WO2026005647A2 - Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мрнк вектора - Google Patents

Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мрнк вектора

Info

Publication number
WO2026005647A2
WO2026005647A2 PCT/RU2025/000257 RU2025000257W WO2026005647A2 WO 2026005647 A2 WO2026005647 A2 WO 2026005647A2 RU 2025000257 W RU2025000257 W RU 2025000257W WO 2026005647 A2 WO2026005647 A2 WO 2026005647A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
reading frame
mrna
open reading
sequence seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/RU2025/000257
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2026005647A3 (ru
Inventor
Александр Леонидович ГИНЦБУРГ
Андрей Дмитриевич КАПРИН
Денис Юрьевич ЛОГУНОВ
Владимир Алексеевич ГУЩИН
Амир Ильдарович ТУХВАТУЛИН
Наталья Михайловна Тухватулина
Софья Рубеновна КОЗЛОВА
Наталия Петровна АНТОНОВА
Елена Владимировна ШИДЛОВСКАЯ
Бахтияр Исраил оглы ВЕРДИЕВ
Роман Алексеевич ИВАНОВ
Денис Александрович КЛЕЙМЕНОВ
Евгения Николаевна БЫКОНЯ
Елена Петровна МАЗУНИНА
Алина Шахмировна ДЖАРУЛЛАЕВА
Андрей Андреевич ПОЧТОВЫЙ
Андрей Эдуардович СИНЯВИН
Евгений Валерьевич УСАЧЕВ
Дарья Владимировна ВАСИНА
Надежда Анатольевна КУЗНЕЦОВА
Сергей Евгеньевич ДМИТРИЕВ
Игорь Андреевич ИВАНОВ
Ирина Леонидовна ТУТЫХИНА
Тимофей Андреевич РЕМИЗОВ
Анастасия Андреевна ЗАХАРОВА
Александр Сергеевич Семихин
Андрей Игоревич ГОСУДАРЕВ
Дмитрий Николаевич ЩЕРБИНИН
Елизавета Александровна ТОКАРСКАЯ
Надежда Леонидовна ЛУБЕНЕЦ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Federal State Budgetary Institution "national Research Center Of Epidemiology And Microbiology Named After Honorary Academician NF Gamalei" Of Ministry Of Health Of Russian Federation
Original Assignee
Federal State Budgetary Institution "national Research Center Of Epidemiology And Microbiology Named After Honorary Academician NF Gamalei" Of Ministry Of Health Of Russian Federation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2024118081A external-priority patent/RU2828631C1/ru
Application filed by Federal State Budgetary Institution "national Research Center Of Epidemiology And Microbiology Named After Honorary Academician NF Gamalei" Of Ministry Of Health Of Russian Federation filed Critical Federal State Budgetary Institution "national Research Center Of Epidemiology And Microbiology Named After Honorary Academician NF Gamalei" Of Ministry Of Health Of Russian Federation
Publication of WO2026005647A2 publication Critical patent/WO2026005647A2/ru
Publication of WO2026005647A3 publication Critical patent/WO2026005647A3/ru
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • An immunobiological agent for the treatment of oncological diseases based on an mRNA vector.
  • the invention relates to immunology and oncology.
  • the developed immunobiological agent can be used in the treatment of patients with cancer of various etiologies.
  • the proposed invention expands the arsenal of means and methods for inducing an immune response in cancer patients.
  • Cancer is one of the leading causes of death worldwide. According to the WHO, in 2022 there will be 20 million new cases of cancer and 9.7 million deaths from cancer worldwide. The number of people alive 5 years after diagnosis in 2022 was 53.5 million. According to these data, approximately one in five people will develop some kind of cancer during their lifetime; about 1 in 9 men and 1 in 12 women will die from this disease [“The Global Cancer Burden Is Growing Along with the Rising Need for Services.” World Health Organization, World Health Organization, www.who.int/ru/news/item/01-02-2024-global-cancer-burden-growing— amidst-mounting-need-for-services. Accessed: 18 June 2024].
  • Cancer development involves the progressive transformation of normal cells into malignant ones, which is the result of genetic and epigenetic changes occurring within the cells.
  • tumor cells can be eliminated by effector cells of the immune system.
  • immune selection tumor immunoediting
  • soluble factors secreted by tumor cells can create a tumor-like environment. the microenvironment provides favorable conditions for evading the effects of the immune system.
  • Tumor cells are known to suppress the targeted immune response using various defense mechanisms. Some of these are associated with the activation of a system of inhibitory mechanisms (immune checkpoints), which transmit an inhibitory signal to cytotoxic T lymphocytes, thereby suppressing immunological reactivity in the initial, inductive phase of the immune response. As a result, T lymphocyte activation is blocked, leading to the predominance of T regulatory cells in the tumor microenvironment and the development of immune tolerance and anergy [Shubnikova E.V., Bukatina T.M., Velts N.Yu., Kaperko D.A., Kutekhova G.V. Immune checkpoint inhibitors: new risks of a new class of antitumor agents // Safety and Risk of Pharmacotherapy, 2020, No. 1, pp. 9-20].
  • inhibitory mechanisms immunological reactivity in the initial, inductive phase of the immune response.
  • immune checkpoint inhibitors have revolutionized oncoimmunology.
  • a whole class of drugs consisting of humanized monoclonal antibodies that inhibit immune checkpoints, has now been developed.
  • This class of drugs has significantly improved patient survival and has become a major breakthrough in anticancer therapy.
  • four immune checkpoint inhibitors are registered in Russia: ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab, and atezolizumab.
  • this field is actively developing, and new targets are being sought.
  • this class of drugs cannot address a number of issues related to low immunogenicity and insufficient presentation of tumor antigens. As a result, some tumor cells are able to evade the immune response.
  • Dendritic cell (DC)-based vaccines are dendritic cells (DC) act as antigen-presenting cells in the human immune system. In this type of vaccine, DC enhance the presentation of tumor antigens to lymphocytes. After activating naive lymphocytes, they become capable of destroying tumor cells presenting these antigens [Bozhenko V.K. Antitumor vaccines. Bulletin of the Russian Scientific Center of Roentgenology and Radiology of the Ministry of Health of the Russian Federation 2022, No. 1, Vol. 22]. Anticancer vaccines of this type typically include DC isolated from patients or generated ex vivo by culturing the patient's hematopoietic progenitor cells or monocytes.
  • DCs are further loaded with tumor antigens and sometimes combined with immunostimulatory agents such as GM-CSF.
  • immunostimulatory agents such as GM-CSF.
  • Another class of cancer vaccines is based on modified (e.g., irradiated with sublethal doses) tumor cells used as antigens, also in combination with immunostimulatory agents.
  • Vaccines of this type are based on both autologous (e.g., OncoVAX, LipoNova) and allogeneic (e.g., Canvaxin, Onyvax-P, GV AX) tumor cell lines.
  • autologous e.g., OncoVAX, LipoNova
  • allogeneic e.g., Canvaxin, Onyvax-P, GV AX
  • the use of these vaccination methods allows for the production of a reproducible, safe vaccine product in which the injected tumor cells cannot proliferate. Irradiated tumor cells naturally express numerous specific antigens, thus facilitating the initiation of an antitumor immune response.
  • whole-cell vaccines can be modified to enhance immunogenicity by transfecting immunostimulatory molecules.
  • the GVAX vaccine platform involves the use of irradiated allogeneic tumor cell lines modified to secrete GM-CSF to enhance the immunogenicity of the vaccine.
  • irradiated cells when cells are irradiated, phosphatidyl serine, an immunosuppressive phospholipid normally found on the inner leaflet of the plasma membrane, is translocated from the inner side of the plasma membrane to its outer side, which in turn leads to the secretion of immunosuppressive factors by dendritic cells and inhibits their maturation, promoting an immunosuppressive environment for the tumor.
  • irradiated cells may retain the ability to secrete immunosuppressive factors similar to the original tumor cells.
  • radiation-induced suppression immunity partially negates the immunogenic effect of irradiated whole cells [Srivatsan S, Patel JM, Bozeman EN, Imasuen IE, He S, Daniels D, Selvaraj P.
  • the next class of therapeutic antitumor vaccines is based on peptide fragments of antigens selectively expressed by tumor cells.
  • the peptides are administered alone or in combination with immunostimulatory agents, which may include adjuvants and cytokines such as granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).
  • immunostimulatory agents such as granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • Peptides loaded into MHC class I are recognized by specific TCRs on CD8+ T cells, which are activated to exert their cytotoxic activity against tumor cells presenting the same peptide-MHC-I complex. This process is defined as active immunotherapy, as the host immune system is either activated de novo or restimulated to trigger an effective tumor-specific immune response, which can ultimately lead to tumor regression.
  • the objective of the present invention is to expand the arsenal of means for the treatment of oncological diseases.
  • the technical result consists in the development of a means that allows for the effective induction of an immune response against tumor cells.
  • an immunobiological agent for the therapy of oncological diseases has been created based on an mRNA vector, in which the mRNA contains the sequence SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:8 at the 5'end; an open frame reads encoding from 1 to 80 tumor gene signatures; sequence SEQ ID N0:6 or SEQ ID N0:7 at the 3' end.
  • the technical result consists in the development of a method for producing an immunobiological agent, comprising the following stages: a) identifying gene signatures of tumor cells; b) synthesizing a set of DNA matrices, each of which contains an open reading frame encoding 1 to 80 detected gene signatures; c) synthesizing a set of mRNA based on the obtained set of DNA matrices;
  • the developed immunobiological agent can be used to induce an immune response to tumor cells that contain gene signatures included in the mRNA vector.
  • Fig. 1 shows the results of in vivo bioluminescence measurements using the IVIS Imaging System (Perkin Elmer, USA).
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:1 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:2 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:3 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:4 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:5 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:8 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame 7. mRNA that has the sequence SEQ ID N0:1 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:2 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:3 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:4 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:5 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:8 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • Fig. 2 shows the results of measuring the tumor volume in animals that were administered a phosphate-buffered solution and the studied mRNA preparations.
  • the ordinate axis shows the tumor volume, mm 3 .
  • mice that were injected with phosphate-buffered saline
  • mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID N0:12;
  • mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID N0:17;
  • mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the 3 identified gene signatures of SEQ ID N0:20.
  • Fig. 3 shows the results of measuring the tumor volume in animals that were administered a phosphate-buffered solution and the studied mRNA preparations.
  • the ordinate axis shows the tumor volume, mm 3 .
  • the abscissa axis shows different groups of animals, where
  • Fig. 4 shows the results of determining the cellular composition of the tumor microenvironment
  • mice 1 - intact mice (no drug was administered), 2 - the drug under study.
  • tumor cells adapt by acquiring mutations and altering the levels of rare proteins essential, for example, for cell survival. This can lead to changes in the molecular signatures of antigens present on tumor cells, which the immune system can recognize. Tracking these changes can reveal new targets for therapeutic agents. However, each malignancy has its own unique characteristics. Therefore, the genetic signatures of tumor cells can vary significantly between patients, even with the same tumor location.
  • the developed method for producing an immunobiological agent involves sequencing DNA isolated from a patient's tumor cells, which results in the creation of a mutaname—a collection of somatic cancer mutations in a specific tumor.
  • a unique algorithm is used to identify gene signatures specific to a patient's tumor cells (i.e., specific changes in gene expression characteristic of a given patient's tumor cells).
  • the ultimate goal of identifying gene signatures is to identify highly immunogenic antigens strictly specific to tumor cells.
  • a set of DNA matrices containing an open reading frame encoding the identified gene signatures is then created.
  • a single DNA matrix contains an open reading frame encoding a single identified gene signature.
  • a single DNA matrix contains an open reading frame encoding between 2 and 80 identified gene signatures.
  • the maximum number of gene signatures in a single DNA template (80) is determined by the maximum capacity of the genetic construct. This number also depends on how many specific gene signatures were detected in a particular patient's tumor.
  • the DNA template contains all the building blocks for the transcription of functional mRNA, as well as the elements necessary for plasmid growth in bacterial cell culture.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:2 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame mRNA that has the sequence SEQ ID N0:3 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:4 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:8 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:6 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:1 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:3 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • Example 5 demonstrates that all of the listed mRNA constructs are capable of providing mRNA translation and target protein synthesis.
  • the above-mentioned mRNAs were created, containing various constructs at the 5' (SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:8) and 3' ends (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7), with an open reading frame encoding luciferase.
  • SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:8) and 3' ends (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7) with an open reading frame encoding luciferase.
  • mRNAs obtained by in vitro transcription using the developed DNA templates were subsequently packaged into lipid nanoparticles and administered into mammals.
  • Translation of mRNA containing an open reading frame encoding gene signatures specific to tumor cells has been shown to facilitate immune system recognition of tumor antigens.
  • the immune system effectively targets and destroys tumor cells. This effect has been shown to correlate with changes in the tumor microenvironment.
  • the invention is supported by the following examples.
  • Example 1 Identification of differences in the gene signatures of tumor and normal cells.
  • the search for genetic signatures of tumor and normal cells is based on obtaining genetic data characterizing the complete genome and/or exome (for normal and tumor cells) and transcriptome (for tumor cells). Nucleic acid extraction from samples and sequencing are performed using available commercial kits according to the manufacturer's instructions. The obtained data are analyzed using proprietary software that enables genomic data quality control, filtering and removal of low-quality sequencing data, mapping to a reference sequence, identifying germline and somatic mutations, searching for specific antigens, including bioinformatic prediction of peptide binding to major histocompatibility complex (MHC) molecules that can be presented on the cell surface and recognized by T cells, as well as assessing immunogenicity and a number of other parameters.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the number of selected gene signatures can vary from a few to two hundred. These can be represented in the genetic construct as a single variant (one construct, one gene signature) or combined into a concatemer (several identified gene signatures arranged sequentially).
  • a mouse melanoma model was used to demonstrate the feasibility of the approach.
  • this example of using a bioinformatics algorithm to select gene signatures characteristic of tumor cells is universal and can be applied to different tumor types and different mammalian species, including humans.
  • mice female, 6-8 weeks old, average weight 20 g were used in the experiment. All animal studies were conducted in accordance with ethical standards.
  • Syngeneic murine melanoma B16-F10 cells were obtained from the collection of the Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology of the Russian Ministry of Health. The cells were cultured in DMEM (Gibco, USA) supplemented with 10% FBS (Gibco, USA), 100 U/ml penicillin and 100 ⁇ g/ml streptomycin (Gibco, USA) in an incubator with 5% CO2 at 37°C. Upon reaching 70-80% confluency, the cells were detached with trypsin and transferred to centrifuge tubes.
  • Example 2 Creation of a DNA template for obtaining mRNA.
  • the DNA template is a circular plasmid DNA containing an open reading frame encoding the identified gene signatures.
  • DNA template variants were developed that contained both individual gene signatures of tumor cells and multiple gene signatures in a single reading frame.
  • the DNA template contains all the structural components necessary for efficient mRNA production in vitro, as well as elements necessary for DNA replication in E. coli and the ampicillin resistance gene.
  • mRNA After transcription from the designed DNA template, mRNA is formed, which has the sequence SEQ ID N0:2 before the open reading frame and SEQ ID N0:7 after the open reading frame.
  • sequences encoding the identified gene signatures (SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18) were synthesized from oligonucleotide primers and flanked by regions of homology with the plasmid vector required for the assembly of the DNA template.
  • the plasmid vector linearized at the Hindlll site and the PCR product (containing the gene signatures) were combined by the Gibson assembly method using the commercial Gibson Assembly® Ultra kit (Codex, USA). All molecular biology work (cloning) was performed using E. coli Top 10 electrocompetent cells.
  • the selection of oligonucleotide primers was carried out using the SnapGene v6.1.2 program.
  • Nucleic acid amplification was performed using MiniAmp (Thermofisher) and T100 (Biorad) instruments. Highly specific amplification of DNA fragments was performed using the 2X Platinum SuperFi Green MasterMix kit. Amplification conditions were as recommended by the manufacturer. PCR products for cloning from agarose gel were purified using the QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions.
  • sequence encoding several gene signatures in a single reading frame (SEQ ID NO:19) and a sequence encoding three gene signatures in a single reading frame, connected via a linker (SEQ ID NO:20) were obtained.
  • SEQ ID NO:19 a sequence encoding several gene signatures in a single reading frame
  • SEQ ID NO:20 a sequence encoding three gene signatures in a single reading frame, connected via a linker
  • E. coli cells transformed with the DNA template were grown in 2xYT liquid medium (1.6% Tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl) or on 2xYT solid medium + 2% agar with antibiotic. Plasmid DNA was isolated from a 4 ml overnight E. coli culture using the QIAGEN Plasmid Midi Kit (100) (QIAGEN: 12143) or QIAGEN Plasmid Maxi Kit (25) (QIAGEN: 12163) according to the standard protocol suggested by the manufacturer.
  • plasmid DNA isolation After plasmid DNA isolation, its concentration was measured on a Qubit®4.0 fluorimeter (Invitrogene, USA) using reagents from the commercial Qubit®dsDNA High Sensitivity Assay Kits (Life Technologies: Q32854) using the standard protocol suggested by the manufacturer. The correct assembly of the final plasmids was confirmed by Sanger sequencing on a Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems) using the commercial BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, according to the manufacturer's recommendations.
  • DNA matrices that contain an open reading frame with a luciferase sequence and encode various variants of mRNA structural elements, in particular:
  • a series of DNA matrices encoding mRNA with the sequence SEQ ID N0:2 up to the open reading frame and sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame wherein the reading frame encodes one or more tumor cell gene signatures (SEQ ID N0:9, or SEQ ID N0:10, or SEQ ID N0:11, or SEQ ID N0:12, or SEQ ID N0:13, or SEQ ID N0:14, or SEQ ID N0:15, or SEQ ID N0:16, or SEQ ID N0:17, or SEQ ID N0:18, or SEQ ID N0:19, or SEQ ID N0:20).
  • tumor cell gene signatures SEQ ID N0:9, or SEQ ID N0:10, or SEQ ID N0:11, or SEQ ID N0:12, or SEQ ID N0:13, or SEQ ID N0:14, or SEQ ID N0:15, or SEQ ID N0:16, or SEQ ID N0:17
  • DNA templates encoding mRNA with different structural elements at the 5’ (SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:8) and 3’ ends (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7), with an open reading frame encoding luciferase, were obtained.
  • Example 3 Synthesis of mRNA based on the obtained DNA templates containing an open reading frame encoding the detected gene signatures.
  • ATP Addenosine - 5'-triphosphate
  • GTP Guanosine - 5'-triphosphate
  • STP Cytidine - 5'-triphosphate
  • N1-methylpseudouridine-5'-triphosphate Nl-Me-PseudoUTP
  • Table 1 shows the reaction mixture composition for a 100 ⁇ L reaction with 2 to 5 ⁇ g of DNA template. If necessary, the reaction volume can be reduced to 25 ⁇ L by sequentially decreasing the amounts of components. Before starting the IVT, all components are thawed on ice and vortexed. Next, the reaction is prepared, and the components are added in the order presented.
  • the reaction mixture is incubated at a temperature of +37°C for 120 minutes, after which 1 ⁇ l of DNase + 12 ⁇ l of DNase buffer (10x) (Synthol) are added to it and the mixture is incubated for another 30 minutes.
  • a set of mRNA with the sequence SEQ ID N0:2 before the open reading frame and the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame was obtained, wherein the reading frame encodes one or more gene signatures of tumor cells (SEQ ID N0:9, or SEQ ID N0: 10, or SEQ ID N0:11, or SEQ ID N0:12, or SEQ ID N0: 13, or SEQ ID N0:14, or SEQ ID N0:15, or SEQ ID N0:16, or SEQ ID N0:17, or SEQ ID N0:18, or SEQ ID N0:19, or SEQ ID N0:20).
  • SEQ ID N0:9, or SEQ ID N0: 10 or SEQ ID N0:11, or SEQ ID N0:12, or SEQ ID N0: 13, or SEQ ID N0:14, or SEQ ID N0:15, or SEQ ID N0:16, or SEQ ID N0:17, or SEQ ID N0:18, or SEQ
  • a set of mRNAs with different structural elements at the 5’ (SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:8) and 3’ ends (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7) with an open reading frame encoding luciferase were obtained.
  • Example 4 Preparation of lipid nanoparticles containing synthesized mRNA.
  • the mRNAs synthesized in Example 3 were encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) using a microfluidic mixing process of a rapid mRNA solution (pH 3.0) with a lipid solution dissolved in alcohol.
  • LNPs lipid nanoparticles
  • the lipids were dissolved in 96% ethanol at molar ratios of 46.3:9:42.7:1.6 (ionizable lipid: distearoylphosphatidylcholine (DSPC): cholesterol: PEGylated lipid (PEG lipid)).
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • PEG lipid PEGylated lipid
  • Acuitas ionizable lipid (ALC-0315) and PEG lipid (1,2-dimyristoyl-3-p-glycero-3-methoxypolyethyleneglycol 2000) were purchased from Cayman Chemical Company.
  • An mRNA solution with a working concentration of 0.2 mg/ml was prepared by mixing water Molecular biology grade, 10x citrate buffer (pH 3.0), and mRNA stock solution.
  • the lipid solution was combined with the mRNA solution (0.2 mg/mL) in a 3:1 volume ratio (aqueous solution: alcohol solution) using microfluidic mixing in a Nanoassmblr Benchtop system (Precision NanoSystems).
  • the ratio of ionizable nitrogen atoms in the ionizable lipid to the number of phosphate groups in mRNA (N:P ratio) was 6 for each composition.
  • the resulting formulations were dialyzed against PBS (pH 7.2) in 20 kDa Slide-A-Lyzer dialysis cassettes (Thermo Fisher Scientific) overnight with gentle stirring of the buffer solution on a magnetic stirrer in a refrigerator at +4°C.
  • the lipid nanoparticle suspension was withdrawn from the dialysis cassette using a syringe, filtered through a 0.2 ⁇ m Acrodisk filter (Supor membrane, Pall corporation), and the LNP preparations were stored at +4 °C until use.
  • a set of lipid particles was obtained containing mRNA with the sequence SEQ ID N0:2 before the open reading frame and the sequence SEQ ID N0:7 after the open reading frame, wherein the reading frame encodes one or more gene signatures of tumor cells (SEQ ID N0:9, or SEQ ID N0:10, or SEQ ID N0:11, or SEQ ID N0:12, or SEQ ID N0:13, or SEQ ID N0:14, or SEQ ID N0:15, or SEQ ID N0:16, or SEQ ID N0:17, or SEQ ID N0:18, or SEQ ID N0:19, or SEQ ID N0:20).
  • lipid particles containing mRNA with different structural elements at the 5’ (SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5 SEQ ID N0:8) and 3’ ends (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7), with an open reading frame encoding luciferase, were obtained.
  • the resulting lipid particles were used to deliver mRNA into mammalian cells.
  • Example 5 Evaluation of target antigen expression after introduction of various mRNA constructs encoding luciferase.
  • mice weighing approximately 18 g were used. The animals were divided into several experimental groups, which were administered:
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:1 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:6 at the 3' end 2) mRNA that has the sequence SEQ ID N0:2 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:6 at the 3' end.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:3 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:6 at the 3' end.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:4 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:6 at the 3' end.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:5 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:6 at the 3' end.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:8 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:6 at the 3' end.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:1 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:7 at the 3' end.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:2 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:7 at the 3' end.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:3 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:7 at the 3' end.
  • mRNA that has the sequence SEQ ID N0:4 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID N0:7 at the 3' end.
  • mice were intraperitoneally injected with 100 ⁇ l of D-luciferin solution in PBS (25 mg/ml). Five minutes after injection, the animals were anesthetized with 1-2% isoflurane and placed in the IVIS L mina III imaging system (Perkin Elmer). Mice were imaged using Living Image software (Perkin Elmer).
  • Example 6 A method for using the developed immunobiological agent to induce an immune response to tumor cells containing gene signatures included in the mRNA vector.
  • the B16-F10 syngeneic melanoma cell line from mice C57N/6 was used in the experiment.
  • the cells were cultured in 75 cm2 culture flasks in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, and L-glutamine in an incubator containing 5% CO2 at a temperature of 37°C. Upon reaching 70-80% confluency, the cells were detached with trypsin and transferred to centrifuge tubes. They were then pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes.
  • phosphate-buffered saline was added to the pellet, mixed, and pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Washing with phosphate-buffered saline was performed twice. Cells were diluted in 1 ⁇ phosphate-buffered saline at a concentration of 2x10 6 cells per milliliter.
  • mice were anesthetized with 3% isoflurane.
  • Cells were injected subcutaneously into the right flank of the mouse at 100 ⁇ l (2 x 105 cells per mouse) using a 1 ml syringe with a 22G needle.
  • the animals were divided into several groups, depending on the type of drug they were administered:
  • the study drug was administered the following day after tumor cell inoculation at a dose of 20 ⁇ g mRNA per mouse using an insulin syringe with a 29G needle.
  • the drug was administered intramuscularly every 4 days.
  • tumor size was determined and its volume calculated.
  • the data obtained are presented in Figure 2.
  • the introduction of mRNA with an open reading frame encoding the detected tumor cell gene signatures results in tumor cell growth restriction. This establishes an immune surveillance system for tumor cells in mammals, enabling effective detection and elimination of tumor cells.
  • Example 7 A method for using the developed immunobiological agent to induce an immune response to tumor cells, in which more than 2 immunobiological agents encoding different tumor gene signatures are simultaneously administered.
  • the B16-F10 syngeneic melanoma cell line from mice C57 ⁇ /6 was used in the experiment.
  • the cells were cultured in 75 cm2 culture flasks in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, and L-glutamine in an incubator with 5% CO2 at a temperature of 37°C. Upon reaching 70-80% confluency, the cells were detached with trypsin and transferred to centrifuge tubes.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • mice were anesthetized with 3% isoflurane.
  • Cells were injected subcutaneously into the right flank of the mouse at 100 ⁇ l (2 x 105 cells per mouse) using a 1 ml syringe with a 22G needle.
  • the animals were divided into several groups, which were administered:
  • the study drug was administered the following day after tumor cell inoculation at a dose of 20 ⁇ g mRNA (the total amount was divided proportionally by the amount of mRNA vectors) per mouse using an insulin syringe with a 29G needle.
  • the drug was administered intramuscularly every 4 days.
  • tumor size was determined and its volume was calculated.
  • the data obtained are presented in Fig. 3.
  • the introduction of several open reading frame mRNA variants encoding the detected gene signatures of tumor cells leads to growth restriction. Tumor cells. This creates an immune surveillance system for tumor cells in mammals, which allows for the effective detection and elimination of tumor cells.
  • Example 8 Changes in the tumor microenvironment.
  • the B16-F10 syngeneic melanoma cell line from mice C57 ⁇ /6 was used in the experiment.
  • the cells were cultured in 75 cm2 culture flasks in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, and L-glutamine in an incubator with 5% CO2 at a temperature of 37°C.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • the cells were detached with trypsin and transferred to centrifuge tubes. They were then pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes.
  • phosphate-buffered saline was added to the pellet, mixed, and pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Washing with phosphate-buffered saline was performed twice. Cells were diluted in 1 ⁇ phosphate-buffered saline at a concentration of 2x10 6 cells per milliliter.
  • mice were anesthetized with 3% isoflurane.
  • Cells were injected subcutaneously into the right flank of the mouse at 100 ⁇ l (2 x 105 cells per mouse) using a 1 ml syringe with a 22G needle.
  • the animals were divided into 2 groups, which were administered every 4 days:
  • the drug administration started on day 1 of the study.
  • mice intact animals
  • mice injected with the study drug were euthanized with carbon dioxide.
  • the tumor was separated from the surrounding tissue with scissors, then minced and passed through a 100- ⁇ m nylon strainer in 10 ml of phosphate-buffered saline containing 1% fetal bovine serum.
  • the cell suspension was pelleted at 450g for 10 minutes, and the pellet was resuspended in 1 ml of phosphate-buffered saline containing 1% fetal bovine serum.
  • 1 million cells were collected from the suspension and pelleted at 450g for 10 minutes. Fc-block was added to the pellet, and the mixture was incubated for 30 minutes at +4°C.
  • phosphate-buffered saline 1 ml was added to the cell suspension, and the mixture was pelleted at 450g for 10 minutes. A mixture of antibodies diluted in staining buffer (BD) was added to the sediment. Antibodies to the following cell markers were used in the study: CD45 - a marker of all leukocytes, CD3 - a marker of T-lymphocytes, F4/80 - a marker of macrophages. Then, to the suspension 1 ml of phosphate-buffered saline was added to each cell and pelleted at 450 g for 10 minutes. The pellet was resuspended in 100 ⁇ l of phosphate-buffered saline with DAPI and analyzed by flow cytometry. DAPI was used to assess cell viability, as this dye only penetrates cells with damaged membranes.
  • staining buffer BD
  • the obtained data show that the developed immunobiological agent induces immune responses that alter the tumor microenvironment and initiates the detection of tumor cells by the immune system, as well as their elimination.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к иммунологии и онкологии. Разработанное иммунобиологическое средство может применяться в терапии пациентов с онкологическими заболеваниями различной этиологии. Средство на основе мРНК вектора, в котором мРНК содержит последовательность SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8 на 5' конце; открытую рамку считывания, кодирующую от 1 до 80 опухолевых генных сигнатур; последовательность SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7 на 3' конце. Также предложены способ получения средства и его применение. Предложенная группа изобретений расширяет арсенал средств и способов для индукции иммунного ответа у пациентов с онкологическими заболеваниями.

Description

Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК вектора.
Область техники
Изобретение относится к иммунологии и онкологии. Разработанное иммунобиологическое средство может применяться в терапии пациентов с онкологическими заболеваниями различной этиологии. Предложенное изобретение расширяет арсенал средств и способов для индукции иммунного ответа у пациентов с онкологическими заболеваниями.
Уровень техники
Онкологические заболевания являются одной из ведущих причин смертности во всем мире. По данным ВОЗ в 2022 г. в мире было зарегистрировано 20 млн новых случаев рака и 9,7 млн случаев смерти от онкологических заболеваний. Число людей, которые оставались в живых через 5 лет с момента постановки диагноза, в 2022 г составляло 53,5 млн человек. Согласно этим данным, приблизительно у каждого пятого человека в течение жизни может развиться какое-либо онкологическое заболевание; примерно 1 из 9 мужчин и 1 из 12 женщин погибнут от данного заболевания [“Глобальное Бремя Онкологических Заболеваний Растет Параллельно с Ростом Потребности в Услугах.” World Health Organization, World Health Organization, www.who.int/ru/news/item/01-02-2024-global-cancer- burden-growing— amidst-mounting-need-for-services. Дата обращения: 18 июня 2024 года].
Согласно прогнозу Международного агентства по изучению рака (МАИР) к 2050 году число случаев онкологических заболеваний в мире может увеличиться примерно на 77%. [Cancer rates set to rise 77 per cent by 2050 https://news.un.org/en/story/2024/02/1146127. Дата обращения: 18 июня 2024 года]. Быстрый рост глобального бремени онкологических заболеваний является следствием как старения населения и демографического роста, так и изменения в подверженности людей воздействию факторов риска.
Развитие рака включает прогрессирующую трансформацию нормальных клеток в злокачественные, которая является результатом происходящих в клетках генетических и эпигенетических изменений. Первоначально возникающие опухолевые клетки могут быть устранены клетками-эффекторами иммунной системы. Однако этот процесс приводит к иммунной селекции (иммуноредактированию опухоли), которая способствует отбору клонов опухолевых клеток с меньшей иммуногенностью, обладающих способностью блокировать активность иммунокомпетентных клеток. В итоге во время опухолевой прогрессии, когда опухоль достигает размеров, обнаруживаемых клиническими методами, растворимые факторы, секретируемые клетками опухоли, могут создавать в опухолевом микроокружении благоприятные условия для ускользания от воздействия иммунной системы.
Известно, что опухолевые клетки способны подавлять направленный иммунный ответ, используя различные механизмы защиты. Некоторые из них связаны с активацией системы ингибиторных механизмов (контрольных точек иммунного ответа), которые передают ингибирующий сигнал цитотоксическому Т-лимфоциту, тем самым подавляя иммунологическую реактивность в начальной фазе иммунного ответа — индуктивной. В результате происходит блокирование активации Т-лимфоцитов, что приводит к преобладанию Т регуляторных клеток в опухолевом микроокружении и развитию иммунной толерантности и анергии [Шубникова Е.В., Букатина Т.М., Вельц Н.Ю., Каперко Д.А., Кутехова Г. В. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа: новые риски нового класса противоопухолевых средств // Безопасность и риск фармакотерапии, 2020, №1, стр. 9-20].
Открытие контрольных точек иммунного ответа произвело революцию в онкоиммунологии. В настоящее время разработан целый класс препаратов, которые представляют собой гуманизированные моноклональные антитела ингибирующие контрольные точки иммунного ответа. Данный класс препаратов значительно улучшил выживаемость пациентов и стал существенным прорывом в противоопухолевой терапии. В настоящее время в России зарегистрировано 4 препарата класса блокаторов иммунных контрольных точек: ипилимумаб, ниволумаб, пембролизумаб и атезолизумаб. Кроме того, это направление активно развивается и проводится поиск новых мишеней. Однако, данный класс препаратов не может решить ряд проблем, связанных с низкой иммуногенностью и недостаточной презентацией опухолевых антигенов. В результате чего часть опухолевых клеток способна ускользать от иммунного ответа.
Другим направлением развития онкоиммунологии является разработка терапевтических вакцин. Существует несколько классов данных препаратов, которые используют разные антигены и различные механизмы образования клеточноопосредованного иммунного ответа:
1) Вакцины на основе дендритных клеток (ДК). Дендритные клетки (ДК) выполняют роль антигенпрезентирующих клеток в иммунной системе человека. В этом типе вакцин ДК усиливают презентацию опухолевых антигенов лимфоцитам. После активации наивных лимфоцитов они становятся способными уничтожать опухолевые клетки, представляющие эти антигены [Боженко В. К. Противоопухолевые вакцины. Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России 2022 год №1 т.22]. Противораковые вакцины данного типа обычно включают ДК, выделенные у пациентов или полученные ex vivo, путем культивирования гемопоэтических клеток- предшественников или моноцитов пациента. ДК дополнительно загружают опухолевыми антигенами и иногда объединяют с иммуностимулирующими агентами, такими как GM- CSF. Хотя собранные данные свидетельствуют о том, что ДК-вакцины хорошо переносятся и имеют хороший профиль безопасности, четкие терапевтические результаты достигаются менее чем у 15% пациентов Calmeiro J, Carrascal МА, Tavares AR, Ferreira DA, Gomes C, Falcao A, Cruz MT, Neves BM. Dendritic Cell Vaccines for Cancer Immunotherapy: The Role of Human Conventional Type 1 Dendritic Cells. Pharmaceutics. 2020 Feb 15;12(2):158. doi: 10.3390/pharmaceuticsl2020158. PMID: 32075343; PMCID: PMC7076373.
2) Другой класс противораковых вакцин основан на модифицированных (например, облученных сублетальными дозами) опухолевых клетках, используемых в качестве антигенов, также в комбинации с иммуностимулирующими агентами. Вакцины данного типа в настоящее время, находящиеся на клинических испытаниях, основаны как на аутологичных (например, OncoVAX, LipoNova), так и на аллогенных (например, Canvaxin, Onyvax-P, GV АХ) опухолевых клеточных линиях. Использование этих методов вакцинации позволяет получить воспроизводимый, безопасный вакцинный продукт, в котором инъецированные опухолевые клетки не могут размножаться. Облученные опухолевые клетки естественным образом экспрессируют многочисленные специфические антигены, таким образом, способствуя инициации противоопухолевого иммунного ответа. Также было показано, что иммунное распознавание опухолевых клеток СО8+Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками усиливается после облучения. Кроме того, цельноклеточные вакцины могут быть модифицированы для повышения иммуногенности путем трансфекции иммуностимулирующих молекул. Например, платформа вакцины GVAX включает использование облученных аллогенных линий опухолевых клеток, модифицированных для секреции GM-CSF для усиления иммуногенности вакцины. Несмотря на все преимущества, данный тип вакцин имеет ряд недостатков. Так, например, при облучении клеток фосфатидил серин, иммуносупрессивный фосфолипид, обычно находящийся на внутреннем листочке плазматической мембраны, транслоцируется с внутренней стороны плазматической мембраны на ее внешнюю сторону, что в свою очередь приводит секреции иммуносупрессивных факторов дендритными клетками и ингибирует их созревание, способствуя иммуносупрессивному окружению опухоли. Более того, облученные клетки могут сохранять способность секретировать иммуносупрессивные факторы подобно исходным опухолевым клеткам. Таким образом, вызванное облучением подавление иммунитета частично сводит на нет иммуногенный эффект облученных целых клеток [Srivatsan S, Patel JM, Bozeman EN, Imasuen IE, He S, Daniels D, Selvaraj P. Allogeneic tumor cell vaccines: the promise and limitations in clinical trials. Hum Vaccin Immunother. 2014;10(l):52-63. doi: 10.4161/hv.26568. Epub 2013 Sep 24. PMID: 24064957; PMCID: РМС4181031].
3) Следующий класс терапевтических противоопухолевых вакцин основан на пептидных фрагментах антигенов, селективно экспрессированных опухолевыми клетками. Пептиды вводят самостоятельно или в комбинации с иммуностимулирующими агентами, которые могут включать адъюванты и цитокины, такие как гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Пептиды, загруженные в МНС класса I, распознаются специфическим TCR CD8+ Т-клеток, которые активируются для проявления своей цитотоксической активности против опухолевых клеток, представляющих тот же комплекс пептид-МНС-1. Этот процесс определяется как активная иммунотерапия, поскольку иммунная система хозяина либо активируется de novo, либо рестимулируется для запуска эффективной специфичной к опухоли иммунной реакции, которая в конечном итоге может привести к регрессии опухоли. Однако, хотя доклинические данные часто показывали обнадеживающие результаты, клинические испытания терапевтических противораковых вакцин, в том числе вакцин на основе пептидов, на сегодняшний день не дали удовлетворительных данных. Ограниченная эффективность противораковых вакцин на основе пептидов является следствием нескольких факторов, включая идентификацию специфических опухолевых антигенов- мишеней, ограниченную иммуногенность пептидов и высокоиммуносупрессивное микроокружение опухоли.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых средств для терапии онкологических заболеваний.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств для терапии онкологических заболеваний.
Технический результат заключается в разработке средства, позволяющего обеспечить эффективную индукцию иммунного ответа против опухолевых клеток.
Указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК вектора, в котором мРНК содержит последовательность SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую от 1 до 80 опухолевых генных сигнатур; последовательность SEQ ID N0:6 или SEQ ID N0:7 на 3’ конце.
Кроме того, технический результат заключается в том, что разработан способ получения иммунобиологического средства, содержащий стадии: а) выявление генных сигнатур опухолевых клеток; б) синтез набора ДНК-матриц, каждая из которых содержит открытую рамку считывания, кодирующую 1 до 80 обнаруженных генных сигнатур; в) синтез набора мРНК на основе полученного набора ДНК-матриц;
Также технический результат заключается в том, что разработано применение созданного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в состав мРНК вектора.
Существует вариант применения, в котором одновременно вводят более 2 разработанных иммунобиологических средств, кодирующих различные опухолевые генные сигнатуры.
Осуществление изобретения
Краткое описание чертежей.
На Фиг. 1 представлены результаты измерения биолюминесценции in vivo на приборе IVIS Imaging System (Perkin elmer, США).
На фотографии номерами обозначены животные, которым вводили следующие варианты мРНК:
1. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
2. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
3. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
4. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
5. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
6. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания. 7. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
8. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
9. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
10. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
11. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
12. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
А обозначено место флуоресценции в диапазоне от 0,5* 108 до 1 * 108 p/sec/cm2/sr.
В обозначено место флуоресценции в диапазоне от 0,5* 108 до 1,5*108 p/sec/cm2/sr/.
На Фиг. 2 представлены результаты измерения объема опухоли у животных, которым вводили фосфатный-буферный раствор и исследуемые препараты мРНК.
На оси ординат представлен объем опухоли, мм3.
На оси абсцисс представлены различные группы животных, где
1. Контрольные мыши, которым вводили фосфатно-солевой буферный раствор
Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9;
3. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:10;
4. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:11;
5. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:12;
6. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:13;
7. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:14;
8. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:15; 9. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:16;
10. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:17;
11. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:18;
12. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 10 обнаруженных генных сигнатур SEQ ID N0:19;
13. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 3 обнаруженных генных сигнатуры SEQ ID N0:20.
На Фиг. 3 представлены результаты измерения объема опухоли у животных, которым вводили фосфатный-буферный раствор и исследуемые препараты мРНК.
На оси ординат представлен объем опухоли, мм3.
На оси абсцисс представлены различные группы животных, где
1. Фосфатно-солевой буфер
2. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9;
3. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:10;
4. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:10 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:11;
На Фиг. 4 представлены результаты определения клеточного состава микроокружения опухоли, где
А - оценка процентного содержания макрофагов,
Б - Т-лимфоцитов.
1 - интактные мыши (не вводился препарат), 2 - исследуемый препарат.
* - р<0.05, критерий Манна-Уитни. Реагируя на стресс, опухолевые клетки адаптируются, подхватывая мутации и изменяя уровень редких белков необходимых, например, для выживания клеток. Это может привести к изменениям в молекулярных сигнатурах антигенов, присутствующих в опухолевых клетках, которые способна распознавать иммунная система. Отслеживание этих изменений может выявить новые мишени, на которые могут быть нацелены терапевтические средства. Однако каждый злокачественный процесс имеет свои уникальные характеристики. Поэтому генетические сигнатуры опухолевых клеток у разных пациентов могут сильно отличаться, даже при условии одинаковой локализации опухолевого процесса.
Разработанный способ получения иммунобиологического средства предполагает секвенирование ДНК, выделенной из опухолевых клеток пациента, по результатам которого составляется мутаном - совокупность мутаций соматического рака в отдельной опухоли. При этом с помощью оригинального алгоритма определяются генные сигнатуры присущие опухолевым клеткам конкретного пациента (т.е. специфические изменения в экспрессии генов, характерные для опухолевых клеток данного пациента). Конечной целью определения генных сигнатур является поиск высокоиммунногенных антигенов, строго специфичных для опухолевых клеток. Далее происходит создание набора ДНК-матриц, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженные генные сигнатуры. При этом существует вариант, когда в одной ДНК- матрице содержится открытая рамка считывания, которая кодирует одну обнаруженную генную сигнатуру. В другом варианте одна ДНК-матрица содержит открытую рамку считывания, кодирующую от 2 до 80 обнаруженных генных сигнатур. Максимальное количество генных сигнатур в одной ДНК матрице (80 шт) определяется максимальной емкостью генетической конструкции. Также это количество зависит от того, сколько специфических генных сигнатур было обнаружено в опухоли у конкретного пациента. Кроме открытой рамки считывания, ДНК-матрица содержит все конструктивные элементы для транскрипции функциональной мРНК, а также элементы, необходимые для наращивания плазмиды в культуре бактериальных клеток.
Было разработано несколько вариантов ДНК-матриц, кодирующих:
1) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
2) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания. 3) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
4) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
5) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
6) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
7) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
8) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
9) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
10) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
11) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
12) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания. Во всех представленных последовательностях мРНК уридин был заменен на псевдоуридин.
В примере 5 продемонстрировано, что все перечисленные конструкции мРНК способны обеспечивать трансляцию мРНК и синтез целевого белка. Для этого был созданы перечисленные выше мРНК, содержащие различные конструктивные элементы на 5’ (SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5 SEQ ID N0:8) и 3’ концах (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7), с открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу. Таким образом, после введения данных мРНК в мышей, можно было оценить синтез люциферазы по реакции с люциферином, которая сопровождается люминесценцией. Кроме того, авторы получали различные варианты данных конструкций с открытой рамкой считывания, кодирующей опухолевые генные сигнатуры, которые обладали высокой противоопухолевой активностью. мРНК, полученные в результате транскрипции in vitro с использованием разработанных ДНК-матриц, в дальнейшем упаковывали в липидные наночастицы и вводили в организм млекопитающих. Было показано, что трансляция мРНК, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую генные сигнатуры, специфичные для опухолевых клеток способствует распознаванию иммунной системой опухолевых антигенов. В результате иммунная система эффективно находит и уничтожает опухолевые клетки. Было показано, что данный эффект коррелирует с изменениями в микроокружении опухоли. Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Выявление отличий в генных сигнатурах опухолевых и нормальных клеток.
Поиск генетических сигнатур опухолевых и нормальных клеток осуществляется на основе получения генетических данных, характеризующих полный геном и/или экзом (для нормальных и опухолевых клеток) и транскриптом (для опухолевых клеток). Экстракция нуклеиновых кислот из образцов и проведение секвенирования выполняются с использованием доступных коммерческих наборов в соответствии с инструкциями производителя. Полученные данные анализируются с помощью оригинального программного обеспечения, которое позволяет провести контроль качества геномных данных, фильтрацию и удаление низкокачественных данных секвенирования, картирование на референсную последовательность, определение зародышевых и соматических мутаций, поиска специфических антигенов, включая биоинформатическое предсказание связывания пептидов с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), которые могут быть представлены на поверхности клеток и распознаны Т- клетками, а также оценку иммуногенности и ряда других показателей. В зависимости от генетического ландшафта опухоли количество отобранных генных сигнатур может варьироваться от нескольких единиц до двух сотен, которые могут быть представлены в генетической конструкции в моноварианте (одна конструкция - одна генная сигнатура), так и объединенны в конкатемер (несколько выявленных генных сигнатур расположены последовательно друг за другом). Для демонстрации работоспособности подхода была использована модель мышиной меланомы. Однако приведенный пример использования биоинформатического алгоритма для выбора генных сигнатур, характерных для опухолевых клеток, является универсальным и может быть использован для разных видов опухолей и разных видов млекопитающих, в том числе для людей.
В эксперименте использовались мыши C57BL/6 (самки, возраст 6-8 недель, средний вес 20 г). Все исследования на животных проводились в соответствии с этическими нормами. Сингенные клетки мышиной меланомы B16-F10 были получены из коллекции ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России. Клетки культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США) в инкубаторе с содержанием 5% СО2 при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Далее к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2x106 кл/мл. Перед введением опухолевых клеток мышей линии С57Ь/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2x105 клеток на мышь).
Через 12 дней отбирали образцы опухолевой и здоровой ткани. Далее проводили полногеномное, экзомное и транскриптомное секвенирования на приборе MGI G400 (MGI, Китай). Полученные данные анализировали с помощью оригинального программного обеспечения, которое позволило выявить около 500 мутаций, характерных для данной опухоли. На основании полученного мутанома был сформирован список специфических антигенов, который в дальнейшем был отфильтрован и приоритизирован по ряду критериев: уровень экспрессии мутантного гена, уникальность (для минимизации риска аутоиммунных реакций), агретопность.
Таким образом, в результате проведенной работы было выявлено 10 генных сигнатур, характерных для данного типа опухоли: SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0: 13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0: 18. Полученные последовательности далее были использованы для получения ДНК-матриц.
Пример 2. Создание ДНК-матрицы для получения мРНК.
Целью данного этапа работы являлось создание ДНК-матрицы для получения мРНК. ДНК матрица представляет собой кольцевую плазмидную ДНК, содержащую открытую рамку считывания, кодирующую выявленные генные сигнатуры. В ходе работы были разработаны варианты ДНК-матриц содержащие как отдельные генные сигнатуры опухолевых клеток, так содержащие несколько генных сигнатур в одной рамке считывания. Кроме, открытой рамки считывания, ДНК-матрица содержит все структурные компоненты необходимые для эффективной наработки мРНК in vitro, а также элементы необходимые для репликации ДНК в E.coli и ген устойчивости к ампициллину.
После транскрипции с разработанной ДНК матрицы образуется мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
Последовательности кодирующие выявленные генные сигнатуры (SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0: 11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18) были синтезированы из олигонуклеотидных праймеров и фланкированы зонами гомологии с плазмидным вектором, необходимым для сборки ДНК-матрицы. Далее, линеаризованный по сайту Hindlll плазмидный вектор и ПЦР-продукт (содержащий генные сигнатуры) были объединены методом сборки по Гибсону с использованием коммерческого набора Gibson Assembly® Ultra kit (Codex, USA). Все молекулярно-биологические работы (клонирования), проводились с помощью Е. coli Тор 10 электрокомпетентных клеток. Подбор олигонуклеотидных праймеров проводился с помощью программы SnapGene v6.1.2.
Амплификация нуклеиновых кислот проводилась на приборах MiniAmp (Thermofisher) и Т100 (Biorad). Высокоспецифичная амплификация фрагментов ДНК проводилась с помощью набора 2Х Platinum SuperFi Green MasterMix. Условия амплификации согласно рекомендации производителя. Очистка ПЦР-продуктов для клонирования из агарозного геля проводилась набором QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя.
Кроме того, были получены: последовательность, кодирующая несколько генных сигнатур в одной рамке считывания (SEQ ID N0:19), а также последовательность, кодирующая три генных сигнатуры в одной рамке считывания, соединенные через линкер (SEQ ID N0:20). Данные последовательности были синтезированы ЗАО «Евроген» и помещены в ДНК-матрицу с помощью методов генной инженерии, аналогично описанному выше.
Наращивание клеток Е. Coli, трансформированных ДНК-матрицей, проводилось в жидкой среде 2xYT (1,6% Триптон, 1% Дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl) или на твердой среде 2xYT + 2% агар, с антибиотиком. Плазмидная ДНК выделялась из ночной культуры Е. coli объемом 4 мл с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (100) (QIAGEN: 12143) или QIAGEN Plasmid Maxi Kit (25) (QIAGEN: 12163) по стандартному протоколу, предложенному производителем. После выделения плазмидной ДНК измеряли её концентрацию на флуориметре Qubit®4.0 (Invitrogene, США) с использованием реагентов из коммерческого набора Qubit®dsDNA High Sensitivity Assay Kits (Life Technologies: Q32854) по стандартному протоколу, предложенному производителем. Правильность сборки финальных плазмид подтверждалась секвенированием по Сэнгеру на аппарате Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems), используя коммерческий набор BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, согласно рекомендациям производителя.
Кроме того был получен ряд ДНК-матриц, которые содержат открытую рамку считывания с последовательностью люциферазы и кодируют различные варианты конструктивных элементов мРНК, в частности:
13) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
14) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
15) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
16) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
17) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
18) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:6 после открытой рамки считывания.
19) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
20) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
21) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
22) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
23) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
24) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания.
Таким образом, в результате проведенной работы был получен ряд ДНК матриц, кодирующих мРНК с последовательностью SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID N0:9, или SEQ ID N0:10, или SEQ ID N0:11, или SEQ ID N0:12, или SEQ ID N0:13, или SEQ ID N0:14, или SEQ ID N0:15, или SEQ ID N0:16, или SEQ ID N0:17, или SEQ ID N0:18, или SEQ ID N0:19, или SEQ ID N0:20 ).
Кроме того, были получены ДНК-матрицы, кодирующие мРНК с различными конструктивными элементами на 5’ (SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5 SEQ ID N0:8) и 3’ концах (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7), с открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.
Пример 3. Синтез мРНК на основе полученных ДНК-матриц, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженные генные сигнатуры.
Для синтеза мРНК проводили реакцию транскрипции in vitro с использованием ДНК-матриц, полученных в предыдущем примере.
Для проведения реакции in vitro транскрипции необходимы следующие компоненты:
- смесь нуклеотидов (Аденозин - 5’- трифосфат (АТР), Гуанозин - 5’ - трифосфат (GTP), Цитидин - 5’ - трифосфат (СТР) и N1 -метилпсевдоуридин-5 '-трифосфат (Nl-Me- PseudoUTP)) (Биолабмикс);
- аналог структуры кэпа1 m7GmAmG (Биолабмикс);
- ингибитор РНКаз (Биолабмикс);
- пирофосфатаза;
- Т7-РНК-полимераза (Биолабмикс);
- Т7-буфер для IVT;
- добавочный буфер.
В таблице 1 представлен состав реакционной смеси, рассчитанный на 100 мкл реакции с количеством ДНК-матрицы от 2 до 5 мкг. При необходимости объем реакции можно уменьшать до 25 мкл кратно снижая количества компонентов. Перед началом IVT все компоненты размораживаются на льду, перемешиваются на вортексе. Далее составляется реакция, компоненты добавляются в представленном порядке.
Таблица 1. Состав реакционной для синтеза мРНК с котранскрипционным кэпированием аналогом кэпа-1 m7GmAmG
Реакционную смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 120 минут, после чего к ней добавляют 1 мкл ДНКазы + 12 мкл буфера для ДНКазы (10х) («Синтол») и смесь инкубируют еще 30 минут.
Таким образом, в результате проведенной работы был получен набор мРНК с последовательностью SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID N0:9, или SEQ ID N0: 10, или SEQ ID N0:11, или SEQ ID N0:12, или SEQ ID N0: 13, или SEQ ID N0:14, или SEQ ID N0:15, или SEQ ID N0:16, или SEQ ID N0:17, или SEQ ID N0:18, или SEQ ID N0:19, или SEQ ID N0:20 ).
Кроме того, были получен набор мРНК с различными конструктивными элементами на 5’ (SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5 SEQ ID N0:8) и 3’ концах (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7), с открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.
Пример 4. Получение липидных наночастиц, содержащих синтезированные мРНК. мРНК, синтез которых описан в примере 3 инкапсулировали в липидные наночастицы (ЛНЧ) с использованием процесса микрофлюидного смешивания быстрого раствора мРНК (pH 3,0) с раствором липидов, растворенных в спирте. Для этого липиды растворяли в 96 % этаноле при молярных соотношениях 46,3:9:42,7:1,6 (ионизируемый липид: дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин: пегилированный липид (ПЭГ-липид)). Ионизируемый липид Acuitas (ALC-0315) и ПЭГ-липид (1,2-димиристоил-зп-глицеро-3- метоксиполиэтиленгликоль 2000) были приобретены в Cayman Chemical Company. Раствор мРНК с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, Юх цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4 °C до использования.
Таким образом, в результате проведенной работы был получен набор липидных частиц, содержащих мРНК с последовательностью SEQ ID N0:2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID N0:7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID N0:9, или SEQ ID N0:10, или SEQ ID N0:11, или SEQ ID N0:12, или SEQ ID N0:13, или SEQ ID N0:14, или SEQ ID N0:15, или SEQ ID N0:16, или SEQ ID N0:17, или SEQ ID N0:18, или SEQ ID N0:19, или SEQ ID N0:20 ).
Кроме того, были получен набор липидных частиц, содержащих мРНК с различными конструктивными элементами на 5’ (SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5 SEQ ID N0:8) и 3’ концах (SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7), с открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.
Полученные липидные частицы использовались для доставки мРНК в клетки млекопитающих.
Пример 5. Оценка экспрессии целевого антигена после введения различных конструкций мРНК, кодирующих люциферазу.
В данном эксперименте были использованы мыши линии BALB/c весом около 18 г. Животные были разделены на несколько экспериментальных групп, которым вводили:
1) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:1 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:6 на 3’ конце. 2) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:6 на 3’ конце.
3) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:3 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:6 на 3’ конце.
4) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:4 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:6 на 3’ конце.
5) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:5 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:6 на 3’ конце.
6) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:8 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:6 на 3’ конце.
7) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:1 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:7 на 3’ конце.
8) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:2 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:7 на 3’ конце.
9) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:3 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:7 на 3’ конце.
10) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:4 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:7 на 3’ конце.
И) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:5 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:7 на 3’ конце.
12) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID N0:8 на 5’ конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID N0:7 на 3’ конце Через 3 часа после введения экспериментальных средств мышам внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора D-люциферина в PBS (25 мг/мл). Через 5 минут после инъекции животных анестезировали 1-2% изофлураном и помещали в систему визуализации IVIS L mina III (Perkin Elmer). Фотографии мышей были обработаны с помощью программного обеспечения Living Image (Perkin Elmer).
Полученные данные показаны на Фиг. 1. Как видно из результатов эксперимента после введения все исследуемых конструкций мРНК наблюдалась экспрессия люциферазы в месте введения и печени животных.
Пример 6. Способ применения разработанного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в состав мРНК вектора.
В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии С57Ы/6. Клетки культивировали в 75 см2 культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% СОг при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2x106 клеток в миллилитре.
Перед введением опухолевых клеток мышей линии С57Ы/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2x105 клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.
Животные были разделены на несколько групп, в зависимости от типа препарата, который им вводили:
1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9;
2) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:10;
3) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:11; 4) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:12;
5) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:13;
6) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:14;
7) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:15;
8) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:16;
9) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:17;
10) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:18;
11) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 10 обнаруженных генных сигнатур SEQ ID N0:19;
12) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 3 обнаруженных генных сигнатуры SEQ ID N0:20.
13) Фосфатно-солевой буфер
Исследуемый препарат вводили на следующие сутки после инокуляции опухолевых клеток из расчета 20 мкг мРНК на мышь инсулиновым шприцом с иглой 29G. Препарат вводили каждые 4 дня внутримышечно.
На 8 день исследования определяли размер опухоли и рассчитывали ее объем. Полученные данные представлены на Фиг.2. Как видно из результатов эксперимента, введение мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры опухолевых клеток, приводит к ограничению роста опухолевых клеток. Таким образом формируется система иммунного надзора за опухолевыми клетками организме млекопитающих, которая позволяет эффективно обнаруживать и элиминировать опухолевые клетки.
Пример 7. Способ применения разработанного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, в котором одновременно вводят более 2 иммунобиологических средств, кодирующих различные опухолевые генные сигнатуры. В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии С57Ы/6. Клетки культивировали в 75 см2 культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% СО2 при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2x106 клеток в миллилитре.
Перед введением опухолевых клеток мышей линии С57Ы/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2x105 клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.
Животные были разделены на несколько групп, которым вводили:
1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9;
2) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:10;
3) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:10 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:11;
4) Фосфатно-солевой буфер
Исследуемый препарат вводили на следующие сутки после инокуляции опухолевых клеток из расчета 20 мкг мРНК (общее количество пропорционально делили количество мРНК векторов) на мышь инсулиновым шприцом с иглой 29G. Препарат вводили каждые 4 дня внутримышечно.
На 8 день исследования определяли размер опухоли и рассчитывали ее объем. Полученные данные представлены на Фиг.З. Как видно из результатов эксперимента, введение нескольких вариантов мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры опухолевых клеток, приводит к ограничению роста опухолевых клеток. Таким образом формируется система иммунного надзора за опухолевыми клетками организме млекопитающих, которая позволяет эффективно обнаруживать и элиминировать опухолевые клетки.
Пример 8. Изменение микроокружения опухоли.
В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии С57Ы/6. Клетки культивировали в 75 см2 культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% СО2 при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2x106 клеток в миллилитре.
Перед введением опухолевых клеток мышей линии С57Ы/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2x105 клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.
Животные были разделены на 2 группы, которым каждые 4 дня вводили:
1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующая 21 обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID N0:19.
2) Фосфатно-солевой буфер
Препараты начинали вводить препарат с 1 дня исследования.
Контрольные мыши (интактные животные) и мыши, которым был введен исследуемый препарат, подвергались эвтаназии углекислым газом. Опухоль отделяли от окружающей ткани ножницами, а затем размельчали и протирали через нейлоновое ситечко с размером пор 100 мкм в 10 мл фосфатно-солевого буфера с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Суспензию клеток осаждали при 450g 10 минут, осадок ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Далее из суспензии отбирали 1 млн клеток, осаждали при 450g 10 минут. К осадку добавляли Fc-блок, инкубировали 30 минут на +4°С. Далее к суспензии клеток добавляли по 1 мл фосфатно-солевого буфера, осаждали при 450g 10 минут. К осадку добавляли смесь антител, разведенных в буфере для окрашивания (Stain buffer, BD). В исследование использовались антител к следующим маркерам клеток: CD45 - маркер всех лейкоцитов, CD3 - маркер Т-лимфоцитов, F4/80- маркер макрофагов. Далее к суспензии клеток добавляли по 1 мл фосфатно-солевого буфера, осаждали при 450g 10 минут. Осадок ресуспендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера с DAPI анализировали методом проточной цитометрии. DAPI использовали для оценки выживаемости клеток, так как данный краситель попадает только в клетки с поврежденной мембранной.
Полученные данные представлены на Фиг.4 Как видно из результатов эксперимента, после введения мРНК, которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженную генную сигнатуру, меняется микроокружение опухоли. В частности, уменьшается количество макрофагов F4/80+, которые играют важную роль в васкуляризации опухоли, а также увеличивается количество CD3+ Т лимфоцитов, что, согласно литературным данным, является прогностическим маркером успешной терапии.
Таким образом, полученные данные показывают, что разработанное иммунобиологическое средство индуцирует иммунные реакции, изменяющие микроокружение опухоли, и инициирует обнаружение иммунной системой опухолевых клеток, а также их элиминацию.
Промышленная применимость.
Разработанное иммунобиологическое средство может использоваться для терапии пациентов с онкологическими заболеваниями различной этиологии.

Claims

Формула изобретения
1. Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК вектора, в котором мРНК содержит последовательность SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую от 1 до 80 опухолевых генных сигнатур; последовательность SEQ ID N0:6 или SEQ ID N0:7 на 3’ конце.
2. Способ получения иммунобиологического средства по п.1, содержащий стадии: а) выявление генных сигнатур опухолевых клеток; б) синтез набора ДНК-матриц, каждая из которых содержит открытую рамку считывания, кодирующую 1 до 80 обнаруженных генных сигнатур; в) синтез набора мРНК на основе полученного набора ДНК-матриц;
3. Применение иммунобиологического средства по п.1 для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в состав мРНК вектора.
4. Применение по п.4, в котором одновременно вводят более 2 иммунобиологических средств по п.1, кодирующих различные опухолевые генные сигнатуры.
PCT/RU2025/000257 2024-06-29 2025-08-28 Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мрнк вектора Pending WO2026005647A2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2024118081 2024-06-29
RU2024118081A RU2828631C1 (ru) 2024-06-29 Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК вектора.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2026005647A2 true WO2026005647A2 (ru) 2026-01-02
WO2026005647A3 WO2026005647A3 (ru) 2026-02-19

Family

ID=98222644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2025/000257 Pending WO2026005647A2 (ru) 2024-06-29 2025-08-28 Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мрнк вектора

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2026005647A2 (ru)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013151663A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
RU2550267C2 (ru) * 2012-12-12 2015-05-10 Елена Андреевна Чирясова Способ воздействия на пролиферативный статус клеток с помощью специфических нуклеотидных последовательностей g-цепи теломерной днк человека
RU2768829C2 (ru) * 2017-02-01 2022-03-24 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Противораковые рнк-вакцины
WO2019173460A1 (en) * 2018-03-07 2019-09-12 Wisconsin Alumni Research Foundation High throughput nucleic acid profiling of single cells
US11162102B2 (en) * 2019-05-13 2021-11-02 Dna Twopointo Inc. Modifications of mammalian cells using artificial micro-RNA to alter their properties and the compositions of their products
RU2765729C1 (ru) * 2021-12-29 2022-02-02 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и способ его применения (варианты)

Also Published As

Publication number Publication date
WO2026005647A3 (ru) 2026-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7509504B2 (ja) 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム
JP7801134B2 (ja) 腫瘍特異的なネオ抗原を同定する組成物および方法
US20210252066A1 (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
JP2024160216A (ja) 免疫療法に対するタンパク質又はタンパク質のフラグメントの有用性を予測するための方法
CN112533630B (zh) 用于癌症的个体化疫苗
KR20080097203A (ko) Ｈｌａ-ａ*3303 구속성 ｗｔ1 펩티드, 및 그것을 포함하는 의약 조성물
JP2015520129A (ja) 多価乳がんワクチン
JP2022514116A (ja) 新規な癌抗原及び方法
US7541035B2 (en) Immunogenic peptides for the treatment of prostate and breast cancer
WO2010117071A1 (ja) ユビキチン融合遺伝子およびそれを用いたｄｎａワクチン
RU2828631C1 (ru) Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК вектора.
RU2828654C1 (ru) Способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих
WO2026005646A2 (ru) Способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих
US11612643B2 (en) Col14A1-derived tumor antigen polypeptide and use thereof
JP7836267B2 (ja) 多細胞形質転換用の修飾ｍＲＮＡ
JP4039483B2 (ja) ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球ｍＨＡエピトープペプチド及びその用途
WO2024215711A1 (en) Modified mammalian vesicles and compositions and methods related thereto
HK40115742A (zh) 用於肺癌的治疗性rna

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 25827411

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2