WO2026005409A1 - Usp10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Usp10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물

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WO2026005409A1
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liver fibrosis
usp10
composition
inhibitor
expression
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전경희
백정환
에르덴빌랙졸자야
황민선
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University Industry Foundation UIF of Yonsei University
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    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • liver tissue When liver tissue is damaged and an inflammatory response occurs, hepatic stellate cells are activated to heal the wounds, secreting large amounts of collagen and the extracellular matrix (ECM). However, if the inflammatory response progresses chronically and this wound healing process becomes excessive, liver fibrogenesis occurs. If liver fibrosis continues, large amounts of collagen are deposited within the liver tissue, and regenerative crystals are surrounded by this collagen, resulting in an abnormal liver structure, which can develop into cirrhosis.
  • ECM extracellular matrix
  • Liver fibrosis is caused by a chronic inflammatory response in the liver tissue, and the causes of this inflammatory response are known to include hepatitis caused by viral infection, alcohol consumption, drug abuse, autoimmune disease, metabolic disorder, cholestasis, and hepatitis caused by other causes.
  • hepatitis caused by viral infection alcohol consumption, drug abuse, autoimmune disease, metabolic disorder, cholestasis, and hepatitis caused by other causes.
  • the incidence of non-viral hepatitis mainly caused by non-alcoholic liver disease or metabolic disease is increasing, and the patient rate and mortality rate of this non-viral liver fibrosis are also increasing.
  • liver fibrosis progresses to cirrhosis, it becomes an irreversible chronic disease in which normal restoration of liver tissue is difficult, and as a result, it progresses to decompensated cirrhosis or liver cancer, and the mortality rate continues to increase.
  • liver fibrosis such as liver fibrosis and non-alcoholic steatohepatitis
  • the inventors of the present invention discovered a compound that can effectively treat diseases related to liver fibrosis, such as liver fibrosis and non-alcoholic steatohepatitis, and confirmed its excellent therapeutic or preventive efficacy, thereby completing the present invention.
  • One aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • Another aspect provides a food composition for preventing or improving liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases, comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • Another aspect provides a feed composition for preventing or improving liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases, comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method for screening for a therapeutic agent for liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, comprising: 1) treating a candidate substance in an in vitro model expressing USP10; and 2) determining the level of USP10 expression or activity in the model.
  • compositions for diagnosing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease comprising a preparation capable of measuring the expression level of a USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same.
  • One aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • USP Ubiquitin-specific protease
  • DRB deubiquitinating enzymes
  • the above USP10 inhibitor may inhibit the expression and/or activity of USP10.
  • agent capable of inhibiting the expression or activity of USP10 or “inhibitor of the expression or activity of USP10” in this specification refers to a substance capable of inhibiting the expression or activity of USP10 by directly or indirectly binding to a gene, mRNA, or protein encoding USP10.
  • the agent capable of inhibiting the expression or activity of USP10 may be used in the same sense as USP10 inhibitor or USP10 inhibitor.
  • the agent capable of inhibiting the expression or activity of the above USP10 is not particularly limited thereto, but as a specific example, the agent capable of inhibiting the expression of USP10 may be characterized by being selected from the group consisting of miRNA, siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide and combinations thereof that complementarily bind to the mRNA of the gene encoding USP10, and the agent capable of inhibiting the activity of USP10 may be characterized by being selected from the group consisting of antibodies, aptamers, small molecules and combinations thereof that complementarily bind to the protein of USP10.
  • siRNA, siRNA or shRNA refers to a nucleic acid molecule that primarily binds to mRNA transcribed from a target gene to inhibit translation of said mRNA in order to mediate RNA interference or gene silencing. Since the siRNA or shRNA can inhibit the expression of a target gene at the translation level, it can be used in an efficient gene knockdown method or gene therapy method, and for the purposes of the present specification, it can be used to inhibit the expression of USP10.
  • the USP10 inhibitor may be an siRNA
  • the siRNA may comprise one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 2, and specifically, a pair of sequences consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • antisense oligonucleotide means DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, which binds to the complementary sequence in the mRNA and exhibits the effect of inhibiting the translation of the mRNA into protein, and for the purposes of this specification, can be used to inhibit the expression of USP10.
  • antibody refers to a proteinaceous molecule capable of specifically binding to an antigenic site of a protein or peptide molecule. Such antibodies can be produced by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene, and then producing the obtained protein by a conventional method. In the present specification, the antibody can be interpreted as a means capable of inhibiting the activity of the activated USP10 protein by binding to the protein.
  • a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a part thereof having antigen binding property capable of specifically binding to USP10 is included in the antibody, and not only all immunoglobulin antibodies can be included, but also special antibodies such as humanized antibodies can be included.
  • the antibody can be a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as a form including a functional fragment of the antibody molecule.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment that possesses at least an antigen-binding function, and can be Fab, F(ab'), F(ab') 2, and Fv, etc.
  • aptamer refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a predetermined target molecule.
  • the aptamer may be RNA, DNA, a modified nucleic acid, or a mixture thereof, and may be linear or cyclic.
  • the shorter the nucleotide sequence constituting the aptamer the easier it is to chemically synthesize and mass-produce, the better the cost-effectiveness, the easier it is to chemically modify, the better the in vivo stability, and the lower the toxicity.
  • the aptamer may be interpreted as a means capable of inhibiting the activity of an activated USP10 protein by binding to the protein.
  • small molecule refers to a small molecular weight organic compound that binds to a biopolymer such as a protein and modulates its function. It may be naturally derived or artificially synthesized, and may inhibit the function of the protein or interfere with protein-protein interactions, but is not limited thereto.
  • the small molecule compound includes, without limitation, any molecule that inhibits the activity of the activated USP10 protein, and a specific example thereof includes, but is not limited to, a molecule that binds to activated USP10 and inhibits its activity.
  • the above USP10 inhibitor may include at least one selected from the group consisting of Spautin-1, USP10-IN-3, USP10-IN-9, Wu-5, P22077, HBX19818, and Quercetin, and specifically, the USP10 inhibitor may include Spautin-1.
  • Spautin-1 in this specification refers to a compound represented by the following chemical formula 1 (IUPAC name: 6-Fluoro-N-[(4-fluorophenyl)methyl]-4-quinazolinamine or 6-Fluoro-N-(4-fluorobenzyl)quinazolin-4-amine) (CAS Number: 1262888-28-7), which is expressed by the chemical formula of C 15 H 11 F 2 N 3 .
  • spautin-1 or a composition comprising the same can inhibit the activity and/or expression level of USP10.
  • USP10-IN-3 in this specification refers to a compound represented by the following chemical formula 2 (IUPAC name: 9-chloro-N-(3-(dipropylamino)propyl)-5, 6, 7, 8-tetrahydroacridine-3-carboxamide) (CAS Number: 904448-58-4), which is expressed by the chemical formula of C 23 H 32 ClN 3 O.
  • USP10-IN-9 in this specification refers to a compound represented by the following chemical formula 3 (IUPAC name: N-(3-(benzyl(ethyl)amino)propyl)-9-chloro-2, 3-dihydro-1H-cyclopenta[b]quinoline-6-carboxamide) (CAS Number: 902281-60-1), which is expressed by the chemical formula C 25 H 28 ClN 3 O.
  • Wu-5" in this specification refers to a compound represented by the following chemical formula 4 (IUPAC name: Ethyl 5-(4-(methoxycarbonyl)phenoxy)-4-nitrothiophene-2-carboxylate) (CAS Number: 2630378-05-9) , which is expressed by the chemical formula of C 15 H 13 NO 7 S.
  • P22077 in this specification refers to a compound represented by the following chemical formula 5 (IUPAC name: 1-(5-(2,4-Difluorophenylthio)-4-nitrothiophen-2-yl)ethanone) (CAS Number: 1247819-59-5), which is expressed by the chemical formula of C 12 H 7 F 2 NO 3 S 2 .
  • HBX19818 in this specification refers to a compound represented by the following chemical formula 6 (IUPAC name: N-(3-(benzyl(methyl)amino)propyl)-9-chloro-5,6,7,8-tetrahydroacridine-2-carboxamide) (CAS Number: 1426944-49-1), which is expressed by the chemical formula of C 25 H 28 ClN 3 O.
  • Quercetin in this specification refers to a compound represented by the following chemical formula 7 (IUPAC name: 3,3 ⁇ ,4 ⁇ ,5,7-Pentahydroxyflavone) (CAS Number: 117-39-5), which is expressed by the chemical formula C 15 H 10 O 7 .
  • the composition may include at least one selected from the group consisting of a compound having USP10 inhibitory activity as the USP10 inhibitor, a stereoisomer thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, and a solvate thereof, and specifically, the composition may include at least one selected from the group consisting of a spautin-1 compound represented by the chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, and a solvate thereof.
  • salts that can be used pharmaceutically among salts, which are substances in which cations and anions are bound by electrostatic attraction, and can typically be a metal salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a salt with a basic or acidic amino acid, etc.
  • the metal salt can be an alkali metal salt (sodium salt, potassium salt, etc.), an alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.), an aluminum salt, etc.
  • the salt with an organic base can be a salt with triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N,N-dibenzylethylenediamine, etc.
  • the salt with an inorganic acid can be a salt with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.
  • Salts with organic acids include salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc.; salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine, etc.; salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid, glutamic acid, etc.
  • Particularly preferred salts include, when the compound has an acidic functional group therein, inorganic salts such as alkali metal salts (e.g., sodium salts, potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts (e.g., calcium salts, magnesium salts, barium salts, etc.), and organic salts such as ammonium salts; and, when the compound has a basic functional group therein, salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc., and salts with organic acids such as acetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc.
  • inorganic salts such as alkali metal salts (e.g., sodium salts, potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts
  • liver fibrosis or “liver fibrogenesis” in this specification refers to the wound healing process that occurs when collagen, secreted in large quantities by activated hepatic stellate cells, combines with the extracellular matrix (ECM) as an inflammatory response continues due to tissue damage. If liver fibrosis continues to progress, a large amount of collagen is deposited within the liver tissue, and regenerative nodules may develop into cirrhosis, in which they are surrounded by collagen and take on an abnormal structure.
  • ECM extracellular matrix
  • liver fibrosis-related disease may refer to a disease that may develop as liver tissue progresses to fibrosis and/or a disease that causes liver fibrosis.
  • the hepatitis-related disease may include at least one selected from the group consisting of liver fibrosis, liver fibrosis, alcoholic steatohepatitis, non-alcoholic steatohepatitis, cirrhosis, liver cirrhosis, and liver failure.
  • the liver cirrhosis may include at least one selected from the group consisting of portal cirrhosis, post-necrotic cirrhosis, biliary cirrhosis, nutritional cirrhosis, alcoholic cirrhosis, viral hepatitis cirrhosis, cholestatic cirrhosis, and cardiac cirrhosis.
  • a composition comprising the above USP10 inhibitor may inhibit the induction or progression of liver fibrosis, or reduce or inhibit fibrosis that has already progressed.
  • composition comprising the above USP10 inhibitor (specifically, spautin-1) may suppress the activity and/or expression level of a liver fibrosis marker.
  • the liver fibrosis marker may include at least one selected from the group consisting of collagen 1, fibronectin, and alpha smooth muscle actin ( ⁇ -SMA).
  • treatment means any action that improves or beneficially changes the symptoms of liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease by administering the composition of the present invention.
  • prevention in this specification means any action that inhibits or delays the possibility of developing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease by administering the composition of the present invention.
  • the composition may contain the USP10 inhibitor at a concentration of 0.1 to 100 ⁇ M, specifically 0.1 to 100 ⁇ M, 0.1 to 80 ⁇ M, 0.1 to 60 ⁇ M, 0.1 to 40 ⁇ M, 0.1 to 20 ⁇ M, 0.1 to 15 ⁇ M, 0.1 to 10 ⁇ M, 0.1 to 8 ⁇ M, 0.1 to 6 ⁇ M, 0.1 to 5 ⁇ M, 0.5 to 100 ⁇ M, 0.5 to 80 ⁇ M, 0.5 to 60 ⁇ M, 0.5 to 40 ⁇ M, 0.5 to 20 ⁇ M, 0.5 to 15 ⁇ M, 0.5 to 10 ⁇ M, 0.5 to 8 ⁇ M, 0.5 to 6 ⁇ M, 0.5 to 5 ⁇ M, 1 to 100 ⁇ M, 1 to 80 ⁇ M, 1 to 60 ⁇ M, 1 to 40 ⁇ M, 1 to 20 ⁇ M, 1 to 15 ⁇ M, 1 to 10 ⁇ M, 1 to 8 ⁇ M, 1 to 6 ⁇ M, 1 to 5 ⁇ M, 1
  • the composition may further comprise a known agent for treating liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, and specifically, may further comprise at least one selected from the group consisting of Resmetirom, lanifibranor, semaglutide, and Efruxifermin.
  • the USP10 inhibitor or a composition comprising the same may be administered in combination with a known agent for treating liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, and specifically may be administered simultaneously and/or sequentially.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier may refer to a carrier or diluent that does not stimulate a living organism and does not inhibit the biological activity or properties of the compound being injected.
  • pharmaceutically acceptable means that the carrier does not inhibit the activity of the active ingredient and does not exhibit toxicity exceeding the adaptability of the subject of application (prescription). Any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable may be used in the pharmaceutical composition.
  • Non-limiting examples of the above carriers include lactose, dextrose, maltodextrin, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, glycerol, ethanol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may be prepared as an oral formulation or a parenteral formulation according to the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • the above pharmaceutical composition can be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, or sterile injection solutions, each according to a conventional method.
  • the above pharmaceutical composition may be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • diluents or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, or surfactants that are commonly used.
  • the above pharmaceutical composition When the above pharmaceutical composition is manufactured into an oral dosage form, it can be manufactured into a dosage form such as powder, granules, tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, suspensions, wafers, etc., using a suitable carrier according to a method known in the art.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers include sugars such as lactose, glucose, sucrose, dextrose, sorbitol, mannitol, and xylitol; starches such as corn starch, potato starch, and wheat starch; cellulosics such as cellulose, methylcellulose, ethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and hydroxypropylmethylcellulose; polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, magnesium stearate, mineral oil, malt, gelatin, talc, polyols, and vegetable oils.
  • the formulation may include diluents and/or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants, as needed.
  • suitable carriers include sterile water, ethanol, polyols such as glycerol or propylene glycol, or mixtures thereof, and preferably, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanolamine, sterile water for injection, and isotonic solutions such as 5% dextrose can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • transdermal dosage form When formulated as a transdermal dosage form, it can be formulated in the form of ointments, creams, lotions, gels, external solutions, pastes, liniments, aerosols, etc.
  • a suitable propellant such as dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, or carbon dioxide
  • the base in the case of formulating it as a suppository, the base can be witepsol, tween 61, polyethylene glycol, cacao butter, laurin butter, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene stearate, sorbitan fatty acid ester, etc.
  • the above pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount, wherein the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat or prevent a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or prevention, and the effective dosage level may be determined according to factors including the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration of the composition of the present invention used, the route of administration and the excretion rate, the treatment period, drugs used in combination or simultaneously with the composition of the present invention used, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition may be administered alone or in combination with a component known to exhibit a therapeutic effect on known liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases. It is important to take all of the above factors into consideration and administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be determined by a person skilled in the art in consideration of the intended use, degree of toxicity of the disease, age, weight, sex, medical history of the patient, or the type of substance used as the active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at about 0.1 ng to about 1,000 mg/kg, preferably 1 ng to about 100 mg/kg, per adult, and the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered once a day or administered in divided doses several times.
  • the dosage or frequency of administration does not limit the scope of the present invention in any way.
  • Another aspect provides a method for treating or preventing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease comprising administering to a subject a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease.
  • the same portions described above also apply to the method.
  • subject may include, without limitation, mammals, birds, reptiles, farmed fish, etc., including rats, livestock, humans, etc., that develop or are at risk of developing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, and the subject may exclude humans.
  • the pharmaceutical composition described above may be administered in single or multiple doses in a pharmaceutically effective amount.
  • the composition may be formulated and administered in the form of a liquid, powder, aerosol, injection, infusion solution (Ringel), capsule, pill, tablet, suppository, or patch.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases may be administered via any conventional route, as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition may be administered, but is not particularly limited thereto, via routes such as intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, transdermal patch administration, oral administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration, depending on the intended purpose.
  • routes such as intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, transdermal patch administration, oral administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration, depending on the intended purpose.
  • routes such as intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, transdermal patch administration, oral administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration, depending on the intended purpose.
  • the oral composition when administered orally, it may be administered in an unformulated form, and since the active ingredient of the pharmaceutical composition may be denatured or decomposed by gastric acid, the oral composition may be administered orally in a form that coat
  • the method may further comprise a step of administering to the subject a known agent for treating liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, specifically, a step of administering at least one selected from the group consisting of Resmetirom, lanifibranor, semaglutide, and Efruxifermin.
  • the method comprises a step of co-administering a USP10 inhibitor or a composition comprising the same and a known treatment for liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, and specifically, the USP10 inhibitor or a composition comprising the same and the known treatment for liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease may be administered simultaneously and/or sequentially.
  • Another aspect provides a food composition for preventing or improving liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • a food composition for preventing or improving liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • improvement in this specification means any act of improving or beneficially altering the symptoms of liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease by administration of the composition of the present invention.
  • food in this specification includes meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, health functional foods, and health foods, and includes all foods in the conventional sense.
  • the above food can be manufactured by a method commonly used in the art, and can be manufactured by adding raw materials and ingredients commonly added in the art during the manufacturing process.
  • the formulation of the food can be manufactured without limitation as long as it is a formulation recognized as a food.
  • the food composition can be manufactured in various forms of formulations, and unlike general drugs, it has the advantage of not having side effects that may occur with long-term use of drugs because it uses food as a raw material, and is highly portable, so the food composition of the present invention can be taken as a supplement to enhance the effect of improving bone-related diseases.
  • the above food composition may be a health functional food composition.
  • health functional food in this specification refers to a food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functionality useful to the human body as defined in Act No. 6727 on Health Functional Foods, and "functionality” refers to obtaining a useful effect for health purposes, such as regulating nutrients or physiological effects for the structure and function of the human body.
  • the above health food refers to a food that has a more active health maintenance or promotion effect than general food
  • health supplement food refers to a food for the purpose of health supplementation.
  • the terms health functional food, health food, and health supplement may be used interchangeably.
  • the above health functional food refers to a food that is made by adding a composition to food materials such as beverages, teas, spices, gum, and confectionery, or by manufacturing it in the form of capsules, powder, suspension, etc., and means that when consumed, it brings about a specific health effect.
  • unlike general drugs it has the advantage of not having the side effects that can occur with long-term use of drugs because it is made from food.
  • the above food composition can be used very usefully because it can be consumed on a daily basis and is expected to be highly effective in improving liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases.
  • the food composition may further comprise a physiologically acceptable carrier, and the type of the carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used.
  • the food composition may comprise additional ingredients commonly used in food compositions to improve odor, taste, sight, etc.
  • the food composition may comprise vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, pantothenic acid, etc.
  • the food composition may comprise minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), and chromium (Cr).
  • the food composition may comprise amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine.
  • the food composition may include food additives such as preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), bactericides (bleaching powder and high-purity bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), etc.), colorants (tar colorants, etc.), color developers (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleaching agents (sodium sulfite), seasonings (MSG, monosodium glutamate, etc.), sweeteners (dulcin, cyclamate, saccharin, sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), leavening agents (alum, D-potassium hydrogen tartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (glucose fillers), film-forming agents, gum-forming agents, gum
  • the above food composition can be added as is or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient mixed can be appropriately determined depending on its purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present invention can be added to the food or beverage in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less.
  • the content below the above range can be included, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient can also be used in an amount above the above range.
  • the above-mentioned food composition may be used as a health beverage composition, and in this case, various flavoring agents or natural carbohydrates may be contained as additional ingredients, as in a conventional beverage.
  • the above-mentioned natural carbohydrates may be monosaccharides such as glucose and fructose; disaccharides such as maltose and sucrose; polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin; and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the sweetener may be a natural sweetener such as thaumatin and stevia extract; or a synthetic sweetener such as saccharin and aspartame.
  • the proportion of the natural carbohydrate may be generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g, per 100 mL of the health beverage composition of the present invention.
  • the health beverage composition may contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, or carbonating agents.
  • it may contain fruit pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, or vegetable drinks.
  • These ingredients may be used independently or in combination.
  • the proportion of these additives is not particularly important, but is typically selected within the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health beverage composition of the present invention.
  • the above food composition may contain the compound of the present invention in various weight % if it can exhibit an effect of improving or preventing liver fibrosis or a disease related to liver fibrosis, and specifically, may contain the compound in an amount of 0.00001 to 100 wt % or 0.01 to 80 wt % relative to the total weight of the food composition, but is not limited thereto.
  • Another aspect provides a feed composition for preventing or improving liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases, comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • a feed composition for preventing or improving liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases comprising a USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • USP10 inhibitor as an active ingredient.
  • feed in this specification may mean any natural or artificial diet, meal, etc. or a component of said meal, intended for or suitable for eating, ingesting and digesting by an animal.
  • the type of the above feed is not particularly limited, and feed commonly used in the relevant technical field can be used.
  • Non-limiting examples of the above feed include plant-based feed such as grains, roots, food processing by-products, algae, fiber, pharmaceutical by-products, oils, starches, meal, or grain by-products; and animal-based feed such as proteins, inorganic substances, oils, minerals, oils, single-cell proteins, zooplankton, or food. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • the above feed composition may further include known additives that can be added to improve or prevent liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases, depending on the formulation.
  • the feed composition may be in the form of a highly concentrated solution, powder, or granules.
  • the feed composition may further include any protein-containing organic grain meal commonly used to meet the dietary needs of animals.
  • the feed composition may be used by being added to animal feed by immersion, spraying, or mixing.
  • the above feed composition may additionally contain substances that have various effects, such as nutrient supplementation and weight loss prevention, increased digestibility and availability of fiber in feed, improved milk quality, prevention of reproductive disorders and improved conception rate, and prevention of summer heat stress.
  • the feed composition may additionally contain mineral preparations such as sodium bicarbonate, bentonite, magnesium oxide, and complex minerals; trace mineral preparations such as zinc, copper, cobalt, and selenium; vitamins such as carotene, vitamin E, vitamins A, D, and E, nicotinic acid, and vitamin B complex; protected amino acids such as methionine and lysate; protected fatty acids such as fatty acid calcium salts; probiotics (lactic acid bacteria), yeast cultures, and mold fermentations; and yeast agents.
  • mineral preparations such as sodium bicarbonate, bentonite, magnesium oxide, and complex minerals
  • trace mineral preparations such as zinc, copper, cobalt, and selenium
  • vitamins such as carotene, vitamin E, vitamins A, D, and E, nicotinic
  • the above feed composition can be applied to a number of animal diets, i.e., feed and drinking water, including mammals and poultry.
  • the above feed composition may include all of a substance added to the feed (i.e., a feed additive), a feed raw material, or the feed itself to be fed to the individual.
  • Another aspect provides a method for screening for a therapeutic agent for liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, comprising: 1) treating a candidate substance with an in vitro model expressing USP10; and 2) determining the level of USP10 expression or activity in the model or a sample obtained therefrom.
  • the same portions described above also apply to the method.
  • the in vitro model expressing the above USP10 may include a tissue, organ, or cell expressing USP10, and specifically, may be an adipocyte expressing USP10.
  • the above sample refers to a material derived from an in vitro model expressing the USP10, and specifically may include, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, urine, cell culture, etc.
  • gene and/or protein samples may be obtained from these samples, and the gene sample may include nucleic acids such as DNA, mRNA, or cDNA synthesized from mRNA, and the type thereof is not limited thereto, as long as the expression level of a specific gene/protein can be confirmed therefrom.
  • the above candidate substance refers to an unknown substance used in screening to determine whether it affects the expression or activity of USP10.
  • the test substance includes, but is not limited to, compounds, nucleotides, antibodies, antisense RNA, siRNA (small interference RNA), and natural product extracts.
  • the step of confirming the above USP10 expression or activity level may include a step of measuring the expression level of mRNA and/or protein of USP10.
  • the mRNA expression level of the above USP10 may be measured by any one method selected from the group consisting of RT-PCR, quantitative or semi-quantitative RT-PCR, quantitative or semi-quantitative real-time RT-PCR, northern blot, and DNA or RNA chip.
  • the protein expression level of the above USP10 may be measured by any one method selected from the group consisting of tissue immunostaining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and immunoblot (Western Blot).
  • the above method may further include a step of determining the candidate substance as a treatment for liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease when the expression or activity level of USP10 is reduced according to the treatment of the candidate substance.
  • a decrease in the expression or activity level of USP10 due to the treatment with the above candidate substance may mean that the expression or activity level of USP10 is decreased compared to the control group not treated with the candidate substance, and specifically, may mean a state in which the activity or expression amount is decreased by 20% or more compared to the control group, more specifically, a state in which the activity or expression amount is decreased by 40% or more, and even more specifically, a state in which the activity or expression amount is decreased by 60% or more.
  • compositions for diagnosing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease comprising a formulation capable of measuring the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same.
  • a formulation capable of measuring the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same comprising a formulation capable of measuring the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same.
  • the composition can diagnose and/or predict the prognosis of liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease in a specific individual by detecting or measuring the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same.
  • diagnosis refers to confirming the presence or characteristics of a pathological condition.
  • diagnosis may refer to determining whether liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease has developed.
  • prognosis in this specification refers to a prediction regarding the progression or recovery of a disease, and refers to a prospect or preliminary assessment.
  • prognosis means determining whether treatment success, survival, recurrence, metastasis, drug responsiveness, resistance, etc., are present in a subject after treatment for liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease. In other words, it refers to an expectation regarding medical outcomes (e.g., long-term survival possibility, disease-free survival rate, etc.), and includes a positive prognosis (positive prognosis) or a negative prognosis (negative prognosis).
  • the negative prognosis includes disease progression or mortality such as recurrence or drug resistance
  • the positive prognosis includes disease improvement or stabilization such as disease remission or regression, such as a disease-free state.
  • prediction in this specification means to guess in advance about the medical outcome, and for the purpose of the present invention, it may mean to guess in advance the course of a patient diagnosed with liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease (progression, improvement, relapse, drug resistance).
  • measuring expression level in this specification refers to measuring the presence, expression, or degree of expression of a specific protein (peptide) or a gene encoding the protein, and may specifically be measuring the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or an mRNA or gene encoding the same.
  • Methods for measuring the expression level of the above protein may include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radical immunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoeletrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography, fluorescence activated cell sorter analysis (FACS), protein chip technology, or biosensor.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • radical immunodiffusion Ouchterlony immunodiffusion
  • rocket immunoeletrophoresis immunohistochemical staining
  • immunoprecipitation assay complement fixation assay
  • immunofluorescence immunochromatography
  • FACS fluorescence activated cell sorter analysis
  • the method for measuring the expression level of the mRNA or gene may be reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNase protection method, Northern blotting, DNA chip technology, or biosensor.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • competitive RT-PCR real-time quantitative RT-PCR
  • quantitative RT-PCR quantitative RT-PCR
  • RNase protection method Northern blotting
  • DNA chip technology DNA chip technology
  • biosensor biosensor
  • agent capable of measuring expression level means a molecule that can be used to determine the expression level of a specific protein or a gene encoding the same, and may specifically include, but is not limited to, an agent capable of detecting and/or amplifying the protein or the gene.
  • agent capable of detecting a specific protein or a gene encoding the same means an agent capable of specifically binding to and recognizing the specific gene or protein, or detecting and amplifying the same
  • agent capable of amplifying a specific gene or protein means an agent capable of increasing the number of copies of the specific gene or protein by repeating the replication thereof, and may refer to, for example, a primer capable of specifically amplifying a polynucleotide including the gene, or a probe capable of specifically binding, but is not limited thereto.
  • the diagnostic composition may comprise a primer, probe, nucleotide, antibody, antibody fragment or antigen-binding fragment thereof, ligand, receptor, protein or a combination thereof that specifically binds to the USP10 protein, a fragment thereof or an mRNA or gene encoding the same.
  • kits for diagnosing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease comprising the composition for diagnosing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease.
  • the same parts described above also apply to the kit.
  • the above kit can diagnose liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases by detecting the expression of USP10 protein, a fragment thereof, or mRNA or gene encoding the same or measuring the expression level.
  • the kit may include primers, probes or optionally antibodies recognizing a marker or fragment thereof retaining antigen binding ability for detecting the expression or measuring the expression level of the USP10 protein, fragments thereof or mRNA or gene encoding the same, as well as one or more other component compositions or devices suitable for the measurement or analysis method.
  • a kit for diagnosing liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases for detecting or measuring the expression level of a polynucleotide or gene may include one or more oligonucleotides that specifically bind to a polynucleotide or gene encoding the USP10 protein or a fragment thereof, and may include a primer corresponding to the gene or a partial sequence thereof, a reverse transcriptase enzyme, a Taq polymerase, a PCR primer, and dNTP, and a kit using a measurement method described in relation to the expression level of the mRNA or gene may be used to measure the expression level of the polynucleotide.
  • kits for diagnosing liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases for detecting or measuring the expression level of a polypeptide or protein may include an antibody or antibody fragment that specifically binds to the USP10 protein or a fragment thereof, and a kit using a measurement method described in relation to the expression level of the protein may be used to measure the expression level of the polypeptide.
  • Another aspect provides a method for providing information for diagnosing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, comprising a step of measuring the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same from a biological sample isolated from an individual.
  • a method for providing information for diagnosing liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease comprising a step of measuring the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same from a biological sample isolated from an individual.
  • the same portions described above also apply to the method.
  • subject in this specification means any living organism that has developed or is likely to develop liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, and may include, but is not limited to, mammals including dogs, cats, mice, rats, monkeys, cows, pigs, mini-pigs, livestock, humans, farmed fish, etc.
  • sample in this specification refers to a material derived from the individual, and specifically may include, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, urine, etc.
  • gene and/or protein samples may be obtained from these samples, and the gene sample may include nucleic acids, for example, DNA, mRNA, or cDNA synthesized from mRNA, etc., and the type thereof is not limited thereto, as long as the expression level of a specific gene/protein can be confirmed therefrom.
  • the method may further include a step of measuring the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same from a biological sample isolated from a control group; and a step of comparing the expression levels of the subject and the control group.
  • control group in this specification may mean a normal individual who has not developed liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease, a non-liver fibrosis patient group, a non-patient group, etc.
  • the method may further include a step of determining that the subject has developed liver fibrosis or a liver fibrosis-related disease or predicting a high risk of developing the disease, if the expression level of the USP10 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same in the subject is higher than that of the control group.
  • Another aspect provides a use for the prevention or treatment of liver fibrosis or liver fibrosis-related diseases using a USP10 inhibitor or a composition containing the same as an active ingredient.
  • a USP10 inhibitor or a composition containing the same as an active ingredient The same portions described above also apply to the above use.
  • Another aspect provides the use of the USP10 inhibitor or a composition comprising the same in the manufacture of a medicament for preventing or treating liver fibrosis or a disease related to liver fibrosis.
  • the same portions described above also apply to the above use.
  • compositions comprising the USP10 inhibitor of the present invention suppresses the activity and/or expression levels of collagen and fibronectin associated with liver fibrosis, and thus the composition can be used to enhance the therapeutic effect of liver fibrosis and/or diseases associated with liver fibrosis.
  • Figure 1 is a diagram showing the expression levels of USP10 and a-SMA according to treatment with USP10 siRNA.
  • Figure 2 is a drawing showing the results of confirming the effect of suppressing the expression level of USP10 according to treatment with spautin-1.
  • Figure 3 is a drawing showing the results of confirming the effect of suppressing the expression level of COL1A or fibronectin according to spautin-1 treatment.
  • Figure 4 is a diagram showing the level of body weight change after administering spautin-1 to a NASH animal model.
  • Figure 5 is a diagram showing the level of change in liver weight after administering spautin-1 to a NASH animal model.
  • Figure 6 is a drawing showing the level of hepatic steatosis and collagen expression by staining the liver after administering spautin-1 to a NASH animal model.
  • Example 1 Evaluation of the level of inhibition of liver fibrosis according to inhibition of USP10 expression or activity.
  • LX2 hepatic fibroblast cells were cultured in DMEM (Welgene, Korea) supplemented with 2% FBS (Corning, NY, USA) and 1% antibiotics (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) at 37°C and 5% CO2 .
  • human USP10 siRNA 25 nM was treated using Lipofectamine RNAimax (Invitrogen), and after 48 h, the medium was replaced, starvation was induced with serum-free medium for 2 h, and then the cells were stimulated with 20 ng/ml TGF- ⁇ 1 (PeproTech, Rehovot, Israel). The cells were collected 48 h after treatment.
  • real-time PCR reactions were performed using SYBR Premix Ex Taq (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA) equipped with ABI equipment (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA), and all results were normalized using ⁇ -actin.
  • LX-2 cells which are hepatic fibroblasts, were treated with TGF- ⁇ to induce hepatic fibrosis, and then cultured with 20 uM of spautin-1. Thereafter, the expression level of USP10 in the cells was confirmed by the method described in Example 1.
  • Example 3 Confirmation of the anti-hepatic fibrosis activity of spautin-1.
  • collagen 1 (COL1A) and fibronectin are known to be proteins secreted from hepatic fibroblasts and induce fibrosis in liver tissue. Therefore, we aimed to confirm the anti-hepatic fibrosis efficacy through the expression/activity levels of COL1A and fibronectin.
  • LX-2 cells which are hepatic fibroblasts, were treated with TGF- ⁇ to induce hepatic fibrosis, and then cultured with 20 uM spautin-1. Thereafter, the expression levels of COL1A and fibronectin in the cells were confirmed by the method described in Example 1.
  • spautin-1 a USP10 inhibitor
  • Example 4 Confirmation of the therapeutic efficacy of spautin-1 in liver fibrosis-related diseases.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • mice 13-week-old male C57BL/6 mice were fed a Methionine and Choline Deficient L-Amino Acid Diet for 8 weeks.
  • the mice were maintained under a specific pathogen free (SPF) 12-h light/dark cycle, and the body weights of the mice were measured at the end of each time point and finally sacrificed under anesthesia.
  • SPF pathogen free
  • spautin-1 was dissolved in DMSO, polyethylene glycol, and distilled water, and the vehicle or spautin-1 (50 mg/kg) was administered to the NASH animal model.
  • the body weight of the NASH animal model administered with the above-mentioned spautin-1 was checked, and it was confirmed that there was no difference in the body weight between the vehicle-administered group and the spautin-1-administered group (Fig. 4).
  • the weight of the liver extracted from the animal model administered with the above-mentioned spautin-1 was compared, and it was confirmed that the liver weight of the animal model administered with spautin-1 was significantly lower (Fig. 5).
  • H&E and Sirius red staining were performed on the livers extracted from the animal model administered with the above-mentioned spautin-1.
  • the mouse livers were isolated under anesthesia and fixed in cold 4% paraformaldehyde for 24 hours. After fixation, the liver tissues were embedded in paraffin, sectioned at 4 ⁇ m thickness, and stained with H&E for morphological analysis.
  • the deparaffinized liver sections were soaked in Picro Sirius Red solution for 2 hours at room temperature using the Picro Sirius Red Stain Kit (Abcam, Cambridge, UK), washed twice with 5% acidified water, and then washed twice with absolute alcohol. After staining, the sections were mounted using a hydrophilic mounting solution and analyzed using a microscope.
  • spautin-1 a USP10 inhibitor

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Abstract

본 발명은 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 간섬유화와 관련된 콜라겐 및 피브로넥틴의 활성 및/또는 발현 수준을 억제하는 것을 확인하였는 바, 상기 조성물을 이용하여 간섬유증 및/또는 간섬유증과 관련된 질병의 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

Description

USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간 조직이 손상되어 염증반응이 일어났을 때, 간 조직의 상처를 치유하기 위해 간성상세포가 활성화되어 다량 분비된 교원질(collagen)과 세포 외기질 (extracellularmatrix, ECM)이 결합하는 과정이 진행된다. 그러나, 염증 반응이 만성적으로 진행되어 이러한 간 조직의 상처 치유과정이 과도하게 나타나면 간 섬유화 현상(liver fibrogenesis)이 나타나게 된다. 간섬유화가 지속적으로 진행되면, 간 조직 내의 교원질이 다량으로 침착되고, 재생 결정이 상기 교원질로 둘러싸여 간 조직이 비정상적인 구조를 나타내는, 간경변증으로 발달할 수 있다.
간섬유증은 간 조직의 만성적인 염증 반응에 의해 나타나며, 이러한 염증 반응의 원인은 바이러스 감염에 의한 간염, 알코올 섭취, 약물 남용, 자가면역질환, 대사질환장애, 담즙분비 정체증 및 이외 원인에 의한 간염 등으로 알려져 있다. 특히, B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus) 등의 감염에 의한 바이러스성 간염 외에도, 비-알코올성 간질환 또는 대사성 질환을 주 원인으로 하는 비-바이러스성 간염의 발병 빈도가 증가하고 있어, 이러한 비-비이러스성　간섬유증의 환자비율 및 사망률 역시 증가하고 있다.
간섬유증이 간경변증으로 진행되면, 간 조직의 정상적인 복원이 어려운 비가역적인 만성 질환으로 나타나며, 이에 따라 비대상성 간경변증 또는 간암으로 진행되어 이에 따른 사망률이 계속적으로 증가되는 추세이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 간섬유증 및 비알코올성 지방간염 등 간섬유증과 관련된 질환을 효과적으로 치료하라 수 있는 화합물을 발견하였으며, 이의 우수한 치료 또는 예방 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 양상은 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 1) USP10을 발현하는 시험관 내 모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및 2) 상기 모델의 USP10 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계를 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 진단용 조성물을 제공한다.
일 양상은 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서의 용어 "USP (Ubiquitin-specific protease)"는 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB) 중 하나로서, 탈유비퀴틴화 반응에 관여하는 효소이다.
상기 USP10 억제제는 USP10의 발현 및/또는 활성을 억제하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "USP10의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제" 또는 "USP10의 발현 또는 활성 억제제"란, USP10을 코딩하는 유전자, mRNA 또는 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합하여 USP10의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 USP10의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 USP10 저해제 또는 USP10 억제제와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
상기 USP10의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, USP10의 발현을 억제할 수 있는 제제는 USP10을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 USP10의 활성을 억제할 수 있는 제제는 USP10의 단백질에 상보적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 소분자 화합물(small molecules) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "miRNA, siRNA 또는 shRNA"란, RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다 상기 siRNA 또는 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있으며, 본 명세서에서의 목적상, USP10의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 USP10 억제제는 siRNA일 수 있고, 상기 siRNA는 서열번호 1 내지 2로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1 및 2로 구성된 한 쌍의 서열일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는데, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 효과를 나타내며, 본 명세서에서의 목적상, USP10의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 항체는 활성화된 USP10 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다. 구체적인 예로, USP10에 특이적으로 결합될 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 상기 항체에 포함되고, 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태가 될 수도 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "앱타머(aptamer)"란 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 앱타머는 활성화된 USP10 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.
본 명세서의 용어 "소분자 화합물(small molecules)"이란, 분자량이 작은 유기 화합물로, 단백질 등의 생체 고분자에 결합하여 그 기능을 조절하는 분자를 의미한다. 천연유래이거나 인공적으로 합성될 수 있으며, 단백질의 기능을 저해하거나 단백질-단백질 상호작용을 방해할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서의 목적상, 상기 소분자 화합물은 활성화된 USP10 단백질의 활성을 억제하는 분자라면 제한 없이 포함하며, 구체적인 예로 활성화된 USP10에 결합하여 활성을 억제하는 분자를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 USP10 억제제는 스파우틴-1(Spautin-1), USP10-IN-3, USP10-IN-9, Wu-5, P22077, HBX19818 및 Quercetin로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 USP10 억제제는 스파우틴-1을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어, "스파우틴-1 (Spautin-1)"은 하기 화학식 1(IUPAC name: 6-Fluoro-N-[(4-fluorophenyl)methyl]-4-quinazolinamine 또는 6-Fluoro-N-(4-fluorobenzyl)quinazolin-4-amine) (CAS Number: 1262888-28-7)로 표시되는 화합물로서, C15H11F2N3의 화학식으로 표현된다.
[화학식 1]
일 구현예에 있어서, 상기 스파우틴-1 또는 이를 포함하는 조성물은 USP10의 활성 및/또는 발현 수준을 억제할 수 있다.
본 명세서에서의 용어, "USP10-IN-3"은 하기 화학식 2(IUPAC name: 9-chloro-N-(3-(dipropylamino)propyl)-5, 6, 7, 8-tetrahydroacridine-3-carboxamide) (CAS Number: 904448-58-4)로 표시되는 화합물로서, C23H32ClN3O의 화학식으로 표현된다.
[화학식 2]
본 명세서에서의 용어, "USP10-IN-9"는 하기 화학식 3(IUPAC name: N-(3-(benzyl(ethyl)amino)propyl)-9-chloro-2, 3-dihydro-1H-cyclopenta[b]quinoline-6-carboxamide) (CAS Number: 902281-60-1)로 표시되는 화합물로서, C25H28ClN3O의 화학식으로 표현된다.
[화학식 3]
본 명세서에서의 용어, "Wu-5"은 하기 화학식 4(IUPAC name: Ethyl 5-(4-(methoxycarbonyl)phenoxy)-4-nitrothiophene-2-carboxylate) (CAS Number: 2630378-05-9)로 표시되는 화합물로서, C15H13NO7S의 화학식으로 표현된다.
[화학식 4]
본 명세서에서의 용어, "P22077"은 하기 화학식 5(IUPAC name: 1-(5-(2,4-Difluorophenylthio)-4-nitrothiophen-2-yl)ethanone) (CAS Number: 1247819-59-5)로 표시되는 화합물로서, C12H7F2NO3S2의 화학식으로 표현된다.
[화학식 5]
본 명세서에서의 용어, "HBX19818"은 하기 화학식 6(IUPAC name: N-(3-(benzyl(methyl)amino)propyl)-9-chloro-5,6,7,8-tetrahydroacridine-2-carboxamide) (CAS Number: 1426944-49-1)로 표시되는 화합물로서, C25H28ClN3O의 화학식으로 표현된다.
[화학식 6]
본 명세서에서의 용어, "Quercetin"은 하기 화학식 7(IUPAC name: 3,3`,4`,5,7-Pentahydroxyflavone) (CAS Number: 117-39-5)로 표시되는 화합물로서, C15H10O7의 화학식으로 표현된다.
[화학식 7]
상기 조성물은 상기 USP10 억제제로서 USP10 억제 활성을 갖는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 및 이의 용매화물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 상기 조성물은 상기 화학식 1로 표현되는 스파우틴-1 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 및 이의 용매화물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다. 특히 바람직한 염으로는, 화합물이 그 내에 산성관능기를 가지는 경우, 알칼리 금속염 (예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염 (예컨대, 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등) 등과 같은 무기염, 및 암모늄염과 같은 유기 염이 있으며, 화합물이 그 내에 염기성 관능기를 가지는 경우, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과 같은 무기산과의 염, 아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등과 같은 유기산과의 염이 있다.
본 명세서에서의 용어 "간섬유증 (liver fibrosis)"또는 "간섬유화 (liver fibrogenesis)"는 조직의 손상으로 인해 염증반응이 계속 진행됨에 따라 활성 간성상세포 (hepatic stellate cell)에서 다량 분비된 교원질 (collagen)과 세포외기질 (extracellularmatrix, ECM)이 결합함으로써 나타나는 상처치유의 과정을 지칭한다. 간섬유화가 지속적으로 진행되면 간 조직 내 교원질이 다량 침착되고, 재생결절이 교원질로 둘러싸여 비정상적인 구조를 지니게 되는 간경화 등으로 발달할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "간섬유증 관련 질환"은 간 조직이 섬유화가 진행됨에 따라 발병할 수 있는 질병 및/또는 간섬유증의 원인이 되는 질병을 의미하는 것일 수 있다. 상기 간염유증 관련 질환은 간섬유증, 간섬유화, 알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간염, 간경변, 간경화 및 간부전으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 간경화는 문맥성 간경화, 괴사후성 간경화, 담즙성 간경화, 영양성 간경화, 알코올성 간경화, 바이러스 간염성 간경화, 담즙정체성 간경화 및 심장성 간경화으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 USP10 억제제(구체적으로, 스파우틴-1)를 포함하는 조성물은 간의 섬유화 유도, 진행 등을 억제하거나, 이미 진행된 섬유화를 감소 또는 억제하는 것일 수 있다.
상기 USP10 억제제(구체적으로, 스파우틴-1)를 포함하는 조성물은 간섬유화 마커의 활성 및/또는 발현 수준을 억제하는 것일 수 있다. 상기 간섬유화 마커는 콜라겐 1(Collagen 1), 피브로넥틴(Fibronectin) 및 α-SMA (Alpha Smooth Muscle Actin)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "치료"는, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서의 용어 "예방"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.
상기 조성물은 상기 USP10 억제제를 0.1 내지 100 μM의 농도로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 0.1 내지 100 μM, 0.1 내지 80 μM, 0.1 내지 60 μM, 0.1 내지 40 μM, 0.1 내지 20 μM, 0.1 내지 15 μM, 0.1 내지 10 μM, 0.1 내지 8 μM, 0.1 내지 6 μM, 0.1 내지 5 μM, 0.5 내지 100 μM, 0.5 내지 80 μM, 0.5 내지 60 μM, 0.5 내지 40 μM, 0.5 내지 20 μM, 0.5 내지 15 μM, 0.5 내지 10 μM, 0.5 내지 8 μM, 0.5 내지 6 μM, 0.5 내지 5 μM, 1 내지 100 μM, 1 내지 80 μM, 1 내지 60 μM, 1 내지 40 μM, 1 내지 20 μM, 1 내지 15 μM, 1 내지 10 μM, 1 내지 8 μM, 1 내지 6 μM, 1 내지 5 μM. 2 내지 100 μM, 2 내지 80 μM, 2 내지 60 μM, 2 내지 40 μM, 2 내지 20 μM, 2 내지 15 μM, 2 내지 10 μM, 2 내지 8 μM, 2 내지 6 μM, 2 내지 5 μM, 2.5 내지 100 μM, 2.5 내지 80 μM, 2.5 내지 60 μM, 2.5 내지 40 μM, 2.5 내지 20 μM, 2.5 내지 15 μM, 2.5 내지 10 μM, 2.5 내지 8 μM, 2.5 내지 6 μM, 2.5 내지 5 μM, 4 내지 100 μM, 4 내지 80 μM, 4 내지 60 μM, 4 내지 40 μM, 4 내지 20 μM, 4 내지 15 μM, 4 내지 10 μM, 4 내지 8 μM, 4 내지 6 μM, 4 내지 5 μM, 5 내지 100 μM, 5 내지 80 μM, 5 내지 60 μM, 5 내지 40 μM, 5 내지 20 μM, 5 내지 15 μM, 5 내지 10 μM, 5 내지 8 μM, 5 내지 6 μM, 6 내지 100 μM, 6 내지 80 μM, 6 내지 60 μM, 6 내지 40 μM, 6 내지 20 μM, 6 내지 15 μM, 6 내지 10 μM, 6 내지 8 μM, 7 내지 100 μM, 7 내지 80 μM, 7 내지 60 μM, 7 내지 40 μM, 7 내지 20 μM, 7 내지 15 μM, 7 내지 10 μM, 7 내지 8 μM, 7.5 내지 100 μM, 7.5 내지 80 μM, 7.5 내지 60 μM, 7.5 내지 40 μM, 7.5 내지 20 μM, 7.5 내지 15 μM, 7.5 내지 10 μM 또는 7.5 내지 8 μM의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 공지된 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 레스메티롬 (Resmetirom), 라니피브라노 (lanifibranor), 세미글루티드 (semaglutide) 및 에프룩시페르민 (Efruxifermin)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 USP10 억제제 또는 이를 포함하는 조성물은 공지된 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제와 병용투여될 수 있으며, 구체적으로 동시에 투여되거나 및/또는 순차적으로 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 약학적 조성물에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 락토스, 덱스트로스, 말토 덱스트린, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 글리세롤, 에탄올, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 추가하여 조제될 수 있다.
상기 약학 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
상기 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환이 발병되거나 발병할 위험이 있는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류, 파충류, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있으며, 상기 개체는 인간을 제외하는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다. 상기 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 약학 조성물의 유효성분이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 공지된 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제를 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 레스메티롬 (Resmetirom), 라니피브라노 (lanifibranor), 세미글루티드 (semaglutide) 및 에프룩시페르민 (Efruxifermin) 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 USP10 억제제 또는 이를 포함하는 조성물과 공지된 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제를 병용투여하는 단계를 포함하는 것으로서, 구체적으로 상기 USP10 억제제 또는 이를 포함하는 조성물과 공지된 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제는 동시에 투여되거나 및/또는 순차적으로 투여될 수 있다.
또 다른 양상은 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "개선"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 상기 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품 조성물은 골 관련 질환의 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다. 구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제 (소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제 (표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제 (부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제 (타르색소 등), 발색제 (아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제 (아황산나트륨), 조미료 (MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료 (둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료 (바닐린, 락톤류 등), 팽창제 (명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물 (food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ~ 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 식품 조성물은 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 개선 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다면 본 발명의 화합물을 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 화합물을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 사료 조성물은 제제에 따라 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 개선 또는 예방을 위해 첨가 가능한 공지의 첨가물을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 고농축액, 분말 또는 과립 형태일 수 있다. 상기 사료 조성물은 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 동물 사료에 침지, 분무, 또는 혼합으로 첨가하여 사용될 수 있다.
상기 사료 조성물은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 사료 조성물은 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료 및 음용수에 적용할 수 있다.
상기 사료 조성물은 사료에 첨가되는 물질 (즉, 사료 첨가제), 사료 원료 또는 개체에 급여되는 사료 자체를 모두 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 1) USP10을 발현하는 시험관 내 모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및 2) 상기 모델 또는 이로부터 수득한 시료의 USP10 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계를 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
상기 USP10을 발현하는 시험관 내 모델은 USP10을 발현하는 조직, 기관, 또는 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, USP10을 발현하는 지방세포(adipocyte)일 수 있다.
상기 시료는 상기 USP10을 발현하는 시험관 내 모델로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변, 세포 배양액 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이들 시료로부터 유전자 및/또는 단백질 시료를 얻을 수 있으며, 유전자 시료는 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA 등을 포함할 수 있으며, 이로부터 특정 유전자/단백질의 발현 수준을 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 후보물질은 USP10의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 항체, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 USP10 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계는 USP10의 mRNA 및/또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 USP10의 mRNA 발현 수준은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR (Quantitative or semi-Quantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR (Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 노던 블롯 (northern blot), 및 DNA 또는 RNA 칩 (chip)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있다.
상기 USP10의 단백질 발현 수준은 조직면역염색법, 효소면역분석법 (ELISA) 및 면역블롯 (Western Blot)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있다.
상기 방법은 3) 상기 후보물질 처리에 따라 USP10의 발현 또는 활성 수준이 감소되는 경우, 상기 후보물질을 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 후보물질 처리에 따라 USP10의 발현 또는 활성 수준이 감소되는 것은 USP10의 발현 또는 활성 수준이 후보물질 무처리 대조군에 비해 감소된 것을 의미하는 것일 수 있으며, 구체적으로 대조군에 비하여 활성 또는 발현량이 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태, 더욱 구체적으로는 60% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.
또 다른 양상은 USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 진단용 조성물을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 조성물은 USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출 또는 측정함으로서 특정 개체의 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환을 진단하거나 및/또는 예후를 예측할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단이란 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 발병 여부를 판별하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "예후"는 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명의 목적상, 예후란 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 치료 후 해당 개체에서 치료 성공 여부, 생존, 재발, 전이, 약물반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 즉, 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.
본 명세서에서의 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적 상 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 재발, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "발현 수준의 측정"은 특정 단백질(펩타이드) 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 존재 여부, 발현 여부 또는 발현 정도를 측정하는 것으로서, 구체적으로 USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 mRNA 또는 유전자의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complenent Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS 분석법 (fluorescenceactivated cell sorter analysis), 단백질 칩 방법 (protein chip technology) 또는 바이오센서 (biosensor)인 것일 수 있다.
상기 mRNA 또는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 방법(DNA chip technology) 또는 바이오센서(biosensor)인 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "발현 수준을 측정할 수 있는 제제"는 특정 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 구체적으로 상기 단백질 또는 상기 유전자를 검출 및/또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "특정 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 검출할 수 있는 제제"는 상기 특정 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나, 검출하여 증폭시킬 수 있는 제제를 의미하고, "특정 유전자 또는 단백질을 증폭할 수 있는 제제"는 상기 특정 유전자 또는 단백질의 복제를 반복하여 그 수를 증가시킬 수 있는 제제를 의미하며, 예를 들어 상기 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 진단용 조성물은 USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 mRNA 또는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체, 항체 단편 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 단백질 또는 그 조합을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 진단용 조성물을 포함하는 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 키트에도 공히 적용된다.
상기 키트는 USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 mRNA 또는 유전자의 발현을 검출하거나 발현 수준을 측정함으로서 상기 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환을 진단할 수 있다.
상기 키트는 USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 mRNA 또는 유전자의 발현을 검출하거나 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체 또는 항원 결합능을 유지하는 이의 단편뿐만 아니라, 상기 측정 또는 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 검출 또는 발현 수준 측정을 위한 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 진단용 키트는 상기 USP10 단백질 또는 이의 단편을 암호하하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자에 특이적으로 결합하는 1 종 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 상기 유전자 또는 이의 일부 서열에 대응하는 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머 및 dNTP를 포함할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 발현 수준을 측정하기 위해 상기 mRNA 또는 유전자의 발현 수준과 관련하여 기술된 측정 방법을 이용한 키트를 이용할 수 있다.
또한, 폴리펩타이드 또는 단백질의 검출 또는 발현 수준 측정을 위한 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 진단용 키트는 상기 USP10 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있으며, 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정하기 위해 상기 단백질의 발현 수준과 관련하여 기술된 측정 방법을 이용한 키트를 이용할 수 있다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "개체"는 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적인 예로, 개, 고양이, 마우스, 래트, 원숭이, 소, 돼지, 미니돼지, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서의 용어 "시료"는 상기 개체로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이들 시료로부터 유전자 및/또는 단백질 시료를 얻을 수 있으며, 유전자 시료는 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA 등을 포함할 수 있으며, 이로부터 특정 유전자/단백질의 발현 수준을 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료로부터, USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 개체 및 상기 대조군의 발현 수준을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "대조군"은 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환이 발병되지 않은 일반 개체, 비-간섬유증 환자군, 비환자군 등을 의미하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 개체에서의 USP10 단백질, 이의 단편 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 상기 대조군보다 높은 경우, 상기 개체를 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환이 발병한 것으로 판별하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 USP10 억제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 용도에도 공히 적용된다.
또 다른 양상은 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서, 상기 USP10 억제제 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 용도에도 공히 적용된다.
본 발명의 USP10 억제제를 포함하는 조성물은 간섬유화와 관련된 콜라겐 및 피브로넥틴의 활성 및/또는 발현 수준을 억제하는 것을 확인하였는 바, 상기 조성물을 이용하여 간섬유증 및/또는 간섬유증과 관련된 질병의 치료 효과를 증진시킬 수 있다.
도 1은 USP10 siRNA의 처리에 따른 USP10 및 a-SMA의 발현 수준을 나타낸 도면이다.
도 2는 스파우틴-1 처리에 따른 USP10의 발현 수준 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 스파우틴-1 처리에 따른 COL1A 또는 피브로넥틴의 발현 수준 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 NASH 동물 모델에 스파우틴-1를 투여한 후 체중 변화 수준을 나타낸 도면이다.
도 5는 NASH 동물 모델에 스파우틴-1를 투여한 후 간의 무게 변화 수준을 나타낸 도면이다.
도 6은 NASH 동물 모델에 스파우틴-1를 투여한 후, 간을 염색하여 간 지방증 및 콜라겐 발현 수준을 나타낸 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: USP10 발현 또는 활성 억제에 따른 간섬유화 억제 수준 평가
USP10 발현 또는 활성 억제에 따른 간섬유화 억제 수준을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 간섬유세포인 LX2 세포를 2% FBS(Corning, NY, USA) 및 1% 항생제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 보충된 DMEM(Welgene, Korea)에서 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 다음으로, Lipofectamine RNAimax(Invitrogen)를 사용하여 인간 USP10 siRNA(25nM)를 처리하고, 48시간 후, 배지를 교체하고 무혈청 배지로 2시간 동안 기아상태를 유도한 후 20ng/ml TGF-β1(PeproTech, Rehovot, Israel)로 자극시킨 후, 처리 48시간 후에 상기 세포를 수집하였다. 다음으로, 수집된 세포에 RNA 용해 시약(Intron)을 처리하여 총 RNA를 수득하였으며, 정량적 RT-PCR 마스터 믹스(TOYOBO, 일본 오사카)를 사용하여 cDNA(1μg)를 합성하였다. 다음으로, ABI 장비(Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA)가 장착된 SYBR Premix Ex Taq(Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA)을 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였으며, 모든 결과는 β-액틴을 사용하여 정규화되었다.
한편, USP10 siRNA의 서열은 하기 표 1에 기재하였고, 실시간 PCR 반응을 위한 프라이버 서열은 표 2에 기재하였다.
USP10 siRNA 서열 (5`-3`) 서열번호
정방향 CCUGUGGACUUGGAAAUUATT 1
역방향 UAAUUUCCAAGUCCACAGGTT 2
프라이머 서열 (5`-3`) 서열번호
USP10 정방향 ATTGAGTTTGGTGTCGATGAAGT 3
역방향 ATTGAGTTTGGTGTCGATGAAGT 4
α-SMA 정방향 CTGGCATCGTGCTGGACTCT 5
역방향 GATCTCGGCCAGCCAGATC 6
그 결과, 먼저 상기 USP10 siRNA은 USP10의 발현 수준을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 다음으로, 간섬유세포에서 분비되어 간 조직에 섬유화를 유도하는 것으로 알려진 α-SMA (Alpha Smooth Muscle Actin)의 경우, TGF-β를 처리하여 간섬유화를 유도한 경우 발현 수준이 증가하였으며, USP10 siRNA 처리에 의해 현저히 감소되는 것을 확인하였다 (도 1).
상기 결과를 토대로, USP10의 발현 또는 활성을 억제할 경우, 간섬유화 관련 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 2: 스파우틴-1의 USP10 억제 활성 확인
USP10 억제제 중 하나인 스파우틴-1(Spautin-1)이 간섬유화 유도 조건에서 USP10을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 간섬유세포인 LX-2 세포에 TGF-β를 처리하여 간섬유화를 유도한 후, 20 uM의 스파우틴-1을 처리하여 배양하였다. 이 후 상기 세포의 USP10의 발현 수준을 실시예 1에 기재된 방법으로 확인하였다.
그 결과, TGF-β 처리에 의해 USP10의 발현 수준이 증가되는 것을 확인하였으며, 스파우틴-1을 처리할 경우에는 증가된 USP10의 발현 수준이 현저히 억제되어 대조군과 유사한 수준으로 낮아지는 것을 확인하였다 (도 2).
상기 결과를 토대로, 간섬유화 유도 조건에서 USP10의 발현 또는 활성 수준이 증가되며, USP10 억제제 중 하나인 스파우틴-1에 의해 상기 증가된 활성/발현이 억제될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 스파우틴-1의 간섬유화 억제 활성 확인
USP10 억제제 중 하나인 스파우틴-1(Spautin-1)이 간섬유화를 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
한편, 콜라겐 1(Collagen1, COL1A) 및 피브로넥틴(Fibronectin)은 간섬유세포에서 분비되어 간조직에서 섬유화가 진행되도록 유도하는 단백질로 알려져 있다. 따라서, 상기 COL1A 및 피브로넥틴의 발현/활성 수준을 통해 간섬유화 억제 효능을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 간섬유세포인 LX-2 세포에 TGF-β를 처리하여 간섬유화를 유도한 후, 20 uM의 스파우틴-1을 처리하여 배양하였다. 이 후 상기 세포의 COL1A 및 피브로넥틴의 발현 수준을 실시예 1에 기재된 방법으로 확인하였다.
그 결과, TGF-β 처리에 의해 COL1A 및 피브로넥틴의 발현 수준이 증가되는 것을 확인하였으며, 스파우틴-1을 처리할 경우에는 증가된 COL1A 및 피브로넥틴의 발현 수준이 현저히 억제되어 대조군과 유사한 수준으로 낮아지는 것을 확인하였다 (도 3).
상기 결과를 토대로, USP10 억제제인 스파우틴-1이 간섬유화를 효과적으로 치료 또는 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4: 스파우틴-1의 간섬유화 관련 질병 치료 효능 확인
USP10 억제제 중 하나인 스파우틴-1의 간섬유화 관련 질병 치료 효능을 평가하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 간섬유화 관련 질병 중 하나인 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 동물 모델을 확보하기 위해, 13주령 수컷 C57BL/6 마우스에 8주동안 메티오닌 및 콜린 결핍 L-아미노산 다이어트 (Methionine and Choline Deficient L Amino Acid Diet)를 식이하였다. 상기 마우스들은 SPF(specific pathogen free) 12시간 명암 주기 조건에서 유지하였으며, 각 시점이 끝날 때마다 마우스의 체중을 측정한 후 최종적으로는 마취하에 희생시켰다. 다음으로, 스파우틴-1을 DMSO, 폴리에틸렌글리콜 및 증류수에 용해시켰으며, 상기 NASH 동물모델에 비히클(vehicle) 또는 스파우틴-1(50 mg/kg)을 투여하였다.
한편, 상기 동물 연구는 연세대학교 보건의료기관 동물관리 및 이용위원회의 승인을 받았다(동물실험 허가번호: 2022-0339).
먼저, 상기 스파우틴-1이 투여된 NASH 동물 모델의 체중을 확인한 결과, 비히클 투여군과 스파우틴-1 투여군의 체중 차이는 나지 않는 것을 확인하였다 (도 4). 다음으로, 상기 스파우틴-1이 투여된 동물 모델에서 적출한 간의 무게를 비교한 결과, 스파우틴-1이 투여된 동물 모델의 경우 간 무게가 현저히 낮은 것을 확인하였다 (도 5).
다음으로, 상기 스파우틴-1이 투여된 동물 모델에서 적출한 간을 염색하여 간 지방증(Hepatic steatosis) 개선 정도 및 콜라겐 발현 수준을 확인하기 위해, H&E 염색 및 시리우스 레드(Sirius red) 염색을 수행하였다. 먼저, 마우스 간을 마취하에 분리하고 차가운 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 시켰다. 고정 후 간 조직을 파라핀에 포매하고 4 um 두께로 절편한 후 H&E로 염색하여 형태학적 분석을 실시하였다. 또한, 시리우스 레드 염색을 위해 파라핀 제거된 간 절편을 Picro Sirius Red Stain Kit(Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 Picro Sirius Red 용액에 실온에서 2시간 동안 담근 후 5% 산성수로 2회 세척한 후 무수알코올로 2회 세척하였다. 염색 후 친수성 장착 용액을 사용하여 섹션을 장착하고 현미경을 사용하여 분석되었다.
그 결과, 스파우틴-1이 투여된 동물 모델의 경우 간 지방증이 현저히 감소되었으며, 콜라겐 발현 수준(시리우스 레드 염색 - 적색 부분) 또한 현저히 감소된 것을 확인하였다 (도 6).
상기 결과를 토대로, USP10 억제제인 스파우틴-1은 간섬유화 관련 질병 중 하나인 비알콜올성 지방간염을 효과적으로 치료 또는 개선할 수 있음을 알 수 있으며, 이를 토대로 간섬유화 및 이와 관련된 질병 또한 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 USP10 억제제는 USP10 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 것인, 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 USP10 억제제는 스파우틴-1(Spautin-1), USP10-IN-3, USP10-IN-9, Wu-5, P22077, HBX19818 및 Quercetin로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐 1(Collagen 1) 및 피브로넥틴(Fibronectin)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 간의 섬유화를 억제하는 것인, 약학 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 간섬유증 관련 질환은 알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간염, 간경변, 간경화 및 간부전으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 레스메티롬 (Resmetirom), 라니피브라노 (lanifibranor), 세미글루티드 (semaglutide) 및 에프룩시페르민 (Efruxifermin) 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  8. USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. USP10 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  10. 1) USP10을 발현하는 시험관 내 모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    2) 상기 모델의 USP10 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계
    를 포함하는, 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제 스크리닝 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은
    3) 상기 후보물질 처리에 따라 USP10의 발현 또는 활성 수준이 감소되는 경우, 상기 후보물질을 간섬유증 또는 간섬유증 관련 질환 치료제로 판단하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
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