CH469672A

CH469672A - Verfahren zum Reinigen von Polymyxin

Info

Publication number: CH469672A
Application number: CH1128164A
Authority: CH
Inventors: Weddle Raymond
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1963-08-30
Filing date: 1964-08-28
Publication date: 1969-03-15
Also published as: GB1089765A; NL6409924A; DK105862C; US3413398A; NL139558B; DE1256649B

Description

Verfahren zum Reinigen von Polymyxin
Die Polymyxine bilden eine Familie der polypeptiden Antibiotica, sie sind antibakteriell wirksam, insbesondere gegen Gram-negative Bakterien. Sie sind metabolische Produkte, die in Nährlösungen gebildet werden, in denen Stämme von Bacillus polymyxa (syn. Bacyllus aerospo- rus) oder Bacillus colistieuçs gezüchtet wurden. Bekannt sind die Polymyxine A, B, C, D, E und das Colistin. Colistin oder Colimyxin, das Produkt des Bacillus colistinus, wird in allen Belangen als ein Polymyxin angesehen ; es ist wahrscheinlich identisch mit Polymyxin E. (Siehe : S. Wilkinson, Lancet (1963), (i), 922-923, und W. B. Hugo and R. J. Stetton, J. Pharm. Pharmacol. (1963), 15, 490491).

Für medizinische Zwecke werden wegen ihrer geringen Toxizität Polymyxin B und E bevorzugt. Wenn in vorliegender Beschreibung nicht anders bezeichnet, bedeutet Polymyzin die Polymyxine B, E und das als Antibioticum bekannte Colistin oder Colimyxin oder ein Gemisch zweier oder aller dieser Stoffe.

Die Polymyxine sind basisch und werden im allgemeinen in Form ihrer Additionssalze mit einer therapeutisch verträglichen Säure, z. B. mit Schwefelsäure, hergestellt und verwendet. Ihre N-Sulfomethylderivate, die sich bei ihrer Behandlung mit Formaldehyd und einem Bisulfit bilden, finden gleichfalls Verwendung und sind wegen ihrer verminderten lokalen Toxizität bei Injiektionen bevorzugt. Diese Derivate liegen meistens in Form ihrer Salze mit einem therapeutisch verträglichen Kation, z. B. Natrium, vor.

Der Wirkungsgrad von Polymyzinpräparaten kann gemäss British Pharmacopoeia 1958 bestimmt werden.

Potenz oder Titer des Präparates gibt den Wirkungsgrad pro Milligramm oder Millimeter an.

Das aus dem Fermentiermedium meistens in Form eines Salzes gewonnene rohe Polymyxin ist durch die im Medium enthaltenen anorganischen und organischen Stoffe gefärbt und verunreinigt. Zwecks Gewinnung von gereinigtem Polymyxin hat man schon Fällung, Umkristallisieren, Behandlung mit Aktivkohle und Adsorption auf Ionenaustauscher mit darauffolgender Elution empfohlen.

Das entache Fallen von Polymyxin mit basischen Mitteln erhöht den Titer des Produktes, hat aber den Nachteil, dass organische mehrwertige Katione sowie andere Verunreinigungen ebenfalls gefällt werden. Ausserdem ist dieses Reinigungsverfahren nur anwendbar, wenn der Titer des rohen Polymyxins 3 000 Einheiten/ mg übersteigt, da weniger reine Rohstoffe meistens unverarbeitbare, klebrige und gelatinöse Niederschläge liefern.

Die Schweizer Patentschrift Nr. 399479 beschreibt ein Verfahren, nach welchem man rohes Polymyxin mit einer Permanganatlösung entfärbt. Nach erfolgter Entfärbung können das Mangan und andere anorganische Katione mit einem Ionenaustauscher entfernt werden.

Versuche haben nun gezeigt, dass wenn bei der Fällung von Polymyxin mit einem basischen Mittel aus wässrigem Medium ein Komplexbildner zugegen ist oder wenn man den gebildeten Niederschlag mit der Lösung eines Komplexbildners behandelt, diese Komplexbildner nicht nur die mehrwertigen anorganischen Katione in Lösung halten oder wieder auflösen, sondern das Aussehen und die Qualität des Niederschlages in unerwartetem Masse verbessern, besonders im ersteren Fall.

Diese überraschende Erscheinung ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass während mehrwertige Katione üblicherweise mit verschiedenen sonst löslichen, organischen Verunreinigungen in alkalischen Medien unlösliche Verbindungen oder Komplexe bilden, oder die gefällten Verbindungen derartiger Katione solche adsorbieren, diese unerwünschte Mitfällung der organischen Vereinigungen durch die lösende Wirkung der Komplexbildner indirekt verhindert wird. Es ergibt sich daraus eine starke Vereinfachung der Fabrikation und eine höhere Ausbeute an gereinigtem Produkt.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Reinigen von Polymyxin, das dadurch gekennzeichnet ist, das man eine Säureadditionssalze von Polymyxin B und/oder E enthaltende wässrige Lösung in Gegenwart eines Komplexbildners mit einem die Polymyxinbase fällenden basischen Mittel behandelt. Man setzt dabei den Komplexbildner zweckmässig in Lösung der wässrigen Lösung der Säureadditionssalze-zu.

Als wässrige Lösung kann man die im Laufe der Polymyxinsynthese anfallende Lösung benutzen oder man kann Polymyxinbase mit Säure in Wasser lösen. Zu diesem Zweck kann man eine beliebige Säure verwenden, die mit Polymixin wasserlösliche Additionssalze bildet, z. B. Schwefelsäure, Salzsäure oder Essigsäure. Man kann ein derartiges festes Säureadditionssalz von Polymyxin in Wasser lösen.

Man verwendet vorzugsweise eine verhältnismässig konzentrierte Lösung mit einem Titer von 0, 3 bis 1, 4 Megaeinheiten pro Milliliter und die Lösung kann auch weitere, mit Wasser mindestens teilweise mischbare Lösungsmittel, z. B. Methanol, Athanol, Aceton oder Di äthyläther, enthalten. Ein Zusatz von Aceton erwies sich als sehr vorteilhaft, weil der dabei gebildete Niederschlag gut verarbeitbar ist. Es zeigte sich, dass eine Lösung von rohem Polymyxin B-sulfat in 10 Gew./Vol. % Aceton enthaltendem Wasser, mit einem Titer von 0, 6 Megaeinheiten/ml. besonders brauchbar ist.

Besonders geeignete Komplexbildner sind diejenigen, welche mit mehrwertigen anorganischen Kationen was serlösliche Komplexverbindungen bilden, wobei diese auch unter basischen Bedingungen löslich bleiben. Insbesondere sind Komplexbildner für Calcium-, Magnesium-, Mangan-und/oder Eisenione brauchbar. Zwecks Anpassung an die vorhandenen Verunreinigungen kön- nen auch mehrere Komplexbildner verwendet werden.

Als Komplexbildner für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kommen z. B. in Frage Polyaminopolycarbonsäuren und ihre Salze. Beispiele für Komplexbildner sind Athylendiamin-N, N, N', N'-tetraessigsäure (Edetinsäure) oder deren Di-natrium und Tetranatriumsalze, Glycinderivate und deren Salze, z. B. N, N- -Di- (2-hydroxyäthyl)-glycin und N- (Carboxymethyl)-N'- -(2'-hydroxyäthyl)-N, N'-äthylendiglycin, sowie Gemische von Diäthylentriaminocarbonsäuren oder Nitrilotriessig- säure. Die komplexbildende Wirksamkeit dieser Stoffe variiert in gewissem Masse mit der Natur der vorhandenen Katione. So kann man z.

B. bei hohen Eisengehalten vorteilhaft N, N-Di- (2-hydroxyäthyl)-glycin verwendet. Da das Polymyxin üblicherweise mit Calcium und Magnesium verunreinigt ist, verwendet man vorzugsweise eine 38 Gew. %-ige Lösung des Tetranatriumsalzes der obengenannten Edetinsäure.

Die anzuwendende Menge an Komplexbildner kann durch Bestimmung des Aschengehaltes des rohen Polymyxins oder des Trockenrückstandes der zu verwendenden Polymyxinlösung festgestellt werden. Nimmt man an, dass die ganze Asche aus Magnesiumverbindungen besteht, welche von allen üblichen mehrwertigen Kationsalzen das niedrigste Aquivalentgewicht haben, gelangt man zu einer eine gewisse Sicherheit bietenden Uber- schätzung der Menge der vorhandenen Ionen. Ein dieser Menge entsprechender Zusatz an Komplexbildner ist stets genügend. Diese Feststellung soll aber nicht als Höchstmenge an Komplexbildner betrachtet werden ; sogar ein mehrfacher Überschuss an Komplexbildner hat keinen Einfluss auf die Qualität oder Menge des Niederschlages.

Vorzugsweise wird der Komplexbildner zusammen mit dem basischen Mittel zugesetzt. Man kann aber auch eine neurale Lösung, z. B. die Lösung des Dinatrium- salzes der Athylendiamin-N, N, N', N'-tetraessigsäure anstatt ihres Tetranatriumsalzes der Polymyxinlösung vor der Fällung zusetzen.

Als basisches Mittel kann jeder Stoff verwendet werden, der die Polymyxinbase zu fällen vermag, z. B. Carbonate und Hydroxyde der Alkalimetalle, und vorzugsweise eine konzentrierte wässrige Lösung von Ammoniak.

Der pH-Wert der Lösung soll bei der Fällung zweckmässig mehr als 8, 5 betragen, aber möglichst weniger als 11, um eine Zersetzung oder einen Wirkungsverlust des Polymyxins in derart stark basischem Medium zu vermeiden.

Am besten arbeitet man zwischen pH 9 und 10, 5. Die ausgefällte Polymyxinbase kann man von der darüber- stehenden Flüssigkeit abtrennen, in das Sulfat oder ein anderes Salz oder ein Polymyxinderivat überführen oder weiter reinigen.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird vorzugsweise nach der eingangs erwähnten Behandlung mit Permanganat durchgeführt. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens kann man das in der Lösung enthaltene Mangan und andere kationische Verunreinigungen entfernen, ohne eine Reinigung mit Ionenaustauschern durchzuführen.

Beispiel I
100 g rohes Polymyxin-E-sulfat (Titer 1796 Einheiten/mg) werden in 500 ml Wasser gelöst und der unlös- liche Stoff abfiltriert. Zu der klaren Lösung gibt man langsam unter stetem Rühren eine Mischung von 250 ml 35-% igem Ammoniak und 250 ml aDetarex 100 (eingetragene Marke, hergestellt von der Firma F. W. Berk & Company Ltd.), die 38 Gew. % Tetranatriumäthylen diamin-N, N, N', N'-tetraessigsäure enthalten, und lässt die Lösung 4 Stunden stehen.

Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen, bis der Geruch von Ammoniak verschwindet, und bei niedriger Temperatur vakuumgetrocknet. Man erhält 6, 9 g Polymyxin-E-Base (Titer 13 060 Einheiten/mg, Asche : 0, 1%).

Bei einem anderen zu Vergleichszwecken ausgeführ- ten Versuch werden ebenfalls 100 g des obigen rohen Polymyxin-E-Sulfat verwendet und die Fällung durch Zugabe einer Mischung von 250 ml 35-% igem Ammoniak und 250 ml destilliertem Wasser ohne Verwendung eines Komplexbildners durchgeführt. Man erhält 13, 7 g Polymyxin-E-Base (Titer wegen der Verunreinigungen unzuverlässig, Asche : 69, 6%.).

Beispiel 2
1, 0 kg rohes Polymyxin-B-sulfat (Titel 1166 Einhei ten/mg, Asche 21, 1%), das aus der Fermentationsbrühe erhalten wurde, wird in 10 Liter Wasser und der unlös- liche Stoff abfiltriert. Die klare Lösung konzentriert man bei niedriger Temperatur auf ein Volumen von 5 Liter.

Zu der Lösung gibt man gemäss dem im Patent Nummer 399479 beschriebenen Verfahren eine 0, 475 n Schwefelsäure, die 2, 5% Kaliumpermanganat enthält, bis die rosa Farbe 5 Minuten permanent ist. Man benötigt ungefähr 1 Liter angesäuerter Permanganatlösung Die Lösung wird dann mit 20 ml 30-i% igem (Gewicht Volumen) Wasserstoffperoxyd behandelt, um die Farbe zu entfernen.

Nach Filtrieren wird langsam unter stetem Rühren eine Mischung von 2, 5 Liter 35-% igem Ammoniak und 2, 0 Litern aDetarex 100) y zugegeben und die Lösung 4 Stunden stehen gelassen. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen, bis er frei von Ammoniakgeruch ist, und bei niedriger Temperatur vakuumgetrocknet. Man erhält 67, 5 g Polymyxin-B-Base (Titer 9166 Einheiten/mg, Asche 0, 15%).

Das Produkt wird darauf durch Lösen der Base in Wasser, das 1 Aquivalent Schwefelsäure enthält, in das Sulfat übergeführt und das Polymixin-B-Sulfat durch Gefriertrocknen erhalten. Die biologische Wirkung ist voll erhalten.

Beispiel 3
104 g rohes Polymyxin-E-sulfat (Titer 1, 192 Einhei ten/mg, Asche als Sulfat 28, 1%) wird wie in Beispiel I in Wasser gelöst und das Filtrat auf 1500 ml aufgefüllt.

Zu 100 ml eines aliquoten Teils der obigen Lösung werden 10 ml Aceton und eine Mischung von 25 ml 35-% igem Ammoniak und eine 25 ml-Lösung eines Komplexbindners zugesetzt. Als Komplexbildner werden die folgenden von der Firma F. W. Berk & Company Ltd. hergestellten verwendet : Muster :

Komplexbildner : 38-gew. % iges Tetranatrium-äthylendiamin, N, N, N', N'-tetraessigsäure (aDetarex 100 , einge- tragene Marke) 2 34, 4-gew. % iges Trinatrium-N-(carboxymethyl)- -N'- (2-hydroxyäthyl)-N, N'-äthylendiglycin ( Detarol) y, eingetragene Marke) 3 Gleiche Mischung von Detarex 100 und 39-gew. %igem Natrium-N, N-di- (2-hydroxy- äthyl)-glycin (aDetarex F , eingetragene Marke) 4 34-gew.

% ige Lösung einer Mischung Diäthy- lentriaminocarbonsäuren ( Detarex PY , einge tragene Marke) 5 12, 5 g Trinatriumnitrilotriessigsäure (aDetarex NTA) > ), mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt 6 Wasser (Bezugsbeispiel).

Der Niederschlag wird gesammelt und wie im Bei spiel 1 getrocknet. Die Ergebnisse sind die folgenden : eit/mg) itäts ute aus @ Sulfat sisi base (g) (Einhei Asche a
Sulfat @
Aktivit@ (%)
1 0,312 13,310 2,2 50,2
2 0, 317 13, 240 0, 65 50, 8
3 0, 370 13, 290 0, 10 59, 5
4 0, 310 13, 310 0, 46 50, 4
5 0, 312 12, 660 2, 7 47, 8
6 0, 749 3, 646 61, 3 32, 8
Beispiel 4
500 g rohes Polymyxin-B-Sulfat (Titer 1, 387 Ein heiten/mg, Asche als Sulfat 17, 6%) werden wie in Bei- spiel 2 in 5 Liter Wasser gelöst und das Filtrat bei nied riger Temperatur auf 2, 5 Liter konzentriert.

Zu 50 ml aliquotem Teil der obigen Lösung werden
5 ml Aceton und eine Mischung aus 25 ml 35-% igem
Ammoniak und eine Lösung von 25 ml eines Komplex bildners zugesetzt. Der Niederschlag wird wie in Beispiel 1 gesammelt und getrocknet.

Man erhält folgende Ergebnisse :
N)
2-Sµ -3.µM-'-"5"
Aktiv ausb@ aus r
Sulfa
1 Detareux 100 1,13 7,063 1,17 57,7
2 Detarol 1, 13 7, 191 1, 17 58, 7
3 < (Detarex F 1, 84 4, 965 0, 19 65, 8
4 Detarex PY 1, 24 6, 988 0, 72 62, 5
5 Detarex NTA 1, 13 7, 026 2, 22 57, 3
6 keiner (Wasser) 1, 69 4, 514 19, 45 55, 0
Beispiel 5 1 Liter der in Beispiel 4 nach Konzentrieren erhaltenen Lösung wird mit einer 250 ml-Lösung von 0, 475 n-Schwefelsäure, die 2, 5% Kaliumpermanganat enthält, nach dem in der Schweizer Patentschrift Nr. 399 479 beschriebenen Verfahren behandelt.

Das Mangandioxyd wird durch Zugabe einer kleinen Menge Wasserstoffperoxyd nochmals gelöst, die Lösung filtriert und das Volumen der Lösung auf 1, 5 Liter eingestellt.

Claims

Zu 150 ml aliquotem Teil der Lösung werden 15 ml Aceton und eine Mischung von 75 ml 35-% igem Ammoniak und eine 75 ml-Lösung eines Komplexbildners zugesetzt. Der Niederschlag wird wie in Beispiel 2 gesammelt und getrocknet. Man erhält folgende Ergebnisse : Erhaltene Base (g) Titer (Einheit/mg) Asche als Sulfat (%) Aktivitätsausbeute aus rohem Sulfat (%) 1 Detarex 100 1,86 7,240 0,42 48,4 2 oDetarex PY 1, 73 7, 602 0, 38 47, 25 3 Detarex NTA 1, 86 7, 127 0, 58 47, 77 4 keiner (Wasser) 2, 99 4, 127 45, 4 44, 47 PATENTANSPRUCH Verfahren zum Reinigen von Polymyxin, dadurch gekennzeichnet,

dass man eine Säureadditionssalze von Polymyxin B und/oder E enthaltende wässrige Lösung in Gegenwart eines Komplexbildners mit einem die Poly myxinbase fällenden basischen Mittel behandelt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komplexbildner einen Stoff verwendet, der zur Bildung von Komplexverbindungen der Katione Calcium, Magnesium, Mangan oder Eisen geeignet ist.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung der Säureadditionssalze ein mehrwertiges anorganisches Kation enthält.

3. Verfahren nach den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung Cal cium-, Magnesium-, Mangan-und/oder Eisenione enthält.

4. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komplexbildner Äthylen- diaminotetraessigsäure oder deren dissoziationsfähiges Salz verwendet.

5. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komplexbildner N, N-Di (2 -hydroxyäthyl)-glycin verwendet.

6. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komplexbildner N- (Carboxymethyl)-N'- (2-hydroxyäthyl)-N, N'-äthylendiglycin verwendet.

7. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komplexbildner ein Gemisch von Diäthylentriaminocarbonsäuren verwendet.

8. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komplexbildner Nitrilotriessigsäure verwendet.

9. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Komplexbildner in molarem Überschuss zu den mehrwertigen Kationen verwendet.

10. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung 10 Gew./Vol. % Aceton enthältt 11. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung pro Millimeter 0, 3 bis 1, 4 Megaeinheiten Polymyxin enthält.

12. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als basisches Mittel Ammoniak verwendet.

13. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH-Wert der wässrigen Lösung mit einer den Komplexbildner enthaltenden Lösung des basischen Mittels zwischen 8, 5 und 11 einstellt.