ２遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子に存在すればよい。
　さらに本実施形態におけるトバモウイルス抵抗性トマトは、ＲＬＫ１遺伝子に変異を有する場合、トバモウイルスに対して機能的なＲＬＫ１タンパク質をコードする遺伝子の全てに変異を有してもよい。例えば、複二倍体等の倍数体植物の場合、複数存在する、トバモウイルスに対して機能的なＲＬＫ１タンパク質をコードする遺伝子が、全てトバモウイルス抵抗性遺伝子に変異していることが好ましい。このようなトバモウイルス抵抗性トマトは、トバモウイルスに対して機能的なＲＬＫ１タンパク質をコードする遺伝子が変異している限り、他の正常なＲＬＫ１遺伝子を有するものであってもよい。また、トバモウイルスに対して機能的なＲＬＫ１タンパク質をコードする内生の遺伝子が全て欠失、破壊等して機能を喪失し、代わりに外来のＲＬＫ１遺伝子を導入したものであってもよい。
　トバモウイルス抵抗性トマトがＲＬＫ２遺伝子に変異を有する場合も上記と同様である。即ち、本発明に係るトバモウイルスに対して機能的ないずれかのタンパク質をコードする遺伝子が変異している限り、他の正常な遺伝子を有するものであってもよい。また、トバモウイルスに対して機能的ないずれかのＲＬＫ２タンパク質をコードする内生の遺伝子を全て欠失、破壊等して機能を喪失し、代わりに外来の相同な遺伝子を導入したものであってもよい。
　一態様において、本実施形態におけるトバモウイルス抵抗性トマトは、そのゲノム内の遺伝子に変異を有する。遺伝子変異はウイルス抵抗性を付与するものである限りに特に限定はない。
　ＲＬＫ遺伝子（ＲＬＫ１遺伝子及び／又はＲＬＫ２遺伝子）及びその相同遺伝子の変異の具体例としては、以下の（ａ）～（ｄ）が挙げられる。
　（ａ）フレームシフト変異、
　（ｂ）ナンセンス変異、
　（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～５）の欠損、および
　（ｄ）１～１０塩基の挿入又は置換。
　（ａ）フレームシフト変異は、塩基の欠失または挿入により、コドンの読み枠がずれ、異なるアミノ酸配列をコードするようになる変異である。コードするアミノ酸配列が変わることにより、変異遺伝子はトバモウイルス抵抗性遺伝子となる。
　（ｂ）ナンセンス変異は、本来アミノ酸をコードしていたコドンが終止コドンに変わる変異であり、これにより、トバモウイルス抵抗性遺伝子となる。
　（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～５）の欠損により、当該欠損領域から下流の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が変化する。このような変化が生じるため、トバモウイルス抵抗性遺伝子となる。
　（ｄ）１～１０塩基の挿入又は置換により、変異領域の下流の塩基配列がコードするアミノ酸配列の読み枠が変化する。読み枠の変化により、元々コードしていたアミノ酸配列が変わり、タンパク質の構造変化等が生じるため、トバモウイルス抵抗性遺伝子となる。一態様において、この変異は、コドンの３番目以外の塩基の変異であることが好ましい。挿入又は置換される塩基の個数は、トバモウイルス抵抗性遺伝子が得られる限り特に限定されないが、例えば、１～５個、１～３個、または１～２個とすることができる。
　トバモウイルス抵抗性遺伝子の有する変異は、上記（ａ）～（ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。尚、上記（ａ）～（ｄ）の変異は、択一的なものではなく、例えば、（ｃ）や（ｄ）の変異の結果として、（ａ）や（ｂ）の変異が起こることもある。
　トマトのゲノム内の変異は、変異を有する遺伝子の発現を抑制するもの、または当該遺伝子のコードするタンパク質をトバモウイルスに対して非機能的にするものであって、変異遺伝子を有する植物にトバモウイルス抵抗性を付与し、且つ当該植物の生命および生育に著しい障害を与えないものである限り、特に限定はない。
　次に、このような変異について具体的に説明する。
　一態様において、トマトがＲＬＫ１遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、ＲＬＫ１遺伝子のエクソン１（配列番号２）に存在することが好ましく、エクソン１の７９０番塩基～８０９番塩基を含む領域、即ち、配列番号３に示したＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＴを含む領域に存在することがより好ましい。トマトがＲＬＫ１遺伝子の相同遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、当該相同遺伝子内の、配列番号２に示される塩基配列に対応する領域に存在することが好ましく、当該領域内の配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に存在することがより好ましい。尚、変異が配列番号３に示した領域または対応する領域に存在するとき、エクソン１内の当該領域以外の部分にも変異が存在する場合もある。
　トマトが配列番号２に示したエクソン１またはそれに対応する領域に変異を有する場合、当該変異は、７塩基欠損、５塩基欠損、１塩基挿入、もしくは塩基の置換であることが好ましい。このような変異のとしては、エクソン１の７９３番～７９９番の７塩基の欠損、７９３番～７９７番の５塩基の欠損、７９５番塩基と７９６番塩基の間の１塩基の挿入、８０６番～８０８番塩基の置換等が挙げられる。具体的には、７９３番～７９７番の５塩基の欠損（変異Ｃ１）、７９３番～７９９番の７塩基の欠損（変異Ｃ２）、７９５番塩基と７９６番塩基の間の１塩基（アデニン）の挿入（変異Ｃ３）、７９３番～７９７番の５塩基の欠損と８０６番～８０８番塩基の置換（ＣＡＧからＡＣＧへの置換）（変異Ｃ４）が挙げられる（図４参照）。変異した領域の塩基配列を配列番号４～７に示した。
　一態様において、トマトがＲＬＫ２遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、ＲＬＫ２遺伝子のエクソン１（配列番号１７）に存在することが好ましく、エクソン１の７９０番塩基～８０９番塩基を含む領域、即ち、配列番号１８に示したＧＡＧＧＴＧＴＣＡＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣを含む領域に存在することがより好ましい。トマトがＲＬＫ２遺伝子の相同遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、当該相同遺伝子内の、配列番号１７に示される塩基配列に対応する領域に存在することが好ましく、当該領域内の配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域に存在することがより好ましい。尚、変異が配列番号１８に示した領域または対応する領域に存在するとき、エクソン１内の当該領域以外の部分にも変異が存在する場合もある。
　トマトが配列番号２に示したエクソン１またはそれに対応する領域に変異を有する場合、当該変異は、１２塩基欠損、６塩基欠損、５塩基欠損、３塩基欠損、もしくは１塩基欠損であることが好ましい。このような変異の具体例としては、エクソン１の２６９番～２８０番の１２塩基の欠損（変異Ｐ１）、２７２番～２８３番の１２塩基の欠損（変異Ｐ２）、２７９番～２８５番の６塩基の欠損（変異Ｐ３）、２７９番～２８４番の５塩基の欠損（変異Ｐ４）、２７９番～２８１番の３塩基の欠損（変異Ｐ５）、及び２７９番の１塩基の欠損（変異Ｐ６）が挙げられる（図５参照）。変異した領域の塩基配列を配列番号１９～２４に示した。
　本実施形態は、トバモウイルス抵抗性遺伝子である、配列番号８～１１のいずれかに示した変異したエクソン１を有する変異ＲＬＫ１遺伝子自体、及び配列番号２５～３０のいずれかに示した変異したエクソン１を有する変異ＲＬＫ２遺伝子自体に関する。このような遺伝子としては、ｃＤＮＡ配列が配列番号１２～１５のいずれかに示した塩基配列を含むか、または配列番号１２～１５のいずれかに示した塩基配列からなる変異ＲＬＫ１遺伝子、ｃＤＮＡ配列が配列番号３１～３６に示した塩基配列を含むか、または配列番号３１～３６のいずれかに示した塩基配列からなる変異ＲＬＫ２遺伝子が好ましい。本実施形態は、また、トマトにトバモウイルス抵抗性を付与するための、上記変異ＲＬＫ１遺伝子および／または変異ＲＬＫ２遺伝子の使用にも関する。
　尚、トマトの有する変異は、上述した領域に限定されるものではなく、トバモウイルス抵抗性が損なわれない限り、ＲＬＫ１遺伝子内および／またはＲＬＫ２遺伝子内の他の領域や、他の遺伝子に変異が存在してもよい。
　一態様において、トマトの遺伝子の変異は、後述するＣＲＩＳＰＲシステム等のゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものであることが好ましい。
　ゲノム内の変異遺伝子は、２つの対立遺伝子の両方に存在するホモ接合型であっても、一方の対立遺伝子にのみ存在するヘテロ接合型であってもよいが、ホモ接合型であることが好ましい。これは同じ変異配列によって２つの対立遺伝子が特徴付けられるホモ接合型の方が、変異遺伝子によってもたらされる性質が、より強く反映されると考えられるためである。
　（ウイルス抵抗性のトマトおよびその部分）
　本実施形態におけるトバモウイルス抵抗性のトマトは、トバモウイルス属ウイルスに抵抗性を示す限り、他のウイルスや細菌に対する抵抗性を示す、複合抵抗性トマトであってもよい。
　一態様において、本実施形態は、トバモウイルス抵抗性を有するトマトの部分に関する。当該部分には、上記特徴を有するトマトおよびその後代植物やクローンの植物体から採取される部分、あるいは植物体または部分から得られる派生物が含まれる。部分の具体例としては、果実、シュート、茎、根、若枝、葯といった器官、並びに植物の組織や細胞が挙げられる。このような部分はいかなる形態であってもよく、懸濁培養物、プロトプラスト、胚、カルス組織、葉片、配偶体、胞子体、花粉および小胞子でもよい。トマトの派生物としては、種子が挙げられる。
　また、本実施形態におけるトバモウイルス抵抗性トマトの部分は、接ぎ木に利用する穂木、台木等であってもよい。また、一態様において、本実施形態は、上述のウイルス抵抗性トマトを再生し得る植物細胞（カルスを含む）等にも関し、本実施形態におけるトバモウイルス抵抗性トマトは、このような植物細胞から得られた植物も含む。
　ウイルス抵抗性を有するトマトの部分は、生食用や加工用に有用である果実が好ましい。また、後代の作出等に有用であることから、当該部分は種子であることも好ましい。
　（トマトまたはその部分の加工品）
　一態様において、本実施形態は、トマトまたはその部分の加工品に関する。当該加工品に特に限定はなく、食用、工業用、医療用などの加工品が挙げられ、特に食用の加工品であることが好ましい。
　例えばウイルス抵抗性を有するトマトがトマトの場合、トマトの食用加工品としては、缶詰トマト、トマトペースト、ケチャップ、トマトソース、トマトスープ、乾燥トマト、トマトジュース、トマトパウダー、トマト濃縮物等が挙げられる。また、トマトを原料とする栄養補助食品（サプリメント）等も加工品の一例である。
　［II］トバモウイルス抵抗性を有する、トマト細胞
　一態様において、本実施形態は、トバモウイルス抵抗性を有するトマト細胞に関する。
　本実施形態のトマト細胞は、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有する。これら遺伝子およびその変異については、トバモウイルス抵抗性のトマトに関連して上述した通りである。
　トマト細胞のトバモウイルス抵抗性は、上述した方法によって確認することができる。例えば、常法により植物細胞にトバモウイルスを感染させ、細胞中のウイルスの蓄積をＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法等の公知の手法で検出することにより、ウイルス抵抗性の有無を確認することができる。
　本実施形態のトバモウイルス抵抗性トマト細胞は、上述したトバモウイルス抵抗性のトマトおよびその後代植物やクローンの植物体または部分から単離したものであってもよいし、後述するトバモウイルス抵抗性のトマトの作出方法によって得られる、遺伝子変異を導入した植物細胞でもよい。さらにトバモウイルス抵抗性トマト細胞の形態にも特に限定はなく、懸濁培養物やプロトプラストも含まれる。
　一態様において、本実施形態は、上述したトマト細胞を有し、トバモウイルス抵抗性を有する、トマト植物体およびその部分に関する。当該トマト植物体およびその部分には、遺伝子変異を導入したトマト植物細胞から再生した植物体または組織や器官といった部分が含まれる。トマト植物細胞から再生した植物体の部分もまた、上述したトマト細胞を有する部分である。尚、部分の詳細については、ウイルス抵抗性トマトに関連して上述した通りである。
　また、トマトの部分は、生食用や加工用に有用である果実が好ましい。また、後代の作出等に有用であることから、当該部分は種子であることも好ましい。
　一態様において、本実施形態は、トマトまたはその部分の加工品に関する。当該加工品に特に限定はなく、食用、工業用、医療用などの加工品が挙げられ、特に食用の加工品であることが好ましい。
　［III］ウイルス抵抗性のトマトの作出方法
　一態様において、本実施形態は、本発明のウイルス抵抗性トマトの作出方法に関する。具体的には、下記の工程を含む作出方法に関する。
　受容体様リガーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より少なくとも１種の遺伝子を選択する工程と、
　トマトのゲノム内の選択した遺伝子に対して、選択した遺伝子の発現が抑制される変異、または選択した遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的になる変異を導入する工程と、
　トバモウイルス属ウイルスに対して抵抗性を有するトマトを選別する工程。
　初めに、変異を導入する標的遺伝子をＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選択する。選択する遺伝子は、１種でもよいし、異なる２種以上の遺伝子の組み合わせでもよい。これら遺伝子については、ウイルス抵抗性のトマトに関連して上述した通りである。
　次に、ウイルス抵抗性トマトの作出方法を具体的に説明する。
　次に、選択した遺伝子に変異を導入する。ゲノム内の遺伝子に変異を導入するための方法としては、大別すると、以下に例示する２通りの方法を挙げることができる。
　（１）直接ゲノム編集：　トバモウイルスに対して機能的なＲＬＫ遺伝子を有する植物のゲノムを直接編集することにより、目的とする箇所にピンポイントで変異を導入し、トバモウイルス抵抗性遺伝子を有する植物を作出する方法。
　（２）変異遺伝子導入：　次の手順（Ａ）と（Ｂ）とを組み合わせた方法である。（Ａ）：トバモウイルス抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。（Ｂ）：植物が有する、上記（Ａ）で作製したトバモウイルス抵抗性遺伝子に対応する内生の遺伝子の内、トバモウイルスに対して機能的な遺伝子をトバモウイルスに対して非機能的なものとする。
　以下、それぞれの方法について説明する。
　（１）直接ゲノム編集
　直接ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ等、部位特異的ヌクレアーゼを用いた公知のゲノム編集技術を用いて実施することができる。ゲノムの特定部位を切断可能な制限酵素を用いて二本鎖切断を導入すると、これが修復される際に、修復エラーにより各種変異が導入される。その結果、標的遺伝子（本実施形態ではトバモウイルスに対して機能的なＲＬＫをコードする遺伝子）に変異が導入される。
　特に高い特異性および高効率で変異を導入することができるため、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることが好ましく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いることが特に好ましい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、標的遺伝子と相補的な２０塩基長程度の配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が標的を認識し、Ｃａｓ９タンパク質が二本鎖を切断し、これが非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路によって修復される際に、修復エラーにより標的部位に変異が導入される。
　植物へのＣａｓタンパク質およびｓｇＲＮＡの送達は、それらをコードするベクターを介して、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、標準的なトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルボンバードメント法等を用いて行うことができる。
　簡便には、後述の実施例に示すように、Ｃａｓ遺伝子およびｓｇＲＮＡを組み込んだバイナリベクターを構築し、これを用いてアグロバクテリウムを形質転換した後、このアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換することで、植物へのＣａｓタンパク質およびｓｇＲＮＡの送達を行うことができる（Friedrich Fauser et al., "The Plant Journal," 2014, 79: 348-359、および大澤良および江面浩、「新しい植物育種技術を理解しよう－ＮＢＴ（New plant breeding techniques）」、国際文献社、２０１３等を参照）。
　アグロバクテリウムにより形質転換する植物の形態は、植物体を再生しうるものであれば特に限定されず、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が挙げられる。アグロバクテリウムの除去後、用いたベクターに応じた薬剤を含む培地中で培養して、薬剤耐性を指標に目的遺伝子が組み込まれた切片の選抜培養をすることができる。
　高効率で標的部位への変異導入が可能になるように、ガイドＲＮＡを設計することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＰＡＭ配列と呼ばれる３塩基の配列（最も一般的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９を用いる場合はＮＧＧ）の３塩基前が一般的に切断される。標的配列の直後にＰＡＭ配列が存在する必要があるため、ＰＡＭ配列の上流を標的配列として、ガイドＲＮＡを設計することができる。
　ガイドＲＮＡの設計においては、塩基配列のＧＣ含有率が高いほど切断効率が高くなるため、ＧＣ含有率を考慮することが好ましい。また、オフターゲット効果による非特異的な切断を極力減らすよう設計することができる。例えば、トマトの２番染色体上に存在するＲＬＫ１遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す図１中、エクソン１（図１中の一重下線部、配列番号２）に存在する四角で示した箇所をＰＡＭ配列とし、この３塩基から上流の通常２０塩基（図１中の波下線部、配列番号３）を標的としてガイドＲＮＡを設計することができる。このようにして標的部位に変異を導入して、トバモウイルス抵抗性のＲＬＫ１遺伝子を有する植物を作出することができる。
　また、トマトの３番染色体上に存在するＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号１６）を示す図２中、エクソン１（図２中の一重下線部、配列番号１７）に存在する四角で示した箇所をＰＡＭ配列とし、この３塩基から上流の通常２０塩基（図２中の波下線部、配列番号１８の２０番～３９番塩基）を標的としてガイドＲＮＡを設計することができる。
　ＣＲＩＳＰＲシステムにより遺伝子内に１箇所の二本鎖切断を導入すると、２０塩基程度が修復され、修復エラーにより変異が導入されると考えられる。よって、一態様において、本実施形態のトバモウイルス抵抗性遺伝子が有する変異は様々である。尚、導入される変異は、必ずしも標的部位に限定されなくてもよい。すなわち、標的部位以外の領域、例えば、標的部位に隣接する領域に変異が存在してもよい。例えば、本発明においては、ＲＬＫ１遺伝子に導入した変異は標的部位に限定されていたが（図４参照）、ＲＬＫ２遺伝子に導入した変異は標的部位に隣接する領域にも存在していた（図５参照）。
　さらに本実施形態は、上記トバモウイルス抵抗性トマトを作出するために使用したガイドＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含むベクターにも関する。ガイドＲＮＡが有する配列は上述したとおりである。本実施形態は、さらに、上記ガイドＲＮＡを含むキットにも関する。当該キットは、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集を実施するために必要な部位特異的ヌクレアーゼ等を含んでいてもよく、トバモウイルス抵抗性トマトを作出するために使用することができる。
　（２）変異遺伝子導入
　変異遺伝子導入は、下記（Ａ）と（Ｂ）の手順を組み合わせた方法である。
　（Ａ）：トバモウイルス抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。
　（Ｂ）：植物が有する、上記（Ａ）で作製したトバモウイルス抵抗性遺伝子に対応する内生の遺伝子の内、トバモウイルスに対して機能的な遺伝子をトバモウイルスに対して非機能的なものとする。
　上記（Ａ）と（Ｂ）を実施する順序は、植物が死に至らない限り、特に限定はなく、（Ｂ）を先に実施してもよい。なお、（Ｂ）のみを特定の部位において実施する方法が、上記（１）直接ゲノム編集である。
　手順（Ａ）において、トバモウイルスに対して非機能的なＲＬＫタンパク質をコードする変異遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。変異遺伝子の作製は、当業者に公知の手法を用いて実施することができる。例えば、所望の変異を有する塩基配列を合成し、これをＰＣＲ等で増幅して得ることができる。ここで導入する変異は、トバモウイルス抵抗性のトマトに関連して上述した通りである。
　作製した変異遺伝子の植物への導入も、当業者に公知の手法を用いて実施することができる。簡便には、変異遺伝子を搭載したベクターを用いて、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等を用いて実施することができる。ここで導入する変異遺伝子は、トマト由来のＲＬＫ遺伝子（またはその相同遺伝子）を変異させたトバモウイルス抵抗性遺伝子であり、別種の植物のトバモウイルス抵抗性遺伝子であってもよい。
　上記ベクターを導入する植物の形態は、植物体を再生しうるものであれば特に限定されず、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が挙げられる。
　次に手順（Ｂ）において、植物が有する内生のＲＬＫ遺伝子（またはその相同遺伝子）の中でトバモウイルスに対して機能的なものを、トバモウイルスに対して非機能的なものに変化させる。手順（Ｂ）の実施には、植物に変異を導入する方法として公知の手法を用いることができる。例えば、イオンビーム、ＥＭＳなどの変異原処理を用いることができる。上述のＣＲＩＳＰＲやＴＡＬＥＮなどのゲノム編集技術等によっても実施することができる。内生ＲＬＫ遺伝子の中で、トバモウイルスに対して機能的なものの全てを、トバモウイルスに対して非機能的なものとすることが望ましい。
　次に、トバモウイルス抵抗性遺伝子を有する植物の部分（葉片や植物細胞等）から植物体を再生する。植物体の再生は、植物の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、トマトについては、Sun H.J. et al., "Plant Cell Physiol.," 2006, 47: 426等を参照して行うことができる。
　さらに再生した植物の中から、トバモウイルスに対して抵抗性を有するトマトを選別する。当該選別は、上述したトバモウイルス抵抗性を確認するための方法によって行うことができる。例えば、常法により植物にトバモウイルスを感染させ、植物体中のトバモウイルスの蓄積をＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ方等の公知の手法で確認することにより、トバモウイルス抵抗性を有する植物を選別することができる。また、トバモウイルスを感染させた植物のトバモウイルス感染症状（葉のモザイク、糸葉、黄化症状、茎のえそ症状、さらに果実の退色、えそおよび輪紋症状等）の有無を確認することによっても、トバモウイルスに対して抵抗性を有するトマトを選別することができる。
　尚、トバモウイルスとしてＴｏＢＲＦＶを使用する際には、非特許文献６の記載のように、ＴｏＢＲＦＶのゲノムＲＮＡに相当する合成合成感染性ＲＮＡ（例えば、配列番号４５）をウイルスの代わりに使用して、ＴｏＢＲＦＶ抵抗性を試験することもできる。
　一態様において、本実施形態は、上述した方法により作出したトマトに関する。当該トマトは、上記で説明したトバモウイルス抵抗性のトマトと同様である。
　トバモウイルス抵抗性遺伝子を有するトバモウイルス抵抗性トマトが一旦得られれば、当該植物の後代やクローンを公知の手法により得ることができる。したがって、本実施形態のトバモウイルス抵抗性トマトには、これらの後代およびクローンも含まれる。
　一態様において、本実施形態は、上述の作出方法によって得られたトバモウイルス抵抗性トマト（初代）またはその後代を、自家受粉または他家受粉させる工程を含む、トバモウイルス抵抗性トマトの育種後代の作出方法に関する。植物の自家受粉または他家受粉は、当業界で公知の方法で実施することが可能であり、自然状態で行われてもよいし、人為的に行われてもよい。このようにして得られた後代をさらに自家受粉または他家受粉させて、さらなる後代を作出することもできる。
　他家受粉において初代または後代と掛け合わせるトマトは、同じ遺伝子に同じ変異を有するトマト、同じ遺伝子に異なる変異を有するトマト、または異なる遺伝子に変異を有するトマトのいずれであってもよい。例えば、ＲＬＫ１遺伝子に変異を有する植物と、ＲＬＫ２遺伝子に変異を有する植物との間の掛け合わせも可能である。また、複数回の交配を実施することによって、３種以上の遺伝子に変異を有する植物を作出することも可能である。
　［実施例１］
　ＲＬＫ１遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＡの作製
　トマトの２番染色体に存在するとされるＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）（配列番号１）のエクソン１内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。
　設定した２０塩基長の部位（配列番号３：ＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＴ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人農業生物資源研究所、現・農研機構より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターを構築した。なお、野生型トマトの２番染色体に存在するＲＬＫ１遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１および配列番号１に示した。
　構築した組換えベクターからそれぞれガイドＲＮＡ配列領域を含むカセット部位を切り出し、バイナリベクター　ｐＺＤ＿ＯｓＵ３ｇＹＳＡ＿ＨｏｌｇｅｒＣａｓ９＿ＮＰＴII内の制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターを得た。
　これらバイナリベクターを用いて、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（タカラバイオ社）を常法により形質転換させ、組換えアグロバクテリウムＡを得た。
　［実施例２］
　ＲＬＫ２遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＢの作製
　トマトの３番染色体に存在するＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）（配列番号１６）のエクソン１内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号１８の２０番～３９番塩基：ＧＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＴＧＡＣＴＴＣＴＣ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人農業生物資源研究所、現・農研機構より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターを構築した。野生型トマトの３番染色体に存在するＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を図２および配列番号１６に示した。
　構築した組換えベクターからそれぞれガイドＲＮＡ配列領域を含むカセット部位を切り出し、バイナリベクター　ｐＺＤ＿ＯｓＵ３ｇＹＳＡ＿ＨｏｌｇｅｒＣａｓ９＿ＮＰＴII内の制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターを得た。これらバイナリベクターを用いて、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（タカラバイオ社）を常法により形質転換させ、組換えアグロバクテリウムＢを得た。
　［実施例３］
　トマトの形質転換
　形質転換するトマトとして、公知の固定品種であるマニーメーカー（以下「ＭＭ」と略す）もしくは自社固定品種Ｓを用いた。アグロバクテリウムを用いたトマトの形質転換は一般的な教科書（例えば、田部井豊編、「形質転換プロトコール＜植物編＞（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、株式会社化学同人社、２０１２）に記載の方法に準じて実施した。
　具体的には、トマトの種子を無菌培地中で発芽させて得た子葉片、または通常播種した苗の子葉片若しくは本葉片を殺菌したものを用意した。次に、実施例１で得た組換えアグロバクテリウムＡもしくは実施例２で得た組換えアグロバクテリウムＢをそれぞれ濁度が０．５～２．０になるまで培養した培養液を用意した。当該培養液にトマト葉片を１０分程度浸漬して、アグロバクテリウムＡまたはＢを感染させた。
　感染から３日後に、アグロバクテリウムを除去した。
　トマトの葉片をカルベニシリン（１００～５００ｍｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２０～１００ｍｇ／ｍｌ）を加えたムラシゲスクーグ培地（ＭＳ基本培地と略すこともある。ＭＳ基本培地に３％ショ糖、１．５ｍｇ／Ｌゼアチン、１％寒天を添加しもの）上に移し、２５℃照明下（１６時間照明／８時間暗黒）での選抜培養に付した。培養開始から１０日～２週間毎に培地を交換して移植継代することで、葉片からのカルス形成を促した。引き続き継代培養を繰り返すことで不定芽を誘導した。
　不定芽が数センチほどに大きくなったら、発根培地（ＭＳ基本培地に１．５％ショ糖１％寒天、５０～２５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリン、２０～１００ｍｇ／ｍｌカナマイシン、場合によってナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を添加したもの）に移植し、１ヶ月毎に継代しながら１～３ヶ月培養した。
　発根培地による培養までは全て無菌培養とした。
　発根した個体（幼苗のような状態）は、無菌培地から取り出し、市販の黒土や赤玉土などを混合したポット培土に移植し、生育させた。このようにして得られた再生個体をトランスジェニック当代（以下、Ｔ０と略すこともある）とした。
　［実施例４］
　遺伝子編集系統の選抜
　トランスジェニック当代の標的遺伝子内に遺伝子組み換えおよび編集部位（塩基の欠損、挿入または置換）が存在するか否かを確認するために、Ｔ０のトマトの葉をすりつぶして、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｎｔ　ＩＩキット（タカラバイオ社）等を用いてキット添付の方法に準じてゲノムＤＮＡを抽出した。
　さらに抽出したＤＮＡを１μＬ用いて、下記プライマーを用いたＰＣＲによって目的の部位を増幅した。
　すなわち、ＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）内の領域に対しては、プライマー１（５’－ＴＴＡＡＣＡＣＧＴＣＴＧＣＧＴＡＡＣＣＴＣ－３’、配列番号３７）およびプライマー２（５’－ＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＣＣ－３’、配列番号３８）、ＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）内の領域に対しては、プライマー３（５’－ＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡ－３’、配列番号３９）およびプライマー４（５’－ＴＡＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＴＡＡＧＣＴＧ－３’、配列番号４０）を用いた。
　ＰＣＲは、Ｔ１００サーマルサイクラー（ＢＩＯＲＡＤ社）を用いて、ＫＯＤ　Ｏｎｅ（東洋紡社）を使用し添付のマニュアルに従ってＤＮＡの増幅を実施した。
　増幅ＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ社）を用いてキットの説明書通りに行い、精製したのち、該当遺伝子に対してＰＣＲに用いたプライマーのうち、フォワード側にあたるプライマー（前述プライマー１もしくはプライマー３）を用いてサンガー法で増幅部位の塩基配列をシーケンシングし、編集の有無を確認した。ただし、編集された部分がアレルによって異なる場合、すなわちヘテロ接合体になっている場合も考えられ、その場合は同じ領域のＤＮＡ増幅産物をシーケンスすると、異なった塩基シグナルが重なって検出され、解読不可能になる。そのため、初めて該当配列をシーケンスする際は、当該領域をＰＣＲした増幅断片をＴＡｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ－Ｐｌｕｓ（東洋紡社）キットを用いてＴＡベクターにクローニングしたのち、サンガー法でシーケンシングを行った（クローニングすると増幅ＤＮＡが１分子ごとにクローニングされるため、クローンごとにシーケンスが確認でき、それらクローンを複数個シーケンスすることで、すべて同じ編集パターン配列であればアレルはホモ接合体、２パターンに分かれればアレルがヘテロ接合体であると推測することができる）。
　その結果、いくつかの再生個体において、ＲＬＫ１遺伝子またはＲＬＫ２遺伝子の塩基配列が編集されていることが確認され、編集系統が選抜された。ＲＬＫ１遺伝子およびＲＬＫ２遺伝子の編集系統を「Ｃ」および「Ｐ」の頭文字番号で示すこともある。
　［実施例５］
　トランスジェニック後代の作製
　さらにそれらの編集系統を自家受粉させ、後代（Ｔ０世代の次の世代をＴ１、さらにその後代をＴ２とする）の種子を採り、播種した苗から［実施例４］の方法でゲノムＤＮＡの抽出、編集部位付近の塩基配列ＰＣＲ増幅、並びにシーケンシングによる編集パターンの確認を実施した。
　［実施例６］
　ＴｏＢＲＦＶの接種源（感染性ＲＮＡ）の作製
　トバモウイルス属ウイルスとして、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｂｒｏｗｎ　ｒｕｇｏｓｅ　ｆｒｕｉｔ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＢＲＦＶ）を使用した。
　ＴｏＢＲＦＶは、検疫上の問題から、ウイルスやウイルス感染葉を国内に持ち込むことが非常に困難である。そこで、非特許文献６の報告に従って、Ｔ７プロモーター（１７塩基長）下にＴｏＢＲＦＶのヨルダン株（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＫＴ３８３４７４）のゲノム配列（但し、６番塩基～９番塩基を削ったもの、６３８８塩基長）をつなげた感染性ＲＮＡ（配列番号４５）を試験管内合成した。尚、ＴｏＢＲＦＶはＲＮＡウイルスであり、そのゲノム配列はＲＮＡ配列である。配列番号４５にはＲＮＡのＵ（ウラシル）をＤＮＡのＴ（チミン）に変換したＤＮＡ配列を示した。
　合成した配列を鋳型とし、プライマー５（５’－ＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴ－３’、配列番号４１）、プライマー６（５’－ＴＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＴＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＣ－３’、配列番号４２）、及びＫＯＤ　Ｏｎｅ（東洋紡社）を用いて、ＫＯＤ　Ｏｎｅ添付の条件でＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター配列を先頭にしたウイルス全長断片を増幅した。
　ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ社）を用いてキットの説明書通りに行い、ＰＣＲ増幅断片からプライマーを除去した。さらにこの精製増幅断片を鋳型とし、Ｔ７ポリメラーゼ（ＨｉＳｃｒｉｂｅ　Ｔ７　Ｑｕｉｃｋ　Ｈｉｇｈ　Ｙｉｅｌｄ　ＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて試薬添付の方法に従い、３７℃、４時間の反応でＲＮＡを転写合成した。
　［実施例６］
　ＴｏＢＲＦＶの接種
　実施例６で合成した２０μＬのＲＮＡのうち、１／１０～１／２量を検定用トマト苗（３～５葉期）の中間位置程度の本葉（複葉）にカーボランダム法で機械的接種（こすりつけ接種）により接種した。
　［実施例７］
　総ＲＮＡの抽出
　接種後１８日目に、ＲＮＡ（ウイルスの代わりとなる感染性ＲＮＡ）を接種した葉（接種葉）、接種していない上位部の葉（上位葉）をそれぞれ選択し、約１００ｍｇを液体窒素で凍結し、磨砕した後、５０℃に温めたＴＲＩｓｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）１ｍＬに溶解した。マイクロチューブに移し、５０℃の恒温槽で１０分加温して、ＲＮＡを抽出した。その後、１／５量のクロロホルムを加えて撹拌し、１５，０００ｒｐｍで１５分遠心した。遠心後の上清に等量のイソプロパノールを加えて、撹拌し、１５，０００ｒｐｍで１５分遠心し、７０％エタノールでリンスした後、抽出ＲＮＡ沈殿をＤＮａｓｅ・ＲＮａｓｅフリー水５０μＬに溶解した。
　［実施例８］
　ＴｏＢＲＦＶのＲＮＡ分析
　実施例７で得られたＲＮＡ試料を５～１０μＬ使って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でキットの説明書の条件通りにファーストストランドｃＤＮＡを合成した。さらにこのｃＤＮＡ試料２μＬとプライマー７（５’－ＧＡＧＡＣＴＴＡＣＧＴＣＧＣＣＧＡＴＴＣ－３’、配列番号４３）及びプライマー８（５’－ＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡＣ－３’、配列番号４４）を用いて、ＧｏＴａｑ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）でＰＣＲを行った。
　ＰＣＲは、９５℃　２分、「９５℃　３０秒、５３℃　３０秒、７２℃　３０秒」を３０サイクル、７２℃　５分の条件で実施した。ＰＣＲ後、１．５％アガロースゲル電気泳動にＰＣＲ産物の１／１０量を供試して、ＴｏＢＲＦＶの有無を確認した。
　ＴｏＢＲＦＶ接種試験のＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す電気泳動写真を図３に示す。図３においては、Ｍはラダーマーカー、ＷＴは野生型品種（マニーメーカー）、Ｒ１はＲＬＫ１遺伝子をフレームシフト変異させた変異体、Ｒ２はＲＬＫ２遺伝子をフレームシフト変異させた変異体、ＰＣは陽性対照を表す。上記分析の結果、対照の品種マニーメーカーでは接種葉、上位葉ともにＴｏＢＲＦＶが検出されたが、ＲＬＫ１変異体及びＲＬＫ２変異体では、接種葉ではＴｏＢＲＦＶが検出されるものの、上位葉では検出されなかった。この結果は、ＲＬＫ１変異体及びＲＬＫ２変異体ではウイルスの植物体内での移行が制限または抑制され、変異体は抵抗性を有していることを示していた。
　実施例４において選抜した編集系統の中から、上記試験でＴｏＢＲＦＶ抵抗性が確認された編集系統の有する遺伝子変異を図４および図５にまとめた。図４にはＲＬＫ１遺伝子に見られた変異Ｃ１～Ｃ４を野性型の配列と共に示し、図５にはＲＬＫ２遺伝子に見られた変異Ｐ１～Ｐ６を野性型の配列と共に示した。
　本出願は、２０２３年６月２９日出願の特願２０２３－１０６９３６に基づく優先権を主張する。当該出願明細書に記載された内容は、全て本願明細書に援用される。
　本発明は、トバモウイルス属ウイルスの感染を阻害する性質、感染後のトバモウイルス属ウイルスの増殖、移行を抑制する性質及び／又はトバモウイルス属ウイルスの感染症状の発現を抑制する性質を有する、トバモウイルス属ウイルス抵抗性のトマト、トマト細胞、及びトマトの作出方法を提供する。本発明によって、トバモウイルス属ウイルス感染によるトマトの収穫量の低減といった、主に農業分野における問題を解消することができる。
　配列番号１：　ＲＬＫ１遺伝子のｃＤＮＡ配列、１番～２８１８番塩基がエクソン１、７９０番～８０９番塩基が標的配列
　配列番号２：　ＲＬＫ１遺伝子のエクソン１、７９０番～８０９番塩基が標的配列
　配列番号３：　ＲＬＫ１遺伝子のエクソン１内の野性型標的配列
　配列番号４：　ＲＬＫ１遺伝子の変異領域Ｃ１
　配列番号５：　ＲＬＫ１遺伝子の変異領域Ｃ２
　配列番号６：　ＲＬＫ１遺伝子の変異領域Ｃ３
　配列番号７：　ＲＬＫ１遺伝子の変異領域Ｃ４
　配列番号８：　変異領域Ｃ１を含むＲＬＫ１遺伝子のエクソン１
　配列番号９：　変異領域Ｃ２を含むＲＬＫ１遺伝子のエクソン１
　配列番号１０：　変異領域Ｃ３を含むＲＬＫ１遺伝子のエクソン１
　配列番号１１：　変異領域Ｃ４を含むＲＬＫ１遺伝子のエクソン１
　配列番号１２：　変異領域Ｃ１を有する、変異ＲＬＫ１遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号１３：　変異領域Ｃ２を有する、変異ＲＬＫ１遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号１４：　変異領域Ｃ３を有する、変異ＲＬＫ１遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号１５：　変異領域Ｃ４を有する、変異ＲＬＫ１遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号１６：：　ＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列、１番塩基～８３０番塩基がエクソン１、２７７番～２９６番塩基が標的配列
　配列番号１７：　ＲＬＫ２遺伝子のエクソン１、２７７番～２９６番塩基が標的配列
　配列番号１８：　標的配列を含む、ＲＬＫ２遺伝子のエクソン１内の野性型領域
　配列番号１９：　ＲＬＫ２遺伝子の変異領域Ｐ１
　配列番号２０：　ＲＬＫ２遺伝子の変異領域Ｐ２
　配列番号２１：　ＲＬＫ２遺伝子の変異領域Ｐ３
　配列番号２２：　ＲＬＫ２遺伝子の変異領域Ｐ４
　配列番号２３：　ＲＬＫ２遺伝子の変異領域Ｐ５
　配列番号２４：　ＲＬＫ２遺伝子の変異領域Ｐ６
　配列番号２５：　変異領域Ｐ１を含むＲＬＫ２遺伝子のエクソン１
　配列番号２６：　変異領域Ｐ２を含むＲＬＫ２遺伝子のエクソン１
　配列番号２７：　変異領域Ｐ３を含むＲＬＫ２遺伝子のエクソン１
　配列番号２８：　変異領域Ｐ４を含むＲＬＫ２遺伝子のエクソン１
　配列番号２９：　変異領域Ｐ５を含むＲＬＫ２遺伝子のエクソン１
　配列番号３０：　変異領域Ｐ６を含むＲＬＫ２遺伝子のエクソン１
　配列番号３１：　変異領域Ｐ１を有する、変異ＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号３２：　変異領域Ｐ２を有する、変異ＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号３３：　変異領域Ｐ３を有する、変異ＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号３４：　変異領域Ｐ４を有する、変異ＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号３５：　変異領域Ｐ５を有する、変異ＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号３６：　変異領域Ｐ６を有する、変異ＲＬＫ２遺伝子のｃＤＮＡ配列
　配列番号３７：　プライマー１
　配列番号３８：　プライマー２
　配列番号３９：　プライマー３
　配列番号４０：　プライマー４
　配列番号４１：　プライマー５
　配列番号４２：　プライマー６
　配列番号４３：　プライマー７
　配列番号４４：　プライマー８
　配列番号４５：　ＴｏＢＲＦＶの感染性ＲＮＡをＤＮＡとして記載した塩基配列、１番塩基～１７番塩基がＴ７プロモーター、１８番塩基～６４０５番塩基がＴｏＢＲＦＶ感染用ＲＮＡ

Claims (30)

  1. 　受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、
    　前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、又は前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、
    　トバモウイルス属ウイルスに対する抵抗性を有する、トマト。
  2. 　前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、請求項１に記載のトマト。
  3. 　前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、請求項２に記載のトマト。
    　（ａ）フレームシフト変異、
    　（ｂ）ナンセンス変異、
    　（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～５）の欠損、及び
    　（ｄ）１～１０塩基の挿入又は置換。
  4. 　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、
    　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ１遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項１又は２に記載のトマト。
  5. 　前記ＲＬＫ１遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、請求項４に記載のトマト。
  6. 　前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４～７から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、請求項５に記載のトマト。
  7. 　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列を含むものであり、
    　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ２遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項１又は２に記載のトマト。
  8. 　前記ＲＬＫ２遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、請求項７に記載のトマト。
  9. 　前記配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２４から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、請求項８に記載のトマト。
  10. 　前記トバモウイルス属ウイルスが、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｂｒｏｗｎ　ｒｕｇｏｓｅ　ｆｒｕｉｔ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＢＲＦＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、及びトマトモットルモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｍｏｔｔｌｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＭＭＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載のトマト。
  11. 　請求項１または２のいずれか一項に記載のトマトの部分。
  12. 　果実である、請求項１１に記載のトマトの部分。
  13. 　種子である、請求項１１に記載のトマトの部分。
  14. 　請求項１１記載のトマトの部分の加工品。
  15. 　食用である、請求項１４に記載の加工品。
  16. 　受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、
    　前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、又は前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、
    　トバモウイルス属ウイルスに対する抵抗性を有する、トマト細胞。
  17. 　請求項１６に記載のトマト細胞を有し、トバモウイルス属ウイルスに対する抵抗性を有する、トマト及びその部分。
  18. 　受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子及びその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子を選択する工程と、
    　トマトのゲノム内の選択した遺伝子に対して、前記選択した遺伝子の発現が抑制される変異、又は前記選択した遺伝子のコードするタンパク質がトバモウイルス属ウイルスに対して非機能的になる変異を導入する工程と、
    　トバモウイルス属ウイルスに対して抵抗性を有するトマトを選別する工程とを含む、トバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  19. 　前記変異を、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入する、請求項１８に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  20. 　前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、請求項１８又は１９に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
    　（ａ）フレームシフト変異、
    　（ｂ）ナンセンス変異、
    　（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～５）の欠損、及び
    　（ｄ）１～１０塩基の挿入又は置換。
  21. 　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、
    　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ１遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項１８又は１９に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  22. 　前記ＲＬＫ１遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、請求項２１に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  23. 　前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４～７から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項２２に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  24. 　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子が、ＲＬＫ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４３７７０）であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列を含むものであり、
    　前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子が、前記ＲＬＫ２遺伝子の相同遺伝子であり、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項１８又は１９に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  25. 　前記ＲＬＫ２遺伝子又はその相同遺伝子内の、配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、請求項２４に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  26. 　前記配列番号１８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２４から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項２５に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  27. 　前記トバモウイルス属ウイルスが、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｂｒｏｗｎ　ｒｕｇｏｓｅ　ｆｒｕｉｔ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＢＲＦＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、及びトマトモットルモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ　ｍｏｔｔｌｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ；ＴｏＭＭＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１８又は１９に記載のトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの作出方法。
  28. 　請求項１８又は１９に記載の作出方法によって得られた、トバモウイルス属ウイルス抵抗性トマト。
  29. 　請求項１８又は１９のいずれか一項に記載の作出方法によって得られたトバモウイルス属ウイルス抵抗性トマト又はその後代を、自家受粉又は他家受粉させる工程を含む、トバモウイルス属ウイルス抵抗性トマトの育種後代の作出方法。
  30. 　請求項２９に記載の作出方法によって得られた、トバモウイルス属ウイルス抵抗性トマト。
     
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121385043A (zh) * 2025-12-25 2026-01-23 酒泉市农业技术推广服务中心 一种结合传感网节点的番茄褐色皱果病毒监测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020111149A1 (ja) * 2018-11-28 2020-06-04 キッコーマン株式会社 トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法
WO2021131628A1 (ja) * 2019-12-24 2021-07-01 キッコーマン株式会社 トマト黄化えそウイルス抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、及びナス科植物の作出方法
WO2022186197A1 (ja) * 2021-03-04 2022-09-09 キッコーマン株式会社 トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020111149A1 (ja) * 2018-11-28 2020-06-04 キッコーマン株式会社 トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法
WO2021131628A1 (ja) * 2019-12-24 2021-07-01 キッコーマン株式会社 トマト黄化えそウイルス抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、及びナス科植物の作出方法
WO2022186197A1 (ja) * 2021-03-04 2022-09-09 キッコーマン株式会社 トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121385043A (zh) * 2025-12-25 2026-01-23 酒泉市农业技术推广服务中心 一种结合传感网节点的番茄褐色皱果病毒监测方法

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