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Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums R-451 und seiner
Komponenten R-451 A bis R-451 E sowie der 0-Acylderivate, Äther und Salze mit Basen des Antibioticums und der Komponenten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums R-451 und seiner Komponenten R-451 A-R-451 E sowie der 0-Acylderivate, Äther und Salze mit Basen des Antibioticums und der Komponenten.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird in der Weise ausgeführt, dass man die neue Art Micromonospora carbonacea, hinterlegt unter der Registrierungsnummer NRRL 2972, oder eine von deren Mutanten*) oder Varianten mit im wesentlichen gleicher biologischer Aktivität unter üblichen Bedingungen, vorzugsweise aerob in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, bebrütet, das gebildete Antibioticum aus der Kultur isoliert und gegebenenfalls reinigt bzw. in seine Komponenten zerlegt und hierauf das Antibioticum bzw. mindestens eine von dessen Komponenten R-451 A, R-451 B, R-451 C, R-451 D und R-451 E gegebenenfalls in eines ihrer 0-Acylderivate, in Äther oder in Salze mit Basen überführt.
Kulturen der erfindungsgemäss verwendeten Art von Mikroorganismen wurden in der Kulturensammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt.
Die zur Gewinnung des neuen Antibioticums R-451 und seiner Komponenten R-451 A-R-451 E als geeignet erkannte neue Art Micromonospora carbonacea, die im folgenden kurz M. carbonacea genannt wird, hat die NRRL-Nummer 2972 erhalten und wurde ursprünglich aus einer Bodenprobe aus Olean, N. Y., U. S. A., erhalten. M. carbonacea zeichnet sich, wenn er unter 20tägiger Bebrütung bei 28 C in einem Medium aus 0, 5% Hefeextrakt, 10/0 Dextrose, 0, 1%Calciumcarbonat und 1, 51o Agar kultiviert wird, durch kohlschwarze, auf Sporenhäufung zurückzuführende Flecken in einem sonst orangefarbenen vegetativen Mycel aus.
Die Sporen von M. carbonacea sind gewöhnlich länglich bis ellipsoïdal, und die Dimensionen reifer Sporen betragen durchschnittlich zo Die vollreifen Sporen sind bei mikroskopischer Betrachtung im hindurchgehenden Licht dunkel gefärbt. Sporophoren treten nicht einigermassen statistisch gleichmässig ("randomly") fiber das gesamte Mycel verteilt auf, sondern stark konzentriert in bestimmten Gebieten des vegetativen Mycels. Dieses scheint sich normalerweise nicht in polymorphe Elemente (Fragmente) aufzuteilen, sondern bleibt ein Ganzes bis zu einer etwaigen Autolyse. Das vegetative Mycel hat einen durchschnittlichen Durchmesser von 0, 6 p, ist nicht säurefest, grampositiv.
Der Organismus nährt sich von gewissen Protein-und Stârkearten, ist aerob und gedeiht gut im Bereiche von 16 bis 370C, aber nicht bei 500C oder darüber. Form und orange Farbe (mit braunschwarzen Flecken) sind typisch für frische Isolate aus dem Boden, doch können diese Merkmale zeitweilig oder dauernd verloren gehen, wenn Stämme wiederholt isoliert und übertragen werden.
*) Unter "Mutanten" werden sowohl natürliche als auch künstliche Mutanten verstanden, insbesondere Mutanten, die aus den betreffendenMikroorganismen mitHilfe von Mutationsmitteln, wie Hochfrequenzstrahlung (Röntgen-oder Ultraviolettstrahlung), Actinophagen und Stickstoffloster, gebildet werden.
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Zur Isolierung des genannten Mikroorganismus wird etwas von der betreffenden Bodenprobe in sterilem destilliertem Wasser geschüttelt, und nach Herstellung geeigneter Verdünnungen wird die Suspension auf
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0, o Calciumpropionat und 2, 00/0 Agar ; alles in destilliertem Wasser.
Die Kulturen werden auf antibiotische Aktivität geprüft, indem man sie zunächst bis zu 60 Tage bei 260C in dem folgenden Medium wachsen lässt : ouzo Rindfleischextrakt, 0, 50/0 Tryptose, 0,1% Dextrose, 2, 4% lösliche Stärke, 0,5% Hefeextrakt, 1,5% Agar, alles in Leitungswasser. Dann extrahiert man den ganzen wässerigen Agar mit Butanol und engt den Butanol-Wasser-Extrakt ein. Durch das Butanol-WasserGemisch wird genügend Antibioticum extrahiert, um ein Konzentrat zu liefern, das in einem Scheibentest das Wachstum von Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis verhindert. Eine antibiotische Aktivitat gegen die gleichen Organismen lässt sich beobachten, wenn man 96 h in einem wässerigen Medium submers bebrütet, das geeignete Nährstoffe enthält z.
B. 0, 50/0 Hefeextrakt, 0,1% lösliche Fischbestandteile, 0, 1'%) Calciumcarbonat, 0, 1'% ; durch Versprühen getrockneten corn steep liquor und 3, 00/0 Lactose.
Tabellen I - V vergleichen die vorstehend beschriebenen neuen mit gewissen bekannten Micromonosporaarten. Sofern sich in einzelnen Tabellenfeldern Striche befinden, bedeutet dies, dass entsprechende Daten entweder fehlen oder nicht in die Tabellen aufgenommen wurden.
Die in Tabelle I aufgenommenen Koloniebeobachtungen wurden nach 14tägiger Bebrütung der betreffenden Medien bei 24 - 260C angestellt. Die gewählten Farbbezeichnungen beziehen sich auf die fol-
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ersteFarbbezeichnung besteht aus einemFarbnamen gemäss dem"DescriptiveColorName Dictionary"von Taylor, Knoche und Granville, herausgegeben durch die Container Corporation of America [1950], in Verbindung mit einer diesem Namen entsprechenden Nummer, welche dem "Color Harmony Manual", 4. Auflage [1958], herausgegeben ebenfalls von der Container Corporation of America, entnommen ist die zweite Bezeichnung besteht aus einem Farbnamen und einer Nummer gleicher Bedeutung, gemäss National Bureau of Standards (U. S. A.), Circular 553 vom 1. November 1955.
Tabelle H vergleicht die charakteristischen Eigenschaften von Kolonien der erfindungsgemäss bevorzugt verwendeten und einiger bekannter Arten der Gattung Micromonospora bei Verwendung verschiedener Medien nach 14tägiger Bebrütung bei 26 C. Die Daten für die bekannten Arten, mit denen die erfindungsgemäss verwendeten verglichen werden, sind aus Bergey's"Manual ofDeterminative Bacteriology", 7. Auflage [1957], herausgegeben von der Williams & Wilkins Company, Baltimore, entnommen.
In den Tabellen mA und EB sind Wachstum und Koloniefarbe der erfindungsgemäss bevorzugt ver- wendeten Micromonosporaarten mit den entsprechenden Eigenschaften dreier verfügbarer bekannter Micromonosporaarten bei Verwendung weiterer Kulturmedien verglichen. Die hier verwendeten Medien sind diejenigen, die man gewöhnlich zur Bestimmung von Streptomycesarten verwendet. Die Koloniefarbe ist nach dem im Zusammenhang mit Tabelle I erläuterten System bezeichnet. Die oben erwähnten Mikroorganismen sind imstande, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zu benutzen.
In Tabelle IV wird ihre Kohlenstoffquellenbenutzung mit derjenigen gewisser bekannter Micromonosporaarten an Hand visueller Schätzungen ihres Wachstums auf Agarplatten in einem Medium verglichen,
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und 10/0 des betreffenden Testkohlehydrats, alles in destilliertem Wasser, besteht.
In Tabelle V wird dieStickstoffquellenbenutzung der erfindungsgemäss bevorzugten Mikroorganismen der Gattung Micromonospora mit derjenigen anderer Micromonosporaarten an Hand visueller Schätzungen ihres Wachstums auf Agarplatten in einem Medium verglichen, das aus 10/0 Glucose, 1, 51o Agar und der betreffenden Stickstoffquelle (in einer Konzentration wie angegeben), alles in destilliertem Wasser, besteht. Die in Tabelle V verwendeten Farbbezeichnungen beruhen auf dem im Zusammenhang mit Tabelle I erläuterten System.
Wie oben gesagt, ist in der Erfindung die Verwendung von Mutanten und Varianten der genannten neuen Micromonosporaart für die Herstellung der Antibiotica inbegriffen. Ein Beispiel einer solchen Variante, die sich von der oben beschriebenen Art in untergeordneter Weise, z. B. morphologisch oder biochemisch, unterscheidet, ist M. carbonacea var. aurantiaca. Eine Kultur davon wurde ebenfalls in der Kulturensammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, U. S. A., hinterlegt und ist dort unter ihrer NRRL-Nummer 2997 verfügbar. Diese Variante wurde ebenfalls ursprünglich aus einer in Olean, N.
Y., entnommenen Bodenprobe isoliert und ist taxonomisch gleich mit M. carbonacea, mit den folgenden Unterschieden :
M. carbonacea var. aurantiaca reduziert Nitrat nicht ; bildet mitunter ein gelbes diffundierbares Pigment, wenn es in einem Kohlehydratmedium auf Basis von Mannose oder Xylose kultiviert wird, und
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bildet Sporen in begrenztem Umfang. Die Koloniefarbe auf den meisten Agarmedien ist orange mit einer Tendenz, mit zunehmendem Alter orangebraun zu werden. Die orange Oberfläche besteht hauptsächlich aus vegetativem Mycel und enthält gelegentlich kleine schwarze Felder, die beinahe zur Gänze aus dunkel gefärbten Sporen bestehen. Auf Bennett's Agar ist das Wachstum dieser Variante gut ; die Kolonie erhöht. Ihre Farbe ist feuerrot-g5NC, intensivrotorange-35.
Auf Tomatenmark-Hafermehl-Agar mit einem 0, 1%gen Natriumcarbonatgehalt ist das Wachstum mittelmässig ; die Kolonie erhöht. Ihre Farbe ist bitter- st ! 6farben-g5PC, tieforange-51.
Die Variante ist der oben beschriebenen Art hinsichtlich der Bildung von Antibiotica im allgemeinen und von Antibiotica der R-451-Gruppe im besonderen äquivalent.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäss verwendbaren Mikroorganismen liefern mit Hilfe der im folgenden beschriebenen Fermentationsverfahren antibiotisch aktive Substanzen. Nach der Fermentation bebrütung) finden sich diese sowohl im Mycel aïs auch in der Brühe ; nach Abtrennung des Mycels von der Brühe wird als Quelle zu ihrer Gewinnung vorzugsweise die Brühe verwendet.
Aus papierchromatographischen Untersuchungen hat sich ergeben, dass die durch M. carbonacea und deren Varianten gebildeten antibiotischen Substanzen mindestens aus fünf Komponenten bestehen, die im folgenden als R-451 A, R-451 B, R-451 C, R-451 D und R-451 E bezeichnet werden. Ihre Abtrennung voneinander hängt von der angewendeten Methode ab. In einem bestimmten verteilungschromatographi- schen System werden die Stoffe mit den den Komponenten A, B, C und D entsprechenden Wanderungseigenschaften als eine Gruppe (antibiotisch aktiv) isoliert, die im folgenden als R-451 bezeichnet wird.
Eine der Hauptkomponenten dieser Gruppe scheint R-451 D zu sein.
Zur Bildung der antibiotischen Substanzen wird der Mikroorganismus M. carbonacea bei einer Temperatur von etwa 25 bis 400C unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässerigen Nährmedium kultiviert, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff quelle enthält. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie Stärke, Dextrin, gewisse Zucker u. dgl. Geeignete Stickstoffquellen können sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, vorzugsweise sind es aber organische Produkte, wie Sojabohnenmehl, Peptone u. dgl.
Die Bebrütung erfolgt bei einem PH im Bereiche von etwa 6 bis 8 ; über einen Zeitraum von etwa 60 bis 72 h. Gegen Ende dieser Zeitspanne ist maximale Antibioticabildung erreicht.
Da sich der überwiegende Anteil antibiotisch aktiver Substanzen in der Brühe befindet, wird das Mycel abfiltriert und verworfen. Die antibiotischen Substanzen werden aus der Brühe durch Lösungsmittelextraktion, etwa wie im folgenden beschrieben, isoliert. Sie können durch verteilungschromatographische Methoden, wie im folgenden näher erläutert, in ihre Komponenten aufgetrennt werden.
Die antibiotischen Substanzen werden zunächst aus dem von der Brühe erhaltenen Extrakt durch Abdampfen des Lösungsmittels in Form eines Rückstandes abgetrennt. Der Rückstand wird papierchromato-
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Agarplatte legt. Nach einer Kontaktdauer von 15 min wird das Papier von der Platte getre. mt, die man dann 16 - 20 h bei 370C bebrütet. Aus der Lage der Inhibitionszonen lässt sich auf die Rp-Werte der antibiotisch aktiven Komponenten schliessen.
Tabelle VI zeigt die verwendeten Lösungsmittelsysteme und die darin fur die Antibioticakomponenten ermittelten RF-Werte. Bei allen Systemen wurden absteigende Lösungsmittel verwendet.
In den folgenden Beispielen sind geeignete Verfahren zum Bebrüten der erfindungsgemäss bevorzugten Mikroorganismen, zum Extrahieren der antibiotischen Substanzen aus der Brühe und zum Auftrennen dieser Substanzen in ihre Hauptkomponenten erläutert. In einigen dieser Beispiele sind Prüfwerte der betreffenden antibiotischen Substanzen, ausgedrückt in Einheiten pro mg, als Massstab ihrer Aktivität angegeben. Die Prüfung erfolgt mikrobiologisch nach einem standardisierten Agar-Diffusionsprüfverfahren ("cup type" ; vgl. Donald C. Grove and William A. Randen. "Assay Methods of Antibiotics - A Laboratory Manual", New York [1955]) unter Verwendung von Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) als Testorganismus.
Es wird eine Kurve aufgenommen, indem man die erzielte Wirkung gegen die Dosierung der betreffenden antibiotischen Substanz (verdünnt in Phosphatpuffer bei PH = 8) in dem folgenden Medium aufträgt
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<tb>
<tb> Pepton <SEP> 0, <SEP> 6%
<tb> Pankreatisches <SEP> Caseinhydrolysat <SEP> 0. <SEP> 41. <SEP>
<tb>
Hefeextrakt <SEP> 0. <SEP> alo
<tb> Rindfleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 15%
<tb> Dextrose <SEP> 0, <SEP> 15%
<tb> Agar <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP>
<tb> . <SEP> PH <SEP> S, <SEP> 6
<tb>
Die verwendete Suspension des Testorganismus (Staphylococcus aureus) wird derart standardisiert, dass sie in einem Kolorimeter Licht mit einer Wellenlänge von 660 mg zu 20go durchlässt. Die quantitative Wirksamkeit der jeweiligen Antibiotic umprobe wird aus der Bezugskurve ermittelt und in Einheiten pro mg ausgedrückt ; wobei als Einheit eine solche Menge Testsubstanz gilt, die erforderlich ist, um bei einem Stahlzylinder von 6, 5 mm Aussendurchmesser eine Inhibitionszone von 15 mm Durchmesser hervorzurufen.
Beispiel 1: Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea im Laboratoriumsmassstab.
A) Keimung :
Man bringt eine lyophilisierte Kultur von M. carbonacea aseptisch in einen 300 ml-Schüttelkolben ein, der 100 ml des folgenden sterilen Mediums enthält :
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<tb>
<tb> Bacto-Rindfleischextrakt <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> Tryptose <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 1g
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 24g <SEP>
<tb> Hefccxtrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> ml*) <SEP>
<tb>
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(280 Umdr/min, 5 cm Rüttelbewegung).
B) Bebrütung :
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ben, deren jeder 500 ml des folgenden Mediums enthält :
EMI4.5
<tb>
<tb> Hefe <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Lösliche <SEP> Fischbestandteile <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> (getrocknet) <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
Man bebrütet die Kolben samt Inhalt 2 - 3 Tage bei 260C auf einer rotierenden Schüttelmaschine und vereinigt dann die Kolbeninhalte.
C) Extraktion der antibiotischen Substanzen :
Zu dem vereinigten Substrat nach Teil B) dieses Beispiels fügt man eine Filterhilfe (Diatomeenerde), filtriert und wäscht das Filtrat mit Äthylacetat oder Chloroform, wobei man das PH der wässerigen Phase bei oder oberhalb 7 (jedoch vorzugsweise so nahe an 7 wie möglich) hält. Aus dem Extrakt wird das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, das zurückbleibende Öl in überschüssigem Chloroform gelöst und durch Filtrieren geklärt.
Die klare Chloroformlösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und die so erhaltene konzentrierte Lösung unter Rühren zu dem zehnfachen Volumen Petrolether (Siedebereich 30-600C) gefügt. Der dabei ausfallende Niederschlag wird ab- *) In diesem und in ähnlichen Rezepten durch die ganze Beschreibung hindurch ist das Lösungsmittel (meist Wasser) einmal als absolute Menge, ein andermal mit dem Vorsatz "ad" angegeben. Obwohl dies, genau genommen, unterschiedliche Angaben sind, so können doch im Rahmen der für diese Rezepte erforderlichen Genauigkeit diese beiden Ausdrücke beliebig gegeneinander ausgetauscht werden.
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filtriert*) und enthält die Hauptmenge der gebildeten antibiotischen Substanzen.
Er ist aktiv gegen
Staphylococcus aureus, wenn Lösungen mit einem Gehalt von nur 10 mol dem Scheibendiffusionstest unterzogen werden.
D) Reinigung der nach Teil C) dieses Beispiels erhaltenen rohen antibiotischen Substanz :
Hier wird eine Reinigung durch Säulenchromatographie an Aluminiumoxyd angewendet. Das Haupt- eluat wird als R-451 bezeichnet und scheint von der Komponente R-451 E frei zu sein. Die Aluminium- oxydreinigung liefert ein wasserlösliches Produkt und ermöglicht so die Bereitung wässeriger Dosierungsformen oder besser löslicher Formen des Antibioticums.
Man bereitet eine Aluminiumoxyd-Adsorptionschromatographiesäule, indem man eine Suspension von reinemAluminiumoxyd (fUr dieChromatographie ; HandelsproduktNo. 71'707 der Firma Merck & Co.) in Chloroform-Methanol (3 : 1) in eine Glassäule von etwa 51 mm lichter Weite giesst, bis die Aluminiumoxydschicht eine Höhe von etwa 61 cm erreicht hat.
Man löst 10 g nach Stufe C) dieses Beispiels erhaltenen rohen antibiotischen Substanz in 50 ml Chloroform und gibt diese Lösung langsam auf die Säule auf. Diese eluiert man dann zunächst mit Chlo- roform-Methanol (3 : 1), wobei man 12 Fraktionen à 500 ml auffängt, sowie anschliessend mit Methanol-Chloroform (3 : 1), wobei man weitere 37 Fraktionen à 500 ml sammelt. Die Fraktionen werden durch Eindampfenlassen kleiner Proben an der Luft und Testen von deren Rückständen gegen Staphylococcus aureus untersucht und nach Massgabe ihrer Aktivität gegen diesen Organismus zu Gruppen vereinigt.
Die Hauptmenge eluierter Substanz und die Hauptaktivität befinden sich in den Fraktionen 13 - 30. Die- se werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und die gelöste Substanz durch Zugabe zu Petrolether ausgefällt. Der Niederschlag, bestehend aus 1,7 g R-451, wird abfiltriert und an der Luft getrocknet. Er zeigt eine Aktivität gegen Staphylococcus aureus (im Scheibendiffusionstest) bei Konzentrationen von 1/lg/m1 aufwärts.
In Tabelle VII ist gezeigt, wie die einzelnen Fraktionen vereinigt werden und in welcher Weise aus ihnen die feste antibiotische Substanz isoliert wird, zusammen mit den Ergebnissen der Scheibentests gegen Staphylococcus aureus und den RF-Werten der vereinigten Fraktionen in dem betreffenden System.
Die RF-Werte wurden in der üblichen Weise durchBioc. utographie des entwickeltenPapierchromatogramms gegen Staphylococcus aureus ermittelt.
Beispiel 2 : Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea var. aurantiaca im Laboratoriumsmassstab.
Indem man die lyophilisierte Kultur von M. carbonacea gemäss Teil A) des Beispiels 1 durch eine entsprechende Kultur von M. carbonacea var. aurantiaca ersetzt und sonst im wesentlichen dem Verfahren des genannten Beispiels folgt, gelangt man gleichermassen zu R-451.
Beispiel 3 : Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea in technischem Massstab.
A) Keimung :
Man bringt eine lyophilisierte Kultur von M. carbonacea aseptisch in einen 300 ml-SchUtte1kolben ein, der 100 ml des folgenden sterilen Nährmediums enthält :
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<tb>
<tb> Bacto- <SEP> Rindfleischextrakt <SEP> 3g <SEP>
<tb> Tryptose <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 24 <SEP> g <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
Der Kolben samt Inhalt wird vier Tage bei 350C (oder bis gute Keimung erfolgt ist) auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Umdr/min, 5 cm Rtittelbewegung) bebrütet.
B) Vorimpfung :
Man fügt je 5 ml des durch obige Keimung erhaltenen ersten Inoculums zu drei 300 ml-Schtîtte & oI-
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72 h bei 300C auf der rotierenden Schüttelmaschine.
C) Bereitung des Inoculums Manubertragtje 25 ml des durch obige Vorimpfung erhaltenen zweiten Inoculums auf zehn 2 1- Kolben, *) Es kann nötig sein, ein-oder mehrmals aus Chloroform umzufällen, falls zunächst an Stelle eines filtrierbaren Feststoffes ein Öl ausfällt.
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deren jeder 500 ml des für die Keimung verwendeten sterilenNährmediums enthält, und bebrütet die Kolben samt Inhalt 72 h bei 300C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Umdr/min, 5 cm Rüttelbe- wegung). Dann werden die Kolbeninhalte vereinigt und aseptisch in einen sterilen Inoculumkolben mit seitlichem Ansatzrobr übertragen (Gesamtvolumen etwa 51).
D) Tankfermentation :
Man überträgt die 5 1 des nach Stufe C) erhaltenen Inoculums aseptisch in einen etwa 130 1 fassenden Fermenter, der 90 1 des für die Keimung verwendeten sterilen Nährmediums enthält, und bebrütet 20-30 h aerob (bis das kompakte Zellvolumen - bestimmt durch 5 min langes Zentrifugieren einer 10 ml-Probe bei 2800 Umdr/min-etwa 2-3 ml, d. h. 20-30 , betragt), unter den folgenden Bedingungen :
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<tb>
<tb> Temperatur <SEP> 350C
<tb> Zufuhr <SEP> an <SEP> steriler <SEP> Luft <SEP> etwa <SEP> 153 <SEP> l/min
<tb> Druck <SEP> etwa <SEP> 0,5 <SEP> au <SEP>
<tb> Rührbewegung <SEP> 180 <SEP> Umdr/min
<tb>
Sobald das kompakte Zellvolumen mindestens 2 ml erreicht hat, überträgt man den Inhalt des Fer-
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500 1rilen Mediums enthält :
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<tb>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> kg
<tb> Losliche <SEP> Fischbestandteîle <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> kg
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> (getrocknet) <SEP> 1,7 <SEP> kg
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> kg <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 51,0 <SEP> kg
<tb> Schaumbekämpfungsmittel <SEP> (GE <SEP> 60) <SEP> 500 <SEP> ml
<tb> Weiches <SEP> Wasser <SEP> 1665 <SEP> 1
<tb>
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425 1 Luft mit einem Druck von etwa 0,5 atü zuführt. Gegen Ende der Bebrütungszeit erreicht die Aktivi- tät des gebildeten Antibioticums ein Maximum, das im wesentlichen konstant bleibt, wie sich durch Probenahme und Testen gegen Staphylococcus aureus ermitteln lässt.
Während der Bebrütung bleibt das PH im wesentlichen konstant im Bereiche von 7, 0 bis 7, 3. Das kompakte Zellvolumen erreicht einen konstanten Wert von etwa 2, 0 ml.
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gleich grossen Volumen Toluol extrahiert, die Toluolextrakte vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein dunkelbrauner öliger Rückstand hinterbleibt. Dieser wird in 1000 ml Chloroform suspendiert, filtriert und die Chloroformlösung unter heftigem Rühren zu dem zehnfachen Volumen Petrol- äther gefügt. Man setzt das Rühren 5 min lang fort, trennt den entstandenen halbfesten öligen Niederschlag durch Dekantieren von der überstehenden Flüssigkeit, löst ihn in 600 ml Chloroform neuerlich auf und fügt die erhaltene Lösung unter heftigem Rühren zu dem fünffachen Volumen Petroläther.
Der dabei ausfallende amorphe Niederschlag wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet.
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F) Alternativverfahren zur Isolierung der antibiotischen Substanzen aus der Tankfermentation :
An Stelle des Verfahrens von Teil E) dieses Beispiels kann auch das Extraktionsverfahren von Beispiel 1 C) angewendet werden. Dabei erhält man etwa 125 g eines festen Produktes mit einer Aktivität, die derjenigen des Produktes von Beispiel 1 C) vergleichbar ist.
G) Auftrennung der antibiotischen Substanzen in Komponenten :
Hier wird im Gegensatz zu der Methode von Beispiel 1 D) eineSäulenchromatographie anDiatomeen- erde angewendet, mit deren Hilfe die antibiotischen Substanzen aufgetrennt und die Komponenten R-451 A, R-451 B, R-451 D, R-451 E sowie die weitere Komponente R-451 Cl isoliert werden können.
Die Auftrennung der gemäss Teil E) oder - weniger vorteilhaft - Teil F) dieses Beispiels anfallenden
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mittelsystems und gereinigter Diatomeenerde (Handelsprodukt Chromosorb W der Firma Johns Manville & Co., nicht mit Säure gewaschen, Korngrösse 60 - 100 Maschen) als inertem Träger fur dieschwerere
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Phase.
Man bereitet zunächst ein Zweiphasen- Lösungsmittelsystem der folgenden Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 60-900C) <SEP> 25 <SEP> Teile
<tb> Äthylacetat <SEP> 75 <SEP> Teile
<tb> Methylalkohol <SEP> 70 <SEP> Teile
<tb> i <SEP> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 30 <SEP> Teile
<tb>
Dann bringt man 1, 9 kg des inerten Trägers mit 950 ml der schwereren Phase des obigen Zweiphasen-
Lösungsmittelgemisches ins Gleichgewicht und giesst das Gemisch langsam in eine 9 cm weite, am Boden mit einer Frittenscheibe versehene Glassäule ein, die vorher zu drei Vierteln mit der leichteren Phase gefüllt wurde. Man lässt die Diatomeenerde sich in der Säule zu einem kompakten Bodensatz absetzen und komprimiert dann weiter mittels eines Stickstoffdrucks von etwa 0, 07 bis 0,15 atü (die Höhe der so hergestellten Säule ist 137 cm).
Nun löst man 7,0 g der amorphen Mischung aus Teil E) bzw. F) dieses Beispiels in 38 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems, versetzt die Lösung mit 19 g Diatomeenerde, bringt die so erhaltene Mischung oben auf die Füllung der Säule auf und komprimiert fest. Man eluiert mit der leichteren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems.
Die Eluate werden mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/min entnommen. Die Anzahl einzelner Fraktionen ist beliebig, hängt aber von dem"Holdup-Volumen" (HUV) der Säule ab. (Das HUV ist definiert als dasjenige Volumen, das die leichtere Phase des Zweiphasen-Systems innerhalb der gesamten Saulenfulhmg einnimmt.) In der vorstehend beschriebenen Säule beträgt das HUV etwa 3500 ml. Das erste gesammelte HUV wird verworfen. Von den darauffolgenden Fraktionen wird je eine Probe mittels des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems I (Tabelle VI) papierchromatographiert und das entwickelte und getrocknetePapierchromatogramm gegen Staphylococcus aureus bioautographisch getestet.
Die Fraktionen werden entsprechend dem Testergebnis zu Gruppen vereinigt, die Fraktionsgruppen im Vakuum zur Trockne eingedampft, die Rückstände gewogen und zur Ermittlung ihrer relativen Zusammensetzung neuerlich papierchromatograph : sch und bio autographisch untersucht. So gelangt man zu den Ergebnissen der Tabelle Vin.
1 g des aus HUV 3-10 erhaltenen Produktes wird dann neuerlich chromatographiert, wobei man den inerten Träger (Chromosorb W) für die schwerere Phase des folgenden Zweiphasen-Lösungsmittelsystems verwendet :
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<tb>
<tb> Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 30 <SEP> - <SEP> 600C) <SEP> 10 <SEP> Teile
<tb> Toluol <SEP> 200 <SEP> Teile
<tb> n- <SEP> Butylalkohol <SEP> 15 <SEP> Teile
<tb> Äthylalkohol <SEP> 15 <SEP> Teile
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 70 <SEP> Teile
<tb>
Man bringt zunächst 600 g des Diatomeenerdeträgers mit 300 ml der schwereren Phase des letztgenannten Zweiph en-Lösungsmittelsystems ins Gleichgewicht, giesst das Gemisch langsam in eine teilweise mit der leichteren Phase dieses Zweiphasen-Lösungsmittelsystems gefüllte Glassäule mit einem Durchmesser von 5 cm,
lässt den Träger sich durch seine Schwere zu einem kompakten Bodensatz absetzen und komprimiert weiter durch einen Stickstoffdruck von etwa 0, 07 bis 0,15 atü. Die Höhe der so bereiteten Säule beträgt 107 cm, und ihr Holdup-Volumen beträgt 900 ml. Darauf wird das zu chromatographierende Produkt in 10 ml der schwereren Phase gelöst, die Lösung mit 5 g des inerten Trägers versetzt und durchgemischt. Die Mischung wird dann auf die Füllung der Säule aufgebracht und fest angepresst. Man eluiert anschliessend mit der leichteren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 100 ml/min. Man entnimmt dabei kontinuierlich Fraktionen von 50 bis 900 ml (entsprechend 1/18 - 1/1 des HUV der Säule).
Das erste HUV, das unmittelbar nach dem Aufbringen des Produktes anfällt, wird verworfen, das zweite und die folgenden werden gesammelt.
Eine Probe jeder gesammelten Fraktion wird sofort mittels des Lösungsmittelsystems I (Tabelle VI) papierchromatographicrt und das entwickelte und getrocknete Papierchromatogramm gegen Staphylococcus aureus bioautographisch getestet. (Lösungsmittelsystem I wird bevorzugt, weil es am raschesten wandert.) Die Fraktionen,. werden entsprechend ihren papierchromatographischenDaten gruppenweise vereinigt und im Vakuum ur Trockne cingedampft, die Rückstände gewogen und neuerlich einer Papier- chromatograph e und bio :'utographischen Tcstung unterzogen, um ihre Zusammensetzung zu bestätigen.
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Das Ergebnis der so erfolgten säulenchromatographischen Auftrennung ist in Tabelle IX gezeigt.
Beispiel 4: Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea var. aurantiaca in techni- schem Massstab.
Wenn man die lyophilisierte Kultur von M. carbonacea, wie sie in Teil A) von Beispiel 3 verwendet wird, durch eine entsprechende Kultur von M. carbonacea var. aurantiaca ersetzt und sonst dem Verfah- ren des Beispiels 3 C Telle A)-D), dann E) oder F), schliesslich G)] folgt, so gelangt man in gleicher Wei- se zu R-451.
Beispiel 5 : Abtrennung von Komponente R-451 D aus R-451.
Man suspendiert 100 mg des Rückstandes aus HUV 1, 5 - 14 gemäss Tabelle IX Beispiel 3 G)] oder der entsprechendenFraktion des Beispiels 4, bei Zimmertemperatur unter heftigem Rühren in 40 ml Äther, filtriert und lässt das Filtrat über Nacht in der Kälte stehen. Der dabei ausfallende Niederschlag wird ab- filtriert, mit eiskaltem Äther gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man etwa 81 mg R-451 D in Form eines nahezu farblosen Pulvers mit einem Prüfwert von 1155 Einheiten/mg erhält.
Das so erhaltene R-451 D erweist sich bei quantitativer Prüfung gegen Staphylococcus aureus als biologisch homogen. Wenn man es nach der Methodik von Stahl unter Verwendung von Aceton-Benzol (1 : 1) aïs Elutionsmittel an einer dünnen Schicht Silikagel chromatographiert und die entwickelte und getrocknete Platte anschliessend mit Schwefelsäure behandelt, so lässt sich keine andere Substanz als
R-451 D entdecken.
Beispiel 5 a : Das Produkt von Beispiel 5 kann weiter gereinigt werden wie folgt : Man löst in möglichst wenig heissem Isopropanol, fügt Aktivkohle (etwa leo des Gewichtes der zu reinigenden Substanz) zu, filtriert und kühlt in einem Eisbad. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Isopropanol gewaschen und im Hochvakuum bei Zimmertemperatur getrocknet. Das so gereinigte Produkt hat einen Prüfwert von 1450 Einheiten/mg.
Beispiel 6 : Herstellung von R-451 D-Acetat.
Man löst 25 mg R-451 D in 1 ml Pyridin, versetzt mit 0, 4 ml Essigsäureanhydrid und lässt die Mischung über Nacht stehen. Dann wird der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, zur Entfernung des Pyridins und der entstandcnen Essigsäure mit Wasser gewaschen und über Nacht im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute : 11 mg eines farblosen amorphen Pulvers, Fp. = 135-1360C. Eine zweite Menge lässt sich aus der Mutterlauge des genannten Niederschlages durch Kühlen über Nacht im Eisschrank (50C), Abfiltrieren des Niederschlages, Freiwaschen von Pyridin und Essigsäureanhydrid sowie Trocknen, wie oben angegeben, erzielen. Ausbeute : 6 mg eines farblosen, amorphen Pulvers.
Wenn man das Produkt an einer dünnen Schicht chromatographiert, wobei man als Adsorbens Silikagel (Handelsprodukt"Silikagel G" der Firma E. Merck AG., Darmstadt) und als Eluierungssystem AcetonBenzol (1 : 1) verwendet, und die entwickelte und getrocknete Platte mit Schwefelsäure besprüht, so lässt sich nur eine einzige Komponente mit dem RF-Wert 0, 87 feststellen. (Unter diesen Bedingungen hat R-451 D einen RF-Wert von 0, 49.) Bei alkalischer Hydrolyse in Methanol wird aus R-451 D-Acetat das eingesetzte R-451 D rückgebildet.
Beispiel 6 a : Das Produkt von Beispiel 6 lässt sich weiter reinigen wie folgt : Man löstin Methylen- chlorid, fügt Aktivkohle zu, filtriert und versetzt das klare Filtrat mit Hexan. Der Niederschlag wird abfiltriert und an der Luft getrocknet.
Beispiel 7 Abtrennung der Komponente R-451 E.
Diese unpolare Komponente der Antibioticamischung findet sich gewöhnlich in hoher Konzentration in der überstehenden Flüssigkeit der Chloroform-Petroläther-Fällung, die in Teil E) des Beispiels 3 beschrieben ist, und in der entsprechenden gemäss Beispiel 4 erhaltenen Fraktion. In geringerer Menge ist sie auch in den ausgefällten antibiotischen Substanzen enthalten und kann von da mit Hilfe des Säulen- chromatographieverfahrens, das in Teil G) des Beispiels 3 beschrieben ist, isoliert werden. Zur Gewinnung von R-451 E wird die Fraktion HUV 1-1, 5 (Tabelle IX) im Vakuum zur Trockne eingedampft und an der Luft getrocknet. So erhält man etwa 320 mg einer bernsteinfarbenen Substanz, von der man weiter durch Umfällen aus Äther-Hexan zu 280 mg eines nahezu farblosen amorphen Pulvers, gereinigtem R-451 E, gelangt.
Nach dem Ergebnis einer papierchromatographischen Untersuchung im System I (Tabelle VI) und anschliessender Bioautographie gegen Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis zu sch1iessen. ist das so hergestellte Antibioticum R-451 E biologisch homogen.
Beispiel 8: Abtrennung der Komponenten R-451 B, R-451 Cl und R-451 A.
A) Vortrennung :
Die Abtrennung der oben genannten Komponenten aus der rohen Antibioticamischung wird durch eine Verteilungschromatographie ähnlich der in Teil G) des Beispiels 3 beschriebenen eingeleitet, wobei
<Desc/Clms Page number 9>
man ein Zweiphasen-Lösungsmittelsystem und eine gereinigte Diatomeenerde (Handelsprodukt Chromosorb W der Firma Johns Manville & Co., nicht mit Säure gewaschen, Korngrösse 60 - 100 Maschen) als inerten Träger für die schwerere Phase verwendet :
Manstellt zunächst das Zweiphasen-System (Petrolâther, Äthylacetat, Methanol, Wasser) her, wie in Beispiel 3 G) beschrieben. Dann bringt man 2,5 kg des inerten Trägers mit 1250 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelgemisches ins Gleichgewicht und füllt die Säule wie in Beispiel 3 G) beschrieben.
Das HUV dieser Säule beträgt etwa 8 000 ml.
Nun löst man 7,4 g der amorphen Mischung nach Beispiel 3 E) oder der entsprechenden, gemäss Beispiel 4 erha1tenenFraktion in 40 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems, fügt 20 g Diatomeenerde zu, gibt die feste Mischung oben auf die Säulenfüllung auf und komprimiert fest. Man eluiert mit der leichteren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems. Nach dem in Beispiel 3 G) beschriebenen säulenchromatographischen Trennverfahren gelangt man zu den Ergebnissen der Tabelle X.
Wie man sieht, werden die Komponenten R-451 B und R-451 Cl in der Fraktionengruppe HUV 1, 9-2, 8, die Komponente R-451 A in der Fraktionengruppe HUV 4, 0 - 5, 0 angereichert.
B) Trennung von R-451 B und R-451 Cl voneinander :
Man chromatographiert 1,8 g des Rückstandes der bei der vorstehenden chromatographischen Trennung anfallenden Fraktionengruppe HUV 1, 9 - 2, 8 an 1800 g Cellulosepulver (Marke Whatman, nicht mit Säure gewaschen, fein), das sich in einer Säule mit 7,5 cm Durchmesser und 150 cm Höhe befindet, wobei man das folgende einphasige Lösungsmittelgemisch verwendet :
EMI9.1
<tb>
<tb> Aceton <SEP> 1 <SEP> Teil
<tb> Petroläther <SEP> (Siedebereich <SEP> 30-600C) <SEP> 25 <SEP> Teile
<tb> Benzol <SEP> 50 <SEP> Teile
<tb>
Man löst die zu chromatographierendeSubstanz in 68 ml des Lösungsmittelgemisches, fügt 50 g Cellulose bei und bringt das Gemisch oben auf die Säule auf.
Dann eluiert man mit einerDurchfluBgeschwin- digkeit von 50 ml/min, wobei man kontinuierlich Fraktionen à 100 ml entnimmt. Das HUV dieser Säule beträgt etwa 6 000 ml. Die Eluate werden gruppenweise vereinigt, wie in Tabelle XI gezeigt. Wie ersichtlich, wird die Komponente R-451 B in der Fraktionengruppe HUV 17, 7 - 27, 7, die Komponente R-451 Cl in der Fraktionengruppe HUV 1, 7 - 17, 6 angereichert.
C) Reinigung von R-451 B :
Man löst 200 mg des aus der Fraktionengruppe HUV 17, 7-27, 7 (Tabelle XI) erhaltenen Rückstandes in 5 ml Aceton und giesst die Acetonlösung unter heftigem Schütteln in 50 ml Hexan. Der ausfallende Niederschlag wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet, wobei man zu 120 mg eines nahezu weissen Pulvers gelangt. Das so erhaltene R-451 B kann mit Spuren anderer Komponenten verunreinigt sein ; wenn man es jedoch nach der Methode von Stahl an einer dünnen Silikagelschicht unter Verwendung von Aceton-Benzol (1 : 1) als Elutionsmittel chromatographiert und die entwickelte, getrocknete Platte anschliessend mit Schwefelsäure behandelt, so ist nur eine einzige Substanz nachweisbar, so dass also eine weitere Reinigung nicht nötig ist.
D) Reinigung von R-451 Cl :
Man löst 100 mg des aus der Fraktionengruppe HUV 1, 7 - 17, 6 (Tabelle XI) erhaltenen Rückstands in 5 ml Aceton und giesst die Lösung unter heftigem Schütteln in 50 ml Isopropyläther. Der ausfallende Niederschlag wird abfiltriert, mit Isopropylather gewaschen und bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Man gelangt so zu etwa 70 mg eines nahezu weissen, aus R-451 Cl bestehenden Pulvers. Das so erhaltene Produkt ist, wie aus quantitativer Testung gegen Staphylococcus aureus folgt, im wesentlichen biologisch homogen.
E) Reinigung von R-451 A :
EMI9.2
(Tabelle X) erhaltenen Rückstandes in 10 ml Dichlormethan auf, filiert, wäscht den festen Rückstand mit Dichlormethan und trocknet ihn bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd. So erhält man 70 mg eines weisslichen, aus R-451 A bestehenden Pulvers.
Beispiel 9 : Statt nach dem in Beispiel 8 [Teile A)-C)] beschriebenen Verfahren kann R-451 B auch wie folgt isoliert werden : Man bereitet eine 64 cm hohe Chromatographiesäule mit einem Durchmesser von etwa 50 mm, indem man eine Aufschlämmung in Methylenchlorid von 500 g Florisil (60 bis 100 Maschen), das 18 h bei 1050C aktiviert wurde, in eine Glassäule giesst - das Holdup-Volumen der so bereiteten Säule ist 1100 ml. Man löst 50 g des amorphen rohen Antibioticums, wie man es aus
<Desc/Clms Page number 10>
Beispiel 3 [Teil E)] erhält, in 300 ml Methylenchlorid und gibt die erhaltene klare Lösung auf die Florisilsäule auf.
Zur Elution schickt man erst 4 HUV Methylenchlorid, dann 8 HUV Methylenchlorid-Aceton (95 : 5), hierauf 8 HUV Methylenchlorid-Aceton (90 : 10), weiter 8 HUV Methylenchlorid-Aceton (80 : 20), 8 HUV Methylenchlorid-Aceton (50: 50) undschliesslich 16 HUV reines Aceton durch die Säule.
Tabelle XIA zeigt das Ergebnis dieser Auftrennung, wobei die eingeklammerten Buchstaben in der rechten Tabellenspalte die in der betreffenden Fraktion vorliegenden R-451-Komponenten bezeichnen.
Das nach dem vorstehenden Absatz oder nach Beispiel. 8 Teile A)-C)] erhaltene Produkt kann weiter gereinigt werden wie folgt Man löst das amorphe Pulver in heissem Isopropanol, fügt Aktivkohle (etwa 101o des Gewichts der zu reinigenden Substanz) zu, rührt 10 min, filtriert und kühlt das Filtrat auf 5 C. Der sich abscheidende Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt, mit kaltem Isopropanol gewaschen und 24 h bei Zimmertemperatur im Hochvakuum getrocknet. Das Produkt hat einen Prüfwert von 760 Einheiten/mg.
Beispiel 10 : Herstellung des Methy1äthers von R-451 D.
Man löst 500 mg R-451 D in 11 ml Äthylacetat und 11 ml Äthyläther, fügt einen Überschuss einer ätherischen Diazomethanlösung zu und lässt die gelbe Lösung 72 h bei 50C stehen. Dann wird in einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 5 ml Isopropanol gelöst, gekühlt und der gebildete Niederschlag abfiltriert.
Man wäscht mit kaltem Isopropanol und trocknet das erhaltene Produkt, das aus 260 mg des gewünschten Methyläthers in Form farbloser Prismen mit den folgenden physikalischen
EMI10.1
Rohes R-451, hergestellt nach Beispiel 1 D), ist eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften :
EMI10.2
<tb>
<tb> I. <SEP> Schmelzpunkt <SEP> 200-204 C
<tb> n. <SEP> Analysenwerte <SEP> (qualitative <SEP> Gruppenbestimmung):
<tb> 1. <SEP> Ninhydrintest <SEP> negativ
<tb> 2. <SEP> Ferrichlorid <SEP> negativ
<tb> II. <SEP> Optische <SEP> Drehung <SEP> : <SEP>
<tb> [α]25D <SEP> = <SEP> -16 <SEP> (0,5% <SEP> in <SEP> Chloroform)
<tb>
IV. Löslichkeit :
Löslich in Wasser ; unlöslich in Petroläther ; löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln; in einem Methanol-Methanol-System durch eine Cellophanmembrane dialysierbar.
V. Ultraviolettspektrum :
Fig. 1 der Zeichnungen zeigt das Absorptionsspektrum für eine Konzentration in Methanol von 5 g/100 ml (X bedeutet die Wellenlänge in mali, D die optische Dichte) --max bei 288 ma L (E1% = 50).
VI. Infrarotspektrum :
Fig. 2 der Zeichnungen stellt das Spektrum in Nujol*) dar, wobei X die Wellenlänge in ju, y die Frequenz in cm* und A, die Absorption bedeuten. Die Absorptionsmaxima (schw = schwach, m = mittel, m-st = mittel bis stark, st = stark, sst = sehr stark, Sch = Schulter) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen :
EMI10.3
<tb>
<tb> \ <SEP> (jLi) <SEP> Intensité <SEP>
<tb> 2,92 <SEP> st
<tb> 5,84 <SEP> m
<tb> 6,00 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 6. <SEP> 12 <SEP>
<tb> 6,45 <SEP> m-st
<tb> 8, <SEP> 00 <SEP> Sch
<tb> 8,07 <SEP> st
<tb> 8,33 <SEP> m-st
<tb> 8, <SEP> 5fi <SEP> Sch
<tb> 9, <SEP> 10 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb>
*) Nujol ist eine Handelsmarke für ein Mineralöl auf Kohlenwasserstoffbasis, hinreichend rein für die Infrarotspektroskopie, erhältlich von der Firma Plough Inc., Memphis, Tennessee.
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> À <SEP> (Il) <SEP> Intensität <SEP>
<tb> 9, <SEP> 60 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10, <SEP> 26 <SEP> m-st
<tb> 10, <SEP> 55 <SEP> m-st
<tb> 11, <SEP> 02 <SEP> schw
<tb>
VII. Stabilität :
Bei PH < 7 schon bei 200C instabil.
Bei PH > 7 bleibt die Aktivität noch nach 30 min langem Er- hitzen auf 1000C erhalten.
EMI11.2
:Bei papierchromatographischer Untersuchung, wie unten ausgeführt, und bioautographischer Ermittlung der Fleckenverteilung (gegenStaphylococcus aureus, wie oben beschrieben) gelangt man zu den folgenden RF-Werten für R-451 :
EMI11.3
<tb>
<tb> Angewendetes <SEP> Lösungsmittelsystem <SEP> RF-Werte
<tb> A: <SEP> 80%iges <SEP> wässeriges <SEP> Methanol <SEP> +3%
<tb> Natriumchlorid <SEP> ; <SEP> aufsteigend <SEP> ; <SEP> Papier
<tb> vorher <SEP> mit <SEP> Sulfat-Bisulfat <SEP> auf <SEP> PH <SEP> = <SEP> 2, <SEP> 3
<tb> gepuffert <SEP> 0,80
<tb> B <SEP> : <SEP> n-Propanol-Pyridin-Wasser-Essigsäure
<tb> (15 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> : <SEP> 12) <SEP> ; <SEP> aufsteigend <SEP> 1,0
<tb> C <SEP> :
<SEP> n-Propanol-Wasser-Essigsäure <SEP>
<tb> (50 <SEP> : <SEP> 40 <SEP> : <SEP> 5); <SEP> aufsteigend <SEP> 0, <SEP> 93
<tb> D <SEP> : <SEP> SOoiges <SEP> wässeriges <SEP> Phenol <SEP> ; <SEP> aufsteigend <SEP> 0, <SEP> 95
<tb> E <SEP> : <SEP> Benzol-Methanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> ; <SEP> aufsteigend <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> F <SEP> : <SEP> Benzol-Chloroform <SEP> (95 <SEP> : <SEP> 5) <SEP> ; <SEP> absteigend <SEP> ; <SEP>
<tb> Papier <SEP> zuerst <SEP> mit <SEP> Formamid-Methanol
<tb> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> gesättigt <SEP> und <SEP> vor <SEP> Verwendung
<tb> (zur <SEP> Entfernung <SEP> des <SEP> Methanols) <SEP> an <SEP> der
<tb> Luft <SEP> getrocknet <SEP> 0, <SEP> 0
<tb> G <SEP> : <SEP> Benzol-Petroläther <SEP> (Siedebereich
<tb> 30 <SEP> - <SEP> 600C) <SEP> -Aceton <SEP> (10 <SEP> : <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> : <SEP> 5) <SEP> ;
<SEP>
<tb> absteigend <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0. <SEP> 14 <SEP> ; <SEP>
<tb> 0. <SEP> 28 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 64. <SEP>
<tb>
Von den Einzelkomponenten von R-451 ist die Komponente R-451 A, erhalten nach dem Verfahren von Beispiel 8 E), eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden Eigenschaften :
I. Ultraviolettspektrum :
Transparent im Bereiche von 220 bis 360 mil.
H. Infrarotspektrum : (Spektrum in Nujol, s. Fig. 3 der Zeichnungen)
Absorptionsmaxima (alle breit und stark ausgeprägt) befinden sich bei folgenden Wellenlängen : 2, 90 , 6,25 , 8,25-10,00 .
R-451 B, hergestellt nach Beispiel 8 C), ist eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden Eigenschaften :
I. Ultraviolettspektrum :
Transparent im Bereiche von 220 bis 360 mu.
H. Infrarotspektrum : (Spektrum in Nujol, s. Fig. 4 der Zeichnungen)
Absorptionsmaxima (mit Intensitäten wie angegeben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen :
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb> X <SEP> (fi) <SEP> Intensität
<tb> 2,94 <SEP> m-st
<tb> 5, <SEP> 72 <SEP> st
<tb> 5,80 <SEP> m-st
<tb> 7, <SEP> 92 <SEP> m-st
<tb> 8,60 <SEP> m-st
<tb> 9, <SEP> 10 <SEP> sr <SEP> (breit) <SEP>
<tb> 9,64 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 12,50 <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb> 13, <SEP> 90 <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb>
EMI12.2
:IV. Analysenwerte : a) Elementaranalyse :
EMI12.3
Methoxygruppen = 12, 80%, C-Methylgruppen = 7. 15%, N-Methylgruppen = 2, 33%.
V. Infrarotspektrum (in Nujol) : Absorptionsmaxima (mit Intensitäten wie angegeben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen :
EMI12.4
<tb>
<tb> # <SEP> ( ) <SEP> Intensität
<tb> 2, <SEP> 88 <SEP> st
<tb> 3. <SEP> 35-3, <SEP> 48 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 3, <SEP> 65 <SEP> schw
<tb> 4, <SEP> 54 <SEP> schw
<tb> 4, <SEP> 65 <SEP> schw
<tb> 5,74 <SEP> st
<tb> 5, <SEP> 82 <SEP> Sch
<tb> 6,02 <SEP> Sch
<tb> 6, <SEP> 10 <SEP> m
<tb> 6, <SEP> 35 <SEP> - <SEP> 6,39 <SEP> m <SEP> (Dublett)
<tb> 6,45 <SEP> st
<tb> 6, <SEP> 78 <SEP> - <SEP> 6, <SEP> 87 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 7, <SEP> 24 <SEP> st
<tb> 7,30 <SEP> Sch
<tb> 7,40 <SEP> Sch
<tb> 7, <SEP> 67- <SEP> 7, <SEP> 80 <SEP> Sch
<tb> 7, <SEP> 92 <SEP> Sch
<tb> 7, <SEP> 98 <SEP> st
<tb> 8,12 <SEP> Sch
<tb> 8, <SEP> 30 <SEP> - <SEP> 8.
<SEP> 35 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 8, <SEP> 55 <SEP> Sch
<tb> 8, <SEP> 75 <SEP> - <SEP> 9, <SEP> 80 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10, <SEP> 20 <SEP> - <SEP> 10, <SEP> 26 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10, <SEP> 30 <SEP> Sch
<tb> 10, <SEP> 33 <SEP> Sch
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb>
<tb> # <SEP> (fi) <SEP> Intensität
<tb> 10, <SEP> 61 <SEP> st
<tb> 10, <SEP> 85 <SEP> Sch
<tb> 11, <SEP> 03 <SEP> m
<tb> 11, <SEP> 52 <SEP> m
<tb> 11, <SEP> 70 <SEP> Sch
<tb> 11, <SEP> 85-12, <SEP> 00 <SEP> Sch
<tb> 12, <SEP> 75-12, <SEP> 81 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 12, <SEP> 98 <SEP> schw
<tb> 13, <SEP> 54-13, <SEP> 60 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 13, <SEP> 85-13, <SEP> 90 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb>
EMI13.2
:Löslich in Chlorkohlenwasserstoffen (Methylenchlorid, Chloroform), Alkohol, Aceton, Pyridin und verdünntem Alkali ; wenig löslich in Benzol ;
unlöslich in Äther, Hexan und Wasser. i R-451 D, hergestellt wie vorstehend beschrieben, ist ein weisses amorphes Pulver mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften :
EMI13.3
<tb>
<tb> I. <SEP> Schmelzpunkt <SEP> (im <SEP> Kofler-Block) <SEP> : <SEP>
<tb> Produkt <SEP> nach <SEP> Beispiel <SEP> 5 <SEP> 138 <SEP> - <SEP> 1400C <SEP> ; <SEP>
<tb> Produkt <SEP> nach <SEP> Beispiel <SEP> 5 <SEP> A) <SEP> 160-1610C.
<tb>
Analysenwerte : a) Elementaranalyse des Produktes nach Beispiel 5 :
EMI13.4
EMI13.5
<tb>
<tb> e) <SEP> Qualitative <SEP> Gruppenbestinm1l1ng <SEP> : <SEP>
<tb> 1. <SEP> Ninhydrintest <SEP> negativ
<tb> 2. <SEP> Elson-Morgan-Test <SEP> positiv
<tb> 3. <SEP> Test <SEP> mit <SEP> alkalischem <SEP> KMnO <SEP> positiv
<tb> 4. <SEP> Anthrontest <SEP> graublau
<tb> 5. <SEP> 2,4-Dinitro-phenylhydrazintest <SEP> positiv
<tb> 6. <SEP> Ehrlich-Test <SEP> (Diphenylamin) <SEP> negativ
<tb> 7. <SEP> Triphenyl-tetrazoliumtest <SEP> negativ
<tb> m. <SEP> Optische <SEP> Drehung:
<tb> Produkt <SEP> nach <SEP> Beispiel <SEP> 5 <SEP> [α]25D <SEP> = <SEP> +29,2 <SEP> (1% <SEP> in <SEP> Dioxan)
<tb> Produkt <SEP> nach <SEP> Beispiel <SEP> 5 <SEP> A) <SEP> [α]25D <SEP> = <SEP> -25,3 <SEP> (1% <SEP> in <SEP> Methanol)
<tb> -37,7 <SEP> (1% <SEP> in <SEP> Pyridin)
<tb>
IV.
Löslichkeit : Sehr gut löslich in Chloroform, Methylenchlorid. Aceton und Methanol sowie 0, 1 n-Natriumhydroxyd; wenig löslich in Äther; unlöslich in Petroläther, Toluol, Benzol, Wasser und lomiger wässeriger Natriumbicarbonat-oder-carbonatlösung.
V. Ultraviolettspektrum :
Fig. 1 der Zeichnungen zeigt das Spektrum in Methanol des Produktes nach Beispiel 5 bei einer Kon-
EMI13.6
<Desc/Clms Page number 14>
VI. Infrarotspektrum :
Fig. 5 der Zeichnungen zeigt das Spektrum in Nujol des Produktes nach Beispiel 5. Die Absorptionsmaxima befinden sich bei den folgenden Wellenlängen :
EMI14.1
<tb>
<tb> À <SEP> (/l) <SEP> Intensität <SEP>
<tb> 2, <SEP> 88 <SEP> st
<tb> 5, <SEP> 73 <SEP> st
<tb> 6, <SEP> 13 <SEP> m-st
<tb> 6,33 <SEP> m-st
<tb> 6,45 <SEP> st
<tb> 7, <SEP> 98 <SEP> st
<tb> 8, <SEP> 32 <SEP> st
<tb> 8 <SEP> 501 <SEP> sot <SEP>
<tb> 10, <SEP> 00
<tb> 10, <SEP> 22 <SEP> st
<tb> 10.
<SEP> 55 <SEP> st
<tb> 11, <SEP> 00 <SEP> m-st
<tb> 11,55 <SEP> m-st
<tb> 12, <SEP> 30 <SEP> schw
<tb> 12, <SEP> 98 <SEP> schw
<tb> 13, <SEP> 55 <SEP> m-st
<tb> 13, <SEP> 87 <SEP> m-st
<tb>
EMI14.2
EMI14.3
<tb>
<tb> 5À <SEP> (j) <SEP> Intensität
<tb> 2,89 <SEP> st
<tb> 3, <SEP> 35- <SEP> 3, <SEP> 48 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 5,73 <SEP> st
<tb> 6,12 <SEP> schw
<tb> 6,35 <SEP> Sch
<tb> 6,45 <SEP> st
<tb> 6, <SEP> 77- <SEP> 6, <SEP> 82 <SEP> st
<tb> 7,10 <SEP> Sch
<tb> 7,24 <SEP> st
<tb> 7,30 <SEP> Sch
<tb> 7,42 <SEP> st
<tb> 7, <SEP> 68-7, <SEP> 84 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 7,99 <SEP> st
<tb> 8,33 <SEP> st
<tb> 8, <SEP> 48- <SEP> 8, <SEP> 70 <SEP> Sch
<tb> 8, <SEP> 84- <SEP> 9,17 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 9, <SEP> 57 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10,00 <SEP> Sch
<tb> 10, <SEP> 22-10, <SEP> 26 <SEP> st <SEP> (Dublett)
<tb> 10,55 <SEP> st
<tb> 10,
<SEP> 91 <SEP> Sch
<tb> 11, <SEP> 00 <SEP> m
<tb> 11, <SEP> 50-11, <SEP> 60 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 11, <SEP> 66 <SEP> Sch
<tb> 11, <SEP> 90-12, <SEP> 00 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 12, <SEP> 25-12, <SEP> 35 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 12, <SEP> 70-12, <SEP> 85 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 13, <SEP> 00 <SEP> schw
<tb> 13, <SEP> 52-13, <SEP> 60 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 13, <SEP> 85-13, <SEP> 90 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 14, <SEP> 42-14, <SEP> 58 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
VII. Bildung von Derivaten : a) Acetat, hergestellt nach Beispiel 6 :
Fp. = 135 - 1360C ; nach Reinigung gemäss Beispiel 6 A) Fp. = 151-160 C.
Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 285 bzw. 286 mbt (E1% = 9,2).
Elementaranalyse : C 53,08%, H 7,08%, N 0,77%;
Infrarotabsorptionsbanden (in Nujol) bei den folgenden Wellenlängen :
EMI15.1
<tb>
<tb> X <SEP> ( ) <SEP> Intensität
<tb> 2,85 <SEP> schw <SEP> (breit) <SEP>
<tb> 5,57 <SEP> m-st
<tb> 5,71 <SEP> st
<tb> 6,14 <SEP> schw
<tb> 6,45 <SEP> m-st
<tb> 8,02 <SEP> st
<tb> 8,38 <SEP> m-st
<tb> 8,88 <SEP> st
<tb> 9,17 <SEP> st
<tb> 9,55 <SEP> st
<tb>
VIII. Stabilität :
R-451 D ist bei 00C und in der Dunkelheit stabil. Bei Zimmertemperatur im direkten Sonnenlicht nimmt die Aktivität nach 24 h langsam ab und ist nach etwa drei Wochen vollständig verschwunden. Gelöst in Methanol, ist R-451 D mindestens zwei Wochen stabil. Bei einem PH unterhalb 5,5 geht die Aktivität rasch verloren, wogegen bei einem PH von mehr als 7 und bis zu 14 die Aktivität mehrere Tage lang erhalten bleibt.
Bei Behandlung mit 0, 1 n-methanolischer Chlorwasserstoffsäure bei Zimmertemperatur geht die antibiotische Aktivität innerhalb 16 h verloren ; behandelt man die saure Mischung mit einer stöchiometrischen Menge 2%iger wässeriger Natriumbicarbonatlösung, dampft anschliessend das Methanol im Vakuum ab und extrahiert mit Chloroform, so erhält man, wie sich durch Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit Benzol-Aceton (75 : 25) als Lösungsmittel und anschliessendes Besprühen mit Schwefelsäure feststellen lässt, eine Mischung von fünf Komponenten, die sämtlich weniger polar als R-451D sind. Bei 16stündigemBehandeln mit 1,0 n-NaOH-Lösung bei Zimmertemperatur bleibt die Aktivität vollständig erhalten.
R-451 E, isoliert und gereinigt, wie in Beispiel 7 beschrieben, ist ein nahezu farbloses amorphes Pulver mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften :
I. Schmelzpunkt : 89 - 960C
II. Analysenergebnisse : a) Elementaranalyse :
C 65,17%, H 7, 54qu, N 1, zo 0 24, 2eo. b) Qualitative Gruppenbestimmungen :
EMI15.2
<tb>
<tb> 1. <SEP> Ninhydrintest <SEP> negativ
<tb> 2. <SEP> Elson-Morgan-Test <SEP> positiv
<tb> 3. <SEP> Test <SEP> mit <SEP> alkalischem <SEP> KMnO, <SEP> positiv
<tb> 4. <SEP> Anthrontest <SEP> positiv
<tb> 5.2, <SEP> 4-Dinitro-phenylhydrazintest <SEP> positiv
<tb> 6. <SEP> Ehrlich-Test <SEP> (mit <SEP> Diphenylamin) <SEP> negativ
<tb> 7. <SEP> Triphenyl-tetrazoliumtest <SEP> positiv
<tb>
EMI15.3
IV.
Löslichkeit :
Löslich in Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Methanol und Äther ; schlecht löslich in Benzol, Toluol und Hexan ; unlöslich in Wasser.
V. Ultraviolettspektrum :
EMI15.4
<Desc/Clms Page number 16>
:VI. Mrarotspektrum : (SpektrumînNujol, s. Fig. ëderZeichnungen).
Die Absorptionsmaxima (Intensitäten wie angegeben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen :
EMI16.1
<tb>
<tb> X <SEP> Intensität
<tb> 2,94 <SEP> m-st
<tb> 5,68 <SEP> st
<tb> 5,76 <SEP> st
<tb> 5, <SEP> 83 <SEP> st
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> sst
<tb> 6,16 <SEP> m-st
<tb> 6,22 <SEP> m-st
<tb> 7, <SEP> 87 <SEP> sst
<tb> 8,31 <SEP> schw
<tb> 8,55 <SEP> schw
<tb> 8,96 <SEP> schw
<tb> 9, <SEP> 33 <SEP> schw
<tb> 9,55 <SEP> schw
<tb> 9, <SEP> 77 <SEP> m-st
<tb> 10,50 <SEP> schw
<tb> 10,90 <SEP> schw
<tb> 11,26 <SEP> m-st
<tb> 11,42 <SEP> schw
<tb> 12,22 <SEP> schw
<tb> 12,62 <SEP> m-st
<tb>
Biologische Eigenschaften der nach obigen Beispielen erhaltenen Antibiotica.
Die Antibiotica der R-451-Gruppe, besonders R-451 und R-451 D, haben einen breiten Wirkungsbereich gegen grampositive Organismen. Sie sind von besonderem Wert für die Behandlung von Krankheiten, die durch penicillinresistente Mikroorganismen hervorgerufen wurden (s. Tabellen xn und XVI). Ausserdem sind sie zur Behandlung von durch Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae u. a., pathogene Mikroorganismen hervorgerufenen Krankheiten brauchbar.
Die Antibiotica der R-451-Gruppe sind auch gegengewisse durchPenicillin angreifbareMikroorganis- men wirksam ; es hat sich jedoch gezeigt, dass sie nicht zu den Penicillinen gehören, was daraus hervorgeht, dass weder R-451 noch R-451 D durchPenicillinase inaktiviert werden. Sie können übrigens auch bei Patienten verwendet werden, die eine durch die Behandlung mit Penicillin oder synthetischen Penicillinderivaten hervorgerufene Empfindlichkeit zeigen-eine relativ häufige Erscheinung, tritt sie doch laut Statistik bei etwa zoo z. B. der Bevölkerung der Vereinigten Staaten von Amerika auf.
Das rohe R-451, hergestellt nach Beispiel 1, ist unter anderem als antiinfektiöses Mittel zur Verhinderung gewisser Krankheitserscheinungen brauchbar, die durch Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Diplococcus pneumoniae u. a. pathogene Organismen hervorgerufen werden. Seine In-vitroAktivität gegen verschiedene Mikroorganismen folgt aus Tabelle xn. Die Anfälligkeit der Mikroorganismen gegen die Antibiotica wurde nach normierten Rohrverdunnungsverfahren ermittelt : Als Inoculum wurden durchwegs Verdünnungen auf 10-5 von 24 halten Brühekulturen vervrendet, wobei die Endpunkte nach 24stündiger Bebrütung bei 370C aufgenommcn wurden. Das Nährmedium war auf Basis Hefeextrakt- Rindfleischextra ! t"Glucose hergestellt.
Seine In-vivo-Aktivität gegen gewisse bakterielle Infektionen wurde ebenfalls. u. zw. an 18-20 g schweren Mäusen, untersucht. Die Mäuse wurden mit einem Inoculum der betreffenden Bakterien durch intraperitoneale Injektion infiziert und wurden dann zweimal täglich mit subkutanen Injektionen von R-451, gelöst in Wasser, behandelt. Tabelle xm zeigt, welche Dosis jeweils erforderlich ist, um einen bestimmten Prozentsatz so behandelter Tiere zu schützen. Bei oraler Verabreicbung von 400 ges (20 mg/kg Maus) in zwei gleichen Gaben, die erste 1/2 h vor der Infektion, wird ebenfalls lOOige : Schutz gegen Streptococcus pyogenes erzielt.
Die akute Toxizität von R-451 wurde an Mäusen mit einem Gewicht von 18 bis 20 g nach verschiedenen normierten Verfahren geprüft, mit den folgenden Ergebnissen :
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb>
<tb> Verabreîchungsweise <SEP> LD <SEP> (mg/kg <SEP> Maus)
<tb> subkutan <SEP> 1000
<tb> intraperitoneal <SEP> 1000
<tb> intravenös <SEP> 850
<tb> oral <SEP> > 2500
<tb>
R-451 A und R-451 B, hergestellt nach Beispiel 8 E) bzw. 8 C), zeigen nach dem Scheibenprüfverfahren (Scheibendurchmesser 6,3 mm), wobei die Inhibitionszone gemessen wurde, nachdem eine mit dem Antibioticum imprägnierte Scheibe auf eine mit dem Tcstorganismus beimpfte Agarplatte aufgebracht und 24 h bei 370C bebrütet worden war, eine In-vitro-Alktivität gegen gewisse Mikroorganismen, wie in Tabellen XIV bzw. XV ausgeführt.
Weitere Daten betreffend die In-vitro-Aktivität von R-451 B (ermittelt an nach Beispiel 9 gereinigtem Material) sind der Tabelle XV A zu entnehmen. (Das Verhalten der Testorganismen gegenüber dem Antibioticum wurde hiebei nach genormten Verdünnungsmethoden bestimmt. In jedem Falle wurden Verdünnungen auf 10-5 von 24 h alten Kulturen als Inoculum verwendet, und die Endpunktc wurden nach 24stündiger Bcbrütung bei 370C in einem"Difco Pen-assay"- Brühemedium aufgenommen. Die Tabelle zeigt die Aktivität des Antibioticums in Einheiten pro ml, wobei die Einheit wie oben definiert ist.)
Die In-vivo-Aktivität von R-451 B, hergestellt nach Beispiel 8 C), wurde in der bei R--451 angege-
EMI17.2
Weitere Daten betreffend die In-vivo-Aktivität von R-451 B (ermittelt an nach Beispiel 18 A) gereinigtemMaterial) sind der Tabelle XVB zu entnehmen. [DieDaten dieser Tabelle wurden pharmakologisch an 18 - 20 g schweren Mäusen als Versuchtieren gegenüber gewissen pathogenen Mikroorganismen ermittelt, u. zw. nach dem folgenden genormten Verfahren : 30 Mäuse wurden mit einem Inoculum des betreffenden Organismus durch intraperitoneale Injektionen infiziert. Dann wurden 20 der Mäuse subkutan mit einer Lösung des Antibioticums in 2 Teilen Äthanol, 0,5 Teilen Tween 80 und 8,5 Teilen Erdnussöl behandelt, wobei die Injektionen in zwei gleichen täglichen Dosierungen verabreicht wurden ; 10 Mäuse blieben als Kontrolltiere unbehandelt. Alle Kontrolltiere starben innerhalb 18 h.
Die Dosis, die erforderlich ist, damit 500/0 der behandelten Tiere nach 48 h noch leben (PDso)'ergab sich gemäss Tabelle XV B.
Die akute Toxizität von R-451 B wurde bestimmt wie folgt :
EMI17.3
<tb>
<tb> Verabreichungsweise <SEP> ID <SEP> (mg/kg <SEP> Maus)
<tb> subkutan <SEP> 2500
<tb> intraperitoneal <SEP> 750
<tb>
R-451 D, hergestellt nach Beispiel 5, zeigt eine In-vitro-Aktivität gegen verschiedene grampositive Organismen, wie aus Tabelle XVI ersichtlich, bestimmt wie bei R-451 angegeben. Ferner wurde die In-vivo-Aktivität des nach Beispiel 5 hergestellten R-451 D in der bei R-451 angegebenen Weise untersucht. Tabelle XVII zeigt die Ergebnisse. Weitere Daten betreffend die In-vitro- und In-vivo-Aktivität von R-451 D (ermittelt an nach Beispiel 5 A) gereinigtem Material) sind den Tabellen XV A bzw. XV B zu entnehmen ; die Bestimmung dieser Daten ist im Zusammenhang mit R-451 B näher erläutert.
Die akute Toxizität von R-451 D wurde bestimmt wie folgt ;
EMI17.4
<tb>
<tb> Verabreichungsweise <SEP> ID50 <SEP> (mg/kg <SEP> Maus)
<tb> subkutan <SEP> 1000
<tb> intrapci.'itonca.). <SEP> 500
<tb> intravenös <SEP> 150
<tb>
Für R-451 E, hergestellt nach Beispiel 7, wurde In der für R-451 A und R-451 B angegebenen Weise die in Tabelle XVI1I aufgeführte In-vitro-Aktivität ermittelt.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotica werden zur Verabreichung an den Patienten in eine der für Antibiotica üblichen Dosierungsformen gebracht, s. B. Injektionslösungen, Salze, Augentropfen. Hie-
EMI17.5
<Desc/Clms Page number 18>
Tabelle 1
EMI18.1
<tb>
<tb> Vergleichende <SEP> Taxonomie <SEP> von <SEP> Micromonosporaarten
<tb> Teil <SEP> A <SEP> : <SEP> Medium <SEP> enthält <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP> NZ-Amin <SEP> Typ <SEP> A, <SEP> 10/0 <SEP> Dextrose, <SEP> 1, <SEP> so <SEP> Agar
<tb> Verwendeter <SEP> Mikroorganismus <SEP> Beobachtete <SEP> Eigenschaften
<tb> Makroskopisch <SEP> Mikroskopisch
<tb> M. <SEP> carbonacea <SEP> Kein <SEP> Luftmycel <SEP> ; <SEP> Kolonie <SEP> flach, <SEP> feucht <SEP> ; <SEP> Wachstum <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> NRRL <SEP> 2972 <SEP> mittelmässig <SEP> ;
<SEP> kein <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> Durchmesser <SEP> 0,6 <SEP> 11. <SEP> ; <SEP> reichliche <SEP> Bildung <SEP> längligebildet. <SEP> cher <SEP> bis <SEP> ellipsoidaler <SEP> Sporen, <SEP> 1,0 <SEP> : <SEP> 1,5 <SEP> ,
<tb> Farbe <SEP> : <SEP> getragen <SEP> von <SEP> büschelweise <SEP> auftretenden <SEP> SporoOberfläche <SEP> : <SEP> Peripherie <SEP> hellorange-g4NA, <SEP> lebhaft <SEP> phoren, <SEP> dunkel <SEP> gefärbt.
<tb> orange-48, <SEP> Zentrum <SEP> ; <SEP> braunschwarz <SEP> ; <SEP>
<tb> Rückseite <SEP> : <SEP> desgleichen
<tb> M. <SEP> chalcea <SEP> Kein <SEP> Luftmycel <SEP> ; <SEP> Kolonie <SEP> schwach <SEP> erhöht, <SEP> gefurcht, <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> ATCC <SEP> 12452 <SEP> wachsartig <SEP> ; <SEP> mittelmässiges <SEP> Wachstum <SEP> ;
<SEP> kein <SEP> diffun-sehr <SEP> fein, <SEP> Durchmesser <SEP> kleiner <SEP> als <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 11. <SEP> ; <SEP>
<tb> dierbares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> reichliche <SEP> Bildung <SEP> kugelförmiger <SEP> bis <SEP> ellipsoidaFarbe <SEP> : <SEP> ler <SEP> Sporen, <SEP> braun, <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> <SEP> im <SEP> Durchmesser,
<tb> Oberfläche <SEP> : <SEP> kaffeebraun-g3PN, <SEP> dunkelolivbraun-96; <SEP> grössteils <SEP> frei, <SEP> aber <SEP> einige <SEP> einzeln <SEP> an <SEP> langen
<tb> Rückseite <SEP> : <SEP> desgleichen <SEP> Sporophoren.
<tb>
M. <SEP> fusca <SEP> Kein <SEP> Luftmycel <SEP> : <SEP> Kolonie <SEP> schwach <SEP> erhöht, <SEP> feucht, <SEP> kör- <SEP> Mycel <SEP> kurz, <SEP> unregelmässig, <SEP> bildet <SEP> viele <SEP> polyNRRL <SEP> B-943 <SEP> nig <SEP> bis <SEP> gefurcht; <SEP> mittelmässiges <SEP> Wachstum; <SEP> ganz <SEP> schwach <SEP> morphe <SEP> Elemente, <SEP> Durchmesser <SEP> 0, <SEP> 8-2, <SEP> 0 <SEP> fi <SEP> ; <SEP>
<tb> gelblichbraunes <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> Sporen <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> <SEP> im <SEP> Durchmesser, <SEP> schwer <SEP> auffindFarbe: <SEP> bar <SEP> unter <SEP> zahlreichen <SEP> dunkelwandigen <SEP> (olivOberfläche <SEP> ; <SEP> braunrotorange-g4PC, <SEP> tieforange-51; <SEP> braunen) <SEP> polymorphen <SEP> Formen.
<tb>
Rückseite: <SEP> kofferbraun-g4NE, <SEP> intensivbraun-55.
<tb>
M. <SEP> sp. <SEP> Kein <SEP> Luftmycel <SEP> ; <SEP> Kolonie <SEP> schwach <SEP> erhöht, <SEP> trocken. <SEP> kör- <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> ATCC <SEP> 10026 <SEP> nig <SEP> bis <SEP> gefurcht <SEP> ; <SEP> kein <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 11. <SEP> im <SEP> Durchmesser <SEP> ; <SEP> Sporen <SEP> äusserst <SEP> reichFarbe <SEP> : <SEP> lich, <SEP> in <SEP> Büscheln <SEP> und <SEP> einzeln, <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> <SEP> im
<tb> Oberfläche <SEP> : <SEP> Peripherie <SEP> kaffeebraun-g3PN, <SEP> dunkeloliv- <SEP> Durchmesser; <SEP> einige <SEP> polymorphe <SEP> Formen <SEP> vorbraun-96, <SEP> Zentrumrotbraunorange-g4PC, <SEP> tieforange-51; <SEP> liegend; <SEP> sowohl <SEP> Sporen <SEP> als <SEP> auch <SEP> polymorphe
<tb> Rückseite <SEP> :
<SEP> desgleichen <SEP> Formen <SEP> dunkelwandig.
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
Tabelle 1 (Fortsetzung)
EMI19.1
<tb>
<tb> Teil <SEP> B <SEP> : <SEP> Medium <SEP> enthält <SEP> 3% <SEP> NZ-Amin <SEP> Typ <SEP> A, <SEP> 10/9 <SEP> Dextrose, <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP> Agar
<tb> Verwendeter <SEP> Mikroorganismus <SEP> Beobachtete <SEP> Eigenschaften
<tb> Makroskopisch <SEP> Mikroskopisch
<tb> M. <SEP> carbonacea <SEP> Keln <SEP> Inftmycal; <SEP> Kolonie <SEP> erhöht, <SEP> gefurcht <SEP> ; <SEP> Wachstum <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regehmässig, <SEP> wandlos,
<tb> NRRL <SEP> 2972 <SEP> gut <SEP> ; <SEP> kein <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> 0,6 <SEP> pt <SEP> im <SEP> Durchmesser <SEP> ; <SEP> Sporen <SEP> einzeln, <SEP> an
<tb> Farbe <SEP> : <SEP> einzelnen <SEP> Sporophoren <SEP> getragen, <SEP> länglich <SEP> bis
<tb> Oberfläche <SEP> ; <SEP> teracottafarben-g5PE. <SEP> Interalvlxaun-55;
<SEP> elliproid, <SEP> 1,0; <SEP> 1,5 <SEP> , <SEP> dunkel <SEP> gefärbt.
<tb>
Rückselte <SEP> : <SEP> desgleichen
<tb> M. <SEP> chalcea <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> erhöht, <SEP> falrig, <SEP> wachsartig; <SEP> Mycel <SEP> lang, <SEP> verzweigt, <SEP> regelmässig, <SEP> wandlos,
<tb> ATCC <SEP> 12452 <SEP> mittelmässiges <SEP> Wachstum <SEP> ; <SEP> kein <SEP> diffundierbares <SEP> 0,5 <SEP> <SEP> im <SEP> Durchmesser <SEP> ; <SEP> Sporen <SEP> reichlich, <SEP> einPigment <SEP> gebildet. <SEP> zeln <SEP> und <SEP> büschelweise <SEP> getragen, <SEP> kugelförmig
<tb> Farbe <SEP> : <SEP> bis <SEP> ellipsoidal, <SEP> 1,0 <SEP> <SEP> im <SEP> Durchmesser.
<tb>
Oberfläche <SEP> ; <SEP> kupferbraun-g5PI, <SEP> intenslybraun-55;
<tb> Rückuefte <SEP> ; <SEP> rotbraan <SEP> bis <SEP> beam-g4PI, <SEP> internsivbraun-56.
<tb>
M. <SEP> fusca <SEP> Kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Kolonie <SEP> erhöht, <SEP> grobkörnig, <SEP> matt <SEP> Mycel <SEP> unregelmässig, <SEP> viele <SEP> polymorphe <SEP> EleNRRL <SEP> B-943 <SEP> ("dull") <SEP> ; <SEP> gutes <SEP> Wachstum <SEP> ; <SEP> ganz <SEP> schwach <SEP> gelblich- <SEP> mente <SEP> vorliegend, <SEP> 0, <SEP> 5-2, <SEP> 0 <SEP> P. <SEP> im <SEP> Durchmesbraunes <SEP> diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> gebildet. <SEP> ser, <SEP> olivbraun <SEP> gefärbt <SEP> ; <SEP> echte <SEP> Sporen, <SEP> 1,0 <SEP> li
<tb> Farbe <SEP> : <SEP> im <SEP> Durchmesser, <SEP> stufenweiser <SEP> Übergang <SEP> in
<tb> Oberfläche <SEP> : <SEP> terracottafarben-g5PE, <SEP> intensivbraun-55; <SEP> polymorphe <SEP> Formen <SEP> mit <SEP> Durchmesser
<tb> Rückseite <SEP> : <SEP> rotbraun-g5PG, <SEP> intensivbraun-55.0, <SEP> 5-2, <SEP> 0 <SEP> J. <SEP> L. <SEP>
<tb>
M. <SEP> sp. <SEP> Kein <SEP> Luftmycel <SEP> ; <SEP> Kolonie <SEP> erhöht, <SEP> dichtkörnig, <SEP> trocken <SEP> ; <SEP> Zwei <SEP> Arten <SEP> Mycel <SEP> : <SEP> lang <SEP> und <SEP> regelmässig
<tb> ATCC <SEP> 10026 <SEP> gutes <SEP> Wachstum. <SEP> einerseits, <SEP> kurz <SEP> und <SEP> unregelmässig <SEP> anderFarbe <SEP> : <SEP> seits, <SEP> bildet <SEP> viele <SEP> polymorphe <SEP> Elemente,
<tb> Oberfläche <SEP> : <SEP> Peripherie <SEP> rotbraunorange-g4PC, <SEP> intensiv- <SEP> 8-2, <SEP> 0 <SEP> lui <SEP> im <SEP> Durchmesser <SEP> ; <SEP> reichlich
<tb> orange-50, <SEP> Zentrum <SEP> schokoladebraun-g4PN, <SEP> dunkel- <SEP> echte <SEP> Sporen, <SEP> büschelweise <SEP> getragen, <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> bu <SEP>
<tb> graubraun-62 <SEP> ; <SEP> im <SEP> Durchmesser, <SEP> kugelförmig <SEP> bis <SEP> ellipRuckseite <SEP> :
<SEP> dunkelzimtbraun <SEP> ("dark <SEP> spice <SEP> brown")-g4PI. <SEP> soidal.
<tb> dunkelbraun-59.
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
Tabelle II
EMI20.1
<tb>
<tb> Verwendetes <SEP> Medt. <SEP> m <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> parva <SEP> M. <SEP> globosa <SEP> M. <SEP> coerulea
<tb> NRRL <SEP> 2972
<tb> Glucose-Asparagin-Wachstum <SEP> : <SEP> schlecht <SEP> Kein <SEP> Luftmycel. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> schlecht <SEP> Wachstum- <SEP> schlecht <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> schlecht <SEP>
<tb> Agar <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> äusserst <SEP> äusserst <SEP> gut. <SEP> Bilgut. <SEP> Bildet <SEP> kein <SEP> lös- <SEP> det <SEP> lösliches <SEP> brauliches <SEP> Pigment. <SEP> nes <SEP> Pigment.
<tb>
Farbe <SEP> : <SEP> blassrosa <SEP> bis <SEP> tief- <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> wechselt <SEP>
<tb> orange <SEP> mit <SEP> bräunlich- <SEP> von <SEP> orange <SEP> bis <SEP> tiefbis <SEP> grünlichschwarzer <SEP> braun, <SEP> mit <SEP> grauSporenschicht <SEP> schwarzer <SEP> bis <SEP> braunschwarzer <SEP> Sporenschicht
<tb> Gelatine <SEP> Verflüssigung <SEP> Verflüssigung <SEP> Schwache <SEP> Verflüssi- <SEP> Verflüssigung <SEP> Verflüssigung <SEP> Rasche <SEP> Verflüssi- <SEP>
<tb> gung
<tb> Milch <SEP> Wird <SEP> langsam <SEP> Peptonbüdung, <SEP> gele- <SEP> Wird <SEP> langsam <SEP> Ver- <SEP> Bleibt <SEP> unverändert <SEP> Koagulation <SEP> und <SEP> Kaum <SEP> koaguliert
<tb> verdaut <SEP> gentlich <SEP> Koagulation <SEP> daut, <SEP> nicht <SEP> Peptonbüdung <SEP> werden.
<SEP> Verkoaguliert <SEP> dauung <SEP> ganz
<tb> schwach
<tb> Saccharose <SEP> Wird <SEP> verbraucht <SEP> Wird <SEP> invertiert <SEP> Wird <SEP> invertiert <SEP> Wird <SEP> nicht <SEP> Wird <SEP> invertiert <SEP> Wird <SEP> invertiert
<tb> invertiert
<tb> Stärke <SEP> Wird <SEP> hydrolysiert <SEP> Wird <SEP> hydrolysiert <SEP> Wird <SEP> hydrolysiert <SEP> Wird <SEP> hydrolysiert <SEP> Wird <SEP> hydrolysiert <SEP> Wird <SEP> hydrolysiert
<tb> Cellulose-Wird <SEP> rasch <SEP> zersetzt <SEP> Wird <SEP> schwach <SEP> Wird <SEP> nicht <SEP> Wird <SEP> nicht <SEP> Wird <SEP> nicht
<tb> angegriffen <SEP> zersetzt <SEP> zersetzt <SEP> zersetzt
<tb>
<Desc/Clms Page number 21>
TabelleII (Forttetzung)
EMI21.1
<tb>
<tb> Verwendetes <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> parva <SEP> M. <SEP> globosa <SEP> M.
<SEP> coerulea
<tb> Medium <SEP> NRRL <SEP> 2972 <SEP>
<tb> Nitratreduktion <SEP> Aus <SEP> Nitraten <SEP> entstehen <SEP> Aus. <SEP> Nitraten <SEP> entstehen <SEP> Wechselhaft <SEP> Keine <SEP> Reduktion <SEP> Aus <SEP> Nitraten <SEP> entstehen <SEP> Keine <SEP> Reduktion
<tb> Nitrite <SEP> Nitrite <SEP> Nitrite
<tb> Temperatur <SEP> Gutes <SEP> Wachstum <SEP> bei <SEP> Optimales <SEP> Wachstum
<tb> 16-37 C, <SEP> kein <SEP> zwischen <SEP> 30 <SEP> und
<tb> Wachetum <SEP> bei <SEP> 50 C <SEP> 35 C
<tb> Wachstum <SEP> Aerob <SEP> Aerob <SEP> Aerob <SEP> Aerob <SEP> Aerob <SEP> Aerob
<tb> (aerob <SEP> oder
<tb> anaerob)
<tb>
<Desc/Clms Page number 22>
Tabelle IIIA
EMI22.1
<tb>
<tb> Verwendetes <SEP> Médium <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp.
<SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> NRRL <SEP> 2972 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943
<tb> Bennett's-Agar <SEP> -)
<tb> Wachstum <SEP> : <SEP> gut <SEP> ; <SEP> erhöhte <SEP> und <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP>
<tb> gefurchte <SEP> Kolonie. <SEP> Farbe; <SEP> Peripherie <SEP> terra- <SEP> Farbe; <SEP> terracottafarben- <SEP> Farbe; <SEP> Peripherie <SEP> terraFarbe <SEP> :
<SEP> hellorange-g5NA, <SEP> cottafarben-g5PE, <SEP> in- <SEP> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> cottafarben-g5PE, <SEP> inlebhaftorange-48 <SEP> (braun- <SEP> tensivixaun-55 <SEP> m, <SEP> Zen- <SEP> tensivbraun-55, <SEP> Zenschwarz <SEP> gefleckt). <SEP> trum <SEP> schokoladebraun- <SEP> trum <SEP> gewürznelken- <SEP>
<tb> g4PN, <SEP> dunkelbraun-59. <SEP> braun <SEP> ("clove <SEP> brown")- <SEP>
<tb> 3PL, <SEP> dunkelgelbbraun-78. <SEP>
<tb>
Emerson-Agar
<tb> Wachstum; <SEP> mittelmässig: <SEP> er- <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum; <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP>
<tb> höhte <SEP> Kolonie. <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> bittersuSfarben <SEP> Faibe <SEP> : <SEP> mandarinen-Farbe <SEP> : <SEP> eichenbraun- <SEP>
<tb> Farbe <SEP> : <SEP> terracottafarben- <SEP> ("bitter <SEP> sweet@)-g5PC, <SEP> farben-g5PA, <SEP> lebhaft- <SEP> g4PI, <SEP> intensivbraun-55.
<tb> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> tieforange-51. <SEP> orange.
<tb>
Tomatenmark- <SEP> *) <SEP>
<tb> Hafermehl-Agar <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut <SEP> ; <SEP> gefurchte <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP>
<tb>
Kolonie. <SEP> Farbe: <SEP> Peripherie <SEP> terra- <SEP> Farbe: <SEP> hellpfirsichfarben- <SEP> Farbe: <SEP> hellpfirsichfarbenFarbe <SEP> : <SEP> Peripherie <SEP> orange-g5LA, <SEP> cottafarben-g5PE, <SEP> inten-g5IA, <SEP> mittelrotorange-37. <SEP> g5IA, <SEP> mittelrotorange-3'7. <SEP>
<tb> intensivorange-50, <SEP> Zentrum <SEP> tivbraun-55, <SEP> Zentrum
<tb> braunschwarz. <SEP> schokoladebraun-4PN, <SEP>
<tb> dunkelbraun-59.
<tb>
Glucose-Wachstum <SEP> : <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> schlecht. <SEP>
<tb>
Asparagin-Agar <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> terracottafarben-Farbe <SEP> : <SEP> leuchtendorange <SEP>
<tb> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> ("sun <SEP> organge")-g5LA,
<tb> intensivorange-50.
<tb>
Glucose-Hefe-*)
<tb> extrakt-Agar <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig <SEP> ; <SEP> ge- <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP>
<tb> furchte <SEP> Kolonie. <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> rot- <SEP> Farbe: <SEP> tiefbraun-g4PI, <SEP> Farbe: <SEP> terracottafarben- <SEP> Farbe: <SEP> eichenlxaunbraunorange-g4NC, <SEP> tieforange-61. <SEP> dunkelbraun-59. <SEP> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> g4PI, <SEP> intensivbraun-55.
<tb>
EMI22.2
<Desc/Clms Page number 23>
usatzTabelleIIIB
EMI23.1
<tb>
<tb> Verwendetes <SEP> Medium <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp. <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> NRRL <SEP> 2972 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943
<tb> Kartoffel <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum <SEP> :
<SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut.
<tb>
Farbe <SEP> : <SEP> rostrot <SEP> ("barn- <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> bittersüssfarben- <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> bittersüssfarben- <SEP>
<tb> red") <SEP> -g6PG, <SEP> mittelrot- <SEP> g5PC, <SEP> tieforange-51. <SEP> g5PC, <SEP> tieforange-51.
<tb> braun-43.
<tb>
Karotte <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP>
<tb>
Farbe <SEP> : <SEP> schokoladebraun-Farbe <SEP> : <SEP> feuerrot-gSNC, <SEP>
<tb> g4PN, <SEP> dunkelbraun-59. <SEP> intensivrotorange-35.
<tb>
Saccharose- <SEP> Nitrit- <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb>
Agar <SEP> (Czapek-Agar)
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> (Be- <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> schlecht.
<tb> obachtungen <SEP> nach <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> kein <SEP> diffundierba- <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> schwarzes <SEP> diffun- <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> kein <SEP> diffundierba- <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> kein <SEP> diffundier- <SEP>
<tb> 2,7 <SEP> und <SEP> 14 <SEP> Tagen <SEP> ; <SEP> res <SEP> Pigment. <SEP> dierbares <SEP> Pigment. <SEP> res <SEP> Pigment. <SEP> bares <SEP> Pigment.
<tb> nach <SEP> Gordonu.
<tb>
Smith, <SEP> J. <SEP> Bac.69,
<tb> 147)
<tb> Pepton-Eisen-Agar <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig. <SEP>
<tb>
(Beobachtungen <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> keine <SEP> Reaktion.
<tb> nach <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> und <SEP> 14 <SEP>
<tb> Tagen)
<tb> Bromkresolpurpur- <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig <SEP> ; <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut <SEP> ; <SEP> Ver- <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig <SEP> ; <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut <SEP> ; <SEP> VerMilch <SEP> teilweise <SEP> Verdauung. <SEP> dauung <SEP> findet <SEP> statt. <SEP> Verdauung <SEP> findet <SEP> statt. <SEP> dauung <SEP> findet <SEP> statt.
<tb>
Farbe <SEP> keine <SEP> PH- <SEP> Farbe <SEP> keine <SEP> PH- <SEP> Farbe: <SEP> keine <SEP> PH- <SEP>
<tb> Änderung. <SEP> Änderung. <SEP> Änderung. <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 24>
Tabelle IV
EMI24.1
<tb>
<tb> Verwendetes <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp.
<tb>
Testkohlehydrat <SEP> NRRL <SEP> 2972 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943 <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> Arabinose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Glucose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Galactose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> mittelmässig
<tb> Lactose <SEP> gut <SEP> mittelmässig <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Lävulose <SEP> gut <SEP> mittelmässig <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Mannose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Raffinose <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Rhamnose <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Stärke <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Xylose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Inosit <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Mannit
<SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Sorbit <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Zur <SEP> Kontrolle <SEP> : <SEP>
<tb> 0, <SEP> 50/0 <SEP> Hefeextrakt <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb>
<Desc/Clms Page number 25>
TabelleV
EMI25.1
<tb>
<tb> Verwendete <SEP> Stickstoff-M, <SEP> carbonacea <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp. <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> quelle <SEP> NRRL <SEP> 2972 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943
<tb> 0,5% <SEP> Difco-Hefe- <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP>
<tb> extrakt <SEP> Kolonie <SEP> erhöht <SEP> und <SEP> ge- <SEP> Farbe: <SEP> rostrot-g6PG, <SEP> Farbe:rotbaunoran- <SEP> Farbe:
<SEP> bittersüssfarbenfurcht. <SEP> mittelrotbraun-43. <SEP> ge-g4PC, <SEP> intensiv- <SEP> g5PC, <SEP> tieforange-51.
<tb>
Farbe <SEP> : <SEP> Peripherie <SEP> organe- <SEP> organe-50.
<tb> g5LA. <SEP> intensivorange-50,
<tb> Zentrum <SEP> braunschwarz
<tb> geleckt.
<tb>
1. <SEP> 0% <SEP> NZ-Amin, <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig <SEP> ; <SEP> j <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut. <SEP>
<tb>
Typ <SEP> A <SEP> Kolonie <SEP> erhöht <SEP> und <SEP> ge- <SEP> Farbe: <SEP> hennafarben- <SEP> Farbe: <SEP> hennafarben- <SEP> Farbe: <SEP> terracottafarfurcht. <SEP> g5PG, <SEP> intensiv- <SEP> g5PG, <SEP> intensiv- <SEP> ben-g5PE, <SEP> intensivFarbe: <SEP> rotbraunorange- <SEP> braun-55. <SEP> braun-55. <SEP> braun-55.
<tb> g4PC, <SEP> tieforange-51
<tb> (schwach <SEP> braunschfarz
<tb> fefleckt).
<tb>
1% <SEP> Asparagin <SEP> Wachstum; <SEP> schlecht, <SEP> Wachstum; <SEP> mittel- <SEP> Wachstum; <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum; <SEP> schlecht.
<tb> mässig.
<tb>
Farbe <SEP> : <SEP> gewürznelken- <SEP>
<tb> braun-g3PL. <SEP> dunkelgelbbraun-78.
<tb>
1% <SEP> Glutarmin- <SEP> Wachstung; <SEP> schlecht. <SEP> Wachatum <SEP> mittel- <SEP> Wachstum; <SEP> schlecht. <SEP> Wachtung; <SEP> schlecht.
<tb> säure <SEP> mässig.
<tb>
Farbe <SEP> : <SEP> gewürznelkenbraun-gSPL, <SEP> dunkel-
<tb> ! <SEP> gelbbraun-'78. <SEP>
<tb>
1% <SEP> Natriumnitrat <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb>
1% <SEP> Ammoniumnitrat <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
Tabelle VI
EMI26.1
<tb>
<tb> Chromatographische <SEP> Studien <SEP> an <SEP> den <SEP> durch <SEP> Bebrütung <SEP> von <SEP> M. <SEP> carbonacea <SEP> gebildeten
<tb> antibiotischen <SEP> Substanzen
<tb> Verwendete <SEP> Lösungsmittelsysteme <SEP> RF-Werte <SEP> für
<tb> R-451 <SEP> A <SEP> R-451 <SEP> B <SEP> R-451 <SEP> C <SEP> R-451D <SEP> R-451E
<tb> I.
<tb>
Benzol <SEP> 10 <SEP> V. <SEP> T..) <SEP>
<tb> Petroläther
<tb> (Siedebereich <SEP> 30-60 C) <SEP> 2,5 <SEP> V.T. <SEP> 0 <SEP> 0. <SEP> 14 <SEP> 0,28 <SEP> 0,64 <SEP> 0, <SEP> 74
<tb> Aceton <SEP> 5 <SEP> V. <SEP> T.
<tb>
Entwicklungsdauer <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 1/2 <SEP> h
<tb> II.
<tb>
Toluol <SEP> -20 <SEP> V. <SEP> T.
<tb> n <SEP> - <SEP> Butanol <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> V. <SEP> T.
<tb>
Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 7 <SEP> V. <SEP> T. <SEP> 0 <SEP> 0,19 <SEP> 0, <SEP> 42 <SEP> 0,61 <SEP> 0,71
<tb> Petroläther
<tb> (Siedebereich <SEP> 30-600C) <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> V. <SEP> T.
<tb>
Entwicklungsdauer <SEP> : <SEP> 4 <SEP> 1/2 <SEP> h
<tb> in.
<tb>
Petroläther
<tb> (Siedebereich <SEP> 60-90 C) <SEP> 5 <SEP> V. <SEP> T. <SEP>
<tb>
Methanol <SEP> 8 <SEP> V. <SEP> T.
<tb>
Äthylacetat <SEP> 5 <SEP> V. <SEP> T. <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 08 <SEP> 0, <SEP> 26 <SEP> 0,60 <SEP> 0, <SEP> 82 <SEP>
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 2 <SEP> V. <SEP> T. <SEP>
<tb>
Entwicklungsdauer <SEP> : <SEP> 2 <SEP> h
<tb> *) <SEP> V. <SEP> T. <SEP> = <SEP> Volumsteile <SEP> ; <SEP> im <SEP> Originalversuch <SEP> : <SEP> 1 <SEP> V. <SEP> T. <SEP> = <SEP> 1 <SEP> pint
<tb>
<Desc/Clms Page number 27>
Tabelle VII
EMI27.1
<tb>
<tb> Chromatographie <SEP> von <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe <SEP> an <SEP> Aluminiumoxyd
<tb> Getestete <SEP> Behandlungsweise <SEP> und <SEP> Ausbeute <SEP> Inhibitionszone <SEP> in <SEP> mm <SEP> bei <SEP> 6,35 <SEP> mm <SEP> im <SEP> Durchmesser <SEP> Papierbioautographische <SEP> Verteilung
<tb> Fraktionen <SEP> messenden <SEP> Filterpapierscheiben <SEP> und <SEP> Konzentrationen <SEP> (RF-Werte)
<tb> (Gruppen) <SEP> (in). <SEP> t <SEP> g/ml) <SEP> von
<tb> 1000 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 1
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 14 <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0,0; <SEP> 0,15; <SEP> 0,29;
<SEP> 0, <SEP> 60; <SEP> 0. <SEP> 74
<tb> 1 <SEP> Inaktiv <SEP> 0000
<tb> 2 <SEP> Rückstand <SEP> in <SEP> Chloroform <SEP> gelöst,
<tb> mit <SEP> zehnfachem <SEP> Volumen <SEP> Petroläther <SEP> gefällt <SEP> ; <SEP> Ausbeute <SEP> : <SEP>
<tb> 102 <SEP> mg <SEP> 23 <SEP> 17 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0,12 <SEP> (Spur); <SEP> 0,62; <SEP> 0, <SEP> 74
<tb> 3-4 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 2 <SEP> ; <SEP>
<tb> Ausbeute <SEP> : <SEP> 725 <SEP> mg <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0
<tb> 5 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 2 <SEP> ; <SEP>
<tb> Ausbeute <SEP> : <SEP> 541 <SEP> mg <SEP> 18 <SEP> 11 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> (Spur) <SEP> ;
<SEP> 0, <SEP> 62 <SEP> (Spur)
<tb> 9-12 <SEP> Inaktiv <SEP> 0000
<tb> 13 <SEP> - <SEP> 30 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 2;
<tb> Ausbeute <SEP> : <SEP> 1, <SEP> 73 <SEP> g <SEP> 26 <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 64
<tb> 31 <SEP> - <SEP> 34 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 2 <SEP> ; <SEP>
<tb> Ausbeute <SEP> : <SEP> 32, <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 25 <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> ; <SEP> 0. <SEP> 29 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 60
<tb> 35 <SEP> - <SEP> 42 <SEP> In <SEP> Wasser <SEP> gelöst, <SEP> lyophilisiert <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP> (schwach) <SEP> ; <SEP>
<tb> Ausbeute <SEP> : <SEP> 111 <SEP> mg <SEP> 22 <SEP> 17 <SEP> 11 <SEP> 0 <SEP> 0,24 <SEP> (schwach) <SEP> ;
<SEP> 0. <SEP> 59 <SEP>
<tb> 43 <SEP> - <SEP> 49 <SEP> Behandelt <SEP> wie <SEP> Fraktionen
<tb> 35 <SEP> - <SEP> 42 <SEP> ; <SEP> Ausbeute <SEP> : <SEP> 67. <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 58
<tb>
EMI27.2
<Desc/Clms Page number 28>
Tabelle VIII
EMI28.1
<tb>
<tb> Chromatographie <SEP> von <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe <SEP> an <SEP> Diatomeenerde
<tb> HUV <SEP> ml <SEP> Eluierungs- <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rück- <SEP> Bioautographisch <SEP> ermittel <SEP> standes <SEP> in <SEP> mg <SEP> mittelte <SEP> RF-Werte
<tb> 1 <SEP> 3500
<tb> 2 <SEP> 3500 <SEP> 4300 <SEP> 0,77
<tb> 2, <SEP> 1 <SEP> - <SEP> 2, <SEP> 9 <SEP> 2800 <SEP> 190 <SEP> 0,79
<tb> 3 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 24500 <SEP> 2200 <SEP> 0, <SEP> 3; <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP> ;
<SEP> 0,75
<tb> 11 <SEP> - <SEP> 13 <SEP> 7000 <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 64
<tb> 14-16 <SEP> 7000 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb>
Tabelle IX
EMI28.2
<tb>
<tb> Chriomatographsiche <SEP> Auftrenung <SEP> von <SEP> HUV <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> aus <SEP> den <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe
<tb> HUV <SEP> ml <SEP> Eluierungs- <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rück- <SEP> Papierchromatographisch <SEP> mittel <SEP> standes <SEP> in <SEP> mg <SEP> bioautographisch <SEP> ermittelte
<tb> RF-Werte
<tb> 1 <SEP> 900 <SEP> - <SEP> -
<tb> 1 <SEP> - <SEP> 1,5 <SEP> 450 <SEP> 320 <SEP> 0,78
<tb> 1,5-14 <SEP> 11000 <SEP> 680 <SEP> 0,64;
<SEP> 0,74
<tb>
Tabelle X
EMI28.3
<tb>
<tb> Vortrennung <SEP> der <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe <SEP> durch <SEP> Chromatographie <SEP> an <SEP> Diatomeenerde
<tb> HUV <SEP> Menge <SEP> Eluierungs-Gewicht <SEP> des <SEP> Rück-Bioautographisch <SEP> ermittelte <SEP>
<tb> mittel <SEP> in <SEP> ml <SEP> standes <SEP> in <SEP> mg <SEP> RF-Werte
<tb> 0, <SEP> 9 <SEP> 7000 <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 1, <SEP> 0-1, <SEP> 1 <SEP> 800 <SEP> 186 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> ; <SEP> 0,55
<tb> 1. <SEP> 2-1. <SEP> 8 <SEP> 5000 <SEP> 900 <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 43 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 9-2, <SEP> 8 <SEP> 7200 <SEP> 5700 <SEP> 0, <SEP> 16; <SEP> 0,23;
<tb> 0, <SEP> 43 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 9-3, <SEP> 9 <SEP> 8000*) <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> ;
<SEP>
<tb> 0, <SEP> 55 <SEP> (Spur)
<tb> 4, <SEP> 0-5, <SEP> 0 <SEP> 8000**) <SEP> 120 <SEP> 0
<tb>
*) EluierungmitAceton **) Eluierung mit Aceton-Methanol (1 : 1)
<Desc/Clms Page number 29>
Tabelle XI
EMI29.1
<tb>
<tb> Chromatographische <SEP> Auftrennung <SEP> der <SEP> Fraktionengruppe <SEP> HUV <SEP> 1, <SEP> 9-2, <SEP> 8 <SEP> von <SEP> Tabelle <SEP> X
<tb> HUV <SEP> Verwendetes <SEP> Eluierungs- <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rück- <SEP> Bioautographischermittel <SEP> in <SEP> ml <SEP> standes <SEP> in <SEP> mg <SEP> mittelte <SEP> RF-Werte
<tb> 0,7 <SEP> 4200
<tb> 0, <SEP> 8 <SEP> - <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 4800 <SEP> 1100 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 7-17, <SEP> 6 <SEP> 96000 <SEP> 300 <SEP> 0,43
<tb> 17, <SEP> 7-27, <SEP> 7 <SEP> 60 <SEP> 000 <SEP> 200 <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> ;
<SEP> 0,23
<tb> 27,7-28,1 <SEP> 2400 <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0,15
<tb>
Tabelle XI A
EMI29.2
<tb>
<tb> Chromatographie <SEP> von <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> R-451-Gruppe <SEP> an <SEP> Florisil <SEP>
<tb> Elutions- <SEP> Eluat <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Rück- <SEP> Bioautographisch <SEP> ermittel <SEP> in <SEP> ml <SEP> standes <SEP> mittelte <SEP> RF-Werte
<tb> CH2C12 <SEP> 4400 <SEP> 10, <SEP> 2g <SEP> 0, <SEP> 43 <SEP> (D) <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP> (E)
<tb> aceton <SEP> 8800 <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0,45 <SEP> (D)
<tb> "+10Aceton <SEP> 8800 <SEP> 13, <SEP> 2 <SEP> g <SEP> 0,43 <SEP> (D)
<tb> "+ <SEP> 20% <SEP> Aceton <SEP> 8 <SEP> 800 <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> (D) <SEP> ;
<SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> (B)
<tb> zo <SEP> Aceton <SEP> 8800 <SEP> 6,3 <SEP> g <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> (B)
<tb> 100tao <SEP> Aceton <SEP> 8800 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> g <SEP> 0,15 <SEP> (3); <SEP> 0,23 <SEP> (B)
<tb>
Tabelle XII
EMI29.3
<tb>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> Stammbezeichnung <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionsder <SEP> verwendeten <SEP> Mikroorganismen <SEP> konzentration <SEP> in <SEP> g/ml
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 7064 <SEP> 0,75
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var.
<SEP> mycoides <SEP> DA <SEP> 39 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 31 <SEP> 0,75
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> DA <SEP> 2100 <SEP> 0, <SEP> 10
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538P <SEP> 0,075
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 1163 <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 12715 <SEP> 0,75
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Gray <SEP> 0,50
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 201*) <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 202**) <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 203***) <SEP> 0, <SEP> 30
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 204***) <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 205***) <SEP> 0,
40
<tb> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> DA <SEP> 20 <SEP> 0,75
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> ATCC <SEP> 12384 <SEP> 0,175
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> DA <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 375
<tb>
*) Ein gegen Novobiocm resistenter Stamm.
**) Ein Gegen Oleandomycin und Erythromycin resistenter Stamm.
***) Gegen Penicillin resistente Stämme.
<Desc/Clms Page number 30>
Tabelle XIII
EMI30.1
<tb>
<tb> In-vivo-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451
<tb> Infizierender <SEP> Verabreichte <SEP> Dosis <SEP> R-451 <SEP> Prozentsatz <SEP> überlebender
<tb> Mikroorganismus <SEP> in <SEP> j <SEP> g/Maus <SEP> und <SEP> Tag <SEP> Mäuse <SEP> nach <SEP> 24 <SEP> h
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0 <SEP> (Kontrollsalzlösung) <SEP> 0
<tb> 40 <SEP> (2 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 50
<tb> 40 <SEP> (2 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> eine
<tb> einzige <SEP> Injektion <SEP> 1 <SEP> h
<tb> nach <SEP> der <SEP> Infektion <SEP> 100
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 40 <SEP> (2 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 50
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 50 <SEP> (2,5 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 100 <SEP> (nach <SEP> 2 <SEP> Tagen)
<tb>
Tabelle XIV
EMI30.2
<tb>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451 <SEP> A
<tb> Konzentration <SEP> Durchmesser <SEP> in <SEP> mm <SEP> der <SEP> Inhibitionszone <SEP> gegen
<tb> in <SEP> zog <SEP> R-451/ml <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> 1000 <SEP> 18 <SEP> 23 <SEP> 13
<tb> 100 <SEP> 9 <SEP> 15 <SEP> 10
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Tabelle XV
EMI30.3
<tb>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451 <SEP> B
<tb> Konzentration <SEP> Durchmesser <SEP> in <SEP> mm <SEP> der <SEP> Inhibitionszone <SEP> gegen
<tb> in <SEP> jug <SEP> R-451 <SEP> B/ml <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> 1000 <SEP> 23 <SEP> 30 <SEP> 17
<tb> 100 <SEP> 20 <SEP> 26 <SEP> 8
<tb> 10 <SEP> 15 <SEP> 22
<SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 8 <SEP> 15 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 31>
Tabelle XV A
EMI31.1
<tb>
<tb> Antibiotisches <SEP> Spektrum <SEP> (In-vitro-Aktivität) <SEP> von <SEP> R-451 <SEP> B <SEP> und <SEP> R-451 <SEP> D
<tb> Testorganismen <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> in <SEP> Einheiten/ml
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> Stammbezeichnung <SEP> R-451 <SEP> B <SEP> R-451 <SEP> D
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> QMCC <SEP> B964 <SEP> 0,3 <SEP> 0, <SEP> 025
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> ATCC <SEP> 5773 <SEP> 1,2 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 1,2 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> ATCC <SEP> 9341 <SEP> 1,2 <SEP> 0,3
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> 0,15 <SEP> 0,025
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538P <SEP> 0,15 <SEP> 0,
025
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 12715 <SEP> 0,6 <SEP> 0, <SEP> 15
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 9996 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0,075
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 11G3 <SEP> 0,6 <SEP> 0,3
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Gray <SEP> 0,3 <SEP> 0,025
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 0,6 <SEP> 0,3
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 2027-2036-je <SEP> 0,25
<tb> (10 <SEP> klinische <SEP> Isolate, <SEP> die <SEP>
<tb> gegen <SEP> Penicillin, <SEP> Streptomycin, <SEP> Tetracyclin <SEP> und
<tb> Erythromycin <SEP> resistent <SEP> sind)
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae') <SEP> DA <SEP> 150-0, <SEP> 25
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes*) <SEP> DA <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0,0075
<tb> Streptococcus <SEP> hacmolyticus <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,
<SEP> 01
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 10541 <SEP> 0,3 <SEP> 0,025
<tb>
*) Hirn-Herz-Infusionsbrühe + 0, 51o menschliches Serum.
Tabelle XV B
EMI31.2
<tb>
<tb> In-vivo-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451 <SEP> B <SEP> und <SEP> R-451 <SEP> D
<tb> PD/50 <SEP> (in <SEP> mg/kg)
<tb> Infizierende <SEP> Mikroorganismen <SEP> R-451 <SEP> B <SEP> R-451 <SEP> D
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1,3 <SEP> 3, <SEP> 75
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 2,5 <SEP> 12,5
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> - <SEP> 3,75
<tb>
<Desc/Clms Page number 32>
Tabelle XVI
EMI32.1
<tb>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451 <SEP> D
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> der <SEP> Stammbezeichnung <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> untersuchten <SEP> Mikroorganismen <SEP> in <SEP> Jlgl <SEP> ml <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 7064 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var.
<SEP> mycoides <SEP> DA <SEP> 39 <SEP> 0,075
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 31 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> QMCC <SEP> 3773 <SEP> 0,025
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 38 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> sphacricus <SEP> DA <SEP> 32 <SEP> 0,75
<tb> Bacillus <SEP> sphaericus <SEP> DA <SEP> 33 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 0,25
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> DA <SEP> 150 <SEP> 0,25
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> ATCC <SEP> 9431 <SEP> 0,0075
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> DA <SEP> 2100 <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 2027 <SEP> - <SEP> 2036 <SEP> je <SEP> 0,25
<tb> (1.
<SEP> 0 <SEP> klinische <SEP> Jsolate, <SEP> die <SEP>
<tb> gegenpenicîllin, <SEP> Strep- <SEP>
<tb> tomycin, <SEP> Tetracyclin <SEP> und
<tb> Erychromycin <SEP> resistent <SEP> sind) <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Gray <SEP> 0,25
<tb> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> DA <SEP> 20 <SEP> 0,025
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes*) <SEP> DA <SEP> 21 <SEP> 0,25
<tb>
*) Hirn-Herz-Infusionsbrübe + 0,5% menschliches Serum.
Tabelle XVII
EMI32.2
<tb>
<tb> In-vivo-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451 <SEP> D
<tb> Infizierender <SEP> Dosierung <SEP> in <SEP> tig <SEP> R-451 <SEP> D <SEP> Prozentsatz <SEP> überlebender
<tb> Mikroorganismus <SEP> pro <SEP> Maus <SEP> und <SEP> Tag <SEP> Mäuse <SEP> nach <SEP> 24 <SEP> h
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0 <SEP> (Kontrollsalzlösung) <SEP> 0
<tb> 75 <SEP> (3, <SEP> 75 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 50
<tb> 100 <SEP> (5.
<SEP> 0 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 100
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 250 <SEP> (12, <SEP> 5 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 50
<tb> 400 <SEP> (20 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 100
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 75 <SEP> (3, <SEP> 75 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 50 <SEP> (nach <SEP> 2 <SEP> Tagen)
<tb> 100 <SEP> (5,0 <SEP> mg/kg <SEP> Maus) <SEP> 100 <SEP> (nach <SEP> 2 <SEP> Tagen)
<tb>
<Desc/Clms Page number 33>
EMI33.1
EMI33.2
<tb>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> R-451 <SEP> E
<tb> Konzentration <SEP> Inhibitionszone <SEP> in <SEP> mm <SEP> gcgen
<tb> in <SEP> lig <SEP> R-451 <SEP> E/ml <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> 1000 <SEP> 20 <SEP> 19 <SEP> 24
<tb> 100 <SEP> 15 <SEP> 13 <SEP> 19
<tb> 10 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 15
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP>
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1.
Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums R-451 und seiner Komponenten R-451 A bis R-451 E sowie der 0-Acylderivate, Äther und Salze mit Basen des Antibioticums und der Komponenten, dadurch gekennzeichnet, dass man die neue Art Micromonospora carbonacea, hinterlegt unter der Registrierungsnummer NRRL 2972. oder eine von deren Mutanten oder Varianten mit im wesent- lichen gleicher biologischer Aktivität unter üblichen Bedingungen, vorzugsweise aerob in einem wässerigen Nährmedium. das assimilierbaren Kohlenstoff und Sdckstoff enthält, bebrütet, das gebildete Antibioticum aus der Kultur isoliert und gegebenenfalls reinigt bzw. in seine Komponenten zerlegt und hierauf das Antibioticum bzw.
mindestens eine von dessen Komponenten R-451 A, R-451 B, R-451 C, R-451 D und R-451 E gegebenenfalls in eines ihrer 0-Acylderivate, in Äther oder in Salze mit Basen überführt.