AT231611B

AT231611B - Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren

Info

Publication number: AT231611B
Application number: AT868560A
Authority: AT
Inventors: Hans Albert Dr Offe; Wilfried Dr Kaufmann; Klaus Dr Bauer
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1959-12-04
Filing date: 1960-11-22
Publication date: 1964-02-10

Description

Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren
Es wurde vorgeschlagen, 6-Acylaminopenicillansäuren dadurch herzustellen, dass man auf 6-Aminopenicillansäure in Gegenwart von Carbonsäuren, deren Salzen oder Derivaten bei pH-Werten von höchstens 6, 5, vorzugsweise höchstens 5, 0, Bakterien bzw. aus diesen gewonnene Extrakte, Enzyme oder Enzymanreicherungen einwirken lässt, die fähig sind, Phenylessigsäure mit der Aminogruppe der 6-Aminopenicillansäure amidartig zu verknüpfen. Als geeignete Carbonsäurederivate hatten sich u. a. Acylglycokolle oder Acylglutaminsäuren erwiesen.

Es wurde nun gefunden, dass man manche 6-Acylaminopenicillansäuren in wesentlich höherer Ausbeute erhält, wenn man 6-Aminopenicillansäure mit Carbonsäureestern von Hydroxy- oder Mercaptoverbindungen, insbesondere von Hydroxy- oder Mercaptocarbonsäuren oder ihren Derivaten umsetzt, u. zw. in Gegenwart von Bakterien, bzw. aus diesen gewonnenen Extrakten, Enzymen oder Enzymanreicherungen, die fähig sind, Phenylessigsäure mit der Aminogruppe der 6-Aminopenicillansäure amidartig zu verknüpfen.

Als 6-Aminopenicillansäure können sowohl die synthetische oder die durch Abbau gewonnene, kristallisierte Substanz oder gegebenenfalls angereicherte rohe Lösungen, wie sie aus Fermentationen oder ändern Prozessen anfallen, benutzt werden.

Hydroxy- und Mercaptoverbindungen im Sinne der Erfindung sind Alkohole, Mercaptane, Phenole und Thiophenol. Beispiele für Alkohole sind Äthanol, Butanol, Dodecylalkohol, Cyclohexanol, Phenylmethylcarbinol und Glykolsäure. Geeignete Mercaptane sind Mercaptobenzthiazol, Thioglykolsäure, 2-Mercaptobuttersäure und Cysteamin.
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Frage.

Beispiele brauchbarer Verbindungen sind Phenylessigsäurethiophenolester, Phenoxyessigsäuremethylester, a - Phenoxypropionylthioglykolsäure, o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäureamid, p-Chlorphenoxyacetylthioglykolsaures Natrium.

Besonders geeignet sind Carbonsäureester von solchen Alkoholen und Mercaptanen, die wieder Carboxylgruppen tragen, beispielsweise Carbonsäureester von Glykol- und Thioglykolsäure.

Die Gegenwart der genannten Bakterien oder Enzyme ist erforderlich, da die Carbonsäureester in wässerigem Milieu bei PH 4-8 allein nicht in der Lage sind, 6-Aminopenicillansäure zu den erwünschten 6-Acylderivaten zu acylieren. Vergleichsversuche haben ergeben, dass beispielsweise a - Phenoxypropio- nylthioglykolsäure, bei PH 4-8 mit 6-Aminopenicillansäure behandelt, keine a- Phenoxypropionyl-
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Vielmehr sind bereits Bakterienzellen, die diese Enzyme enthalten, oder ihre Lysate als reaktionsbedingende Agentien verwendbar.

Geeignete Bakterien können leicht aufgefunden werden, indem man eine l'% ige wässerige Lösung von Kaliumphenylacetat, die 0, 0251o 6-Aminopenicillansäure enthält, auf PH 4,5 bringt und mit einer Suspension der zu prüfenden Bakterien versetzt. Findet man nach einer 2stündigen Bebrütungszeit bei

3'7 C in 1 cm der Lösung mehr als 10 Einheiten Penicillin G, so sind die Bakterien zu dieser Synthese geeignet. Vor allem sind diejenigen Bakterien zur Synthese befähigt, die bei höheren pH-Werten die
Amidbindung in der 6-Stellung des Penicillinmoleküls unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure angrei- fen.

Man kann deshalb auch so vorgehen, dass man die gleichen Bakterien zunächst zur Abspaltung von i 6-fAminopenicillansäure aus Penicillin und sodann zur Acylierung von 6-Aminopenicillansäure verwendet.

Als geeignet zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens haben sich beispielsweise die im folgenden genannten Bakterienarten erwiesen : 1. Pseudomonas aureofaciens 2. Pseudomonas fluorescens 3. Pseudomonas aeruginosa 4. Alcaligenes faecalis 5. Escherichia coli 6. Aerobacter aerogenes 7. Serratia marcescens 8. Proteus rettgeri 9. Proteus OX 19 10. Samonella 11. Shigella 12. Micrococcus roseus 13. Micrococcus lysodeicticus 14. Sarcina lutea 15. Arthrobacter 16. Bacillus subtilis var. niger 17. Mycobacterium phlei
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Ein besonderer Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist es ferner, solche 6-Acylaminopenicillansäuren mit den wertvollen antibiotischen Eigenschaften der Penicilline in hoher Ausbeute darzustellen, die durch Fermentation mit penicillinbildenden Pilzen in Gegenwart der entsprechenden Carbonsäuren (sogenannten Praecursoren) nicht entstehen.

B e i s p i e l 1: 160 1 2 Vol.-%ige Maisquellwasserlösung, enthaltend 0, 2% Kaliumphenylacetat werden mit Kaliumhydroxydlösung auf PH 7, 0 eingestellt und 30 min auf 1200C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und 40 min bei 1100C im Fermenter sterilisiert. Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400 cms einer 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC 11 105 beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150 1 Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet
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Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 11/15 m Phosphatpufferlösung von PH 6,0 gewaschen und nach dem Abzentrifugieren zu einer dichten Suspension in 1/15 m Phosphatpufferlösung von PH 6, 0 resuspendiert.

Dieser Suspension setzt man 0, 125% 6-Aminopenicillansäure, 0, 50/0 &alpha;-Phenoxypropionylthioglycol- säure und 0,1% Toluol zu. Das Reaktionsgemisch wird dann mit konzentrierter Sodalösung auf PH 6,5 eingestellt und 1 h bei 370C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 884 Einheiten Penicillinaktivität pro cm, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac. subtilis ATCC 6633.

Diese Penicillinaktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen &alpha;-Methylphenoxy- acetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Herstellung der a-Phenoxypropionylthioglycolsäure : in 200 cm 4, 4%ige Natronlauge werden 9,2 g Thioglykolsäure gelöst. Zu dieser Lösung gibt man unter Einleiten von Stickstoff und gutem Rühren bei 0-5 C 18,4 g &alpha;-Pherioxypropionsäurechlorid innerhalb von 30 min. Nach 2stündigem Nachrühren bei
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Beispiel 2 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0, 0250/0 6-Amino- penicillansäure, 0, 5% o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäure und 0, ils Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Salzsäure auf PH 5,0 eingestellt und 1 h bei 370C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 324 Einheiten Penicillinaktivität pro cm, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac. subtilis ATCC 6633. Diese Penicillinaktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen o-Chlorphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Die verwendete o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäure wird aus o-Chlorphenoxyacetylchlorid mit Thioglykolsäure nach Art der Phenoxypropionylthioglykolsäure (s. Beispiel 1) hergestellt. Sie bildet farblose Kristalle von F 120 C.

Beispiel 3 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0, 125% 6-Aminopenicillansäure, 0, 5% p-Methoxyphenoxyacetylthioglykolsäure und 0, 1% Toluol zugesetzt. Das Reak-

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bei der enzymatischen Reaktion entstandenen p-Methoxyphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Die verwendete p-Methoxyphenoxyacetylthioglycolsäure wird aus p-Methoxyphenoxyacetylchlorid mit Thioglykolsäure dargestellt, (s. Beispiel 1). Farblose Kristalle vom F 850C.

Beispiel 4 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0, 1250% 6-Amino- penicillansäure, 1, 0% 2,6-Dichlorphenoxyacetylthioglykolsäure und 0, 10/0 Toluol zugesetzt. Das Reak- tionsgemisch wird dann mit Salzsäure auf PH 5,0 eingestellt und 1 h bei 370C aufbewahrt. Nach dieser
Zeit enthält der Ansatz 247 Einheiten Penicillinaktivität pro cm*, gemessen an einem Penicillin-G-Stand- ard im Plattentest mit Bac. subtilis ATCC 6633. Diese Penicillinaktivität wird von der bei der enzyma- tischen Reaktion entstandenen 2, 6-Dichlorphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Die verwendete 2, 6-Dichlorphenoxyacetylthioglyckolsäure wird aus 2, 6-Dichlorphenoxyacetylchlorid mit Thioglycolsäure hergestellt (s. Beispiel 1). Sie bildet farblose Kristalle vom P 60 C.

Beispiel 5 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0, 125% 6-Amino- penicillansäure, 1, 0% p-Nitrophenoxyacetylthioglykolsäure und 0, 10/0 Toluol zugesetzt. Das Reaktions- gemisch wird dann mit Salzsäure auf PH 5, 0 eingestellt und 1 h bei 370C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 256 Einheiten Penicillinaktivität pro cm3, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac. subtilis ATCC 6633. Diese Penicillinaktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen p-Nitrophenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt. Die p-Nitrophenoxyacetylthioglykolsäure wird aus p-Nitrophenoxyacetylchlorid mit Thioglykolsäure hergestellt (s. Beispiel 1).

Sie bildet ein hellbraunes Pulver vom F 101oC.

Beispiel 6 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0,025%6-Amino- penicillansäure, 0, 5% o-Chlorphenoxyessigsäure-phenylester und 0, 10/0 Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann auf PH 5,5 eingestellt und 1 h bei 370C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 5,9 Einheiten Penicillin-Aktivität pro cms, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac. subtilis ATCC 6633. Diese Penicillin-Aktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen o-Chlorphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Der verwendete o-Chlorphenoxyessigsäure-phenylester wird aus o-Chlorphenoxyessigsäurechlorid und Phenolnatrium bei 0-5 C in Tetrahydrofuran hergestellt. Nach dem Umlösen aus Ligroin zeigt er den F 54-560C.

Beispiel 7 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0, 025'% 6-Amino- penicillansäure, 0,5% o-Chlorphenoxyacetylglykolsäure und 0, 10/0 Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann auf PH 6,5 eingestellt und 1 h bei 370C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 368 Einheiten Penicillin-Aktivität pro cm*, gemessen an einemPenicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac. subtilis ATCC 6633. Diese Penicillin-Aktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen o-Chlorphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Die verwendete o-Chlorphenoxyacetylglycolsäure der Formel 2-CI-C H-O-CH-CO-O-CH-COOH wurde gewonnen, indem man eine wässerige Lösung des Triäthylaminsalzes der Glykolsäure mit überschüssigem Triäthylamin- und dem gleichen Volumen Tetrahydrofuran versetzte und bei 0-5 C 2-Chlorphenoxyessigsäurechlorid zutropfte. Eine andere Darstellungsweise besteht in der Umsetzung von Glykolsäure-tert-butylester mit 2-Chlorphenoxyacetylchlorid in alkalischem Medium und anschliessender ther-
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Beispiel 8 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0,025%6-Amino- penicillansäure, 0, 5% o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäureamid und 0, 10/0 Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann auf PH 5,5 eingestellt und 1 h bei 37toc aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 53 Einheiten Penicillin-Aktivität pro cm*, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac. subtilis ATCC 6633. Diese Penicillin-Aktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen o-Chlorphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Das verwendete o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäureamid wird hergestellt, indem man Thioglykolsäureamid in wässerig-alkalischer Lösung bei 0 - 5 C mit 2-Chlorphenoxyessigsäurechlorid versetzt, Sein Schmelzpunkt liegt bei 180 C.

Beispiel 9 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0, 025% 6-Aminopeni- cillansäure, 0,5% &alpha;-Phenoxypropionyl-ss-thipropionsäure und 0, 1% Toluol zugesetzt. Das Reaktionsge- misch wird dann auf PH 6,5 eingestellt und 1 h bei 370C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz
246 Einheiten Penicillin-Aktivität pro ems, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit
Bac. subtilis ATCC 6633. Diese Penicillin-Aktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen &alpha;-Methylphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Die als Ausgangsmaterial benutzte a-Phenoxypropionyl-ss-thiopropionsäure der Formel
C6H5-O-CH- (CH3)-CO-S-CH2-CH2-COOH wird aus dem Dinatriumsalz der 0-Mercaptopropionsäure in wässseriger Lösung mit &alpha;-Phenoxypropionyl- chlorid bei 0-5 C dargestellt. Nach dem Ansäuern und Extrahieren mit Äther stellt sie ein schwach gelbliches Harz dar.

Beispiel 10 : Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakteriensuspension werden 0, 025% 6-Aminopenicillansäure, 0, 5% Diphenoxyacetylthioglykolsäure und 0, 1% Toluol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann auf pH 5,0 eingestellt und 1 h bei 37 C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 122 Einheiten Penicillin-Aktivität pro cm*, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest mit Bac. subtilis ATCC 6633. Diese Penicillin-Aktivität wird von der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen Diphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure bewirkt.

Diphenoxyacetylthioglykolsäure der Formel (C. H.-0),-CH-CO-S-CH,-COOH wurde aus Diphenoxyessigsäurechlorid mit einer wässerigen Lösung des Dinatriumsalzes der Thioglykolsäure gewonnen. Aus Essigester-Petroläther kristallisiert sie und zeigt den F 850 C.

B e i s p i e l 11: 160 1 2 Vol.-%ige Maisquellwasserlösung, enthaltend 0, 2% Kaliumphenylacetat werden mitKaliumhydroxydIösung auf PH 7, 0 eingestellt und 30 min auf 1200C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und 40 min bei 1100C im Fermenter sterilisiert. Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400 cm einer 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC 11 105 beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150 1 Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 h bei 310C ohne Überdruck kultiviert. Während der gesamten Wachstumszeit werden durch eine von der Luftleitung des Fermenters getrennte Leitung 5 1 Kohlendioxyd/min in die Kultur eingeleitet.

Die Luft- und Kohlensäurezufuhr zu der Kultur wird dann abgebrochen und es erfolgt eine Zugabe von 0, 05% Toluol und ein Zusatz von Penicillin G bis zu einer Konzentration von 5000 Einheiten pro cm'.

Unter schwacher Rührung wird der Ansatz bei einer Temperatur von 370C gehalten. Das in den sauren Bereich abfallende PH wird durch wiederholte Zusätze von 25%iger Natriumcarbonatlösung auf PH 7,5 zurückgestellt. Nach 21/2stündiger Reaktionszeit ist das Penicillin G fast vollständig zu 6-Aminopeni-
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gespalten.propionylthioglykolsäure, die vorher mit Natronlauge neutralisiert wurde, dem Ansatz zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird weiters 2 1/2 h unter schwachem Rühren bei 370C und PH 7, 5 gehalten. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 3800 Einheiten pro cm &alpha;-Phenoxyäthylpenicillin.
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mit 150 l Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 20 h bei 250C kultiviert.

Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 l 0, 9% iger NaCl-Lösung gewaschen und nach erneutem Abzentrifugieren in 1/15 m Phosphatpufferlösung von PH 6,0 resuspendiert. Dieser Suspension setzt man 0, 125% 6-Aminopenicillansäure, 0,5% &alpha;-Phenoxypropionylthioglykolsäure
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acetylglutaminsäure, werden mit KOH auf PH 7, 0 eingestellt und dann 30 min bei 1200C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und 40 min bei 110 C im Fermenter sterilisiert.

Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400 cm* einer 24stündigen Schüttelkultur eines aus dem Erd-

boden isolierten Arthrobacter-Stammes beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150 1 Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 22 h bei 250C kultiviert.

Die Bakterienzellen aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 l 0, 9 oiger NaCl-Lösung gewaschen und nach erneutem Abzentrifugieren in 1/15 m Phosphatpufferlösung von PH 6,0 resuspendiert. Dieser
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setzt man 0. 125% 6-Amlnopenicillansäure, 0, 5% < x-PhenoxypropionylglykolsäurePATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von 6 - Acylamino - penicillansäuren durch Umsetzung von 6-Aminopenicillansäure mit Derivaten von Carbonsäuren in Gegenwart von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, bzw. aus diesen gewonnenen Extrakten, Enzymen oder Enzymanreicherungen, die fähig sind, Phenylessigsäure mit der Aminogruppe der 6-Aminopenicillansäure amidartig zu verknüpfen, dadurch gekennzeichnet, dass als Derivate der Carbonsäuren deren Ester von Hydroxy- oder Mercaptoverbindungen verwendet werden.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Hydroxy- oder Mercaptoverbindungen Hydroxy- oder Mercaptocarbonsäuren, oder ihre Derivate wie Ester, Amide oder Salze verwendet.