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Verfahren zur Gewinnung des Dihydro-Follikelhormons aus dem Urin trächtiger Stuten.
Die Oestrogenstoffe, die man bisher in dem Urin trächtige Stuten fand, enthalten alle eine
Hydroxylgruppe mit phenolartigem Charakter und ausserdem noch eine Ketongruppe. Unter diesen
Stoffen ist relativ in grösster Menge das Follikelhormon von Bruttoformel CHO anwesend.
Vor einiger Zeit ist den Autoren Wintersteiner, Schwenk und Withmann gelungen (Proceding of Society for Experimental Biology and Medicine, 1934-35, S. 1087-88), in dem Urin trächtiger
Stuten ein Hormon nachzuweisen, das nach diesen Autoren wahrscheinlich mit dem Dihydro-Follikel- hormon identisch ist. Die von den Autoren gewonnenen Hormonmengen waren aber so klein, dass diese nicht einmal für die Analyse ausreichen.
Die in der deutschen Patentschrift Nr. 629808 vorgeschlagene Arbeitsweise ermöglicht zwar die
Anreicherung von in den Ausgangsstoffen gleichzeitig vorhandenem Keimdrüsenhormon in verschie- denen Fraktionen und insbesondere die Reindarstellung des Follikelhormons, führt jedoch nicht zu angereicherten Fraktionen des Dihydro-Follikelhormons und noch weniger zur Abscheidung desselben in kristallinischer Form.
Es wurde nun gefunden, dass aus dem Urin trächtiger Stuten das Dihydro-Follikelhormon in bedeutender Menge gewonnen werden kann, wenn man die wässerig-alkalischen Lösungen des rohen oder teilweise vorgereinigten Hormongemisches-welches aus dem Pferdeurin nach irgendeiner bekannten Weise abgetrennt wurde und aus welchem eventuell die säureartigen Verunreinigungen bereits vorher entfernt wurden-auf eine Alkalität von etwa drei Zehntel normal bringt, durch Ausschütteln mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Benzol, Äther, vorreinigt und die in der alkalischen Lösung zurückgebliebenen Hormone in geeigneter und an sich bekannter Weise, z.
B. durch weiteres Abstumpfen der Alkalität und Ausschütteln mit Benzol auszieht, nach Abtreiben des Benzols die flüchtigen Phenole durch Abdampfen im Vakuum oder auf anderem Wege ente fernt, den Rückstand in wässeriger, etwa normal Lauge aufnimmt, die Lösung auf eine Alkalität von etwa 0'3 normal einstellt, durch Ausschütteln mit Benzol vorreinigt und nachher durch Ausschütteln mit Äther eine an Dihydro-Follikelhormon reiche Fraktion auszieht und nach Abdunsten des Äthers durch Kristallisierung des Rückstandes in geeigneten Lösungsmitteln, wie z. B. in Benzol, Alkohol, das Dihydro-Follikelhormon gewinnt.
Die Gewinnung des Dihydro-Follikelhormons in praktisch brauchbarer Menge aus dem Urin trächtiger Stuten hat eine grosse industrielle Wichtigkeit, denn das Dihydro-Follikelhormon ist bekanntlich bedeutend wirksamer, als das Follikelhormon selbst.
Das als Ausgangsstoff benutzte rohe Hormongemisch kann in irgendeiner bekannten Weise hergestellt werden. Z. B. in der Weise, dass der Urin mit Mineralsäuren, wie z. B. mit Salzsäure, auf saure Reaktion eingestellt, dann gekocht und nach Abkühlen mit organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser nicht mischbar sind, ausgezogen wird, wodurch die im Harn befindlichen Säuren, Phenole und andere Stoffe, die Phenolcharakter aufweisen, in die organisehen Lösungsmittel übergehen. Das organische Lösungsmittel kann eventuell nach partieller Einengung zur Entfernung säureartiger Begleitstoffe mit Natriumbicarbonatlösung behandelt werden. Nachher wird mit wässeriger Natronlauge, z. B. mit normal Natronlauge, ausgezogen. Man kann aber das rohe Hormongemisch, welches als Ausgangsstoff dient, aus dem Pferdeurin auch durch andere Methoden gewinnen.
Das vorher erwähnte
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Verfahren kann z. B. auch ohne Anwendung des Ansäuerns mit Mineralsäure und Kochen dieses an- gesäuerten Urins ausgeführt werden.
Das vorliegende Verfahren benutzt als Ausgangsstoffe die wässerig-alkalischen Lösungen der rohen Gesamthormone oder von bereits teilweise gereinigten Hormongemischen. Als Alkali ist zweck- I mässig Natron- oder Kalilauge zu verwenden. Diese alkalische Lösung wird mit Säuren so weit ab- gestumpft, dass keine Trübung entsteht, wobei die Lösung eine Normalität von etwa 0'3 zeigt. Jetzt wird durch mehrmaliges Ausschütteln mit Benzol oder mit einem ähnlichen organischen Lösungsmittel eine Hormonfraktion ausgezogen, die verhältnismässig wenig Dihydro-Follikelhormon enthält. Diese
Extrahierung kann eventuell auch mit andern organischen Lösungsmitteln, wie z. B. mit Äther wieder- holt werden.
Die zurückbleibenden Hormone werden aus der alkalisch-wässerigen Lösung nach weiterer
Neutralisation durch Ausschütteln mit Benzol ausgezogen. Sie können aber auch auf andern bekannten
Wegen gewonnen werden. Aus dem, von den Lösungsmitteln befreiten Auszug werden die flüchtigen
Phenole, zweckmässig durch Vakuumdestillation, entfernt. Der von den flüchtigen Phenolen befreite
Rückstand wird entweder direkt in wässerigem Alkali, wie z. B. in normal Natronlauge gelöst, oder nach vorherigem Lösen in Äther mit verdünnter Natronlauge ausgezogen. Die alkalisch-wässerige
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kristallisieren, z. B. aus Alkohol, gereinigt wird.
Das in solcher Weise gewonnene Dihydro-Follikelhormon weist eine spezifische Drehung von etwa + 800 auf. In konzentrierter Schwefelsäure zeigt es eine bläulich-grüne Fluoreszenz. Gemischt mit der niedriger schmelzenden Modifikation des aus Ketooestrin durch Reduktion gewonnenen Dihydro- hormons, zeigt es keine Schmelzpunkterniedrigung.
Bei der erwähnten Arbeitsweise kann man aus den an Ketohormonen angereicherten Fraktionen auch das Ketooestrin durch Kristallisieren abtrennen. Man kann aber das Ketooestrin von den begleitenden Verunreinigungen und von Hormonen, die die Ketongruppe nicht enthalten, auch in Form von mit Ketonreagenzien gebildeten Derivaten abtrennen.
Diese Vorreinigung mit Ketonreagenzien kann man auch bei den an Dihydro-Follikelhormon angereicherten Fraktionen-vor Abtrennen des Dihydro-Follikelhonnons durch Kristallisieren oder in einem noch früheren Stadium der Auf-
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Beispiel :
1350 kg Urin von trächtigen Stuten werden fünfmal je mit 400 l Benzol ausgerührt und die vereinigten benzolischen Lösungen auf etwa 121 eingeengt, dann mit einer 5%igen Natriumbicarbonat-
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geschüttelt, zu den vereinigten alkalischen Lösungen 3'05l konzentrierte Salzsäure zugesetzt, fünfmal mit je 48l Benzol ausgeschüttelt und das Ausschütteln noch zweimal mit 20l Äther wiederholt.
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mit je 48 l Benzol ausgeschüttelt.
Der benzolisehe Auszug wird zur Trockne verdampft und der Rück- stand bei etwa 1 mm Druck auf dem Wasserbad destilliert, wodurch grosse Mengen von Phenolen entfernt werden. Der Rückstand wird in 1'5 l Äther gelöst, die Lösung filtriert und viermal mit je 2'5 l Normalnatronlauge ausgeschüttelt. Die vereinigten alkalischen Lösungen werden mit Salzsäure auf etwa 0'3 Nonnalitât eingestellt und fünfmal mit je 10 l Benzol ausgeschüttelt und das Ausschütteln noch zweimal mit 5 l Äther wiederholt. Die vereinigten Ätherauszüge werden zur Trockne verdampft und der Rückszand aus Benzol oder Äther oder Alkohol umkristallisiert.
Vor der Umkristallisierung kann man eine Vorreinigung mit Semicarbazid einschalten. Ausbeute etwa 1 g Dihydro-Follikelhormon.