WO2025018656A1 - 저장단백질 함량이 저감된 콩 형질전환체 및 이의 용도 - Google Patents

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    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm

Definitions

  • the present invention relates to a soybean transformant having a reduced storage protein content and its use.
  • the soybean seed is composed of 40% protein, and compared to other plants, it has a much higher protein content, so it can be considered a suitable species for overexpressing useful proteins.
  • the William 82 variety has the advantage of being exportable as a foreign variety.
  • the endogenous storage protein of soybeans accounts for more than 70% of the total protein, the accumulation of useful proteins, which are external proteins, is hindered.
  • RNAi RNA interference
  • siRNA small interfering RNA
  • the vector since the siRNA transcribed from the inserted vector acts as a mediator of protein expression suppression, the vector must continue to exist even after the generation is developed in order to maintain the protein suppression trait. Transformants created with RNAi cannot escape from GMO (Genetically Modified Organism) preparations, but since the pathway from mRNA to protein is completely blocked, it is expected that a large amount of proteins can be knocked down.
  • GMO Genetically Modified Organism
  • Korean Patent Publication No. 2011-0044211 discloses 'Improved protein production and storage in plants'
  • Korean Patent Publication No. 2014-0123783 discloses 'Transformant with improved composition of storage protein and method for producing same', but 'Soybean transformant with reduced storage protein content and use thereof' of the present invention is not described.
  • the present invention was derived from the above-mentioned needs, and the present inventors used RNAi technology to produce soybean transgenic plants in which the expression of glycinin (11S) and ⁇ -conglycinin (7S), which are soybean storage proteins, was suppressed, either individually or both, in order to suppress endogenous storage proteins and increase the amount of accumulation of exogenous useful proteins. Thereafter, the soybean transgenic plants were crossed with soybean plants producing thioredoxin (TRX) using a traditional method, and the production of thioredoxin was confirmed.
  • TRX thioredoxin
  • the present invention provides a method for producing a soybean transgenic plant having a reduced storage protein content in a seed, comprising the steps of: transforming a soybean plant cell with a recombinant plant RNAi (RNA interference) vector including a storage protein coding gene to suppress the expression of the storage protein coding gene; and redifferentiating a transformed soybean plant from the transformed soybean plant cell.
  • RNAi RNA interference
  • the present invention provides a soybean transgenic plant having a reduced storage protein content in seeds produced by the above method and a transformed seed thereof.
  • the present invention provides a method for mass producing a useful protein from soybean seeds, which comprises the step of artificially crossing a soybean transgenic plant having a reduced storage protein content with a soybean plant overexpressing a useful protein.
  • the present invention provides a method for producing a transgenic plant having increased productivity of useful protein in seeds compared to the parent plant, the method comprising the step of artificially crossing a soybean transgenic plant with a reduced storage protein content as a parent plant and a soybean plant overexpressing a useful protein as a parent plant.
  • the soybean plant with suppressed storage protein expression is intended to be cultivated and utilized as a transformed soybean for the production of useful proteins.
  • the transformed soybean with suppressed storage protein expression can be additionally transformed for overexpression of useful proteins, or can be crossed with a transformed plant overexpressing useful proteins to produce an exogenous useful protein at a high yield.
  • Figure 1 is a diagram of the pCKLSL-Glycinin vector used to knock down the glycinin gene.
  • the upper part shows a part of the sequence of the glycinin gene inserted into the vector, and the lower part shows a schematic diagram of the pCKLSL-Glycinin vector.
  • Figure 2 is about the pCKLSL-Glycinin/Conglycinin vector used to knockdown the glycinin/conglycinin gene.
  • the upper part shows a part of the sequence of the glycinin/conglycinin gene inserted into the vector, and the lower part shows a schematic diagram of the pCKLSL-Glycinin/Conglycinin vector.
  • Figure 3 shows the pCKLSL-Conglycinin vector used to knock down the conglycinin gene.
  • the upper part shows a part of the sequence of the conglycinin gene inserted into the vector, and the lower part shows a schematic diagram of the pCKLSL-Conglycinin vector.
  • FIG 4 shows the Agrobacterium-mediated soybean transformation method.
  • (a-1) is the appearance of soybean explants grown on CCM medium after Agrobacterium inoculation
  • (a-2) is the appearance after 5 days
  • (b) is the appearance of the explants transferred to SIM-1 medium and induced to grow shoots for 14 days
  • (c) is the appearance of the shoots cultured after the explants were transferred to SIM-2 and selected with PPT for 14 days
  • (d) is the appearance of the explants transferred to SEM medium for shoot elongation and cultured until the shoots grew to about 10 cm
  • (e) is the appearance of the shoots transferred to RM medium for root induction and cultured for 21 days
  • (f) is the appearance of the rooted shoots transferred to soil and acclimatized
  • (g) is the appearance of the transformed plant
  • (h) is the result of PPT leaf painting, the leaves of the non-transformant were sensitive to PPT (h-1), The leaves of the transformants showed resistance (
  • Figure 5 shows the results of PCR confirmation of the introduced gene in the T 0 transgenic plant.
  • Figure 6 shows the results of Southern blot analysis to confirm the copy number of the introduced gene in the T 0 transgenic plant.
  • Figure 7 shows the results of confirming the expression level of the knockout target gene in T 0 transgenic plants by qRT-PCR.
  • Figure 8 shows the results of analyzing the expression of storage proteins in T 1 seeds of transgenic plants.
  • Figure 9 shows the results of comparing the productivity of TRX by crossing transgenic plants in which glycinin expression is inhibited with soybean plants producing thioredoxin (TRX).
  • Figure 10 shows the results of comparing the productivity of TRX in progeny seeds of a cross between a transgenic plant in which glycinin expression is inhibited and a soybean plant producing thioredoxin (TRX).
  • the present invention provides a method for producing a soybean transgenic plant having a reduced storage protein content in a seed, the method comprising the steps of: transforming a soybean plant cell with a recombinant plant RNAi (RNA interference) vector including a storage protein coding gene to suppress the expression of the storage protein coding gene; and redifferentiating a transformed soybean plant from the transformed soybean plant cell.
  • RNAi RNA interference
  • the storage protein may be at least one selected from the group consisting of ⁇ -conglycinin and glycinin proteins, but is not limited thereto.
  • the beta-conglycinin (7S) is a heterogeneous glycoprotein having a molecular weight in the range of 150 to 240 kDa, and is a protein composed of various combinations of three highly negatively charged subunits identified as alpha, alpha' and beta.
  • the above glycinin (11S) is a large protein with a molecular weight of approximately 360 kDa, and is a hexameric protein composed of various combinations of five major subunits identified as G1, G2, G3, G4, and G5.
  • beta-conglycinin coding gene may include alpha, alpha' and beta subunit coding genes, and preferably may be an alpha subunit coding gene of Glyma20g28650 or Glyma20g38660 , an alpha' subunit coding gene of Glyma10g39150 and a beta subunit coding gene of Glyma20g28460 or Glyma20g28640 , but is not limited thereto.
  • the glycinine coding gene according to the present invention may include G1, G2, G3, G4 and G5 subunit coding genes, and preferably may be, but is not limited to, genes of Glyma03g32030 (G1), Glyma03g32020 (G2), Glyma1g34780 (G3), Glyma10g04280 (G4) and Glyma13g18450 (G5).
  • G1 Glyma03g32030
  • G2 Glyma03g32020
  • G3 Glyma1g34780
  • G4 and Glyma13g18450 G5
  • Information on each of the above subunit coding genes can be found at SoyBase (https:/www.soybase.org/).
  • recombinant in the present invention refers to a cell which replicates a heterologous nucleic acid, expresses said nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • a recombinant cell may express a gene or gene fragment not found in the native form of said cell, either in sense or antisense form.
  • a recombinant cell may also express a gene found in the native cell, but which gene has been modified and reintroduced into the cell by artificial means.
  • RNAi is an abbreviation for RNA interference, and refers to a phenomenon in which, when an agent that induces RNAi, such as double-stranded RNA (also called dsRNA), is introduced into a cell, homologous mRNA is specifically degraded, thereby inhibiting the synthesis of a gene product.
  • RNAi as used here has the same meaning as the agent that induces RNAi.
  • RNAi is a process in which short double-stranded RNA selectively degrades target mRNA corresponding to its own base sequence, thereby stopping the transcription and protein synthesis of the target gene, and there are several methods for producing siRNA (small interfering RNA) used to specifically induce this RNAi phenomenon, including a method of directly synthesizing siRNA in vitro and then introducing it into cells through transfection, and a method of utilizing an shRNA (short hairpin RNA) expression vector that is designed to express siRNA in cells.
  • siRNA small interfering RNA
  • an shRNA expression vector When an shRNA expression vector is expressed in a cell through transformation using a method utilizing an expression vector, the sense and antisense sequences of the target base sequence are positioned with a linker in between from the promoter and expressed, thereby synthesizing a small hairpin structured shRNA.
  • the shRNA synthesized in this way is decomposed by an RNase III enzyme called Dicer present in the cell and converted into an siRNA of about 21 to 23 nucleotides with an accurate structure, and it is obvious to those skilled in the art that it binds to a protein complex called RISC (RNA-induced Silencing Complex) to decompose the target mRNA (Plant Cell Physiol. "Simple RNAi Vectors for Stable and Transient Suppression of Gene Function in Rice” 45(4): 490-95 (2004)).
  • RISC RNA-induced Silencing Complex
  • the term "vector” means a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, a phage particle, or simply a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host, the vector may replicate and function independently of the host genome, or in some cases may be integrated into the genome itself.
  • a "vector for plant transformation” means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and appropriate nucleic acid sequences necessary to express the coding sequence operably linked in a particular plant host organism. Promoters, enhancers, termination signals, and polyadenylation signals that are available in plant cells are known to those skilled in the art.
  • the vector of the present invention is most preferably a vector for plant transformation, but is not limited thereto.
  • the vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or expression.
  • the vector of the present invention can be constructed using a prokaryotic cell or a eukaryotic cell as a host.
  • a prokaryotic cell for example, when the recombinant vector of the present invention is an expression vector and uses a prokaryotic cell as a host, it generally includes a strong promoter capable of promoting transcription (e.g., pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.), a ribosome binding site for initiating translation, and a transcription/translation termination sequence.
  • promoter means a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription.
  • a "plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in a plant cell.
  • a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental states or cell differentiation. A constitutive promoter may be preferred in the present invention because selection of transformants can be performed by various tissues at various stages. Therefore, a constitutive promoter does not limit the possibility of selection.
  • the storage protein coding gene may preferably be operably linked downstream of a beta-conglycinin promoter, but is not limited thereto.
  • the beta-conglycinin promoter according to the present invention may be composed of the base sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector may preferably contain one or more selectable markers.
  • the marker is a nucleic acid sequence having a characteristic that can be selected, typically by chemical means, and includes any gene that can distinguish transformed cells from non-transformed cells.
  • the marker gene may be, but is not limited to, a dominant drug resistance gene.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed by methods known to those skilled in the art.
  • the methods include in vitro recombinant DNA techniques, DNA synthesis techniques, and in vivo recombination techniques.
  • Any host cell known in the art can be used as the host cell for stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention, and examples thereof include Bacillus strains such as Escherichia coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, B. thuringiensis , and enteric bacteria and strains such as Salmonella typhimurium , Serratia marcescens , and various Pseudomonas species.
  • Bacillus strains such as Escherichia coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, B. thuringiensis , and enteric bacteria and strains such as Salmonella typhimurium , Ser
  • yeast e.g., Saccharomyce cerevisiae
  • insect cells e.g., human cells
  • human cells e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, and MDCK cell lines
  • plant cells can be used as host cells, preferably plant cells.
  • Plant cell used in plant transformation may be any plant cell.
  • Plant cells include cultured cells, cultured tissues, cultured organs, and whole plants.
  • Plant tissue includes differentiated or undifferentiated plant tissues, such as but not limited to roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used in culture, such as single cells, protoplasts, shoots, and callus tissues. Plant tissues may be in planta , organ culture, tissue culture, or cell culture.
  • Transformation of plants refers to any method for transferring DNA into plants. Such transformation methods do not necessarily require regeneration and/or tissue culture periods. Transformation of plant species is now commonplace for plant species, including both dicotyledonous and monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the invention into a suitable progenitor cell. Methods include the calcium/polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), electroporation of protoplasts (Shillito RD et al., 1985 Bio/Technol.
  • a preferred method according to the present invention comprises Agrobacterium mediated DNA transfer.
  • any method known in the art can be used for regenerating a transformed plant from the transformed plant cell.
  • the transformed plant cell must be regenerated into a whole plant.
  • Techniques for regenerating a mature plant from callus or protoplast cultures are well known in the art for a number of different species.
  • the present invention also provides a soybean transgenic plant with reduced storage protein content produced by the above method and a transformed seed thereof.
  • the soybean transgenic plant with reduced storage protein content according to the present invention may be a plant in which the ⁇ -conglycinin and/or glycinin protein coding gene is knocked down by RNA interference.
  • the present invention also provides a method for mass producing a useful protein from soybean seeds, comprising the step of artificially crossing a soybean transgenic plant having a reduced storage protein content with a soybean plant overexpressing a useful protein.
  • the useful protein may be at least one selected from the group consisting of antigens, antibodies, cell receptors, enzymes, structural proteins, serum, and cell proteins, but is not limited thereto.
  • the artificial crossbreeding can be performed according to a method known to those skilled in the art related to plant breeding.
  • a method for mass-producing useful proteins from soybean seeds according to one embodiment of the present invention utilizes the fact that the content of useful proteins is significantly increased in the offspring generation after artificial crossing a soybean transgenic plant having a reduced storage protein content according to the present invention with a soybean plant overexpressing a useful protein, compared to a soybean plant overexpressing a useful protein.
  • the present invention also provides a method for producing a transgenic plant having increased productivity of useful proteins in seeds compared to the parent plant, the method comprising the step of artificially crossing a soybean transgenic plant with a reduced storage protein content as a parent plant and a soybean plant overexpressing a useful protein as a parent plant.
  • RNAi-mediated transformation was performed by constructing an insert with a hairpin structure to produce double-stranded siRNA and inserting it into the pCKLSL vector.
  • a total of three vectors were constructed: pCKLSL-Glycinin (sense size: 320 bp; SEQ ID NO: 2) targeting glycinin (11S), pCKLSL-Glycinin/Conglycinin (sense size: 364 bp; SEQ ID NO: 3) targeting glycinin and conglycinin (7S), and pCKLSL-Conglycinin (sense size: 174 bp; SEQ ID NO: 4) targeting conglycinin.
  • the gene targeting 11S was extracted from Monica et al.
  • Plasmid DNA was extracted from E. coli strain DH5 ⁇ into which T-DNA had been introduced, and the extracted plasmid DNA was inserted into EHA105 strain, an Agrobacterium competent cell, via electroporation.
  • EHA105 was cultured in liquid SOC medium for 1 hour and then cultured for 2 days on solid medium containing antibiotics.
  • a single colony selected via antibiotics was cultured in liquid YEP medium, and when the OD 600 nm value reached 0.5 to 0.7, a storage stock and an inoculation stock were created and stored at -70°C.
  • the William 82 variety ( Glycine max cv. Williams 82) used in the transformation experiment was selected by selecting seeds that were smooth, unwrinkled, and free of spots or dots when viewed with the naked eye.
  • 100 selected seeds were transferred to a petri dish (90 mm ⁇ 20 mm) lined with sterilized 3 mm filter paper, and the seed surfaces were initially disinfected with chlorine gas generated by mixing 95 ml of 8% sodium hypochlorite solution and 5 ml of 12 N hydrochloric acid in a desiccator for 20 hours.
  • the gas-sterilized seeds were stored in a petri dish sealed with parafilm.
  • the seeds that had completed wet culture were divided evenly into three 50-mL conical tubes. 45 mL of 1% sodium hypochlorite and 3 to 5 drops of Tween 20 were added to each tube, and the seeds were stirred for 10 minutes to perform secondary seed disinfection. After secondary disinfection, the disinfection solution was discarded and washed three times for 10 minutes using sterilized, distilled water. The washed seeds were soaked in sterilized water at 25°C for 20 hours.
  • the seeds soaked in sterile water were split vertically with a scalpel blade (Feather, No. 11) to leave only the explant with the embryonic axis attached, and the seed coat was removed.
  • Half of the hypocotyl and the hypocotyl attached to the explant were completely removed, and the site of the embryonic axis was wounded 10 times with a scalpel blade dipped in soaking solution.
  • the wounded explants were placed in the soaking solution and co-cultured for 30 minutes.
  • the moisture of the explants was removed in a petri dish lined with sterilized 3 mm filter paper and tissue paper.
  • the browned shoots and the lower part of the pads were removed by thinly cutting with a scalpel blade (Feather, No. 15).
  • the explants were placed 5–6 at a time on solid SEM plates dispensed in petri dishes (100 mm ⁇ 40 mm) to ensure absorption of nutrients.
  • Subculture was performed every 2 weeks with new SEM medium, and the browned shoots and pads were removed at each subculture to ensure nutrient absorption.
  • two petri dishes were connected to allow the shoots to elongate sufficiently.
  • the lower part of the stem was cut diagonally with a scalpel blade (Feather, No.
  • the soil was a mixture of topsoil (10% pearl, 10% FG, 300 L, Sungro Horticulture Co., Ltd.) and vermiculite in a 3:1 ratio.
  • the transplanted plants were acclimatized in a magenta box (25°C, 18 h/6 h light/dark) so that they could gradually adapt to the external environment.
  • PPT leaf painting 100 mg/L was performed on the surface of the leaves to conduct a second selection.
  • the individuals selected in the second selection were transplanted to a larger pot (20 cm ⁇ 25 cm) and grown in a greenhouse under the conditions of 25°C, 18 h/6 h (light/dark).
  • T 0 transgenic plants produced were sampled for analysis of young leaves (approximately 1 g). The collected leaves were rapidly cooled with liquid nitrogen and stored at -70°C. Finally, T 1 seeds were harvested from the transgenic plants, completely dried, and stored at -20°C. The harvested seeds were used for generation expansion and protein analysis.
  • PCR analysis was performed. For comparison, leaves sampled from the T 0 transgenic plant and leaves from the non-transgenic plant were finely ground in a mortar and pestle using liquid nitrogen. Genomic DNAs were extracted from the finely ground leaves using the CTAB method. The extracted DNAs were analyzed for PCR to confirm whether the T-DNA was introduced into the transgenic plant.
  • pCKLSL-Glycinin, pCKLSL-Glycinin/Conglycinin, and pCKLSL-Conglycinin mediated by RNAi were analyzed by PCR using the bar gene and ⁇ -conglycinin promoter-sense gene sequences.
  • the primers used to confirm the introduction of the gene are as follows.
  • Primer information used to confirm gene introduction Primer name Sequence (5' ⁇ 3') Sequence number Bar gene primer F TCTACCATGAGCCCAGAACG 8 Bar gene primer R GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC 9 ⁇ -Conglycinin promoter primer F TCAGTTACTTATCCTTCCTCCATC 10 Glycinin (sense) primer R CCCGGTACCAGCCACCGCAAAGTTTTGTGG 11 Glycinin/Conglycinin (sense) primer R GCCAACAAGTTCAATGTTTGCATC 12 Conglycinin (sense) primer R GCCAACAAGTTCAATGTTTGCATC 13
  • PCR was performed using a pre-mix taq PCR kit (GenetBio) and a thermal cycler (Bio-Rad), and the size of the PCR amplification product was confirmed by loading it onto a 1% agarose gel.
  • Genomic DNAs were extracted from 1 g leaf samples of finely ground non-transgenic and T 0 transgenic plants by the CTAB method. The extracted genomic DNA was adjusted to a concentration of 15–20 ng/ ⁇ l.
  • 10X enzyme buffer was added to the DNA and treated at 4°C for 4 hours.
  • 5 ⁇ l of enzyme HindIII (Roche) was added and treated at 4°C for 2 minutes and 40 seconds, and then treated at 37°C for 30 minutes.
  • the membrane was completely dried using a 3 mm filter paper and UV cross-linked using a spectro Linker XL-1000 UV crosslinker.
  • the membrane was sealed with 12 ml of DIG Easy hyb buffer and pre-hybridized (blocked) in a shaking incubator at 42°C and 110 rpm for 3 hours. After 3 hours of treatment, hybridization was performed overnight using the DIG Probe Synthesis Kit (Roche) amplified by PCR. On the 4th day, the membrane was treated with 2X SSC + 0.1% SDS buffer for 2 minutes, then treated with 0.5X SSC + 0.1% SDS buffer at 68°C for 30 minutes with agitation. After washing with DIG wash and Block buffer set (Roche), it was developed with CDP-Star in the dark.
  • RNA from transgenic and non-transgenic plants was extracted using the Plant RNA Reagent System.
  • RT-PCR was performed using SubPrimeScript RT-PCR Premix (2X) (GeNet Bio).
  • pCKLSL-Glycinin, pCKLSL-Glycinin/Conglycinin, and pCKLSL-Conglycinin mediated by RNAi were subjected to bar gene PCR analysis, and tublin , a housekeeping gene, was used to confirm that RNAs from the same sample were used.
  • Primer information used in RT-PCR Primer name Sequence (5' ⁇ 3') Sequence number Bar gene primer F AAGCACGGTCAACTTCCGTA 14 Bar gene primer R GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC 9 Tublin gene primer F TGAGCAGTTCACGGCCATGCT 15 Tublin gene primer R CTCGGCAGTGGCATCCTGGT 16
  • Primer information used in real-time PCR Primer name Sequence (5' ⁇ 3') Sequence number glycinin 1 primer F AGCCACAGTGCAAGGGTAAA 17 glycinin 1 primer R CGAACATTGCATTCTTGCGGA 18 glycinin 2 primer F CTCCGCAAGAATGCTATGTTCG 19 glycinin 2 primer R TCCTCTGGCAATGCGTTCAA 20 glycinin 3 primer F TCTCAGCGTGATAAGCCCAC 21 glycinin 3 primer R ACGAACATAGCATTCTTGCGG 22 glycinin 4 primer F AGTGTTCGACGGTGAGCTAAG 23 glycinin 4 primer R TTGATACTTGAGCTGACGCACT 24 glycinin 5 primer F ATCATCGCCCAAGGGAAAGG 25 glycinin 5 primer R ACTGGTTCATCGCCAGTGTT 26 ⁇ -conglycinin ⁇ primer F ACAGACTTCAATCTGGTGATGC 27 ⁇ -conglycinin ⁇ primer
  • Protein analysis was performed on seeds harvested from the produced transformants.
  • the harvested seeds were soaked in triple-distilled water for one day.
  • the soaked soybeans were split in half, and the weight of the explants without the hypocotyl attached was measured.
  • the explants were ground with 2 ml of sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2.5% SDS, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 10% glycerol), stirred for 1 hour at 25°C, and then treated at 95°C for 10 minutes. After that, the supernatant was extracted by centrifugation at 25°C for 5 minutes and 12,000 rpm. The extracted supernatant was quantified, mixed with 6X loading dye, and loaded onto a gel.
  • genomic DNAs were extracted from the leaves and PCR analysis was performed.
  • PCR was performed using the ⁇ -conglycinin promoter-sense gene and bar gene portions of the T-DNA region.
  • Gene introduction was confirmed in the pCKLSL-Glycinin transgenic plants, and it was confirmed that the glycinin gene and bar gene were introduced in 11 plants finally (Fig. 5a).
  • pCKLSL-Glycinin/Conglycinin confirmed that the glycinin/conglycinin gene and bar gene were introduced in 15 plants finally (Fig. 5b).
  • Fig. 5c In the pCKLSL-Conglycinin transgenic plants, it was confirmed that the conglycinin gene and bar gene were introduced in 5 plants finally (Fig. 5c).
  • the copy numbers of the introduced genes were confirmed through Southern blot in pCKLSL-Glycinin and pCKLSL-Glycinin/Conglycinin transgenic plants mediated by RNAi.
  • pCKLSL-Glycinin was confirmed to have 1 copy in #9, #13, #15, and #17, and #2, #8, and #16 were confirmed to have multiple copies (Fig. 6a).
  • pCKLSL-Glycinin/Conglycinin was confirmed to have 1 copy in #4, #6, and #15, and multiple copies in #8, #17, and #18 (Fig. 6b).
  • RT-PCR was performed to confirm the expression of the introduced gene, bar gene, and the tublin gene, a housekeeping gene, was used as an internal control.
  • qRT-PCR was used for the analysis.
  • pCKLSL-Conglycinin selected #5, #6, #7, #8, #9, and #10 as RT-PCR results, and unlike the previous two genes, the expression levels were not reduced overall, but it was confirmed that the target gene, conglycinin ⁇ , was reduced in #5 (Fig. 7c).
  • Seeds were harvested from the produced transformants and protein analysis was performed using SDS-PAGE. Protein analysis of T 1 seeds of RNAi-mediated transformants was performed at Mediprogen. Two seeds of non-transformed plants were used for comparison with seeds of transformed plants. The harvested seeds of pCKLSL-Glycinin and pCKLSL-Glycinin/Conglycinin were analyzed, and pCKLSL-Glycinin was able to confirm a knockdown result in #2 and pCKLSL-Glycinin/Conglycinin was able to confirm a knockdown result in #4 (Fig. 8). As expected from real-time PCR, rebalancing between proteins occurred in pCKLSL-Glycinin, as evidenced by the fainter target glycinin and non-target conglycinin bands.
  • the F2 seeds contained thioredoxin protein at a level approximately 10 times higher than the thioredoxin protein level of thioredoxin-producing soybean plants (Fig. 10).

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Abstract

본 발명은 저장단백질 함량이 저감된 콩 형질전환체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 베타-콘글리시닌(β-conglycinin) 및/또는 글리시닌(glycinin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi (RNA interference) 벡터로 형질전환되어 베타-콘글리시닌 및/또는 글리시닌 유전자의 발현이 억제된 콩 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체를 이용한 유용단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

저장단백질 함량이 저감된 콩 형질전환체 및 이의 용도
본 발명은 저장단백질 함량이 저감된 콩 형질전환체 및 이의 용도에 관한 것이다.
콩의 종자는 40%가 단백질로 이루어져 있으며, 타 식물체와 비교하였을 때 단백질 함량이 월등히 많다는 점에서 유용단백질 과발현에 적합한 종이라고 볼 수 있다. 특히나 William 82 품종은 외국품종으로써 수출이 가능하다는 장점이 있다. 하지만 콩의 내인성 저장단백질이 전체 단백질의 70% 이상을 차지하고 있기 때문에 외부 단백질인 유용단백질의 축적이 방해된다.
RNAi (RNA interference)는 이중 가닥의 siRNA (small interfering RNA)를 넣어 해당 정보를 가진 mRNA를 선택적으로 분해함으로써 mRNA에서 단백질로 합성되는 경로를 차단하는 원리이다. RNAi 방법의 경우, 삽입한 벡터에서 전사된 siRNA가 단백질 발현 억제의 매개가 되기 때문에 세대를 전개하여도 벡터가 계속 존재하여야 단백질 억제 형질이 유지될 수 있다. RNAi로 만들어진 형질전환체는 GMO (Genetically Modified Organism) 제제에서 벗어날 수 없지만 mRNA에서 단백질로의 경로를 완전히 차단하므로 다량의 단백질을 녹다운(knockdown) 시킬 수 있을 것으로 기대된다.
한편, 한국공개특허 제2011-0044211호에는 '식물에서의 개선된 단백질 생산 및 저장'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0123783호에는 '저장단백질의 조성이 개량된 형질전환체 및 이의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '저장단백질 함량이 저감된 콩 형질전환체 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 내생의(endogenous) 저장단백질을 억제하여 외래유용단백질 축적량을 증가시키고자, RNAi 기술을 이용하여 콩의 저장단백질인 글리시닌(glycinin, 11S)과 베타-콘글리시닌(β-conglycinin, 7S)을 각각 또는 모두 발현억제한 콩 형질전환 식물체를 제조하였다. 그 후, 상기 콩 형질전환 식물체를 티오레독신(thioredoxin, TRX) 생산 콩 식물체와 전통적인 방법으로 교배하여 티오레독신의 생산량을 확인한 결과, 티오레독신 생산 콩 식물체의 생산량보다 저장단백질의 발현이 억제된 형질전환체와의 교배를 통해 제조된 콩 식물체에서 티오레독신의 생산량이 약 3배 증가한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 저장단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi (RNA interference) 벡터로 콩 식물세포를 형질전환시켜 저장단백질 코딩 유전자의 발현을 억제하는 단계; 및 상기 형질전환된 콩 식물세포로부터 형질전환된 콩 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체와 유용단백질을 과발현하는 콩 식물체를 인공교배시키는 단계를 포함하는, 콩 종자에서 유용단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체를 모본으로 하고, 유용단백질을 과발현하는 콩 식물체를 부본으로 하여 이를 인공교배시키는 단계를 포함하는, 부본 대비 종자에서 유용단백질의 생산성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 저장단백질 발현이 억제된 콩 식물체는 품종화하여 유용단백질 생산을 위한 형질전환용 콩으로 활용하고자 한다. 또한, 저장단백질 발현이 억제된 형질전환용 콩은 추가적으로 유용단백질 과발현 형질전환을 진행하거나, 유용단백질 과발현 형질전환체와 교배하여 외생의(exogenous) 유용단백질을 고수율로 생산해 낼 수 있을 것이다.
도 1은 글리시닌 유전자를 녹다운시키기 위해 사용된 pCKLSL-Glycinin 벡터에 관한 것으로, 상단은 벡터 내 삽입된 글리시닌 유전자의 일부 서열을 보여주고, 하단은 pCKLSL-Glycinin 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 글리시닌/콘글리시닌 유전자를 녹다운시키기 위해 사용된 pCKLSL-Glycinin/Conglycinin 벡터에 관한 것으로, 상단은 벡터 내 삽입된 글리시닌/콘글리시닌 유전자의 일부 서열을 보여주고, 하단은 pCKLSL-Glycinin/Conglycinin 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 콘글리시닌 유전자를 녹다운시키기 위해 사용된 pCKLSL-Conglycinin 벡터에 관한 것으로, 상단은 벡터 내 삽입된 콘글리시닌 유전자의 일부 서열을 보여주고, 하단은 pCKLSL-Conglycinin 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 4는 아그로박테리움-매개 콩 형질전환 방법을 보여주는 것으로, (a-1)은 아그로박테리움 접종 후 CCM 배지에 치상한 콩 절편체의 모습이고, (a-2)는 5일 후의 모습이며, (b)는 절편체를 SIM-① 배지로 옮기고 14일 동안 신초를 유도한 모습이고, (c)는 절편체를 SIM-②로 옮겨 신초를 배양한 것으로 14일 동안 PPT로 선발한 모습이며, (d)는 절편체를 신초 신장을 위해 SEM 배지로 옮기고 신초가 약 10 cm가 될 때까지 배양한 모습이며, (e)는 신초를 뿌리 유도를 위해 RM 배지로 옮기고 21일 동안 배양한 모습이며, (f)는 발근한 신초를 토양으로 옮겨 순화한 모습이고, (g)는 형질전환 식물체의 모습이며, (h)는 PPT 잎 페인팅 결과로, 비형질전환체의 잎은 PPT에 감수성을 보이고(h-1), 형질전환체의 잎은 저항성을 보였다(h-2).
도 5는 T0 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 PCR로 확인한 결과이다.
도 6은 T0 형질전환 식물체에서 도입된 유전자의 카피 수를 서던블랏으로 확인한 결과이다.
도 7은 T0 형질전환 식물체에서 녹아웃 표적 유전자의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 8은 형질전환 식물체의 T1 종자에서 저장단백질 발현을 분석한 결과이다.
도 9는 글리시닌의 발현이 저해된 형질전환 식물체와 티오레독신(TRX) 생산 콩 식물체를 교배하여 TRX의 생산성을 비교한 결과이다.
도 10은 글리시닌의 발현이 저해된 형질전환 식물체와 티오레독신(TRX) 생산 콩 식물체의 교배체의 후대 종자에서 TRX의 생산성을 비교한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저장단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi (RNA interference) 벡터로 콩 식물세포를 형질전환시켜 저장단백질 코딩 유전자의 발현을 억제하는 단계; 및 상기 형질전환된 콩 식물세포로부터 형질전환된 콩 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 저장단백질은 베타-콘글리시닌(β-conglycinin) 및 글리시닌(glycinin) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 베타-콘글리시닌(7S)은 분자량이 150 내지 240 kDa 범위인 비균질 당단백질로, 알파, 알파' 및 베타로 확인된 3개의 고도로 음성 전하를 띠는 서브유닛의 다양한 조합물로 구성된 단백질이다.
또한, 상기 글리시닌(11S)은 분자량이 약 360 kDa인 대형 단백질로, G1, G2, G3, G4 및 G5로 확인된 5가지 주요 서브유닛의 다양한 조합물로 구성된 6량체 단백질이다.
또한, 본 발명에 따른 상기 베타-콘글리시닌 코딩 유전자는 알파, 알파' 및 베타 서브유닛 코딩 유전자를 포함할 수 있고, 바람직하게는 Glyma20g28650 또는 Glyma20g38660의 알파 서브유닛 코딩 유전자, Glyma10g39150의 알파' 서브유닛 코딩 유전자 및 Glyma20g28460 또는 Glyma20g28640의 베타 서브유닛 코딩 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 상기 글리시닌 코딩 유전자는 G1, G2, G3, G4 및 G5 서브유닛 코딩 유전자를 포함할 수 있고, 바람직하게는 Glyma03g32030 (G1), Glyma03g32020 (G2), Glyma1g34780 (G3), Glyma10g04280 (G4) 및 Glyma13g18450 (G5)의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 각 서브유닛 코딩 유전자 정보는 SoyBase (https:/www.soybase.org/)에서 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
또한, 용어 "RNAi"는 RNA 간섭(RNA inteference)의 약어이고, 이중나선 RNA(dsRNA로도 불림)과 같은 RNAi를 유발하는 작용제가 세포 내로 도입시 이에 대해 상동적인 mRNA가 특이적으로 분해되어 유전자 생성물의 합성이 억제되는 현상을 나타낸다. 여기에 사용된 RNAi는 RNAi를 유발하는 작용제와 동일한 의미를 지닌다. 상기 RNAi는 짧은 이중가닥 RNA가 자신의 염기서열에 해당하는 표적 mRNA를 선택적으로 분해하여 표적 유전자의 전사와 단백질 합성을 중단시키는 과정이며, 이러한 RNAi 현상을 특이적으로 유도하는데 사용되는 siRNA (small interfering RNA)을 제조하기 위한 방법은, 생체외(in vitro)에서 siRNA를 직접 합성한 후 형질도입(transfection)을 통해 세포 안으로 도입시키는 방법 및 세포 내에서 siRNA를 발현할 수 있도록 제작된 shRNA (short hairpin RNA) 발현벡터를 활용하는 방법이 있다. 발현벡터를 활용하는 방법을 이용하여 shRNA 발현벡터를 형질전환을 통해 세포 내에서 발현시키면 프로모터로부터 표적 염기서열의 센스(sense) 및 안티센스(anti-sense) 서열이 링커(linker)를 사이에 두고 위치하며 발현되게 되고, 이를 통해 small hairpin 구조의 shRNA가 합성된다. 이렇게 합성된 shRNA는 세포 안에 존재하는 Dicer라는 RNase Ⅲ 효소에 의해 분해되어 정확한 구조를 갖는 약 21 내지 23개의 뉴클레오티드의 siRNA로 전환되고, RISC (RNA-induced Silencing Complex)라는 단백질 복합체와 결합하여 표적 mRNA를 분해시키는 것은 통상의 기술자에게 자명하다 (Plant Cell Physiol. "Simple RNAi Vectors for Stable and Transient Suppression of Gene Function in Rice" 45(4): 490-95 (2004)).
본 발명에서, 용어 "벡터"란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 특히 "식물 형질전환용 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 식물 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 식물세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 본 발명의 벡터는 식물 형질전환용 벡터인 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.
본 발명에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 저장단백질 코딩 유전자는 바람직하게는 베타-콘글리시닌 프로모터의 하류에 작동가능하게 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 베타-콘글리시닌 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자(dominant drug resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균(Escherichia coli) JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체는 베타-콘글리시닌(β-conglycinin) 및/또는 글리시닌(glycinin) 단백질 코딩 유전자가 RNA 간섭(RNA inteference)에 의해 녹다운(knockdown)된 식물체일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체와 유용단백질을 과발현하는 콩 식물체를 인공교배시키는 단계를 포함하는, 콩 종자에서 유용단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 콩 종자에서 유용단백질을 대량으로 생산하는 방법에 있어서, 상기 유용단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 인공교배는 식물체의 육종과 관련되어 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 콩 종자에서 유용단백질을 대량으로 생산하는 방법은, 유용단백질을 과발현하는 콩 식물체 대비, 본 발명에 따른 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체와 유용단백질을 과발현하는 콩 식물체의 인공교배 후 자손세대에서 유용단백질의 함량이 현저히 증가되는 것을 이용한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체를 모본으로 하고, 유용단백질을 과발현하는 콩 식물체를 부본으로 하여 이를 인공교배시키는 단계를 포함하는, 부본 대비 종자에서 유용단백질의 생산성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 벡터 구축 및 아그로박테리움 준비
RNAi를 매개로 한 형질전환은 이중가닥의 siRNA가 생성되도록 헤어핀 구조로 인서트(insert)를 제작하였으며 pCKLSL 벡터에 삽입하였다. 글리시닌(glycinin, 11S)을 타깃한 pCKLSL-Glycinin (sense size: 320 bp; 서열번호 2), 글리시닌과 콘글리시닌(conglycinin, 7S)을 타깃한 pCKLSL-Glycinin/Conglycinin (sense size: 364 bp; 서열번호 3), 콘글리시닌을 타깃한 pCKLSL-Conglycinin (sense size: 174 bp; 서열번호 4) 총 3개를 제작하였다. 11S를 타깃한 유전자는 Monica 등(Plant Physiology, 2011, 156;330-345)에서 발췌하여 이용하였으며 7S를 타깃한 유전자는 동아대학교 작물분자육종 및 형질전환 실험실에서 제작하였다. 또한 선발용 유전자인 bar 유전자를 T-DNA에 함께 도입하였다.
T-DNA가 도입된 대장균 균주 DH5α에서 플라스미드 DNA를 추출하였으며 추출한 플라스미드 DNA는 전기충격법을 통해 아그로박테리움 컴피턴트 세포(competent cell)인 EHA105 균주에 삽입하였다. EHA105는 액체 SOC 배지에서 1시간 배양 후 항생제가 포함된 고체 배지에서 이틀 동안 배양하였다. 항생제를 통해 선발된 단일 콜로니는 액체 YEP 배지에서 배양 후 OD600nm 값이 0.5~0.7이 되었을 때 보관용 stock과 접종용 stock을 만들어 -70℃에 보관하였다.
2. 식물체
형질전환 실험에 사용된 William 82 품종(Glycine max cv. Williams 82)은 육안으로 보았을 때, 주름지지 않고 매끈하며 얼룩이나 점이 없는 온전한 형태의 종자를 선발한다. 우선적으로 선발한 100립의 종자를 멸균한 3 mm 여과지를 깐 페트리 디쉬(90 mm × 20 mm)에 옮겨 담은 뒤, 데시케이터(desiccator)에서 20시간 동안 8% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액 95 ㎖와 12N 염산 5 ㎖를 혼합하여 발생되는 염소 가스로 종자 표면을 1차적으로 소독하였다. 가스 소독을 진행한 종자는 페트리 디쉬를 파라필름(parafilm)으로 밀봉하여 보관하였다.
접종 이틀 전, 종자의 갈라짐 방지를 위해 가스 소독한 종자에 멸균한 3차 증류수를 5 ㎖ 처리하여 25℃, 20시간 동안 습윤 배양하였다.
접종 하루 전, 습윤 배양을 끝낸 종자를 50 ㎖ 코니칼 튜브 3개에 균등하게 나눠 담았다. 각 튜브에 1% 차아염소산나트륨 45 ㎖과 Tween 20을 3~5방울 넣은 뒤, 10분간 교반함으로써 2차 종자 소독을 진행하였다. 2차 소독을 진행한 후 소독 용액을 버리고 멸균한 3차 증류수를 사용하여 10분간 3회 수세하였다. 수세를 끝낸 종자는 멸균수를 넣어 25℃, 20시간 침지하였다.
3. 접종을 위한 아그로박테리움 준비
접종 하루 전, 카나마이신(kanamycin) 100 ppm, 리팜피신(rifampicin) 25 ppm이 첨가된 200 ㎖ 액체 YEP 배지에 접종용 아그로박테리움 stock 300-500 ㎕ 넣고 28℃, 200 rpm의 진탕배양기에서 OD600nm 값이 0.5~0.6이 되도록 15~18시간 동안 배양시켰다. 접종 당일, 배양액의 OD600nm 값을 측정한 후 배양액을 30 ㎖씩 3개의 50 ㎖ 원심분리 튜브에 분주하였다. 20℃, 15분, 7,000 rpm으로 원심분리하여 액체 YEP 배지는 제거하고 아그로박테리움 펠렛만 사용한다. 펠렛을 액체 CCM 배지 15 ㎖에 녹여 침지(dipping) 용액으로 사용하였다(표 1).
Figure PCTKR2024009387-appb-img-000001
4. 형질전환 콩 식물체의 생산
4-1. 아그로박테리움 접종
접종 당일, 멸균수로 불린 종자를 scalpel blade (Feather, No 11)로 수직으로 갈라 두 개의 절편체(explant) 중 배축(embryonic axis)이 붙은 절편체만 남기고 나머지 반쪽과 종피는 제거하였다. 절편체에 달려 있는 하배축 절반과 배축을 완전히 제거하고 배축이 있던 자리에 scalpel blade에 침지 용액을 묻혀 10회 상처 냈다. 상처 낸 절편체는 침지 용액에 넣어 30분간 공배양 하였다. 공배양한 종자는 멸균한 3 mm 여과지와 휴지를 깐 페트리 디쉬에서 절편체의 물기를 제거하였다. 페트리 디쉬에 분주한 고체 CCM에 멸균된 3 mm 여과지를 깔고 절편체를 향축(adaxial) 방향이 배지를 향하도록 하여 7개씩 치상하였다. 마이크로포(micropore)로 페트리 디쉬를 밀봉하고 25℃, 18시간/6시간(광/암)의 조건으로 5일간 배양하였다.
4-2. 수세 및 신초 유도
5일간 공배양 후 scalpel blade (Feather, No 15)로 절편체에서 하배축의 2/3과 배축을 제거하였다. 50 ㎖ 코니칼 튜브에 절편체를 균등히 나누어 담고 45 ㎖의 액체 SIM배지로 10분간 3회 수세하여 아그로박테리움 균을 제거하였다. 이후 멸균된 3 mm 여과지를 깐 페트리 디쉬에서 절편체의 물기를 제거하였다. 페트리 디쉬에 분주한 고체 SIM-①에 절편체를 향축 방향이 위를 향하도록 6개씩 치상하였다. 마이크로포로 페트리 디쉬를 밀봉하고 25℃, 18시간/6시간(광/암)의 조건으로 2주간 배양하였다. 2주간 배양 후 scalpel blade (Feather, No 15)로 절편체의 절반과 primary shoot를 제거하였다. 10 mg/L의 PPT가 첨가된 고체 SIM-②에 절편체를 5~6개씩 치상하였고 마이크로포로 페트리 디쉬를 밀봉하고 25℃, 18시간/6시간(광/암)의 조건으로 2주간 배양하였다.
4-3. 신초 신장 및 발근 유도
2주간 배양 후 scalpel blade (Feather, No 15)로 갈변한 shoot와 pad 아랫부분을 얇게 깎아 제거하였다. 페트리 디쉬(100 mm × 40 mm)에 분주한 고체 SEM에 절편체를 5~6개씩 치상함으로써 영양분이 흡수되도록 하였다. 이후 2주마다 새 SEM 배지로 계대배양하였고 매 계대마다 영양분 흡수가 이루어지도록 갈변한 shoot와 pad를 제거하였다. Shoot가 길게 자라면 두 개의 페트리 디쉬를 연결하여 shoot이 충분히 신장되도록 하였으며 shoot이 10 cm 정도 자라면 scalpel blade (Feather, No 11)으로 줄기 아래쪽을 사선으로 잘라 줄기의 아래에 IBA (Indol butyric acid, 1 mg/㎖) 용액을 3분간 처리 후 멸균한 유리 시험관(30 mm × 200 mm)에 30 ㎖씩 분주한 고체 RM에 옮겨 심어 25℃, 18시간/6시간(광/암)의 조건으로 약 3주간 근권 생장하였다.
4-4. 순화 및 이차 선발
RM 배지에서 근권 생장하면 3차 증류수로 수세하여 배지를 최대한 제거한 후 작은 포트(6 cm × 5.6 cm)에 이식하였다. 흙은 상토(펄 10% FG 10% 300 L, 선그로원예(주))와 질석을 3 : 1 비율로 섞어 사용하였다. 이식한 식물체는 외부 환경에 조금씩 적응할 수 있도록 마젠타(magenta) 상자에서 순화하였다(25℃, 18시간/6시간 광/암). 순화 중 줄기와 잎이 성장하면 잎의 표면에 PPT leaf painting (100 mg/L)을 실시하여 2차 선발을 진행하였다. 2차 선발에서 선발된 개체는 보다 큰 포트(20 cm × 25 cm)에 이식하여 25℃, 18시간/6시간(광/암)의 조건으로 온실에서 생육하였다.
4-5. 잎 샘플링 및 종자 수확
생산된 T0 형질전환 식물체는 분석을 위해 어린잎을 1 g 가량 샘플링하였다. 채취한 잎은 액체질소로 급속 냉각시켜 -70℃에서 보관하였다. 또한 최종적으로 형질전환 식물체에서 T1 종자를 수확하여 완전히 건조시켜 -20℃에서 보관하였다. 수확한 종자는 세대 전개와 단백질 분석에 이용하였다.
5. 형질전환 식물체에서 T-DNA 및 유전자 발현 확인
5-1. PCR 분석
T0 형질전환체의 유전자 도입을 확인하기 위해 PCR 분석을 진행하였다. T0 형질전환 식물체에서 샘플링 한 잎과 비교를 위해 비형질전환(non-transgenic) 식물체의 잎을 액체질소를 사용하여 막자사발로 곱게 마쇄하였다. 곱게 마쇄한 잎에서 CTAB 방법으로 게노믹 DNAs를 추출하였다. 추출한 DNAs는 PCR 분석을 통해 형질전환체 식물에 T-DNA가 도입되었는지 확인하였다. RNAi를 매개로 한 pCKLSL-Glycinin, pCKLSL-Glycinin/Conglycinin, pCKLSL-Conglycinin은 bar 유전자, β-conglycinin promoter~sense 유전자 서열을 이용하여 PCR 분석을 진행하였다. 유전자 도입 확인을 위해 사용한 프라이머는 아래와 같다.
유전자 도입 확인에 사용된 프라이머 정보
Primer name Sequence (5'→3') 서열번호
Bar gene primer F TCTACCATGAGCCCAGAACG 8
Bar gene primer R GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC 9
β-Conglycinin promoter primer F TCAGTTACTTATCCTTCCTCCATC 10
Glycinin (sense) primer R CCCGGTACCAGCCACCGCAAAGTTTTGTGG 11
Glycinin/Conglycinin (sense) primer R GCCAACAAGTTCAATGTTTGCATC 12
Conglycinin (sense) primer R GCCAACAAGTTCAATGTTTGCATC 13
PCR은 pre-mix taq PCR kit (GenetBio)와 Thermal cycler (Bio-Rad)를 이용하여 수행하였으며, 1% 아가로스 겔에 로딩하여 PCR 증폭산물의 크기를 확인하였다.
5-2. 게노믹 DNA 서던블랏 분석
pCKLSL-Glycinin과 pCKLSL-Glycinin/Conglycinin T0 형질전환 식물체에 도입된 벡터의 카피(copy) 수를 확인하기 위해 서던블랏(Southern blot)을 진행하였다. 곱게 마쇄한 비형질전환 식물체와 T0 형질전환 식물체의 1 g 잎 시료에서 CTAB 방법으로 게노믹 DNAs를 추출하였다. 추출한 게노믹 DNA는 15~20 ng/㎕ 농도로 맞추었다. 1일차, DNA에 10X 효소 버퍼(enzyme buffer)를 넣고 4℃에서 4시간 처리하였다. 효소 5 ㎕ (HindⅢ (Roche))를 넣고 4℃에서 2분 40초 처리 후, 37℃에서 30분 처리하였다. HindⅢ 효소 5 ㎕를 추가로 넣고 4℃에서 2분 40초 처리 후, 37℃에서 밤새(overnight) 반응시켰다. 2일차, 전기영동을 통해 제한효소에 의해 잘린 밴드를 확인하였다. 제한효소가 잘 처리되었다면 동일한 양의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 -4℃에서 30분 이상 반응시켜 DNA를 정제하였다. 0.8% 아가로스 겔에서 정제한 DNA에 10X loading dye 5 ㎕를 넣고 50 V로 전개시켰다. 그 후 겔의 불필요한 부분을 제거하고 탈퓨린화(depurination) 용액(HCl 1.54 ㎖ + D.W 198.6 ㎖)으로 15분간 처리한 후 멸균수로 2회 세척하였다. 변성(denaturation) 용액(NaOH 20 g + NaCl 58.44 g)으로 30분 처리 후 멸균수로 1회 세척하였다. Glass - 3 mm bridge - 겔 - 멤브레인 - 3 mm 여과지(2장/wet) - 3 mm 여과지(2장/dry) - 와이퍼 롤(한 팩) - 무게감 있는 책 순으로 배치하여 겔의 밴드를 멤브레인으로 이동(transfer)시킨다. 3일차, 트랜스퍼가 끝난 멤브레인은 2X SSC 용액(sodium citrate tribasic dihydrate 88.23 g + Nacl 175.32 g, pH 7.0)으로 5분간 처리하였다. 그 후 멤브레인은 3 mm 여과지를 이용하여 물기를 완전히 제거한 후 spectro Linker XL-1000 UV crosslinker로 UV cross linking하였다. 멤브레인은 DIG Easy hyb buffer 12 ㎖를 넣고 밀봉하여 42℃, 110 rpm의 진탕 배양기에서 3시간 동안 pre-hybridization (blocking)하였다. 3시간 처리 후 PCR로 증폭시킨 DIG Probe Synthesis Kit (Roche)를 이용하여 hybridization을 밤새 진행하였다. 4일차, 멤브레인을 2X SSC + 0.1% SDS buffer로 2분간 처리 후 0.5X SSC + 0.1% SDS buffer로 68℃, 30분간 교반하며 처리하였다. DIG wash 및 Block buffer set (Roche)로 세척 후 암실에서 CDP-Star로 현상하였다.
5-3. RT-PCR 분석
T0 형질전환 식물체의 유전자 발현을 확인하기 위해서 RT-PCR 분석을 시행하였다. 형질전환 식물체와 비형질전환 식물체의 RNA는 Plant RNA Reagent System을 이용하여 추출하였다. RT-PCR은 SubPrimeScript RT-PCR Premix (2X) (GeNet Bio)를 이용하여 수행하였다. RNAi를 매개로 한 pCKLSL-Glycinin, pCKLSL-Glycinin/Conglycinin, pCKLSL-Conglycinin은 bar 유전자 PCR 분석을 진행하였으며 항존유전자(housekeeping gene)인 tublin을 이용하여 동일한 시료의 RNAs가 사용되었음을 확인하였다.
RT-PCR에 사용된 프라이머 정보
Primer name Sequence (5'→3') 서열번호
Bar gene primer F AAGCACGGTCAACTTCCGTA 14
Bar gene primer R GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC 9
Tublin gene primer F TGAGCAGTTCACGGCCATGCT 15
Tublin gene primer R CTCGGCAGTGGCATCCTGGT 16
5-4. Real-time PCR 분석
RNAi를 매개로 한 T0 형질전환 식물체의 유전자 발현을 확인하기 위해서 real-time PCR을 진행하였다. RNAi를 매개로 한 pCKLSL-Glycinin, pCKLSL-Glycinin/Conglycinin, pCKLSL-Conglycinin 형질전환체의 경우 mRNA를 분해하여 단백질 발현을 억제하기 때문에 단순히 RNA를 증폭시켜 확인하는 RT-PCR로는 글리시닌과 콘글리시닌 유전자 발현양을 정확히 확인할 수 없다. 따라서 real-time PCR을 이용하여 유전자의 발현 양을 확인하였다. real-time PCR은 TB Green® Premix Ex TaqTM (Takara)를 사용하여 진행하였다. 96 well hard-shell PCR Plates (Bio rad)를 이용하였으며 CFX96TM Real-Time System을 이용하여 분석을 진행하였다.
real-time PCR에 사용된 프라이머 정보
Primer name Sequence (5'→3') 서열번호
glycinin 1 primer F AGCCACAGTGCAAGGGTAAA 17
glycinin 1 primer R CGAACATTGCATTCTTGCGGA 18
glycinin 2 primer F CTCCGCAAGAATGCTATGTTCG 19
glycinin 2 primer R TCCTCTGGCAATGCGTTCAA 20
glycinin 3 primer F TCTCAGCGTGATAAGCCCAC 21
glycinin 3 primer R ACGAACATAGCATTCTTGCGG 22
glycinin 4 primer F AGTGTTCGACGGTGAGCTAAG 23
glycinin 4 primer R TTGATACTTGAGCTGACGCACT 24
glycinin 5 primer F ATCATCGCCCAAGGGAAAGG 25
glycinin 5 primer R ACTGGTTCATCGCCAGTGTT 26
β-conglycinin α primer F ACAGACTTCAATCTGGTGATGC 27
β-conglycinin α primer R TCGAATTTGGTATCGTAGGAGGC 28
β-conglycinin β primer F GTCCTTAGCGGGAGAGCCAT 29
β-conglycinin β primer R AGTAGGACTGTTGGGCTTGAGT 30
6. 형질전환 콩 종자의 단백질 발현
생산한 형질전환체에서 수확한 종자에서 단백질 분석을 진행하였다. 수확한 종자를 3차 증류수에 하루동안 불린다. 불린 콩을 반 갈라 배축이 붙어 있지 않은 절편체의 무게를 측정하였다. 절편체를 시료 버퍼(62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2.5% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 10% glycerol) 2 ㎖로 마쇄하고, 25℃에서 1시간 동안 교반하며 반응시킨 후 95℃에서 10분 처리하였다. 그 후 25℃, 5분, 12,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 추출하였다. 추출한 상등액은 정량하여 6X loading dye를 섞어 겔에 로딩하였다.
실시예 1. 콩 형질전환 식물체의 생산
저장단백질 함량이 낮은 콩 형질전환체를 생산하기 위해 pCKLSL 벡터에 RNAi를 매개로 하여 각각 1,465 bp의 글리시닌 유전자(서열번호 5, 도 1), 3,190 bp의 글리시닌/콘글리시닌 유전자(서열번호 6, 도 2), 1,161 bp의 콘글리시닌 유전자(서열번호 7, 도 3)를 도입하여 제작하였다. 콩의 저장단백질을 녹다운시키기 위해서 William 82 종자에 half-seed 방법을 토대로 아그로박테리움 형질전환 및 재분화 실험을 진행하였다(도 4).
형질전환 결과 pCKLSL-Glycinin 형질전환 식물체는 20개체(형질전환율 : 0.9%), pCKLSL-Glycinin/Conglycinin 형질전환 식물체는 20개체(형질전환율 : 1.41%), pCKLSLS-Conglycinin 형질전환 식물체는 10개체(형질전환율 : 0.58%)가 확인되었다. 또한 각 T0 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수확하였다.
Figure PCTKR2024009387-appb-img-000002
Figure PCTKR2024009387-appb-img-000003
실시예 2. T0 형질전환 식물체에서 도입된 유전자의 확인
생산된 형질전환 식물체에서 유전자가 도입되었는지 확인하기 위해 잎에서 게노믹 DNAs를 추출하여 PCR 분석을 시행하였다. RNAi를 매개로 한 형질전환체는 T-DNA 영역 중 β-conglycinin promoter~sense 유전자, bar 유전자 부분을 이용하여 PCR을 시행하였다. pCKLSL-Glycinin 형질전환 식물체에서 유전자 도입을 확인하여 최종적으로 11개의 개체에서 글리시닌 유전자와 bar 유전자가 도입되었음을 확인하였다(도 5a). pCKLSL-Glycinin/Conglycinin은 최종적으로 15개의 개체에서 글리시닌/콘글리시닌 유전자와 bar 유전자가 도입되었음을 확인하였다(도 5b). pCKLSL-Conglycinin 형질전환 식물체에서 최종적으로 5개의 개체에서 콘글리시닌 유전자와 bar 유전자가 도입되었음을 확인하였다(도 5c).
RNAi를 매개로 한 pCKLSL-Glycinin과 pCKLSL-Glycinin/Conglycinin 형질전환 식물체에서 서던블랏을 통해 도입된 유전자의 카피 수를 확인하였다. 분석 결과 pCKLSL-Glycinin은 #9, #13, #15, #17에서 1 카피를 확인할 수 있었으며, #2, #8, #16은 다수 카피로 확인되었다(도 6a). pCKLSL-Glycinin/Conglycinin은 #4, #6, #15에서 1 카피를 확인할 수 있었으며, #8, #17, #18에서 다수 카피를 확인할 수 있었다(도 6b).
형질전환 식물체의 유전자 도입을 확인한 이후 도입된 유전자인 bar 유전자 발현을 확인하기 위해 RT-PCR을 진행하였으며 항존유전자 tublin 유전자를 내부 대조군으로 사용하여 진행하였다. 또한, RNAi의 특성상 단순히 RT-PCR로 타겟한 글리시닌과 콘글리시닌 유전자의 발현양의 정확한 분석이 어려워 qRT-PCR을 통해 분석을 진행하였다. RT-PCR 결과 pCKLSL-Glycinin은 #2, #3, #4, #8, #9, #11, #13, #14, #15, #16, #17, #18을 선발하였으며, qRT-PCR 분석 결과 #2, #8, #9, #13, #15, #16, #17에서 저장단백질의 발현양이 전반적으로 줄어들었음을 확인할 수 있었다(도 7a). pCKLSL-Glycinin/Conglycinin은 RT-PCR 결과 #2, #4, #5, #6, #7, #8, #9, #12, #15, #16, #17, #18, #19을 선발하였으며, qRT-PCR을 진행하여 #4, #6, #8, #15, #17, #18에서 저장단백질의 발현양이 전반적으로 줄어들었음을 확인할 수 있었다(도 7b). pCKLSL-Glycinin과 비교하였을 때 콘글리시닌 유전자가 더 급변한 것을 확인하였다. pCKLSL-Conglycinin는 RT-PCR을 통해 #5, #6, #7, #8, #9, #10을 선발하였으며, qRT-PCR 결과 앞선 두 유전자들처럼 발현양이 전체적으로 줄어든 것은 없었으나 #5에서 표적 유전자인 콘글리시닌 α가 줄어들었음을 확인하였다(도 7c).
실시예 3. T1 종자에서 단백질 발현 분석
생산된 형질전환체에서 종자를 수확하여 SDS-PAGE를 통해 단백질 분석을 진행하였다. RNAi를 매개로 한 형질전환체의 T1 종자의 단백질 분석은 메디프로젠에서 진행하였다. 형질전환 식물체의 종자와 비교하기 위해 비형질전환 식물체의 종자 2립을 사용하였다. 수확이 진행된 pCKLSL-Glycinin, pCKLSL-Glycinin/Conglycinin의 종자를 분석하였으며 pCKLSL-Glycinin은 #2에서 녹다운 결과를 확인할 수 있었으며 pCKLSL-Glycinin/Conglycinin은 #4에서 녹다운 결과를 확인할 수 있었다(도 8). pCKLSL-Glycinin은 타깃한 글리시닌 밴드와 타깃하지 않은 콘글리시닌 밴드가 옅어진 것으로 보아 real-time PCR에서 예상한 대로 단백질 간 재분배(rebalancing)이 일어났음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 저장단백질 생산이 녹다운된 형질전환 콩을 이용한 유용단백질 생산
저장단백질의 발현이 억제된 식물체를 이용하였을 때 외래단백질의 생산성 증가여부를 조사하였다. RNAi에 의한 글리시닌 억제벼 #2의 T1 식물과 셀트리온에서 육성한 티오레독신(thioredoxin, TRX) 과발현 형질전환체의 호모계통 식물체와 자연교배하여 종자를 수확하였다. 교배에 의해 수확한 종자(F1)로 티오레독신의 생산성을 웨스턴 및 SDS-PAGE로 분석하였다.
그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 티오레독신 생산 콩 식물체의 티오레독신 단백질 수준보다, 글리시닌의 발현이 억제된 형질전환 식물체와 티오레독신 생산 콩 식물체와의 교배체에서 생산된 티오레독신 단백질 수준이 약 3배 정도 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 교배체의 종자 재배를 통한 세대 진전을 진행한 결과, F2 종자에서 티오레독신 생산 콩 식물체의 티오레독신 단백질 수준보다 약 10배 이상 높은 수준의 티오레독신 단백질이 확인되었다(도 10).

Claims (9)

  1. 저장단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 RNAi (RNA interference) 벡터로 콩 식물세포를 형질전환시켜 저장단백질 코딩 유전자의 발현을 억제하는 단계; 및
    상기 형질전환된 콩 식물세포로부터 형질전환된 콩 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 저장단백질은 베타-콘글리시닌(β-conglycinin) 및 글리시닌(glycinin) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 저장단백질 코딩 유전자는 베타-콘글리시닌 프로모터의 하류에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 베타-콘글리시닌 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체의 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 종자에서 저장단백질 함량이 감소된 콩 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 따른 콩 형질전환 식물체의 형질전환된 종자.
  7. 제5항에 따른 콩 형질전환 식물체와 유용단백질을 과발현하는 콩 식물체를 인공교배시키는 단계를 포함하는, 콩 종자에서 유용단백질을 대량으로 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유용단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 콩 종자에서 유용단백질을 대량으로 생산하는 방법.
  9. 제5항에 따른 콩 형질전환 식물체를 모본으로 하고, 유용단백질을 과발현하는 콩 식물체를 부본으로 하여 이를 인공교배시키는 단계를 포함하는, 부본 대비 종자에서 유용단백질의 생산성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
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