WO2025005632A1 - 이온화 가능한 펩타이드를 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

이온화 가능한 펩타이드를 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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peptide
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주국연
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    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to a lipid nanoparticle-based drug delivery system using an ionizable peptide and a method for producing the same.
  • the Drug Delivery System is designed to efficiently deliver the required amount of drugs while reducing side effects and maximizing efficacy and effectiveness. It is a high value-added core technology with a high probability of success that can create economic benefits comparable to new drug development, and its purpose is to improve the quality of patient treatment by making drug administration more efficient.
  • the solubilization technology of poorly soluble drugs which is one of the core technologies of drug delivery systems and belongs to the technology for promoting drug absorption, is considered the most reasonable way to reduce the development cost of new drug substances and increase the added value of currently released drugs.
  • the development of improved new drugs through the development of drug solubilization technology is a field that can create enormous added value at low cost.
  • Gene therapy using gene drug delivery systems holds great promise for correcting genetic mutations and treating numerous diseases. Effective gene delivery is one of the major challenges in successfully and safely performing such gene therapy, and viral vectors have been proven to be effective for gene delivery.
  • viruses as gene delivery systems is limited due to several problems such as immunogenicity, tumorigenic potential, cytotoxicity, limited DNA size and complex production process in viral vectors, and restrictions on repeated administration due to immune responses. Therefore, non-viral gene carriers such as cationic liposomes and polymers that can overcome the above problems have begun to receive attention as alternatives to viral systems.
  • An ideal nonviral gene carrier should condense genetic material to form a nano-sized complex that can be absorbed by cells, maintain a stable structure for easy delivery to cells, and be stably maintained from degradation by enzymatic reactions in the body until the external genetic material is delivered to the cell nucleus.
  • most genes are anionic, and cationic materials should be used to effectively load them into nonviral carriers.
  • attempts have been made to form gene complexes using only cationic polymers, proteins, or peptides, or to use cationic lipid nanoparticles.
  • nucleic acid-lipid particles containing nucleic acids, cationic lipids, non-cationic lipids, and conjugated lipids that suppress particle aggregation can be adopted as a means to facilitate nucleic acid delivery into cells or the body, and lipid nanoparticles containing pH-sensitive cationic lipids as constituent lipids as carriers for efficiently delivering nucleic acids such as siRNA into target cells have been reported.
  • the inventors of the present invention have made efforts to develop a drug delivery vehicle capable of efficiently delivering anionic drugs, nucleic acids, etc. to a target organ or cell, and as a result, have prepared a pH-sensitive ionizable peptide having improved stability when forming a complex with nucleic acids, and have confirmed that lipid nanoparticles encapsulating the complex of the peptide and nucleic acid have excellent stability and remarkable drug delivery ability to the target, thereby completing the present invention.
  • Patent Document 1 U.S. Registered Patent No. 9404127 (Title of the invention: Non-liposomal systems for nucleic acid delivery, Applicant: PROTIVA BIOTHERAPEUTICS, INC., Registration date: August 2, 2016)
  • Patent Document 2 Republic of Korea Publication No. 10-2020-0018782 (Title of the invention: Lipid membrane structure for intracellular delivery of siRNA, Applicant: Hokkaido Daigaku, Publication date: February 20, 2020)
  • Patent Document 3 Republic of Korea Publication Patent No. 10-2019-0093816 (Title of the invention: Lipid nanoparticle mRNA vaccine, Applicant: Curevac Age et al., Publication date: August 26, 2019)
  • Patent Document 4 Republic of Korea Registered Patent No. 10-1308591 (Title of the invention: Anionic drug delivery system containing cationic lipid and its manufacturing method, Applicant: Samyang Biopharm Co., Ltd., Registration date: September 9, 2013)
  • the purpose of the present invention is to provide a lipid nanoparticle-based drug delivery system using an ionizable peptide and a method for producing the same.
  • the present invention comprises: (a) a complex comprising a nucleic acid, and an ionizable peptide comprising a water-soluble enhancing tag and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • anionic lipid (b) anionic lipid; (c) neutral lipid; (d) cholesterol; and, (e) PEG-modified lipid; and is characterized by a mixing ratio thereof.
  • the above nucleic acid is characterized in that it comprises at least one selected from the group consisting of plasmid DNA, single-stranded DNA, double-stranded DNA, miRNA, siRNA, ssRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, antisense RNA, and LNA.
  • the above nucleic acid can be encapsulated in the lipid nanoparticles at an encapsulation rate of 70% or higher, preferably, 70 to 94%, more preferably, 80 to 94%.
  • the above water-soluble enhancing tag may be selected from the group consisting of S-tag, b'a' domain of protein disulfide isomerase (PDIb'a'), maltose binding protein (MBP), hexahistidine (His6), thioredoxin (Trx), glutathione S-transferase (GST), N-utilization substance Protein A (NusA), small ubiquitin related modifier (SUMO), and protein disulfide isomerase (PDI).
  • PKIb'a' protein disulfide isomerase
  • MBP maltose binding protein
  • His6 hexahistidine
  • Trx thioredoxin
  • GST glutathione S-transferase
  • NusA N-utilization substance Protein A
  • SUMO small ubiquitin related modifier
  • PDI protein disulfide isomerase
  • the above complex may contain nucleic acid:peptide in a weight ratio of 1:5 to 1:15. Preferably, it is contained in a weight ratio of 1:5 to 1:10.
  • the lipids of the above (b) to (e) may include 30 to 50 mol % of anionic lipid, 30 to 50 mol % of neutral lipid, 10 to 30 mol % of cholesterol, and 0.5 to 5 mol % of PEG-modified lipid.
  • DPPG dipalmitoylphosphatidylglycerol
  • DOPG dioleoylphosphatidylglycerol
  • Soy PG L- ⁇ -phosphatidylglycerol (Soy)
  • Cardiolipin (1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol),
  • DMPG dimyristoylphosphatidylglycerol
  • POPG palmitoyloleoylphosphatidylglycerol
  • DOPS dioleoylphosphatidylserine
  • DTPA diethylenetriamine pentaacetic acid
  • DMPS diristoylphosphatidylserine
  • DMPA diristoylphosphatidic acid
  • DOPA dioleoylphosphatidic acid
  • lipid comprising at least one selected from the group consisting of CHEMS (cholesterol hemisuccinate) or a salt thereof.
  • the above neutral lipid is HSPC (hydrogenated soy phosphatidylcholine),
  • DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • succinoyl-diacylglycerol succinoyl-diacylglycerol
  • It may include at least one selected from the group consisting of glycerides or a salt thereof.
  • the above PEG-modified lipid is characterized by polyethylene glycol (PEG) being bound to anionic lipid or neutral lipid.
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention provides a method for producing a nucleic acid-peptide complex, comprising the steps of: (a) mixing a nucleic acid solution and a water-soluble enhancing tag and an ionizable peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • step (c) a step of adding and dispersing the complex prepared in step (a) into the lipid film formed in step (b) to form a lipid nanoparticle dispersion; a method for preparing a lipid nanoparticle-based drug delivery vehicle is provided.
  • the pH can be adjusted to pH 7.0 to pH 7.4 for drug delivery when completing the lipid nanoparticle manufacturing.
  • a method of preparing a dispersion using a droplet-based microfluidic system in the above-mentioned (c) can be applied to prepare a lipid nanoparticle-based drug delivery vehicle.
  • the 'ionizable peptide' of the present invention is a 'peptide whose cohesion between nucleic acid and peptide changes depending on acidity', and is characterized by having strong cohesion with nucleic acid in an acidic state and weak cohesion with nucleic acid in a neutral state.
  • LNPs encapsulating mRNA deliver mRNA into the cytoplasm through intracellular entry.
  • LNPs Upon intracellular entry, LNPs are trapped in endosomes, and how much mRNA escapes from the endosome before fusion with lysosomes is an important factor in transfection efficiency.
  • Ionizable peptides have the property of absorbing protons in the weakly acidic environment of the endosomes and becoming cationized, thereby contributing to the escape of mRNA from the endosomes by increasing the osmotic pressure and structural instability of the endosome.
  • the nucleic acid is a therapeutic agent for intracellular or in vivo delivery, and can form a complex through electrostatic interaction with a cationic ionizable peptide, and may be, for example, at least one selected from the group consisting of plasmid DNA, single-stranded DNA, double-stranded DNA, miRNA, siRNA, ssRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, antisense RNA, and LNA, but is not limited thereto.
  • miRNA refers to a single-stranded RNA molecule consisting of 21 to 23 nucleotides in length, which regulates gene expression. miRNA is an oligonucleotide that is not expressed in cells and has a short stem-loop structure. miRNA has complete or partial homology with 1 or more mRNA (messenger RNA) and suppresses target gene expression through complementary binding with the mRNA.
  • miRNA messenger RNA
  • siRNA refers to a double-stranded RNA capable of inducing RNAi (RNA interference) phenomenon through cleavage of a specific mRNA, or a single-stranded RNA having a double-stranded form within the single-stranded RNA. It is composed of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of a target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. Since siRNA can suppress the expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knock-down method or a method of gene therapy. The bond between the double strands is formed through hydrogen bonds between nucleotides, and not all nucleotides within the double strand need to be completely complementary.
  • RNAi RNA interference
  • the length of the siRNA may be about 15 to 60 nucleotides, specifically about 15 to 50, about 15 to 40, about 15 to 30, about 15 to 25, about 16 to 25, about 19 to 25, about 20 to 25, or about 20 to 23 nucleotides.
  • the siRNA length refers to the number of nucleotides on one side of the double-stranded RNA, that is, the number of base pairs, and in the case of single-stranded RNA, refers to the length of the double strand within the single-stranded RNA.
  • the siRNA may be composed of nucleotides having various functional groups introduced therein for purposes such as increasing blood stability or weakening an immune response.
  • ssDNA means a single-stranded oligonucleotide that selectively binds to a specific target DNA and induces an antigen effect.
  • RNA means a single-stranded RNA consisting of 50 to 70 nucleotides, which forms a stem-loop structure in vivo.
  • a long RNA of 19 to 29 nucleotides complementarily forms base pairs on both sides of a loop region of 5 to 10 nucleotides to form a double-stranded stem.
  • mRNA means synthetic mRNA (in vitro transcribed mRNA) capable of expressing a gene.
  • ncRNA refers to RNA that is not translated into a protein and functions as RNA itself.
  • ncRNA includes tRNA, rRNA, snoRNA, miRNA, and lncRNA that we commonly know, and is involved in transcription, splicing, translation, etc. in various places in the cell.
  • the term "antisense RNA” refers to RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, which binds to the complementary sequence in the mRNA and inhibits translation of the mRNA into a protein.
  • the antisense RNA sequence refers to an RNA sequence that is complementary to the mRNA of the genes and can bind to the mRNA. It can inhibit the essential activity for translation, translocation into the cytoplasm, maturation, or any other overall biological function of the gene mRNA.
  • the length of the antisense RNA can be 6 to 100 bases, specifically 8 to 60 bases, more specifically 10 to 40 bases.
  • the antisense RNA can be synthesized in vitro by a conventional method and administered in vivo, or the antisense RNA can be synthesized in vivo.
  • One example of synthesizing an antisense oligonucleotide in vitro is using RNA polymerase.
  • One example of how to synthesize antisense RNA in vivo is to use a vector with the origin of the multiple cloning site (MCS) in the opposite direction to allow the antisense RNA to be transcribed.
  • MCS multiple cloning site
  • the antisense RNA has a translation stop codon within its sequence to prevent it from being translated into a peptide sequence.
  • LNA Locked nucleic acids
  • LNA nucleosides contain general nucleic acid bases of DNA and RNA, and can form base pairs according to the Watson-Crick base pairing rule.
  • LNA cannot form an ideal shape in Watson-Crick bonding.
  • LNA can pair with a complementary nucleotide chain more quickly, thereby increasing the stability of the double helix.
  • the ionizable peptide may be composed of a water-solubility enhancing tag and an amino acid sequence of a human PA R cluster (human PA R cluster; -SRRRRRRS-) of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may be composed of a repeating bond structure after the water-solubility enhancing tag, but is preferably composed of one water-solubility enhancing tag and one amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence of sequence number 2 can be mentioned.
  • the above solubility enhancing tag refers to a labeling substance (tag) that can improve the aqueous stability of the complex when the ionizable peptide of the present invention is combined with an anionic nucleic acid to form a complex.
  • Any tag that can express the ionizable peptide in a water-soluble form can be used without limitation.
  • the water-soluble enhancing tag may be selected from the group consisting of an S-tag, the b'a' domain of protein disulfide isomerase (PDIb'a'), maltose binding protein (MBP), hexahistidine (His6), thioredoxin (Trx), glutathione S-transferase (GST), N-utilization substance Protein A (NusA), small ubiquitin related modifier (SUMO), and protein disulfide isomerase (PDI).
  • the above water-soluble enhancement tag may be each bound to the N-terminus, the C-terminus, or both the N-terminus and the C-terminus of the human PA R cluster of the present invention, and may be bound one or more times in sequence.
  • the water-solubility enhancing tag coupled to sequence number 4 may be an S-tag (KETAAAKFERQHMDS), which may be coupled to the N-terminus of the human-derived arginine cluster (human PA R cluster; -SRRRRRRS-) to form the ionizable peptide of the present invention.
  • S-tag KETAAAKFERQHMDS
  • human PA R cluster human PA R cluster; -SRRRRRRS-
  • the aqueous stability of the complex when forming a complex by binding to a nucleic acid, the aqueous stability of the complex can be improved, and even when encapsulated in a lipid nanoparticle, the stability of the lipid nanoparticle can be increased.
  • the nucleic acid can be stably delivered into the target cell, and a high gene expression level can be contributed.
  • the lipid in the PEG-modified lipid can be used without limitation as long as it is a lipid that can bind to PEG (polyethylene glycol), and for example, any neutral lipid or anionic lipid can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the above PEG-modified lipid refers to a form in which lipid and PEG are conjugated, and means a lipid having a polyethylene glycol (PEG) polymer, which is a hydrophilic polymer, bound to one end.
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG-modified lipid contributes to the stability of the nanoparticles in serum within the lipid nanoparticles, and acts as a stabilizer lipid that prevents aggregation between lipid nanoparticles.
  • the PEG-modified lipid protects the nucleic acid from a decomposing enzyme when delivering the nucleic acid in the body, thereby enhancing the stability of the nucleic acid in the body, and can increase the half-life of a drug encapsulated in the lipid nanoparticles.
  • PEG may be directly conjugated to the lipid or may be linked to the lipid via a linker moiety.
  • Any linker moiety suitable for conjugating PEG to the lipid may be used, including, for example, non-ester-containing linker moieties and ester-containing linker moieties.
  • the non-ester containing linker moieties include, but are not limited to, amido (-C(O)NH-), amino (-NR-), carbonyl (-C(O)-), carbamate (-NHC(O)O-), urea (-NHC(O)NH-), disulfide (-S-S-), ether (-O-), succinyl (-(O)CCH2CH2C(O)-), succinamidyl (-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), ether, disulfide, as well as combinations thereof (e.g., linkers containing both a carbamate linker moiety and an amido linker moiety).
  • ester containing linker moieties include, but are not limited to, carbonate (-OC(O)O-), succinoyl, phosphate ester (-O-(O)POH-O-), sulfonate ester, and combinations thereof.
  • PEG in the above PEG-modified lipid is a hydrophilic polymer that has the ability to inhibit the adsorption of plasma proteins, thereby increasing the circulation time of lipid nanoparticles in the body and preventing aggregation between nanoparticles.
  • PEG-modified lipid exhibits a stealth function in the body, thereby preventing the decomposition of nanoparticles by immune cells.
  • the above PEG may be a functionalized PEG in which a functional group is bonded to a side that is not bonded to lipid.
  • the usable functional group may be at least one selected from the group consisting of a succinyl group, a carboxylic acid, a maleimide, an amine group, biotin, a cyanuric group, and a folate.
  • cholesterol provides morphological stability to the lipid filling within the lipid nanoparticles, and is dispersed in the core and surface of the nanoparticles to enhance the stability of the nanoparticles.
  • the average particle size of the lipid nanoparticles may be 10 to 2,000 nm. If the size of the lipid nanoparticles is less than 10 nm, the complex may be difficult to encapsulate in the lipid nanoparticles, and the stability may be reduced when injected into the body, which is not preferable. In addition, if the size exceeds 2,000 nm, the stability of the composition containing the lipid nanoparticles may be reduced when injected into the body, which is not preferable.
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing a peptide-nucleic acid complex by mixing a nucleic acid solution and an ionizable peptide comprising a water-soluble enhancing tag and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • step (c) a step of adding and dispersing the complex prepared in step (a) into the lipid film formed in step (b) to form a lipid nanoparticle dispersion; a method for preparing a lipid nanoparticle-based drug delivery vehicle is provided.
  • step (b) is a step of introducing a lipid solution containing an organic solvent, anionic lipid, neutral lipid, cholesterol, and PEG-modified lipid into a reactor, and removing the organic solvent to form a lipid film.
  • anionic lipids neutral lipids, cholesterol and PEG-modified lipids are as described above, their description is omitted here.
  • the step of removing the organic solvent may include a step of maintaining the inside of the reactor in a vacuum state and evaporating the organic solvent in the lipid solution introduced into the reactor. At this time, the temperature inside the reactor may be set to a high temperature to evaporate only the organic solvent. In this way, by evaporating and removing the organic solvent, the remaining lipid components in the lipid solution, excluding the organic solvent, form a lipid film on the inner wall and bottom of the reactor.
  • the type of the organic solvent is not particularly limited, and any organic solvent that can dissolve the lipid used in the manufacture of the lipid nanoparticle-based drug delivery system of the present invention can be used.
  • the organic solvent may preferably be a nonpolar or low-polar organic solvent, and may be selected from the group consisting of benzene, butanol, butyl acetate, carbon tetrachloride, chloroform, cyclohexane, dichloroethane, dichloromethane, diethyl ether, diisopropyl ether, ethyl acetate, heptane, hexane, isooctane, methyl ethyl ketone (MEK), methyl t-butyl ether (MTBE), pentane, toluene, trichloroethylene, xylene, and mixed solvents thereof.
  • MEK methyl ethyl ketone
  • MTBE methyl t-buty
  • step (c) is a step of adding and dispersing the complex manufactured in step (a) into the lipid film formed in step (b) to form a lipid nanoparticle dispersion.
  • a freezing/thawing process of freezing the dispersion and thawing the frozen dispersion may be further included. Specifically, the process of exposing the dispersion to liquid nitrogen for 5 minutes to freeze it and exposing it to warm water again to thaw it may be repeated. At this time, the freezing/thawing process may be repeated 1 to 12 times, and by repeating the steps of freezing and thawing the lipid film composition in this way, a lipid nanoparticle dispersion having a more uniform size can be formed, and the drug encapsulation efficiency of the lipid nanoparticles can be increased. However, if the number of times exceeds 12, the encapsulation efficiency of the lipid nanoparticles may actually decrease, so that the number of times is preferably 12 or less.
  • the term "encapsulation” means encapsulating a delivery substance to surround it and efficiently introduce it into a living body.
  • nucleic acids encapsulated in lipid nanoparticles can be confirmed according to the following formula.
  • Encapsulation rate (%) (Weight of nucleic acid loaded on lipid nanoparticle / Weight of nucleic acid introduced into lipid nanoparticle) x 100
  • the present invention relates to a lipid nanoparticle-based drug delivery system using an ionizable peptide and a method for producing the same.
  • the lipid nanoparticle-based drug delivery system of the present invention can deliver genes to target cells with high efficiency in the body and also improve gene expression levels in target cells by using a pH-sensitive ionizable peptide having an excellent encapsulation rate when forming a complex with a gene having an anionic property, and therefore can be usefully used in related technical fields such as lipid nanoparticle-mediated gene therapy.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the process of preparing a nucleic acid complex using an ionizable peptide at pH 4.0 and then finally storing the lipid nanoparticle under pH 7.2 conditions.
  • Figure 2 is a photograph showing the results of electrophoresis of a composition in which Fluc mRNA (Fly luciferase) and No. 2 peptide are mixed at different pHs and weight ratios to explore the mixing ratio conditions of nucleic acid and ionizable peptide complexes.
  • Fluc mRNA Fluc luciferase
  • No. 2 peptide are mixed at different pHs and weight ratios to explore the mixing ratio conditions of nucleic acid and ionizable peptide complexes.
  • Figure 3 shows the mRNA delivery efficiency after subcutaneously injecting the lipid nanoparticles and Fluc mRNA of Manufacturing Example 1 into experimental animals.
  • the upper photo shows the protein expression of the gene due to mRNA delivery at 24 and 48 hours, and the lower graph shows the results in numerical form.
  • Figure 4 is a photograph showing the results of electrophoresis of a composition in which No. 3 peptide or No. 2 peptide was mixed with Fluc mRNA to confirm the conditions for preparing a complex according to the human PA R cluster structure of an ionizable peptide.
  • Figure 5 is a photograph showing the results of electrophoresis of a composition in which each of No. 3 peptide and No. 1 peptide was mixed with Fluc mRNA to confirm the conditions for preparing a complex depending on the presence or absence of an S-tag of an ionizable peptide.
  • sequences 1 to 3 below were manufactured by requesting GenScript, a peptide biosynthesis organization. They were synthesized by the method of Patent Registration No. 10-2549868. These sequences were synthesized based on the human PA R cluster peptide sequence of sequence number 4 (NCBI, #NP_002752.1) and the S-Tag peptide sequence of sequence number 5.
  • an ionizable peptide and mRNA are mixed under acidic conditions (e.g., pH 4.0) to obtain a complex, and the complex and each lipid are mixed under neutral conditions (e.g., pH 7.2) to manufacture a complete lipid nanoparticle.
  • Fluc mRNA (MG IVT Fluc mRNA) was produced in-house and was synthesized manually through in vitro transcription (IVT) using Fluc plasmid DNA as a template and T7 polymerase (Cat #: 2540A, TaKaRa), and then purified using phenol: chloroform: Isoamyl alcohol. Then, the purity and concentration were confirmed using Nanodrop (BIOTEK Synergy H1) and agarose gel, and small amounts were dispensed and stored in a deep freezer for use.
  • lipid nanoparticles were prepared under the conditions shown in Table 2 below.
  • the lipid nanoparticles were prepared using a thin film hydration method.
  • DOPE neutral lipid
  • Cholesterol DPPG (anionic lipid): DSPE-PEG
  • a complex Acetate buffer, pH 4
  • lipid nanoparticles were prepared by going through a freeze-thaw procedure, replacing the LNP solution (dialysis, PBS, pH 7.2), and then filtering through a 0.2 ⁇ m syringe filter.
  • the stability of the synthesized lipid nanoparticle samples was evaluated by visual and dynamic light scattering (DLS) analysis, which allows measurement of particles with a size of 0.3–10 ⁇ m, immediately after synthesis, after 3 h (stored at 4 °C), and after 24 h (stored at 4 °C).
  • DLS visual and dynamic light scattering
  • lipid nanoparticles Neutral lipid Cholesterol Anionic lipids PEG-modified lipids mol % mixing ratio Manufacturing example 1 DOPE Cholesterol DPPG DSPE-PEG 38.5:40:20:1.5 Manufacturing example 2 DSPC Cholesterol DOPA DSPE-PEG 38.5:40:20:1.5 Manufacturing example 3 DPPC Cholesterol DPPS DSPE-PEG 38.5:40:20:1.5 Manufacturing example 4 DSPC Cholesterol POPS DOPC-PEG 38.5:40:20:1.5 Manufacturing example 5 HSPC Cholesterol DOPS DPPE-PEG 38.5:40:20:1.5 Manufacturing example 6 DOPE Cholesterol DPPG DSPE-PEG 35:35:27:3 Manufacturing example 7 DOPE Cholesterol DPPG DSPE-PEG 40:43:15:2 Manufacturing example 8 DOPE Cholesterol DPPG DSPE-PEG 39:35:25:1
  • the final average particle size of the lipid nanoparticles manufactured in this way was measured and analyzed by DLS (dynamic light scattering), and the results were expressed as follows.
  • nucleic acid mRNA
  • Ribogreen assay as follows, and the following high encapsulation rate was confirmed.
  • the Fluc mRNA encapsulated in the lipid nanoparticle of Manufacturing Example 1 is a genetic material encoding the fly luciferase protein, and when the coding protein is expressed, it oxidizes the additionally injected substrate luciferin to cause luminescence.
  • the delivery efficiency of Fluc mRNA can be evaluated through the luminescence intensity of luciferin, and the delivery efficiency of the mRNA of the lipid nanoparticle was confirmed through an experiment on a 6-week-old BalB/c male mouse animal model.
  • each mouse group was injected intramuscularly (IM) with 4.8 ⁇ g of mRNA per individual, and 24 and 48 hours later, 100 ⁇ l of D-luciferin solution (Perkin Elmer) was injected intraperitoneally, and the luminescence signal within 5-10 minutes was confirmed using optical imaging equipment (IVIS, PerkinElmer).
  • the luminescence value (luminescence) was calculated as Total Flux (photons/s) after designating the Region of Interest (ROI).
  • the lipid nanoparticles of Manufacturing Example 1 are very useful in delivering Fluc mRNA to the target well and maintaining its expression.
  • Example 2 a complex was obtained by mixing Fluc mRNA and peptides of various structures, and then the result was subjected to gel running to determine whether the mRNA dragging phenomenon occurred and the complex was not formed properly, or whether the dragging phenomenon disappeared and the complex was formed properly.
  • the No. 2 peptide synthesized in the present invention has a structure in which one human PA R cluster is bound to an S-tag, and the No. 3 peptide has a structure in which two human PA R clusters are connected in series to an S-tag.
  • Fig. 4 shows the result of electrophoresis (gel running) for the complex of Fluc mRNA and No. 3 peptide
  • the lower photo of Fig. 4 shows the result of electrophoresis (gel running) for the complex of Fluc mRNA and No. 2 peptide. It can be confirmed that the complex in which mRNA and No. 3 peptide are mixed at a weight ratio of 1:1 is not disintegrated even at pH 7.2.
  • Lipid nanoparticles were manufactured under the conditions of Manufacturing Example 1 using the complexes of various mixing conditions manufactured in Example 5.
  • the lipids used at this time were DOPE (neutral lipid): Cholesterol: DPPG (anionic lipid): DSPE-PEG in the ratio of 38.5:40:20:1.5 (mol%). Based on 60 ⁇ g of Fluc mRNA, the peptides were mixed according to the mixing ratio in Table 6 below, and the encapsulation rate was also shown. In addition, this experiment was performed repeatedly, and the results for two representative samples are shown below.
  • the mRNA (complex) encapsulation rate in the lipid nanoparticles was confirmed to be in a state where aggregation occurred with the naked eye due to the strong charge interaction with mRNA when the lipid nanoparticles containing No. 1 peptide consisting of only two human PA R clusters were manufactured, and the particle size was non-uniform to the extent that PDI measurement was difficult.
  • a similar aggregation phenomenon occurred in the lipid nanoparticles containing No. 3 peptide in which the S-tag and two human PA R clusters are linked.
  • the No. 3 peptide is not suitable as an ionizable peptide due to the side effect of causing aggregation during the production of lipid nanoparticles. Accordingly, it is proven that the No. 2 peptide of the present invention is the best ionizable peptide that increases the encapsulation rate of mRNA.
  • the lipid nanoparticle carrier of the present invention comprises a complex comprising a nucleic acid and an ionizable peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and includes various anionic lipids, neutral lipids, cholesterol, and PEG-modified lipids.

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Abstract

본 발명은 이온화 가능한 펩타이드를 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체는 음이온성을 갖는 유전자와 복합체 형성 시 우수한 봉입율을 갖는 이온화 가능한 펩타이드를 이용함으로써, 체내에서 유전자를 고효율로 표적 세포까지 전달할 수 있고, 또한 표적 세포 내에서 유전자 발현량을 향상시킬 수 있으므로, 지질 나노입자 매개 유전자 치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

이온화 가능한 펩타이드를 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법
본 발명은 이온화 가능한 펩타이드를 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
의약 제제 산업에 있어 약물의 부작용을 줄이고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 약물전달시스템(DDS; Drug Delivery System)은 신약개발과 맞먹는 경제적 이익을 창출할 수 있으면서 성공 가능성이 큰 고부가가치 핵심기술로서 약물투여를 효율화함으로서 환자 치료의 질을 높이는데 그 목적이 있다.
약물전달시스템의 핵심기술 중의 하나인 약물흡수 촉진 기술에 속하는 난용성 약물의 가용화 기술은 신약 물질의 개발비용을 줄일 수 있는 동시에 현재 출시되어 있는 의약품의 부가가치를 높일 수 있는 가장 합리적인 방법으로 여겨지고 있다. 특히, 우리나라와 같이 신약개발 여건이 열악한 상황에서 약물의 가용화 기술의 개발을 통한 개량 신약의 개발은 적은 비용으로 막대한 부가가치를 창출할 수 있는 분야이다.
유전자 약물전달시스템을 이용한 유전자 치료법은 유전적 결합을 수정하고 수많은 질병을 치료하는데 있어 커다란 희망으로 자리 잡고 있다. 이러한 유전자 치료법을 성공적이고 안전하게 수행함에 있어서, 효과적인 유전자 전달이 주요한 과제 중 하나이며, 바이러스 전달체가 유전자 전달에 있어 효과적임이 입증되었다. 그러나 면역원성, 종양 발생 가능성, 세포독성, 바이러스 벡터 내의 제한된 DNA 크기 및 복잡한 생산 공정, 면역반응으로 인한 반복적 투여의 제한과 같은 여러 문제점으로 인해 유전자 전달 시스템으로서 바이러스의 이용이 제한되고 있다. 따라서, 상기 문제점을 극복할 수 있는 양이온성 리포좀 및 중합체와 같은 비-바이러스성 유전자 담체가 바이러스성 시스템의 대체 수단으로서 주목을 받기 시작했다.
이상적인 비바이러스성 유전자 운반체는 유전 물질을 응축하여 세포의 흡수가 가능한 나노 크기의 복합체를 형성해야 하고, 세포에 전달이 용이할 수 있도록 안정적인 구조체를 유지해야 하며, 외부의 유전 물질이 세포핵으로 전달 될 때까지 체내 효소반응에 의한 분해 등으로부터 안정하게 유지되어야 한다. 특히, 대부분의 유전자는 음이온성을 가지고 있고, 이를 효과적으로 비바이러스성 운반체에 탑재하기 위해서 양이온성 소재를 사용해야 한다. 이와 같이 이상적인 비바이러스성 유전자 운반체를 제조하기 위해 양이온성 고분자, 단백질 또는 펩타이드만으로 유전자 복합체를 형성하거나, 양이온성 지질 나노입자를 이용하는 등의 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, 세포 내 또는 체내에 핵산 전달을 용이하게 하기 위한 방안으로 핵산, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 입자의 응집을 억제하는 접합 지질을 포함하는 핵산-지질 입자를 채택할 수 있음이 보고되어 있고, siRNA 등의 핵산을 효율적으로 표적 세포 내에 송달하기 위한 캐리어가 되는 지질 나노입자로서 pH 감수성 양이온성 지질을 구성 지질로서 포함하는 지질 나노입자가 보고되어 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 목적하는 기관 또는 세포에 음이온성 약물, 핵산 등을 효율적으로 전달할 수 있는 약물 전달체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 핵산과 복합체 형성 시에 안정성이 향상된 pH 감수성 이온화 가능한 펩타이드를 제조하였고, 상기 펩타이드와 핵산이 결합된 복합체를 봉입하고 있는 지질 나노입자의 안정성이 우수하고, 타겟으로의 약물 전달력이 현저함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 미국 등록특허 제9404127호 (발명의 명칭 : Non-liposomal systems for nucleic acid delivery, 출원인 : PROTIVA BIOTHERAPEUTICS, INC., 등록일 : 2016년08월02일)
(특허문헌 2) 대한민국 공개특허 제10-2020-0018782호 (발명의 명칭 : siRNA 세포 내 송달을 위한 지질막 구조체, 출원인 : 훗가이도 다이가쿠, 공개일 : 2020년02월20일)
(특허문헌 3) 대한민국 공개특허 제10-2019-0093816호 (발명의 명칭 : 지질 나노입자 mRNA 백신, 출원인 : 큐어백 아게 외 1인, 공개일 : 2019년08월26일)
(특허문헌 4) 대한민국 등록특허 제10-1308591호 (발명의 명칭 : 양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법, 출원인 : 주식회사 삼양바이오팜, 등록일 : 2013년09월09일)
본 발명의 목적은 이온화 가능한 펩타이드를 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은, (a) 핵산, 및, 수용성 향상 태그와 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 이온화 가능한 펩타이드가 혼합된 복합체;
(b) 음이온성 지질; (c) 중성지질; (d) 콜레스테롤; 및, (e) PEG-변형지질;을 포함하는 것과 이들의 혼합 비율을 특징으로 하는 지질나노입자 기반 약물 전달체에 관한 것이다.
상기 핵산은 플라스미드 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, miRNA, siRNA, ssRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 핵산은 지질 나노입자에 봉입율 70% 이상, 바람직하게는, 70~94%, 더 바람직하게는 80~94%로 봉입될 수 있다.
상기 수용성 향상 태그는 S-태그, 단백질 이황화물 이성질화효소의 b'a' 도메인(b'a' domain of PDI; PDIb'a'), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein; MBP), 헥사히스티딘(hexahistidine; His6), 티오레독신(thioredoxin; Trx), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST), N-이용 기질 단백질 A(N-utilization substance Protein A; NusA), 수모(small ubiquitin related modifier; SUMO) 및 단백질 이황화물 이성질화효소(protein disulfide isomerase; PDI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 복합체는 핵산:펩타이드가 1:5 내지 1:15의 중량비로 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는 1:5 내지 1:10의 중량비로 포함된 것이 좋다.
상기 (b) 내지 (e)의 지질은 음이온성 지질 30~50 mol %, 중성지질 30~50 mol %, 콜레스테롤 10~30 mol % 및 PEG 변형지질 0.5~5 mol %로 포함될 수 있다.
상기 음이온성 지질은,
DSPG(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol),
DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol),
DOPG(dioleoylphosphatidylglycerol),
SOPG(1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol),
Soy PG(L-α-phosphatidylglycerol (Soy)),
Egg PG(L-α-phosphatidylglycerol (Egg, Chicken)),
DLPG(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol),
Cardiolipin(1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol),
DMPG(dimyristoylphosphatidylglycerol),
POPG(palmitoyloleoylphosphatidylglycerol),
DOPS(dioleoylphosphatidylserine),
DTPA(diethylenetriamine pentaacetic acid),
DPTGA(1,4-dipalmitoyl-tartarate-2,3-diglutaric acid),
DSTSA(1,4-disteroyl-tartarate-2,3-disuccinic acid),
CHHDA(2-carboxyheptadecanoyl heptadecylamide),
DMPS(dimyristoylphosphatidylserine),
DPPS(dipalmitoylphosphatidylserine),
POPS(palmitoyloleoylphosphatidylserine),
DMPA(dimyristoylphosphatidic acid),
DPPA(dipalmitoylphosphatidic acid),
DOPA(dioleoylphosphatidic acid),
POPA(palmitoyl-oleoylphosphatidic acid),
CetylP(Cetyl phosphate) 및
CHEMS(cholesterol hemisuccinate)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 또는 이의 염을 포함하는 지질인 것을 특징으로 한다.
상기 중성지질은 HSPC(hydrogenated soy phosphatidylcholine),
DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),
DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),
POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
DSPE(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),
POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
SM(N-palmitoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine),
DLPE(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
DPPE(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline),
디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol),
석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol),
포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine),
테트라에테르 리피드(tetraether lipid),
스핑고리피드(sphingolipid),
디아크릴 글리세롤(diacryl glycerol) 및
글리세리드(glyceride)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 또는 이의 염을 포함할 수 있다.
상기 PEG-변형 지질은 음이온성 지질 또는 중성지질에 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 (a) 핵산 용액 및 수용성 향상 태그와 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 이온화 가능한 펩타이드를 혼합하여 핵산-펩타이드 복합체를 제조하는 단계;
(b) 유기 용매, 음이온성 지질, 중성지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 반응기에 도입하고, 유기 용매를 제거하여 지질 필름을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 형성된 지질 필름에 상기 단계 (a)에서 제조된 복합체를 가하고, 분산시켜 지질 나노입자 분산액을 형성하는 단계;를 포함하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
또한 약물 전달체 제조단계에서 pH 3.8~4.2 유지 후, 지질 나노입자 제조를 마치면서 약물 전달을 위해 pH 7.0 내지 pH 7.4로 조절할 수 있다.
또 다른 방법으로서, 본 발명에서는, 지질을 동결 융해하는 대신, 상기 제(c)에서 액적-기반 미세유체 시스템으로 분산액을 제조하는 방법을 적용하여 지질 나노입자 기반 약물 전달체를 제조할 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 '이온화 가능한 펩타이드'는 '산성도에 따라 핵산과 펩타이드의 응집성의 양상이 달라지는 펩타이드'로서 산성 상태에서는 핵산과의 응집성이 강해지며, 중성 상태에서는 핵산과의 응집성이 약해지는 것이 특징이다.
이러한 특성은 산성 조건에서 mRNA와의 복합체 형성을 효과적으로 유도하고 음전하 LNP로 mRNA 고효율 봉입이 가능하게 한다. 펩타이드의 이온화 가능한 특성은 LNP에 탑재된 mRNA의 형질 감염 효율 증가에 기여한다.
mRNA를 봉입한 LNP는 세포 내 이입을 통해 mRNA를 세포질로 전달하게 된다. 세포 내 이입시 LNP는 엔도좀(endosome) 내에 갇히게 되는데, 라이소좀과의 융합 전 얼마나 많은 mRNA가 엔도좀 밖으로 탈출시키는지가 형질감염 효율의 중요한 요소이다. 이온화 가능한 펩타이드는 약산성의 엔도좀 환경에서 proton을 흡수하여 양이온화되는 특성을 가지고 있으며, 이에 따라 엔도좀의 삼투압 증가 및 구조 불안정성 증가를 통해 mRNA의 엔도좀 탈출에 기여한다.
본 발명에서 핵산은 세포 내 또는 생체 내 전달하기 위한 치료제로써, 양이온성을 띄는 이온화 가능한 펩타이드와 정전기적 상호작용을 통해 복합체를 형성할 수 있고, 예를 들어, 플라스미드 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, miRNA, siRNA, ssRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다. miRNA는 세포 내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오티드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2 이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.
본 발명에서, 용어 "siRNA"란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중 가닥 RNA(duplex RNA), 혹은 단일 가닥 RNA 내부에서 이중 가닥의 형태를 띄는 단일 가닥 RNA를 지칭한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. 이중 가닥 사이의 결합은 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지고, 이중 가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 완전 결합해야 하는 것은 아니다.
siRNA의 길이는 약 15 내지 60개, 구체적으로 약 15 내지 50개, 약 15 내지 40개, 약 15 내지 30개, 약 15 내지 25개, 약 16 내지 25개, 약 19 내지 25개, 약 20 내지 25개, 또는 약 20 내지 23개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 siRNA 길이는 이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다. 또한 siRNA는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 다양한 작용기를 도입한 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "ssDNA"은 특정 타겟 DNA에 선택적으로 결합하여 안티진(antigene) 효과를 유도하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "shRNA"는 단일 가닥으로 50 내지 70개로 구성된 뉴클레오티드를 의미하며, in vivo 상에서 스템-루프(stemloop) 구조를 이루고 있다. 5 내지 10개의 뉴클레오티드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19 내지 29개의 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.
본 발명에서, 용어 "mRNA"는 유전자를 발현 가능한 합성 mRNA(in vitro transcribed mRNA)를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "ncRNA"는 단백질로 번역되지 않고 RNA 자체로서 기능을 수행하게 된다. ncRNA에는 우리가 흔히 알고있는 tRNA, rRNA부터 snoRNA, miRNA, lncRNA까지 포함되며 세포 내 곳곳에서 전사, splicing, 번역 등에 관여한다.
본 발명에서, 용어 "안티센스 RNA"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 RNA 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 RNA의 길이는 6 내지 100 염기, 구체적으로 8 내지 60 염기, 보다 구체적으로, 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 RNA는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 용어 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 왓슨-크릭 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 이온화 가능한 펩타이드는, 수용성 향상 태그 및 서열번호 4의 인간 유래 아르기닌 클러스터(human PA R cluster; -SRRRRRRS-)의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 서열번호 4의 아미노선 서열은 수용성 향상 태그 이 후 반복 결합 구조로 이루어질 수 있으나 바람직하게는 1개의 수용성 향상 태그 및 1개의 서열번호 4의 아미노선 서열로 이루어진 것이 좋다.
이에, 상기 이온화 가능한 펩타이드의 일 예로서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 들 수 있다.
상기 수용성 향상 태그(solubility enhancing tag, S-태그)는 본 발명의 이온화 가능한 펩타이드를 음이온성 핵산과 결합하여 복합체를 형성할 시에 상기 복합체의 수용액 안정성을 향상시킬 수 있는 표지물질(tag)를 의미하는 것으로, 상기 이온화 가능한 펩타이드를 수용성 형태로 발현시킬 수 있는 것이면 어느 것이든 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 상기　수용성 향상 태그는 S-태그, 단백질 이황화물 이성질화효소의 b'a' 도메인(b'a' domain of PDI; PDIb'a'), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein; MBP), 헥사히스티딘(hexahistidine; His6), 티오레독신(thioredoxin; Trx), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST), N-이용 기질 단백질 A(N-utilization substance Protein A; NusA), 수모(small ubiquitin related modifier; SUMO) 및 단백질 이황화물 이성질화효소(protein disulfide isomerase; PDI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 수용성 향상 태그는 본 발명의 인간 유래 아르기닌 클러스터(human PA R cluster)의 N-말단, C-말단 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 각각 결합된 것일 수 있고, 하나 또는 둘 이상 연속적으로 결합할 수 있다.
본 발명에서 서열번호 4에 결합되는 수용성 향상 태그, 즉, 서열번호 2의 아미노산 서열 구성 일부를 이루는 수용성 향상 태그는 S-태그(KETAAAKFERQHMDS)일 수 있으며, 이는 상기 인간 유래 아르기닌 클러스터(human PA R cluster; -SRRRRRRS-)의 N-말단에 결합되어 본 발명의 이온화 가능한 펩타이드를 형성할 수 있다.
상기 S-태그를 포함하는 이온화 가능한 펩타이드의 경우, 핵산과 결합하여 복합체 형성 시, 복합체의 수용액 안정성을 향상시킬 수 있고, 지질 나노입자 내에 봉입되었을 때에도 상기 지질 나노입자의 안정성을 증대시킬 수 있다. 이를 통해, 표적 세포 내에 핵산을 안정적으로 전달할 수 있고, 높은 유전자 발현량에 기여할 수 있다.
본 발명에서 PEG-변형 지질 내 지질은 PEG(폴리에틸렌글리콜)과 결합할 수 있는 지질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 중성지질 또는 음이온성 지질 그 어떤 것이라도 사용할 수 있다.
상기 PEG-변형 지질은 지질과 PEG가 컨쥬게이트된(conjugated) 형태를 지칭하는 것으로, 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 중합체가 결합된 지질을 의미한다. 상기 PEG-변형 지질은 지질 나노입자 내에서 나노입자의 혈청 내 입자 안정성에 기여하며, 지질 나노입자 간 응집을 막는 안정화제 지질(stabilizer lipid) 역할을 수행한다. 또한, 상기 PEG-변형 지질은 핵산의 생체 내 전달시 분해효소로부터 핵산을 보호하여 핵산의 체내 안정성을 강화시키며, 상기 지질 나노입자 내 봉입된 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다.
상기 PEG-변형 지질에서 PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 예를 들면, 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 상기 에스테르-비함유 링커 모이어티는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카르보닐(-C(O)-), 카르바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 다이설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH2CH2C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 다이설파이드뿐만 아니라 이들의 조합(예컨대, 카르바메이트 링커 모이어티 및아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 에스테르-함유 링커 모이어티는, 예를 들면 카르보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 PEG-변형 지질 내 PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억제하는 능력을 가지고 있어서 지질 나노입자의 체내 순환시간을 증가시키며, 나노입자 간의 응집현상을 막는 역할을 한다. 또한, PEG-변형 지질은 생체 내에서 스텔스(stealth) 기능을 나타내어 면역세포에 의한 나노입자의 분해를 방지할 수 있다.
상기 PEG는 지질과 결합하지 않은 쪽에 관능기가 결합된 것(functionalized PEG)일 수 있다. 이 때 사용 가능한 관능기는 숙시닐기(succinyl), 카르복시산(carboxylic acid), 말레이미드(maleimide), 아민기, 바이오틴, 시아누르기(cyanur), 및 폴레이트(folate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 콜레스테롤은 상기 지질 나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 한다.
본 발명에서 지질 나노입자의 평균 입자 크기는 10 내지 2,000 nm일 수 있다. 지질 나노입자의 크기가 10 nm 미만일 경우, 상기 복합체가 지질 나노입자에 봉입되기 어려울 수 있으며, 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다. 또한 2,000 nm를 초과할 경우에도 상기 지질 나노입자가 포함된 조성물이 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명은 (a) 핵산 용액, 및, 수용성 향상 태그와 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 이온화 가능한 펩타이드를 혼합하여 펩타이드-핵산 복합체를 제조하는 단계;
(b) 유기 용매, 음이온성 지질, 중성지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 반응기에 도입하고, 유기 용매를 제거하여 지질 필름을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 형성된 지질 필름에 상기 단계 (a)에서 제조된 복합체를 가하고, 분산시켜 지질 나노입자 분산액을 형성하는 단계;를 포함하는, 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 (b)는 유기 용매, 음이온성 지질, 중성지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 반응기에 도입하고, 유기 용매를 제거하여 지질 필름을 형성하는 단계이다.
상기 음이온성 지질, 중성지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형 지질에 대해서는 전술한 바와 같으므로, 여기서의 기재는 생략한다.
상기 유기 용매를 제거하는 단계는, 상기 반응기의 내부를 진공 상태로 유지하고, 상기 반응기 내에 도입된 지질 용액 중 유기 용매를 증발시키는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 반응기 내 온도를 고온으로 설정해 유기 용매만을 증발시킬 수 있다. 이와 같이, 유기 용매를 증발시켜 제거함으로써, 상기 지질 용액 중 유기 용매를 제외한 나머지 지질 성분은 상기 반응기의 내벽 및 바닥부에 지질 필름을 형성하게 된다.
상기 유기 용매의 종류는 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체 제조에 이용되는 지질을 용해할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 상기 유기 용매는 바람직하게는, 비극성 또는 저극성 유기 용매일 수 있고, 벤젠, 부탄올, 부틸 아세테이트, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 사이클로헥세인, 디클로로에테인, 디클로로메테인, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 에틸 아세테이트, 헵테인, 헥세인, 이소옥테인, 메틸 에틸 케톤(MEK), 메틸 t-부틸 에테르(MTBE), 펜테인, 톨루엔, 트리클로로에틸렌, 자일렌 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 (c)는 상기 단계 (b)에서 형성된 지질 필름에 상기 단계 (a)에서 제조된 복합체를 가하고, 분산시켜 지질 나노입자 분산액을 형성하는 단계이다.
상기 단계 (c)에 있어서, 상기 분산액을 동결시키고, 동결된 분산액을 융해시키는 동결/융해 과정을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 분산액을 액화 질소에 5분간 노출시켜 동결시키고, 재차 온수에 노출하여 융해시키는 과정을 반복할 수 있다. 이때, 상기 동결/융해 과정을 1 내지 12회 반복할 수 있고, 이와 같이 지질 필름 조성물을 동결하고 융해하는 단계를 반복함으로써 보다 균일한 크기의 지질 나노입자 분산액이 형성될 수 있고, 지질 나노입자의 약물 봉입 효율을 높일 수 있다. 단, 12회를 초과할 경우에는 지질 나노입자의 봉입 효율이 오히려 줄어들 수 있기 때문에 12회 이내가 바람직하다.
본 발명에서, 용어 "봉입(encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 의미한다.
또한 지질 나노입자에 봉입되는 핵산의 봉입율은 다음의 식에 따라 확인할 수 있다.
봉입율 (%) = (지질 나노입자에 담지되는 핵산의 중량 / 지질 나노입자에 투입되는 핵산의 중량) x 100
본 발명은 이온화 가능한 펩타이드를 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 지질 나노입자 기반 약물 전달체는 음이온성을 갖는 유전자와 복합체 형성 시 우수한 봉입율을 갖는 pH 감수성 이온화 가능한 펩타이드를 이용함으로써, 체내에서 유전자를 고효율로 표적 세포까지 전달할 수 있고, 또한 표적 세포 내에서 유전자 발현량을 향상시킬 수 있으므로, 지질 나노입자 매개 유전자 치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 이온화 가능한 펩타이드를 적용한 핵산 복합체를 pH 4.0에서 제조 후, 최종적으로 pH 7.2 조건에서 지질 나노입자를 보관하는 과정을 나타내는 모식도다.
도 2는 핵산 및 이온화 가능한 펩타이드 복합체의 혼합비 조건을 탐색하기 위해, pH별, 각 중량비 별로, Fluc mRNA(Fly luciferase)와 No.2 펩타이드를 혼합한 조성물을 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 제조예 1의 지질 나노입자, Fluc mRNA를 실험동물에 피하주사한 후의 mRNA 전달 효율을 나타낸 것으로서, 상단의 사진은 mRNA 전달로 인한 유전자의 단백질 발현을 24시간 및 48시간에 촬영한 사진이며, 하단의 그래프는 이를 수치화하여 나타낸 그래프 결과다.
도 4는 이온화 가능한 펩타이드의 human PA R cluster 구조에 따른 복합체 제조 조건을 확인하기 위해, Fluc mRNA에 No.3 펩타이드, 또는, No.2 펩타이드 각각을 혼합한 조성물을 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 이온화 가능한 펩타이드의 S-태그 유무에 따른 복합체 제조 조건을 확인하기 위해, Fluc mRNA에 No.3 펩타이드, 또는, No.1 펩타이드 각각을 혼합한 조성물을 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 이온화 가능한 펩타이드의 합성>
하기 1 내지 3의 서열을 펩타이드 생합성 기관인 GenScript사에 의뢰하여 제조하였다. 등록특허 제10-2549868호의 방법으로 합성하였다. 이 서열들은 서열번호 4의 human PA R cluster 펩타이드 서열 (NCBI, #NP_002752.1)과 서열번호 5의 S-Tag 펩타이드 서열을 기준으로 하여 합성하였다.
서열번호 No. Peptide sequence
1 SRRRRRRSSRRRRRRS
(human PA R cluster)-(human PA R cluster)
2 KETAAAKFERQHMDSSRRRRRRS
(S-tag)-(human PA R cluster)
3 KETAAAKFERQHMDSSRRRRRRSSRRRRRRS
(S-tag)-(human PA R cluster)-(human PA R cluster)
4 SRRRRRRS
(human PA R cluster, #NP_002752.1)
5 KETAAAKFERQHMDS
(S-tag)
<실시예 2. mRNA 및 이온화 가능한 펩타이드의 적정 혼합비 확인>
도 1에 개시한 바와 같이, 본 발명의 지질 나노입자를 제조하기 위해, 산성 조건(예:pH 4.0)에서 이온화 가능한 펩타이드와 mRNA를 혼합하여 복합체를 얻고, 중성 조건(예:pH 7.2)에서 복합체와 각 지질을 혼합하여 완성도 있는 지질 나노입자를 제조하는 것을 특징으로 한다. Fluc mRNA(MG IVT Fluc mRNA)는 자체 제작한 것으로, Fluc plasmid DNA를 template로 T7 polymerase (Cat #: 2540A, TaKaRa)를 이용하여 in vitro transcription (IVT)을 통하여 매뉴얼 방법으로 합성한 다음, phenol : chloroform : Isoamyl alcohol을 이용하여 정제한 후, Nanodrop (BIOTEK Synergy H1) 및 아가로즈 젤로 순도 및 농도를 확인하고, 소량씩 분주하여 딥프리저에 보관하며 사용하였다.
이에, 본 실험에서는 가장 먼저 mRNA와 이온화 가능한 펩타이드의 적정 혼합조건부터 확인하였고, pH 4.0 조건, pH 4.0에서 pH 7.2로의 변환 조건, pH 7.2 조건에서 각각 mRNA의 함량을 1 중량부(0.25㎍)으로 고정하였을 때, 이온화 가능한 펩타이드 (서열번호 2)의 함량을 0.5 중량부(0.125㎍)에서 10 중량부(2.5㎍)까지 변화하여, 이들을 각각 혼합하고, 복합체 형성을 아가로스겔 전기영동 분석으로 확인하였다. 이 때, 복합체를 이루지 못하면, gel 상에서 mRNA가 나타나 밴드 또는 끌림 현상이 나타나게 된다. 실험 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 확인한 바, pH 4.0 조건에서 mRNA와 이온화 가능한 펩타이드는 1:0.5 중량비로 혼합시, 복합체가 형성되지 않아 mRNA의 끌림 현상이 관찰된다(네번째 레인). (도 2의 only mRNA : MG IVT Fluc mRNA, only hLMWP2 : No.2 Ionizable peptide)
이와 비교하여, 1:1의 중량비로 혼합시, 복합체가 형성되어 mRNA가 gel에서 관찰되지 않는다(첫번째 화살표). mRNA 및 펩타이드를 1:5와 1:10의 중량비로 혼합한 것은 복합체가 잘 형성되었음을 확인할 수 있다.
그러나, 이 복합체 샘플 중, 1:1의 중량비 샘플은, pH 4.0에서 pH 7.2로 옮겨 gel running한 바, 복합체 형성된 것이 해체되어 mRNA의 끌림 현상이 약하게 관찰된다(두번째 화살표). mRNA 및 펩타이드를 1:5와 1:10의 중량비로 혼합한 것은 이 조건에서도 복합체는 잘 유지되고 있다.
이는 펩타이드의 가역적 이온화 특성으로 인한 것으로서, 지질 나노입자의 제조를 위한 중성 조건에서 mRNA와 펩타이드의 혼합비가 1:1인 경우는 지질 나노입자의 제조 전에 복합체가 해체될 수 있음을 시사한다.
따라서, 복합체가 지질 나노입자가 형성될 때까지 안정적으로 유지하기 위해서는 mRNA, 즉, 핵산 대비 적어도 5배 이상이어야 함을 이 pH 4.0에서 pH 7.2의 변화 실험을 통해 확인할 수 있다.
이는 다시 pH 7.0 조건에서 동일하게 복합체를 제조하고, gel running을 수행하여, 역시 mRNA와 펩타이드의 혼합비가 1:1인 경우는 mRNA의 끌림 현상이 나타나고(세번째 화살표), mRNA와 펩타이드의 혼합비가 1:5 이상일 때 mRNA의 끌림 현상이 나타나지 않음을 확인하여 입증하였다.
<실시예 3. 지질 나노입자의 제조, 특성 확인 및 봉입율 테스트>
실시예 2의 결과를 기반으로 다음의 표 2의 조건으로 지질 나노입자를 제조하였다. 지질 나노입자는 박막 수화 방법을 사용하여 준비하였다.
예를 들어, 제조예 1의 지질나노입자의 경우, DOPE(중성지질) : Cholesterol : DPPG(음이온성지질) : DSPE-PEG를 38.5 : 40 : 20 : 1.5 (mol %)로서, 지질 총 1.5mg을 클로로포름 1 mL에 용해시키고 용매를 증발시켜 지질 필름을 형성하였다. 그 후, 형성된 지질 필름을 Fluc mRNA 60㎍, 서열번호 2의 펩타이드 600㎍가 혼합되어 형성된 복합체 1mL (Acetate buffer, pH 4)로 수화하였다.
그 다음, 동결-해동 절차를 거처, LNP 용액을 교체한 (투석, PBS, pH 7.2) 다음 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과함으로써, 지질 나노입자를 제조하였다.
합성된 지질 나노입자 샘플은 합성 직후, 3 시간 후(4 ℃에서 보관) 및 24 시간 후(4 ℃에서 보관)에 육안 및 0.3~10 μm 크기의 입자 측정이 가능한 DLS(dynamic light scattering) 분석을 통해 안정성을 평가하였다.
제조예 1 mRNA 서열번호 2의 Peptide Lipid
조성 Fluc mRNA KETAAAKFERQHMDSSRRRRRRS
(S-tag)-(human PA R cluster)		 DOPE:Cholesterol:DPPG:DSPE-PEG
(38.5:40:20:1.5 (mol %))
함량 60 ㎍ 600 ㎍ 1.5 mg
지질나노입자 중성지질 콜레스테롤 음이온성지질 PEG-변형지질 mol % 혼합비
제조예 1 DOPE Cholesterol DPPG DSPE-PEG 38.5:40:20:1.5
제조예 2 DSPC Cholesterol DOPA DSPE-PEG 38.5:40:20:1.5
제조예 3 DPPC Cholesterol DPPS DSPE-PEG 38.5:40:20:1.5
제조예 4 DSPC Cholesterol POPS DOPC-PEG 38.5:40:20:1.5
제조예 5 HSPC Cholesterol DOPS DPPE-PEG 38.5:40:20:1.5
제조예 6 DOPE Cholesterol DPPG DSPE-PEG 35:35:27:3
제조예 7 DOPE Cholesterol DPPG DSPE-PEG 40:43:15:2
제조예 8 DOPE Cholesterol DPPG DSPE-PEG 39:35:25:1
이렇게 제조한 지질 나노입자에 대해 최종적인 평균 입자 크기를 측정하고, DLS(dynamic light scattering) 분석을 측정하여 이를 다음과 같이 나타내었다.
지질 나노입자 Size (nm) PDI
제조예 1 124 0.18
제조예 2 132 0.14
제조예 3 141 0.12
제조예 4 114 0.12
제조예 5 137 0.19
제조예 6 125 0.12
제조예 7 128 0.13
제조예 8 115 0.14
또한 하기와 같이 지질 나노입자에 복합체에 대한 핵산(mRNA)의 봉입율을 Ribogreen assay를 통해 확인한 바, 다음과 같은 높은 봉입율이 확인되었다.
지질 나노입자 mRNA 봉입률 (%)
제조예 1 94
제조예 2 90
제조예 3 91
제조예 4 90
제조예 5 94
제조예 6 92
제조예 7 91
제조예 8 90
<실시예 4. 지질 나노입자의 타겟 전달 효율 확인>
제조예 1의 지질 나노입자에 봉입된 Fluc mRNA는 fly luciferase 단백질을 코딩하는 유전물질로서, 코딩 단백질이 발현되면 추가로 주입된 기질(substrate) luciferin을 산화시켜 발광하게 만드는 역할을 한다. Luciferin의 발광 세기를 통해 Fluc mRNA 전달 효율을 평가할 수 있으며, BalB/c 6주령 수컷 마우스 동물모델 실험을 통해 지질 나노입자의 mRNA의 전달 효율을 확인하였다.
이를 위해 각 마우스 군에 각 개체당 4.8㎍의 mRNA를 근육 주사한 (Intramuscular injection, IM) 후 24시간과 48시간 후에 D-luciferin 용액(Perkin Elmer) 100 μl를 복강내로 주사하고 5-10분 이내의 발광 신호를 광학영상장비(IVIS, PerkinElmer)로 확인하였다. 발광값(luminescence)는 ROI(Region of Interest)를 지정한 후, Total Flux(photons/s)로 산출하였다.
도 3을 확인해보면, Fluc mRNA만 단독으로 피하주사한 마우스 군(mRNA only)에서는 24시간과 48시간 후에도 103 photons/s 수준의 낮은 luminescence를 나타내어 실제 육안상으로 사진을 보기에는 mRNA로 인한 어떠한 반응도 나타나지 않은 것처럼 보였다.
이에 반해, 제조예 1의 지질 나노입자를 피하주사한 마우스 군(LNP-mRNA)에서는 106 photons/s 수준의 높은 전달효율이 관찰되며, 이는 촬영 사진 상으로도 매우 강한 발광 이미지를 남겼다.
따라서, 제조예 1의 지질 나노입자가 Fluc mRNA를 타겟으로 잘 전달하고, 이를 발현할 수 있도록 유지하는 데 있어 매우 유용함을 확인할 수 있다.
<실시예 5. 이온화 가능한 펩타이드의 구조에 따른 핵산 복합체 제조 조건 테스트>
다음으로는 이온화 가능한 펩타이드의 구조 중, 어느 위치가 더 핵산 복합체의 생성에 더 중요한 영향을 주는지, 또는 이 펩타이드의 구성에 필수적인 아미노산 서열이 어떤 구성인지를 확인하기 위해 추가적인 실험을 실시하였다.
이에, 실시예 2에서 수행한 것과 같이, Fluc mRNA와 다양한 구조의 펩타이드를 혼합하여 복합체를 얻은 후, 이를 gel running하여 mRNA의 끌림 현상이 나타나 복합체가 잘 만들어지지 않거나, 이 끌림 현상이 사라져 복합체가 잘 형성되는 지의 여부를 확인하였다.
이를 위해 본 발명에서 합성한 No.2 펩타이드는 S-tag에 human PA R cluster가 1개 결합된 구조를 하고 있으며, No.3 펩타이드는 S-tag에 human PA R cluster가 2개 직렬로 연결된 구조를 하고 있다.
도 4의 상단 사진은 Fluc mRNA와 No.3 펩타이드의 복합체, 도 4의 하단 사진은 Fluc mRNA와 No.2 펩타이드의 복합체에 관한 전기영동(gel running) 결과로서, mRNA와 No.3 펩타이드가 1:1의 중량비로 혼합된 복합체는 pH 7.2가 되어도 복합체의 형성이 해체되지 않음을 확인할 수 있다.
한편, pH 7.2에서 비록 복합체가 해체되긴 해도, pH 4.0에서 mRNA와 No.3 펩타이드가 1:0.5로 혼합된 조건에서도 복합체가 형성된 것으로 나타난다(네번째 레인에 끌림 현상이 보이지 않음). 이는 이온화가능한 펩타이드 구조에서, human PA R cluster가 늘어날수록 mRNA와의 정전기적 상호작용이 강해지는 것을 파악할 수 있다. 즉, 펩타이드의 양이 적어도 강력한 복합체가 형성될 수 있음을 의미한다.
도 4의 하단 gel 사진의 결과는 No.2 펩타이드를 사용하였기에, 실시예 2의 결과와 동일하며, 여전히 mRNA의 5배 중량 이상의 No.2 펩타이드를 필요로 함을 보여주고 있다.
한편, 도 5의 하단 gel 사진과 같이, S-tag가 없고, human PA R cluster만 직렬로 2번 반복된 No.1 펩타이드를 이용하여 같은 실험을 반복하였는데, mRNA와 No.1 펩타이드가 1:1의 중량비로 혼합된 복합체는 pH 4.0에서도 pH 7.2에서도 복합체 상태를 잘 유지하는 것으로 확인된다.
그러나, mRNA와 No.1 펩타이드가 1:0.5의 중량비로 혼합되었을 때에는 pH 4.0에서도 7.2에서도 모두 복합체 형성이 잘 되지 않는다. 이와 비교하여, 도 5의 상단 gel 사진 결과를 확인하면, No.3의 펩타이드는 여전히 pH 4.0에서는 1:0.5 혼합비에서는 복합체를 형성한다.
이는 S-tag의 유무로 인해 human PA R cluster 서열이 갖는 pH에 대한 적응성이 달라짐을 의미하며, S-tag이 펩타이드 자체의 ionizable 특성이 중요 요인으로 작용하는 것일 수도 있음을 뜻한다.
이에, S-tag의 유무와 human PA R cluster의 반복 서열이 지질 나노입자의 제조에 어떠한 영향을 주는지 다음의 봉입율 실험을 통해서 보다 명백히 확인하기로 하였다.
<실시예 6. 이온화 가능한 펩타이드 특성별 지질 나노입자의 봉입율 확인>
실시예 5에서 제조된 다양한 혼합 조건의 복합체를 이용하여 제조예 1 조건으로 지질 나노입자를 제조하였다.
이 때 사용한 지질은 DOPE(중성지질) : Cholesterol : DPPG(음이온성지질) : DSPE-PEG를 38.5 : 40 : 20 : 1.5 (mol %)가 되게 하였다. Fluc mRNA 60㎍ 기준, 하기 표 6의 혼합비에 따라 펩타이드를 혼합하였고, 봉입율도 같이 나타내었다. 또한, 본 실험은 반복적으로 실험하되, 이를 대표적으로 2개의 샘플에 대한 결과로서 하기에 나타내었다.
지질 나노입자 펩타이드 서열 mRNA:peptide 혼합비 mRNA 봉입률 (%)
비교제조예 1 No.1 1:1 Aggregation
비교제조예 2 No.1 1:1 Aggregation
비교제조예 3 No.1 1:5 Aggregation
비교제조예 4 No.1 1:5 Aggregation
비교제조예 5 No.1 1:10 Aggregation
비교제조예 6 No.1 1:10 Aggregation
비교제조예 7 No.2 1:1 9
비교제조예 8 No.2 1:1 5
제조예 9 No.2 1:5 80
제조예 10 No.2 1:5 94
제조예 11 No.2 1:10 90
제조예 12 No.2 1:10 88
제조예 13 No.2 1:15 92
제조예 14 No.2 1:15 91
비교제조예 15 No.3 1:1 Aggregation
비교제조예 16 No.3 1:1 Aggregation
비교제조예 17 No.3 1:5 Aggregation
비교제조예 18 No.3 1:5 Aggregation
비교제조예 19 No.3 1:10 Aggregation
비교제조예 20 No.3 1:10 Aggregation
표 6의 결과를 살펴보면, 지질 나노입자 내의 mRNA(복합체) 봉입율은, human PA R cluster 2개만으로 구성된 No.1 펩타이드가 포함된 지질 나노입자의 제조 시, mRNA와의 강력한 charge interaction으로 인해, 육안으로도 뭉침(Aggregation)이 발생한 상태인 것으로 확인되었고, PDI 측정이 어려울 정도로 입자 크기가 불균일하였다. 또한, S-tag와 human PA R cluster 2개가 연결된 No.3의 펩타이드가 포함된지질 나노입자에서도 역시 비슷한 뭉침 현상이 발생하였다.
이로 인해, S-tag의 유무는 human PA R cluster 2개가 연결된 펩타이드의 뭉침 현상에는 전혀 영향을 주지 못하는 것으로 확인된다.
결국, 복합체 형성이 잘 되었을지라도, 이와 같이 지질 나노입자 제조시의 뭉침 현상을 일으키는 부작용으로 인해, No.3 펩타이드는 결국 이온화 가능한 펩타이드로서 적절하지 않음을 알 수 있다. 이에, 본 발명의 No.2 펩타이드가 mRNA의 봉입율을 높이는, 이온화 가능한 펩타이드로 가장 우수한 것임이 입증된다.
따라서, 본 발명의 지질 나노입자 전달체는 핵산 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 이온화 가능한 펩타이드가 혼합된 복합체를 포함하고, 다양한 음이온성 지질, 중성지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형지질을 포함한다.
이상과 같이 특정된 사항들과 한정된 실시예를 통해 본 발명이 설명되었으나, 이는 본 발명의 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 청구범위뿐 아니라 이 청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. (a) 핵산, 및, 수용성 향상 태그와 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 이온화 가능한 펩타이드가 혼합된 복합체;
    (b) 음이온성 지질; (c) 중성지질; (d) 콜레스테롤; 및, (e) PEG-변형지질;을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질나노입자 기반 약물 전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 플라스미드 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, miRNA, siRNA, ssRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질나노입자 기반 약물 전달체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 지잘 나노입자에 봉입율 70% 이상으로 봉입되는 것을 특징으로 하는 지질나노입자 기반 약물 전달체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 수용성 향상 태그는 S-태그, 단백질 이황화물 이성질화효소의 b'a' 도메인(b'a' domain of PDI; PDIb'a'), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein; MBP), 헥사히스티딘(hexahistidine; His6), 티오레독신(thioredoxin; Trx), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST), N-이용 기질 단백질 A(N-utilization substance Protein A; NusA), 수모(small ubiquitin related modifier; SUMO) 및 단백질 이황화물 이성질화효소(protein disulfide isomerase; PDI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 태그인 것을 특징으로 하는 지질나노입자 기반 약물 전달체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 음이온성 지질은,
    DSPG(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol),
    DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol),
    DOPG(dioleoylphosphatidylglycerol),
    SOPG(1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol),
    Soy PG(L-α-phosphatidylglycerol (Soy)),
    Egg PG(L-α-phosphatidylglycerol (Egg, Chicken)),
    DLPG(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol),
    Cardiolipin(1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol),
    DMPG(dimyristoylphosphatidylglycerol),
    POPG(palmitoyloleoylphosphatidylglycerol),
    DOPS(dioleoylphosphatidylserine),
    DTPA(diethylenetriamine pentaacetic acid),
    DPTGA(1,4-dipalmitoyl-tartarate-2,3-diglutaric acid),
    DSTSA(1,4-disteroyl-tartarate-2,3-disuccinic acid),
    CHHDA(2-carboxyheptadecanoyl heptadecylamide),
    DMPS(dimyristoylphosphatidylserine),
    DPPS(dipalmitoylphosphatidylserine),
    POPS(palmitoyloleoylphosphatidylserine),
    DMPA(dimyristoylphosphatidic acid),
    DPPA(dipalmitoylphosphatidic acid),
    DOPA(dioleoylphosphatidic acid),
    POPA(palmitoyl-oleoylphosphatidic acid),
    CetylP(Cetyl phosphate) 및
    CHEMS(cholesterol hemisuccinate)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 또는 이의 염을 포함하는 지질인 것을 특징으로 하는 지질나노입자 기반 약물 전달체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 중성지질은 HSPC(hydrogenated soy phosphatidylcholine),
    DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),
    DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),
    POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
    DSPE(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
    DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),
    POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),
    DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
    SM(N-palmitoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine),
    DLPE(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
    DPPE(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
    포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline),
    디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol),
    석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol),
    포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine),
    테트라에테르 리피드(tetraether lipid),
    스핑고리피드(sphingolipid),
    디아크릴 글리세롤(diacryl glycerol) 및
    글리세리드(glyceride)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 또는 이의 염을 포함하는 지질인 것을 특징으로 하는 지질나노입자 기반 약물 전달체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 PEG-변형 지질은 음이온성 지질 또는 중성지질에 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 것을 특징으로 하는 지질나노입자 기반 약물 전달체.
  8. (a) 핵산 용액, 및, 수용성 향상 태그와 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 이온화 가능한 펩타이드를 혼합하여 핵산-펩타이드 복합체를 제조하는 단계;
    (b) 유기 용매, 음이온성 지질, 중성지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 반응기에 도입하고, 유기 용매를 제거하여 지질 필름을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 형성된 지질 필름에 상기 단계 (a)에서 제조된 복합체를 가하고, 분산시켜 지질 나노입자 분산액을 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    단계(c)에서 지질을 동결 융해하는 대신, 상기 액적-기반 미세유체 시스템으로 분산액을 제조하는 방법을 적용하는 것을 특징으로 하는 지질 나노입자 기반 약물 전달체의 제조방법.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110038941A1 (en) * 2007-12-27 2011-02-17 The Ohio State University Research Foundation Lipid Nanoparticle Compositions and Methods of Making and Using the Same
KR102475540B1 (ko) * 2022-04-26 2022-12-08 주식회사 무진메디 약물이 담지된 지질 나노입자 제조 방법 및 제조 장치
WO2022266032A1 (en) * 2021-06-14 2022-12-22 Generation Bio Co. Cationic lipids and compositions thereof
KR102505508B1 (ko) * 2014-08-14 2023-03-03 엘.이.에이.에프. 홀딩스 그룹 엘엘씨. 리포솜 캡슐화 친화 약제

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110038941A1 (en) * 2007-12-27 2011-02-17 The Ohio State University Research Foundation Lipid Nanoparticle Compositions and Methods of Making and Using the Same
KR102505508B1 (ko) * 2014-08-14 2023-03-03 엘.이.에이.에프. 홀딩스 그룹 엘엘씨. 리포솜 캡슐화 친화 약제
WO2022266032A1 (en) * 2021-06-14 2022-12-22 Generation Bio Co. Cationic lipids and compositions thereof
KR102475540B1 (ko) * 2022-04-26 2022-12-08 주식회사 무진메디 약물이 담지된 지질 나노입자 제조 방법 및 제조 장치

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GenPept 25 July 2016 (2016-07-25), .: "Homo sapiens protamine 1, partial [synthetic construct]", XP093254075 *
GE YICHEN, TIAN TAORAN, SHAO XIAORU, LIN SHIYU, ZHANG TAO, LIN YUNFENG, CAI XIAOXIAO: "PEGylated Protamine-Based Adsorbing Improves the Biological Properties and Stability of Tetrahedral Framework Nucleic Acids", APPLIED MATERIALS & INTERFACES, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 11, no. 31, 7 August 2019 (2019-08-07), US , pages 27588 - 27597, XP093098170, ISSN: 1944-8244, DOI: 10.1021/acsami.9b09243 *

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