AT248023B

AT248023B - Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin und seinen Derivaten

Info

Publication number: AT248023B
Application number: AT245264A
Authority: AT
Inventors: Ivan Villax
Original assignee: Ivan Villax
Priority date: 1963-03-28
Filing date: 1964-03-20
Publication date: 1966-07-11

Description


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  Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin und seinen Derivaten 
Die Erfindung betrifft die Herstellung und die Isolierung von Tetracycline, wie Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin und Dimethylchlortetracyclin, mittels neuer Erdalkalidibenzyläthylendiiminkomplexe des Tatracyclins bzw. der Tetracyclinderivate. 



   Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden die neuen Komplexe dadurch gebildet, dass man   N, N'-Dibenzylidenäthylendiimin - im   folgenden A-DBÄD   genannt - der Formel C6Hs. CH = N-     - CHg-CH -N=CH. C Hg dem   Kulturmedium während der Fermentierung oder der bereits fermentierten Brühe in Gegenwart von Erdalkalimetallionen zusetzt ; die Komplexe werden nach der Abscheidung vom Myzel bei einem PH zwischen 8-9, 5 gefällt. Das betreffende Tetracyclin wird dann aus den auf diese Weise erhaltenen Komplexen durch Einstellung des pH auf seinen isoelektrischen Punkt durch Ansäuern freigesetzt. 



   Vorliegende Erfindung bietet wesentliche Vorteile für die industrielle Anwendung : die Abscheidung wird in wenigen Arbeitsschritten vollendet ; organische Lösungsmittel sind nicht erforderlich ; es weiden billige Trennmittel angewendet und hohe Ausbeuten erzielt. 



   Wenn A-DBÄD dem Kulturmedium während der Fermentierung zugesetzt wird, wird die Fermenterungsausbeute, d. h. die durch das Medium während der Fermentierung erzielte antibiotische Aktivität um etwa   5-20% gesteigert,   u. zw. je nach den Arbeitsbedingungen und dem verwendeten Stamm im Vergleich zu Fermentierungen, die ohne Zusatz von A-DBÄD durchgeführt werden. 



   Man hat schon vorgeschlagen, zur Gewinnung von Chlortettacyclin und/oder Tetracyclin auf mikrobiologischem Wege mit Hilfe von Streptomyces-Stämmen als fermentierenden Mikroorganismus Streptomyces lusitanus C. B. S. A 101 oder dessen Varianten oder Mutanten zu verwenden, die Fermentation in Gegenwart von Dibenzyläthylendiamin durchzuführen und das entsprechende Tetracyclinderivat in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium zu gewinnen. Das Verfahren vorliegender Erfindung ist im Hinblick auf den niedrigeren Preis des A-DBÄD wirtschaftlicher, ausserdem werden etwas höhere Ausbeuten erzielt. 



   Es wird der Brühe eine Menge A-DBÄD zugesetzt, die mindestens gleich einem halben Mol je Mol Antibiotikum entspricht, wenn es sich um die Herstellung von Tetracyclin, Oxytetracyclin und Chlortetracyclin handelt. Wenn Demethylchlortetracyclin hergestellt wird, verwendet man vorzugsweise   1t   Mol A-DBÄD je Mol des Antibiotikums. 



   Um höchste Ausbeuten zu erzielen, setzt man während der Fermentierung 10-1000 mg A-DBÄD je Liter Brühe in verschiedenen Portionen zu und man setzt der angesäuerten und filtrierten Brühe bei einem   pl,   von 5 die Menge A-DBÄD zu, die erforderlich ist, um die vorstehend angegebenen Verhältnisse, berechnet auf die Menge des während der Fermentierung erzielten Antibiotikums, zu erreichen. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Isolierung der Tetracycline mittels der   A-DBÄD-Komplexe,   wenn diese ausschliesslich in der Phase der bereits fermentierten Brühe durchgeführt wird. 



   Für die Zwecke der Erfindung kann jeder Tetracycline erzeugende Mikroorganismus verwendet werden, 
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 Streptomyces rimosus, Streptomyces viridifaciens, Streptomyces sayamaensis, Streptomyces psammoticus, Streptomyces lusitanus, Streptomyces varsoviensis, einschliesslich deren Mutanten. 



   Das A-DBÄD wird dem Kulturmedium in mehreren Anteilen unter sterilen Bedingungen zugesetzt. 



  Befriedigende Ergebnisse werden erzielt, wenn das Zusetzen bei Beginn nach 36,96 und 120 Stunden der Fermentierung erfolgt. Die fermentierte   Blühe   wird dann mit einer   Säure,   wie Schwefelsäure oder   Oxalsäure-auch   andere Säuren können verwendet werden-bei einem pH von 0, 5 bis 1, 8 angesäuert. 



  Die Brühe wird dann filtiiert und das pH mit Ammoniak auf 5 eingestellt, falls die Brühe zur Bildung des   A-DBÄD-Komplexes   ausreichende Mengen Erdalkalimetallionen enthält, und falls dies nicht der Fall ist, wird das PH mit einem Erdalkalimetallhydroxyd eingestellt. Man setzt die erforderliche Menge   A-DBÄD   zu, um eine Gesamtmenge von wenigstens einem halben Mol je Mol vorliegenden Tetracyclins, Oxytetra- 

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 Komplex wird dann ausgefällt. 



   Eine Analyse der verschiedenen Ansätze ermöglichte festzustellen, dass die gebildeten Komplexe fol- 
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 :in denen Me ein Erdalkalimetall ist. Ausser den vorstehend angegebenen Komplexen können andere weniger wichtige Komplexe, die eine andere Zusammensetzung haben, hergestellt und gebildet werden. 



   Man filtriert dann den gebildeten Komplex, wäscht ihn mit Wasser und suspendiert ihn im noch nassen
Zustand in Wasser. Durch Einstellen des pH der Suspension auf den isoelektrischen Punkt des jeweils vorliegenden Tetracyclins mit einer Säure, wie   Chlorwasserstoffsäure,   Schwefelsäure oder Oxalsäure, kann die entsprechende Tetracyclinbase im reinen Zustand hergestellt werden. Durch Umkristallisation der Komplexe unter Anwendung eines geeigneten Lösungsmittels, wie Dimethylformamid und durch Zusetzen von Wasser können die Komplexe in reinem Zustand erhalten werden.

   Im Hinblick auf die Tatsache, dass die Brühen im allgemeinen Calciumsalze in einer grossen Menge enthalten, und die mit verdünnter Schwefelsäure angesäuerte Brühe ebenfalls Calciumionen in einer für die Fällung des Komplexes überschüssigen Menge enthält, ermöglicht das Zusetzen eines ,,sequestring agent", wie Äthylensdiamintetraacetat, vor der   Fällung   des Komplexes, höhere Ausbeuten zu   eizielen.   Auch das Zusetzen eines Antioxydants zu der angesäuerten Brühe ermöglicht, ein Produkt mit höherem Reinheitsgrad zu eibalten. 



  Als Antioxydans kann man Ammoniumfoimaldehydsulfoxylat odei irgendein anderes mild wirkendes Antioxydans verwenden. 



   Die nach der Fällung bei den pH-Werten des isoelektrischen Punktes erhaltenen Basen entsprechen dem Reinheitsgrad, der von den verschiedenen Pharmakopoen gefordert wird, und sie können für medizinische Zwecke verwendet oder in die entsprechenden Säuresalze durch bekannte Verfahren übergeführt werden. 



   Die weiteren   Fermentierungsbedingungen   sind im allgemeinen bekannt, und die folgenden Beispiele geben eine eindeutige Veranschaulichung, wie die Fermentierung durchgeführt wird. 



   Wenn die   #-DBÄD-Komplexe   hauptsächlich auch zur Isolierung der verschiedenen Tetlacycline dienen, können die Komplexe auch als solche für pharmazeutische Zwecke verwendet werden, da sie eine antibiotische Wirksamkeit in vitro und in vivo haben, die dem entsprechenden Tetracyclin, das sie enthalten, 
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 EMI2.4 
 
<tb> 
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50%....................... <SEP> 28 <SEP> g <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 14 <SEP> g <SEP> 
<tb> Stärke <SEP> 38 <SEP> g <SEP> 
<tb> (NH4)2SO4....................... <SEP> 5,7 <SEP> g
<tb> NH4Cl........................... <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb> Mus04. <SEP> 4H2O....................... <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> Coil. <SEP> 6 <SEP> H2O <SEP> ....................................0,002g
<tb> 
 

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 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> ZnSÛ4......................................

   <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> Erdnussmehl.................................. <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Specköl <SEP> 35 <SEP> g <SEP> je <SEP> Liter <SEP> Leitungswassei
<tb> 
 (PH 6, 7-6, 8 nach der Sterilisation) ; es wurde mit   150 1   einer Vorkultur von Streptomyces viridifaciens geimpft und dem Medium je Liter   l   g A-DBÄD in vier gleichen Anteilen bei Beginn und nach 36,72 und 98 Stunden der Fermentierung zugesetzt. Die Fermentierung wird bei 28   C unter Belüftung von 2 I/Liter per Minute durchgeführt. Nach 150 Stunden erhält man 8, 6 g Tetracyclin je Liter. Das Medium wird dann mit 25%iger Schwefelsäure auf einen PH von 1, 5 angesäuert, mittels eines Trommelfilters filtriert und der Filterkuchen wird dann zweimal mit Wasser bei einem pH von 1, 5 extrahiert.

   Man setzt den vereinigten Filtraten 18   kg "Versene"   (Äthylendiamintetraacetat als sequestring agent) und 12 kg A-DBÄD zu ; dann wird der pH-Wert mit 12%igem Ammoniak auf 9, 5 eingestellt. Nach 3 Stunden Rühren filtriert man den Niederschlag, der im wesentlichen aus einem unreinen   A-DBÄD-Tetracyclincalciumkomplex   der Formel   ss-DBÄDs. Ca4'   Tetracyclin, besteht. Der feuchte Niederschlag wird dann in Wasser suspendiert, mit einer   10% igen   wässerigen Lösung von Oxalsäure unter Rühren auf ein pH von 1, 5 eingestellt.

   Die Lösung wird dann 
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<tb> 
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50%..................,....... <SEP> lOg
<tb> Zucker <SEP> 10g
<tb> CaC03....................................... <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 
<tb> (NHHPO,.................................. <SEP> 2g <SEP> 
<tb> KH2PO4........................ <SEP> 2g
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> ................... <SEP> 0,25g
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> cm <SEP> 
<tb> 
 wurde mit l ml einei Sporensuspension   von Streptomyces alboflavus-Mutante M-108-OX (CBS) geimpft     und bei 25   C 36 Stunden in einem rotierenden Schüttelgerät auf Temperatur gehalten.

   Dann wurde ein Probefermentierungsgerät, das ein sterilisiertes Medium folgender Zusammensetzung enthielt :    
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<tb> 
<tb> Leitungswasser <SEP> 1201
<tb> Stärke <SEP> , <SEP> 6 <SEP> kg
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50%.......................... <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> kg
<tb> CaCOg....................................... <SEP> 0, <SEP> 72 <SEP> kg
<tb> (NHJ, <SEP> SO4 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> kg
<tb> NH4Cl....................................... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> kg
<tb> CoCl2......................... <SEP> 0,180g
<tb> CuSO4. <SEP> 5H2O................... <SEP> 0,6 <SEP> g
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <SEP> H20................................ <SEP> 6 <SEP> g <SEP> 
<tb> FeSO4........................... <SEP> 0,180g
<tb> Sonnenblumenöl.................. <SEP> 0,2 <SEP> kg
<tb> 
 mit der vorstehend angegebenen, nach 36 Stunden erhaltenen Vorkultur geimpft.

   Man   setzt 400 mgA-DBAD   je Liter in vier gleichen Teilen bei Beginn nach 36,72 und 96 Stunden der Fermentierung zu. 



   Die Submers-Fermentierung wurde dann bei   260 C   unter Rühren und bei einer sterilen Belüftung durchgeführt. 



   Die Fermentierung wurde nach 150 Stunden abgebrochen ; es ergab sich eine Endkonzentration von 7, 6 g Oxytetracyclin je Liter. 



   Man säuert die fermentierte Brühe mit Schwefelsäure   (25%)   bis zu einem PH von 1, 5 an, filtriert sie und das Myzel wird mit Wasser ausgewaschen. Die vereinigten Filtrate ergaben 240 1. Man setzt dann 2 g Äthylendiamintetraacetat als sequestiing agent je Liter zu. Dann stellt man das pi auf 6 mit Ammoniak   (12%)     ein und gibt 140 g #-DBÄD zu und steigert das pH auf 9,5 mit Ammoniak (12%).   Nach dreistündigem   Rühren filtriert man und wäscht den gebildeten Niederschlag, bis das PH des Waschwassers 7 erreicht. 



  Man suspendiert den feuchten Niederschlag in Wasser und säuert mit Oxalsäure (10%) bis zu einem PH   von 1, 5 an. Man filtriert die Lösung und stellt das PH auf 5 ein. Die reine Oxytetracyclinbase kristallisiert. 



  Nach dem Filtrieren und Waschen trocknet man das Produkt ; tatsächliche Ausbeute   87%.   



   Beispiel 3 : Man verfährt wie im Beispiel 2 angegeben, aber man impft das Medium mit Streptomyces rimosus. 142 Stunden später enthält die Brühe je Liter 6, 3 g Oxytetracyclin ; endgültige Ausbeute 89  . 



   Beispiel 4 : Man impft   300 l eines   sterilen Kulturmediums folgender Zusammensetzung : 
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<tb> 
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50%........................,. <SEP> 28 <SEP> g <SEP> 
<tb> CaCO3............................... <SEP> 12 <SEP> g <SEP> 
<tb> Stärke <SEP> 38 <SEP> g <SEP> 
<tb> NH4Cl.............................. <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb> MnSO4. <SEP> 4H2O......................... <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> 
 

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<tb> 
<tb> ZnCl2.............................. <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> g <SEP> 
<tb> CoC12. <SEP> 6H2O........................ <SEP> 0,005g
<tb> Erdnussmehl <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Specköl............................

   <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ccm
<tb> 
 (pH 6, 7 nach der Stetilisation) mit einer Sporensuspension von Streptomyces lusitanus 101-A (CBS) und fügt 1200 mg/Liter A-DBÄD in vier gleichen Anteilen dem Medium bei Beginn nach 36,72 und 96 Stunden der Fermentierung zu, die bei 27   C unter Rühren und bei einer sterilen Belüftung durchgeführt wird, wobei die Luftmenge allmählich von 1, 5 I/Liter je Minute auf 4, 0 I/Liter je Minute gesteigert wird. Nach 150 Stunden beträgt die Aktivität 
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 schlag filtriert, mit Wasser gewaschen und gut abtropfen gelassen.   Mai : gibt   den noch feuchten Niederschlag zu 12 1 Dimethylformamid und fällt den Komplex durch Zusetzen von 361 Wasser aus und durch 
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 mg, ausgedrückt in Chlortetracyclinhydrochlorid. Die tatsächliche Ausbeute beläuft sich auf   88, 1%.   



   Beispiel 5 : Man impft 300   l   des wie in Beispiel 4 angegebenen zusammengesetzten Mediums mit einer Sporensuspension einer Demethylchlortetracyclin bildenden Streptomyces aureofaciens-Art. Man setzt dem Medium zu Beginn 100 mg/Liter und jeweils 200 mg/Liter   #-DBÄD nach   56 und 112 Stunden Fermentierung zu. Nach 130stündiger Fermentierung erhält man je Liter 2, 8 g Demethylchlortetracyclin. Man setzt dann dem angesäuerten Filtrat 170 g A-DBÄD zu und verfährt weiter, wie im Beispiel 4 angegeben. Das Endprodukt hat folgende Zusammensetzung: 52,8% Demethylchlortetracyclin als wasserfreie Base,   38, 4% A-DBÄD, 6, 72% Calcium   und   2, 43%   Wasser entsprechend der Formel :   Demethylchortetracyclin2.#-DBÄD3.Ca3   in wasserfreiem Zustand. Ausbeute   79%.   



   Nach dem Verfahren der Erfindung lassen sich folgende Komplexe des Tetracyclins bzw. seiner Derivate herstellen : 
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   In den vorstehend angegebenen Formeln bedeutet Me ein Erdalkalimetall-Ion.

Claims

PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin oder einem seiner Derivate, wie Chlortettacyclin, Oxytetracyclin oder Demethylchlortetracyclin, durch aerobe Fermentation eines wässerigen Fermentierungsmediums, das Erdalkalimetallionen enthält, mit einem ein Tetracyclin bildenden Mikroorganismus einer Streptomyces-Art, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Fermentierungsmedium eine kleine, aber wirksame Menge von N.

N'-Dibenzylidenäthylendiimin in mehreren Anteilen während der Fermentierung zusetzt und weitere Mengen N,N'-Dibenzylidenäthylendiimin der angesäuerten und filtrierten Brühe in solchen Mengen zusetzt, dass eine Endkonzentration von 0, 5 bis 1, 5 Mol je Mol des in der Brühe enthaltenen Antibiotikums erreicht wird, worauf der N,N'-Dibenzylidenäthylendiimin-Erdalkalimetallkomplex des gebildeten Tetracyclins bei einem pH zwischen 8 und 9, 5 gefällt und gegebenenfalls die freie Base der Tetracyclinverbindung aus dem Komplex durch Einstellung des pH auf 3-6 in einem wässerigen Medium freigesetzt wird.