WO2025169902A1 - 神経細胞集団に残存する未分化細胞を検出または除去する方法 - Google Patents

神経細胞集団に残存する未分化細胞を検出または除去する方法

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WO2025169902A1
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glycan
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undifferentiated
neural
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陽樹 小高
浩章 舘野
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting or removing undifferentiated cells remaining in a neural cell population induced from pluripotent stem cells.
  • Non-Patent Document 1 neural cell populations induced from pluripotent stem cells are contaminated with undifferentiated cells such as neural progenitor cells and mesenchymal cells that are resistant to neural induction, and techniques for detecting or removing them have been developed. For example, it has been reported that treating neural cell populations induced from pluripotent stem cells with a gamma-secretase inhibitor can promote the maturation of the neural cell population and suppress tumorigenicity after transplantation (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 a technique for detecting tumorigenic undifferentiated neural progenitor cells by PET imaging using a probe [ 18 F]FEDAC specific to translocator protein 18 kDa (TSPO) expressed on the outer mitochondrial membrane of undifferentiated neural progenitor cells has been reported (Non-Patent Document 2).
  • glycan markers present on the cell surface. Because cell surface markers are easy to detect, they enable highly efficient and accurate cell identification. However, no glycan markers specific to undifferentiated cells remaining in neural cell populations induced from pluripotent stem cells have been reported, nor have any techniques for detecting and removing undifferentiated cells based on such markers been reported.
  • the present invention aims to easily and accurately detect and remove undifferentiated cells remaining in a neural cell population induced from pluripotent stem cells.
  • the present invention provides a method for detecting or removing undifferentiated cells remaining in a neural cell population induced from pluripotent stem cells, the method comprising: (a1) a step of contacting the neural cell population with a first glycan-binding molecule, wherein the first glycan-binding molecule binds to Lewis X; (a2) a step of detecting or removing cells to which the first glycan-binding molecule has bound in step (a1), wherein the cells to which the first glycan-binding molecule has bound are undifferentiated neural progenitor cells; and/or (b1) a step of contacting the neural cell population with a second glycan-binding molecule, wherein the second glycan-binding molecule binds to N-acetyllactosamine or poly-N-acetyllactosamine; and (b2) a step of detecting or removing cells to which the second glycan
  • steps (a1) and (b1) may be performed simultaneously or sequentially in any order
  • steps (a2) and (b2) may be performed simultaneously or sequentially in any order.
  • the glycan-binding molecule is preferably a lectin or an antibody.
  • the glycan-binding molecule is preferably conjugated to a detectable label.
  • the glycan-binding molecule is preferably conjugated to a cytotoxic substance.
  • the pluripotent stem cells are preferably iPS cells, and more preferably human iPS cells.
  • the undifferentiated neural progenitor cells express NES, PAX6, VIM, and SOX1.
  • the mesenchymal-like cells express NES, ACTA2, and PDGFRB.
  • the method of the present invention makes it possible to specifically detect or remove undifferentiated cells remaining in a neural cell population induced from pluripotent stem cells. Therefore, the method of the present invention is useful for preparing highly safe neural cell populations for transplantation and for developing high-quality assay systems using highly pure neural cell populations.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the schedule for producing an iPS cell-derived neural cell population.
  • FIG. 2 shows fluorescent immunostained images (top) of iPS cells (iPSCs), neural progenitor cells (NPCs), and neuronal populations (neurons) using an anti-TUJ1 antibody, and Hoechst stained images (bottom).
  • FIG. 3 shows UMAP plots of RNA expression information and sugar chain reactivity information of iPSCs, NPCs, and neurons.
  • FIG. 4 is a UMAP plot of RNA expression information and sugar chain reactivity information for neuron only.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the schedule for producing an iPS cell-derived neural cell population.
  • FIG. 2 shows fluorescent immunostained images (top) of iPS cells (iPSCs), neural progenitor cells (NPCs), and neuronal populations (neurons) using an anti-TUJ1 antibody, and Hoechst stained images (bottom).
  • FIG. 3 shows UMAP plots of
  • FIG. 5 is a heat map showing the expression profiles of marker genes in mature neurons (mNeurons), immature neurons (imNeurons), undifferentiated NPCs (undiffNPCs), and mesenchymal-like cells (MCs).
  • FIG. 6 is a dot plot showing the reactivity of mNeuron, imNeuron, undiffNPC, and MC with various lectins.
  • FIG. 7 is a violin plot showing the amount of rAAL binding and the amount of FUT10 gene expression in mNeurons, imNeurons, undiffNPCs, and MCs.
  • FIG. 8 is a violin plot showing the amount of rLSLN binding in mNeurons, imNeurons, undiffNPCs, and MCs, and the expression levels of B4GALT1 and B3GNT2 genes.
  • FIG. 9 shows fluorescent immunostained images of neurons using anti-SSEA1 antibody and anti-nestin antibody (top) and Hoechst stained images (bottom).
  • FIG. 10 shows a fluorescent stained image (top) of a neuron stained with Cy3-labeled rLSLN and a Hoechst stained image (bottom).
  • FIG. 9 shows fluorescent immunostained images of neurons using anti-SSEA1 antibody and anti-nestin antibody (top) and Hoechst stained images (bottom).
  • FIG. 10 shows a fluorescent stained image (top) of a neuron stained with Cy3-labeled rLSLN and a Hoechst stained image (bottom).
  • FIG. 11 is a histogram showing the results of flow cytometry analysis of SSEA1-positive cells in iPSC-derived neuronal cell populations that were untreated (control) or treated (IR700-SSEA1) with IR700-labeled anti-SSEA1 antibody.
  • FIG. 12 shows the results of flow cytometric gating of rLSLN+/PDGFRB+ cells in iPSC-derived neuronal cell populations untreated (control) or treated with LSL (LSL 0.3 ⁇ g/mL or 1 ⁇ g/mL).
  • the present invention provides a method for detecting or removing undifferentiated cells remaining in a neural cell population induced from pluripotent stem cells, the method comprising: (a1) a step of contacting the neural cell population with a first glycan-binding molecule, wherein the first glycan-binding molecule binds to Lewis X; (a2) a step of detecting or removing cells bound by the first glycan-binding molecule in step (a1), wherein the cells bound by the first glycan-binding molecule are undifferentiated neural progenitor cells; and/or (b1) a step of contacting the neural cell population with a second glycan-binding molecule, wherein the second glycan-binding molecule binds to N-acetyllactosamine or poly-N-acetyllactosamine; and (b2) a step of detecting or removing cells bound by the second glycan-binding molecule in
  • the method of this embodiment targets a neural cell population induced from pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, embryonic germ (EG) cells, pluripotent germ stem (mGS) cells, and Muse cells.
  • the neural cell population targeted by the method of this embodiment may be derived from any pluripotent stem cell, but is preferably derived from ES cells or iPS cells, and more preferably derived from iPS cells.
  • the pluripotent stem cells in this embodiment may be derived from any vertebrate, preferably from mammals such as mice, rats, rabbits, sheep, goats, pigs, cows, monkeys, and humans, and particularly preferably from humans.
  • pluripotent stem cells can be prepared from any tissue or cell according to methods known in the art.
  • iPS cell lines or ES cell lines may be obtained from, for example, the Kyoto University iPS Cell Research Foundation (CiRA_F), the RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC), or the American Type Culture Collection (ATCC).
  • the term "neuronal cell population” refers to a cell population that is obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells into neurons and that is substantially composed of neurons. Therefore, the neural cell population of this embodiment may, for example, contain neurons at a ratio of at least 50%, preferably 80% or more.
  • a neuronal population can be prepared from pluripotent stem cells by culturing the pluripotent stem cells under conditions in which, for example, a basal medium such as DMEM/F-12 medium, N2 medium, or a mixture thereof is appropriately supplemented with a BMP signaling pathway inhibitor such as dorsomorphin, a TGF signaling pathway inhibitor such as SB431542, or a Wnt signaling pathway inhibitor such as XAV-939.
  • a basal medium such as DMEM/F-12 medium, N2 medium, or a mixture thereof
  • a BMP signaling pathway inhibitor such as dorsomorphin
  • TGF signaling pathway inhibitor such as SB431542
  • Wnt signaling pathway inhibitor such as XAV-939.
  • undifferentiated cells refer to cells that are resistant to neural induction and retain pluripotency (the ability to differentiate into cells other than neural cells) and self-renewal ability even under neural induction conditions. Therefore, in this embodiment, undifferentiated cells are specifically undifferentiated neural progenitor cells or mesenchymal-like cells that remain after neural induction of pluripotent stem cells.
  • undifferentiated neural progenitor cells and “mesenchymal-like cells” can be defined based on the expression of undifferentiated cell markers, such as stemness markers, proliferative cell markers, neural progenitor cell markers, and mesenchymal stem cell markers.
  • undifferentiated cell markers such as stemness markers, proliferative cell markers, neural progenitor cell markers, and mesenchymal stem cell markers.
  • stemness markers such as stemness markers, proliferative cell markers, neural progenitor cell markers, and mesenchymal stem cell markers.
  • undifferentiated neural progenitor cells may also include neural stem cells.
  • the undifferentiated neural progenitor cells preferably express, for example, NES (nestin gene), PAX6 (paired box 6 gene), VIM (vimentin gene) and SOX1 (SRY-related HMG box 1 gene), and more preferably further express one or more markers selected from the group consisting of SOX2 (SRY-related HMG box 2 gene), HES5 (Hes family bHLH transcription factor 5 gene), ID4 (DNA-binding inhibitor 4 gene), PCNA (proliferating cell nuclear antigen gene) and MKI67 (KI-67 antigen gene).
  • the mesenchymal-like cells preferably express, for example, NES, ACTA2 (smooth muscle ⁇ 2 actin gene), and PDGFRB (platelet-derived growth factor receptor ⁇ gene), and more preferably further express one or more markers selected from the group consisting of PAX6, VIM, MCAM (melanoma cell adhesion molecule gene), DES (desmin gene), NT5E (5'-nucleotidase gene), and ENG (endoglin gene).
  • NES smooth muscle ⁇ 2 actin gene
  • PDGFRB platelet-derived growth factor receptor ⁇ gene
  • the undifferentiated neural progenitor cells and mesenchymal-like cells in this embodiment do not express neuronal markers or synaptic markers.
  • Neuronal markers include, for example, CD24 (signal transduction factor CD24 gene), DCX (doublecortin gene), GAP43 (growth-associated protein 43 gene), MAPT (microtubule-associated protein tau gene), STMN2 (stathmin 2 gene), and TUBB3 (tubulin ⁇ 3 gene).
  • synaptic markers examples include NRXN1 (neurexin 1 gene), NRXN2 (neurexin 2 gene), NRXN3 (neurexin 3 gene), SHANK1 (SH3 and multiple ankyrin repeat protein 1), SHANK2 (SH3 and multiple ankyrin repeat protein 2), SHANK3 (SH3 and multiple ankyrin repeat protein 3), SYT1 (synaptotagmin 1 gene), SYT2 (synaptotagmin 2 gene), SYT3 (synaptotagmin 3 gene), and STX1A (syntaxin 1A gene).
  • Marker expression can be analyzed using known techniques such as RT-PCR, Western blotting, and flow cytometry.
  • glycan-binding molecules are used to identify undifferentiated cells. Because the glycans displayed on cell surfaces vary depending on the type and state of the cell, undifferentiated cells can be identified based on the binding between glycans specifically present on the surface of undifferentiated cells and the corresponding glycan-binding molecules.
  • a glycan-binding molecule that binds to Lewis X (LeX, also known as SSEA1 or CD15) is used to identify undifferentiated neural progenitor cells, and (b) a glycan-binding molecule that binds to N-acetyllactosamine (LacNAc) or poly-N-acetyllactosamine (polyLacNAc) is used to identify mesenchymal-like cells.
  • LeX is a glycan consisting of a structure represented by Gal ⁇ 1-4(Fuc ⁇ 1-3)GlcNAc.
  • LacNAc is a glycan consisting of a structure represented by Gal ⁇ 1-4GlcNAc.
  • either or both of (a) LeX-based detection or elimination of undifferentiated neural progenitor cells and (b) (poly)LacNAc-based detection or elimination of mesenchymal-like cells can be performed, and preferably both can be performed.
  • both (a) and (b) are performed, (a) and (b) may be performed sequentially or simultaneously.
  • (a) and (b) are performed sequentially, the order is not particularly limited, and (b) may be performed after (a), or vice versa.
  • the "glycan-binding molecule" in this embodiment may be any molecule that can recognize LeX or (poly)LacNAc, including, but not limited to, proteins such as lectins or antibodies, and nucleic acids such as aptamers.
  • the glycan-binding molecule in this embodiment may preferably be a lectin or antibody.
  • the "antibody” in this embodiment may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and the monoclonal antibody may be any of a mouse antibody, chimeric antibody, humanized antibody, or fully human antibody. Furthermore, the antibody in this embodiment may also include antigen-binding fragments with equivalent glycan recognition ability, such as Fab, F(ab')2, scFv, and nanobody.
  • Anti-LeX antibodies and anti-(poly)LacNAc antibodies can be prepared according to any method known in the art.
  • Anti-LeX antibodies and anti-(poly)LacNAc antibodies are commercially available, and they may be used in the method of this embodiment.
  • Lectin is a general term for proteins other than antibodies that recognize and bind to glycans, and is found in a wide range of organisms, from animals to plants, fungi, and viruses. In the method of this embodiment, any type of lectin derived from any organism can be used, as long as it can recognize LeX or (poly)LacNAc with high accuracy. Lectins in this embodiment may include not only those that specifically bind to LeX or (poly)LacNAc, but also those that can bind to other glycans but bind to LeX or (poly)LacNAc with sufficiently high affinity (e.g., at least twice as high). Lectins in this embodiment may also include partial fragments or recombinant forms that have equivalent glycan recognition ability.
  • Examples of lectins that recognize LeX include Ralstonia solanacearum-derived lectin (RSL), Ralstonia solanacearum-derived lectin 2 (RSIIL), Aleuria aurantia-derived lectin (AAL), Aspergillus oryzae-derived lectin (AOL), Lotus tetragonolobus-derived lectin (LTL), and Pseudomonas aeruginosa-derived lectin (PAIIL).
  • RSL Ralstonia solanacearum-derived lectin
  • RSIIL Ralstonia solanacearum-derived lectin 2
  • AAL Aleuria aurantia-derived lectin
  • AOL Aspergillus oryzae-derived lectin
  • LTL Lotus tetragonolobus-derived lectin
  • PAIIL Pseudomonas aeruginosa-derived lectin
  • Examples of lectins and recombinant forms thereof that recognize (poly)LacNAc include Aikawatake mushroom (Laetiporus sulphureus)-derived lectin (LSL), Aikawatake lectin N-terminal domain recombinant (rLSLN), cellular slime mold (Dictyostelium dicodeum)-derived lectin (Discoidin II), human-derived galectin 3 (rGal3C), and tomato (Lycopersicon esculentum)-derived lectin (LEL).
  • Aikawatake mushroom Laetiporus sulphureus
  • LSLN Aikawatake lectin N-terminal domain recombinant
  • rLSLN Aikawatake lectin N-terminal domain recombinant
  • rLSLN Aikawatake lectin N-terminal domain recombinant
  • rLSLN Aikawatake lectin N-terminal domain
  • Lectins may be prepared by any method known in the art. For example, they may be isolated from the organism from which they originate, or nucleic acids encoding the lectins may be prepared by genetic engineering methods and introduced into host cells such as E. coli for expression. Information on the amino acid sequences of lectins and the nucleic acid sequences encoding them can be obtained from designated databases via portal sites such as the GlyCosmos Portal (https://glycosmos.org/). For example, for LSL, UniProt ID: Q7Z8V1 and GenBank ID: AB112940.1 are available. The above-mentioned lectins and their recombinant forms are also commercially available, and these may be used in the method of this embodiment.
  • the glycan-binding molecule in this embodiment may be conjugated to a detectable label.
  • a detectable label By using a glycan-binding molecule conjugated to a detectable label, undifferentiated cells remaining in a neural cell population induced from pluripotent stem cells can be easily detected or removed, and preferably detected.
  • Detectable labels include, but are not limited to, fluorescent dyes, enzymes, radioisotopes, metal particles, etc.
  • the detectable label in this embodiment may preferably be a fluorescent dye or an enzyme.
  • the glycan-binding molecule of this embodiment may be conjugated to a cytotoxic substance instead of or in addition to a detectable label.
  • a glycan-binding molecule conjugated to a cytotoxic substance undifferentiated cells remaining in a neural cell population induced from pluripotent stem cells can be easily detected or removed, preferably removed.
  • cytotoxic substances include, but are not limited to, anticancer drugs such as methotrexate, cyclosporine, and cisplatin; cytotoxic peptides such as diphtheria toxin, Pseudomonas exotoxin A, saporin, and ricin; radionuclides such as iodine-131, rhenium-186, indium-111, and yttrium-90; and photosensitizers such as phthalocyanine derivatives (e.g., IRDye700DX), merocyanine derivatives (e.g., merocyanine-540), and chlorin derivatives (e.g., talaporfin).
  • the cytotoxic substance of this embodiment may preferably be a photosensitizer.
  • the detectable label or cytotoxic substance may be conjugated to the glycan-binding molecule directly or via a linker according to any method known in the art.
  • the detectable label or cytotoxic substance may be conjugated to any one or more positions of the antibody or lectin, for example, to either or both of the N-terminus and C-terminus.
  • a glycan-binding molecule is brought into contact with a neuronal population.
  • the glycan-binding molecule is added to the culture medium of the neuronal population and incubated for a certain period of time.
  • the glycan-binding molecule may be added at a final concentration of, for example, 1 to 10 ⁇ g/mL, preferably 5 to 10 ⁇ g/mL.
  • the incubation time may be, for example, 0.5 to 3 hours, preferably 1 to 2 hours.
  • Cells to which glycan-binding molecules are bound can be detected by any method known in the art, including, but not limited to, fluorescent detection and chemiluminescent detection. In the method of this embodiment, cells to which glycan-binding molecules are bound are preferably detected by fluorescent detection.
  • Cells bound by glycan-binding molecules can be removed by any method known in the art, including, but not limited to, killing with a cytotoxic substance, separation by flow cytometry, and separation by magnetic beads. In the method of this embodiment, cells bound by glycan-binding molecules are preferably removed by a cytotoxic substance.
  • the method of this embodiment distinguishes between differentiated and undifferentiated cells in a neural cell population induced from pluripotent stem cells based on cell surface glycosylation markers. Therefore, the method of this embodiment makes it possible to easily and accurately detect and remove undifferentiated cells remaining in a neural cell population induced from pluripotent stem cells.
  • iPS cells 201B7 line
  • iPSCs Neural Differentiation of iPS Cells Human iPS cells (201B7 line) (hereinafter simply referred to as "iPS cells” or “iPSCs”) were obtained from RIKEN BRC. iPS cells were cultured on plates coated with Matrigel human ES cell-optimized matrix (Corning) using mTeSR+ medium (Veritas). iPSCs with passage numbers less than 60 were used in all experiments.
  • iPSCs were induced to differentiate into neural progenitor cells (NPCs) using the STEMdiff SMADi Neural Induction Kit (Veritas) according to the accompanying protocol.
  • NPCs were cultured on plates coated with Matrigel human ES cell-optimized matrix using STEMdiff SMADi Neural Induction Medium (Veritas). NPCs at passage number less than 5 were used for all experiments.
  • NPCs were detached using Accutase (Innovative Cell Technologies), dispersed into single cells, and then seeded onto plates coated with 0.07% polyethyleneimine (Sigma-Aldrich) and 3.3 ⁇ g/mL laminin (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries). They were then cultured in NeuroBasal Medium (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 2% B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), 1% GlutaMax supplement (Thermo Fisher Scientific), and 5 ⁇ M DAPT (Sigma-Aldrich). On day 7, the medium was replaced with NeuroBasal Plus Medium supplemented with 2% B27 Supplement Plus (Thermo Fisher Scientific) and 1% GlutaMax Supplement. Thereafter, half of the medium was replaced twice a week.
  • PBS D-PBS(-)
  • primary antibody solution anti-TUJ1 antibody (Merck Millipore, MAB1637), diluted 1/500
  • secondary antibody Cy3-labeled anti-mouse IgG (Jackson ImmunoResearch), diluted 1/2000
  • Hoechst 33342 Dojindo Chemical Industries
  • scGR-seq analysis of iPSC-derived neuronal populations Non-neuronal glycan markers remaining in iPSC-derived neuronal populations were identified using single-cell glycan and RNA sequencing (scGR-seq) (Minoshima, F. et al., 2021; iScience, 24(8):102882). iPSCs and NPCs were detached and dispersed into single cells using Accutase. Neurons were detached and dispersed into single cells using Accutase supplemented with 50 units/mL papain (Worthington Biochemical) and 0.25 mg/mL L-cysteine (Sigma-Aldrich).
  • the DNA barcodes in the supernatant were amplified for 20 cycles by PCR using i5/i7 index primers (New England Biolabs) and NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (New England Biolabs).
  • the PCR product was purified using Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter). The quality of the purified PCR product was confirmed using MultiNA (Shimadzu Corporation), and the nucleic acid sequence was determined using a MiSeq sequencer (Illumina) (26 bp, paired end).
  • An RNA library for scGR-seq was prepared using the GenNext TM RamDA-seq TM Single Cell Kit according to the accompanying protocol.
  • RNA library was confirmed using MultiNA, and the nucleic acid sequence was determined using Nova-Seq6000 (Illumina) (151 bp, paired end) and HiSeqX (Illumina) (151 bp, paired end).
  • the DNA barcode sequence data was analyzed using the Barcode DNA counting system (https://github.com/bioinfo-tsukuba/barcode-dna-counting-system) to obtain raw count data for each lectin.
  • the sc-RNAseq sequence data was analyzed using fastp (version 0.22.0), HISAT2 (version 2.2.0), and StringTie (version 2.1.1) to obtain raw count data mapped to GRCh38.
  • UMAP Uniform Manifold Approximation and Projection
  • the data from the three iPSC, NPC, and neuron samples were classified by sample and displayed in a UMAP plot.
  • UMAP_1 and UMAP_2 represent orthogonal components obtained by dimensionally compressing the RNA and glycan data.
  • the clusters for each cell population were distributed without overlapping.
  • cluster analysis was performed on neuron data alone, and the results, depicted in a UMAP plot, are shown in Figure 4.
  • Neurons were classified into four subclusters. Based on their RNA expression patterns, these subclusters were named mature neuron (mNeuron), immature neuron (imNeuron), undifferentiated NPC (undiffNPC), and mesenchymal-like cells (MC).
  • Figure 5 shows the expression profiles of marker genes in each cluster. Marker genes expressed in neurons in general (pan-Neuron in the figure) were expressed in mNeuron and imNeuron, whereas synaptic marker genes expressed in mature neurons (Synapse in the figure) were highly expressed in mNeuron. Marker genes expressed in NPCs in general (pan-NPC in the figure) were expressed in undiffNPCs and MCs. Neural stem cell marker genes (Stemness in the figure) and proliferating cell marker genes (Proliferation) were highly expressed in undiffNPCs, suggesting that undiffNPCs possess high stemness. Genes indicating mesenchymal properties (Mesenchyme) were highly expressed in MCs. These results revealed that in addition to neurons, iPSC-derived neural cell populations contain subpopulations of undifferentiated NPCs (undiffNPCs) with high stemness and NPCs (MCs) with mesenchymal cell properties.
  • iPSC-derived neural cell populations contain sub
  • Figure 6 shows the results of dot plots of lectin reactivity (binding ratio) for each subcluster for lectins that showed significant (p ⁇ 0.05) differences in reactivity between subclusters.
  • the size of the circle indicates the prevalence of lectin reactivity (the percentage of cells with non-zero values), and the gray scale indicates the intensity of reactivity (the average of the values across all cells).
  • the lectin with the highest fold change relative to other subclusters was rAAL (recombinant Aleuria aurantia lectin).
  • rAAL is a fucose-binding lectin
  • the lectin with the highest fold change relative to other subclusters was rLSLN (recombinant Laetiporus sulphureus lectin N-terminal domain). Since rLSLN has a high affinity for LacNAc/polyLacNAc, this suggests an increase in the expression levels of LacNAc/polyLacNAc-containing glycans and enzymes involved in their synthesis in MC.
  • Figure 7 shows the results of comparing the amount of rAAL bound in each subcluster and the expression level of FUT10, an ⁇ 1,3-fucosyltransferase gene involved in the synthesis of fucose-containing glycans. It was confirmed that rAAL was bound to undiffNPC in large amounts, and that FUT10 was highly expressed in undiffNPC. FUT10 is known to be primarily involved in the synthesis of LeX, and these results suggest that the expression level of LeX is increased in undiffNPC.
  • Figure 8 shows the results of comparing the amount of rLSLN bound in each subcluster and the expression levels of B4GALT1, a ⁇ 1,4-galactosyltransferase gene involved in the synthesis of LacNAc/polyLacNAc-containing glycans, and B3GNT2, a ⁇ 1,3-N-acetylglucosaminyltransferase involved in the elongation of polyLacNAc chains. It was confirmed that rLSLN was bound in large amounts to MC, and that B4GALT1 and B3GNT2 were highly expressed in MC. These results suggest that the synthesis of LacNAc/polyLacNAc-containing glycans is enhanced in MC.
  • IR700 IR700-Labeled Anti-SSEA1 Antibody
  • the photosensitizer IRDye700DX (hereinafter simply referred to as "IR700") is a dye used in photoimmunotherapy. When cells are loaded with a cell surface antigen-specific antibody conjugated with IR700 and irradiated with near-infrared light, the IR700 exerts its local toxicity, selectively killing the antibody-bound cells. We tested whether undifferentiated NPCs could be selectively removed using an IR700-labeled anti-SSEA1 antibody.
  • Anti-SSEA1 antibody (STEMCELL Technologies, 60060) was labeled with IR700 using the IRDye700DX Protein Labeling Kit - High MW according to the protocol provided with the kit.
  • An iPSC-derived neuronal cell population supplemented with medium without IR700-labeled anti-SSEA1 antibody served as a control.
  • the medium was then replaced with one without IR700-labeled anti-SSEA1 antibody, and the cells were irradiated with near-infrared light (10 mW/ cm2 ) for 10 minutes. After incubation in a CO2 incubator at 37°C for 3 hours, cells were detached using Accutase and collected. Ghost Dye TM Violet 450 (Cytek Biosciences, 1/1000 dilution) was added to 1 x 106 cells and incubated on ice for 30 minutes. After washing the cells with 1% BSA/PBS, phycoerythrin (PE)-labeled anti-SSEA1 antibody (BioLegend, 125606) (1/20 dilution) was added and incubated on ice for 1 hour. After washing the cells twice with 1% BSA/PBS, the percentage of SSEA1-positive cells was analyzed using a CytoFLEX flow cytometer (Beckman Coulter).
  • PE phycoerythrin
  • Figure 11 shows the flow cytometry results for condition 4 in Table 2, with the solid line representing the cell population stained with PE-labeled anti-SSEA1 antibody and the dotted line representing the unstained cell population. Compared to the control, the proportion of SSEA1-positive cells in the cell population treated with IR700-labeled anti-SSEA1 antibody was reduced by 10-30%. These results demonstrate that undifferentiated NPCs can be removed using IR700-labeled anti-SSEA1 antibody.
  • rLSLN A nucleic acid sequence encoding the recombinant N-terminal domain (1-149 aa) of LSL (RCSB PDB No. 1W3A) (rLSLN, SEQ ID NO: 1) was inserted into the pET-27b vector to obtain the rLSLN expression vector (rLSLN-pET27b).
  • BL21-CodonPlus(DE3)-RIL was transformed with rLSLN-pET27b, and rLSLN was expressed and purified by standard procedures.
  • rLSLN was labeled with R-phycoerythrin (PE) using the R-Phycoerythrin Labeling Kit- NH (Dojindo Laboratories) to prepare PE-labeled rLSLN.
  • PE R-phycoerythrin
  • iPSC-derived neuronal populations were treated with medium containing LSL (0.3-3 ⁇ g/mL) and incubated in a CO2 incubator at 37°C for 1 hour.
  • An iPSC-derived neuronal population treated with medium without LSL served as a control.
  • Cells were detached and collected using Accutase.
  • Ghost Dye TM Violet 450 (1/1000 dilution) was added to 1 x 106 cells and incubated on ice for 30 minutes. After washing with 1% BSA/PBS, PE-labeled rLSLN (1/100 dilution) and APC-labeled anti-PDGFRB antibody (BioLegend, 323608) (1/20 dilution) were added and incubated on ice for 1 hour.
  • the cells were washed twice with 1% BSA/PBS, and the ratio of rLSLN+/PDGFRB+ cells was analyzed using a flow cytometer CytoFLEX (Beckman Coulter).
  • Figure 12 shows the results of flow cytometry under conditions 7 and 8 in Table 3.
  • the vertical axis (PE-rLSLN) indicates the amount of PE-labeled rLSLN bound
  • the horizontal axis (APC-PDGFRB) indicates the amount of APC-labeled anti-PDGFRB antibody bound.
  • “APC-A, PE-A subset” indicates the rLSLN-positive and PDGFRB-positive cell population (rLSLN/PDGFRB cells). Compared to the control, the proportion of rLSLN/PDGFRB cells in the cell population treated with 1 ⁇ g/mL LSL was reduced by 29 to 50%.

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Abstract

多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を検出または除去する方法であって、（１）糖鎖結合性分子を前記神経細胞集団に接触させるステップと、（２）前記糖鎖結合性分子が結合した細胞を検出または除去するステップとを含み、ここで、（ａ）前記糖鎖結合性分子がルイスＸに結合するものであり、前記未分化細胞が未分化神経前駆細胞である、または（ｂ）前記糖鎖結合性分子がＮ－アセチルラクトサミンまたはポリ－Ｎ－アセチルラクトサミンに結合するものであり、前記未分化細胞が間葉系様細胞である、方法を提供する。

Description

神経細胞集団に残存する未分化細胞を検出または除去する方法
　本発明は、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を検出または除去する方法に関する。
　多能性幹細胞から特定の細胞への分化を誘導する方法が開発されており、多能性幹細胞から調製された様々な種類の細胞が再生医療や創薬において利用されている。しかし、多能性幹細胞から調製された細胞集団には、通常、未分化細胞が残存するため、移植用途では造腫瘍性のリスクが問題となる。また、創薬における細胞アッセイ系でも、未分化細胞の混入により、目的細胞の純度が低下するという問題がある。多能性幹細胞から調製された細胞集団に残存する未分化細胞を検出・除去する技術が求められている。
　多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団には、神経誘導抵抗性の神経前駆細胞や間葉系細胞などの未分化細胞が混入することが知られており、それらを検出または除去するための技術が開発されている。例えば、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団をγセクレターゼ阻害剤で処置することにより、神経細胞集団の成熟を促進し、移植後の造腫瘍性を抑制できることが報告されている（非特許文献１）。また、未分化神経前駆細胞のミトコンドリア外膜に発現するトランスロケータータンパク質１８ｋＤａ（ＴＳＰＯ）に特異的なプローブ［１８Ｆ］ＦＥＤＡＣを用いたＰＥＴ撮像により、造腫瘍性の未分化神経前駆細胞を検出する技術が報告されている（非特許文献２）。
　一方、細胞表面に存在する糖鎖マーカーに基づいて細胞の種類や状態を判別できることが知られている。細胞表面マーカーは検出が容易であることから、高効率かつ高精度での細胞の判別を可能とする。しかし、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞に特異的な糖鎖マーカーは報告されておらず、それらに基づく未分化細胞の検出・除去技術の報告もされていない。
Ｏｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６；（４）：６４９-６６３ Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０２０；９（４）：４６５－４７７
　本発明は、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を、容易かつ高精度で検出・除去することを目的としてなされたものである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、未分化細胞の表面に特異的に存在する糖鎖を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、一実施形態によれば、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を検出または除去する方法であって、（ａ１）第１の糖鎖結合性分子を前記神経細胞集団に接触させるステップと、ここで、前記第１の糖鎖結合性分子がルイスＸに結合するものであり、（ａ２）前記ステップ（ａ１）において第１の糖鎖結合性分子が結合した細胞を検出または除去するステップと、ここで、前記第１の糖鎖結合性分子が結合した細胞が未分化神経前駆細胞である、ならびに／または、（ｂ１）第２の糖鎖結合性分子を前記神経細胞集団に接触させるステップと、ここで、前記第２の糖鎖結合性分子がＮ－アセチルラクトサミンまたはポリ－Ｎ－アセチルラクトサミンに結合するものであり、（ｂ２）前記ステップ（ｂ１）において第２の糖鎖結合性分子が結合した細胞を検出または除去するステップと、ここで、前記第２の糖鎖結合性分子が結合した細胞が間葉系様細胞である、方法を提供するものである。
　上記方法において、前記ステップ（ａ１）および（ｂ１）は同時または任意の順番で順次実施されてよく、前記ステップ（ａ２）および（ｂ２）は同時または任意の順番で順次実施されてよい。
　前記糖鎖結合性分子は、レクチンまたは抗体であることが好ましい。
　前記糖鎖結合性分子は、検出可能な標識にコンジュゲートされていることが好ましい。
　前記糖鎖結合性分子は、細胞毒性物質にコンジュゲートされていることが好ましい。
　前記多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であることが好ましく、ヒトｉＰＳ細胞であることがより好ましい。
　前記未分化神経前駆細胞は、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＶＩＭおよびＳＯＸ１を発現していることが好ましい。
　前記間葉系様細胞は、ＮＥＳ、ＡＣＴＡ２およびＰＤＧＦＲＢを発現していることが好ましい。
　本発明に係る方法によれば、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を特異的に検出または除去することができる。そのため、本発明に係る方法は、安全性の高い移植用神経細胞集団の調製や、純度の高い神経細胞集団を用いた高品質のアッセイ系の開発のために有用である。
図１は、ｉＰＳ細胞由来神経細胞集団の作製スケジュールを示す概略図である。 図２は、ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）および神経細胞集団（Ｎｅｕｒｏｎ）の抗ＴＵＪ１抗体を用いた蛍光免疫染色像（上）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色像（下）を示す図である。 図３は、ｉＰＳＣ、ＮＰＣおよびＮｅｕｒｏｎのＲＮＡ発現情報および糖鎖反応性情報のＵＭＡＰプロットである。 図４は、ＮｅｕｒｏｎのみのＲＮＡ発現情報および糖鎖反応性情報のＵＭＡＰプロットである。 図５は、成熟Ｎｅｕｒｏｎ（ｍＮｅｕｒｏｎ）、未成熟Ｎｅｕｒｏｎ（ｉｍＮｅｕｒｏｎ）、未分化ＮＰＣ（ｕｎｄｉｆｆＮＰＣ）および間葉系様細胞（ＭＣ）におけるマーカー遺伝子の発現プロファイルを示すヒートマップである。 図６は、ｍＮｅｕｒｏｎ、ｉｍＮｅｕｒｏｎ、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣおよびＭＣの種々のレクチンに対する反応性を示すドットプロットである。 図７は、ｍＮｅｕｒｏｎ、ｉｍＮｅｕｒｏｎ、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣおよびＭＣにおけるｒＡＡＬの結合量およびＦＵＴ１０遺伝子の発現量を示すバイオリンプロットである。 図８は、ｍＮｅｕｒｏｎ、ｉｍＮｅｕｒｏｎ、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣおよびＭＣにおけるｒＬＳＬＮの結合量ならびにＢ４ＧＡＬＴ１およびＢ３ＧＮＴ２遺伝子の発現量を示すバイオリンプロットである。 図９は、Ｎｅｕｒｏｎの抗ＳＳＥＡ１抗体および抗ネスチン抗体を用いた蛍光免疫染色像（上）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色像（下）を示す図である。 図１０は、ＮｅｕｒｏｎのＣｙ３標識ｒＬＳＬＮを用いた蛍光染色像（上）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色像（下）を示す図である。 図１１は、ＩＲ７００標識抗ＳＳＥＡ１抗体で処理されていない（対照）または処理された（ＩＲ７００－ＳＳＥＡ１）ｉＰＳＣ由来神経細胞集団におけるＳＳＥＡ１陽性細胞をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すヒストグラムである。 図１２は、ＬＳＬで処理されていない（対照）または処理された（ＬＳＬ０．３μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ）ｉＰＳＣ由来神経細胞集団におけるｒＬＳＬＮ＋／ＰＤＧＦＲＢ＋細胞をフローサイトメトリーによりゲーティングした結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、第一の実施形態によれば、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を検出または除去する方法であって、（ａ１）第１の糖鎖結合性分子を前記神経細胞集団に接触させるステップと、ここで、前記第１の糖鎖結合性分子がルイスＸに結合するものであり、（ａ２）前記ステップ（ａ１）において第１の糖鎖結合性分子が結合した細胞を検出または除去するステップと、ここで、前記第１の糖鎖結合性分子が結合した細胞が未分化神経前駆細胞である、ならびに／または、（ｂ１）第２の糖鎖結合性分子を前記神経細胞集団に接触させるステップと、ここで、前記第２の糖鎖結合性分子がＮ－アセチルラクトサミンまたはポリ－Ｎ－アセチルラクトサミンに結合するものであり、（ｂ２）前記ステップ（ｂ１）において第２の糖鎖結合性分子が結合した細胞を検出または除去するステップと、ここで、前記第２の糖鎖結合性分子が結合した細胞が間葉系様細胞である、方法である。
　本実施形態の方法は、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団を対象とする。「多能性幹細胞」には、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、多能性生殖幹（ｍＧＳ）細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法が対象とする神経細胞集団は、いずれの多能性幹細胞から誘導されたものであってもよいが、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から誘導されたものであることが好ましく、ｉＰＳ細胞から誘導されたものであることがより好ましい。
　本実施形態における多能性幹細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
　多能性幹細胞の調製方法は十分に確立されており（例えば、ｉＰＳ細胞については、Ｃｅｌｌ，２００７；１３１（５）：８６１－８７２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９）、当分野において公知の方法にしたがって、任意の組織または細胞から多能性幹細胞を調製することができる。あるいは、すでに樹立されたｉＰＳ細胞株やＥＳ細胞株を、例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究財団（ＣｉＲＡ＿Ｆ）、理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから入手してもよい。
　本実施形態における「神経細胞集団」は、多能性幹細胞から神経細胞への分化を誘導して得られた、実質的に神経細胞からなる細胞集団を意味する。したがって、本実施形態の神経細胞集団は、例えば、神経細胞を少なくとも５０％、好ましくは８０％以上の割合で含むものであってよい。
　多能性幹細胞を神経細胞へと誘導する方法はすでに十分に確立されており（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：２７５－２８０，２００９）、本実施形態における神経細胞集団は、当分野において公知の任意の方法にしたがって多能性幹細胞から調製されてよい。具体的には、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地、Ｎ２培地またはそれらの混合物などを基本培地として、ドルソモルフィンのようなＢＭＰシグナル経路阻害剤、ＳＢ４３１５４２のようなＴＧＦシグナル経路阻害剤、ＸＡＶ－９３９のようなＷｎｔシグナル経路阻害剤などを適宜添加した条件下で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞から神経細胞集団を調製することができる。
　本実施形態における「未分化細胞」とは、神経誘導条件下でも多分化能（神経細胞以外の細胞への分化能）および自己複製能を保持する、神経誘導抵抗性の細胞をいう。したがって、本実施形態における未分化細胞は、具体的には、多能性幹細胞の神経誘導後に残存する未分化神経前駆細胞または間葉系様細胞である。
　本実施形態における「未分化神経前駆細胞」および「間葉系様細胞」は、Ｓｔｅｍｎｅｓｓマーカー、増殖細胞マーカー、神経前駆細胞マーカー、間葉系幹細胞マーカーなどの未分化細胞マーカーの発現に基づいて定義され得る。言い換えれば、形態学的には分化した神経細胞と同様の形状を呈する細胞であっても、未分化細胞マーカーを発現する限り、本実施形態における未分化細胞に包含されてよい。また、本実施形態における未分化神経前駆細胞には、神経幹細胞も包含されてよい。
　本実施形態における未分化神経前駆細胞は、例えば、ＮＥＳ（ネスチン遺伝子）、ＰＡＸ６（ペアードボックス６遺伝子）、ＶＩＭ（ビメンチン遺伝子）およびＳＯＸ１（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス１遺伝子）を発現していることが好ましく、ＳＯＸ２（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス２遺伝子）、ＨＥＳ５（ＨｅｓファミリーｂＨＬＨ転写因子５遺伝子）、ＩＤ４（ＤＮＡ結合阻害因子４遺伝子）、ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原遺伝子）およびＭＫＩ６７（ＫＩ－６７抗原遺伝子）からなる群から選択される１または複数のマーカーをさらに発現していることがより好ましい。本実施形態における間葉系様細胞は、例えば、ＮＥＳ、ＡＣＴＡ２（平滑筋α２アクチン遺伝子）およびＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体β遺伝子）を発現していることが好ましく、ＰＡＸ６、ＶＩＭ、ＭＣＡＭ（メラノーマ細胞接着分子遺伝子）、ＤＥＳ（デスミン遺伝子）、ＮＴ５Ｅ（５’－ヌクレオチダーゼ遺伝子）およびＥＮＧ（エンドグリン遺伝子）からなる群から選択される１または複数のマーカーをさらに発現していることがより好ましい。
　一方、本実施形態における未分化神経前駆細胞および間葉系様細胞は、神経細胞マーカーおよびシナプスマーカーを発現していないことがより一層好ましい。神経細胞マーカーには、例えば、ＣＤ２４（シグナル伝達因子ＣＤ２４遺伝子）、ＤＣＸ（ダブルコルチン遺伝子）、ＧＡＰ４３（成長関連タンパク質４３遺伝子）、ＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質タウ遺伝子）、ＳＴＭＮ２（スタスミン２遺伝子）、ＴＵＢＢ３（チューブリンβ３遺伝子）などが挙げられる。シナプスマーカーには、例えば、ＮＲＸＮ１（ニューレキシン１遺伝子）、ＮＲＸＮ２（ニューレキシン２遺伝子）、ＮＲＸＮ３（ニューレキシン３遺伝子）、ＳＨＡＮＫ１（ＳＨ３およびマルチプルアンキリンリピートタンパク質１）、ＳＨＡＮＫ２（ＳＨ３およびマルチプルアンキリンリピートタンパク質２）、ＳＨＡＮＫ３（ＳＨ３およびマルチプルアンキリンリピートタンパク質３）、ＳＹＴ１（シナプトタグミン１遺伝子）、ＳＹＴ２（シナプトタグミン２遺伝子）、ＳＹＴ３（シナプトタグミン３遺伝子）、ＳＴＸ１Ａ（シンタキシン１Ａ遺伝子）などが挙げられる。
　マーカーの発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの公知の手法により解析することができる。
　本実施形態の方法では、未分化細胞を同定するために糖鎖結合性分子を使用する。細胞表面に提示される糖鎖は、細胞の種類や状態によって異なるため、未分化細胞の表面に特異的に存在する糖鎖とそれに対する糖鎖結合性分子との結合に基づき、未分化細胞を同定することができる。
　本実施形態の方法では、（ａ）未分化神経前駆細胞を同定するためにルイスＸ（ＬｅＸ、別名：ＳＳＥＡ１またはＣＤ１５）に結合する糖鎖結合性分子を使用し、（ｂ）間葉系様細胞を同定するためにＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）またはポリ－Ｎ－アセチルラクトサミン（ポリＬａｃＮＡｃ）に結合する糖鎖結合性分子を使用する。ＬｅＸは、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃで表される構造からなる糖鎖である。ＬａｃＮＡｃはＧａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃで表される構造からなる糖鎖である。
　本実施形態の方法では、（ａ）ＬｅＸに基づく未分化神経前駆細胞の検出または除去および（ｂ）（ポリ）ＬａｃＮＡｃに基づく間葉系様細胞の検出または除去のいずれか一方または両方を実施することができ、好ましくは両方を実施することができる。（ａ）および（ｂ）の両方を実施する場合、（ａ）および（ｂ）は順次または同時に実施されてよい。（ａ）および（ｂ）を順次する場合、その順番は特に限定されず、（ａ）を実施した後に（ｂ）を実施してもよいし、その逆でもよい。
　本実施形態における「糖鎖結合性分子」は、ＬｅＸまたは（ポリ）ＬａｃＮＡｃを認識できるものであれば任意の分子であってよく、例えば、レクチンまたは抗体などのタンパク質や、アプタマーなどの核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態における糖鎖結合性分子は、好ましくはレクチンまたは抗体であり得る。
　本実施形態における「抗体」は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、モノクローナル抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体のいずれであってもよい。また、本実施形態における抗体には、同等の糖鎖認識能を有する抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ナノボディなども含まれてよい。
　抗体の調製方法は十分に確立されており、当分野において公知の任意の方法にしたがって、抗ＬｅＸ抗体および抗（ポリ）ＬａｃＮＡｃ抗体を調製することができる。抗ＬｅＸ抗体および抗（ポリ）ＬａｃＮＡｃ抗体は市販されており、本実施形態の方法では、それらを使用してもよい。
　「レクチン」は、糖鎖を認識して結合する抗体以外のタンパク質の総称であり、動物から植物、菌類、ウイルスにまで幅広く存在する。本実施形態の方法では、高い精度でＬｅＸまたは（ポリ）ＬａｃＮＡｃを認識できるものであれば、任意の生物由来の任意の種類のレクチンを使用することができる。本実施形態におけるレクチンには、ＬｅＸまたは（ポリ）ＬａｃＮＡｃに特異的に結合するもののみならず、他の糖鎖にも結合し得るがＬｅＸまたは（ポリ）ＬａｃＮＡｃに対して十分に高い（例えば、少なくとも２倍の）親和性で結合するものも含まれてよい。また、本実施形態におけるレクチンには、同等の糖鎖認識能を有する部分断片や組換え体なども含まれてよい。
　ＬｅＸを認識するレクチンとしては、例えば、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来レクチン（ＲＳＬ）、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来レクチン２（ＲＳＩＩＬ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ　ａｕｒａｎｔｉａ）由来レクチン（ＡＡＬ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来レクチン（ＡＯＬ）、Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ由来レクチン（ＬＴＬ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来レクチン（ＰＡＩＩＬ）などが挙げられる。（ポリ）ＬａｃＮＡｃを認識するレクチンおよびその組換え体としては、例えば、アイカワタケ（Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ　ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ）由来レクチン（ＬＳＬ）、アイカワタケレクチンＮ末端ドメイン組換え体（ｒＬＳＬＮ）、細胞性粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ　ｄｉｃｏｄｅｕｍ）由来レクチン（Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ　ＩＩ）、ヒト由来ガレクチン３（ｒＧａｌ３Ｃ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）由来レクチン（ＬＥＬ）などが挙げられる。
　レクチンは、当分野において公知の任意の方法にしたがって調製されてよく、例えば、それが由来する生物から単離されてもよいし、遺伝子工学的方法により、レクチンをコードする核酸を作製し、大腸菌などの宿主細胞に導入して発現させてもよい。レクチンのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列の情報は、例えばＧｌｙＣｏｓｍｏｓ　Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｌｙｃｏｓｍｏｓ．ｏｒｇ／）のようなポータルサイトを介して、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ＬＳＬであれば、ＵｎｉＰｒｏｔ　ＩＤ：Ｑ７Ｚ８Ｖ１およびＧｅｎＢａｎｋ　ＩＤ：ＡＢ１１２９４０．１が利用可能である。また、上記のレクチンおよびその組換え体は市販されており、本実施形態の方法では、それらを使用してもよい。
　本実施形態における糖鎖結合性分子は、検出可能な標識にコンジュゲートされていてもよい。検出可能な標識にコンジュゲートされた糖鎖結合性分子を用いることにより、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を容易に検出または除去することができ、好ましくは検出することができる。検出可能な標識には、例えば、蛍光色素、酵素、放射性同位体、金属粒子などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態における検出可能な標識は、好ましくは蛍光色素または酵素であってよい。
　また、本実施形態における糖鎖結合性分子は、検出可能な標識に代えて、または検出可能な標識に加えて、細胞毒性物質にコンジュゲートされていてもよい。細胞毒性物質にコンジュゲートされた糖鎖結合性分子を用いることにより、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を容易に検出または除去することができ、好ましくは除去することができる。細胞毒性物質には、例えば、メトトレキサート、シクロスポリン、シスプラチンのような抗がん剤；ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、サポリン、リシンのような細胞毒性ペプチド；ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０のような放射性核種；フタロシアニン誘導体（例えばＩＲＤｙｅ７００ＤＸ）、メロシアニン誘導体（例えばメロシアニン５４０）、クロリン誘導体（例えばタラポルフィン）のような光増感剤などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態における細胞毒性物質は、好ましくは光増感剤であってよい。
　検出可能な標識または細胞毒性物質は、当分野において公知の任意の方法にしたがって、糖鎖結合性分子に直接またはリンカーを介してコンジュゲートされてよい。例えば、糖鎖結合性分子が抗体またはレクチンであれば、検出可能な標識または細胞毒性物質は、抗体またはレクチンの任意の１以上の位置に、例えば、Ｎ末端およびＣ末端のいずれか一方もしくは両方にコンジュゲートされてよい。
　本実施形態の方法では、糖鎖結合性分子を神経細胞集団に接触させる。糖鎖結合性分子と神経細胞集団とを接触させるためには、神経細胞集団の培養液に糖鎖結合性分子を添加し、一定時間インキュベートすればよい。糖鎖結合性分子は、例えば１～１０μｇ／ｍＬ、好ましくは５～１０μｇ／ｍＬの終濃度で添加されてよい。インキュベーション時間は、例えば０．５～３時間、好ましくは１～２時間であってよい。
　次いで、糖鎖結合性分子が結合した細胞を検出または除去する。なお、本実施形態において「除去」（およびその文法的変形）とは、神経細胞集団から未分化細胞を完全に除去することのみならず、未分化細胞の数または割合を減少させることをも含む。
　糖鎖結合性分子が結合した細胞は、当分野において公知の任意の方法にしたがって検出することができ、そのような方法には、例えば、蛍光検出および化学発光検出などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法では、糖鎖結合性分子が結合した細胞は、蛍光検出されることが好ましい。
　糖鎖結合性分子が結合した細胞は、当分野において公知の任意の方法にしたがって除去することができ、そのような方法には、例えば、細胞毒性物質による殺傷、フローサイトメトリーによる分離、磁気ビーズによる分離などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法では、糖鎖結合性分子が結合した細胞は、細胞毒性物質により除去されることが好ましい。
　本実施形態の方法は、細胞表面の糖鎖マーカーに基づき、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団における分化細胞と未分化細胞とを判別する。そのため、本実施形態の方法によれば、多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を、容易かつ高精度で検出・除去することができる。
　以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜１．ｉＰＳ細胞由来の神経細胞集団の調製＞
（１－１）ｉＰＳ細胞の神経分化
　ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）（以下、単に「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰＳＣ」と記載する）は、ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣより入手した。ｉＰＳ細胞を、マトリゲルヒトＥＳ細胞最適化マトリックス（コーニング）でコートされたプレート上で、ｍＴｅＳＲ＋培地（ベリタス）を用いて培養した。すべての実験に、継代数が６０未満のｉＰＳＣを用いた。
　ＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＳＭＡＤｉ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ベリタス）を用い、付属のプロトコールに従って、ｉＰＳＣから神経前駆細胞（以下、「ＮＰＣ」と記載する）への分化を誘導した。ＮＰＣを、マトリゲルヒトＥＳ細胞最適化マトリックスでコートされたプレート上で、ＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＳＭＡＤｉ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（ベリタス）を用いて培養した。すべての実験に、継代数が５未満のＮＰＣを用いた。
　神経細胞への分化のため、ＮＰＣをアキュターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により剥離し、単一細胞に分散した後、０．０７％のポリエチレンイミン（シグマアルドリッチ）および３．３μｇ／ｍＬのラミニン（富士フイルム和光純薬）でコートされたプレート上に播種し、２％のＢ２７サプリメント（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）、１％のＧｌｕｔａＭａｘサプリメント（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）および５μＭのＤＡＰＴ（シグマアルドリッチ）を添加したＮｅｕｒｏＢａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて培養した。７日目に、培地を２％のＢ２７サプリメントプラス（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）および１％のＧｌｕｔａＭａｘサプリメントを添加したＮｅｕｒｏＢａｓａｌ　Ｐｌｕｓ　Ｍｅｄｉｕｍに交換した。以後、週に２回、培地の半量を交換した。
　神経細胞集団の作製スケジュールの概略を図１にまとめる。ｉＰＳＣから誘導されたＮＰＣは最大Ｐ４まで継代され、ＮＰＣを神経分化条件下で２１～２８日間培養することにより神経細胞集団（以下、「Ｎｅｕｒｏｎ」とも記載する）を得た。
（１－２）免疫細胞染色
　神経細胞への分化を確認するために、神経細胞マーカーであるチューブリンβ３（ＴＵＢＢ３、以下「ＴＵＪ１」と記載する）に対するモノクローナル抗体よる免疫染色を行った。細胞を４％パラホルムアルデヒド（富士フイルム和光純薬）により固定し、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬）（以下、単に「ＰＢＳ」と記載する）で洗浄後、１％のＢＳＡ（シグマアルドリッチ）および０．２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ナカライテスク）を含有するＰＢＳを加えて室温で３０分間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ（－）（以下、単に「ＰＢＳ」と記載する）で３回洗浄後、一次抗体溶液（抗ＴＵＪ１抗体（メルクミリポア、ＭＡＢ１６３７）、１／５００希釈）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、二次抗体（Ｃｙ３標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、１／２０００希釈）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学）（１μｇ／ｍＬ）溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ５１、オリンパス）で撮影した。
　結果を図２に示す。ｉＰＳＣおよびＮＰＣと比較して、ＮｅｕｒｏｎではＴＵＪ１の強い染色と神経突起構造が確認された。この結果から、ｉＰＳＣから神経細胞集団が調製できたことが示された。
＜２．ｉＰＳＣ由来神経細胞集団のｓｃＧＲ－ｓｅｑ解析＞
　ｉＰＳＣ由来神経細胞集団に残存する非神経細胞に特異的な糖鎖マーカーを、シングルセル糖鎖・ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＧＲ－ｓｅｑ）（Ｍｉｎｏｓｈｉｍａ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，２０２１；ｉＳｃｉｅｎｃｅ，２４（８）：１０２８８２）により探索した。ｉＰＳＣおよびＮＰＣを、アキュターゼにより剥離し、単一細胞に分散した。Ｎｅｕｒｏｎを、５０ユニット／ｍＬのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）および０．２５ｍｇ／ｍＬのＬ－システイン（シグマアルドリッチ）を添加したアキュターゼにより剥離し、単一細胞に分散した。細胞（各１×１０５個）を、０．５μｇ／ｍＬのＤＮＡオリゴヌクレオチド標識レクチンライブラリー（表１）を含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で、４℃で１時間インキュベートした。ＵＶベンチランプ（ＵＶＰ　Ｂｌａｋ－Ｒａｙ　ＸＸ－１５Ｌ、アナリティクイエナ）により、３６５ｎｍの紫外光を１５Ｗ、１５分間照射した。３０秒間の遠心分離により細胞を回収し、ＤＮＡバーコードを含む上清を新しいＰＣＲチューブに移した。細胞をＧｅｎＮｅｘｔＴＭ ＲａｍＤＡ－ｓｅｑＴＭ Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（東洋紡）のＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒに溶解した。上清中のＤＮＡバーコードを、ｉ５／ｉ７　ｉｎｄｅｘ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）とＮＥＢＮｅｘｔ　Ｕｌｔｒａ　ＩＩ　Ｑ５　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたＰＣＲにて２０サイクル増幅した。ＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（ベックマン・コールター）を用いて精製した。精製ＰＣＲ産物の品質をＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）で確認し、ＭｉＳｅｑシーケンサー（イルミナ）（２６ｂｐ、ペアエンド）で核酸配列を決定した。ｓｃＧＲ－ｓｅｑのためのＲＮＡライブラリーを、ＧｅｎＮｅｘｔＴＭ ＲａｍＤＡ－ｓｅｑＴＭ Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔを用い、付属のプロトコールに従って調製した。ＲＮＡライブラリーの品質をＭｕｌｔｉＮＡで確認し、Ｎｏｖａ－Ｓｅｑ６０００（イルミナ）（１５１ｂｐ、ペアエンド）およびＨｉＳｅｑＸ（イルミナ）（１５１ｂｐ、ペアエンド）で核酸配列を決定した。ＤＮＡバーコードの配列データを、Ｂａｒｃｏｄｅ　ＤＮＡ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏ－ｔｓｕｋｕｂａ／ｂａｒｃｏｄｅ－ｄｎａ－ｃｏｕｎｔｉｎｇ－ｓｙｓｔｅｍ）で解析し、各レクチンのｒａｗカウントデータを取得した。ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑの配列データを、ｆａｓｔｐ（バージョン０．２２．０）、ＨＩＳＡＴ２（バージョン２．２．０）、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ（バージョン２．１．１）で解析し、ＧＲＣｈ３８に対してマッピングしたｒａｗカウントデータを取得した。ｉＰＳＣ、ＮＰＣおよびＮｅｕｒｏｎの３サンプルに由来するｒａｗカウントデータ、またはＮｅｕｒｏｎサンプルのみに由来するｒａｗカウントデータを、Ｓｅｕｒａｔ　Ｒ　ｐａｃｋａｇｅ（バージョン４．０．２）を用いて品質管理および正規化し、重み付き最近傍アルゴリズムにより糖鎖（ＤＮＡバーコード）およびＲＮＡのデータを統合し、非線形次元削減手法であるＵＭＡＰ（Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｍａｎｉｆｏｌｄ　Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）により次元圧縮を行った。ｉＰＳＣ、ＮＰＣおよびＮｅｕｒｏｎの３サンプルのデータは、サンプルごとに類別し、ＵＭＡＰ　ｐｌｏｔで描写した。Ｎｅｕｒｏｎサンプルのデータ群に対しては、細胞亜集団を同定するため、クラスタリング解析（Ｌｏｕｖａｉｎ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を行い、クラスターごとに類別した。その後、各クラスターについて差次的発現遺伝子解析を行い、反応性が変動したレクチンを抽出した。
　表１．ＤＮＡオリゴヌクレオチド標識レクチンの一覧表
（表中の略称は以下の通り。Ｇａｌ：Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ，ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，Ｆｕｃ：Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ，Ｇｌｃ：Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｓｉａ：Ｓｉａｌｉｃ　ａｃｉｄ，　ＬａｃＮＡｃ：Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＪＯＭ：Ｊ－ＯＩＬ　ＭＩＬＬＳ，ＩＮＣ．，Ｖｅｃｔｏｒ：ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ，Ｓｅｉｋａｇａｋｕ：ＳＥＩＫＡＧＡＫＵ　ＣＯＲＰ．，ＥＹ：ＥＹ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．，ＡＩＳＴ：Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒ＆Ｄ：Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ，ＪＩＲ：Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ。レクチン名の最初に「ｒ」がつくものは組換え体を意味する。）
　ｉＰＳＣ、ＮＰＣおよびＮｅｕｒｏｎの解析結果を図３に示す。図中、Ｘ軸（ＵＭＡＰ＿１）およびＹ軸（ＵＭＡＰ＿２）は、ＲＮＡおよび糖鎖データを次元圧縮した直交成分を示す。各細胞集団のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、Ｎｅｕｒｏｎのデータのみをクラスター解析し、ＵＭＡＰプロットに描写した結果を図４に示す。Ｎｅｕｒｏｎは４つのサブクラスターに分類された。これらのサブクラスターを、ＲＮＡ発現パターンに基づき、成熟Ｎｅｕｒｏｎ（ｍＮｅｕｒｏｎ）、未成熟Ｎｅｕｒｏｎ（ｉｍＮｅｕｒｏｎ）、未分化ＮＰＣ（ｕｎｄｉｆｆＮＰＣ）および間葉系様細胞（ＭＣ）と名付けた。
　各クラスターにおけるマーカー遺伝子の発現プロファイルを図５に示す。神経細胞全般に発現するマーカー遺伝子（図中、ｐａｎ－Ｎｅｕｒｏｎ）は、ｍＮｅｕｒｏｎおよびｉｍＮｅｕｒｏｎに発現していたのに対し、成熟神経細胞に発現するシナプスマーカー遺伝子（図中、Ｓｙｎａｐｓｅ）は、ｍＮｅｕｒｏに高発現していた。ＮＰＣ全般に発現するマーカー遺伝子（図中、ｐａｎ－ＮＰＣ）は、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣおよびＭＣに発現していた。神経幹細胞マーカー遺伝子（図中、Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）および増殖細胞マーカー遺伝子（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣに高発現しており、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣが高い幹細胞性を有していることが示唆された。間葉系性質を示す遺伝子（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）はＭＣに高発現していた。これらの結果から、ｉＰＳＣ由来神経細胞集団には、神経細胞の他に、高い幹細胞性を有する未分化のＮＰＣ（ｕｎｄｉｆｆＮＰＣ）および間葉系細胞の性質を有するＮＰＣ（ＭＣ）の亜集団が存在することが明らかになった。
　サブクラスター間で有意（ｐ＜０．０５）に反応性が異なったレクチンについて、各サブクラスターに対するレクチンの反応性（結合量比）をドットプロットで描写した結果を図６に示す。図中、円の大きさがレクチンに対する反応性の存在率（値が０ではない数値をもつ細胞の割合）を、グレースケールが反応性の強弱（全細胞の値を平均した値）を示す。ｕｎｄｉｆｆＮＰＣにおいて、他のサブクラスターに対する倍率変化（ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）が最も高いレクチンは、ｒＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ　ａｕｒａｎｔｉａレクチン組換え体）だった。ｒＡＡＬはフコース結合性レクチンであることから、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣにおけるフコース含有糖鎖およびその合成に関連する酵素の発現レベルの増加が示唆された。一方、ＭＣにおいて、他のサブクラスターに対する倍率変化が最も高いレクチンは、ｒＬＳＬＮ（Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ　ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓレクチンＮ末端ドメイン組換え体）だった。ｒＬＳＬＮはＬａｃＮＡｃ／ポリＬａｃＮＡｃに高親和性であることから、ＭＣにおけるＬａｃＮＡｃ／ポリＬａｃＮＡｃ含有糖鎖およびその合成に関連する酵素の発現レベルの増加が示唆された。
　各サブクラスターにおけるｒＡＡＬの結合量およびフコース含有糖鎖の合成に関連するα１，３－フコース転移酵素遺伝子であるＦＵＴ１０の発現量を比較した結果を図７に示す。ｕｎｄｉｆｆＮＰＣにｒＡＡＬが多く結合しており、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣにおいてＦＵＴ１０が高発現していることが確認された。ＦＵＴ１０は主にＬｅＸの合成に関与することが知られており、ｕｎｄｉｆｆＮＰＣにおいてＬｅＸの発現レベルが増加していることが示唆された。
　各サブクラスターにおけるｒＬＳＬＮの結合量ならびにＬａｃＮＡｃ／ポリＬａｃＮＡｃ含有糖鎖の合成に関連するβ１，４－ガラクトース転移酵素遺伝子であるＢ４ＧＡＬＴ１およびポリＬａｃＮＡｃ鎖の伸長に関与するβ１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素であるＢ３ＧＮＴ２の発現量を比較した結果を図８に示す。ＭＣにｒＬＳＬＮが多く結合しており、ＭＣにおいてＢ４ＧＡＬＴ１およびＢ３ＧＮＴ２が高発現していることが確認された。この結果から、ＭＣにおいてＬａｃＮＡｃ／ポリＬａｃＮＡｃ含有糖鎖の合成が亢進していることが示唆された。
＜３．糖鎖マーカーに基づく未分化細胞の検出＞
　ｕｎｄｉｆｆＮＰＣに属する細胞をＬｅＸ陽性細胞として特異的に特徴づけできるかどうか、または、ＭＣに属する細胞をＬａｃＮＡｃ／ポリＬａｃＮＡｃ陽性細胞として特異的に特徴づけできるかどうかを検証するために、下記の通り蛍光免疫染色を行った。
（３－１）抗ＳＳＥＡ１抗体を用いた免疫細胞染色
　ｉＰＳＣ由来神経細胞集団を４％パラホルムアルデヒドにより固定し、ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００／ＰＢＳを加えて室温で３０分間インキュベートした後、一次抗体（抗ＳＳＥＡ１抗体（メルクミリポア、ＭＡＢ４３０１））（１／１００希釈）および抗ネスチン抗体（メルクミリポア、ＭＡＢ１２５９）（１／１０００希釈）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、二次抗体（Ｃｙ３標識標識抗マウスＩｇＭ（メルクミリポア、ＡＰ１２８Ｃ））（１／１０００希釈）およびＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン、Ａ－１１００１）、１／１０００希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１μｇ／ｍＬ）溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄後、倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ５１、オリンパス）で撮影した。
　結果を図９に示す。抗ＳＳＥＡ１抗体により染色された細胞は、神経細胞とは異なる形態であり、かつ、ネスチン（神経幹細胞／ＮＰＣマーカー）陽性であった。これらの結果から、ＳＳＥＡ１（ＬｅＸ）に基づいて未分化ＮＰＣを検出できることが示された。
（３－２）標識ｒＬＳＬＮを用いた蛍光染色
　ｉＰＳＣ由来神経細胞集団を４％パラホルムアルデヒドにより固定し、ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加えて室温で３０分間インキュベートした後、Ｃｙ３標識ｒＬＳＬＮ（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１μｇ／ｍＬ）溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄後、倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ５１、オリンパス）で撮影した。
　結果を図１０に示す。Ｃｙ３標識ｒＬＳＬＮにより染色された細胞は、扁平状であり核が大きく、間葉系細胞と同様の形態であった。この結果から、ＬａｃＮＡｃ／ポリＬａｃＮＡｃに基づいて間葉系様細胞を検出できることが示された。
＜４．糖鎖マーカーに基づく未分化細胞の除去＞
（４－１）ＩＲ７００標識抗ＳＳＥＡ１抗体を用いた未分化ＮＰＣの除去
　光増感剤ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ（以下、単に「ＩＲ７００」と記載する）は、光免疫療法で使用される色素である。ＩＲ７００がコンジュゲートされた細胞表面抗原特異的抗体を細胞に負荷し、近赤外光を照射すると、ＩＲ７００が局所的に毒性を発揮することにより、抗体が結合した細胞を選択的に殺傷することができる。ＩＲ７００で標識された抗ＳＳＥＡ１抗体を用いて、未分化ＮＰＣを選択的に除去できるかどうかを試験した。
　ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　－　Ｈｉｇｈ　ＭＷを用いて、キット付属のプロトコールに従って、抗ＳＳＥＡ１抗体（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、６００６０）をＩＲ７００により標識した。ｉＰＳＣ由来神経細胞集団にＩＲ７００標識抗ＳＳＥＡ１抗体（１０～２０μｇ／ｍＬ）を含有する培地を添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１時間静置した。ＩＲ７００標識抗ＳＳＥＡ１抗体を含有しない培地を添加したｉＰＳＣ由来神経細胞集団を対照とした。その後、ＩＲ７００標識抗ＳＳＥＡ１抗体を含有しない培地に交換し、近赤外光（１０ｍＷ／ｃｍ２）を１０分間照射した。３７℃のＣＯ２インキュベーター内で３時間静置した後、アキュターゼにより細胞を剥離し、回収した。１×１０６個の細胞にＧｈｏｓｔ　ＤｙｅＴＭ　Ｖｉｏｌｅｔ　４５０（Ｃｙｔｅｋ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１／１０００希釈）を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を洗浄した後、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＳＳＥＡ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１２５６０６）（１／２０希釈）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーターＣｙｔｏＦＬＥＸ（ベックマン・コールター）によりＳＳＥＡ１陽性細胞の比率を解析した。
　結果を表２および図１１に示す。図１１は、表２における条件４のフローサイトメトリーの結果であり、実線はＰＥ標識抗ＳＳＥＡ１抗体により染色した細胞集団を、点線は未染色の細胞集団を示す。対照と比較して、ＩＲ７００標識抗ＳＳＥＡ１抗体で処理された細胞集団におけるＳＳＥＡ１陽性細胞の比率が１０～３０％減少した。これらの結果から、ＩＲ７００標識抗ＳＳＥＡ１抗体を用いて未分化ＮＰＣを除去できることが示された。
　表２．実験条件および除去効率（ＩＲ７００標識抗ＳＳＥＡ１抗体／未分化ＮＰＣ）
（４－２）ＬＳＬを用いたＭＣの除去
　アイカワタケ由来レクチン（ＬＳＬ）はＬＳＬＮの全長体であり、ＬＳＬＮと同様の糖鎖認識能と、Ｃ末端ドメイン由来の細胞毒性を有する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３；２７８（４２）：４０４５５－６３）。ＬＳＬを用いて、間葉系様細胞（ＭＣ）を選択的に除去できるかどうかを試験した。
　ＬＳＬ（ＲＣＳＢ　ＰＤＢ　Ｎｏ．１Ｗ３Ａ）のＮ末端ドメイン（１－１４９ａａ）組換え体（ｒＬＳＬＮ、配列番号１）をコードする核酸配列をｐＥＴ－２７ｂベクターに挿入し、ｒＬＳＬＮ発現ベクター（ｒＬＳＬＮ－ｐＥＴ２７ｂ）を得た。ｒＬＳＬＮ－ｐＥＴ２７ｂによりＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬを形質転換し、通常の手順によりｒＬＳＬＮを発現させ、精製した。Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いてｒＬＳＬＮをＲ－フィコエリスリン（ＰＥ）により標識し、ＰＥ標識ｒＬＳＬＮを調製した。ｉＰＳＣ由来神経細胞集団にＬＳＬ（０．３～３μｇ／ｍＬ）を含有する培地を添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１時間静置した。ＬＳＬを含有しない培地を添加したｉＰＳＣ由来神経細胞集団を対照とした。アキュターゼにより細胞を剥離し、回収した。１×１０６個の細胞にＧｈｏｓｔ　ＤｙｅＴＭ　Ｖｉｏｌｅｔ　４５０（１／１０００希釈）を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＥ標識ｒＬＳＬＮ（１／１００希釈）およびＡＰＣ標識抗ＰＤＧＦＲＢ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３２３６０８）（１／２０希釈）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーターＣｙｔｏＦＬＥＸ（ベックマン・コールター）によりｒＬＳＬＮ＋／ＰＤＧＦＲＢ＋細胞の比率を解析した。
　結果を表３および図１２に示す。図１２は、表３における条件７および８のフローサイトメトリーの結果である。図中、縦軸（ＰＥ－ｒＬＳＬＮ）はＰＥ標識ｒＬＳＬＮの結合量を示し、横軸（ＡＰＣ－ＰＤＧＦＲＢ）はＡＰＣ標識抗ＰＤＧＦＲＢ抗体の結合量を示す。「ＡＰＣ－Ａ，ＰＥ－Ａ　ｓｕｂｓｅｔ」は、ｒＬＳＬＮ陽性かつＰＤＧＦＲＢ陽性の細胞集団（ｒＬＳＬＮ＋／ＰＤＧＦＲＢ＋細胞）を示す。対照と比較して、１μｇ／ｍＬのＬＳＬで処理された細胞集団におけるｒＬＳＬＮ＋／ＰＤＧＦＲＢ＋細胞の比率は２９～５０％減少した。また、ＬＳＬの細胞障害活性は、高密度の細胞集団（０．５～０．８７５×１０６細胞／ｃｍ２）では阻害され（表３、条件３および４）、低密度の細胞集団（０．２５～１．６８×１０５細胞／ｃｍ２）での除去効率の方が高かった（表３、条件７および８）。これらの結果から、ＬＳＬを用いて間葉系様細胞を除去でき、低密度培養において除去効率をより高めることができることが示された。
　表３．実験条件および除去効率（ＬＳＬ／ＭＣ）

Claims (9)

  1. 　多能性幹細胞から誘導された神経細胞集団に残存する未分化細胞を検出または除去する方法であって、
    　（ａ１）第１の糖鎖結合性分子を前記神経細胞集団に接触させるステップと、ここで、前記第１の糖鎖結合性分子がルイスＸに結合するものであり、
    　（ａ２）前記ステップ（ａ１）において第１の糖鎖結合性分子が結合した細胞を検出または除去するステップと、ここで、前記第１の糖鎖結合性分子が結合した細胞が未分化神経前駆細胞である、
    ならびに／または、
    　（ｂ１）第２の糖鎖結合性分子を前記神経細胞集団に接触させるステップと、ここで、前記第２の糖鎖結合性分子がＮ－アセチルラクトサミンまたはポリ－Ｎ－アセチルラクトサミンに結合するものであり、
    　（ｂ２）前記ステップ（ｂ１）において第２の糖鎖結合性分子が結合した細胞を検出または除去するステップと、ここで、前記第２の糖鎖結合性分子が結合した細胞が間葉系様細胞である、
    方法。
  2. 　前記ステップ（ａ１）および（ｂ１）が同時または任意の順番で順次実施され、かつ、前記ステップ（ａ２）および（ｂ２）が同時または任意の順番で順次実施される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記糖鎖結合性分子がレクチンまたは抗体である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記糖鎖結合性分子が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記糖鎖結合性分子が細胞毒性物質にコンジュゲートされている、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記未分化神経前駆細胞が、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＶＩＭおよびＳＯＸ１を発現する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記間葉系様細胞が、ＮＥＳ、ＡＣＴＡ２およびＰＤＧＦＲＢを発現する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
     
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