WO2025005777A1 - 신규 crispr/cas13 시스템 및 그 용도 - Google Patents

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cas13
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crispr
rna
protein
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이봉희
바야르사이칸델거
바야르사이칸고비저럴
가시우나스게드리우스
스티티리트미글
구옥재
강현아
이재석
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Nsage Corp
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    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Definitions

  • the CRISPR/Cas13 system is a type of CRISPR/Cas system.
  • the CRISPR/Cas13 system includes an effector protein (Cas13 protein) and a guide RNA.
  • the CRISPR/Cas13 system recognizes and cleaves a single-stranded RNA having a sequence complementary to a spacer sequence of the guide RNA and a protospacer flanking sequence (PFS). After a certain CRISPR/Cas13 system cleaves the single-stranded RNA, a secondary cleavage activity is activated to randomly cleave surrounding single-stranded RNA.
  • PFS protospacer flanking sequence
  • the CRISPR/Cas13 system belongs to the Type VI CRISPR/Cas system of Class 2.
  • the CRISPR/Cas13 system is further divided into several subtypes, including Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas13x, and Cas13y.
  • the above subtypes are also referred to as IV-a, IV-b, IV-c, IV-d, IV-x, and IV-y, respectively.
  • the CRISPR/Cas13 systems belonging to each subtype show slight differences in the size of the Cas13 protein, the structure of the guide RNA, etc.
  • the CRISPR/Cas13 system includes a Cas13 protein and a guide RNA for the same.
  • the Cas13 protein and the guide RNA act as a complex.
  • the protein-RNA complex can bind to a target nucleic acid (by recognizing the target nucleic acid) and cleave the nucleic acid.
  • some protein-RNA complexes have a secondary cleavage activity that cleaves any surrounding nucleic acid after cleaving the target nucleic acid.
  • the Cas13 protein-guide RNA complex is also referred to as a Ribonucleoprotein (RNP).
  • the Cas13 protein recognizes a PFS (Protospacer Flanking Sequence) and can cleave a nucleic acid.
  • the guide RNA can guide the Cas13 protein-guide RNA complex to the target nucleic acid by binding to the target nucleic acid having the target sequence.
  • the above CRISPR/Cas13 system is known to function by targeting single-stranded RNA as a target nucleic acid.
  • the Cas13 protein can be broadly divided into the REC (RECognition) lobe and the NUC (NUClease) lobe.
  • the upper NUC lobe contains two HEPN (Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding) domains.
  • the upper REC lobe is an important part for the Cas13 protein to recognize the guide RNA and form a complex.
  • the upper NUC lobe cleaves nucleic acids.
  • the structure of the Cas13 protein has already been reported by several researchers. For example, it is described in detail in Xue et. al (Engineering CRISPR/Cas13 System against RNA Viruses: From Diagnostics to Therapeutics. Bioengineering (Basel), 2022 Jul; 9(7): 291).
  • the guide RNA of the CRISPR/Cas13 system is composed of a single RNA molecule, unlike the guide RNA of the CRISPR/Cas9 system. This is called crRNA.
  • the guide RNA contains direct repeats and a spacer.
  • the direct repeats and spacers have different connection structures depending on the subtype of the CRISPR/Cas13 system.
  • the guide RNAs of Cas13a and Cas13d subtypes have direct repeats and spacers sequentially connected from the 5' end to the 3' end.
  • the guide RNA of the Cas13b subtype has spacers and direct repeats sequentially connected from the 5' end to the 3' end.
  • the CRISPR/Cas13 system can target-specifically cleave nucleic acids. Two conditions are required for target-specific nucleic acid cleavage activity to occur. First, there must be a base sequence of a certain length that the Cas13 protein can recognize in the nucleic acid. Second, there must be a sequence that can complementarily bind to a spacer included in the guide RNA around the base sequence of the certain length. 1) When the Cas13 protein recognizes the base sequence of the certain length, and 2) the spacer complementarily binds to a portion around the base sequence of the certain length, the CRISPR/Cas13 system cleaves the nucleic acid. At this time, the base sequence of the certain length recognized by the Cas13 protein is called the protospacer flanking sequence (PFS). This is a concept corresponding to the protospacer adjacent motif (PAM) of CRISPR/Cas9.
  • PPS protospacer flanking sequence
  • the above PFS is determined by the type of the Cas13 protein. If the PFS of the Cas13 protein is known, it can be used to design a CRISPR/Cas13 system that targets nucleic acids around the PFS.
  • the CRISPR/Cas13d system is known to not require PFS.
  • the above CRISPR/Cas13d system can cleave the corresponding nucleic acid without any other conditions (regardless of the PFS sequence) as long as the spacer of the guide RNA can be complementarily bound.
  • CRISPR/Cas13 systems have a collateral cleavage function in addition to target-specific nucleic acid cleavage activity.
  • the collateral cleavage function is activated.
  • a CRISPR/Cas13 system with the collateral cleavage function activated randomly cleaves surrounding single-stranded nucleic acids. By applying this collateral cleavage function, the CRISPR/Cas13 system can be used to detect whether a target nucleic acid is present in a sample.
  • This specification discloses a novel CRISPR/Cas13 system that has not been previously reported. This specification discloses each component of the novel CRISPR/Cas13 system. This specification discloses the function of the novel CRISPR/Cas13 system. This specification discloses the uses for which the novel CRISPR/Cas13 system can be utilized.
  • the inventors of this specification have specified components of a novel CRISPR/Cas13 system from microbial genetic sequence information disclosed in a public database. Specifically, they have specified a guide RNA comprising a Cas13 protein of SEQ ID NO: 1 and a direct repeat sequence of SEQ ID NO: 2. The inventors have manufactured a novel CRISPR/Cas13 system based on the specified information. Then, they have experimentally confirmed that the novel CRISPR/Cas13 system can cleave a nucleic acid specifically for a target. In addition, they have confirmed that the novel CRISPR/Cas13 system belongs to the Cas13d subtype and can operate without protospacer flanking sequence (PFS) restrictions. Furthermore, they have experimentally confirmed that the novel CRISPR/Cas13 system has an auxiliary cleavage function.
  • PFS protospacer flanking sequence
  • novel CRISPR/Cas13 system of this specification can target-specifically cleave single-stranded nucleic acids. Since the novel CRISPR/Cas13 system has secondary cleavage activity, it can randomly cleave any surrounding nucleic acids after recognizing the target nucleic acid. By applying these features, the novel CRISPR/cas13 system can be used for target nucleic acid detection.
  • Figure 1 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 2.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 2.1 represents the results for Example 2.1 according to Table 3, and Control represents the results when only Cas13 protein was added.
  • Figure 2 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 2.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 2.2 represents the results for Example 2.2 according to Table 3, and Control represents the results when only Cas13 protein was added.
  • Figure 3 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 2.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 2.3 represents the results for Example 2.3 according to Table 3, and Control represents the results when only Cas13 protein was added.
  • Figure 4 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 2.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 2.4 represents the results for Example 2.4 according to Table 3, and Control represents the results when only Cas13 protein was added.
  • Figure 5 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 2.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 2.5 represents the results for Example 2.5 according to Table 3, and Control represents the results when only Cas13 protein was added.
  • Figure 6 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 2.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 2.6 represents the results for Example 2.6 according to Table 3, and Control represents the results when only Cas13 protein was added.
  • Figure 7 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity by concentration according to Experimental Example 2.2.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Examples 2.2.1 to 2.2.5 represent examples of the corresponding labels disclosed in Table 4, respectively, and Control represents the results of adding only Cas13 protein.
  • Figure 8 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity by concentration according to Experimental Example 2.2.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Examples 2.5.1 to 2.5.5 represent examples of the corresponding labels disclosed in Table 4, respectively, and Control represents the results of adding only Cas13 protein.
  • Figure 9 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 3.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 3.1 represents Example 3.1 according to Table 4, and Control represents the results of adding only Cas13 protein.
  • Figure 10 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 3.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 3.2 represents Example 3.2 according to Table 4, and Control represents the results of adding only Cas13 protein.
  • Figure 11 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity over time according to Experimental Example 3.1.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Example 3.3 represents Example 3.3 according to Table 4, and Control represents the results of adding only Cas13 protein.
  • Figure 12 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity by concentration according to Experimental Example 3.2.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Examples 3.3.1 to 3.3.5 represent examples of the corresponding labels disclosed in Table 6, respectively, and Control represents the results of adding only Cas13 protein.
  • Figure 13 shows the results of measuring the fluorescence signal intensity by concentration according to Experimental Example 3.2.
  • the vertical axis of the chart represents the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time in minutes.
  • Examples 3.4.1 to 3.4.5 represent examples of the corresponding labels disclosed in Table 6, respectively, and Control represents the results of adding only Cas13 protein.
  • This specification provides a novel CRISPR/Cas13 composition
  • a Cas13 protein comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid encoding said Cas13 protein; and a programmable guide RNA, or a nucleic acid encoding said programmable guide RNA, wherein said programmable guide RNA has a structure in which a direct repeat portion and a guide domain are linked in a 5'-to-3'-end direction, said direct repeat portion interacts with said Cas13 protein to form a complex, said direct repeat portion comprises an RNA sequence of SEQ ID NO: 2, and said guide domain can complementarily bind to a predetermined target nucleic acid.
  • the nucleic acid encoding the above Cas13 protein may be DNA or mRNA, and the nucleic acid encoding the above programmable guide RNA may be DNA.
  • the novel CRISPR/Cas13 composition comprises the Cas13 protein and the programmable guide RNA, wherein the Cas13 protein and the programmable guide RNA can form a protein-RNA complex.
  • the novel CRISPR/Cas13 composition may comprise a nucleic acid encoding the Cas13 protein and a nucleic acid encoding the programmable guide RNA.
  • the nucleic acid encoding the Cas13 protein and the nucleic acid encoding the programmable guide RNA can be contained in a single vector molecule.
  • the nucleic acid encoding the Cas13 protein and the nucleic acid encoding the programmable guide RNA may each be contained in two or more vector molecules.
  • the vector may be a viral vector, a non-viral vector, or a suitable combination thereof.
  • This specification provides a method of cleaving a non-target RNA using a novel CRISPR/Cas13 system comprising: mixing the novel CRISPR/Cas13 composition with a sample, wherein the sample comprises a target RNA and a non-target RNA, and a guide domain of a programmable guide RNA of the novel CRISPR/Cas13 composition is capable of complementarily binding to the target RNA.
  • This specification provides a method of detecting a target RNA using a novel CRISPR/Cas13 system, comprising: (a) mixing the novel CRISPR/Cas13 composition, a sample, and a detection reagent, wherein a guide domain of a programmable guide RNA of the novel CRISPR/Cas13 composition can complementarily bind to the target RNA, and the detection reagent comprises a reporter, and the reporter comprises a probe nucleic acid, and when the probe nucleic acid is cleaved, the reporter generates a detectable signal, wherein when the sample comprises the target RNA, a protein-RNA complex of the novel CRISPR/Cas13 composition complementarily binds to the target RNA, and a secondary cleavage function of the protein-RNA complex is activated, thereby cleaving the probe nucleic acid; and (b) measuring the detectable signal in the mixture, wherein information about the target RNA can be obtained by measuring the detectable signal.
  • the process (b) above may be a process of measuring whether a detectable signal occurs; the intensity of the occurring signal; a change in signal intensity over time; or any combination of the above.
  • the information about the target RNA may be whether the target RNA is present, how much of the target RNA is present in the sample, or all of the above.
  • the detectable signal may be a fluorescence signal.
  • This specification provides a method for providing COVID-19 diagnostic information, comprising: (a) mixing a novel CRISPR/Cas13 complex, a sample, and a detection reagent, wherein the sample is a sample collected from a patient suspected of having COVID-19 infection, wherein the novel CRISPR/Cas13 complex comprises: a Cas13 protein of SEQ ID NO: 1; and a guide RNA, wherein the guide RNA has a structure in which a direct repeat of SEQ ID NO: 2 and a guide domain are sequentially linked from a 5' end to a 3' end, and the guide domain comprises an RNA sequence selected from SEQ ID NOs: 37 to 51, and SEQ ID NOs: 52 to 56, wherein the detection reagent comprises a reporter, wherein the reporter comprises a probe nucleic acid, and when the probe nucleic acid is cleaved, the reporter generates a fluorescent signal; (b) measuring a fluorescent signal in the mixture; And, (c) a process of analyzing
  • the process (b) above may be a process of measuring whether a fluorescence signal is generated; the intensity of the generated fluorescence signal; a change in the fluorescence signal over time; or any combination thereof.
  • amino acid single-letter notation or three-letter notation is used, and is described in the direction from the N-terminal to the C-terminal.
  • VSKN it means a peptide in which valine, serine, lysine, and asparagine are sequentially connected in the direction from the N-terminal to the C-terminal.
  • Thr-Leu-Lys it means a peptide in which threonine, leucine, and lysine are sequentially connected in the direction from the N-terminal to the C-terminal.
  • amino acids that cannot be expressed in the single-letter notation other letters are used and additional explanations are provided.
  • each amino acid is as follows: Alanine (Ala, A); Arginine (Arg, R); Asparagine (Asn, N); Aspartic acid (Asp, D); Cysteine (Cys, C); Glutamic acid (Glu, E); Glutamine (Gln, Q); Glycine (Gly, G); Histidine (His, H); Isoleucine (Ile, I); Leucine (Leu, L); Lysine (Lys K); Methionine (Met, M); Phenylalanine (Phe, F); Proline (Pro, P); Serine (Ser, S); Threonine (Thr, T); Tryptophan (Trp, W); Tyrosine (Ty, Y); and Valine (Val, V).
  • a base when referring to a base, they may be interpreted as adenine (A), thymine (T), cytosine (C), guanine (G), or uracil (U) themselves, respectively, and when referring to a nucleoside, they may be interpreted as adenosine (A), thymidine (T), cytidine (C), guanosine (G), or uridine (U), respectively, and when referring to a nucleotide in a sequence, they should be interpreted to mean a nucleotide including each of the above nucleosides.
  • the inventors of this specification discovered a novel CRISPR/Cas13 system from a known database.
  • the inventors first specified Cas13 protein and guide RNA from microbial genetic sequence information in a known database. Then, the specified Cas13 protein and guide RNA were synthesized, and a CRISPR/Cas13 complex was prepared. The inventors confirmed that the prepared CRISPR/Cas13 complex had target-specific nucleic acid cleavage activity and ancillary cleavage function, thereby completing the invention.
  • the inventors utilized genetic information known to the National Center for Biotechnology Information (NCBI). By deciphering the metagenome sequencing data of cow gut known to NCBI, they obtained genomic information on each microorganism contained in cow stomach juice. Based on the sequence information of the known Cas13 protein, they found genes encoding the CRISPR/Cas13 system among the genes of the microorganisms contained in the camel stomach. They specified the amino acid sequence of the Cas13 protein and the guide RNA sequence from the above genes. Among the candidates for the CRISPR/Cas13 system obtained in this way, the inventors selected a candidate with a particularly excellent collateral cleavage function.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • This specification discloses a novel CRISPR/Cas13 system.
  • the novel CRISPR/Cas13 system was discovered from a known database.
  • the novel CRISPR/Cas13 system can cleave a target nucleic acid. After the novel CRISPR/Cas13 system recognizes the target nucleic acid, it can also cleave any surrounding nucleic acid. In other words, the novel CRISPR/Cas13 system has both target-specific nucleic acid cleavage activity and accessory cleavage activity.
  • the novel CRISPR/Cas13 system belongs to the Cas13d subtype.
  • the novel CRISPR/Cas13 system can recognize and cleave a target nucleic acid without PFS limitation.
  • the inventors of this specification identified the novel CRISPR/Cas13 system from the known database, and experimentally verified its function to complete the invention.
  • the novel CRISPR/Cas13 system comprises a novel Cas13 protein.
  • the novel Cas13 protein is an ortholog of the Cas13 protein.
  • the novel Cas13 protein is identified from a known database, but its function or use has not been elucidated before.
  • the novel Cas13 protein can form a complex with a programmable guide RNA as described below.
  • the novel Cas13 protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence similar thereto.
  • the above Cas13 protein can recognize and exhibit the above-described target-specific nucleic acid cleavage function and/or the secondary cleavage function when 1) the target nucleic acid contains a specific sequence, and 2) a sequence adjacent to the specific sequence can complementarily bind to the guide RNA.
  • the specific sequence is called a protospacer flanking sequence (PFS).
  • the PFS is a sequence adjacent to the 5'-terminal side, the 3'-terminal side, or both ends of a sequence (target sequence) that can complementarily bind to the guide RNA.
  • the CRISPR/Cas13 system belonging to the Cas13d subtype does not require PFS.
  • the CRISPR/Cas13d system functions only as long as the target sequence can complementarily bind to the guide RNA. It has been experimentally confirmed that the novel CRISPR/Cas13 system disclosed in this specification belongs to the Cas13d subtype. Therefore, the novel CRISPR/Cas13 system can recognize the target nucleic acid and perform its function only with the programmable guide RNA without the limitation of PFS.
  • the novel CRISPR/Cas13 system comprises a programmable guide RNA.
  • the programmable guide RNA comprises a direct repeat and a guide domain.
  • the programmable guide RNA has the direct repeat and the guide domain sequentially linked from the 5'-end to the 3'-end.
  • the programmable guide RNA comprises the following structure:
  • additional domains can be included between the direct repeat portion and the guide domain as needed.
  • the above direct repeats are the portions that form the stem-loop structure.
  • the above direct repeats allow the above programmable guide RNA to interact with the above novel Cas13 protein to form a complex.
  • the nucleic acid sequence of the above direct repeats can vary depending on the above Cas13 protein.
  • the above guide domain corresponds to the spacer of the guide RNA described in the "CRISPR/Cas13 system".
  • the above guide domain is artificially designed according to a predetermined target sequence. Depending on how the above guide domain is designed, it determines which nucleic acid the above CRISPR/Cas13 system will target and function.
  • the novel CRISPR/Cas13 system above can cleave target RNA.
  • the novel CRISPR/Cas13 complex above binds to the target RNA, it can cleave it.
  • the programmable guide RNA of the novel CRISPR/Cas13 system above is designed.
  • the programmable guide RNA above is designed to be able to complementarily bind to the target RNA above.
  • the novel CRISPR/Cas13 system above has collateral cleavage activity.
  • the collateral cleavage function is activated.
  • the novel CRISPR/Cas13 system with the collateral cleavage function activated randomly cleaves surrounding single-stranded RNA.
  • the nucleic acid sequence of the single-stranded RNA cleaved by the collateral cleavage activity is unrelated to the sequence of the target RNA. Any nucleic acid sequence is cleaved by the novel CRISPR/Cas13 system with the collateral cleavage function activated.
  • the novel CRISPR/Cas13 system may refer to a complex of the Cas13 protein and the programmable guide RNA.
  • the complex may be referred to as a protein-RNA complex or a ribonucleoprotein (RNP).
  • the novel CRISPR/Cas13 system above may refer to a vector capable of expressing the Cas13 protein and the programmable guide RNA above.
  • the expression vector above is not limited in its composition or form as long as it can express each component of the novel CRISPR/Cas13 system above.
  • the expression vector above includes a nucleic acid encoding the Cas13 protein above and a nucleic acid encoding the programmable guide RNA above, and may include other components such as a promoter.
  • the expression vector above may be DNA, mRNA, or a suitable combination thereof.
  • novel CRISPR/Cas13 system may refer to a novel CRISPR/Cas13 composition.
  • the novel CRISPR/Cas13 composition comprises: the novel Cas13 protein or a nucleic acid encoding the novel Cas13 protein; and the programmable guide RNA or a nucleic acid encoding the programmable guide RNA.
  • the novel CRISPR/Cas13 system can bind to a predetermined target RNA according to the design of a programmable guide RNA (target RNA recognition function).
  • the novel CRISPR/Cas13 system can cleave the predetermined target RNA (target-specific nucleic acid cleavage activity). After the novel CRISPR/Cas13 system cleaves the predetermined target RNA, it can randomly cleave surrounding single-stranded RNAs regardless of sequence (collateral cleavage activity).
  • the CRISPR/Cas13 system can be used to cleave non-target RNAs having arbitrary nucleic acid sequences.
  • the CRISPR/Cas13 system can be used to detect whether there is a target RNA in a sample. The above uses are described in more detail below.
  • the non-target nucleic acid cleavage method utilizes the property of the novel CRISPR/Cas13 system that when it recognizes a target nucleic acid, a secondary cleavage function is activated to cleave any nucleic acid.
  • the non-target nucleic acid cleavage method includes a process of contacting a target nucleic acid and a non-target nucleic acid with the novel CRISPR/Cas13 system.
  • the novel CRISPR/Cas13 system is described in the section “Novel CRISPR/Cas13 System”.
  • the guide domain of the guide RNA of the CRISPR/Cas13 system is designed to target the target nucleic acid.
  • the novel CRISPR/Cas13 system In order to cleave the above non-target nucleic acid, the novel CRISPR/Cas13 system provided herein is used.
  • the novel CRISPR/Cas13 system is as described in “Novel CRISPR/Cas13 System”.
  • the form in which the CRISPR/Cas13 system is used may vary.
  • a novel CRISPR/Cas13 complex; an expression vector for each component of the novel CRISPR/Cas13 system; a novel CRISPR/Cas13 composition; or an appropriate combination thereof may be used.
  • the target nucleic acid refers to a nucleic acid that the novel CRISPR/Cas13 system can recognize.
  • the target nucleic acid can be hybridized with the guide domain of the programmable guide RNA of the novel CRISPR/Cas13 system.
  • the target nucleic acid includes a nucleic acid sequence complementary to the guide domain.
  • the above non-target nucleic acid is a single-stranded nucleic acid that can be cleaved by the Cas13 protein of the above novel CRISPR/Cas13 system. Unlike the above target nucleic acid, the above non-target nucleic acid has no restrictions on its sequence and length.
  • the above non-target nucleic acid cleavage method utilizes the ancillary cleavage function of the above novel CRISPR/Cas13 system.
  • the ancillary cleavage function is activated when the above novel CRISPR/Cas13 system recognizes the target nucleic acid. Therefore, it is preferable that the above non-target nucleic acid cleavage method is performed in the order in which the above novel CRISPR/Cas13 system first contacts the target nucleic acid and then contacts the non-target nucleic acid.
  • the non-target nucleic acid can be cleaved even if the target nucleic acid is contacted later.
  • the order in which the novel CRISPR/Cas13 system is contacted with the target nucleic acid and the non-target nucleic acid is not particularly important.
  • the order in which the novel CRISPR/Cas13 system is contacted with the target nucleic acid and the non-target nucleic acid can vary as needed. In some cases, the target nucleic acid and the non-target nucleic acid can be contacted with the novel CRISPR/Cas13 system at the same time.
  • the target nucleic acid detection method utilizes the ancillary cleavage activity of the novel CRISPR/Cas13 system.
  • the target nucleic acid detection method comprises the steps of mixing the novel CRISPR/Cas13 system with a sample and a detection reagent; and, measuring whether a predetermined signal is generated from the mixture.
  • the sample is a sample that is likely to contain a target nucleic acid.
  • the detection reagent comprises a reporter that generates a specific signal under specific conditions.
  • the reporter comprises a probe nucleic acid.
  • the reporter When the probe nucleic acid is cleaved, the reporter generates a detectable signal (e.g., fluorescence). If the target nucleic acid is present in the sample, the novel CRISPR/Cas13 system recognizes the target nucleic acid. When the novel CRISPR/Cas13 system recognizes the target nucleic acid, the ancillary cleavage function is activated to randomly cleave surrounding nucleic acids. As a result, when the probe nucleic acid of the reporter is cleaved, a detectable signal is generated. By measuring and analyzing the above detectable signals, it is possible to determine whether and how much of the above target nucleic acid is present in the sample.
  • a detectable signal e.g., fluorescence
  • the above method for detecting target nucleic acids using the novel CRISPR/Cas13 system is performed using a sample.
  • a sample By performing the above method, it is possible to determine whether the above sample contains the target nucleic acids and how much of the target nucleic acids it contains.
  • the above sample is a target nucleic acid detection target.
  • the above sample may have various forms as needed.
  • the above sample may contain a body fluid of a human or non-human animal.
  • the above sample may be a sample that has been appropriately pretreated with a body fluid of a human or non-human animal.
  • the novel CRISPR/Cas13 system is used to determine whether the above sample contains a target nucleic acid and how much of the target nucleic acid it contains.
  • the novel CRISPR/Cas13 system is as described in “Novel CRISPR/Cas13 System”.
  • the novel CRISPR/Cas13 system can be used in the form of a novel CRISPR/Cas13 complex, an expression vector for each component of the novel CRISPR/Cas13 system, a novel CRISPR/Cas13 composition, or a suitable combination thereof.
  • a detection reagent is used to generate a measurable signal.
  • the above detection reagent includes a reporter.
  • the above reporter includes a probe nucleic acid.
  • the above reporter emits a measurable signal when the probe nucleic acid is cleaved.
  • the measurable signal can be, for example, a fluorescent signal.
  • nucleic acids surrounding the novel CRISPR/Cas13 system are randomly cleaved.
  • the probe nucleic acid of the reporter is cleaved as a result, the reporter generates a measurable signal.
  • the above detection reagent may further comprise an additional substance.
  • the additional substance may be selected in various ways as needed.
  • the additional substance may be a substance that promotes the secondary cleavage activity of the novel CRISPR/Cas13 system.
  • the additional substance may be a substance that amplifies a measurable signal generated from the above reporter.
  • the above measurable signal is a signal that can be measured when performing the target nucleic acid detection method. This is determined by the type of reporter included in the above detection reagent. As long as the purpose of the above method can be achieved, it is not important what the above measurable signal is.
  • the signal generated from the above reporter can be various.
  • the above signal can be fluorescence of a specific wavelength.
  • the sample, the novel CRISPR/Cas13 system, and the detection reagent must all be collected in one place.
  • the above process can be expressed in various ways.
  • the sample, the novel CRISPR/Cas13 system, and the detection reagent can be mixed, mixed, reacted, contacted, or any combination of the above actions can be collected in one place.
  • the above process must be performed under conditions where the novel CRISPR/Cas13 system recognizes the target nucleic acid, the secondary cleavage function is activated to cleave the probe nucleic acid of the reporter, a measurable signal is generated from the reporter, and the series of processes of measuring the signal are not disturbed.
  • the above process is not limited in its method, environment, or place of performance. For the sake of convenience, this process will be referred to as "mixing" hereinafter.
  • the order of mixing the sample, the novel CRISPR/Cas13 system, and the detection reagent is not very important.
  • the above sample, the above novel CRISPR/Cas13 system, and the above detection reagent can be mixed at the same time, or can be mixed in any order.
  • the series of reactions described above can sufficiently occur.
  • the order of mixing the above sample, the above novel CRISPR/Cas13 system, and the above detection reagent does not significantly affect the effect of the target nucleic acid detection method.
  • the above target nucleic acid detection method includes a process of measuring the detectable signal. As described above, if there is a target nucleic acid in the sample, the reporter of the detection reagent emits a detectable signal through a series of reactions. The method of measuring the detectable signal is determined by considering what the signal is emitted and in what pattern it is emitted. The above method is not particularly limited, and a known method can be used.
  • Cas13 protein of subtype VI-D also called Cas13d protein.
  • the Cas13 protein is LDIEKILSVHINNIVYTLNNIRRKDNAEDDDFIGYMSTRNDYDTFIEPRKHNISEDAAKS IDKSRASFEEYLQPPVKDCLHYFGNTFFAPREIEKTYTDNRGFERKKKVTVNSLIDEKEI YYIFALLGGLRQFCTHDNKSGRNWLYSLEENGINSDAKAVLDKYYNSAVARIDESFVDNA SKTNFKLIFNAMDVSDEALQDNIAKAFYKFTVCKSFKNMGFSIKKLREQLLELPEYEGLK DKHYDSVRSKLYQIMDFVIYLSFKDEKFKKDNEEKINNIVNELRATLNEEDKGRVYASYA ERMKSELKPAIARLKSDIDKIKDSRVKEFELDASVKYRLSKVVESVRLKDRATYFTKLIY LTTLFLDGKEINDLLTTLIHQFENIASFIDVMNDRGIDCRFSDGYKLFESSKQIAFELRN V
  • the Cas13 protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 that is at least about 50%, at least about 51%, at least about 52%, at least about 53%, at least about 54%, at least about 55%, at least about 56%, at least about 57%, at least about 58%, at least about 59%, at least about 60%, at least about 61%, at least about 62%, at least about 63%, at least about 64%, at least about 65%, at least about 66%, at least about 67%, at least about 68%, at least about 69%, at least about 70%, at least about 71%, at least about 72%, at least about 73%, at least about 74%, at least about 75%, at least about 76%, at least about 77%, at least about 78%, at least about 79%, at least about 80%, at least about 81% or more, about 82% or more, about 83% or more, about 84% or more, about 85% or more, about 86% or more, about 87% or more, about 88% or more,
  • the Cas13 protein has the function of cleaving single-stranded nucleic acids.
  • the Cas13 protein recognizes a protospacer flanking sequence (PFS) selected from the following:
  • RNA sequences selected from 5'-N-3', 5'-NN-3', and 5'-NNN-3',
  • N is independently selected from A, U, C, or G;
  • N is independently selected from A, T, C, or G.
  • Example 7 including a modified domain
  • the Cas13 protein comprises a modified protein domain.
  • the modified protein domain of the Cas13 protein means that one or more amino acids are substituted, deleted, and/or inserted compared to the unmodified protein domain.
  • the Cas13 protein comprises a modified HEPN domain.
  • Example 10 including additional domains
  • the Cas13 protein further comprises an additional protein domain.
  • the single-stranded nucleic acid is single-stranded RNA or single-stranded DNA.
  • the programmable guide RNA has the direct repeat portion and the guide domain sequentially linked in the 5'-to-3'-terminal direction,
  • the above direct repeats can interact with Cas13 proteins of the VI-D subtype to form a complex.
  • the programmable guide RNA comprises:
  • the direct repeat portion has an RNA sequence of GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACC (SEQ ID NO: 2).
  • Example 15 including sequences similar to direct repeats
  • the direct repeat portion is about 50% or more, about 51% or more, about 52% or more, about 53% or more, about 54% or more, about 55% or more, about 56% or more, about 57% or more, about 58% or more, about 59% or more, about 60% or more, about 61% or more, about 62% or more, about 63% or more, about 64% or more, about 65% or more, about 66% or more, about 67% or more, about 68% or more, about 69% or more, about 70% or more, about 71% or more, about 72% or more, about 73% or more, about 74% or more, about 75% or more, about 76% or more, about 77% or more, about 78% or more or more, about 79% or more, about 80% or more, about 81% or more, about 82% or more, about 83% or more, about 84% or more, about 85% or more, about 86% or more, about 87% or more, about 88% or more, about 89% or more, about 90% or more, about 91%
  • the direct repeat portion is capable of interacting with the Cas13 protein of any one of Examples 1 to 11 to form a complex.
  • the guide domain has a length selected from among 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt, 29 nt, 30 nt, 31 nt, 32 nt, 33 nt, 34 nt, 35 nt, 36 nt, 37 nt, 38 nt, 39 nt, 40 nt, 41 nt, 42 nt, 43 nt, 44 nt, 45 nt, 46 nt, 47 nt, 48 nt, 49 nt, and 50 nt, or has a length within two numerical ranges selected from the numerical ranges. (e.g., 17nt to 20nt).
  • the guide domain is capable of complementary binding and/or hybridizing with a nucleic acid of the predetermined target sequence.
  • the guide domain is about 50% or more, about 51% or more, about 52% or more, about 53% or more, about 54% or more, about 55% or more, about 56% or more, about 57% or more, about 58% or more, about 59% or more, about 60% or more, about 61% or more, about 62% or more, about 63% or more, about 64% or more, about 65% or more, about 66% or more, about 67% or more, about 68% or more, about 69% or more, about 70% or more, about 71% or more, about 72% or more, about 73% or more, about 74% or more, about 75% or more, about 76% or more, about 77% or more, about 78% or more, about 79% or more, about 80% or more, about Having a sequence that is at least 81%, at least about 82%, at least about 83%, at least about 84%, at least about 85%, at least about 86%, at least about 87%, at least about 88%, at least about 89% or more, about 80% or
  • the guide domain is a sequence complementary to the predetermined target sequence, but comprises 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 mismatches.
  • the nucleic acid of the predetermined target sequence is RNA or DNA.
  • the direct repeats of the Cas13 protein and the programmable guide RNA interact to form a complex.
  • the CRISPR/Cas13 complex can bind to a target nucleic acid, and the sequence of the target nucleic acid comprises the following sequence:
  • said predetermined target sequence is about 50% or more, about 51% or more, about 52% or more, about 53% or more, about 54% or more, about 55% or more, about 56% or more, about 57% or more, about 58% or more, about 59% or more, about 60% or more, about 61% or more, about 62% or more, about 63% or more, about 64% or more, about 65% or more, about 66% or more, about 67% or more, about 68% or more, about 69% or more, about 70% or more, about 71% or more, about 72% or more, about 73% or more, about 74% or more, about 75% or more, about 76% or more, about 77% or more, about 78% or more, about 79% or more, about 80% or more, about At least 81%, at least about 82%, at least about 83%, at least about 84%, at least about 85%, at least about 86%, at least about 87%, at least about 88%, at least about 89%, at least about 90%
  • the sequence of the target nucleic acid further includes a Protospacer Flanking Sequence (PFS) recognized by the Cas13 protein.
  • PFS Protospacer Flanking Sequence
  • Example 24 the PFS is selected from the following:
  • RNA sequences selected from 5'-N-3', 5'-NN-3', and 5'-NNN-3',
  • N is independently selected from A, U, C, or G;
  • N is independently selected from A, T, C, or G.
  • the PFS in the target nucleic acid is adjacent to the 3'-terminus or the 5'-terminus of the target sequence.
  • Example 26 the PFS and the target sequence are separated by a distance of 0 nt, 1 nt, 2 nt, or 3 nt.
  • the CRISPR/Cas13 complex has a collateral cleavage function
  • the secondary cleavage function is activated to cleave any nucleic acid present in the vicinity of the CRISPR/Cas13 complex.
  • the CRISPR/Cas13 complex has a target specific cleavage function
  • the CRISPR/Cas13 complex binds to the target nucleic acid, it cleaves the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid and any nucleic acid are RNA or DNA.
  • a vector capable of expressing components of the CRISPR/Cas13 system including:
  • Example 32 contained in one vector
  • Example 31 the nucleic acid encoding the Cas13 protein and the nucleic acid encoding the programmable guide RNA are contained in one nucleic acid molecule.
  • Example 33 included in different vectors
  • Example 31 the nucleic acid encoding the Cas13 protein and the nucleic acid encoding the programmable guide RNA are each contained in nucleic acids of different molecules.
  • the vector is a non-viral vector and/or a viral vector.
  • Example 35 nonviral vector type
  • the nonviral vector is selected from a plasmid, a phage, naked DNA, a DNA complex, mRNA, and a PCR amplicon.
  • Example 36 Type of viral vector
  • the viral vector is selected from a retrovirus, a lentivirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a vaccinia virus, a poxvirus, and a herpes simplex virus.
  • nucleic acid encoding the Cas13 protein and the nucleic acid encoding the programmable guide RNA are each independently selected from DNA and RNA.
  • the nucleic acid encoding the Cas13 protein is TTTTGAAAATGTTAAACAGGGCGCAAATACTGAGGGCGAATCCTCAGGAGTCAATTGACAAGGCACAGAAGCAGGGACTGATTTCTTTGTACTTAACCGTTCTATATCTTTTGACAAAGAATCTTGTTTATGTAAACTCACGCTATTTTCTTGCATTCCATTGTCTTGAGCGTGATGCGCAGC TGCTTGGAAGCGGTGCTGGGCATCATGAGCCTTATGTTGCTCTTACTCAGCGCTTTATTAATGAAGATAAGCTCAATGAGCATGCCTGCGAATATCTTAAGACCAATATTGCAAATTCGGATGAATATACAATTAGAATATTCCGCAATAATGCTGCTCACTTGAGTGCTGTTAGAAATGCA AATCTGTATATTGCATTAAAATATTAAATAATGCTGCTCACTTGAGTGCTGTTAGAAATGCA AATCTGTATATTGACAAGTTAAATAATGCTGCTCACTTGAGTGCTGTTAGAAATGCA AATCTGT
  • a CRISPR/Cas13 composition comprising:
  • a programmable guide RNA according to any one of Examples 12 to 21, or a nucleic acid encoding said programmable guide RNA.
  • the CRISPR/Cas13 composition comprises the Cas13 protein and the programmable guide RNA, and the Cas13 protein and the programmable guide RNA combine to form a ribonucleoprotein.
  • Example 40 the CRISPR/Cas13 composition comprises a CRISPR/Cas13 complex of any one of Examples 22 to 30.
  • the CRISPR/Cas13 composition comprises a nucleic acid encoding the Cas13 protein and a nucleic acid encoding the programmable guide RNA.
  • the CRISPR/Cas13 composition comprises an expression vector of each component of the CRISPR/Cas13 system of any one of Examples 31 to 38.
  • Example 44 protein-encoding nucleic acid and guide RNA
  • the CRISPR/Cas13 composition comprises a nucleic acid encoding the Cas13 protein and the programmable guide RNA.
  • Example 45 mRNA-limited
  • Example 44 the nucleic acid encoding the Cas13 protein is mRNA.
  • Example 46 Composition for detecting target nucleic acid
  • Detection reagents including:
  • a reporter comprising a probe nucleic acid
  • the reporter when the probe nucleic acid is cleaved, the reporter generates a detectable signal.
  • the detectable signal is a fluorescence signal.
  • a method for cleaving a non-target nucleic acid using a CRISPR/Cas13 system comprising:
  • the target nucleic acid has 1) a predetermined target sequence, and 2) a PFS recognized by the Cas13 protein of the CRISPR/Cas13 complex,
  • the guide domain of the programmable guide RNA of the above CRISPR/Cas13 complex is designed to target the predetermined target sequence
  • the above non-target nucleic acid has a different sequence from the target nucleic acid
  • the secondary cleavage function is activated, thereby cleaving the non-target nucleic acid.
  • Example 48 the process of contacting the CRISPR/Cas13 complex with the target nucleic acid and the non-target nucleic acid is performed in a selected order among the following:
  • Example 51 Method for detecting target nucleic acid
  • a method for detecting a target nucleic acid using a CRISPR/Cas13 system comprising:
  • the target nucleic acid has 1) a predetermined target sequence, and 2) a PFS recognized by the Cas13 protein of the CRISPR/Cas13 complex,
  • the guide domain of the programmable guide RNA of the above CRISPR/Cas13 complex is designed to target the predetermined target sequence
  • the target nucleic acid When the target nucleic acid is present in the sample, the target nucleic acid binds to the CRISPR/Cas13 complex and the secondary cleavage activity is activated, whereby the probe nucleic acid included in the reporter can be cleaved by the Cas13 complex.
  • the reporter When the probe nucleic acid contained in the reporter of the above detection reagent is cleaved, the reporter generates a detectable signal
  • the presence or absence of the target nucleic acid and/or the amount present in the sample can be derived, found out, measured, determined, detected and/or analyzed from the detectable signal.
  • Example 51 the process of blending, mixing, reacting, and/or contacting the sample, the CRISPR/Cas13 complex of any one of Examples 22 to 30, and the detection reagent of any one of Examples 46 to 47 is performed in a selected order among the following:
  • the method for detecting a target nucleic acid using the CRISPR/Cas13 system is a method for detecting whether the sample contains a nucleic acid of a COVID-19 virus.
  • Example 54 COVID-19 N-gene, E-gene detection method
  • the target nucleic acid is ucugauaauggaccccaaaaucagcgaaaugcaccccgcauuacguuugguggacccucagauucaacuggcaguaaccagaauggagaacgcaguggggcgcgaucaaaacaacgucggc cccaagguuuacccaauaauacugcgucuugguucaccgcucucacucaacauggcaaggaagaccuuaaauucccucgaggacaaggcguuccaauuaacaccaauagcaguccagaugac caaauuggcuacuaccgaagagcuaccagacgaauucgugguggugacgguaaaaaugaaagaucucaguccaagaugguauuucuacuaccuaggaacugggccagaagcuggacucccuau ggugcuaaaacaaagacggcaaaaggcguuccaauuaacaccaaua
  • the target sequence of the target nucleic acid is CGCAUUACGUUUGGUGGACC (SEQ ID NO: 57), UUCAACUGGCAGUAACCAGA (SEQ ID NO: 58), UUACAAACAUUGGCCGCAAA (SEQ ID NO: 59), GGGAGCCUUGAAUACACCAA (SEQ ID NO: 60), CACAUUGGCACCCGCAAUCC (SEQ ID NO: 61), AAUGCUGCAAUCGUGCUACA (SEQ ID NO: 62), GGGGAACUUCUCCUGCUAGA (SEQ ID NO: 63), CUUUGCUGCUGCUUGACAGA (SEQ ID NO: 64), CAGCUUGAGAGCAAAAUGUC (SEQ ID NO: 65), GAUUCAACUGGCAGUAACCA (SEQ ID NO: 66), CACAUUGGCACCCGCAAUCCU (SEQ ID NO: 67), AAUGCUGCAAUCGUGCUACAA (SEQ ID NO: 68), A nucleic acid
  • the guide domain of the programmable guide RNA of the CRISPR/Cas13 complex is ggUccaccaaacgUaaUgcg (SEQ ID NO: 37), UCUGGUUACUGCCAGUUGAA (SEQ ID NO: 38), UUUgcggccaaUgUUUgUaa (SEQ ID NO: 39), UUGGUGUAUUCAAGGCUCCC (SEQ ID NO: 40), GGAUUGCGGGUGCCAAUGUG (SEQ ID NO: 41), UGUAGCACGAUUGCAGCAUU (SEQ ID NO: 42), UCUAGCAGGAGAAGUUCCCC (SEQ ID NO: 43), UCUGUCAAGCAGCAGCAAAG (SEQ ID NO: 44), GACAUUUUGCUCUCAAGCUG (SEQ ID NO: 45), UggUUacUgccagUUgaaUc (SEQ ID NO: 46), A nucleic acid sequence selected from among aggaUUgcgggU
  • the programmable guide RNA of the CRISPR/Cas13 complex is GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUggUUacUgccagUUgaaUc (SEQ ID NO: 16), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCaggaUUgcgggUgccaaUgUg (SEQ ID NO: 17), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUUgUagcacgaUUgcagcaUUU (SEQ ID NO: 18), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCCAAAUUGUGCAAUUUGCGGCCAA (SEQ ID NO: 19), GAAACGUACUACACCCUUUUGUAAGGGUCUGAAACCGCCAAUGUUUGUAAUCAGUUCCU (SEQ ID NO: 20), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCGCCAAUGU
  • Example 58 for use in detecting target nucleic acid
  • the novel Cas13 protein expression vector manufactured in Experimental Example 1.2 was induced intracellularly, and the novel Cas13 protein was manufactured in various E. coli strains (NiCo21 (DE3), T7 Express lysY/Iq, NEB® Express Iq) under various growth conditions (medium, temperature, induction conditions, etc.), and the manufactured amount was tested through SDS-PAGE analysis.
  • the E. coli cells were transformed with the plasmid vector prepared in Experimental Example 1.2 according to the manufacturer's instructions.
  • a single colony was grown overnight in Luria-Bertani broth containing 100 ug ml-1 of ampicillin at 37°C.
  • the cells were diluted 1:200 in 250 ml of the same medium and grown at 37°C until the OD600 reached 0.70 to 0.75.
  • the culture was incubated at room temperature for 1 hour, and protein expression was induced with 0.5 mM isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranoside by incubation for 16-18 hours with shaking (220 rpm) at 23°C.
  • the cells were pelleted by centrifugation at ⁇ 4000 g for 20 min and stored in a refrigerator at -20°C.
  • frozen cells Prior to purification of the novel Cas13 protein, frozen cells were resuspended in sonication buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 5% glycerol, 0.2% Tween20, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1x Halt Protease Inhibitor Cocktail (Fisher Scientific), 40 mM imidazole at 25°C) using 5 ml of buffer per 1 g of pellet.
  • sonication buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 5% glycerol, 0.2% Tween20, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1x Halt Protease Inhibitor Cocktail (Fisher Scientific), 40 mM imidazole at 25°C) using 5 ml of buffer per 1 g of pellet.
  • the pellets suspended in the above sonication buffer were sonicated using a Qsonica Microtip Probe 420-A at 30% amp per 30 mL of sample, 5 sec ON/15 sec OFF, on ice for 4 x 2 min (interval treatment was performed to prevent overheating).
  • the sample after the above sonication was centrifuged at 40,000 g for 1 hour to remove cell debris.
  • the novel Cas13 protein was obtained by eluting the column with a linear gradient of imidazole with increasing concentration from 40 mM to 700 mM at 25°C, 0.5 M NaCl to 20 mM Tris-HCl, pH 7.5.
  • crRNA The programmable guide RNA (hereinafter also referred to as crRNA) of the novel CRISPR/Cas13 system specified in Experimental Example 1.1 was synthesized through in vitro transcription using TranscriptAid T7 High Yield Transcription kit (Thermo fisher) or HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kits (New England Biolabs).
  • a fragment containing a T7 promoter at the proximal end of the crRNA coding sequence was generated by PCR using a primer as a template, or a T7 primer oligonucleotide was annealed to a single-stranded template oligonucleotide.
  • the manufactured crRNA was purified using the RNeasy MiniElute Cleanup Kit (Qiagen) or the Monarch RNA Cleanup Kit (50 ⁇ g) (New England Biolabs).
  • the primers used in the above in vitro transcription are as follows:
  • the reaction solution was prepared by mixing 1x NEB 2.0 buffer, 0.6 U/uL Rnase Inhibitor, 12.5 nM Rnase alert (IDT reporter), target RNA at various concentrations (0.1 - 100 ng/uL) depending on the experimental example, and 100 uL of purified water containing no nuclease.
  • the above mixture was loaded into 384-well (SPL) and incubated at 37°C for up to 1 h in a fluorescence plate reader (TECAN, Infinite 200 Pro M Plex), and fluorescence measurements were performed every 3 min ( ⁇ ex: 535 nm; ⁇ em: 485 nm, gain: -135).
  • TECAN Infinite 200 Pro M Plex
  • the target nucleic acid corresponds to the N-gene of COVID-19, and the sequence is as follows:
  • compositions of each novel CRISPR/Cas13 complex used in Experimental Example 2.1 are shown in the following table:
  • compositions of each novel CRISPR/Cas13 complex used in Experimental Example 2 are shown in the following table:
  • compositions of each novel CRISPR/Cas13 complex used in Experimental Example 3.1 are shown in the following table:
  • the target nucleic acid corresponds to the E-gene of COVID-19, and the sequence is as follows:
  • compositions of each novel CRISPR/Cas13 complex used in Experimental Example 3.2 are shown in the following table:
  • Example 3.4.5 the detection limit is exceeded after 4 minutes of reaction, for Example 3.4.4, after 8 minutes of reaction, and for Example 3.4.3, after 14 minutes of reaction, and the figure of 65000 is inserted to fill in the data points.
  • the invention disclosed in this specification relates to a novel CRISPR/Cas13 system.
  • the novel CRISPR/Cas13 system is capable of cleaving a nucleic acid in a target-specific manner and, additionally, of cleaving any nucleic acid.
  • the novel CRISPR/Cas13 system can be used for non-target nucleic acid cleavage or for target nucleic acid detection.

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Abstract

이 명세서에서는 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 개시한다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 공지 데이터베이스로부터 발굴되었다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 표적-특이적 핵산 절단 활성과 부수적 절단 활성을 모두 가진다. 이 명세서의 발명자들은 공지 데이터베이스로부터 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 특정하고, 실험을 통해 그 기능을 실증하여 발명을 완성하였다.

Description

신규 CRISPR/CAS13 시스템 및 그 용도
이 명세서는 Class 2 중 Type VI CRISPR/Cas 시스템에 속하는 CRISPR/Cas13 시스템에 대한 기술을 다룬다.
CRISPR/Cas13 시스템
CRISPR/Cas13 시스템 개괄
이 명세서에서는 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 개시한다. 위 CRISPR/Cas13 시스템은 CRISPR/Cas 시스템의 한 종류이다. 위 CRISPR/Cas13 시스템은 이펙터 단백질 (Cas13 단백질) 및 가이드 RNA를 포함한다. 위 CRISPR/Cas13 시스템은 가이드 RNA의 스페이서 서열과 상보적인 서열, 그리고 프로토스페이서 측면 서열 (Protospacer Flanking Sequence; PFS)을 가지는 단일가닥 RNA를 인식하고, 이를 절단한다. 어떤 CRISPR/Cas13 시스템은 위 단일가닥 RNA를 절단한 후, 부수적 절단 활성이 활성화되어 주변의 단일가닥 RNA를 무작위로 절단한다.
이하 CRISPR/Cas13 시스템의 구조 및 기능에 대해 더 자세히 설명한다.
CRISPR/Cas13 시스템 분류
CRISPR/Cas13 시스템은 Class 2 중 Type VI CRISPR/Cas 시스템에 속한다. 상기 CRISPR/Cas13 시스템은 다시 Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas13x, Cas13y 등 몇 가지 서브타입으로 나뉜다. 위 서브타입은 각각 IV-a, IV-b, IV-c, IV-d, IV-x, 및 IV-y로 지칭되기도 한다. 각각의 서브타입에 속하는 CRISPR/Cas13 시스템은 Cas13 단백질 크기, 가이드 RNA의 구조 등에서 약간의 차이점을 보인다.
CRISPR/Cas13 시스템 구성 및 기능
CRISPR/Cas13 시스템은 Cas13 단백질 및 이에 대한 가이드 RNA를 포함한다. 위 Cas13 단백질 및 위 가이드 RNA는 복합체를 이루어 작용한다. 위 단백질-RNA 복합체는 표적 핵산과 결합하여 (표적 핵산을 인식하여) 그 핵산을 절단할 수 있다. 또한, 어떤 단백질-RNA 복합체는 표적 핵산을 절단한 후, 주변에 있는 임의의 핵산을 절단하는 부수적 절단 활성이 있다. 위 Cas13 단백질-가이드 RNA 복합체는 RNP (Ribonucleoprotein)으로 지칭하기도 한다. 위 Cas13 단백질은 PFS (Protospacer Flanking Sequence)를 인식하고, 핵산을 절단할 수 있다. 위 가이드 RNA는 표적 서열을 가지는 표적 핵산에 결합함으로써 위 Cas13 단백질-가이드 RNA 복합체를 표적 핵산으로 가이드할 수 있다.
위 CRISPR/Cas13 시스템은 단일가닥 RNA를 표적 핵산으로 하여 기능한다고 알려져 있다.
Cas13 단백질의 구조
Cas13 단백질은 크게 REC (RECognition) lobe 및 NUC (NUClease) lobe로 나눌 수 있다. 위 NUC lobe는 두 개의 HEPN (Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding) 도메인을 포함한다. 위 REC lobe는 상기 Cas13 단백질이 가이드 RNA를 인식하여 복합체를 이루는 데 중요한 부분이다. 위 NUC lobe는 핵산을 절단한다. Cas13 단백질의 구조는 여러 연구자들이 이미 보고한 바 있다. 예를 들어, Xue et. al (Engineering CRISPR/Cas13 System against RNA Viruses: From Diagnostics to Therapeutics. Bioengineering (Basel), 2022 Jul; 9(7): 291)에 자세히 설명되어 있다.
가이드 RNA의 구조
CRISPR/Cas13 시스템의 가이드 RNA는 CRISPR/Cas9 시스템의 가이드 RNA와는 달리 단일 RNA 분자로 이뤄져 있다. 이를 crRNA라 한다. 상기 가이드 RNA는 직접 반복부(direct repeat) 및 스페이서를 포함한다.
상기 직접 반복부와 스페이서는 연결구조는 상기 CRISPR/Cas13 시스템의 서브타입에 따라 다르다. 예를 들어, Cas13a와 Cas13d 서브타입의 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단으로 직접 반복부 및 스페이서가 순서대로 연결되어 있다. 반면, Cas13b 서브타입의 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 스페이서 및 직접 반복부가 순서대로 연결되어 있다.
CRISPR/Cas13 시스템의 표적-특이적 핵산 절단 활성 및 PFS (Protospacer Flanking Sequence)
CRISPR/Cas13 시스템은 표적 특이적으로 핵산을 절단할 수 있다. 표적-특이적 핵산 절단 활성이 발휘되기 위해 두 가지 조건이 필요하다. 첫째로, 핵산 내에 Cas13 단백질이 인식할 수 있는 일정 길이의 염기 서열이 있어야 한다. 둘째로, 상기 일정 길이의 염기 서열 주변에 가이드 RNA에 포함된 스페이서와 상보적으로 결합할 수 있는 서열이 있어야 한다. 1) Cas13 단백질이 상기 일정 길이의 염기 서열을 인식하고, 2) 상기 스페이서가 상기 일정 길이의 염기 서열 주변 부분과 상보적으로 결합하면 위 CRISPR/Cas13 시스템은 그 핵산을 절단한다. 이때, 상기 Cas13 단백질에 의해 인식되는 일정 길이의 염기 서열을 프로토스페이서 측면 서열 (Protospacer Flanking Sequence; PFS)라 한다. 이는, CRISPR/Cas9의 프로토스페이서 인접 모티브 (Protospacer Adjacent Motif; PAM)에 대응되는 개념이다.
상기 PFS는 상기 Cas13 단백질의 종류에 따라 정해진다. 상기 Cas13 단백질의 PFS를 안다면, 이를 사용하여 PFS 주변의 핵산을 표적화하는 CRISPR/Cas13 시스템을 설계할 수 있다.
Cas13 서브타입 중 CRISPR/Cas13d 시스템은 PFS가 필요하지 않다고 알려졌다. 위 CRISPR/Cas13d 시스템은 가이드 RNA의 스페이서가 상보적으로 결합할 수만 있으면, 다른 조건 없이 (PFS 서열 여부와는 관련없이) 해당 핵산을 절단할 수 있다.
CRISPR/Cas13 시스템의 부수적 절단 활성 (collateral cleavage activity)
어떤 CRISPR/Cas13 시스템은 표적-특이적 핵산 절단 활성 외 부수적인 절단 기능(collateral cleavage function)을 가진다. 위 CRISPR/Cas13 시스템이 표적 핵산을 인식하면 부수적 절단 기능이 활성화된다. 부수적 절단 기능이 활성화된 CRISPR/Cas13 시스템은 주변에 있는 단일가닥 핵산을 무작위로 절단한다. 이러한 부수적 절단 기능을 응용하면, CRISPR/Cas13 시스템을 이용하여 샘플 내 표적 핵산이 있는 지 검출할 수 있다.
이 명세서를 통해 기존에 보고된 바 없는 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 개시하고자 한다. 이 명세서를 통해 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 각 구성 요소를 개시하고자 한다. 이 명세서를 통해 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 기능을 밝히고자 한다. 이 명세서를 통해 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 어떤 용도로 활용할 수 있는 지 밝히고자 한다.
이 명세서의 발명자들은 공지 데이터베이스에 개시된 미생물 유전 서열 정보로부터 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 구성요소를 특정하였다. 구체적으로, 서열번호 1의 Cas13 단백질과 서열번호 2의 직접 반복부 서열을 포함하는 가이드 RNA를 특정하였다. 위 발명자들은 특정된 정보를 토대로 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 제조하였다. 그리고, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 표적 특이적으로 핵산을 절단할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다. 덧붙여, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 Cas13d 서브타입에 속하며, 프로토스페이서 측면 서열 (Protospacer Flanking Sequence; PFS) 제한 없이 동작할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 부수적 절단 기능을 가짐을 실험을 통해 확인하였다.
발명자들은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 비표적 핵산 절단, 또는 표적 핵산 검출에 사용할 수 있음을 알아냈다. 위 발명자들은 비표적 핵산을 절단하는 방법, 그리고 표적 핵산을 검출하는 방법을 구체적으로 제시하였고, 이를 실증하였다.
이 명세서의 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 단일가닥 핵산을 표적 특이적으로 절단할 수 있다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 부수적 절단 활성을 가지므로, 표적 핵산을 인식한 후 주변의 임의의 핵산을 무작위로 절단할 수 있다. 이러한 특징을 응용하면, 위 신규 CRISPR/cas13 시스템을 표적 핵산 검출에 사용할 수 있다.
도 1은 실험예 2.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 2.1은 표 3에 따른 Example 2.1에 대한 결과를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 2는 실험예 2.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 2.2은 표 3에 따른 Example 2.2에 대한 결과를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 3은 실험예 2.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 2.3은 표 3에 따른 Example 2.3에 대한 결과를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 4는 실험예 2.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 2.4은 표 3에 따른 Example 2.4에 대한 결과를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 5는 실험예 2.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 2.5은 표 3에 따른 Example 2.5에 대한 결과를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 6은 실험예 2.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 2.6은 표 3에 따른 Example 2.6에 대한 결과를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 7은 실험예 2.2에 따라 농도 별 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 2.2.1 내지 Example 2.2.5는 각각 표 4에 개시된 해당 레이블의 실시예를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 8은 실험예 2.2에 따라 농도 별 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 2.5.1 내지 Example 2.5.5는 각각 표 4에 개시된 해당 레이블의 실시예를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 9는 실험예 3.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 3.1은 표 4에 따른 Example 3.1을, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 10은 실험예 3.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 3.2은 표 4에 따른 Example 3.2을, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 11은 실험예 3.1에 따라 시간에 따른 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 3.3은 표 4에 따른 Example 3.3을, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 12는 실험예 3.2에 따라 농도 별 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 3.3.1 내지 Example 3.3.5는 각각 표 6에 개시된 해당 레이블의 실시예를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
도 13은 실험예 3.2에 따라 농도 별 형광 신호 강도를 측정한 결과이다. 차트의 세로축은 상대적인 형광 세기, 가로축은 분으로 나타낸 반응 시간을 의미한다. Example 3.4.1 내지 Example 3.4.5는 각각 표 6에 개시된 해당 레이블의 실시예를, Control은 Cas13 단백질만을 첨가한 결과를 나타낸다.
이하, 발명의 실시를 위한 최선의 형태를 예시적으로 개시한다. 이는 본 명세서에서 개시되는 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다. 본 단락에 서술된 실시예는 예시에 불과하며, 본 단락에 서술된 구현예만이 "본 발명의 최선의 형태"라고 이해되면 안 된다. 통상의 기술자라면 본 단락에 서술된 예시에 대한 많은 변형 및 보다 바람직한 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이며, 그러한 내용 또한 본 발명의 실시를 위한 최선의 형태에 포함된다고 보아야 한다.
이 명세서는 다음을 포함하는 신규 CRISPR/Cas13 조성물을 제공한다: 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 Cas13 단백질, 또는 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산; 그리고 프로그램 가능한 가이드 RNA, 또는 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산, 위 프로그램 가능한 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 직접 반복부와 가이드 도메인이 연결된 구조를 가지고, 위 직접 반복부는 위 Cas13 단백질과 상호작용하여 복합체를 형성하고, 위 직접 반복부는 서열번호 2의 RNA 서열을 포함하고, 위 가이드 도메인은 미리 결정된 표적 핵산과 상보적으로 결합할 수 있음.
일 실시예로, 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산은 DNA 또는 mRNA이고, 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 DNA일 수 있다.
일 실시예로, 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물은 위 Cas13 단백질과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 포함하고, 위 Cas13 단백질과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA는 단백질-RNA 복합체를 형성할 수 있다.
일 실시예로, 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물은 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
일 실시예로, 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 한 분자의 벡터에 포함될 수 있다.
일 실시예로, 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 두 분자 이상의 벡터에 각각 포함될 수 있다.
일 실시예로, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 또는 이들의 적절한 조합일 수 있다.
이 명세서는 다음을 포함하는 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 사용하여 비표적 RNA를 절단하는 방법을 제공한다: 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물을 샘플과 혼합하는 과정, 여기서, 상기 샘플은 표적 RNA 및 비표적 RNA를 포함하고, 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물의 프로그램 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인은 위 표적 RNA와 상보적으로 결합할 수 있음.
이 명세서는 다음을 포함하는, 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 사용하여 표적 RNA를 검출하는 방법을 제공한다: (a) 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물, 샘플, 그리고 검출 시약을 혼합하는 과정, 여기서, 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물의 프로그램 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인은 위 표적 RNA와 상보적으로 결합할 수 있고, 위 검출 시약은 리포터를 포함하고, 위 리포터는 프로브 핵산을 포함하고, 위 프로브 핵산이 절단되면 위 리포터는 검출 가능한 신호를 생성함, 여기서, 위 샘플이 위 표적 RNA를 포함하는 경우, 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물의 단백질-RNA 복합체가 위 표적 RNA와 상보적으로 결합하고, 위 단백질-RNA 복합체의 부수적 절단 기능이 활성화되고, 이에 따라 위 프로브 핵산이 절단됨; 그리고 (b) 위 혼합물에서 위 검출 가능한 신호를 측정하는 과정, 위 검출 가능한 신호를 측정하여 위 표적 RNA에 대한 정보를 얻을 수 있음.
일 실시예로, 위 (b) 과정은 위 검출 가능한 신호의 발생 여부; 발생하는 신호의 강도; 신호 강도의 시간에 따른 변화; 또는 위 사항의 임의의 조합을 측정하는 과정일 수 있다.
일 실시예로, 위 표적 RNA에 대한 정보는 위 표적 RNA가 존재하는 지 여부, 위 표적 RNA가 샘플 내에 얼마나 포함되었는 지 여부, 또는 위 사항 모두일 수 있다.
일 실시예로, 위 검출 가능한 신호는 형광 신호일 수 있다.
이 명세서에서는 다음을 포함하는, COVID-19 진단 정보 제공 방법을 제공한다: (a) 신규 CRISPR/Cas13 복합체, 검체, 그리고 검출 시약을 혼합하는 과정, 여기서, 위 검체는 COVID-19 감염이 의심되는 환자에서 채취한 검체이고, 여기서, 위 신규 CRISPR/Cas13 복합체는 다음을 포함함: 서열번호 1의 Cas13 단백질; 그리고 가이드 RNA, 여기서, 위 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 서열번호 2의 직접 반복부와 가이드 도메인이 순차적으로 연결된 구조이고, 위 가이드 도메인은 서열번호 37 내지 서열번호 51, 그리고 서열번호 52 내지 서열번호 56 중 선택된 RNA 서열을 포함함, 여기서, 위 검출 시약은 리포터를 포함하고, 위 리포터는 프로브 핵산을 포함하고, 위 프로브 핵산이 절단되면 위 리포터는 형광 신호를 생성함; (b) 위 혼합물에서 형광 신호를 측정하는 과정; 그리고, (c) 위 형광 신호를 분석하여 검체를 제공한 환자가 COVID-19에 감염되었는 지에 대한 정보를 얻는 과정.
일 실시예로, 위 (b) 과정은 형광 신호 발생 여부; 발생하는 형광 신호의 강도; 형광 신호의 시간에 따른 변화; 또는 이들의 임의의 조합을 측정하는 과정임일 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 구현예와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양하게 구현될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정 구현예로 제한되지 않는다. 이러한 구현예들은 본 명세서에 적용되는 법적 요건을 만족시키기 위해 제공되는 것으로 보아야 한다. 본 명세서에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 명세서에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
용어의 정의
약
본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1%, 또는 0% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
아미노산 서열 표기
달리 서술하지 않는 한, 본 명세서에서 아미노산 서열을 기재할 때는 아미노산 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법을 사용하여, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 기재한다. 예를 들어, VSKN으로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 발린(Valine), 세린(Serine), 리신(Lysine), 및 아스파라긴(Asparagine)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 또 다른 예를 들어, Thr-Leu-Lys로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 트레오닌(Threonine), 류신(Leucine), 및 리신(Lysine)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 상기 일문자 표기법으로 나타낼 수 없는 아미노산의 경우, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다.
각각의 아미노산 표기 방법은 다음과 같다: 알라닌(Alanine; Ala, A); 아르기닌(Arginine; Arg, R); 아스파라긴(Asparagine; Asn, N); 아스파르트산(Aspartic acid; Asp, D); 시스테인(Cysteine; Cys, C); 글루탐산(Glutamic acid; Glu, E); 글루타민(Glutamine; Gln, Q); 글리신(Glycine; Gly, G); 히스티딘(Histidine; His, H); 이소류신(Isoleucine; Ile, I); 류신(Leucine; Leu, L); 리신(Lysine; Lys K); 메티오닌(Methionine; Met, M); 페닐알라닌(Phenylalanine; Phe, F); 프롤린(Proline; Pro, P); 세린(Serine; Ser, S); 트레오닌(Threonine; Thr, T); 트립토판(Tryptophan; Trp, W); 티로신(Tyrosine; Tyr, Y); 및 발린(Valine; Val, V).
핵산 서열 표기
본 명세서에서 사용되는 A, T, C, G 및 U 기호는 당업계 통상의 기술자가 이해하는 의미로 해석된다. 문맥 및 기술에 따라 DNA 또는 RNA 상에서 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 적절히 해석될 수 있다. 예를 들어, 염기를 의미하는 경우는 각각 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U) 자체로 해석될 수 있고, 뉴클레오사이드를 의미하는 경우는 각각 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 유리딘(U)으로 해석될 수 있으며, 서열에서 뉴클레오타이드를 의미하는 경우는 상기 각각의 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
공지 데이터베이스로부터 신규 CRISPR/Cas13 시스템 발굴
이 명세서의 발명자들은 공지 데이터베이스로부터 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 발굴하였다. 위 발명자들은 먼저 공지된 데이터베이스의 미생물 유전 서열 정보로부터 Cas13 단백질과 가이드 RNA를 특정하였다. 그 후, 특정된 Cas13 단백질과 가이드 RNA를 합성하고, CRISPR/Cas13 복합체를 제조하였다. 위 발명자들은 제조된 CRISPR/Cas13 복합체가 표적-특이적 핵산 절단 활성과 부수적 절단 기능이 있음을 확인하여 발명을 완성하였다.
구체적으로, 위 발명자들은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 공지된 유전자 정보를 활용하였다. NCBI에 공지된 소 위(gut)의 메타지놈 (metagenome) 시퀀싱 데이터를 해독하여 소 위즙에 포함된 각 미생물에 대한 유전체 정보를 얻었다. 알려진 Cas13 단백질의 서열 정보를 토대로 낙타 위에 포함된 미생물의 유전자 중 CRISPR/Cas13 시스템을 암호화하는 유전자들을 찾았다. 위 유전자로부터 Cas13 단백질의 아미노산 서열과 가이드 RNA 서열을 특정했다. 위 발명자들은 이렇게 얻어진 CRISPR/Cas13 시스템 후보군 중, 부수적 절단 기능(collateral cleavage function)이 특히 우수한 후보를 선별했다.
신규 CRISPR/Cas13 시스템
신규 CRISPR/Cas13 시스템 개괄
이 명세서에서는 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 개시한다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 공지 데이터베이스로부터 발굴되었다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 표적 핵산을 절단할 수 있다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 표적 핵산을 인식한 후 주변의 임의의 핵산 또한 절단할 수 있다. 달리 표현해, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 표적-특이적 핵산 절단 활성과 부수적 절단 활성을 모두 가진다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 Cas13d 서브타입에 속한다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 PFS 제한 없이 표적 핵산을 인식하고 절단할 수 있다. 이 명세서의 발명자들은 공지 데이터베이스로부터 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 특정하고, 실험을 통해 그 기능을 실증하여 발명을 완성하였다.
신규 Cas13 단백질 - 아미노산 서열
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 신규 Cas13 단백질을 포함한다. 위 신규 Cas13 단백질은 Cas13 단백질의 오소로그(ortholog)이다. 위 신규 Cas13 단백질은 공지된 데이터베이스로부터 특정된 것이나, 이전까지 그 기능이나 용도가 밝혀진 바 없다. 위 신규 Cas13 단백질은 이하 설명할 프로그램 가능한 가이드 RNA와 복합체를 이룰 수 있다. 위 신규 Cas13 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이와 유사한 아미노산 서열을 포함한다.
신규 Cas13 단백질 - PFS 서열
상기 Cas13 단백질은 1) 표적 핵산이 특정 서열을 포함하고, 2) 위 특정 서열과 인접한 서열이 가이드 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 경우, 이를 인식하여 전술한 표적-특이적 핵산 절단 기능 및/또는 부수적 절단 기능을 발휘할 수 있다. 이때, 위 특정 서열을 프로토스페이서 측면 서열 (Protospacer Flanking Sequence; PFS)라 한다. 상기 PFS는 가이드 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 서열 (표적 서열)의 5'-말단 쪽, 3'-말단 쪽, 또는 양쪽 말단 모두에 인접한 서열이다.
신규 Cas13 단백질 - PFS 서열, Cas13d 서브타입의 경우
Cas13d 서브타입에 속하는 CRISPR/Cas13 시스템은 PFS가 필요하지 않다고 알려져 있다. CRISPR/Cas13d 시스템은 표적 서열이 가이드 RNA와 상보적으로 결합할 수 있기만 하면 기능한다. 이 명세서에서 개시하는 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 Cas13d 서브타입에 속한다는 사실이 실험을 통해 확인되었다. 따라서, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 PFS의 제한 없이 프로그램 가능한 가이드 RNA 만으로도 표적 핵산을 인식하고, 그 기능을 발휘할 수 있다.
프로그램 가능한 가이드 RNA - 가이드 RNA 구조
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 프로그램 가능한 가이드 RNA를 포함한다. 위 프로그램 가능한 가이드 RNA는 직접 반복부 (direct repeat) 및 가이드 도메인을 포함한다. 위 프로그램 가능한 가이드 RNA는 5'-말단에서 3'-말단 방향으로, 상기 직접 반복부 및 가이드 도메인이 순차적으로 연결되어 있다. 달리 표현하여, 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA는 다음 구조를 포함한다:
5' - (직접 반복부) - (가이드 도메인) - 3'
여기서, 필요에 따라 직접 반복부와 가이드 도메인 사이에 추가 도메인이 더 포함될 수 있다.
각각의 도메인에 대해서는 이하 더 구체적으로 설명한다.
프로그램 가능한 가이드 RNA - 직접 반복부
위 직접 반복부는 스템-루프 구조를 형성하는 부분이다. 위 직접 반복부는 위 프로그램 가능한 가이드 RNA가 위 신규 Cas13 단백질과 상호작용하여 복합체를 이루도록 한다. 위 직접 반복부의 핵산 서열은 위 Cas13 단백질에 따라 달라질 수 있다.
프로그램 가능한 가이드 RNA - 가이드 도메인
위 가이드 도메인은 《CRISPR/Cas13 시스템》에서 설명한 가이드 RNA의 스페이서에 대응된다. 위 가이드 도메인은 미리 결정된 표적 서열에 따라 인위적으로 설계된다. 위 가이드 도메인을 어떻게 설계하느냐에 따라, 위 CRISPR/Cas13 시스템이 어떤 핵산을 표적으로 기능할 지 결정된다.
신규 CRISPR/Cas13 시스템의 기능 - 표적 RNA 절단 활성
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 표적 RNA를 절단할 수 있다. 위 신규 CRISPR/Cas13 복합체가 표적 RNA와 결합하면 이를 절단할 수 있다. 위 표적 RNA에 따라 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 프로그램 가능한 가이드 RNA를 설계한다. 위 프로그램 가능한 가이드 RNA는 위 표적 RNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 설계되었다.
신규 CRISPR/Cas13 시스템의 기능 - 부수적 절단 활성
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 부수적 절단 활성을 가진다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 표적 RNA와 결합하면 부수적 절단 기능이 활성화된다. 부수적 절단 기능이 활성화된 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 주변의 단일가닥 RNA를 무작위로 절단한다. 여기서, 상기 부수적 절단 활성에 의해 절단되는 단일가닥 RNA의 핵산 서열은 상기 표적 RNA의 서열과는 관련없다. 어떤 핵산 서열을 가지든 부수적 절단 기능이 활성화된 신계 CRISPR/Cas13 시스템에 의해 절단된다.
신규 CRISPR/Cas13 복합체
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 상기 Cas13 단백질 및 위 프로그램 가능한 가이드 RNA의 복합체를 지칭할 수 있다. 위 복합체는 단백질-RNA 복합체 또는 리보뉴클레오프로틴 (RNP; RiboNucleoProtein)으로 지칭될 수 있다.
신규 CRISPR/Cas13 시스템의 각 구성요소 발현 벡터
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 위 Cas13 단백질과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 발현할 수 있는 벡터를 지칭할 수 있다. 위 발현 벡터는 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 각 구성요소를 발현할 수 있다면 그 구성이나 형태가 제한되지 않는다. 위 발현 벡터는 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하고, 프로모터 등 기타 구성을 포함할 수 있다. 위 발현 벡터는 DNA, mRNA, 또는 이들의 적절한 조합일 수 있다.
신규 CRISPR/Cas13 조성물
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 신규 CRISPR/Cas13 조성물을 지칭할 수 있다.
위 신규 CRISPR/Cas13 조성물은 다음을 포함한다: 위 신규 Cas13 단백질 또는 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산; 그리고 위 프로그램 가능한 가이드 RNA 또는 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산.
신규 CRISPR/Cas13 시스템의 용도
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 프로그램 가능한 가이드 RNA의 설계에 따라 미리 결정된 표적 RNA와 결합할 수 있다 (표적 RNA 인식 기능). 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 위 미리 결정된 표적 RNA를 절단할 수 있다 (표적-특이적 핵산 절단 활성). 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 위 미리 결정된 표적 RNA를 절단한 후, 주변의 단일가닥 RNA를 서열 관계없이 무작위로 절단할 수 있다 (부수적 절단 활성). 이러한 성질을 활용하면, 위 CRISPR/Cas13 시스템을 임의의 핵산 서열을 가지는 비표적 RNA를 절단하는 데 활용할 수 있다. 또한, 위 CRISPR/Cas13 시스템을 샘플 내 표적 RNA가 있는 지 검출하는 데 활용할 수 있다. 위 용도에 대해서는 이하 더 자세히 설명한다.
신규 CRISPR/Cas13 시스템을 이용한 비표적 핵산 절단 방법
비표적 핵산 절단 방법 개괄
이 명세서에서는 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 사용한 비표적 핵산 절단 방법을 개시한다. 위 비표적 핵산 절단 방법은 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 표적 핵산을 인식하면 부수적 절단 기능이 활성화되어 임의의 핵산을 자르는 성질을 활용한다. 위 비표적 핵산 절단 방법은 신규 CRISPR/Cas13 시스템에 표적 핵산과 비표적 핵산을 접촉시키는 과정을 포함한다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 《신규 CRISPR/Cas13 시스템》 단락에서 설명하였다. 위 CRISPR/Cas13 시스템의 가이드 RNA의 가이드 도메인은 위 표적 핵산을 표적할 수 있도록 설계되었다.
이하, 위 방법에 대해 더 상세히 설명한다.
신규 CRISPR/Cas13 시스템
위 비표적 핵산을 절단하기 위해, 본 명세서에서 제공하는 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 사용한다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 《신규 CRISPR/Cas13 시스템》에서 설명된 바와 같다. 목적에 따라 CRISPR/Cas13 시스템이 사용되는 형태는 달라질 수 있다. 예를 들면, 신규 CRISPR/Cas13 복합체; 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 각 구성요소 발현 벡터; 신규 CRISPR/Cas13 조성물; 또는 이들의 적절한 조합이 사용될 수 있다.
표적 핵산
위 비표적 핵산 절단 방법에서 표적 핵산은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 인식할 수 있는 핵산을 의미한다. 구체적으로, 위 표적 핵산은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 프로그래밍 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인과 혼성화 (hybridized) 될 수 있다. 달리 표현하여, 위 표적 핵산은 위 가이드 도메인과 상보적인 핵산 서열을 포함한다.
비표적 핵산
위 비표적 핵산은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 Cas13 단백질이 절단할 수 있는 단일가닥 핵산이다. 위 표적 핵산과 달리, 위 비표적 핵산은 그 서열 및 길이에 제한이 없다.
표적 핵산 및 비표적 핵산을 접촉시키는 순서
위 비표적 핵산 절단 방법은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 부수적 절단 기능을 이용한다. 위 부수적 절단 기능은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 표적 핵산을 인식했을 때 활성화된다. 따라서, 위 비표적 핵산 절단 방법은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 표적 핵산과 먼저 접촉하고, 그 후 비표적 핵산과 접촉하는 순서로 수행되는 것이 바람직하다. 하지만, 비표적 핵산이 먼저 접촉하더라도, 신규 CRISPR/Cas13 시스템과 충분히 인접해 있는 한, 표적 핵산이 나중에 접촉해도 비표적 핵산이 절단될 수 있다. 결론적으로, 위 비표적 핵산 절단 방법을 수행할 때, 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 표적 핵산과 비표적 핵산에 접촉시키는 순서는 크게 중요하지 않다. 위 비표적 핵산 절단 방법을 수행할 때, 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 표적 핵산과 비표적 핵산에 접촉시키는 순서는 필요에 따라 다양하게 할 수 있다. 경우에 따라, 위 표적 핵산과 비표적 핵산을 신규 CRISPR/Cas13 시스템에 동시에 접촉시킬 수 있다.
신규 CRISPR/Cas13 시스템을 이용한 표적 핵산 검출 방법
표적 핵산 검출 방법 개괄
이 명세서는 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 활용한 표적 핵산 검출 방법을 개시한다. 위 표적 핵산 검출 방법은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 부수적 절단 활성을 이용한다. 위 표적 핵산 검출 방법은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 샘플 및 검출시약과 혼합하는 과정; 그리고, 위 혼합물에서 미리 정해 놓은 신호가 생성되는 지 측정하는 과정을 포함한다. 여기서, 위 샘플은 표적 핵산을 포함할 가능성이 있는 시료이다. 위 검출 시약은 특정 조건에서 특정 신호를 생성하는 리포터를 포함한다. 위 리포터는 프로브 핵산을 포함한다. 위 프로브 핵산이 절단되면 위 리포터는 검출 가능한 신호 (예를 들면, 형광)를 생성한다. 샘플에 표적 핵산이 있다면 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 위 표적 핵산을 인식한다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 위 표적 핵산을 인식하면, 부수적 절단 기능이 활성화되어 주변의 핵산을 무작위로 절단한다. 이로 인해 리포터의 프로브 핵산이 절단되면 검출 가능한 신호가 생성된다. 위 검출 가능한 신호를 측정하고 분석하면, 샘플에 위 표적 핵산이 있는 지, 얼마나 많이 있는 지 알 수 있다.
이하 이 방법에 사용되는 각 구성요소 및 각각의 과정에 대해 상세히 설명한다.
샘플
위 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 이용한 표적 핵산 검출 방법은 샘플을 가지고 수행된다. 위 방법을 수행하면 위 샘플이 표적 핵산을 포함하는 지, 표적 핵산을 얼마나 포함하는 지 등을 알 수 있다. 달리 말해, 위 샘플은 표적 핵산 검출 대상이다. 위 샘플은 필요에 따라 다양한 형태일 수 있다. 예를 들면, 위 샘플은 인간 또는 인간이 아닌 동물의 체액을 포함할 수 있다. 또 다른 예를 들면, 위 샘플은 인간 또는 인간이 아닌 동물의 체액을 적절히 전처리한 시료일 수 있다.
신규 CRISPR/Cas13 시스템
위 샘플이 표적 핵산을 포함하는 지, 표적 핵산을 얼마나 포함하는 지 등을 알기 위해 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 사용한다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 《신규 CRISPR/Cas13 시스템》에서 설명된 바와 같다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 신규 CRISPR/Cas13 복합체, 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 각 구성요소 발현 벡터, 신규 CRISPR/Cas13 조성물, 또는 이의 적절한 조합 형태로 사용될 수 있다.
검출 시약
위 샘플이 표적 핵산을 포함할 때, 측정 가능한 신호를 만들기 위해 검출 시약을 사용한다. 위 검출 시약은 리포터를 포함한다. 위 리포터는 프로브 핵산을 포함한다. 위 리포터는 프로브 핵산이 절단되면 측정 가능한 신호를 내보낸다. 측정 가능한 신호는, 예를 들어 형광 신호일 수 있다. 위 샘플에 표적 핵산이 있는 경우, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 위 표적 핵산과 결합할 수 있다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 위 표적 핵산과 결합하면, 부수적 절단 기능이 활성화된다. 부수적 절단 기능이 활성화되면 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템 주변의 핵산이 무작위로 절단된다. 이로 인해 위 리포터의 프로브 핵산이 절단되면, 위 리포터는 측정 가능한 신호를 생성한다. 결론적으로, 샘플, 신규 CRISPR/Cas13 시스템, 그리고 검출 시약을 혼합했을 때, 위 샘플에 표적 핵산이 있다면 리포터에 의해 측정 가능한 신호가 발생할 것이다.
위 검출 시약은 추가 물질을 더 포함할 수 있다. 위 추가 물질은 필요에 따라 다양하게 선택된다. 예를 들어, 위 추가 물질은 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 부수적 절단 활성을 촉진하는 물질일 수 있다. 또 다른 예로, 위 추가 물질은 위 리포터에서 발생한 측정 가능한 신호를 증폭하는 물질일 수 있다.
측정 가능한 신호
위 측정 가능한 신호는 표적 핵산 검출 방법을 수행할 때 측정할 수 있는 신호이다. 이는 위 검출 시약에 포함된 리포터의 종류에 따라 결정된다. 위 방법의 목적을 이룰 수 있는 한, 위 측정 가능한 신호가 무엇인 지는 중요하지 않다. 위 리포터로부터 생성되는 신호는 다양할 수 있다. 예를 들어, 위 신호는 특정 파장의 형광일 수 있다. 위 측정 가능한 신호가 발생하는 지, 발생하는 신호는 얼마나 강한 지, 그리고 신호 강도가 어떻게 변하는 지 등을 측정하면 위 표적 핵산에 대한 정보를 얻을 수 있다. 위 표적 핵산에 대한 정보는, 예를 들어 샘플 내 표적 핵산이 있는 지, 양은 얼마나 되는 지 등일 수 있다.
샘플, CRISPR/Cas13 시스템, 검출 시약을 혼합하는 과정
위에서 설명한 바, 표적 핵산, 신규 CRISPR/Cas13 시스템, 그리고 리포터가 접촉하면 측정 가능한 신호가 발생한다. 따라서, 표적 핵산을 검출하기 위해서는 샘플, 신규 CRISPR/Cas13 시스템, 그리고 검출 시약을 모두 한 곳에 모아야 한다. 위 과정은 다양하게 표현될 수 있다. 예를 들어, 위 샘플, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템, 그리고 위 검출 시약을 섞거나, 혼합하거나, 반응시키거나, 접촉시키거나, 또는 위 행위를 적절히 조합하여 한 곳에 모을 수 있다. 위 과정은 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템이 위 표적 핵산을 인식하고, 부수적 절단 기능이 활성화되어 위 리포터의 프로브 핵산을 절단하고, 리포터로부터 측정 가능한 신호가 발생하고, 이를 측정하는 일련의 과정이 방해 받지 않는 조건에서 수행되어야 한다. 위 조건을 만족하는 한, 위 과정은 그 방법이나 환경, 그리고 수행 장소가 제한되지 않는다. 편하게 설명하게 위해, 이후 이 과정을 "혼합한다"고 표현하겠다.
샘플, CRISPR/Cas13 시스템, 검출 시약을 혼합하는 순서
위 표적 핵산 검출 방법에서 샘플, 신규 CRISPR/Cas13 시스템, 그리고 검출 시약을 혼합하는 순서는 크게 중요하지 않다. 위 샘플, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템, 그리고 위 검출 시약을 동시에 혼합할 수 있고, 임의의 순서로 혼합할 수 있다. 위 표적 핵산 검출 방법의 원리 상 위 샘플과 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 먼저 혼합하고, 그 후 검출 시약을 혼합하는 순서가 바람직하게 여겨질 수 있다. 하지만, 적절한 시간 내에 혼합하기만 하면 위에서 설명한 일련의 반응이 충분히 일어날 수 있다. 위 샘플, 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템, 그리고 위 검출 시약을 혼합하는 순서는 표적 핵산 검출 방법의 효과에 큰 영향이 없다.
검출 가능한 신호를 측정하는 과정
위 표적 핵산 검출 방법은 위 검출 가능한 신호를 측정하는 과정을 포함한다. 위에서 설명한 대로, 샘플 내 표적 핵산이 있는 경우, 일련의 반응을 거쳐 검출 시약의 리포터가 검출 가능한 신호를 발산한다. 발산되는 신호가 무엇인 지, 어떤 패턴으로 방출되는 지 등을 고려하여 위 검출 가능한 신호를 측정하는 방법을 결정한다. 위 방법은 특별히 제한되지 않으며, 공지된 방법을 사용할 수 있다.
발명의 가능한 실시예
Cas13 단백질
실시예 1, 신규 Cas13d 단백질
VI-D 서브타입의 Cas13 단백질 (Cas13d 단백질이라고도 지칭함).
실시예 2, 신규 Cas13 단백질
실시예 1에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 VSKNDNIKSKAKALGLKSTFQVGDEVVMTSFGKGNKAIVEKIVRGTDVQSVPTEPNFSAE IEGKKFDLVGRAHIQTKSDNPQYSKKRTGDDMIGAKAALEKRFFGGTFDDNIHIQLAYNV LDIEKILSVHINNIVYTLNNIRRKDNAEDDDFIGYMSTRNDYDTFIEPRKHNISEDAAKS IDKSRASFEEYLQPPVKDCLHYFGNTFFAPREIEKTYTDNRGFERKKKVTVNSLIDEKEI YYIFALLGGLRQFCTHDNKSGRNWLYSLEENGINSDAKAVLDKYYNSAVARIDESFVDNA SKTNFKLIFNAMDVSDEALQDNIAKAFYKFTVCKSFKNMGFSIKKLREQLLELPEYEGLK DKHYDSVRSKLYQIMDFVIYLSFKDEKFKKDNEEKINNIVNELRATLNEEDKGRVYASYA ERMKSELKPAIARLKSDIDKIKDSRVKEFELDASVKYRLSKVVESVRLKDRATYFTKLIY LTTLFLDGKEINDLLTTLIHQFENIASFIDVMNDRGIDCRFSDGYKLFESSKQIAFELRN VNSFARMTRTSKDDENATHMMYIDAAEILGTDYTEEQIEEHLNLEKKRMIPGTKKADMNF RNFIINNVIKSSRFNYLVRYSNPKKIRALADNEGVIRFVLGELPDAQIDRYTLLCGFNPD ADRQEKTDKLAKAITGLRFNDFENVKQGANTEGESQESIDKAQKQGLISLYLTVLYLLTK NLVYVNSRYFLAFHCLERDAQLLGSGAGHHEPYVALTQRFINEDKLNEHACEYLKTNIAN SDEYTIRIFRNNAAHLSAVRNANLYIDKLKEFKSYYEIYHFLSQENIYGKYCVDKKYVTA DENGSKTISVKISKDYCPQVYIDKSLEYFDKLNKYGTYCKDFTKALNSPFGYNLARYKNL SIEGLFDRNRPGDKGENTFED(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함함.
실시예 3, 유사한 서열 포함
실시예 1에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 약 51% 이상, 약 52% 이상, 약 53% 이상, 약 54% 이상, 약 55% 이상, 약 56% 이상, 약 57% 이상, 약 58% 이상, 약 59% 이상, 약 60% 이상, 약 61% 이상, 약 62% 이상, 약 63% 이상, 약 64% 이상, 약 65% 이상, 약 66% 이상, 약 67% 이상, 약 68% 이상, 약 69% 이상, 약 70% 이상, 약 71% 이상, 약 72% 이상, 약 73% 이상, 약 74% 이상, 약 75% 이상, 약 76% 이상, 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 약 100% 일치하거나(identical), 동일하거나(same), 매칭되거나(matched), 및/또는 동등한(equivalent) 아미노산 서열을 가짐.
실시예 4, 기능 한정
실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 단일가닥 핵산을 절단하는 기능을 가짐.
실시예 5, PFS 한정
실시예 1 내지 실시예 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 다음 중 선택된 프로토스페이서 측면 서열 (Protospacer Flanking Sequence; PFS)를 인식함:
5'-N-3', 5'-NN-3', 및 5'-NNN-3' 중 선택된 RNA 서열,
여기서, N은 각각 독립적으로 A, U, C, 또는 G 중 선택된 것임; 및
5'-N-3', 5'-NN-3', 및 5'-NNN-3' 중 선택된 DNA 서열,
여기서, N은 각각 독립적으로 A, T, C, 또는 G 중 선택된 것임.
실시예 6, PFS 필요없음
실시예 1 내지 실시예 3 내지 실시예 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 단일가닥 핵산을 절단하는 기능을 발휘할 때,
PFS를 인식하지 않음, PFS를 인식할 필요가 없음, 및/또는 PFS에 의존하지 않음.
실시예 7, 변형된 도메인 포함
실시예 1 내지 실시예 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 변형된 단백질 도메인을 포함함.
실시예 8, 변형의 의미
실시예 7에 있어서, 상기 Cas13 단백질 중 변형된 단백질 도메인은 변형되지 않은 단백질 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환되거나, 삭제되거나, 및/또는 삽입된 것을 의미함.
실시예 9, 변형된 도메인
실시예 7 또는 실시예 8에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 변형된 HEPN 도메인을 포함함.
실시예 10, 추가적인 도메인 포함
실시예 1 내지 실시예 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 추가적인 단백질 도메인을 더 포함함.
실시예 11, 핵산 한정
실시예 1 내지 실시예 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일가닥 핵산은 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA임.
프로그램 가능한 가이드 RNA
실시예 12, 프로그램 가능한 가이드 RNA
다음을 포함하는 프로그램 가능한 가이드 RNA:
직접 반복부(direct repeat); 및
미리 결정된 표적 서열을 표적할 수 있도록 설계된 가이드 도메인,
여기서, 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 상기 직접 반복부 및 상기 가이드 도메인이 순차적으로 연결된 것이고,
상기 직접 반복부는 VI-D 서브타입의 Cas13 단백질과 상호작용하여 복합체를 형성할 수 있는 것임.
실시예 13, 구조식 표현
실시예 12에 있어서, 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA는 다음을 포함함:
5'-[직접 반복부]-[가이드 도메인]-3',
여기서, 상기 직접 반복부와 상기 가이드 도메인은 실시예 12에서 정의된 바와 같음.
실시예 14, 직접 반복부 서열 한정
실시예 12 내지 실시예 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 직접 반복부는 GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACC(서열번호 2)의 RNA 서열을 가짐.
실시예 15, 직접 반복부와 유사한 서열 포함
실시예 12에 있어서, 상기 직접 반복부는 GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACC(서열번호 2)의 RNA 서열과 약 50% 이상, 약 51% 이상, 약 52% 이상, 약 53% 이상, 약 54% 이상, 약 55% 이상, 약 56% 이상, 약 57% 이상, 약 58% 이상, 약 59% 이상, 약 60% 이상, 약 61% 이상, 약 62% 이상, 약 63% 이상, 약 64% 이상, 약 65% 이상, 약 66% 이상, 약 67% 이상, 약 68% 이상, 약 69% 이상, 약 70% 이상, 약 71% 이상, 약 72% 이상, 약 73% 이상, 약 74% 이상, 약 75% 이상, 약 76% 이상, 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 약 100% 일치하거나(identical), 동일하거나(same), 매칭되거나(matched), 및/또는 동등한(equivalent) RNA 서열을 가짐.
실시예 16, 직접 반복부 기능 한정
실시예 12 내지 실시예 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 직접 반복부는 실시예 1 내지 실시예 11 중 어느 하나의 Cas13 단백질과 상호작용하여 복합체를 이룰 수 있는 것임.
실시예 17, 길이 한정
실시예 12 내지 실시예 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 도메인은 10nt, 11nt, 12nt, 13nt, 14nt, 15nt, 16nt, 17nt, 18nt, 19nt, 20nt, 21nt, 22nt, 23nt, 24nt, 25nt, 26nt, 27nt, 28nt, 29nt, 30nt, 31nt, 32nt, 33nt, 34nt, 35nt, 36nt, 37nt, 38nt, 39nt, 40nt, 41nt, 42nt, 43nt, 44nt, 45nt, 46nt, 47nt, 48nt, 49nt, 및 50nt 중 선택된 길이를 가지거나, 상기 수치범위 중 선택된 두 수치 범위 내 길이를 가짐 (예를 들어, 17nt 내지 20nt).
실시예 18, 표적 의미
실시예 12 내지 실시예 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 도메인은 상기 미리 결정된 표적 서열의 핵산과 상보적으로 결합하거나 (complementary bind), 및/또는 혼성화될 수 있는 것 (hybridize)임.
실시예 19, 상보적인 서열, % 한정
실시예 12 내지 실시예 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 도메인은 상기 미리 결정된 표적 서열과 약 50% 이상, 약 51% 이상, 약 52% 이상, 약 53% 이상, 약 54% 이상, 약 55% 이상, 약 56% 이상, 약 57% 이상, 약 58% 이상, 약 59% 이상, 약 60% 이상, 약 61% 이상, 약 62% 이상, 약 63% 이상, 약 64% 이상, 약 65% 이상, 약 66% 이상, 약 67% 이상, 약 68% 이상, 약 69% 이상, 약 70% 이상, 약 71% 이상, 약 72% 이상, 약 73% 이상, 약 74% 이상, 약 75% 이상, 약 76% 이상, 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 약 100% 상보적인 서열을 가짐.
실시예 20, 상보적인 서열, 미스매치 개수 한정
실시예 12 내지 실시예 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 도메인은 상기 미리 결정된 표적 서열과 상보적인 서열이되, 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개의 미스매치를 포함함.
실시예 21, 표적 RNA 한정
실시예 12 내지 실시예 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 미리 결정된 표적 서열의 핵산은 RNA 또는 DNA임.
Cas13 복합체
실시예 22, Cas13 복합체
다음을 포함하는 CRISPR/Cas13 복합체:
실시예 1 내지 실시예 11 중 어느 하나의 Cas13 단백질; 및
실시예 12 내지 실시예 21 중 어느 하나의 프로그램 가능한 가이드 RNA,
여기서, 상기 Cas13 단백질 및 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA의 직접 반복부가 상호작용하여 복합체를 형성함.
실시예 23, PFS 및 표적 핵산 인식
실시예 22에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 복합체는 표적 핵산과 결합할 수 있으며, 상기 표적 핵산의 서열은 다음 서열을 포함함:
미리 결정된 표적 서열로, 상기 미리 결정된 표적 서열은 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인의 서열과 약 50% 이상, 약 51% 이상, 약 52% 이상, 약 53% 이상, 약 54% 이상, 약 55% 이상, 약 56% 이상, 약 57% 이상, 약 58% 이상, 약 59% 이상, 약 60% 이상, 약 61% 이상, 약 62% 이상, 약 63% 이상, 약 64% 이상, 약 65% 이상, 약 66% 이상, 약 67% 이상, 약 68% 이상, 약 69% 이상, 약 70% 이상, 약 71% 이상, 약 72% 이상, 약 73% 이상, 약 74% 이상, 약 75% 이상, 약 76% 이상, 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 약 100% 상보적인 서열임.
실시예 24, PFS 추가 포함
실시예 23에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 복합체의 상기 Cas13 단백질이 PFS를 인식하는 것일 경우, 상기 표적 핵산의 서열은 상기 Cas13 단백질이 인식하는 Protospacer Flanking Sequence (PFS)를 더 포함함.
실시예 25, PFS 한정
실시예 24에 있어서, 상기 PFS는 다음 중 선택된 것임:
5'-N-3', 5'-NN-3', 및 5'-NNN-3' 중 선택된 RNA 서열,
여기서, N은 각각 독립적으로 A, U, C, 또는 G 중 선택된 것임; 및
5'-N-3', 5'-NN-3', 및 5'-NNN-3' 중 선택된 DNA 서열,
여기서, N은 각각 독립적으로 A, T, C, 또는 G 중 선택된 것임.
실시예 26, PFS 및 표적 서열 위치 관계
실시예 23 내지 실시예 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 핵산 내 상기 PFS는 상기 표적 서열의 3'-말단 또는 5'-말단에 인접함.
실시예 27, PFS 및 표적 서열의 거리
실시예 26에 있어서, 상기 PFS 및 상기 표적 서열은 0nt, 1nt, 2nt, 또는 3nt 거리만큼 떨어져 있음.
실시예 28, Cas13 복합체, 부수적 절단 기능
실시예 22 내지 실시예 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 복합체는 부수적 절단 기능 (collateral cleavage function)을 가지며,
상기 CRISPR/Cas13 복합체가 상기 표적 핵산과 결합하는 경우, 부수적 절단 기능이 활성화되어 상기 CRISPR/Cas13 복합체의 주변에 존재하는 임의의 핵산을 절단함.
실시예 29, Cas13 복합체, 표적핵산 절단기능
실시예 22 내지 실시예 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 복합체는 표적 특이적 절단 기능 (target specific cleavage function)을 가지며,
상기 CRISPR/Cas13 복합체가 상기 표적 핵산과 결합하는 경우, 상기 표적 핵산을 절단함.
실시예 30, 핵산 종류 한정
실시예 28 내지 실시예 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 핵산 및 임의의 핵산은 RNA 또는 DNA임.
CRISPR/Cas13 시스템의 각 구성요소를 발현할 수 있는 벡터
실시예 31, 발현벡터
CRISPR/Cas13 시스템의 구성요소를 발현할 수 있는 벡터로, 다음을 포함함:
실시예 1 내지 실시예 11 중 어느 하나의 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산; 및
실시예 12 내지 실시예 21 중 어느 하나의 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산.
실시예 32, 1개의 벡터에 포함
실시예 31에 있어서, 상기 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 한 분자의 핵산에 포함된 것임.
실시예 33, 서로 다른 벡터에 포함
실시예 31에 있어서, 상기 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 각각 다른 분자의 핵산에 포함된 것임.
실시예 34, 벡터 종류
실시예 31 내지 실시예 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 비바이러스 벡터 및/또는 바이러스 벡터인 것임.
실시예 35, 비바이러스 벡터 종류
실시예 34에 있어서, 상기 비바이러스 벡터는 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, mRNA, 및 PCR 앰플리콘(amplicon) 중 선택된 것임.
실시예 36, 바이러스 벡터 종류
실시예 34 내지 실시예 35에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스 중 선택된 것임.
실시예 37, 핵산 종류 한정
실시예 31 내지 실시예 36 중 어느 하나에 있어서, Cas13 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 각각 독립적으로 DNA 및 RNA 중 선택된 것임.
실시예 38, Cas13 단백질을 암호화하는 DNA
실시예 37에 있어서, 상기 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산은 TTTTGAAAATGTTAAACAGGGCGCAAATACTGAGGGCGAATCTCAGGAGTCAATTGACAAGGCACAGAAGCAGGGACTGATTTCTTTGTACTTAACCGTTCTATATCTTTTGACAAAGAATCTTGTTTATGTAAACTCACGCTATTTTCTTGCATTCCATTGTCTTGAGCGTGATGCGCAGCTGCTTGGAAGCGGTGCTGGGCATCATGAGCCTTATGTTGCTCTTACTCAGCGCTTTATTAATGAAGATAAGCTCAATGAGCATGCCTGCGAATATCTTAAGACCAATATTGCAAATTCGGATGAATATACAATTAGAATATTCCGCAATAATGCTGCTCACTTGAGTGCTGTTAGAAATGCAAATCTGTATATTGACAAGTTGAAGGAATTTAAATCGTACTATGAGATTTATCATTTCCTTTCTCAAGAGAATATTTACGGTAAATATTGCGTTGATAAGAAATATGTTACAGCCGATGAAAATGGAAGTAAAACAATAAGTGTTAAAATTAGCAAGGATTATTGTCCTCAGGTATATATCGACAAGTCGCTTGAATACTTTGACAAGCTCAATAAATATGGTACGTATTGCAAGGACTTCACGAAGGCACTCAATTCGCCATTCGGCTACAACCTCGCAAGATATAAGAATCTGTCTATCGAGGGCTTGTTTGACCGAAACCGTCCCGGAGACAAAGGTGAGAACACGTTTGAGGACTAA(서열번호 4)의 DNA 서열을 가짐.
CRISPR/Cas13 조성물
실시예 39, CRISPR/Cas13 조성물
다음을 포함하는 CRISPR/Cas13 조성물:
실시예 1 내지 실시예 11 중 어느 하나의 Cas13 단백질, 또는 상기 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산; 및
실시예 12 내지 실시예 21 중 어느 하나의 프로그램 가능한 가이드 RNA, 또는 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산.
실시예 40, CRISPR/Cas13 복합체
실시예 39에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 조성물은 상기 Cas13 단백질 및 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA를 포함하고, 상기 Cas13 단백질 및 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA가 결합하여 리보뉴클레오프로틴 (ribonucleoprotein)을 형성하고 있음.
실시예 41, 복합체 한정
실시예 40에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 조성물은 실시예 22 내지 실시예 30 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 복합체를 포함함.
실시예 42, CRISPR/Cas13 시스템 구성요소 발현 벡터
실시예 39에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 조성물은 상기 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함함.
실시예 43, 발현 벡터 한정
실시예 42에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 조성물은 실시예 31 내지 실시예 38 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 시스템의 각 구성요소 발현벡터를 포함함.
실시예 44, 단백질 암호화 핵산 및 가이드 RNA
실시예 39에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 조성물은 상기 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 프로그램 가능한 가이드 RNA를 포함함.
실시예 45, mRNA 한정
실시예 44에 있어서, 상기 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산은 mRNA임.
표적 핵산 검출용 조성물
실시예 46, 표적 핵산 검출용 조성물
다음을 포함하는 검출 시약:
프로브 핵산을 포함하는 리포터,
여기서, 상기 프로브 핵산이 절단되는 경우, 상기 리포터가 검출 가능한 신호를 생성함.
실시예 47, 검출 가능한 신호 한정
실시예 46에 있어서, 상기 검출 가능한 신호는 형광 신호임.
비표적 핵산 절단 방법/용도
실시예 48, 비표적 핵산 절단 방법
다음을 포함하는, CRISPR/Cas13 시스템을 사용하여 비표적 핵산을 절단하는 방법:
실시예 22 내지 실시예 30 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 복합체를 표적 핵산 및 비표적 핵산과 접촉시키는 과정,
여기서, 상기 표적 핵산은 1) 미리 결정된 표적 서열, 및 2) 상기 CRISPR/Cas13 복합체의 Cas13 단백질이 인식하는 PFS를 가지며,
상기 CRISPR/Cas13 복합체의 프로그램 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인은 상기 미리 결정된 표적 서열을 표적할 수 있도록 설계된 것이고,
상기 비표적 핵산은 상기 표적 핵산과 상이한 서열을 가지고,
상기 CRISPR/Cas13 복합체가 상기 표적 핵산과 접촉한 결과, 부수적 절단 기능이 활성화되어 상기 비표적 핵산이 절단됨.
실시예 49, 접촉 순서
실시예 48에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 복합체를 표적 핵산 및 비표적 핵산과 접촉시키는 과정은 다음 중 선택된 순서로 수행됨:
(a) 상기 CRISPR/Cas13 복합체를 상기 표적 핵산과 접촉시킨 후, 이를 상기 비표적 핵산과 접촉시킴;
(b) 상기 CRISPR/Cas13 복합체를 상기 비표적 핵산과 접촉시킨 후, 이를 상기 표적 핵산과 접촉시킴; 및
(c) 상기 CRISPR/Cas13 복합체를 상기 표적 핵산 및 비표적 핵산과 동시에 접촉시킴.
실시예 50, 비표적 핵산 절단 용도
실시예 22 내지 실시예 30 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 복합체, 실시예 31 내지 실시예 38 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 시스템의 구성요소 발현벡터, 및/또는 실시예 39 내지 실시예 45 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 조성물을 실시예 48 내지 실시예 49 중 어느 하나의 비표적 핵산 절단 방법에 사용하는 용도.
표적 핵산 검출 방법/용도
실시예 51, 표적 핵산 검출 방법
CRISPR/Cas13 시스템을 사용하여 표적 핵산을 검출하는 방법으로, 다음을 포함함:
(a) 샘플, 실시예 22 내지 실시예 30 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 복합체, 및 실시예 46 내지 실시예 47 중 어느 하나의 검출 시약을 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시키는 (contact) 과정,
여기서, 상기 표적 핵산은 1) 미리 결정된 표적 서열, 및 2) 상기 CRISPR/Cas13 복합체의 Cas13 단백질이 인식하는 PFS를 가지며,
상기 CRISPR/Cas13 복합체의 프로그램 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인은 상기 미리 결정된 표적 서열을 표적할 수 있도록 설계된 것이고,
상기 샘플 내 상기 표적 핵산이 존재하는 경우, 상기 표적 핵산이 상기 CRISPR/Cas13 복합체와 결합하여 부수적 절단 활성이 활성화되며, 이에 따라 상기 리포터에 포함된 프로브 핵산이 상기 Cas13 복합체에 의해 절단될 수 있으며,
상기 검출 시약의 리포터에 포함된 프로브 핵산이 절단되는 경우, 상기 리포터는 검출 가능한 신호를 생성함; 및
(b) 상기 혼합물로부터 상기 검출 가능한 신호를 관찰하거나 (observe), 측정하거나 (measure) 및/또는 검출하는 (detect) 과정,
여기서, 상기 검출 가능한 신호로부터 상기 표적 핵산의 존부 및/또는 샘플 내 존재하는 양을 도출하거나 (derive), 알아내거나 (find out), 측정하거나 (measure), 결정하거나 (determine), 검출하거나 (detect) 및/또는 분석할 (analyze) 수 있음.
실시예 52, 샘플, 복합체, 및 검출 시약 접촉 순서
실시예 51에 있어서, 상기 샘플, 실시예 22 내지 실시예 30 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 복합체, 및 실시예 46 내지 실시예 47 중 어느 하나의 검출 시약을 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시키는 (contact) 과정은 다음 중 선택된 순서로 수행됨:
(1) 상기 샘플 및 상기 CRISPR/Cas13 복합체를 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시킨 (contact) 후, 상기 검출 시약을 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시킴 (contact);
(2) 상기 샘플 및 상기 검출 시약을 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시킨 (contact) 후, 상기 CRISPR/Cas13 복합체를 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시킴 (contact);
(3) 상기 CRISPR/Cas13 복합체 및 상기 검출 시약을 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시킨 (contact) 후, 상기 샘플을 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시킴 (contact); 및
(4) 상기 샘플, 상기 CRISPR/Cas13 복합체, 및 상기 검출 시약을 동시에 섞거나 (blend), 혼합하거나 (mix), 반응시키거나 (react), 및/또는 접촉시킴 (contact).
실시예 53, COVID-19 검출 방법
실시예 51 내지 실시예 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 시스템을 사용하여 표적 핵산을 검출하는 방법은 상기 샘플 내 COVID-19 바이러스의 핵산이 포함되었는 지 여부를 검출하는 방법임.
실시예 54, COVID-19 N-gene, E-gene 검출 방법
실시예 53에 있어서, 상기 표적 핵산은 ucugauaauggaccccaaaaucagcgaaaugcaccccgcauuacguuugguggacccucagauucaacuggcaguaaccagaauggagaacgcaguggggcgcgaucaaaacaacgucggccccaagguuuacccaauaauacugcgucuugguucaccgcucucacucaacauggcaaggaagaccuuaaauucccucgaggacaaggcguuccaauuaacaccaauagcaguccagaugaccaaauuggcuacuaccgaagagcuaccagacgaauucgugguggugacgguaaaaugaaagaucucaguccaagaugguauuucuacuaccuaggaacugggccagaagcuggacucccuauggugcuaacaaagacggcaucauaggguugcaacugagggagccuugaauacaccaaaagaucacauuggcacccgcaauccugcuaacaaugcugcaaucgugcuacaacuuccucaaggaacaacauugccaaaaggcuucuacgcagaagggagcagaggcggcagucaagccucuucucguuccucaucacguagucgcaacaguucaagaaauucaacuccaggcagcaguaggggaaccuccugcuagaauggcuggcaauggcggugaugcugcucuugcuuugcugcugcuugacagauugaaccagcuugagagcaaaaugucugguaaaggccaacaacaacaaggccaaacugucacuaagaaaucugcugcugaggcuucuaagaagccucggcaaaaacguacugccacuaaagcauacaauguaacacaagcuuucggcagacgugguccagaacaaacccaaggaaauuuuggggaccaggaacuaaucagacaaggaacugauuacaaacauuggccgcaaauugcacaauuugcccccagcgcuucagcguucuucggaaugucgcgcauuggcauggaagaaaaaa(서열번호 5) 및/또는 uacucauucguuucggaagagacagguacguuaauaguuaauagcguacuucuuuuucuugcuuucgugguauucuugcuaguuacacuagccauccuuacugcgcuucgauugugugcguacugcugcaauauuguuaacgugagucuuguaaaaccuucuuuuuacguuuacucucguguuaaaaaucugaauucuucuagaguuccugaucuucuggucuaaaaaa(서열번호 6)임.
실시예 55, 표적 서열 한정
실시예 54에 있어서, 상기 표적 핵산의 표적 서열은 CGCAUUACGUUUGGUGGACC(서열번호 57), UUCAACUGGCAGUAACCAGA(서열번호 58), UUACAAACAUUGGCCGCAAA(서열번호 59), GGGAGCCUUGAAUACACCAA(서열번호 60), CACAUUGGCACCCGCAAUCC(서열번호 61), AAUGCUGCAAUCGUGCUACA(서열번호 62), GGGGAACUUCUCCUGCUAGA(서열번호 63), CUUUGCUGCUGCUUGACAGA(서열번호 64), CAGCUUGAGAGCAAAAUGUC(서열번호 65), GAUUCAACUGGCAGUAACCA(서열번호 66), CACAUUGGCACCCGCAAUCCU(서열번호 67), AAUGCUGCAAUCGUGCUACAA(서열번호 68), UUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUG(서열번호 69), AGGAACUGAUUACAAACAUUGGC(서열번호 70), GGGACCAGGAACUAAUCAGACAA(서열번호 71), CUAGCCAUCCUUACUGCG(서열번호 72), CGGAAGAGACAGGUACGUUA(서열번호 73), GUUACACUAGCCAUCCUUAC(서열번호 74), UGUGCGUACUGCUGCAAUAUU(서열번호 75), 및 CAAUAUUGUUAACGUGAGUCUU(서열번호 76) 중 선택된 핵산 서열임.
실시예 56, 가이드 도메인 한정
실시예 54에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 복합체의 프로그램 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인은 ggUccaccaaacgUaaUgcg(서열번호 37), UCUGGUUACUGCCAGUUGAA(서열번호 38), UUUgcggccaaUgUUUgUaa(서열번호 39), UUGGUGUAUUCAAGGCUCCC(서열번호 40), GGAUUGCGGGUGCCAAUGUG(서열번호 41), UGUAGCACGAUUGCAGCAUU(서열번호 42), UCUAGCAGGAGAAGUUCCCC(서열번호 43), UCUGUCAAGCAGCAGCAAAG(서열번호 44), GACAUUUUGCUCUCAAGCUG(서열번호 45), UggUUacUgccagUUgaaUc(서열번호 46), aggaUUgcgggUgccaaUgUg(서열번호 47), UUgUagcacgaUUgcagcaUU(서열번호 48), CAAAUUGUGCAAUUUGCGGCCAA(서열번호 49), GCCAAUGUUUGUAAUCAGUUCCU(서열번호 50), UUGUCUGAUUAGUUCCUGGUCCC(서열번호 51), cgcagUaaggaUggcUag(서열번호 52), UaacgUaccUgUcUcUUccg(서열번호 53), gUaaggaUggcUagUgUaac(서열번호 54), aaUaUUgcagcagUacgcaca(서열번호 55), 및 aagacUcacgUUaacaaUaUUg(서열번호 56) 중 선택된 핵산 서열을 가짐.
실시예 57, 프로그램 가능한 가이드 RNA 한정
실시예 54에 있어서, 상기 CRISPR/Cas13 복합체의 프로그램 가능한 가이드 RNA는 GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUggUUacUgccagUUgaaUc(서열번호 16), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCaggaUUgcgggUgccaaUgUg(서열번호 17), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUUgUagcacgaUUgcagcaUU(서열번호 18), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCCAAAUUGUGCAAUUUGCGGCCAA(서열번호 19), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCGCCAAUGUUUGUAAUCAGUUCCU(서열번호 20), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUUGUCUGAUUAGUUCCUGGUCCC(서열번호 21), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCggUccaccaaacgUaaUgcg(서열번호 22), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUCUGGUUACUGCCAGUUGAA(서열번호 23), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUUUgcggccaaUgUUUgUaa(서열번호 24), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUUGGUGUAUUCAAGGCUCCC(서열번호 25), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCGGAUUGCGGGUGCCAAUGUG(서열번호 26), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUGUAGCACGAUUGCAGCAUU(서열번호 27), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUCUAGCAGGAGAAGUUCCCC(서열번호 28), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUCUGUCAAGCAGCAGCAAAG(서열번호 29), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCGACAUUUUGCUCUCAAGCUG(서열번호 30), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCUaacgUaccUgUcUcUUccg(서열번호 32), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCgUaaggaUggcUagUgUaac(서열번호 33), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCaaUaUUgcagcagUacgcaca(서열번호 34), GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCaagacUcacgUUaacaaUaUUg(서열번호 35), 및 GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACCcgcagUaaggaUggcUag(서열번호 36) 중 선택된 핵산 서열을 가짐.
실시예 58, 표적 핵산 검출 용도
실시예 22 내지 실시예 30 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 복합체, 실시예 31 내지 실시예 38 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 시스템의 구성요소 발현벡터, 및/또는 실시예 39 내지 실시예 45 중 어느 하나의 CRISPR/Cas13 조성물을 실시예 51 내지 실시예 57 중 어느 하나의 표적 핵산 검출 방법에 사용하는 용도.
실험예
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. 실험방법 및 재료
실험예 1.1. 공지 DB로부터 신규 CRISPR/Cas13 시스템 서열 특정
NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 데이터베이스에 공개된 소 위의 메타지놈 (metagenome) 데이터를 사용하였다. 상기 NGS데이터를 가지고, 다음과 같은 방법으로 CRISPR/Cas13 시스템을 특정하였다:
(1) MEGAHIT v.1.2.9(NGS assembly software)로 시퀀스 데이터를 어셈블리하여 미생물의 게놈 정보를 도출하였다. (Li D, Liu CM, Luo R, Sadakane K, Lam TW. MEGAHIT: an ultra-fast single-node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de Bruijn graph. Bioinformatics. 2015 May 15;31(10):1674-6. doi: 10.1093/bioinformatics/btv033. Epub 2015 Jan 20. PMID: 25609793).
(2) 공지된 Cas13 서열 (예를 들어, Lachnospiraceae bacterium 유래 Cas13) 정보를 참고하고, (BLAST) 툴을 사용하여 상동성(homology) 분석을 통해 상기 미생물의 게놈 정보에 포함된 Cas13 단백질 후보군을 특정하였다.
(3) (2)와 동일한 방법으로, 각 Cas13 단백질 후보군에 대한 가이드 RNA 후보군을 특정하였다.
이하, 상기 방법으로 도출된 CRISPR/Cas13 시스템의 서열정보를 이용하여 실험을 진행하였다.
상기 방법으로 특정된 CRISPR/Cas13 시스템의 각 정보는 다음과 같다:
Subject Sequence SEQ ID NO
Cas13 protein VSKNDNIKSKAKALGLKSTFQVGDEVVMTSFGKGNKAIVEKIVRGTDVQSVPTEPNFSAEIEGKKFDLVGRAHIQTKSDNPQYSKKRTGDDMIGAKAALEKRFFGGTFDDNIHIQLAYNVLDIEKILSVHINNIVYTLNNIRRKDNAEDDDFIGYMSTRNDYDTFIEPRKHNISEDAAKSIDKSRASFEEYLQPPVKDCLHYFGNTFFAPREIEKTYTDNRGFERKKKVTVNSLIDEKEIYYIFALLGGLRQFCTHDNKSGRNWLYSLEENGINSDAKAVLDKYYNSAVARIDESFVDNASKTNFKLIFNAMDVSDEALQDNIAKAFYKFTVCKSFKNMGFSIKKLREQLLELPEYEGLKDKHYDSVRSKLYQIMDFVIYLSFKDEKFKKDNEEKINNIVNELRATLNEEDKGRVYASYAERMKSELKPAIARLKSDIDKIKDSRVKEFELDASVKYRLSKVVESVRLKDRATYFTKLIYLTTLFLDGKEINDLLTTLIHQFENIASFIDVMNDRGIDCRFSDGYKLFESSKQIAFELRNVNSFARMTRTSKDDENATHMMYIDAAEILGTDYTEEQIEEHLNLEKKRMIPGTKKADMNFRNFIINNVIKSSRFNYLVRYSNPKKIRALADNEGVIRFVLGELPDAQIDRYTLLCGFNPDADRQEKTDKLAKAITGLRFNDFENVKQGANTEGESQESIDKAQKQGLISLYLTVLYLLTKNLVYVNSRYFLAFHCLERDAQLLGSGAGHHEPYVALTQRFINEDKLNEHACEYLKTNIANSDEYTIRIFRNNAAHLSAVRNANLYIDKLKEFKSYYEIYHFLSQENIYGKYCVDKKYVTADENGSKTISVKISKDYCPQVYIDKSLEYFDKLNKYGTYCKDFTKALNSPFGYNLARYKNLSIEGLFDRNRPGDKGENTFED 1
Direct repeat GAAACGUACUACACCCUUUUUGUAAGGGUCUGAAACC 2
실험예 1.2. 신규 Cas13 단백질 발현 벡터 제조
실험예 1.1에서 발굴한 신규 Cas13 단백질의 아미노산 서열에 대해, 대장균 (E. Coli) 코돈 최적화한 핵산 서열을 특정하고, 이를 pET28 벡터에 클로닝하여 신규 Cas13 단백질 발현 벡터를 제조하였다.
실험예 1.3. 신규 Cas13 단백질 제조 및 정제
실험예 1.2에서 제조된 신규 Cas13 단백질 발현 벡터를 세포 내 유도하여, 다양한 성장조건 (배지, 온도, 유도조건 등)하에서 다양한 대장균 균주(NiCo21(DE3), T7 Express lysY/Iq, NEB® Express Iq) 내에서 신규 Cas13 단백질을 제조하였고, 제조된 양을 SDS-PAGE 분석을 통해 테스트하였다.
상기 테스트 결과를 통해, 플라스크 스케일 생산을 위한 최적화된 성장조건 및 균주가 선택되었다.
구체적으로, 상기 대장균 세포를 제조자의 지시에 따라 실험예 1.2에서 제조된 플라스미드 벡터로 형질전환시켰다. 단일 콜로니는 37C에서 100ug ml-1의 암피실린을 함유하는 Luria-Bertani 액체배지에서 하룻밤 성장시켰다. 세포를 250ml의 동일한 배지에 1:200으로 희석하고 OD600이 0.70 내지 0.75가 될 때까지 37C에서 성장시켰다. 배양물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 23℃에서 진탕(220rpm)하면서 16-18시간의 인큐베이션에 의해 0.5mM 이소프로필-b-D-1-티오갈락토피라노시드로 단백질 발현을 유도하였다.
상기 최적화된 성장조건 하 대장균이 신규 Cas13 단백질을 생산하도록 유도한 후, 세포를 ~4000g에서 20분동안 원심분리하여 펠릿화하고 냉장고에서 -20℃에서 보관하였다.
신규 Cas13 단백질 정제 전, 냉동된 세포를 초음파 처리 완충액(25°C에서 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5M NaCl, 5% 글리세롤, 0.2% Tween20, 1mM DTT, 1mM EDTA, 1x Halt Protease Inhibitor Cocktail (Fisher Scientific), 40 mM 이미다졸)에 팰릿 1g 당 5ml의 버퍼를 사용하여 재현탁하였다.
상기 초음파 처리 완충액에 현탁한 팰릿을 Qsonica Microtip Probe 420-A를 사용하여, 샘플 30ml 당 30% amp, 5초 ON/15초 OFF 조건으로, 얼음 위에서, 4 x 2분 처리 (과열을 방지하기 위하여 간격을 두고 처리함)하여 세포를 파쇄하였다.
상기 초음파 처리가 완료된 샘플을 40,000g에서 1시간 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다.
상기 원심분리 결과의 상청액을 0.2 μm PES 주사기 필터 (Fisher Scientific)를 통해 여과하였고, 25°C, 0.5M NaCl, 40mM 이미다졸 완충액에서 20mM Tris-HCl pH 7.5로 평형화된 Ni2+-충전 HiTrap 킬레이트 HP 컬럼(Cytiva)에 로드하였다.
상기 컬럼을 25°C, 0.5M NaCl에서 20mM Tris-HCl, pH 7.5에서, 40mM에서 700mM까지 농도가 증가하는 선형 구배의 이미다졸에 용출시켜 신규 Cas13 단백질을 수득하였다.
실험예 1.4. 프로그래밍 가능한 가이드 RNA 제조
실험예 1.1에서 특정된 신규 CRISPR/Cas13 시스템의 프로그래밍 가능한 가이드 RNA (이하, crRNA로도 지칭함)는 TranscriptAid T7 High Yield Transcription kit (Thermo fisher) 또는 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kits (New England Biolabs)를 사용하여 시험관 외 전사 (in vitro Transc ription)를 통해 합성되었다.
상기 시험관 외 전사를 위해, 상기 crRNA 암호화 서열의 근위 말단에 T7 프로모터를 함유하는 단편을 프라이머를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 생성하거나, T7 프라이머 올리고핵산을 단일 가닥 주형 올리고핵산에 어닐링하였다.
제조된 crRNA를 RNeasy MiniElute Cleanup 키트(Qiagen) 또는 Monarch RNA Cleanup Kit(50μg)(New England Biolabs)를 사용하여 정제하였다.
상기 시험관 외 전사에 사용된 프라이머는 다음 표와 같다:
신규 CRISPR/Cas13 시스템의 프로그래밍 가능한 가이드 RNA를 합성하기 위해 사용된 프라이머
Label Sequence SEQ ID NO
crRNA Forward primer GAAATTAATACGACTCACTATAGGAAACGTACTACACCCTTTTTGTAAGGGTCTGAAACC 77
crRNA Example 2.1 Reverse primer GATTCAACTGGCAGTAACCAGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 78
crRNA Example 2.2 Reverse primer CACATTGGCACCCGCAATCCTGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 79
crRNA Example 2.3 Reverse primer AATGCTGCAATCGTGCTACAAGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 80
crRNA Example 2.4 Reverse primer TTGGCCGCAAATTGCACAATTTGGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 81
crRNA Example 2.5 Reverse primer AGGAACTGATTACAAACATTGGCGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 82
crRNA Example 2.6 Reverse primer GGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 83
crRNA Example 3.1 Reverse primer CGGAAGAGACAGGTACGTTAGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 84
crRNA Example 3.2 Reverse primer GTTACACTAGCCATCCTTACGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 85
crRNA Example 3.3 Reverse primer TGTGCGTACTGCTGCAATATTGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 86
crRNA Example 3.4 Reverse primer CAATATTGTTAACGTGAGTCTTGGTTTCAGACCCTTACAAAAAGGG 87
실험예 1.5. 신규 CRISPR/Cas13 복합체 제조
신규 CRISPR/Cas13 복합체를 실험예 1.3에 의해 제조된 40 nM의 Cas13 단백질 및 실험예 1.4에 의해 제조된 40nM의 crRNA를 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100ug/mL BSA (pH=7.9)를 함유하는 NEB r2.1 완충액에서 실온에서 15분 동안 배양하여 제조하였다.
실험예 1.6. CRISPR/Cas13 복합체를 이용한 표적핵산 검출 방법
1x NEB 2.0 buffer, 0.6 U/uL의 Rnase Inhibitor, 12.5 nM의 Rnase alert (IDT reporter) 실험예에 따라 다양한 농도(0.1 - 100 ng/uL)의 표적 RNA, 및 뉴클레이즈를 포함하지 않는 정제수 100 uL를 혼합하여 반응 용액을 제조하였다.
상기 반응 용액에 실험예 1.5에 의해 제조된 신규 CRISPR/Cas13 복합체를 첨가하였다.
상기 혼합물을 384-웰(SPL)에 로드하고 형광 플레이트 판독기(TECAN, Infinite 200 Pro M Plex)에서 37°C에서 최대 1시간 동안 배양하고 3분마다 형광 측정을 수행하였다 (λex: 535 nm; λem: 485 nm, gain: -135).
실험예 2. 신규 CRISPR/Cas13 복합체를 이용한 표적핵산 검출 실험 1
실험예 2.1. 가이드 도메인 서열에 따른 표적 핵산 검출 실험
실험예 1.5에 따라 제조된 신규 CRISPR/Cas13 복합체가 부수적 절단 활성을 가지고, 나아가 표적 핵산 검출에 활용할 수 있는 지를 확인하기 위해, 실험예 1.6에 따라 표적 핵산 검출 실험을 진행하였다.
표적 핵산은 COVID-19의 N-gene에 해당되며, 서열은 다음과 같다:
ucugauaauggaccccaaaaucagcgaaaugcaccccgcauuacguuugguggacccucagauucaacuggcaguaaccagaauggagaacgcaguggggcgcgaucaaaacaacgucggccccaagguuuacccaauaauacugcgucuugguucaccgcucucacucaacauggcaaggaagaccuuaaauucccucgaggacaaggcguuccaauuaacaccaauagcaguccagaugaccaaauuggcuacuaccgaagagcuaccagacgaauucgugguggugacgguaaaaugaaagaucucaguccaagaugguauuucuacuaccuaggaacugggccagaagcuggacucccuauggugcuaacaaagacggcaucauaggguugcaacugagggagccuugaauacaccaaaagaucacauuggcacccgcaauccugcuaacaaugcugcaaucgugcuacaacuuccucaaggaacaacauugccaaaaggcuucuacgcagaagggagcagaggcggcagucaagccucuucucguuccucaucacguagucgcaacaguucaagaaauucaacuccaggcagcaguaggggaaccuccugcuagaauggcuggcaauggcggugaugcugcucuugcuuugcugcugcuugacagauugaaccagcuugagagcaaaaugucugguaaaggccaacaacaacaaggccaaacugucacuaagaaaucugcugcugaggcuucuaagaagccucggcaaaaacguacugccacuaaagcauacaauguaacacaagcuuucggcagacgugguccagaacaaacccaaggaaauuuuggggaccaggaacuaaucagacaaggaacugauuacaaacauuggccgcaaauugcacaauuugcccccagcgcuucagcguucuucggaaugucgcgcauuggcauggaagaaaaaa(서열번호 5)
실험예 2.1에서 사용한 신규 CRISPR/Cas13 복합체의 각 구성은 다음 표에 나타내었다:
각 실험의 음성 대조군으로, 프로그래밍 가능한 가이드 RNA 없이, Cas13 단백질만을 첨가하였다.
실험예 2에서 사용한 신규 CRISPR/Cas13 복합체의 각 구성
Label Cas13 protein
(SEQ ID NO)		 Direct Repeat
(SEQ ID NO)		 Guide domain PFS
Example 2.1 1 2 TGGTTACTGCCAGTTGAATC G
Example 2.2 AGGATTGCGGGTGCCAATGTG G
Example 2.3 TTGTAGCACGATTGCAGCATT C
Example 2.4 CAAATTGTGCAATTTGCGGCCAA C
Example 2.5 GCCAATGTTTGTAATCAGTTCCT C
Example 2.6 TTGTCTGATTAGTTCCTGGTCCC G
상기 실험 결과를 도 1 내지 도 6에 나타내었다:
실험 결과, 상기 신규 CRISPR/Cas13 복합체는 1) 다양한 서열의 가이드 도메인이 모두 표적 핵산과 결합하여 부수적 절단 기능이 활성화되며, 2) 표적 핵산 검출 용도로 사용할 수 있을 정도로 충분한 부수적 절단 활성을 보이는 것을 볼 수 있다.
실험예 2.2. 농도에 따른 표적 핵산 검출 실험
실험예 1.5에 따라 제조된 신규 CRISPR/Cas13 복합체가 부수적 절단 활성을 가지고, 나아가 표적 핵산 검출에 활용할 수 있는 지를 확인하기 위해, 전술한 COVID-19의 N-gene을 표적 핵산으로 하여, 실험예 1.6에 따라 표적 핵산 검출 실험을 진행하였다.
실험예 2에서 사용한 신규 CRISPR/Cas13 복합체의 각 구성은 다음 표에 나타내었다:
실험예 2.2에서 사용한 신규 CRISPR/Cas13 복합체의 각 구성 및 농도
Label Cas13 protein
(SEQ ID NO)		 Direct Repeat
(SEQ ID NO)		 Guide domain PFS Concentration
(ng/uL)
Example 2.2.1 1 2 AGGATTGCGGGTGCCAATGTG G 0.05
Example 2.2.2 0.1
Example 2.2.3 0.25
Example 2.2.4 0.5
Example 2.2.5 1
Example 2.5.1 GCCAATGTTTGTAATCAGTTCCT C 0.05
Example 2.5.2 0.1
Example 2.5.3 0.25
Example 2.5.4 0.5
Example 2.5.5 1
각 실험의 음성 대조군으로, 프로그래밍 가능한 가이드 RNA 없이, Cas13 단백질만을 첨가하였다.
상기 실험 결과를 도 7 내지 도 8에 나타내었다:
실험 결과, 상기 신규 CRISPR/Cas13 복합체는 1) 적은 농도로도 표적 핵산과 결합하여 부수적 절단 기능이 활성화되며, 2) 표적 핵산 검출 용도로 사용할 수 있을 정도로 충분한 부수적 절단 활성을 보이는 것을 볼 수 있다.
실험예 3. 신규 CRISPR/Cas13 복합체를 이용한 표적핵산 검출 실험 2
실험예 3.1. 가이드 도메인 서열에 따른 표적 핵산 검출 실험
실험예 1.5에 따라 제조된 신규 CRISPR/Cas13 복합체가 부수적 절단 활성을 가지고, 나아가 표적 핵산 검출에 활용할 수 있는 지를 확인하기 위해, 실험예 1.6에 따라 표적 핵산 검출 실험을 진행하였다.
실험예 3.1에서 사용한 신규 CRISPR/Cas13 복합체의 각 구성은 다음 표에 나타내었다:
표적 핵산은 COVID-19의 E-gene에 해당되며, 서열은 다음과 같다:
uacucauucguuucggaagagacagguacguuaauaguuaauagcguacuucuuuuucuugcuuucgugguauucuugcuaguuacacuagccauccuuacugcgcuucgauugugugcguacugcugcaauauuguuaacgugagucuuguaaaaccuucuuuuuacguuuacucucguguuaaaaaucugaauucuucuagaguuccugaucuucuggucuaaaaaa(서열번호 6)
실험예 3에서 사용한 신규 CRISPR/Cas13 복합체의 각 구성
Label Cas13 protein
(SEQ ID NO)		 Direct Repeat
(SEQ ID NO)		 Guide domain PFS
Example 3.1 1 2 TAACGTACCTGTCTCTTCCG A
Example 3.2 GTAAGGATGGCTAGTGTAAC T
Example 3.3 AATATTGCAGCAGTACGCACA G
Example 3.4 AAGACTCACGTTAACAATATTG C
상기 실험 결과를 도 9 내지 도 11에 나타내었다:
여기서, 상기 Example 3.4의 경우, 반응 직후 형광 신호 강도 측정 범위를 넘어섰으며, 따로 그래프를 도시하지는 않았다.
실험 결과, 상기 신규 CRISPR/Cas13 복합체는 1) 다양한 서열의 가이드 도메인이 모두 표적 핵산과 결합하여 부수적 절단 기능이 활성화되며, 2) 표적 핵산 검출 용도로 사용할 수 있을 정도로 충분한 부수적 절단 활성을 보이며, 3) Protospacer Flanking Sequence에 대한 의존 없이, 가이드 도메인과 상보적인 서열의 존재 만으로 기능한다는 것을 볼 수 있다.
실험예 3.2. 농도에 따른 표적 핵산 검출 실험
실험예 1.5에 따라 제조된 신규 CRISPR/Cas13 복합체가 부수적 절단 활성을 가지고, 나아가 표적 핵산 검출에 활용할 수 있는 지를 확인하기 위해, 전술한 COVID-19의 E-gene을 표적 핵산으로 하여, 실험예 1.6에 따라 표적 핵산 검출 실험을 진행하였다.
실험예 3.2에서 사용한 신규 CRISPR/Cas13 복합체의 각 구성은 다음 표에 나타내었다:
실험예 2.2에서 사용한 신규 CRISPR/Cas13 복합체의 각 구성 및 농도
Label Cas13 protein
(SEQ ID NO)		 Direct Repeat
(SEQ ID NO)		 Guide domain PFS Concentration
(ng/uL)
Example 3.3.1 1 2 AATATTGCAGCAGTACGCACA G 0.05
Example 3.3.2 0.1
Example 3.3.3 0.25
Example 3.3.4 0.5
Example 3.3.5 1
Example 3.4.1 AAGACTCACGTTAACAATATTG C 0.05
Example 3.4.2 0.1
Example 3.4.3 0.25
Example 3.4.4 0.5
Example 3.4.5 1
각 실험의 음성 대조군으로, 프로그래밍 가능한 가이드 RNA 없이, Cas13 단백질만을 첨가하였다.
상기 실험 결과를 도 12 내지 도 13에 나타내었다:
여기서, Example 3.4.5의 경우 반응 4분 이후, Example 3.4.4의 경우 반응 8분 이후, Example 3.4.3의 경우 반응 14분 이후 검출 한도를 넘어서며, 65000의 수치는 데이터 포인트를 채우기 위해 삽입한 것이다.
실험 결과, 상기 신규 CRISPR/Cas13 복합체는 1) 적은 농도로도 표적 핵산과 결합하여 부수적 절단 기능이 활성화되며, 2) 표적 핵산 검출 용도로 사용할 수 있을 정도로 충분한 부수적 절단 활성을 보이는 것을 볼 수 있다.
이 명세서에서 개시하는 발명은 신규 CRISPR/Cas13 시스템과 관련된다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템은 표적 특이적으로 핵산을 절단할 수 있으며, 부수적으로 임의의 핵산을 절단할 수 있다. 위 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 비표적 핵산 절단, 또는 표적 핵산 검출 용도로 사용할 수 있다.

Claims (14)

  1. 다음을 포함하는 신규 CRISPR/Cas13 조성물:
    서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 Cas13 단백질, 또는 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산; 그리고
    프로그램 가능한 가이드 RNA, 또는 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산,
    위 프로그램 가능한 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 직접 반복부와 가이드 도메인이 연결된 구조를 가지고,
    위 직접 반복부는 위 Cas13 단백질과 상호작용하여 복합체를 형성하고,
    위 직접 반복부는 서열번호 2의 RNA 서열을 포함하고,
    위 가이드 도메인은 미리 결정된 표적 핵산과 상보적으로 결합할 수 있음.
  2. 제1항의 신규 CRISPR/Cas13 조성물에 있어서,
    위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산은 DNA 또는 mRNA이고,
    위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 DNA임.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 하나의 신규 CRISPR/Cas13 조성물에 있어서,
    위 신규 CRISPR/Cas13 조성물은 위 Cas13 단백질과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 포함하고,
    위 Cas13 단백질과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA는 단백질-RNA 복합체를 형성함.
  4. 제1항 내지 제2항 중 어느 하나의 신규 CRISPR/Cas13 조성물에 있어서,
    위 신규 CRISPR/Cas13 조성물은 위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함함.
  5. 제4항의 신규 CRISPR/Cas13 조성물에 있어서,
    위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 한 분자의 벡터에 포함됨.
  6. 제4항의 신규 CRISPR/Cas13 조성물에 있어서,
    위 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산과 위 프로그램 가능한 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 두 분자 이상의 벡터에 각각 포함됨.
  7. 제5항 내지 제6항 중 어느 하나의 신규 CRISPR/cas13 조성물에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 또는 이들의 적절한 조합임.
  8. 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 사용하여 비표적 RNA를 절단하는 방법으로, 다음을 포함함:
    제3항의 신규 CRISPR/Cas13 조성물을 샘플과 혼합하는 과정,
    여기서, 상기 샘플은 표적 RNA 및 비표적 RNA를 포함하고,
    위 신규 CRISPR/Cas13 조성물의 프로그램 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인은 위 표적 RNA와 상보적으로 결합할 수 있음.
  9. 신규 CRISPR/Cas13 시스템을 사용하여 표적 RNA를 검출하는 방법으로, 다음을 포함함:
    (a) 제3항의 신규 CRISPR/Cas13 조성물, 샘플, 그리고 검출 시약을 혼합하는 과정,
    여기서, 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물의 프로그램 가능한 가이드 RNA의 가이드 도메인은 위 표적 RNA와 상보적으로 결합할 수 있고,
    위 검출 시약은 리포터를 포함하고, 위 리포터는 프로브 핵산을 포함하고,
    위 프로브 핵산이 절단되면 위 리포터는 검출 가능한 신호를 생성함,
    여기서, 위 샘플이 위 표적 RNA를 포함하는 경우, 위 신규 CRISPR/Cas13 조성물의 단백질-RNA 복합체가 위 표적 RNA와 상보적으로 결합하고, 위 단백질-RNA 복합체의 부수적 절단 기능이 활성화되고, 이에 따라 위 프로브 핵산이 절단됨; 그리고
    (b) 위 혼합물에서 위 검출 가능한 신호를 측정하는 과정,
    위 검출 가능한 신호를 측정하여 위 표적 RNA에 대한 정보를 얻을 수 있음.
  10. 제9항의 표적 RNA를 검출하는 방법에 있어서,
    위 (b) 과정은 위 검출 가능한 신호의 발생 여부; 발생하는 신호의 강도; 신호 강도의 시간에 따른 변화; 또는 위 사항의 임의의 조합을 측정하는 과정임.
  11. 제9항 내지 제10항 중 어느 하나의 표적 RNA를 검출하는 방법에 있어서,
    위 표적 RNA에 대한 정보는 위 표적 RNA가 존재하는 지 여부, 위 표적 RNA가 샘플 내에 얼마나 포함되었는 지 여부, 또는 위 사항 모두임.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 표적 RNA를 검출하는 방법에 있어서,
    위 검출 가능한 신호는 형광 신호임.
  13. 다음을 포함하는, COVID-19 진단 정보 제공 방법:
    (a) 신규 CRISPR/Cas13 복합체, 검체, 그리고 검출 시약을 혼합하는 과정,
    여기서, 위 검체는 COVID-19 감염이 의심되는 환자에서 채취한 검체이고,
    여기서, 위 신규 CRISPR/Cas13 복합체는 다음을 포함함:
    서열번호 1의 Cas13 단백질; 그리고 가이드 RNA,
    여기서, 위 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 서열번호 2의 직접 반복부와 가이드 도메인이 순차적으로 연결된 구조이고,
    위 가이드 도메인은 서열번호 37 내지 서열번호 51, 그리고 서열번호 52 내지 서열번호 56 중 선택된 RNA 서열을 포함함,
    여기서, 위 검출 시약은 리포터를 포함하고, 위 리포터는 프로브 핵산을 포함하고,
    위 프로브 핵산이 절단되면 위 리포터는 형광 신호를 생성함;
    (b) 위 혼합물에서 형광 신호를 측정하는 과정; 그리고,
    (c) 위 형광 신호를 분석하여 검체를 제공한 환자가 COVID-19에 감염되었는 지에 대한 정보를 얻는 과정.
  14. 제13항의 COVID-19 진단 정보 제공 방법에 있어서,
    위 (b) 과정은 형광 신호 발생 여부; 발생하는 형광 신호의 강도; 형광 신호의 시간에 따른 변화; 또는 이들의 임의의 조합을 측정하는 과정임.
PCT/KR2024/095888 2023-06-30 2024-06-24 신규 crispr/cas13 시스템 및 그 용도 Ceased WO2025005777A1 (ko)

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