AT214572B

AT214572B - Verfahren zur Gewinnung von Properdin

Info

Publication number: AT214572B
Application number: AT811358A
Authority: AT
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1957-11-22
Filing date: 1958-11-21
Publication date: 1961-04-10

Description

Verfahren zur Gewinnung von Properdin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Properdin aus dieses enthaltenden Substanzen wie menschliche oder tierische Flüssigkeiten einschliesslich Blut u. dgl., insbesondere aus dem mit "Cohn-Fraktion I" bezeichneten Produkt aus tierischem Blut.

Es wurden bereits verschiedene Verfahren zur Gewinnung von geieinigtem Properdin angegeben, sie sind jedoch hinsichtlich des Konzentrations-undReinheitsgrades des erhaltenen Produktes Beschränkungen unterworfen und ausserdem umständlich und langwierig.

Ziel der Erfindung ist ein neues und einfaches Verfahren, bei dem das Properdin, im Vergleich zu seiner Konzentration im Blut od. dgl. angereichert und dann gereinigt wird, wobei ein den bisherigen überlegenes Properdinpräparat erhalten wird.

Properdin ist ein Plasmaprotein, das, gemeinsam mit andern Faktoren, für die baktericide Wirkung des Serums verantwortlich ist. Frühere Beobachtungen ergaben, dass die Anwesenheit des Properdinsystems im Blut von Mensch und Tieren von wesentlicher Bedeutung für deren Immunität gegenüber verschiedenen Formen bakterieller oder sonstiger Einwirkungen zu sein scheint. Beispielsweise sind Meerschweinchen sehr anfällig für Infektionen und ihr Serum enthält nur verhältnismässig geringe Mengen von Properdin, wogegen das Serum der infektions-resistenten Ratte einen sehr hohen Properdingehalt, den höchsten bisher bei Warmblütern festgestellten, aufweist.

Properdin ist normalerweise im menschlichen Blutstrom vorhanden und kann durch den Körper mobilisiert werden. Es scheint, dass Widerstandsfähigkeit gegen Bakterienangriff zum Teil durch das Properdinsystem verliehen wird und dass dieses System als ein von der Natur vorgesehener Mechanismus zu betrachten ist, der der Bakterienwirkung Widerstand entgegenzusetzen hat, solange noch keine Antikörper ausgebildet sind. Daraus ergibt sich die Wichtigkeit eines Properdinpräparates, das wie das erfindungsgemäss herstellbare in erhöhter Konzentration und Reinheit und in einer Form vorliegt, die für die Einführung in das Serum von Warmblütern geeignet ist.

Gemäss der Erfindung wird Blutplasma zunächst dem bekannten Cohnschen Xthanol-Kaltfraktionie- rungsverfahren unterworfen, wobei die in der Fachliteratur als Cohn-Fraktion I bekannte Paste erhalten wird. Diese Paste wird in einem Glycin-Citratpuffer bei einer Temperatur unter 00 C suspendiert, gerührt und das Fibrinogen durch Zentrifugieren unter 00 C entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wird bei einer Temperatur knapp über 00 C mit einer Zinkacetatlösung versetzt, bis eine Konzentration von ungefähr 0, 02 Mol erreicht ist. Vorzugsweise wird die Zinkacetatlösung allmählich unter kräftigem Rühren zugesetzt und die resultierende Lösung während ungefähr 18 Stunden stehen gelassen. Der gebildete Zinkniederschlag wird abdekantiert oder-zentrifugiert.
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gelöst.

Zink und Äthylendiamin-tetraessigsäure werden dann aus der Lösung, vorzugsweise durch Dialyse, entfernt und die resultierende Flüssigkeit mit Natriumtetrametaphosphat versetzt, wobei, nach Herabsetzen des PH beträchtliche Mengen an Material ausgefällt werden, das abzentrifugiert oder in sonstiger Weise abgetrennt wird.

Die nach der Metaphosphatfällung hinterbleibende überstehende Flüssigkeit wird dann annähernd neutral gemacht, wonach die Lösung lyophilisiert wird. Das lyophilisierte Material wird in wenig Wasser

suspendiert und gegen Natriumchlorid od. dgl. dialysiert. Die dialysierte Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt und filtriert, wobei als Endprodukt eine sterile, mit Properdin angereicherte Lösung erhalten wird.

Das nachstehende Beispiel erläutert im einzelnen eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens.

Bei s pie 1 : Gewinnung von Properdin aus Cohn-Praktion I.

1400 1 mit Citrat behandelten Plasmas werden dem Cohn'schen Äthanol-Kaltextraktionsverfahren unterworfen, wobei 20 kg Fraktion I-Paste (rohes Fibrinogen) erhalten werden. Diese Paste wird in 10 Volumina (2001) kaltem (-30 C) Glycinpuffer mit Hilfe eines Waring-Mischers suspendiert. Dieser Puffer hat vorzugsweise folgende Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Natriumcitrat. <SEP> 6H2O <SEP> 1,91 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 13,6 <SEP> g
<tb> Natriumacetat <SEP> . <SEP> 3H2O <SEP> 7,94 <SEP> g
<tb> Glycin <SEP> 75, <SEP> 07 <SEP> g
<tb> Äthanol <SEP> 73, <SEP> 3 <SEP> cms
<tb>
Wasser auffüllen auf 1 Liter, PH mit 0, 4 m Essigsäure auf 6, 0 einstellen.

Die Suspension wird während 2 Stunden bei-30 C gerührt und das Fibrinogen bei -30 C abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird während drei Tagen bei -30 C stehen gelassen, um noch geringe Mengen fibrinogenartiges Material auszufällen. Dieses wird durch Zentrifugieren bei -50 C entfernt und verworfen.
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überstehender Flüssigkeit). Die Zinkacetatlösung wird allmählich unter kräftigem Rühren zugesetzt und die resultierende Lösung während 18 Stunden bei -20 C stehen gelassen. Der Zinkniederschlag wird durch Abdekantieren der Hauptmenge von der überstehenden Flüssigkeit und Zentrifugieren des Restes bei -20C abgetrennt. Die Ausbeute an Zinkniederschlag beträgt 650 g.

Der Zink-Proteinkomplex wird bei Raumtemperatur in 10 Liter 0,25 m Äthylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) bei PH 7, 2 gelöst, was ungefähr 1/2-stündiges Rühren erfordert. Zink und EDTA werden durch Dialyse gegen 0, 15 m Natriumchlorid bei +20 C entfernt. (Drei Wechsel von je 200 l Salzlösung im Verlauf von 72 Stunden.) Eine geringe, nach der Dialyse hinterbleibende Menge von unlöslichem Material wird abzentrifugiert.

Die dialysierte Flüssigkeit wird durch Zusatz von 10% igem Natriumtstrametaphosphat (100 cm3 pro Liter) und anschliessenden Zusatz von 5% tiger Salzsäure bis zu einem PH von 3, 5 bis weiter gereinigt.

Unter diesen Bedingungen fällt eine beträchtliche Menge an festem Material aus. Zur Vollendung der Fällung wird die Lösung während 3 - 4 Stunden bei -20 C stehen gelassen. Der Niederschlag lässt sich leicht durch Zentrifugieren entfernen.

Die von der Metaphosphatfällung hinterbleibende überstehende Flüssigkeit wird mit 1 m Natriumbicarbonat auf PH 7, 0 - 7, 2 eingestellt und die Lösung lyophilisiert. Das lyophilisierte Material wird in 3 1 destilliertem Wasser suspendiert und 1/2 Stunde bei -20 C gerührt.

Diese Suspension wird gegen 0, 15 m NaCl bei +20 C dialysiert. Es werden 2 Wechsel von je 1001 Salzlösung während einer Zeitdauer von 48 Stunden vorgenommen.

Die dialysierte Lösung wird durch Zentrifugieren bei +20 C geklärt und enthält 250 Einheiten Properdin pro cm3 (600 Einheiten Proteinstickstoff pro cm'). Diese Lösung wird durch ein Sterilisierungsfilter wie "R. epublic Nò. S-6" filtriert. Die so erhaltene Lösung enthält 150 Einheiten Properdin pro cm3 bei einer spezifischen Aktivität von 340 Einheiten Proteinstickstoff pro cm. Das Endvolumen beträgt 4 Liter.

Verschiedene andere Wege zur Gewinnung des Properdins aus der überstehenden Flüssigkeit der Metaphosphatfällung wurden mit unterschiedlichem Erfolg eingeschlagen. Fällung mit Ammoniumsulfat (über 500/0ig) und anschliessende Dialyse des erhaltenen Niederschlages ergab ein Material mit einer spezifischen Aktivität von 300 bis 400 Einheiten Protein-Stickstoff pro mg bei Ausbeuten von ungefähr 75 lu, bezogen auf die von der Metaphosphatfällung zurückbleibende Flüssigkeit. Alkoholfällung (15%ig) ergab nur eine 40 %ige Ausbeute.

Insgesamt konnte bisher eine etwa 400-fache Anreicherung in dem Endprodukt erzielt werden.

Das erfindlmgsgemässe Verfahren betrifft somit die Gewinnung von Properdin aus der Cohn-Fraktion I, wobei eine Zinklösung zur Ausfällung einer mit Properdin angereicherten Fraktion verwendet wird, und wobei zur Abtrennung von inerten Proteinen eine Behandlung mit Natrium-tetrametaphosphat vorgesehen ist und der Überschuss an anorganischem Material entfernt wird. Dieses Verfahren ist leichter durchführbar und wesentlich billiger als die früher angewendeten Methoden. Bisher war bekannt, dass Properdin ein Spuren-Protein im Serum ist, das nahezu spezifisch von Zymosan, einem sehr kostspieligen Material aus Hefezellwänden, adsorbiert werden kann.

Ein derartiges Isolierverfahren setzt die Verwendung von frischem Serum oder Plasma voraus, das Magnesium und verschiedene Komplementärstoffe in bestimmter Konzentration enthält und erfordert eine sehr genaue Temperaturkontrolle.

Im Gegensatz hiezu wird gemäss der Erfindung an Stelle von frischem Serum eine billige Waschlösung der Cohn-Fraktion I, welche 7% Alkohol und 1 Mol Glycin je Liter enthält, als Ausgangsmaterial verwendet. Der Properdingehalt dieser Lösung variiert weitgehend je nach seiner ursprünglichen Konzentration in dem bei der Herstellung verwendeten Plasma, es kann jedoch gemäss der Erfindung in jedem Falle eine mehr als 100-fache Anreicherung leicht erzielt werden. Die Verwendung von Zink als Fällungsmittel ermöglicht eine sehr weitgehende Anreicherung des Properdins ; ebenso erweist sich die Verwendung von Natriumtetrametaphosphat als äusserst nützlich für den Anreicherungsvorgang.

Obwohl zu erwarten gewesen wäre, dass das Properdin innerhalb eines eher weiten pH-Bereiches ausgefällt wird, zeigte es sich, dass es tatsächlich innerhalb eines Bereiches von pH 4,2 bis 3, 2 nicht ausgefällt wird, sondern in der flüssigen Phase verbleibt. Der Verfahrensschritt der Fällung mit Natriumtetrametaphosphat kann daher in der Praxis bei einem PH zwischen 4, 2 und 3, 2 durchgeführt werden. Dabei wird aber eine grosse Menge von inertem Protein entfernt und die Reinheit des Endproduktes beträchtlich verbessert.

Die Ausführungen der USA-Patentschrift Nr. 2, 726, 235, in der die Abtrennung von Plasmaprotein unter Verwendung von Natriumtetrametaphosphat beschrieben ist, deuten wohl darauf hin, dass Properdin (das in der Literatur als Beta-Globulinbezeichnet wird) gemeinsam mit den andernBeta-Glubuli- nen ausgefällt wird ; dies trifft jedoch nicht zu, denn tatsächlich findet sich das Properdin innerhalb eines verhältnismässig grossen pH-Bereiches in der überstehenden Lösung.

Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung ist leicht ersichtlich. Das Properdin ist ein Serumprotein, das gemeinsam mit dem Komplement, einem (components of complement) Komplex aus Serumproteinen (C'1. C'2, C'3, C'4), und Magnesium das Properdinsystem bildet, welches normalerweise im Serum von Mensch und Tieren anwesend ist. Dieses System besitzt in vitro die Fähigkeit, abnormale Erythrocyten zu zersetzen., Bakterien zu zerstören, Protozoen zu töten und gewisse Virusarten zu inaktivieren. Diese wertvolle Substanz kann nunmehr nach dem erfindungsgemässen Verfahren mit erheblich niedrigeren Kosten gewonnen werden.

Es wurde gefunden, dass nach dem oben beschriebenen Verfahren eine Properdinlösung erhalten werden kann, welche mehrere hundert Properdin-Titereínheiten pro mg enthält und einen Reinheitsgrad entsprechend mindestens mehreren hundert Einheiten Protein-Stickstoff pro mg aufweist.
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schrieben.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem und konzentriertem Properdin, dadurch gekennzeichnet, dass Cohn-Fraktion L gegebenenfalls nach Entfernung des Fibrinogens, mit einer Zinksalzlösung, vorzugsweise einer Zinkacetatlösung, behandelt, der gebildete, Properdin enthaltende Niederschlag ab getrennt und in wässeriger, annähernd neutraler Äthylendiamin-tetraessigsäurelösung gelöst wird, worauf die gegebenenfalls zwecks Entfernung von Zink und Äthylendiamin-tetraessigsäure dialysierte Lösung mit Natriumtetrametaphosphat versetzt, die nach Ansäuern ausgefallenen inerten Proteine entfernt werden und das Filtrat gegebenenfalls weiter gereinigt wird.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass die Cohn-Fraktion I vor Zusatz der Zinksalzlösung bei einer Temperatur unter 00 C in einem Alkohol-Glycinpuffer suspendiert und aus dieser Suspension das unlösliche Fibrinogen bei einer Temperatur unter 00 C entfernt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Natriumtetrametaphosphat versetzte Lösung mit Salzsäure auf ein PH zwischen ungefähr 3, 2 - 4, 2 eingestellt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, dass man das Filtrat des <Desc/Clms Page number 4> EMI4.1 und durch anschliessende Dialyse und bzw. oder Klären und Filtrieren weiter reinigt bzw. konzentriert.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man ein gegebenes Volumen der Cohn-Fraktion I in ungefähr 5 - 10 Volumina eines Glycin-Citratpuffers folgender Zusammensetzung suspendiert : EMI4.2 <tb> <tb> Natriumcitrat. <SEP> 6t% <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 91 <SEP> g <tb> Natriumchlorid <SEP> 13, <SEP> 6. <SEP> g <tb> Natriumacetat. <SEP> 3H2O <SEP> 7, <SEP> 94 <SEP> g <tb> Glycin <SEP> 75. <SEP> 07 <SEP> g <SEP> <tb> Äthanol <SEP> 73,3 <SEP> ems <tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> Liter <SEP> ;

<SEP> <tb> das PH bei unter 0 C mit 0,4 m Essigsäure auf 6,0 einstellt, aus dieser Suspension das unlösliche Fibrinogen bei einer Temperatur unter 00 C entfernt, die verbleibende Flüssigkeit mit einer ungefähr 1 m Zinkacetatlösung versetzt, den Zinhniederschlag entfernt und in ungefähr 1/4 m Äthylendiamintetraessigsäure bei einem PH von ungefähr 7, 2 löst, Zink und Äthylendiamin-tetraessigsäure durch Dialyse gegen ungefähr 0, 15 m Natriumchlorid entfernt, die dialysierte überstehende Flüssigkeit mit Natriumtetrametaphosphat versetzt, das pq mittels Salzsäure auf ungefähr 3, 5 - 4 einstellt, den Niederschlag entfernt, die verbleibende Flüssigkeit auf ein PH von ungefähr 7 einstellt, lyophilisiert, hierauf gegen ungefähr 0,15 m Natriumchlorid dialysiert,

klärt und durch steriles Filtrieren ein gereinigtes, konzentriertes Properidinpräparat gewinnt.