AT215076B - Verfahren zur Herstellung eines neuen fungiciden Antibiotikums - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Herstellung eines neuen fungicide Antibiotikums 
Die Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung von   fungieid und antibiotisch wirkenden   Stoffen. 



   Es wurde gefunden, dass ein aus   Wüstensand   isolierter Streptomycetenstamm, welcher in dem pharmazeutischen Institut der Medizinischen Fakultät der Universität in   Debreezin unter   der Bezeichnung   "Streptomyces     Sua 3    hinterlegt wurde, ein fungicid wirkendes Antibiotikum erzeugt. Der neue Stamm SA-IX-3 hat den Namen   Streptomyces   Flavofungini n. sp. erhalten. 



   Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums (Flavofun- 
 EMI1.1 
 lierung des Antibiotikums nach an sich bekannten Methoden, und ist dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces   Flavefungini   bzw. seine Mutanten oder Varianten vorzugsweise submers bei Temperaturen von etwa 26 bis   29    C und einem pH-Wert von etwa 8 bis 8 zweckmässig bei Zusatz von   Sehaumverhin-   
 EMI1.2 
 gene Hefen und hefeartige Pilze, Dermatophytes und Fadenpilze. 



   Die charakteristischen morphologischen und   biochemischen Eigenschaften desStreptomycesFlavofun-   gini sind aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich : 
 EMI1.3 
 
<tb> 
<tb> Czapek-Dox <SEP> gutes <SEP> Wachstum, <SEP> gelbgrüne, <SEP> runzelige <SEP> hyaline
<tb> Glucose <SEP> Agar <SEP> Kolonien, <SEP> keine <SEP> Sporen
<tb> Czapek-Dox-Agar <SEP> grüngelbe <SEP> Kolonien <SEP> mit <SEP> fleckigen <SEP> weissen
<tb> mit <SEP> Saccharose <SEP> Luftmycelen
<tb> Czapek-Dox-Agar <SEP> lebhaft <SEP> grüne <SEP> runzelig <SEP> hyaline <SEP> Kolonien,
<tb> glyzerinhaltig <SEP> keine <SEP> Sporen
<tb> Asparagin-Glucose-Agar <SEP> grüngelbe, <SEP> trockene <SEP> Kolonien, <SEP> gekraust
<tb> Hefe-Glucose-Agar <SEP> blassgelbe <SEP> Kultur, <SEP> trockene <SEP> runzelige <SEP> Kolonien
<tb> Nähragar <SEP> blassgelbe <SEP> hyaline <SEP> Kultur,

   <SEP> gelblich-braunes
<tb> Exopigment
<tb> Blutagar <SEP> grünliche <SEP> hyaline <SEP> Kolonien, <SEP> verdauen <SEP> kein <SEP> Blut
<tb> Loeff1er <SEP> Serum <SEP> gelbe <SEP> feuchte <SEP> Kultur <SEP> mit <SEP> ausgiebiger <SEP> brauner
<tb> Pigmenterzeugung, <SEP> mässige <SEP> Verflüssigung
<tb> Stärkeagar <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> blassgelbe <SEP> hyallne <SEP> Kolonien, <SEP> wenige <SEP> weisse <SEP> Sporen
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> Sabouraud-Agar <SEP> schöne <SEP> grüngelbe <SEP> Kultur, <SEP> trockene <SEP> runzelige
<tb> Kolonien
<tb> Kalzium-Malat <SEP> Agar <SEP> mittelmässiges <SEP> Wachstum, <SEP> grüngelbe <SEP> Kolonien
<tb> Sojamehl-Agar <SEP> ausgiebiges <SEP> Wachstum, <SEP> grüngelbe <SEP> runzelige <SEP> Kolonien
<tb> Cornsteep <SEP> Agar <SEP> *)

   <SEP> blassgelbe <SEP> hyaline <SEP> Kultur <SEP> 
<tb> Kartoffel-Agar <SEP> grünliche <SEP> hyaline <SEP> Kultur
<tb> Maische-Agar <SEP> **) <SEP> grünliche, <SEP> starkrunzelige <SEP> bröckelige <SEP> Kolonien
<tb> Bouillon <SEP> grünliche, <SEP> starkrunzelige <SEP> bröckelige <SEP> Kolonien
<tb> Glucose-Bouillon <SEP> grünliche, <SEP> starkrunzelige <SEP> bröckelige <SEP> Kolonien
<tb> Kartoffel-Schnitzel <SEP> grünlichgraue, <SEP> bröckelige, <SEP> feuchte <SEP> Kultur, <SEP> 
<tb> braungerändertes <SEP> Pigment
<tb> Gelbe <SEP> Rüben-Schnitzel <SEP> schwache, <SEP> gelbliche <SEP> bröckelige <SEP> Kultur
<tb> *)Cornsteep <SEP> Agar <SEP> :

   <SEP> **) <SEP> Maische-Agar:
<tb> Agar-Agar <SEP> 20 <SEP> g <SEP> Maischeextrakt <SEP> 900 <SEP> ml
<tb> Pepton <SEP> 5g <SEP> Hefeextrakt <SEP> 100ml
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> 15 <SEP> g <SEP> Pepton <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 
<tb> NaCl <SEP> 5g <SEP> Na2HPO4 <SEP> 10g
<tb> Glucose <SEP> 10g <SEP> KH2PO4 <SEP> 20g
<tb> Dest. <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> g
<tb> 
 
Einwiegen, 1 Stunde stehen lassen, dann kochen, aber nicht unter Druck. Den   pa-Wert   auf 7,8 einstellen. Filtrieren durch wattierte Gaze, dann bei 1, 5 at sterilisieren. 



   Das   erfindungsgemässe Antibiotikum   verdaut koagulierte Eier   nicht ; die Milchkoagulation   ist schwach und benötigt lange Zeit. Das Antibiotikum koaguliert die   Lakmusniilch   etwas langsamer, sodann   pepteni-   
 EMI2.2 
 
NOSlyse ist negativ. 



   Die antibiotische Wirkung des Flavofungins auf verschiedene Pilze wird durch die folgende Tabelle gezeigt : 
 EMI2.3 
 
<tb> 
<tb> I. <SEP> Hefen <SEP> und <SEP> hefeattige <SEP> Pilze: <SEP> Inhibitiotrskonzentration
<tb> y/nd
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 4
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 4
<tb> Candida-Krusei <SEP> 6
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 3
<tb> Sacharomyces <SEP> niger <SEP> 2
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> 2
<tb> Rhodotorula <SEP> sp. <SEP> 2
<tb> Torulopsis <SEP> puleherrima <SEP> 2
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 II.

   Fadenpilze : 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Aspergillus <SEP> elavatus <SEP> 15
<tb> Penicillium <SEP> sp. <SEP> 10
<tb> Penicillium <SEP> sp. <SEP> 20
<tb> Scopulariopsis <SEP> sp. <SEP> 15
<tb> Cephalosporium <SEP> sp. <SEP> 15
<tb> Phialophora <SEP> verrucosa <SEP> 20
<tb> Monosporium <SEP> apiospermum <SEP> 15
<tb> Helminthosporium <SEP> sp. <SEP> 10
<tb> Trichothecium <SEP> roseum <SEP> 15
<tb> Mastigocladium <SEP> 10
<tb> Geotrichum <SEP> sp. <SEP> 20
<tb> III. <SEP> Pathogene <SEP> Pilze <SEP> :

   <SEP> Inhibitionskonzentration <SEP> 
<tb> 1/mi
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 20
<tb> Trichophyton <SEP> tonsurans <SEP> 30
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> (2 <SEP> Stämme) <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> gypseum <SEP> (2 <SEP> Stämme) <SEP> 20
<tb> Trichophyton <SEP> purpureum <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> cerebriforme <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> sulphureum <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Epidermophyton <SEP> K.-W- <SEP> (2 <SEP> Stämme) <SEP> 20
<tb> Epidermophyton <SEP> K.-W-15
<tb> Epidermophyton <SEP> inguinale <SEP> 10
<tb> Microsporum <SEP> canis <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Microsporum <SEP> gypseum <SEP> (von <SEP> Menschen) <SEP> 10
<tb> Microsporum <SEP> gypseum <SEP> (aus <SEP> Erde)

   <SEP> 50
<tb> Achorion <SEP> Quinkeanum <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Keratinomyces <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> 10
<tb> Sporotrichum <SEP> schenkii <SEP> 10
<tb> Nocardia <SEP> asteroides <SEP> 20
<tb> Hormodendrum <SEP> compactum <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> 
 
Die Aktivität desFlavofungin wurde mit Nystatin durch die Pfizer Corporation gegen 47 verschiedele Pilze untersucht. Aus dem Resultat ist ersichtlich, dass das Flavofungin ein breites fungicides Spek-   zum gegen verschiedene Pilze besitzt.

   Die tieferstehende Tabelle führt die fungistatischeninhibitions- {onzentrationen an,"ti"bedeutet, dass eine teilweise Inhibitionswirkung erzielt wurde.   

 <Desc/Clms Page number 4> 

 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Pilze <SEP> : <SEP> Nystatin <SEP> Flavcfungin
<tb> Einheiten/ml <SEP> g/ml
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Blastomyces <SEP> brasiliensis <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Blastomyces <SEP> dermatitidis <SEP> 1000 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> sulfureum <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Sporotrichum <SEP> schenldi <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Hormodendrum <SEP> compactum <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> 10 <SEP> ti <SEP> 10
<tb> Phialophora <SEP> verrucosa <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 8 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> - 

  <SEP> Trichophyton <SEP> gypseum <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 1000 <SEP> 100'
<tb> Pityrosporum <SEP> ovale- <SEP> Traub <SEP> 100 <SEP> 10. <SEP> ti <SEP> 
<tb> Pityrosporum <SEP> ovale <SEP> 12078 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> ti
<tb> Torulopsis <SEP> albida <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> ti
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Botyrytis <SEP> allii <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Neocosmospora <SEP> vasinfecta <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Fusarium <SEP> oxysporum <SEP> 1000 <SEP> 10
<tb> Helminthosporium <SEP> victoria <SEP> 100 <SEP> ti <SEP> 100 <SEP> ti
<tb> Pythium <SEP> debarynum <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> 10 <SEP> ti <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> steckii <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> frequentans <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> citrinum <SEP> 100 

  <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> finiculosum <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> nidulans <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> soppi <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Aspergillus <SEP> terreus <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Paecilomyces <SEP> varioti <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> flavus-oryzae <SEP> Gruppe <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Hormodendron <SEP> sp.

   <SEP> (Wehmyer) <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Mucor <SEP> Mucedo <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> oxalicum <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Schizosaccharomyces <SEP> octosporus <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Pullularia <SEP> pullulans <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Byesochlamys <SEP> fulva <SEP> 10 <SEP> ti <SEP> 10 <SEP> ti
<tb> Cladosporium <SEP> herbarum <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> ti
<tb> Cladosporium/Hormodendron/cladosporoides <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Endomyces <SEP> fibuliger <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Margarinomyces <SEP> bubaki <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Oospora <SEP> lactis <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> digitatum <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 Toxizität bei   Mäusen :

   a)   In subkutaner   wässeriger   Suspension 250 mg/kg verursacht weder akute, noch nachträgliche Symptome. b) Per os : in wässeriger Suspension mit Magensonde einge- führt 250 mg/kg, verursacht weder akute, noch nachträg- liche Symptome. 
 EMI5.1 
 
Therapeutisches Experiment : Mäuse wurden mit Candida albicans und gleichzeitig mit
Oxytetracyklin gefüttert. Das Flavofungin wurde per os
100 mg/kg zweimal verabreicht. Nach dieser Behandlung wurde im Feces der Mäuse gar keine, oder nur wenige Ko- lonien der Candida albicans gefunden. 



   Der   Streptomycetenstamm   SA-IX, vorteilhaft der Stamm SA-IX-3 wird unter Rühren und Belüftung submers in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenhydratquelle, wie z. B. Zucker, Stärke, weiters eine organische Stickstoffquelle, ferner anorganische Salze enthält. Die Zubereitung des Impfstoffes und die Gärung wird vorteilhaft wie folgt ausgeführt :
Der bei der Gärung angewandte Stamm wird in einen festen Nährboden eingeimpft, z. B. in einen   asparaginhältigenNährboden.   Die Kultur wird mehrere Tage lang bei 270 C geztichtet und dann wird zum Einimpfen eines flüssigen Nährbodens, welcher ebenfalls Asparagin enthält, verwendet. Dieser Nährboden besteht vorteilhaft ausHefeextrakt, welcher neben Asparagin anorganische Nitrate, Phosphate, ferner Ma-   gnesiumsulfat   und Kaliumchlorid enthält.

   Diese Kultur verwendet man um in Schüttelkolben einzimpfen, in welchen dieselben für 3 - 4 Tage bei 270 C gezüchtet werden. Diese Kultur hat eine lebhaft grünlichgelbe Farbe. Der bei der Gärung verwendete Impfstoff wurde von diesem Zwischenimpfstoff in einem Nährboden gezüchtet, der als organische Stickstoffquelle Pepton, als Kohlenhydratquelle Zucker oder Glycerin, weiters anorganische Salze enthält. Das   Züchten wurde   bei 270 C   36 - 46   Stunden lang durchgeführt, wobei eine blassgelbe, dicke   Mycelmasse   gebildet wurde. 



   Von diesem Impfstoff wurde   5 - 100/0   auf den Nährboden berechnet verwendet. Die Gärung wurde bei   270   C unter Rühren und Belüftung durchgeführt. Nach 48 Stunden wurde die Gärflüssigkeit gelb, woraus man auf die Bildung von Flavofungin schliessen kann.   DieGärung   wurde 80 - 90 Stunden lang fortgesetzt. 



  Die Erzeugung vonFlavofungin kann biologisch durch Candida Albicans, oder durch das Ultraviolett-Spek- 
 EMI5.2 
 ten und Temperaturen bezeichnen die optimalen Bedingungen, von welchen Bedingungen auch Abweichungen auftreten können, wie dies bei biologischen Vorgängen oft der Fall ist. Im Laufe der Gärung   - falls nötig-kann   ein schaumbildungsverhinderndes Mittel, z. B.   Pflanzenöl   zugefügt werden. 



   Falls die Gärflüssigkeit grössere Mengen   schaumbildungsverhindernder Stoffe enthält,   wird nach Beendigung der Gärung Chlorkohlenwasserstoff, z. B. Chloroform hinzugefügt, um den schaumhindernden Stoff zu lösen, wonach die Gärflüssigkeit filtriert wird. Das erzeugte Antibiotikum, zusammen mit dem Mycel verbleibt auf dem Filter. Falls   diegärflüssigkeit   keine, oder ganz geringe Mengen schaumhindern-   der Stoffe enthält,   so braucht man keine organischen Lösungsmittel hinzufügen, sondern es kann die Gärflüssigkeit unmittelbar filtriert werden. 



   Die beim Filtrieren erhaltene nasse Mycelmasse wird mit einem heissen Ester, vorteilhaft mit Äthylacetat extrahiert. Aus diesem Lösungsmittel erhält man nach Abtreiben des Lösungsmittels das Antibiotikum als sehr reine Kristalle. 
 EMI5.3 
 :0 = 27, 7% als Differenz 
Die dementsprechende empirische Formel    chez  
Wahrscheinliches Molekulargewicht : 568 
Das erhaltene Produkt ist gelb, in konz. Salzsäure oder konz. Schwefelsäure gelöst, hat eseine rote Farbe, welche in das Bräunliche übergeht.

   Es ist gut löslich in Eisessig, Pyridin   und Dimethylformsmid,   ziemlich gut löslich in niederen Alkoholen, in Äthylacetat und andern Estern, sehr schlecht löslich in 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 
 EMI6.1 
 sindtraviolett-Absorptionsspektrum wird durch Fig. 1 der Zeichnung veranschaulicht, wogegen Fig. 2 das Ultrarot-Absorptions-Spektrum zeigt. 



   Das Antibiotikum entfärbt Kaliumpermanganat-und Brom-Lösung und kann katalytisch hydriert werden. Bei der Hydrierung verliert das Antibiotikum seine Farbe und seine biologische   Aktivität.   Das Anti biotikum kann acyliert und bromiert werden. Gemäss durchgeführten Untersuchungen enthält es 4 oder 5 Doppelbindungen und    zwei C-CH   Gruppen. Das Molekulargewicht des bromietten weissen amorphen Derivates beträgt etwa 892. Man erhält dieses Produkt, wenn man zu der Ätherlösung des Flavofungins unter Eiskühlung und Rühren Brom in Ätherlösung tropfenweise hinzufügt. Aus wasserhaltigem Äthanol umgelöst 
 EMI6.2 
 



   Die antibiotische Aktivität des kristallinen Flavofungins wird in Anwesenheit von Sauerstoff, und insbesondere in Anwesenheit von Sauerstoff und Feuchtigkeit allmählich vermindert. Der freien Luft ausgesetzt, verliert es binnen 2 Wochen   50%   seiner Aktivität. In einer Stickstoff- oder Kohlensäureatmosphäre kann es gelagert werden, ohne seine Aktivität einzubüssen. 



   Nachstehend sind einige Beispiele des erfindungsgemässen Verfahrens angeführt. 



     Beispiel l :   a) Herstellung des Vorimpfstoffes. 
 EMI6.3 
 werden lwird auf 7 eingestellt. Die Lösung wird sterilisiert und von einer ebenfalls sterilisierten   40% gen   Glykoselösung so viel hinzugefügt, bis der Glykosegehalt des   Nährbodens 2%   beträgt. Die Lösung wird sodann mit sterilem Wasser zu 500 ml aufgefüllt. Dieser Nährboden wird mit Streptomyces Flavofungini n. sp. geimpft, welche man auf einem Schrägnährboden gezüchtet hat. Die Züchtung erfolgt dann bei 270 C während 80 Stunden in geschüttelten Kolben. b) Herstellung des Impfstoffes. 
 EMI6.4 
 36 Stunden lang in geschüttelten Kolben gezüchtet. Nach 36 Stunden wurde die Farbe der Flüssigkeit blassgelb und enthielt eine grosse Menge Mycelien ; der pH-Wert blieb unverändert. c) Gärung. 



   6 Glasfermentoren von jel21Nutzraum wurden mit einem sterilisierten Nährboden folgender Zusammensetzung gefüllt : 
 EMI6.5 
 
<tb> 
<tb> Glycose <SEP> (100%) <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 
<tb> Pepton <SEP> 0, <SEP> 25%
<tb> MgSO4#7H2O <SEP> 0,05%
<tb> Na <SEP> HPO <SEP> 0, <SEP> 50% <SEP> 
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,05%
<tb> 
 
 EMI6.6 
 wurde in 6 gleiche Teile geteilt und in die   Fermentoren   zugemessen. Die Gärung wurde bei 270 C durchgeführt, unter Rühren (Drehzahl 240). Die eingeführte Luft betrug auf   11 Nährboden   berechnet 0,   51   pro Minute. Um das Schäumen zu verhindern, wurde am Anfang der Gärung je   etwa   20 ml Sonnenblumenöl in jeden Fermentor   eingeführt   und dann gegen Ende der   Gärung weitere   20 ml in kleineren Portionen hinzugefügt.

   Schon nach 48 Stunden wurde die Farbe der   Gärflüssigkeit   lebhaft gelb und das Medium wurde dickflüssig. Die in den 36, 60 und 84 Stunden entnommenen Proben zeigten 0,55g/1, 1,25 g/1 bzw. 1,55 g/l reinen Flavofungingehalt. Die im Laufe der Gärung alle 12 Stunden vollzogene Sterilitätsprüfung bezeugte, dass die Gärung durchgehends steril abläuft. Der Zuckergehalt des   Nährbodens   verminderte sich in der 84. Stunde bereits auf 0,   - dans   Fortsetzen der Gärung war danach nicht begründet. d) Aufarbeitung der Gärflüssigkeit. 



   70   I   mycelhältige Gärflüssigkeit wird filtriert, wobei auf dem Filter 4 kg feuchtes, grünlichgelbes, festes Material zurückbleibt. Dieses wird unter   Rückflusskühler   1/2 Stunde lang mit   4 1   Äthylacetat ge- 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 kocht, danach das Äthylacetat vom Mycel abfiltriert und das Kochen mit je 4   l   Äthylacetat fünfmal wiederholt. Das vereinigte Filtrat wird in Vakuum bei   40 - 500   C bis zur Trübung eingeengt ; man erhält etwa   5 I   konzentrierte Lösung. Auf Zimmertemperatur abgekühlt, scheidet sich das Flavofungin in kristalliner Form aus. Die Kristalle werden filtriert, mit kaltem Azeton und kaltem Äther gewaschen und in Vakuum getrocknet. Man erhält 104 g gelbes, kristallines Produkt.

   Nach weiterem Einengen der Mutterlauge kann noch 6 g Flavofungin gleicher Reinheit gewonnen werden. 



     Beispiel 2 : 40 l Gärflüssigkeit   wird laut Beispiel 1 hergestellt, mit dem Unterschied, dass aU schaumbildungshinderndes Mittel eine grössere Menge Sonnenblumenöl im Laufe der Gärung hinzugefügt wird. Die Gärflüssigkeit wird filtriert. Zu dem Filtrat, das keine Mycelien, aber Sonnenblumenöl enthält, werden 5   Vor. -0/0   Chloroform hinzugefügt und gerührt. Nach Absonderung der zweiFlüssigkeitsphasen fällt das Flavofungin   am Rand der Chloroformphase   aus. DieseChloroformphase wird abgesondert und geschleudert. Von der so erhaltenen festen Flavofunginmasse wird das noch verbliebene Chloroform in Vakuum abgetrieben, und der trockene Rückstand mit 400   m1   Aceton verrieben. Das im warmen Aceton aufgelöste Flavofungin scheidet sich nach Abkühlen kristallin aus.

   Es wird filtriert, mit kaltem Aceton gewaschen und aus   5 l wässerigem   Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 38 g reines, kristallines Flavofungin. 



   Das durch Filtrieren erhaltene Mycel - dessen Nassgewicht ungefähr 2,5 kg   beträgt-wird   zehnmal mit je   2 1   kaltem Methanol verrieben und jedesmal filtriert. Die vereinigten Filtrate werden zu etwa   5 1   eingedampft, woraus das rohe Flavofungin kristallin ausfällt. Aus Äthylacetat umkristallisiert erhält man 16 g reines Flavofungin. 



   Um weiteres Flavofungin zu erhalten, wird die methanolhältige Mutterlauge auf etwa 2 1 eingeengt, 300 ml Wasser hinzugefügt und das Gemisch auf 200 ml eingeengt. Nach Kühlen wird dieses Konzentrat mit 11 Butanol extrahiert und derButanolextrakt zu einer sirupartigen Masse konzentriert, deren Volumen etwa 200 ml beträgt. Durch Hinzufügen von 800 ml Äthylacetat werden die begleitenden Verunreinigungen ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Schleudern abgesondert und die Äthylacetatlösung zu einer sirupartigen Masse eingeengt. Dann werden 600 ml Petroläther hinzugefügt. 



   Das ausgefällte, rohe, nicht kristalline Flavofungin wird aus Aceton und dann aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei man weitere 16 g reines Flavofungin erhält. So erhält man insgesamt 70 g Flavofungin. 



     Beispiel 3 : Man verfährt wie inBeispiel l,   mit dem Unterschied, dass zu   70 I mycelhältiger G r-   flüssigkeit-deren pH mit Phosphorsäure auf   5 - 6   eingestellt wurde - 3, 5 1 Chloroform   (5%   auf die 70   l   gerechnet) hinzugefügt werden. Nach kräftigem Rühren wird das Gemisch filtriert. Das feuchte Mycel - 4 kg-wird nach Beispiel 1 bearbeitet. Ausbeute : 110 g gelbes, kristallines Produkt. Nach Konzentrieren der Mutterlauge erhält man weitere 5 g kristallines Produkt gleicher Reinheit. 



   Beispiel4 :KatalytischesHydrierendesFlavofungins. 



   2,5 g   Pal1adium-Kohle-Katalytor   wird in 50   m1   abs. Äthanol suspendiert und mit Wasserstoff gesättigt. 5,0 g kristallines Flavofungin wird in einem Gemisch von 315 ml abs. Äthanol und 20 ml Wasser gelöst. Die beiden Lösungen werden vereinigt und Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Binnen 20 Minuten wird 429 ml Wasserstoff bei 22, 10 C und 764 mm Druck verbraucht. Bei weiterem Hydrieren während 72 Minuten wird noch 54,4 ml Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung in Vakuum bei 450 C zur Trockne verdampft.   5, 19   g glasartiger Rückstand wird erhalten. Aus einem Gemisch von 100 ml Methanol und 150 ml Wasser umkristallisiert erhält man 3, 95 g weisse Nadeln.

   Noch zweimal umkristallisiert erhält man ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von   149 -   1510 C. Bei der Hydrierung wird etwa 5 Mol Wasserstoff, gerechnet auf 1 Mol Flavofungin, verbraucht. 
 EMI7.1 
 Essigsäureanhydrid und 5 ml Pyridin gelöst und   2-3   Tage lang stehen gelassen, danach zur Trockne verdampft. Die Lösungsmittelspuren werden durch Destillation mit viermal 5 ml Äthanol in Vakuum entfernt. 
 EMI7.2 
 ginmolekül 7 alkoholische Hydroxylgruppen enthält. Das acetylierte Produkt ist nicht empfindlich gegen Sauerstoff. 



   Das acetylierte Produkt kann folgenderweise desacetyliert werden : 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 
 EMI8.1 
 wird 60   ml 25'% Kaliumhydroxyd beigefügt   und 2 Tage lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, danach mit   10vlo   Salzsäure bei Eiskühlung neutralisiert. Die erhaltene Lösung wird auf   2/3   ihres Volumens eingeengt. Nach Kühlen scheidet sich das Flavofungin in kristalliner Form aus, welches dieselben biologischen und physikalischen Eigenschaften aufweist, wie vor der Acetylierung. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen fungicide Antibiotikums (Flavofungin) durch Züchtung eines Streptomycetenstammes in einem wässerigen Medium und anschliessende Isolierung des Antibiotikums nach an sich bekannten Methoden, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces Flavofungini bzw. seine Mutanten oder Varianten vorzugsweise submers bei Temperaturen von etwa 26 bis 290 C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 zweckmässig bei Zusatz von Schaumverhinderern züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet ist und das Antibiotikum durch Extraktion mittels eines in Wasser unlöslichen bzw. teilweise   löslichen,   organischen Lösungsmittels aus dem Gärmedium, gegebenenfalls nach Abtrennung des Mycels aus dem Kulturfiltrat und aus dem Mycel gewinnt.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Gärungsmedium vor oder nach Abtrennung des Mycels mit Chlorkohlenwasserstoffen extrahiert, die an der Grenzfläche des organischen Lösungsmittels ausgeschiedene feste Phase absondert und aus dieser das Antibiotikum mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Äthylacetat extrahiert.