WO2026004792A1 - 細胞性免疫応答活性を測定する方法及びそのためのキット - Google Patents

細胞性免疫応答活性を測定する方法及びそのためのキット

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WO2026004792A1
WO2026004792A1 PCT/JP2025/022448 JP2025022448W WO2026004792A1 WO 2026004792 A1 WO2026004792 A1 WO 2026004792A1 JP 2025022448 W JP2025022448 W JP 2025022448W WO 2026004792 A1 WO2026004792 A1 WO 2026004792A1
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plasma
cells
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太郎 齊藤
裕太 東久世
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Canon Medical Diagnostics Corp
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring cellular immune response activity and a kit for use therein.
  • Cellular immunity is one of the immune responses of the body that eliminates foreign substances that invade from the outside.
  • Cellular immunity is an immune response system that recognizes foreign substances, such as pathogens, that have invaded the body and activates CD4 + T cells and/or CD8 + T cells via antigen-presenting cells, thereby eliminating the foreign substances (or cells containing the foreign substances, such as infected cells) (Non-Patent Document 1). Measuring the activity of the cellular immune response allows us to determine the level of the body's immune response.
  • the activity of the cellular immune response can be measured by adding an antigen derived from a pathogen or other pathogen to a sample containing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived from a subject, stimulating white blood cells such as T cells contained in the PBMCs, and then detecting effector molecules such as cytokines (e.g., interferon- ⁇ ) produced by the stimulated white blood cells, detecting the gene expression of effector molecules in white blood cells, or detecting white blood cells expressing effector molecules.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Non-Patent Document 2 As examples of methods for measuring the activity of a subject's cellular immune response to pathogens, methods for measuring the activity of a subject's cellular immune response to SARS-CoV-2 have been reported, including a method using ELISpot technology (Non-Patent Document 2), an ELISA method (Non-Patent Document 3), a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method (Patent Document 1), and a flow cytometry technology (Non-Patent Document 4).
  • ELISpot technology Non-Patent Document 2
  • ELISA method As examples of methods for measuring the activity of a subject's cellular immune response to SARS-CoV-2 have been reported, including a method using ELISpot technology (Non-Patent Document 2), an ELISA method (Non-Patent Document 3), a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method (Patent Document 1), and a flow cytometry technology (Non-Patent Document 4).
  • Samples containing white blood cells such as T cells used in methods for measuring cellular immune response activity include whole blood, which is collected as is, and PBMCs, which are separated from collected blood. From the perspective of long-term storage and transportation of samples, it is preferable that the samples can be frozen.
  • Cell cryopreservation solutions such as CELLBANKER (registered trademark) (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) are known as preservation solutions for stably cryopreserving cells.
  • PBMCs can be stored in a frozen state for long periods of time by using the above-mentioned cell cryopreservation solution, making them more suitable than whole blood for long-term storage.
  • PBMCs are often used as samples to measure cellular immune response activity.
  • the inventors compared the activity signals obtained when measuring cellular immune response activity using PBMCs as a subject's sample with the activity signals obtained when measuring cellular immune response activity using whole blood as a subject's sample, they found that the activity signals obtained when measuring cellular immune response activity using PBMCs as a subject's sample were lower.
  • the present invention aims to provide a method for measuring cellular immune response activity with sufficient sensitivity using PBMCs as a subject's sample, and a measurement kit for measuring cellular immune response activity with sufficient sensitivity using PBMCs as a subject's sample.
  • a method for measuring the cellular immune response activity of a subject comprising: (1) incubating an aqueous medium containing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) collected from the subject, an antigen, and human serum or plasma; and (2) measuring immune effector molecules in the PBMCs after step (1).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the content of human serum or plasma in the aqueous medium in step (1) is 20% or more and less than 100% based on the total mass of the aqueous medium.
  • measuring the immune effector molecule comprises measuring the expression level of mRNA of the immune effector molecule.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • kits according to any one of [9] to [13], further comprising a blood collection tube.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs which can be stored frozen for long periods, as a subject's sample.
  • 1 is a graph showing the results of measuring IFN- ⁇ (IFNG) gene expression using fresh blood.
  • 1 is a graph showing the results of measuring IFN- ⁇ (IFNG) gene expression using PBMC.
  • 10 is a graph showing the results of measuring IFN- ⁇ (IFNG) gene expression after antigen stimulation of PBMC in plasma from the same subject. This graph shows the results of a Student's t-test on the cellular immune activity when PBMCs were stimulated with antigen in the plasma of the same subject, and the cellular immune activity when PBMCs were stimulated with antigen in RPMI medium that did not contain human serum or human plasma.
  • This graph shows the average values for six cases of the relative values (relative values when the measurement value of fresh blood is set to 100) of the cellular immune activity when PBMCs were stimulated with antigen in plasma from the same subject and when PBMCs were stimulated with antigen in RPMI medium not containing human serum or human plasma, to the measurement value of fresh blood.
  • the method for measuring the cellular immune response activity of a subject of this embodiment includes: The method includes (1) incubating an aqueous medium containing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) collected from a subject, an antigen, and human serum or plasma, and (2) measuring immune effector molecules in the PBMCs after step (1).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the incubation step (step (1)) is a step in which PBMCs are stimulated by adding an antigen. This causes the stimulated PBMCs to produce immune effector molecules.
  • PBMCs are stimulated by adding an antigen.
  • antigen-presenting cells By incubating PBMCs with antigen, antigen-presenting cells take up the antigen, process it as needed, and present it on the cell surface together with major histocompatibility complex (MHC) molecules.
  • MHC major histocompatibility complex
  • TCR T cell receptor
  • the subject may be a human or a non-human animal.
  • the non-human animal is preferably a mammal.
  • the subject may be an individual infected with a specific pathogen, an individual suspected of being infected, an uninfected individual, or an individual vaccinated against a specific pathogen.
  • the specific pathogen is SARS-CoV-2
  • the subject may be an individual infected with SARS-CoV-2, an individual suspected of being infected with SARS-CoV-2, an individual uninfected with SARS-CoV-2, or an individual vaccinated against SARS-CoV-2.
  • Whole blood is usually collected from a vein and stored in a blood collection tube containing an anticoagulant.
  • blood collection tubes include EDTA blood collection tubes and sodium heparin blood collection tubes.
  • EDTA may affect lymphocyte activity, so sodium heparin blood collection tubes are more preferred.
  • Peripheral blood mononuclear cells are obtained by removing and separating plasma components, red blood cells, platelets, and granulocytes from whole blood. They include monocytes and lymphocytes such as T cells (CD4 + cells/CD8 + cells), B cells, NK cells, and dendritic cells.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells collected from a subject
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells collected from a subject
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells collected from a subject
  • antigen and human serum or plasma
  • the PBMCs and human serum or plasma can be simultaneously separated from whole blood and used.
  • the method of this embodiment may include, prior to step (1), a step of preparing PBMCs derived from a subject.
  • the step of preparing PBMCs derived from a subject may be or may include a step of separating and/or isolating PBMCs from whole blood (specimen) collected from the subject. Separation of PBMCs from whole blood may be performed by density gradient centrifugation, which may be performed using a density gradient medium such as Ficoll or LymphoPrep.
  • whole blood may be stratified in a centrifuge tube containing a density gradient medium, and by centrifuging, PBMCs will gather at the interface between the density gradient medium and plasma, and PBMCs can be obtained by collecting the white layer (PBMC layer) formed at this interface.
  • PBMC layer white layer
  • PBMCs can be cryopreserved, and cell function can be maintained for long periods of time. They can be cryopreserved using a preservation solution that stably freezes and preserves cells. Examples of such preservation solutions include cell cryopreservation solutions such as CELLBANKER (registered trademark) (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.).
  • CELLBANKER registered trademark
  • the PBMCs used in the method of this embodiment may also be frozen and thawed after collection from a subject. Even when frozen and thawed PBMCs are used, the method of this embodiment can still measure cellular immune response activity with sufficient sensitivity.
  • Human serum or plasma is obtained by centrifuging collected blood and recovering the liquid portion. Serum is obtained by centrifuging the collected blood after allowing it to clot naturally. On the other hand, plasma is obtained by centrifuging in the presence of an anticoagulant. Serum does not contain clotting factors such as fibrinogen.
  • Human serum or plasma may be derived from a single donor, for example, from the subject in the method of this embodiment. When human serum or plasma is derived from a subject, whole blood collected from the subject can be separated and used separately as PBMCs and human serum or plasma.
  • the antigens used in the method of this embodiment are not particularly limited, but include, for example, proteins derived from pathogens such as viruses, bacteria, and parasites; proteins derived from cells recognized as non-self in the body, such as tumor cells, infected cells, and inflammatory cells; and peptides containing the amino acid sequences that make up the above proteins. Two or more types of antigens may be combined.
  • Viruses from which antigens are derived include, for example, SARS-CoV-2, human immunodeficiency virus (HIV), influenza virus, cytomegalovirus (CMV), hepatitis B virus, measles virus, rubella virus, poliovirus, and human papillomavirus (HPV).
  • Virus-derived proteins include, for example, the spike protein (S protein) of SARS-CoV-2, HIV Gag protein, HIV envelope protein (gp120), influenza virus M1 protein, influenza virus hemagglutinin (HA), CMV pp65 protein, hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), and HPV E7 protein.
  • Bacteria from which antigens can be derived include, for example, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. Proteins derived from bacteria include, for example, ESAT-6 from Mycobacterium tuberculosis and listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes.
  • ESAT-6 from Mycobacterium tuberculosis
  • LLO listeriolysin O
  • Tumor cells from which antigens are derived include, for example, cells expressing neoantigens, gp100, MART-1, PSA, CEA, AFP, MUC-1, CA125, CA19-9, HER2, Survivin, and WT-1 positive cells.
  • Proteins derived from tumor cells include, for example, tumor-specific proteins expressed on the cell surface of tumor cells.
  • Infected cells from which antigens are derived include cells infected with the viruses listed above.
  • Proteins derived from infected cells include, for example, viral proteins displayed on the cell surface of infected cells.
  • Inflammatory cells from which antigens are derived include cells involved in the autoimmune response that occurs in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Crohn's disease, and type 1 diabetes.
  • Proteins derived from inflammatory cells include, for example, proteins expressed on the cell surface of inflammatory cells.
  • antigen presentation and recognition can be carried out in an aqueous medium in vitro or ex vivo, and those skilled in the art can select or prepare an aqueous medium suitable for that purpose based on their general knowledge.
  • the aqueous medium contains PBMCs, an antigen, and human serum or plasma.
  • the content of human serum or plasma in the aqueous medium during the incubation process may be 20% or more and less than 100% based on the total mass of the aqueous medium.
  • the medium other than the PBMCs and antigens e.g., storage buffer
  • the PBMCs and antigens prepared in this manner are added to human serum or plasma, the aqueous medium excluding the PBMCs and antigens becomes approximately 100% human serum or plasma.
  • the content of human serum or plasma in the aqueous medium in the incubation step may be 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 92% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more, based on the total mass of the aqueous medium.
  • the aqueous medium may contain, for example, water and/or a liquid medium for cell culture in addition to PBMCs, antigen, and human serum or plasma, or may not contain a liquid medium.
  • the mass of human serum or plasma in the aqueous medium before incubation is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, but may be, for example, 0.05 mL to 1.0 mL, 0.05 mL to 0.5 mL, 0.1 mL to 0.3 mL, or 0.1 mL to 0.2 mL for 0.3 x 10 6 cells of PBMCs.
  • the conditions for incubating an aqueous medium containing PBMCs, an antigen, and human serum or plasma are not particularly limited and can be set appropriately by one skilled in the art.
  • the incubation can be carried out at a temperature ranging from 30°C to 40°C, preferably from 36.5°C to 37.5°C.
  • the incubation can be carried out for, for example, 1 hour or more, 1 hour to 72 hours, 1 hour to 48 hours, 1 hour to 24 hours, 1 hour to 2 hours, 2 hours to 3 hours, 3 hours to 4 hours, 4 hours to 5 hours, 5 hours to 6 hours, 6 hours to 7 hours, 6 hours to 8 hours, 8 hours to 24 hours, 1 hour to 4 hours, or 2 hours to 4 hours.
  • the antigen content in the aqueous medium before incubation in the incubation step is also not particularly limited and can be set appropriately by those skilled in the art, but may be, for example, 0.1 to 20 ⁇ g/mL, 0.2 to 10 ⁇ g/mL, or 0.5 to 5 ⁇ g/mL.
  • the number of PBMC cells in the aqueous medium before incubation in the incubation step is not particularly limited and can be appropriately determined by those skilled in the art, but may be, for example, 0.2 ⁇ 10 6 cells to 0.3 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • the measurement step (step (2)) in this embodiment is a step of measuring immune effector molecules in PBMCs after stimulating the PBMCs with an antigen in the incubation step.
  • the term "measuring" used in the context of cellular immune response activity may include not only quantifying cellular immune response activity, but also determining or testing for the presence or absence of significant cellular immune response activity based on the quantification results (e.g., in comparison with a negative control and/or a positive control).
  • White blood cells include lymphocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, etc. Monocytes differentiate into macrophages and dendritic cells, so they are also considered to be part of white blood cells. Examples of lymphocytes include T cells, B cells, and natural killer cells. Furthermore, T cells can include CD4 + T cells and CD8 + T cells. PBMCs are white blood cells excluding granulocytes (neutrophils, eosinophils, basophils, and mast cells).
  • the activity of the cellular immune response can be measured by measuring immune effector molecules in PBMCs after stimulating the PBMCs with antigen during the incubation process.
  • Immune effector molecules can be measured by detecting the immune effector molecules, detecting gene expression of immune effector molecules in PBMCs, detecting PBMCs expressing immune effector molecules, etc. Measuring immune effector molecules may involve measuring the expression level of mRNA of the immune effector molecule, or detecting and/or quantifying the protein that is the immune effector molecule.
  • Methods for measuring the mRNA expression levels of immune effector molecules include, for example, hybridization-based methods such as Northern blots and microarrays, RNase protection, and RNA-Seq (sequencing).
  • hybridization-based methods such as Northern blots and microarrays, RNase protection, and RNA-Seq (sequencing).
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • real-time RT-PCR include the SYBR® Green method and the TaqMan® method.
  • LAMP loop mediated isothermal amplification
  • Other methods with higher quantitative capabilities include, for example, the digital droplet PCR method and the digital droplet LAMP method.
  • RNA When measuring the expression level of mRNA of an immune effector molecule, RNA may be extracted from PBMCs, or specific cell subsets (e.g., CD4 + T cells or CD8 + T cells) may be isolated from PBMCs using flow cytometry or magnetic beads, and then RNA may be extracted. RNA extraction can be performed by a total RNA extraction method using commonly available commercially available magnetic beads, centrifugal columns, etc. Examples of RNA include mRNA, RNA fractions containing mRNA, and total RNA.
  • the mRNA to be measured may be mature mRNA that has undergone various processes such as splicing, or RNA (pre-mRNA) that has not yet been processed to become mature mRNA.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • qPCR quantitative PCR
  • the qPCR master mix used for quantitative PCR can be the aforementioned SYBR® Green or TaqMan®.
  • the conditions for the qPCR reaction can be set appropriately by those skilled in the art.
  • the mRNA expression level of the immune effector molecule can be measured by normalizing the obtained relative mRNA expression level to an internal control gene. In the case of real-time RT-PCR, fluorescent signals are collected for each cycle of the qPCR reaction, allowing amplification of the PCR product to be monitored in real time.
  • the step of measuring immune effector molecules in PBMCs may be, for example, an RT-PCR method comprising the following steps (a) to (b) or (a) to (c): (a) lysing PBMCs to obtain a lysate containing mRNA; (b) capturing mRNA from the lysate, and (c) measuring mRNA levels.
  • Step (a) includes, for example, lysing cells using a cell lysis buffer.
  • Cell lysis elutes mRNA contained in PBMCs, yielding a lysate containing mRNA.
  • Any known cell lysis buffer can be used as the cell lysis buffer.
  • Step (b) may involve, for example, transferring the lysate obtained in step (a) to an mRNA capture substrate (e.g., an oligo(dT)-immobilized substrate) and incubating it at 4°C for 1 to 24 hours to capture the mRNA on the substrate.
  • an mRNA capture substrate e.g., an oligo(dT)-immobilized substrate
  • Step (c) includes, for example, adding a reverse transcription buffer containing a primer and reverse transcriptase to the mRNA isolated in step (b) to produce complementary DNA (cDNA), and contacting the cDNA with sense and antisense primers specific to the nucleic acid sequence of the immune effector molecule gene and DNA polymerase to obtain a DNA amplification product. This allows the expression level of the immune effector molecule mRNA to be measured.
  • the expression level of the immune effector molecule mRNA is quantified. Quantification may be calculated by comparing the amount of mRNA encoding one or more markers with a reference value.
  • reference values include the expression level of a gene whose expression is neither induced nor suppressed by a stimulant (e.g., an antigen peptide), and a specific example is the expression level of a known housekeeping gene (e.g., ⁇ -actin).
  • the mRNA expression level can be evaluated, for example, based on the cycle threshold value (Ct value) obtained using real-time RT-PCR.
  • Normalizing the Ct value of the immune effector molecule with the Ct value of the housekeeping gene allows for easy comparison of the expression levels of immune effector molecules between samples.
  • the detected amounts of one or more immune effector molecules and housekeeping genes are measured, the immune effector molecule is normalized using the Ct value of the housekeeping gene, and the normalized Ct value is converted to gene expression level, allowing for an approximate calculation of the amount of mRNA whose expression has changed (e.g., increased) due to antigen stimulation.
  • the expression level of one or more immune effector molecules induced by stimulation with an antigen with the expression level of the same immune effector molecules from a non-induction treated (solvent only control) sample it is possible to evaluate changes in the expression level of immune effector molecules due to stimulation.
  • the degree of induction can be roughly calculated from the fold increase (F.I.) value, which is the comparison of the gene expression level of the induced immune effector molecule with the gene expression level of the immune effector molecule that has not been subjected to induction treatment.
  • Methods for detecting and/or quantifying immune effector molecule proteins include, for example, methods using ELISpot technology, ELISA, and flow cytometry.
  • ELISpot technology is a method for detecting and/or quantifying molecules secreted by individual cells. By capturing the secreted immune effector molecules with antibodies and visualizing them as spots, the number of individual cells secreting immune effector molecules can be quantified.
  • ELISA is a method for detecting and/or quantifying the concentration of a specific protein. It uses specific antibodies to capture immune effector molecules secreted by stimulating PBMCs, and can quantify their concentration using chemiluminescence or fluorescence.
  • Flow cytometry technology uses fluorescently labeled antibodies to detect immune effector molecules on the surface or inside individual cells, and by measuring the fluorescence intensity of each cell, it is possible to analyze cellular characteristics and molecular expression.
  • the method of this embodiment allows the activity of cellular immune responses to be measured ex vivo.
  • the kit of this embodiment is for measuring the cellular immune response activity of a subject, and the measurement of the cellular immune response activity of a subject may be performed by the method described above.
  • the kit of this embodiment may be for measuring the cellular immune response activity of a subject using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) incubated with an antigen in human serum or plasma.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the kit of this embodiment may include reagents for measuring antigens and/or immune effector molecules.
  • the antigens, immune effector molecules, and methods for measuring them are as described above.
  • the reagent for measuring immune effector molecules may be a reagent for measuring the expression level of mRNA of an immune effector molecule.
  • reagents for measuring the expression level of mRNA of an immune effector molecule include a total RNA extraction reagent, reverse transcriptase, random primers or oligo-dT primers, a qPCR master mix (typically containing DNA polymerase, dNTPs, MgCl 2 , a buffer, a fluorescent dye, etc., such as SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)), primers specific to the gene of the target immune effector molecule, primers for an internal control gene (e.g., a housekeeping gene), and combinations thereof.
  • a RNA extraction reagent typically containing DNA polymerase, dNTPs, MgCl 2 , a buffer, a fluorescent dye, etc., such as SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)
  • the reagent for measuring the expression level of mRNA of an immune effector molecule may include a reagent for purifying RNA from PBMCs and/or a reagent for synthesizing cDNA from mRNA.
  • the kit of this embodiment may optionally include an RNase inhibitor, and/or a PCR reaction plate, and/or reagents for isolating mRNA from total RNA.
  • the reagent for measuring immune effector molecules may be a reagent for detecting and/or quantifying proteins that are immune effector molecules.
  • Reagents for detecting and/or quantifying proteins that are immune effector molecules may include, for example, reagents selected from a capture antibody specific to an immune effector molecule, a secondary antibody that binds to the captured immune effector molecule, a substrate solution for an enzyme reaction, a stop solution for an enzyme reaction, a cell culture buffer, and combinations thereof; fluorescently labeled antibodies that detect immune effector molecules or cell surface markers, cell fixation/permeabilization reagents, cell staining buffers, dead cell staining reagents, and combinations thereof.
  • the kit of this embodiment may further include one or more selected from the following: a blood collection tube (e.g., a heparin sodium blood collection tube); a PBMC separation tube (e.g., SepMate-50 (manufactured by STEMCELL TECHNOLOGIES)) or reagent (e.g., density gradient media such as Ficoll (registered trademark) or Lymhoprep (registered trademark)) for separating and/or isolating PBMCs from whole blood; a cell preservation solution (e.g., CultureSure DMSO (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), CELLBANKER (registered trademark) (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.)); a wash buffer; a detergent; a surfactant; a cell culture vessel (e.g., a cell culture plate); and a cell culture medium (e.g., RPMI medium).
  • the blood collection tube may
  • the above-mentioned components that may be contained in a reagent for measuring immune effector molecules can be combined in any manner and used in the above-mentioned method for measuring cellular immune response activity.
  • the components may be combined to prepare one or more mixed solutions, which can then be used in the above-mentioned method for measuring cellular immune response activity.
  • the kit of this embodiment may include one or more containers containing the reagents, etc., as described above.
  • the reagents, etc. may be contained in separate containers for each type, or may be contained in any combination in a container.
  • the kit of this embodiment may include instructions for using the kit and/or a label indicating how to use the kit.
  • a label includes any written or recorded material provided on or with the kit, or otherwise associated with the kit.
  • the instructions for use and the label may be written directly on the instructions and label, or may be written as a link (e.g., a URL, QR code (registered trademark)) to a site that describes the instructions for use.
  • kits of this embodiment include the aspects described above in relation to the method for measuring cellular immune response activity, and can be applied without limitation.
  • Sample Preparation refers to samples collected in heparin sodium collection tubes, mixed by inversion, and then used for antigen stimulation within 24 hours. After collection, the number of cells in fresh blood was counted using Turk's solution.
  • Samples described as "frozen PBMC” refer to samples in which PBMCs were separated from blood collected in heparin sodium collection tubes and stored frozen. The PBMC separation process is shown below. Blood collected in heparin sodium collection tubes was dispensed into 50 mL Falcon tubes and centrifuged at 300 g and 25°C for 10 minutes to separate it into plasma and blood cell components.
  • the plasma was dispensed into another 50 mL Falcon tube, frozen in a -80°C freezer, and stored.
  • the blood cells remaining in the 50 mL Falcon tube were mixed with an equal volume of "PBS buffer containing 2% FBS (referred to as PBS-2%FBS)" as the plasma dispensed into another 50 mL Falcon tube.
  • PBS-2%FBS "PBS buffer containing 2% FBS
  • An equal volume of PBS-2% FBS as the blood volume collected was then added and mixed.
  • the blood cell suspension prepared in PBS-2% FBS as described above was dispensed into a SepMate-50 tube containing Lymphoprep and centrifuged at 1200 g and 25°C for 10 minutes to separate PBMCs.
  • the PBMCs were transferred to another 50 mL Falcon tube, and 10 mL of PBS-2% FBS was added to the suspension and the suspension was suspended. The suspension was then centrifuged at 300 g and 25°C for 8 minutes, after which the supernatant was removed. The same procedure was repeated to wash the PBMCs. The PBMCs were then suspended in 1 mL of Cell Banker and frozen in a -80°C freezer for storage.
  • PepGen Sf an overlapping peptide pool product based on the amino acid sequence of the spike protein constituting the wild-type Wuhan-Hu-1 strain of SARS-CoV-2, was prepared. These peptide pools consisted of multiple peptides corresponding to 15-amino acid fragments of the spike protein amino acid sequence, with adjacent peptides overlapping by 11 amino acids.
  • peptide plates were dissolved in antigen diluent (PBS buffer containing 20% DMSO) to a concentration of 20 ⁇ g/mL. 5 ⁇ L of each peptide pool solution was dispensed into each well of a cell culture plate. In addition to each peptide pool solution, 5 ⁇ L of the antigen diluent was also dispensed into other wells of the cell culture plate as a negative control.
  • the cell culture plates into which each solution was dispensed (hereinafter referred to as peptide plates) were frozen and stored in a -80°C freezer.
  • the RPMI medium was then transferred to the 50 mL Falcon tube (at this point, 10 mL of RPMI medium containing PBMCs was present in the 50 mL Falcon tube).
  • the RPMI medium containing the PBMCs was centrifuged at 300 g for 10 minutes at 25°C, and the supernatant was removed.
  • the PBMCs were washed again with human serum-free RPMI medium in the same manner as above, and then suspended in human serum-free RPMI medium. After that, the cells were counted and adjusted to a cell concentration similar to that of fresh blood.
  • the peptide plate which had been frozen, was kept at 25°C and the peptide pool solution was thawed.
  • Fresh blood or PBMCs with an adjusted cell concentration were added to each well of the peptide plate in an amount of 120 ⁇ L and mixed by stirring. After stirring, the mixture was incubated at 37°C for 4 hours to stimulate the leukocytes contained in the fresh blood or PBMCs (frozen PBMCs). After incubation, the peptide plate containing the peptide-stimulated leukocytes or PBMCs was frozen and stored at -80°C.
  • PBMCs cryopreserved in (4) were also subjected to the same procedure as for fresh blood, and the PBMCs were captured on the filter.
  • centrifugation refers to rotating the plate in a centrifuge and applying centrifugal force toward the bottom of the plate.
  • mRNA capture plate Another multiwell plate (hereinafter referred to as the mRNA capture plate) with oligo(dT) immobilized in each well was placed below the filter plate, with the wells of both plates stacked vertically. The plate was then centrifuged at 2500 g and 4°C for 5 minutes. The filter plate was removed, and the mRNA capture plate containing the cell lysate in its wells was incubated at 4°C for 1 to 24 hours. After incubation, each well was washed with wash buffer to remove any non-oligo(dT)-binding substances contained in the cell lysate.
  • log 2 F.I. A larger value indicates an increased level of mRNA expression induced by peptide stimulation.
  • Test Example 2 [When PBMCs were stimulated with antigen in human serum-free RPMI medium] Blood was collected in sodium heparin blood collection tubes from six subjects who had received the COVID-19 mRNA vaccine, and fresh blood and frozen PBMCs from the same subjects were used to compare the cellular immune activity when fresh blood was used with that when frozen PBMCs were used, according to the method described in Test Example 1. In the measurement of cellular immune activity using PBMCs, the step of antigen stimulation of PBMCs was carried out in RPMI medium that did not contain human serum or human plasma.
  • Example 1 [When PBMCs were stimulated with antigen in human plasma] Blood was collected in heparin sodium blood collection tubes from six subjects who had received the COVID-19 mRNA vaccine. Fresh blood and frozen PBMCs from the same subjects were used to compare the cellular immune activity when using fresh blood with that when using frozen PBMCs, according to the method described in Test Example 1. In the cellular immune activity measurement using PBMCs in this Example 1, the antigen stimulation step was performed in the plasma of the same subject, rather than in RPMI medium containing no human serum or plasma as in Test Example 2. For subjects 1, 2, and 5, 0.1 mL of plasma was added per 0.3 x 10 PBMC cells, and for subjects 3, 4 , and 6 , 0.1 mL of plasma was added per 0.2 x 10 PBMC cells.
  • PBMCs were stimulated with an antigen in the plasma of the same subject, and the IFN- ⁇ (IFNG) gene was measured as an indicator of cellular immune activity.
  • the results are shown in Table 2 and Figure 3.
  • PBMCs were stimulated with an antigen in the plasma of the same subject, expression increased beyond the margin of error for gene expression fluctuations (-1 ⁇ LOG 2 F.I. ⁇ 1).
  • the average values of the results for six cases were calculated and are shown in Figure 4.
  • a Student's t-test was performed on the cellular immune activity of PBMCs stimulated with an antigen in the plasma of the same subject compared to the cellular immune activity of PBMCs stimulated with an antigen in RPMI medium containing no human serum or human plasma.
  • the cellular immune activity of PBMCs stimulated with an antigen in the plasma of the same subject was significantly higher (p ⁇ 0.0001). Furthermore, the relative values (relative values when the measured value of fresh blood is set to 100) of the cellular immune activity when PBMCs were stimulated with antigen in plasma from the same subject and when PBMCs were stimulated with antigen in RPMI medium containing no human serum or human plasma, for six cases, are shown in Figure 5. The cellular immune activity when PBMCs were stimulated with antigen in plasma from the same subject showed a value close to 100%.

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Abstract

（１）被験者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、抗原と、ヒト血清又は血漿とを含む水性媒体をインキュベートする工程、及び（２）工程（１）の後、ＰＢＭＣ中の免疫エフェクター分子を測定する工程を含む、被験者の細胞性免疫応答活性を測定する方法、を提供する。

Description

細胞性免疫応答活性を測定する方法及びそのためのキット
　本発明は、細胞性免疫応答活性を測定する方法及びそのためのキットに関する。
　外部から侵入する異物を排除する生体の免疫応答の1つとして細胞性免疫がある。細胞性免疫とは、体内に侵入した病原体等の異物を認識し、抗原提示細胞を介してＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することで異物（あるいは異物を含む細胞、例えば感染細胞）の排除をもたらす、免疫応答系である（非特許文献１）。細胞性免疫応答の活性を測定することにより、生体の免疫応答の程度を知ることができる。
　細胞性免疫応答の活性の測定は、被験者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む試料に、病原体等由来の抗原を添加することでＰＢＭＣに含まれるＴ細胞等の白血球を刺激した後、刺激された白血球によって産生されるサイトカイン（例えばインターフェロンγ）などのエフェクター分子を検出するか、白血球におけるエフェクター分子の遺伝子発現を検出するか、又は、エフェクター分子を発現している白血球を検出することで行うことができる。病原体に対する被験者の細胞性免疫応答の活性を測定する方法の例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する被験者の細胞性免疫応答の活性を測定する方法が報告されており、ＥＬＩＳｐｏｔ技術を用いる方法（非特許文献２）、ＥＬＩＳＡ法を用いる方法（非特許文献３）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法を用いる方法（特許文献１）、フローサイトメトリー技術を用いる方法（非特許文献４）が報告されている。
　細胞性免疫応答活性を測定する方法で用いられるＴ細胞等の白血球を含む検体としては、採取した血液をそのまま用いる全血と、採取された血液から分離したＰＢＭＣとがある。検体の長期保存や輸送の観点から、検体を凍結保存できることが好ましい。細胞を安定に凍結保存する保存液として、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）（日本全薬工業株式会社製）などの細胞凍結保存液が知られている。
　全血を用いて細胞性免疫応答活性を測定する方法では、全血からＰＢＭＣを分離する工程がなく、ＰＢＭＣを用いて細胞性免疫応答活性を測定する方法よりも簡便であるが、上記細胞凍結保存液を使用した凍結保存をすることができないため、採取後すぐの全血（新鮮血）を使用しなければならないという欠点がある。
　一方、ＰＢＭＣは、上記細胞凍結保存液を使用して保存することで、凍結状態で長期保存することができることから、長期保存という観点で全血よりも適している。
国際公開第２０２３／１６７２５０号
Current Opinion in Immunology Vol3 pp471-475, 1991 International Journal of Infectious Diseases, Vol 113. pp 155-162, 2021 International Journal of Infectious Diseases, Vol 106. pp 338-347, 2021 med Rxiv 2020 Nov3;2020.10.30.20223099.
　上記の理由から、細胞性免疫応答活性の測定には、検体としてＰＢＭＣが用いられることが多い。しかしながら、本発明者らが、被験者の検体としてＰＢＭＣを用いて細胞性免疫応答活性を測定した際に得られる活性シグナルと、被験者の検体として全血を用いて細胞性免疫応答活性を測定した際に得られる活性シグナルとを比較したところ、被験者の検体としてＰＢＭＣを用いて細胞性免疫応答活性を測定した際に得られる活性シグナルが低いことが判明した。
　本発明は、被験者の検体としてＰＢＭＣを用いて細胞性免疫応答活性を十分な感度で測定する方法、及び、被験者の検体としてＰＢＭＣを用いて十分な感度で細胞性免疫応答活性を測定するための測定用キットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、被験者の検体としてＰＢＭＣを用いて細胞性免疫応答活性を測定する方法において、ＰＢＭＣを抗原で刺激する反応を、ヒト血清又は血漿の存在下で行うことにより、細胞性免疫応答活性を十分な感度で測定することが可能となることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は、例えば、以下の態様を含む。
〔１〕　（１）被験者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、抗原と、ヒト血清又は血漿とを含む水性媒体をインキュベートする工程、及び
　（２）工程（１）の後、ＰＢＭＣ中の免疫エフェクター分子を測定する工程
を含む、被験者の細胞性免疫応答活性を測定する方法。
〔２〕　ヒト血清又は血漿が、上記被験者由来である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕　工程（１）における水性媒体中のヒト血清又は血漿の含有量が、水性媒体の全体の質量を基準として２０％以上１００％未満である、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕　工程（１）において、インキュベート前の水性媒体中におけるヒト血清又は血漿の質量が、０．３×１０６ｃｅｌｌｓのＰＢＭＣに対して、０．０５ｍＬ～１．０ｍＬである、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕　ＰＢＭＣが、被験者から採取した後に凍結融解されたものである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕　工程（１）の前に、被験者から採取した全血からＰＢＭＣを分離及び／又は単離する工程をさらに含む、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕　水性媒体が液体培地を含まない、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕　免疫エフェクター分子を測定することが、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することである、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕　〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法により、被験者の細胞性免疫応答活性を測定するためのキット。
〔１０〕　（１）抗原、及び
　（２）免疫エフェクター分子を測定するための試薬
を含む、ヒト血清又は血漿下で抗原とインキュベートした末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して被験者の細胞性免疫応答活性を測定するためのキット。
〔１１〕　（３）ＰＢＭＣを分離及び／又は単離するためのＰＢＭＣ分離用チューブ又は試薬、
　（４）ＰＢＭＣからＲＮＡを精製するための試薬、及び
（５）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための試薬をさらに含み、
　試薬（２）が、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するための試薬である、〔１０〕に記載のキット。
〔１２〕　細胞性免疫応答活性を測定するためのキットの使用方法が記載された説明書又はラベルをさらに含む、〔９〕～〔１１〕のいずれかに記載のキット。
〔１３〕　密度勾配遠心分離用の密度勾配媒体をさらに含む、〔９〕～〔１２〕のいずれかに記載のキット。
〔１４〕　採血管をさらに含む、〔９〕～〔１３〕のいずれかに記載のキット。
〔１５〕　被験者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取する工程をさらに含む、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、被験者の検体として、凍結状態で長期保存可能なＰＢＭＣを用いて細胞性免疫応答活性を十分な感度で測定することが可能となる。
新鮮血を用いてＩＦＮ－γ（ＩＦＮＧ）遺伝子発現を測定した結果を示すグラフである。 ＰＢＭＣを用いてＩＦＮ－γ（ＩＦＮＧ）遺伝子発現を測定した結果を示すグラフである。 同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行い、ＩＦＮ－γ（ＩＦＮＧ）遺伝子発現を測定した結果を示すグラフである。 同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性と、ヒト血清及又はヒト血漿を含まないＲＰＭＩ培地中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性について、Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定を実施した結果を示すグラフである。 同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性と、ヒト血清及又はヒト血漿を含まないＲＰＭＩ培地中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性とについて、新鮮血の測定値に対する相対値（新鮮血の測定値を１００としたときの相対値）の６例の平均値を示すグラフである。
　以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本実施形態の被験者の細胞性免疫応答活性を測定する方法は、
（１）被験者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、抗原と、ヒト血清又は血漿とを含む水性媒体をインキュベートする工程、及び
（２）工程（１）の後、ＰＢＭＣ中の免疫エフェクター分子を測定する工程を含む。
　本実施形態におけるインキュベート工程（工程（１））は、抗原を添加することによりＰＢＭＣを刺激する工程である。これにより、刺激されたＰＢＭＣが免疫エフェクター分子を産生する。このＰＢＭＣの刺激をヒト血清又は血漿の存在下で行うことで、ＰＢＭＣを用いて細胞性免疫応答活性を十分な感度で測定することができる。
　ＰＢＭＣと抗原をインキュベートすることにより、抗原提示細胞が抗原を取り込み、必要に応じてプロセッシングし、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と共に細胞表面に提示する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）がＭＨＣ－抗原複合体を認識すると、Ｔ細胞が活性化して免疫エフェクター分子を産生する。
　本実施形態において、被験者は、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。ヒト以外の動物は、哺乳動物であることが好ましい。被験者は、特定の病原体による感染者、当該感染の疑いがある者、未感染者、又は特定の病原体に対するワクチンの接種者であってもよい。例えば、特定の病原体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であった場合には、被験者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある者、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染者、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの接種者であってもよい。
　全血の採取は通常静脈から行われ、採取された血液は抗凝固剤が入った採血管に保存される。採血管としては、例えば、ＥＤＴＡ採血管、及びヘパリンナトリウム採血管が挙げられる。ＥＤＴＡはリンパ球の細胞活性に影響を及ぼす可能性があるため、ヘパリンナトリウム採血管がより好ましい。
　末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、全血から、血漿成分、赤血球、血小板、顆粒球を除去して分離することで得られ、単球と、Ｔ細胞（ＣＤ４＋細胞／ＣＤ８＋細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞等のリンパ球とが含まれる。「被験者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」とは、被験者に由来するＰＢＭＣを意味し、全血から「分離」して得られたものを意味する。したがって、工程（１）においては、原則として「被験者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」と、「抗原」と、「ヒト血清又は血漿」とは、それぞれ別個に準備したものを使用する。ただし、ＰＢＭＣとヒト血清又は血漿が同一の被験者由来のものである場合には、ＰＢＭＣとヒト血清又は血漿とを同時に全血から分離して用いることができる。
　本実施形態の方法は、工程（１）の前に、被験者由来のＰＢＭＣを準備する工程を含んでもよい。被験者由来のＰＢＭＣを準備する工程は、被験者から採取した全血（検体）からＰＢＭＣを分離及び／又は単離する工程であるか、又はこれを含んでもよい。全血からのＰＢＭＣの分離は、密度勾配遠心分離により行ってよく、密度勾配遠心分離は、フィコールやリンホプレップ等の密度勾配媒体を使用して行ってよい。例えば、全血を、密度勾配媒体を含む遠心分離管で層別化し、遠心することでＰＢＭＣは密度勾配媒体とプラズマの間の界面に集まるため、この界面に形成された白い層（ＰＢＭＣ層）を回収することでＰＢＭＣを得ることができる。
　ＰＢＭＣは凍結保存が可能であり、長期間にわたって細胞の機能を保持することができる。細胞を安定に凍結保存する保存液を使用して凍結保存するができる。そのような保存液としては、例えば、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）（日本全薬工業株式会社製）等の細胞凍結保存液が挙げられる。本実施形態の方法で使用するＰＢＭＣも、被験者から採取した後に凍結融解されたものであってもよい。凍結融解したＰＢＭＣを用いた場合でも本実施形態の方法により細胞性免疫応答活性を十分な感度で測定することが可能である。
　ヒト血清又は血漿は、採取した血液を遠心分離して液体部分を回収することで得られる。血清は、採取した血液を自然に凝固させてから遠心分離をする。一方、血漿は抗凝固剤の存在下で遠心分離をする。血清にはフィブリノーゲンなどの凝固因子が含まれていない。ヒト血清又は血漿は、単一ドナー由来であってよく、例えば、本実施形態の方法における被験者由来であってもよい。ヒト血清又は血漿が被験者由来である場合には、被験者から採取した全血を分離させ、ＰＢＭＣと、ヒト血清又は血漿とに分けて用いることができる。
　本実施形態の方法において使用される抗原は特に限定されないが、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体由来するタンパク質；腫瘍細胞、感染細胞、炎症細胞等の生体内で非自己と識別された細胞等に由来するタンパク質；及び上記タンパク質を構成するアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。抗原は２種類以上の抗原を組み合わせてもよい。
　抗原の由来となるウイルスとしては、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が挙げられる。ウイルスに由来するタンパク質としては、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）、ＨＩＶのＧａｇタンパク質、ＨＩＶのエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）、インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、ＣＭＶのｐｐ６５タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及びＨＰＶのＥ７タンパク質が挙げられる。
　抗原の由来となる細菌としては、例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が挙げられる。細菌に由来するタンパク質としては、例えば結核菌のＥＳＡＴ－６、及びリステリア菌のリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）が挙げられる。
　抗原の由来となる腫瘍細胞としては、例えば、ネオアンチゲンを発現した細胞、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＭＵＣ－１、ＣＡ１２５、ＣＡ１９－９、ＨＥＲ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、及びＷＴ－１陽性細胞が挙げられる。腫瘍細胞に由来するタンパク質としては、例えば、腫瘍細胞の細胞表面に発現した腫瘍特異的タンパク質が挙げられる。
　抗原の由来となる感染細胞としては、上記ウイルスに感染した細胞等が挙げられる。感染細胞に由来するタンパク質としては、例えば、感染細胞の細胞表面に提示されたウイルスタンパク質が挙げられる。
　抗原の由来となる炎症細胞としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病及び1型糖尿病等の自己免疫疾患で生じる自己免疫応答に係る細胞が挙げられる。炎症細胞に由来するタンパク質としては、例えば、炎症細胞の細胞表面に発現したタンパク質が挙げられる。
　抗原提示、及び抗原認識をｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏの水性媒体中で行えること自体は本技術分野で確立されており、当業者はその目的に適した水性媒体を通常の知識に基づいて選択又は調製することができる。
　本実施形態において、水性媒体は、ＰＢＭＣと、抗原と、ヒト血清又は血漿とを含む。インキュベート工程における水性媒体中のヒト血清又は血漿の含有量は、水性媒体の全体の質量を基準として２０％以上１００％未満であってもよい。例えば、ＰＢＭＣ及び抗原を添加する際、ＰＢＭＣ及び抗原以外の媒体（例えば、保存用バッファ）をヒト血清又は血漿に置き換えることができる。そのように準備したＰＢＭＣ及び抗原をヒト血清又は血漿に添加した場合、ＰＢＭＣ及び抗原を除いた水性媒体がほぼ１００％ヒト血清又は血漿となる。インキュベート工程における水性媒体中のヒト血清又は血漿の含有量は、水性媒体の全体の質量を基準として３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上であってもよく、９９．９％以下、又は９９．８％以下であってもよい。水性媒体は、ＰＢＭＣ、抗原、及びヒト血清又は血漿以外に、例えば、水、及び／又は細胞培養用の液体培地を含んでもよく、液体培地を含まないものであってもよい。
　インキュベート工程における、インキュベート前の水性媒体中におけるヒト血清又は血漿の質量は、本願発明の効果が奏される限り特に限定されないが、０．３×１０６ｃｅｌｌｓのＰＢＭＣに対して、例えば、０．０５ｍＬ～１．０ｍＬ、０．０５ｍＬ～０．５ｍＬ、０．１ｍＬ～０．３ｍＬ、又は０．１ｍＬ～０．２ｍＬであってもよい。
　ＰＢＭＣと、抗原と、ヒト血清又は血漿とを含む水性媒体をインキュベートする条件は、特に制限されず、当業者が適宜設定できるが、例えば、３０℃～４０℃の範囲の温度で実施され得、好ましくは３６．５℃～３７．５℃で実施することができる。また、インキュベーションは、例えば、１時間以上、１時間～７２時間、１時間～４８時間、１時間～２４時間、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～７時間、６時間～８時間、８時間～２４時間、１時間～４時間又は２時間～４時間で行うことができる。
　インキュベート工程における、インキュベート前の水性媒体中における抗原の含有量も、特に制限されず、当業者が適宜設定できるが、例えば、０．１～２０μｇ／ｍＬ、０．２～１０μｇ／ｍＬ、又は０．５～５μｇ／ｍＬであってよい。
　また、インキュベート工程における、インキュベート前の水性媒体中におけるＰＢＭＣの細胞数も、特に制限されず、当業者が適宜設定できるが、例えば、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ～０．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってもよい。
　本実施形態における測定工程（工程（２））は、インキュベート工程において抗原によりＰＢＭＣを刺激した後のＰＢＭＣ中の免疫エフェクター分子を測定する工程である。細胞性免疫応答活性の文脈で使用される「測定する」という用語は、細胞性免疫応答活性を定量化することだけでなく、その定量化結果に基づいて（例えば陰性対照及び／又は陽性対照と比較して）有意な細胞性免疫応答活性の有無を判定又は検査することも含み得る。
　白血球には、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、単球などが含まれる。単球はマクロファージや樹状細胞に分化するため、これらも白血球の一部とされる。リンパ球の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞が挙げられる。さらに、Ｔ細胞にはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれ得る。なお、白血球から顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞）を除いたものがＰＢＭＣである。
　細胞性免疫応答の活性の測定は、インキュベート工程において抗原によりＰＢＭＣを刺激した後のＰＢＭＣ中の免疫エフェクター分子を測定することにより行うことができる。
　免疫エフェクター分子の測定は、免疫エフェクター分子を検出すること、ＰＢＭＣおける免疫エフェクター分子の遺伝子発現を検出すること、及び免疫エフェクター分子を発現しているＰＢＭＣを検出すること等により行うことができる。免疫エフェクター分子を測定することは、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することであってもよく、免疫エフェクター分子であるタンパク質を検出及び／又は定量することであってもよい。
　免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法としては、例えば、ノザンブロットやマイクロアレイ等のハイブリダイゼーションに基づく方法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（配列決定）法等が挙げられるが、迅速性、簡便性、信頼性等の観点から逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法が好ましく、特にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法は優れた定量性を有するため好ましい。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法としては、例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）法が挙げられる。また、臨床現場などで簡便かつ迅速に使用できる方法として、例えば、定温核酸増幅法のＬｏｏｐ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（ＬＡＭＰ）法、Ｈｅｌｉｃａｓｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｉｎｖａｄｅｒ　ａｓｓａｙ法等も挙げられる。また、より定量性の高い方法として、例えば、Ｄｉｇｉｔａｌ　ｄｒｏｐｌｅｔ　ＰＣＲ法やＤｉｇｉｔａｌ　ｄｒｏｐｌｅｔ　ＬＡＭＰ法等も挙げられる。
　免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定する場合、ＰＢＭＣからＲＮＡ抽出してもよく、フローサイトメトリー又は磁気ビーズを用いる等してＰＢＭＣから特定の細胞サブセット（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞やＣＤ８＋Ｔ細胞）を分離してからＲＮＡ抽出してもよい。ＲＮＡ抽出は、一般的な市販の磁気ビーズ、遠心カラム等を利用したＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出法により行うことができる。ＲＮＡとしては、例えばｍＲＮＡ、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ画分、及びＴｏｔａｌ　ＲＮＡが挙げられる。免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定する際の測定対象となるｍＲＮＡは、スプライシング等のさまざまなプロセシングを受けて成熟したｍＲＮＡであっても、プロセシングを受けて成熟したｍＲＮＡになる前のＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体）であってもよい。
　逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法を用いる場合には、その後、逆転写酵素を用いて抽出したＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ｃＤＮＡを鋳型として免疫エフェクター分子に特異的なプライマーを用いて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行うことができる。定量ＰＣＲに使用するｑＰＣＲマスターミックスとしては、上述したＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）等を使用することができる。ｑＰＣＲ反応の条件は当業者が適宜設定することができる。得られた相対的なｍＲＮＡ発現レベルを内部標準遺伝子に対して正規化することで、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することができる。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法の場合には、ｑＰＣＲ反応の各サイクルごとに蛍光シグナルを収集し、ＰＣＲ産物の増幅をリアルタイムでモニターすることができる。
　ＰＢＭＣ中の免疫エフェクター分子を測定する工程は、例えば、以下の（ａ）～（ｂ）又は（ａ）～（ｃ）を含むＲＴ－ＰＣＲ法であってもよい。
　（ａ）ＰＢＭＣを細胞溶解して、ｍＲＮＡを含有する溶解物を得ること、
（ｂ）溶解物からｍＲＮＡを捕捉すること、及び
（ｃ）ｍＲＮＡレベルを測定すること。
　工程（ａ）としては、例えば、細胞溶解バッファーを用いて細胞を溶解することが挙げられる。細胞溶解によりＰＢＭＣに含まれるｍＲＮＡが溶出され、ｍＲＮＡを含有する溶解物が得られる。細胞溶解バッファーとしては、公知の細胞溶解バッファーを用いることができる。
　工程（ｂ）としては、例えば、工程（ａ）で得られた溶解物を、ｍＲＮＡ捕捉用基材（例えば、オリゴ（ｄＴ）固定化基材）に移して、４℃で１～２４時間インキュベートし、基材上にｍＲＮＡを捕捉することが挙げられる。
　工程（ｃ）としては、例えば、工程（ｂ）で単離されたｍＲＮＡに、プライマー及び逆転写酵素を含む逆転写バッファーを添加し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作り出すこと、並びにｃＤＮＡを免疫エフェクター分子の遺伝子の核酸配列に特異的なセンス及びアンチセンスプライマーとＤＮＡポリメラーゼとに接触させ、ＤＮＡ増幅産物を得ることが挙げられる。これにより、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することができる。
　ＰＣＲ反応終了後、又はＰＣＲ反応進行中（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの場合）に、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルが定量される。定量は、１つ以上のマーカーをコードするｍＲＮＡの量を参照値と比較することによって算出されてもよい。参照値としては、例えば、刺激剤（例：抗原ペプチド）によって発現が誘導も抑制もされない遺伝子の発現レベルを使用でき、具体例としては、公知のハウスキーピング遺伝子（例えば、β－アクチン）の発現レベルが挙げられる。ｍＲＮＡの発現レベルの評価は、例えば、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を用いて得られるサイクル閾値（Ｃｔ値）に基づいて行うことができる。免疫エフェクター分子のＣｔ値をハウスキーピング遺伝子のＣｔ値でノーマライズすることで、検体間での免疫エフェクター分子の発現量を容易に比較することができる。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法では、１つ以上の免疫エフェクター分子とハウスキーピング遺伝子の検出量を測定し、ハウスキーピング遺伝子のＣｔ値を用いて免疫エフェクター分子をノーマライズし、ノーマライズされたＣｔ値を遺伝子発現量に換算することで、抗原による刺激により発現変化（例：増加）したｍＲＮＡ量を概算することができる。
　また、例えば、１つ以上の免疫エフェクター分子の、抗原による刺激にて誘導された発現レベルを、非誘導処理（溶媒のみのコントロール）サンプルからの同じ免疫エフェクター分子の発現レベルと比較することで、刺激による免疫エフェクター分子の発現レベル変化を評価することもできる。誘導された免疫エフェクター分子の遺伝子発現量を誘導処理されていない免疫エフェクター分子の遺伝子発現量と比較した倍増率（Ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｆ．Ｉ．））値等から誘導の度合いを概算することができる。
　免疫エフェクター分子であるタンパク質を検出及び／又は定量する方法としては、例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ技術を用いる方法、ＥＬＩＳＡ法を用いる方法、及びフローサイトメトリー技術を用いる方法等が挙げられる。ＥＬＩＳｐｏｔ技術は、個々の細胞が分泌する分子を検出及び／又は定量するための方法であり、抗体により分泌された免疫エフェクター分子を捕捉し、スポットとして可視化することで免疫エフェクター分子を分泌する個々の細胞の数を定量することができる。ＥＬＩＳＡ法は、特定のタンパク質の濃度を検出及び／又は定量するための方法であり、ＰＢＭＣを刺激することにより分泌される免疫エフェクター分子を特異的な抗体を用いて捕捉し、化学発光や蛍光を利用して濃度を定量することができる。フローサイトメトリー技術は、蛍光標識抗体を用いて個々の細胞の表面又は内部の免疫エフェクター分子を検出し、細胞ごとの蛍光強度を測定することで、細胞の特性や分子の発現を解析することができる。
　細胞性免疫応答の活性の測定において、指標とできる一般的な免疫エフェクター分子としては、例えば、Ｔｈ１サイトカインが挙げられる。Ｔｈ１サイトカインは、Ｔｙｐｅ１　Ｔ　ｈｅｌｐｅｒ（Ｔｈ１）ｃｅｌｌから分泌されるサイトカインである。Ｔｈ１サイトカインの具体例としては、公知のＴ細胞機能関連マーカーであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン２（ＩＬ２）、及びインターロイキン１０（ＩＬ１０）等が挙げられる。これらのマーカーは細胞性免疫の一部として刺激されたＰＢＭＣにおいて発現が誘導される。なお、上記マーカーはヒトにおける名称で表示しているが、動物種によっては、又は文脈によっては、同じマーカーが別の名称で呼ばれることもあり得る。
　本実施形態の方法により、細胞性免疫応答の活性の測定をｅｘ　ｖｉｖｏで行うことができる。
　本実施形態のキットは、被験者の細胞性免疫応答活性を測定するためのものであり、被験者の細胞性免疫応答活性の測定は、上述した方法により行われるものであってよい。
　本実施形態のキットは、ヒト血清又は血漿下で抗原とインキュベートした末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して被験者の細胞性免疫応答活性を測定するためのものであってよい。
　本実施形態のキットは、抗原、及び／又は免疫エフェクター分子を測定するための試薬を含むものであってよい。抗原、免疫エフェクター分子、及びその測定方法等については、上述したとおりである。
　免疫エフェクター分子を測定するための試薬は、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するための試薬であってもよい。免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するための試薬としては、例えば、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出試薬、逆転写酵素、ランダムプライマー若しくはオリゴｄＴプライマー、ｑＰＣＲマスターミックス（典型的には、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ２、バッファー、及び蛍光色素等を含む、例えば、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製））、標的免疫エフェクター分子の遺伝子に特異的なプライマー、内部標準遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）のプライマー、及びこれらの組み合わせ等が含まれ得る。また、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するための試薬として、ＰＢＭＣからＲＮＡを精製するための試薬、及び／又はｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための試薬を含むものであってもよい。また、本実施形態のキットは、任意で、ＲＮａｓｅ阻害剤、及び／又はＰＣＲ反応プレート、及び／又はＴｏｔａｌ　ＲＮＡからｍＲＮＡを単離するための試薬を含んでもよい。
　免疫エフェクター分子を測定するための試薬は、免疫エフェクター分子であるタンパク質を検出及び／又は定量するための試薬であってもよい。免疫エフェクター分子であるタンパク質を検出及び／又は定量するための試薬としては、例えば、免疫エフェクター分子に特異的な捕捉抗体、捕捉された免疫エフェクター分子に結合する二次抗体、酵素反応の基質溶液、酵素反応の停止溶液、細胞培養バッファー、及びこれらの組み合わせ等から選択される試薬、免疫エフェクター分子若しくは細胞表面マーカーを検出する蛍光標識抗体、細胞固定・透過試薬、細胞染色バッファー、死細胞染色試薬、及びこれらの組み合わせ等から選択される試薬が含まれ得る。
　本実施形態のキットは、採血管（例えば、ヘパリンＮａ採血管）；全血からＰＢＭＣを分離及び／又は単離するためのＰＢＭＣ分離用チューブ（例えば、ＳｅｐＭａｔｅ－５０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製））若しくは試薬（例えば、フィコール（登録商標）、リンホプレップ（登録商標）等の密度勾配媒体）；細胞保存液（例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ　ＤＭＳＯ（富士フイルム和光純薬社製）、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）（日本全薬工業株式会社製））；洗浄バッファー；洗浄剤；界面活性剤；細胞培養容器（例えば、細胞培養プレート）；及び細胞培養培地（例えば、ＲＰＭＩ培地）から選択される１又は複数をさらに含んでもよい。採血管は、抗凝固剤を含んでいてもよい。一般的な抗凝固剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及びクエン酸ナトリウム等が挙げられる。
　免疫エフェクター分子を測定するための試薬が含み得る上述の成分は、任意に組み合わせて、前述の細胞性免疫応答活性の測定方法に用いることができ、例えば、各成分を組み合わせて１又は複数種の混合液を調整して、前述の細胞性免疫応答活性を測定方法に用いてもよい。
　本実施形態のキットは、上述したような試薬等を含む１又は複数の容器を含んでもよい。試薬等は、その種類毎に個別の容器に含まれていてもよく、任意に組み合わせて容器に含まれていてもよい。
　本実施形態のキットは、キットの使用説明書、及び／又はキットの使用方法を示すラベルを含んでもよい。ラベルは、キット上若しくはキットと共に提供されるか、又は別の方法でキットに付属するあらゆる書込若しくは記録された材料を含む。また、使用説明書及びラベルに示される使用方法は、使用説明書及びラベルに直接記載されていてもよく、使用方法が記載されたサイトへのリンク（例えば、ＵＲＬ、ＱＲコード（登録商標））として記載されていてもよい。
　本実施形態のキットにおける具体的な態様等として、細胞性免疫応答活性の測定方法で上述した態様等を制限なく適用することができる。
　以下、実施例を示して本開示の実施形態をさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は代表的な実験結果の例示に過ぎず、発明の実施形態がこれらの詳細に限定されるわけではないことが理解されるべきである。なお、以下の実施例においては、次のメーカーの試薬類を使用した。
［試薬］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆと記す）（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）；ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ　ＤＭＳＯ（以下、ＤＭＳＯと記す）、ＰＢＳ（－）（以下、ＰＢＳバッファーと記す）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、Ｔｗｅｅｎ２０と記す）（以上、富士フイルム和光純薬社製）；Ｍ－ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍ－ＭＬＶ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）；ＲＮａｓｉｎ（商標）Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（以下、ＲＮａｓｉｎと記す）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）；ベノインジェクトＩＩ真空採血管ヘパリンナトリウム（以下、ヘパリンＮａ採血管と記す）（テルモ社製）；９６ウェル　透明　丸底　細胞培養表面処理　マイクロプレート（以下、細胞培養プレートと記す）、Ｃｏｓｔａｒ［登録商標］６ウェル　透明　細胞培養処理　マルチウェルプレート（以下、６ウェルプレートと記す）、Ｆａｌｃｏｎ［登録商標］コニカルチューブ（５０ｍＬ）（以下、５０ｍＬファルコンチューブと記す）（以上、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）；ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ　Ｏｐｔｉｃａｌ　９６－Ｗｅｌｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｐｌａｔｅ，　０．１　ｍＬ（以下、９６ウェルＰＣＲプレート）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）；　ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）；ＳｅｐＭａｔｅ－５０、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（以上、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）；ＲＰＭＩ　Ｍｅｄｉｕｍ　１６４０（以下、ＲＰＭＩ培地と記す）、ＦＢＳ（以上、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）；ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１（日本全薬工業社製）；ヒトＡＢ型男性ドナー脱フィブリン血清（以下、ヒト血清と記す）（ＧＲＩＦＯＬＳ社製）；Ｔｕｒｋｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、チュルク液と記す）（シグマアルドリッチ社製）。
［試験例１　細胞性免疫応答活性の測定方法］
（１）サンプルの準備
　新鮮血と記載するサンプルは、ヘパリンＮａ採血管に採血し、反転混和を行った後、２４時間以内に抗原刺激に使用したサンプルを指す。新鮮血は採血後に、チュルク液を用いて細胞数をカウントした。凍結ＰＢＭＣと記載するサンプルは、ヘパリンＮａ採血管に採血した血液から、ＰＢＭＣを分離し凍結保管したサンプルを指す。以下に、ＰＢＭＣ分離の工程を示す。ヘパリンＮａ採血管に採血した血液を、５０ｍＬファルコンチューブに分注し、３００ｇ、２５℃で１０分間遠心を行うことで、血漿と血球成分に分けた。血漿は別の５０ｍＬファルコンチューブに分注し－８０℃のフリーザーで凍結し保管した。５０ｍＬファルコンチューブに残存した血球に、上記で別の５０ｍＬファルコンチューブに分注した血漿と同量の「ＦＢＳを２％含むＰＢＳバッファー（ＰＢＳ－２％ＦＢＳと記す）」を加え混合し、さらに上記の採血量と同量のＰＢＳ－２％ＦＢＳを加え混合した。上記の通りにＰＢＳ－２％ＦＢＳで調製した血球の懸濁液を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを分注済みのＳｅｐＭａｔｅ－５０に分注し、１２００ｇ、２５℃で１０分間遠心を行い、ＰＢＭＣを分離した。別の５０ｍＬファルコンチューブにＰＢＭＣを移動し、当該ＰＢＭＣに１０ｍＬのＰＢＳ－２％ＦＢＳを加え懸濁し、３００ｇ、２５℃で８分間遠心を行った後、上清を取り除いた。再度、同様の操作を行い、ＰＢＭＣを洗浄した後、当該ＰＢＭＣを１ｍＬのセルバンカーに懸濁し、－８０℃のフリーザーで凍結し保管した。
（２）刺激用のペプチドプール
　野生型Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成するスパイクタンパク質のアミノ酸配列を元に作製されたオーバーラップペプチドプール製品である、ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆを準備した。これらのペプチドプールはスパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５アミノ酸長断片に相当する複数のペプチドから構成され、隣接するペプチドが互いに１１アミノ酸オーバーラップしている。
（３）ペプチドプレートの準備及び保管
　ペプチドプールを、抗原希釈液（２０％のＤＭＳＯを含むＰＢＳバッファー）を用いて２０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。各ペプチドプール溶液を５μＬずつ、細胞培養プレートの各ウェルに分注した。また、前記各ペプチドプール溶液の他、陰性コントロールとして前記抗原希釈液を５μＬずつ細胞培養プレートの別のウェルに分注した。それぞれの溶液が分注された細胞培養プレート（以下、ペプチドプレートと記す）を、－８０℃のフリーザーで凍結し保管した。
（４）新鮮血及びＰＢＭＣのペプチド刺激
　凍結保管していたＰＢＭＣを２５℃で保持し、ＰＢＭＣを融解した。６ウェルプレートに当該ＰＢＭＣを分注し、ヒト血清を５％含むＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ－５％ヒト血清）を５ｍＬ加え、３７℃で１６時間回復培養を行った。１６時間培養した後に、当該ＰＢＭＣを含むＲＰＭＩ培地５ｍＬを、５０ｍＬファルコンチューブに移動した。その後、ＰＢＭＣが存在していた空のウェルに、ヒト血清を含まないＲＰＭＩ（以下、ヒト血清フリーＲＰＭＩ培地と記す）を５ｍＬ添加して共洗いし、当該ＲＰＭＩ培地を、上記５０ｍＬファルコンチューブに移動した（この時点で、５０ｍＬファルコンチューブには、ＰＢＭＣを含む１０ｍＬのＲＰＭＩ培地が存在している）。当該ＰＢＭＣを含むＲＰＭＩ培地を３００ｇ、２５℃で１０分間遠心した後、上清を取り除いた。再度、上記と同様に、ヒト血清フリーＲＰＭＩ培地を用いてＰＢＭＣを洗浄した後、当該ＰＢＭＣをヒト血清フリーＲＰＭＩ培地に懸濁した。その後セルカウントを行い、新鮮血と同様の細胞濃度になるように調製した。
　凍結保管していたペプチドプレートを２５℃で保持し、ペプチドプール溶液を融解した。新鮮血、又は細胞濃度を調整したＰＢＭＣを、ペプチドプレートの各ウェルに１２０μＬずつ添加し、攪拌し混合した。攪拌の後、３７℃で４時間インキュベートし、新鮮血に含まれる白血球、又はＰＢＭＣ（凍結保管していたＰＢＭＣ）に対してペプチド刺激を行った。インキュベート後、ペプチド刺激された白血球又はＰＢＭＣを含むペプチドプレートを－８０℃で凍結し保管した。
（５）抗原刺激後の新鮮血に含まれる白血球の捕捉
　（４）で凍結した、上記ペプチドプレートを３７℃で１５分間保持し、各ウェル中のサンプルを融解した。マルチウェルフィルタープレートのウェルに、フィルター洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー）を１５０μＬずつ添加し、２５００ｇ、４℃で１分間遠心分離した。その後、上記全血サンプルをウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１０分間静置した後、２５００ｇ、４℃で２分間遠心分離を行い、フィルター上に白血球を捕捉した。また、（４）で凍結保存したＰＢＭＣにも、新鮮血と同様の操作を行い、フィルター上にＰＢＭＣを捕捉した。なお、この実施例の文脈では、「遠心分離」とは、遠心分離機でプレートを回転させてプレートの底方向に遠心力を掛けることを意味する。
（６）ｍＲＮＡの溶出及び捕捉
　細胞溶解バッファーを、上記フィルタープレートの各ウェルのフィルター上に６０μＬずつ添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、フィルター上の白血球又はＰＢＭＣを溶解した。オリゴ（ｄＴ）が各ウェルに固定化されている別のマルチウェルプレート（以下、ｍＲＮＡ捕捉用プレートという）を、上記フィルタープレートの下に配置して両プレートのウェルを上下に重ならせ、２５００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。フィルタープレートを取り外し、細胞溶解液をウェル中に受け入れたｍＲＮＡ捕捉用プレートを４℃で１～２４時間インキュベートした。インキュベート後、洗浄バッファーを用いて各ウェルを洗浄し、細胞溶解液中に含まれていたオリゴ（ｄＴ）非結合性物質を取り除いた。
（７）ｃＤＮＡの合成
　逆転写酵素を含む逆転写バッファーを、ｍＲＮＡ捕捉用プレートの各ウェルに３０μＬずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。前記操作により、ｍＲＮＡ捕捉用プレートに捕捉されていたポリＡテールを有すｍＲＮＡの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。
（８）ｑＰＣＲ
　ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘに、各遺伝子（アクチンベータ：ＡＣＴＢ、インターフェロンガンマ：ＩＦＮＧ）用のプライマー対（表１に配列を示す）を混合し、９６ウェルＰＣＲプレートのウェルに６μＬずつ分注した。上記（６）で得られたｃＤＮＡ溶液を４μＬずつウェルに添加し、７５００　ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、当該システムの取扱説明書に従い、下記のサイクルでリアルタイムＰＣＲを行った。
　Ｓｔａｇｅ１：９５℃　１０：００，
　Ｓｔａｇｅ２：４０ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　９５℃　００：３０　ａｎｄ　６５℃　１：００，
　Ｓｔａｇｅ３：Ｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ
（９）測定結果の解析方法
　リアルタイムＰＣＲにより得られた各遺伝子の測定値は、反応の閾値を満たすサイクル数であるＣｔ値で表すこととした。また、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ遺伝子のＣｔ値を用いて、検出対象遺伝子（ＩＦＮＧ）のＣｔ値をノーマライズし、ノーマライズされたＣｔ値を遺伝子発現量へ換算することで、刺激により発現増加したｍＲＮＡ量を概算した。すなわち、概算したｍＲＮＡ発現量を、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と比較することで、ペプチド刺激特異的なｍＲＮＡ発現量を決定し、結果はｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．で表現した。例えば、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が０の時は、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量とが同じであることを意味し、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が１の時は、刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量が、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量の２倍であることを意味する。従って、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が大きいほど、ペプチド刺激で誘導されたｍＲＮＡ発現量が増加したことを意味する。
［試験例２］
［ヒト血清フリーＲＰＭＩ培地中でＰＢＭＣを抗原刺激した場合］
　ＣＯＶＩＤ－１９ｍＲＮＡワクチンを接種した方６例を対象に、ヘパリンＮａ採血管に血液を採取し、試験例１に記載の方法に従い、同一被験者の新鮮血と凍結ＰＢＭＣとを用いて、新鮮血を用いた場合の細胞性免疫活性と、凍結ＰＢＭＣを用いた場合の細胞性免疫活性とを比較した。なお、ＰＢＭＣを用いる細胞性免疫活性測定において、ＰＢＭＣの抗原刺激を行う工程は、ヒト血清及又はヒト血漿を含まないＲＰＭＩ培地中で行った。
　ＩＦＮ－γ（ＩＦＮＧ）遺伝子を細胞性免疫の活性の指標として測定した新鮮血の結果を図１に、ＰＢＭＣの結果を図２に示す。新鮮血を用いた場合は、遺伝子発現変動の誤差の範囲（－１＜ＬＯＧ２Ｆ．Ｉ．＜１）を上回る発現の増加した一方、ヒト血清及又はヒト血漿を含まないＲＰＭＩ培地中で、ＰＢＭＣを抗原刺激した場合は、誤差の範囲を上回る発現の増加がみられなかった。
［実施例１］
［ヒト血漿中でＰＢＭＣを抗原刺激した場合］
　ＣＯＶＩＤ－１９ｍＲＮＡワクチンを接種した方６例を対象に、ヘパリンＮａ採血管に血液を採取し、試験例１に記載の方法に従い、同一被験者の新鮮血と凍結ＰＢＭＣとを用いて、新鮮血を用いた場合の細胞性免疫活性と、凍結ＰＢＭＣを用いた場合の細胞性免疫活性とを比較した。なお、本実施例１のＰＢＭＣを用いる細胞性免疫活性測定において、抗原刺激を行う工程は、試験例２の「ヒト血清及又はヒト血漿を含まないＲＰＭＩ培地中で行う」のではなく、同一被験者の血漿中で行った。また、被験者１、２、５については、ＰＢＭＣの細胞数０．３×１０６個に対して０．１ｍＬの血漿を添加し、被験者３、４、６については、ＰＢＭＣの細胞数０．２×１０６個に対して０．１ｍＬの血漿を添加した。
　同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行い、ＩＦＮ－γ（ＩＦＮＧ）遺伝子を細胞性免疫の活性の指標として測定した結果を表２及び図３に示す。同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合、遺伝子発現変動の誤差の範囲（－１＜ＬＯＧ２Ｆ．Ｉ．＜１）を上回る発現が増加した。また、６例の結果の平均値を算出した結果を図４に示す。図４について、同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性と、ヒト血清及又はヒト血漿を含まないＲＰＭＩ培地中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性とについて、Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定を実施したところ、同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性の方が有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。また、同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性と、ヒト血清及又はヒト血漿を含まないＲＰＭＩ培地中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性とについて、新鮮血の測定値に対する相対値（新鮮血の測定値を１００としたときの相対値）の６例の平均値を図５に示す。同一被験者の血漿中でＰＢＭＣの抗原刺激を行った場合の細胞性免疫活性は、１００％に近い値を示した。

Claims (11)

  1. 　（１）被験者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、抗原と、ヒト血清又は血漿とを含む水性媒体をインキュベートする工程、及び
    　（２）工程（１）の後、ＰＢＭＣ中の免疫エフェクター分子を測定する工程
    を含む、被験者の細胞性免疫応答活性を測定する方法。
  2. 　ヒト血清又は血漿が、前記被験者由来である、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（１）における水性媒体中のヒト血清又は血漿の含有量が、水性媒体の全体の質量を基準として２０％以上１００％未満である、請求項１に記載の方法。
  4. 　工程（１）において、インキュベート前の水性媒体中におけるヒト血清又は血漿の質量が、０．３×１０６ｃｅｌｌｓのＰＢＭＣに対して、０．０５ｍＬ～１．０ｍＬである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　ＰＢＭＣが、被験者から採取した後に凍結融解されたものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　工程（１）の前に、被験者から採取した全血からＰＢＭＣを分離及び／又は単離する工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　水性媒体が液体培地を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　免疫エフェクター分子を測定することが、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の方法により、被験者の細胞性免疫応答活性を測定するためのキット。
  10. 　（１）抗原、及び
    　（２）免疫エフェクター分子を測定するための試薬
    を含む、ヒト血清又は血漿下で抗原とインキュベートした末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して被験者の細胞性免疫応答活性を測定するためのキット。
  11. 　（３）ＰＢＭＣを分離及び／又は単離するためのＰＢＭＣ分離用チューブ又は試薬、
    　（４）ＰＢＭＣからＲＮＡを精製するための試薬、及び
    （５）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための試薬をさらに含み、
    　試薬（２）が、免疫エフェクター分子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するための試薬である、請求項１０に記載のキット。
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