CH388963A - Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren - Google Patents

Description

      Verfahren    zur Herstellung von     C-Acylaminopenicillansäuren       Im deutschen Patent Nr. 1 149 361 ist vorge  schlagen worden,     6-Acylaminopenicillansäuren    da  durch herzustellen, dass man auf     6-Aminopenicillan-          säure    in Gegenwart von     Carbonsäuren,    deren     Salzen     oder Derivaten bei einem     pH    von höchstens 6,5,  Bakterien bzw.

   aus diesen gewonnene Extrakte,  Enzyme     oder        Enzymanreicherungen    einwirken     lässt,     die fähig sind, die     Phenylessigsäure    mit der     Amino-          gruppe    der     6-Aminopenicillansäure        amidartig    zu ver  knüpfen. Als geeignete     Carbonsäurederivate    hatten  sich unter anderem     Acylglycokolle    oder     Acylglutamin-          säuren    erwiesen.  



  Es wurde nun gefunden, dass man manche       6-Acylaminopenicillansäuren    in wesentlich höherer  Ausbeute erhält, wenn man     6-Aminopenicillansäure     mit     Carbonsäureestern    von     Hydroxy-        oder        Mercapto-          verbindungen,    insbesondere von     Hydroxy-    und       Mercaptocarbonsäuren    oder ihren Derivaten umsetzt,  und zwar in Gegenwart von Bakterien bzw.

   aus die  sen gewonnenen Extrakten, Enzymen oder Enzym  anreicherungen, die fähig sind,     Phenylessigsäure    mit  der     Aminogruppe    der     6-Aminopenicillansäure        amid-          artig    zu verknüpfen.  



  Als     6-Aminopenicillansäure    können sowohl die  synthetische     oder    die durch Abbau gewonnene,  kristallisierte Substanz oder gegebenenfalls angerei  cherte rohe Lösungen, wie sie aus Fermentationen  oder andern Prozessen anfallen, benutzt werden.  



       Hydroxy-    und     Mercaptoverbindungen    im Sinne  der Erfindung sind Alkohole,     Mercaptane,        Phenole     und     Thiophenole.    Beispiele für Alkohole sind  Äthanol,     Butanol,        Dodecylalkohol,        Cyclohexanol,          Phenylmethylcarbinol    und     Glykolsäure.    Geeignete         Mercaptane    sind     Mercaptobenzthiazol,        Thioglykol-          säure,

          2-Mercaptobuttersäure    und     Cysteamin.     



  Als     Phenole    oder     Thiophenole    kommen Phenol,       p-Oxybenzoesäure,        Thiophenol    oder     Thiokresol    in  Frage.  



  Beispiele brauchbarer Verbindungen sind       Phenylessigsäurethiophenolester,          Phenoxyessigsäuremethylester,          a-Phenoxypropionylthioglykolsäure,          o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäureamid,          p-chlorphenoxyacetylthioglykolsaures    Natrium.  Besonders geeignet sind     Carbonsäureester    von sol  chen Alkoholen und     Mercaptanen,    die wiederum       Carboxylgruppen    tragen, beispielsweise     Carbonsäure-          ester    von Glykol- und     Thioglykolsäure.     



  Die Gegenwart der     genannten        Enzyme    ist erfor  derlich, da die     Carbonsäureester    in     wässrigem        Milieu     bei     pH        4-8    allein nicht in der Lage sind,     6-Amino-          penicillansäure    zu den erwünschten     6-Acylderivaten     zu     acylieren.        Vergleichsversuche    haben ergeben, dass  beispielsweise     a-Phenoxypropionylthioglykolsäure,

      bei       pH    4-8     mit        6-Aminopenicillansäure    behandelt, keine       a-Phenoxyproponyl    - 6 -     aminopenicillansäure    liefert,  während der Zusatz einer Enzymlösung die ge  wünschte Synthese schnell und in hoher Ausbeute  bewirkt. Es ist nicht     erforderlich,    die synthese  bewirkenden Enzyme zu isolieren. Vielmehr sind be  reits     Bakterienzellen,    die diese Enzyme enthalten,  oder ihre     Lysate    als reaktionsbedingende Agenzien  verwendbar.  



  Ein besonderer Vorteil des     vorliegenden    Ver  fahrens     ist    es     ferner,    solche     6-Acylaminopenicillan-          säuren    mit den wertvollen antibiotischen Eigenschaf-           ten    der Penicilline in hoher Ausbeute darzustellen,  die durch Fermentation     mit        penicillinbildenden        Pilzen     in Gegenwart der entsprechenden     Carbonsäuren    (so  genannten     Präcursoren)    nicht entstehen.  



  <I>Beispiel 1</I>  160 Liter 2     Vol.    %     ige        Maisquellwasserlösung,     enthaltend     0,2/10        Kaliumphenylacetat,    werden     mit          Kaliumhydroxydlösung    auf     pH    7,0 eingestellt und  30 Minuten auf 120  C erhitzt. Nach Abkühlung  wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und  40 Minuten bei 110  C im     Fermenter    sterilisiert.

    Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400     em3     einer 18stündigen     Schüttelkultur    von E.     coli        ATCC     <B><I>11</I>105</B> beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150 Liter       Luft/Min.    bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes  pro Minute belüftet und 17 Stunden bei 31  C ohne  Überdruck     kultiviert.    Während der gesamten Wachs  tumszeit werden durch eine von der Luftleitung des       Fermenters    getrennte Leitung 5 Liter Kohlendioxyd/  Minute in die Kultur eingeleitet.

   Die Bakterienzellen  werden aus der Kulturlösung     abzentrifugiert,    in 16  Liter     1/15    m     Phosphatpufferlösung    von     pH    6,0 ge  waschen und nach dem     Abzentrifugieren    zu einer  dichten Suspension in     1/15    m     Phosphatpufferlösung     von     pH    6,0     resuspendiert.     



  Dieser Suspension setzt man 0,125 %     6-Amino-          penicillansäure,    0,5 %     a-Phenoxypropionylthioglykol-          säure    und 0,1 %     Toluol    zu.

   Das Reaktionsgemisch  wird dann mit     konzentrierter        Sodalösung    auf     pH    6,5  eingestellt und eine Stunde bei 37  C     aufbewahrt.     Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 884 Einheiten       Penicillinaktivität    pro     cm3,    gemessen an einem     Peni-          cifin-G-Standard    im     Plattentest        Bac.        subtilis        ATCC     6633.

   Diese     Penicillinaktivität    wird von der bei der  enzymatischen Reaktion entstandenen     a-Methyl-          phenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure    bewirkt.  



  Herstellung der a -     Phenoxypropionylthioglykol-          säure:    In 200     cm3    4,4     %        ige    Natronlauge werden  9,2 g     Thioglykolsäure    gelöst. Zu dieser Lösung gibt  man unter Einleiten von Stickstoff und gutem  Rühren bei 0 bis 5  C 18,4 g     a-Phenoxypropion-          säurechlorid    innerhalb von 30 Minuten. Nach zwei  stündigem     Nachrühren    bei 20  C wird mit     Salzsäure     angesäuert. Das abgeschiedene Öl wird mit Äther  aufgenommen.

   Nach dem Trocknen und Verdampfen  des Äthers     hinterbleiben    22,9 g     a-Phenoxypropionyl-          thioglykolsäure    als viskoses Öl, das nach längerem  Stehen kristallisiert. F. 52 .  



  <I>Beispiel 2</I>  Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakterien  suspension werden 0,025 %     6-Aminopenicillansäure,     0,5 %     o-Chlorphenoxyacetylthioglykolsäure    und 0,1       Toluol    zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann  mit Salzsäure auf     pH    5,0 eingestellt und eine Stunde  bei 37  C aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der       Ansatz    324 Einheiten     Penicillinaktivität    pro     cm3,     gemessen an     einem    Penicillin     -G-Standard    im Platten  test mit     Bac.        subtilis        ATCC    6633.

   Diese Penicillin-         aktivität    wird von der bei der enzymatischen Reak  tion entstandenen o -     Chlorphenoxyacetyl    - 6 -     amino-          penicillansäure    bewirkt.  



  Die verwendete     o-Chlorphenoxyacetylthioglykol-          säure    wird aus     o-Chlorphenoxyacetylchlorid    mit       Thioglykolsäure    nach Art der     Phenoxypropionylthio-          glykolsäure    (siehe Beispiel 1) hergestellt. Sie bildet  farblose Kristalle vom F. 120 .  



  <I>Beispiel 3</I>  Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakterien  suspension werden 0,125 %     6-Aminopenicillansäure,     0,5 %     p-Methoxyphenoxyacetylthioglykolsäure    und  0,1 %     Toluol    zugesetzt. Das     Reaktionsgemisch    wird  dann mit     konzentrierter        Sodalösung    auf     pH    6,5 ein  gestellt und eine Stunde bei 37  C aufbewahrt.

   Nach  dieser Zeit enthält der Ansatz 744 Einheiten     Peni-          cillinaktivität    pro     cm3,    gemessen an einem     Peni-          cillin-G-Standard    im     Plattentest    mit     Bac.        subtilis          ATCC    6633. Diese     Penicillinaktivität    wird von  der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen       p-Methoxyphenoxyacetyl-6-aminopenicillansäure    be  wirkt.  



  Die verwendete     p-Methoxyphenoxyacetylthio-          glykolsäure    wird aus     p-Methoxyphenoxyacetylchlorid     mit     Thioglykolsäure    dargestellt (siehe Beispiel 1).  Farblose Kristalle vom F. 85 .  



  <I>Beispiel 4</I>  Einer wie in Beispiel 1 gewonnenen Bakterien  suspension werden 0,125 %     6-Aminopenicillansäure,          1,0%        2,6-Dichlorphenoxyacetylthioglykolsäure    und  0,1 %     Toluol    zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird  dann mit     Salzsäure    auf     pH    5,0 eingestellt und eine  Stunde bei 37  C aufbewahrt.

   Nach dieser Zeit ent  hält der Ansatz 247 Einheiten     Penicillinaktivität     pro     cm3,    gemessen an einem     Penicillin-G-Standard     im     Plattentest    mit     Bac.        subtilis        ATCC    6633. Diese       Penicillinaktivität    wird von der bei der enzyma  tischen Reaktion entstandenen     2,6-Dichlorphenoxy-          acetyl-6-aminopenicillansäure    bewirkt.  



  Die verwendete     2,6-Dichlorphenoxyacetylthio-          glykolsäure    wird aus     2,6-Dichlorphenoxyacetylchlorid     mit     Thioglykolsäure    hergestellt (siehe Beispiel 1). Sie  bildet farblose Kristalle vom F. 60 .  



  <I>Beispiel S</I>  Einer wie in Beispiel 1     gewonnenen    Bakterien  suspension werden<B>0,125%</B>     6-Aminopenicillansäure,     1,0%     p-Nitrophenoxyacetylthioglykolsäure    und 0,1       Toluol    zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann  mit Salzsäure auf     pH    5,0 eingestellt und eine Stunde  bei 37  C     aufbewahrt.    Nach dieser Zeit enthält der  Ansatz 256 Einheiten     Penicillinaktivtät    pro     cm3,    ge  messen an einem     Penicillin-G-Standard    im Platten  test mit     Bac.        subtilis        ATCC    6633.

   Diese Penicillin  aktivität wird von der bei der enzymatischen     Reak,          tion    entstandenen     p-Nitrophenoxyacetyl-6-amino-          penicillansäure    bewirkt. Die     p-Nitrophenoxyacetyl-          thioglykolsäure    wird aus     p-Nitrophenoxyacetylchlorid         mit     Thioglykolsäure    hergestellt (siehe Beispiel 1).  Sie bildet ein hellbraunes Pulver vom F.<B>101'.</B>

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 6-Acylamino- penicillansäuren durch Umsetzung von 6-Amino- penicillansäure mit Derivaten von Carbonsäuren in Gegenwart von Bakterien bzw.

   aus diesen gewon nenen Extrakten, Enzymen oder Enzymanreicherun gen, die fähig sind, Phenylessigsäure mit der Amino- gruppe der 6-Aminopenicillansäure amidartig zu ver knüpfen, dadurch gekennzeichnet, dass als Derivate der Carbonsäuren deren Ester von Hydroxy- oder Mercaptoverbindungen verwendet werden.

   UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Hydroxy- oder Mercapto- verbindungen Hydroxy- oder Mercaptocarbonsäuren oder ihre Derivate wie Ester, Amide oder Salze ver wendet.