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Verfahren zur Herstellung von neuen Cephalosporinderivaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von antibiotisch wirksamen Cephalosporinderivaten.
Unter den Verbindungen mit dem Kern der Produkte vom Cephalosporin C-Typ gibt es solche der Klasse des Cephalosporin CA, welche in 3-Stellung des Thiazinringes einen Methyl-tert.-amino- substituenten enthalten, der ein inneres Salz oder Zwitterion bildet.
Die neuen, nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellten Verbindungen gehören zur Klasse der Cephalosporin CA-Verbindungen, für die das Cephalosporin CA selbst der Prototyp ist :
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Die neuen Verbindungen gemäss der Erfindung können durch die folgende Formel
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veranschaulicht werden, worin R a-Thienyl, ss -Thienyl, a-Furyl oder ss-Furyl bedeutet, m und n Ooder 1 sind und Rl, das einen Substituenten in der 3- oder 4-Stellung des Pyridinringes symbolisiert, einen Cyano-, Carboxyl-, Carbamyl-, N-Methylcarbamyl-, Carbo-(C1-C4)-alkoxy-, Hydroxy- oder (C1-C4)- - Alkanoyl-Rest bedeutetj sie umfassen auch die Salze derselben mit pharmazeutisch verwendbaren Säuren.
Bei der Benennung der neuen Verbindungen, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden, ist es üblich, die Grundstruktur des gesättigten, ring-kondensierten ss-Lactamthiazins als "Cepham"
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zu bezeichnen und die Verbindungen als Derivate davon zu benennen, wobei die Bezeichnung"Cephem" auf die Grundstruktur mit einer einzigen olefinischen Bindung hinweist. Nach diesem System wird Cephalosporin CA selbst als 7- (5'-Aminoadipamido)-3-pyridinomethyl-3-cephem-4-carbonsäure be-
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lung 7 befindlichen Radikale sowie der Pyridinverbindung, die zur Substitution der Acetoxygruppe in Stellung 3 angewendet wird, hervorzuheben.
So kann 7- (a-Thienylacetamido)-3- (4'-carbamylpyridinomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure als a-Thienylmethylisonicotinamid-cephalosporin CA bezeichnet werden.
Die folgenden Verbindungen veranschaulichen Beispiele für nach der Erfindung herstellbare Cephalosporin CA - Verbindungen :
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-Thienylmethyl-3-butyrylpyridin-cephalosporin CAss-Furylisobutylnicotinat-cephalosporin CA und die Salze derselben mit pharmazeutisch anwendbaren Säuren, beispielsweise Hydrochloride, Hydro-
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bequem aus der analogen Cephalosporin C-Verbindung, welche die gewünschte Acylamidogruppe in Stellung 7 und die charakteristische Acetoxymethylgruppe in Stellung 3 aufweist, durch Vermischen in wässeriger Lösung mit einem Überschuss des entsprechenden substituierten Pyridins und Umsetzung bei erhöhter Temperatur erhalten werden.
Die Reaktion wird zweckmässig bei PH-Werten von etwa 3 bis 8, 5, vorzugsweise bei pH-Werten von 6 bis 7, und bei Temperaturen von etwa 40 bis etwa 1000 C, vorzugsweise bei etwa 50-75 C, durchgeführt. Unter den bevorzugten Bedingungen ist eine Reaktionszeit von 4 bis 8 h im allgemeinen ausreichend. Niedrige Temperaturen erfordern längere Zeit, während höhere Temperaturen dazu führen können, dass das Produkt abgebaut wird. Die Cephalosporin C-Verbindung kann in Form der freien Säure oder als Salz verwendet werden. Die Pyridinverbindung soll in wenigstens äquimolarem Verhältnis zur Cephalosporin C-Verbindung und vorzugsweise in wesentlichem Überschuss benutzt werden, z.
B. in einem Molverhältnis von 3 : 1 bis 10 : 1 oder mehr, um einen möglichst hohen Umwandlungsgrad der Cephalosporin C-Verbindung zu erreichen ; der verwendete Überschuss kann bequem rückgewonnen und wiederverwendet werden. Unter den Reaktionsbedingungen wird die Acetoxygruppe abgespalten und durch die substituierte Pyridinverbindung ersetzt, wobei die Verknüpfung der letzteren mit der verbleibenden Methylengruppierung direkt mit dem Ringstickstoffatom erfolgt und ein quaternäres Ammoniumderivat gebildet wird, das wieder mit der Carboxylgruppe
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in Stellung 4 ein inneres Salz bildet.
Das gewünschte Produkt kann bequem aus der Reaktionsmischung durch Eindampfen zur Trockne unter Vakuum, Verreiben mit Aceton zur Entfernung der Ausgangsmaterialien und wiederholtes Fällen aus wässeriger Lösung durch Zugabe von Aceton erhalten werden. In vielen Fällen ist es zweckmässig, das Produkt direkt aus wässeriger Lösung umzukristallisieren, indem man es in Wasser bei erhöhter Temperatur auflöst und dann die Lösung kühlt.
Das gewünschte Cephalosporin C-Ausgangsmaterial kann in bequemer Weise durch Acylieren von 7-Aminocephalosporansäure mit einem Acylierungsmittel der gewünschten Struktur unter üblichen Bedingungen erhalten werden. Ein geeignetes Acylierungsmittel ist das entsprechende thienyl- oder furyl- - substituierte Acy1chlorid oder -bromid. Die Acylierung wird in Wasser oder in einem entsprechenden organischen Lösungsmittel, vorzugsweise unter im wesentlichen neutralen Bedingungen und insbesondere
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h.wässerigem, 50 vol.-tigemAceton und einer genügenden Menge Natriumbicarbonat vermischt, um die Auflösung zu begünstigen, wobei die Konzentration der 7-Aminocephalosporansäure etwa 1 bis etwa
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Zimmertemperatur erwärmen,
worauf sie auf einen PH- Wert von etwa 2 angesäuert und mit Äthylacetat oder einem andern unmischbaren Lösungsmittel extrahiert wird. Der Äthylacetatextrakt wird unter Verwendung von Kaliumhydroxyd oder einer andern Base auf einen pH-Wert von etwa 4, 5 eingestellt und mit Wasser extrahiert. Die wässerige Lösung wird abgetrennt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in der geringstmöglichen Menge Wasser aufgenommen und das acylierte Produkt wird durch Zugabe eines grossen Überschusses von Aceton und erforderlichenfalls von Äther gefällt. Das dabei erhaltene kristalline Material wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
Die Acylierung der 7-Aminogruppe kann auch mit der entsprechenden Carbonsäure ausgeführt werden, wenn diese zusammen mit einem äquimolaren Anteil oder einer grösseren Menge eines Carbodiimids eingesetzt wird, wobei die Acylierung bei in solchen Fällen üblichen Temperaturen verläuft.
Beliebige der Carbodiimide sind für diesen Zweck wirksam, in denen der wirksame Rest die-N=C=N- - Struktur ist. Erläuternde Beispiele umfassen N, N'-Diäthylcarbodiimid, N, N'-Di-n-propylcarbodiimid, N, NI - Diisopropylcarbodiimid, N, N 1- Dicyclohexylcarbodiimid, N, N'- Diallylcarbodiimid, N, N'-bis.
- (p-Dimethylaminophenyl)-carbodiimid, N-Äthyl-N'- (4"-äthylmorpholinyl)-carbodiimid u. dgl. sowie andere geeignete Carbodiimide, wie sie in den USA-Patentschriften Nr. 2, 938, 892 und Nr. 3, 065, 224 beschrieben sind.
Die Acylierung der 7-Aminogruppe kann auch mit einem aktivierten Derivat der entsprechenden Carbonsäure, zweckmässig dem entsprechenden Säureanhydrid, oder einem gemischten Anhydrid, dem Azid oder einem aktivierten Ester durchgeführt werden. Andere geeignete Derivate können leicht ermittelt werden.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert, die lediglich erläuternden, jedoch keineswegs beschränkenden Charakter haben. Die antibiotischen Wirksamkeiten, die nachfolgend angegeben sind, wurden gegen Staphylococcus aureus 209 P unter Anwendung einer entsprechenden Modifikation der Methode von Higgens et al., Antibiotics 0 ; 0 Chemotherapy, 3,50-54 (Januar [1953]) und Loo et al., Journal of Bacteriology, 50,701-709 [1945] durchgeführt.
Beispiel l : (X-Thienylmethylisonicotinamidcephalosporin CA.
Eine Mischung von 101 g des Natriumsalzes von 7- (a-Thienylacetamido) -cephalosporansäure, 200 g Isonicotinamid und 11 Wasser wird 40 h auf 37, 50 C erhitzt und dann unter Vakuum zur Trockne gebracht. Der Rückstand wird dreimal mit Aceton verrieben (10 l, 5 l und 5 l). Das in Aceton unlösliche Material, das 105 g wiegt, wird mit 300 ml Wasser versetzt, schwach erwärmt, abgekühlt und filtriert.
Das wasserunlösliche Material wird mit 700 ml Aceton verrührt, dann abgetrennt und an der Luft getrocknet. Das dabei erhaltene Produkt, das 32 g wiegt, wird in heissem Wasser gelöst und umkristallisiert. Man erhält 18, 4 g 7-(α-Thienylacetamido)-3-(4'-carbamylpyridinomethyl)-3-cephem- -4-carbonsäure mit einem F. von 147 bis 1500 C (Zers.) mit Maxima im UV-Absorptionsspektrum bei 233 und 262 ma = 16650 bzw. 13550).
Eine umkristallisierte Probe des Produktes zeigte eine antibiotische Aktivität von 690 Penicillin G-Einheiten je mg. Das Produkt ist in Lösung (10 y/ml) in 1/10-molarem Phosphatpuffer im pH-Bereich von 4, 5 bis 7, 5 bei 40 C während eines Monats stabil.
Beispiel 2: α-Thienylmethylnicotinamid-cephalosporin CA.
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1, 0 g Natriumsalz der 7- (a-Thienylacetamido) -cephalosporansäure und 2, 0 g Nicotinamid werden in 50 ml Wasser gelöst. Die entstehende Lösung wird unter Verwendung von In-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2, 5 eingestellt und es wird 18 h auf 400 C erhitzt. Die Mischung wird dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird zweimal mit Aceton (100 ml und 50 ml) verrieben. Das acetonunlösliche Material wird in 3, 5 ml Wasser gelöst und durch Zugabe von 36, 5 ml Aceton wiedergefällt. Die Feststoffe werden mit 40 ml Aceton verrieben und unter vermindertem Druck getrocknet.
Man erhält 420 mg 7- (a-Thienylacetamido) -3- (3'-carbamylpyridinomethyl) -3-cephem-4-carbonsäure mit Maxima im UV-Absorptionsspektrum bei 232 und 260 mg (e = 10 700 bzw. 7750). Die antibiotische Wirksamkeit beträgt 260 Penicillin G-Einheiten/mg.
Beispiel 3 : a-Thienylmethyl-3-hydroxypyridin-cephalosporin CA'
200 mg 7- (a-Thienylacetamido) -3 - (3 l-hydroxypyridinomethyl) -3 -cephem -4- carbonsäure werden gemäss Beispiel 2 durch Umsetzung von 1, 0 g des Natriumsalzes von 7- (a-Thienylacetamido) -cephalo- sporansäure mit 2, 0 g 3-Hydroxypyridin hergestellt. Das Reaktionsprodukt zeigte Maxima im UV-Absorptionsspektrum bei 236 und 322 mg ! ( = 12000 bzw. 2200) sowie eine antibiotische Wirksamkeit von 200 Penicillin G-Einheiten/mg.
Beispiel 4 : a-Thienylmethyl-3- (N'-methylcarbamyl)-pyridin-cephalosporin CA.
370 mg 7- ( < x-Thienylacetamido)-3- (3'- [N"-methylcarbamyl] -pyridinomethyl)-3-cephem-4-car- bonsäure werden nach Beispiel 2 durch Umsetzung von 1, 0 g des Natriumsalzes von 7 - (a-Thienylacet- amido)-cephalosporansäure mit 2, 0g 3- (N'-Methylcarbamyl)-pyridin erhalten. Das Reaktionsprodukt hat Maxima im UV-Absorptionsspektrum bei 235 und 260 mu (e = 13500 bzw. 8 900) und eine antibiotische Aktivität von 260 Penicillin G-Einheiten/mg.
Eine umkristallisierte Probe des Reaktionsproduktes zeigte eine antibiotische Wirksamkeit von 570 Penicillin G-Einheiten/mg.
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bonsäure werden durch Umsetzung von 1, 0 g des Natriumsalzes von 7- (a-Thienylacetamido) -cephalo- sporansäure mit 2,0 g 4-(N'-Methylcarbamyl)-pyridin bei pH 2,9 erhalten, wobei Verfahrensweise und Reaktionsbedingungen wie im Beispiel 2 angewendet werden. Ein 340 mg-Anteil des so erhaltenen Produktes wird durch Auflösen in 2 ml Wasser, Fällung mit 40 ml Aceton, Abfiltrieren, Verreiben mit 40 ml Aceton und Trocknen unter Vakuum gereinigt.
Die Ausbeute an gereinigtem Produkt beträgt 220 mg ; die Absorptionsmaxima im UV-Spektrum liegen bei 232 und 264 mu (e = 11600 bzw. 6550), die antibiotische Aktivität beträgt 490 Penicillin G-Einheiten/mg.
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und der pH-Wert wird unter Verwendung von In-Salzsäure auf 2, 8 eingestellt. Zur Lösung gibt man 6 g 4-Cyanopyridin und erhitzt die Mischung 20 h auf 400 C. Das Reaktionsprodukt wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Acetonanteilen von 500,250 und 250 ml verrieben und dann unter Vakuum getrocknet. Ausbeute 2, 75 g.
Der so erhaltene Festkörper wird in 4 ml Wasser gelöst, mit 80 ml Aceton verrieben und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute 1, 75 g. Der Feststoff wird erneut in 4 ml Wasser aufgelöst, mit 100 ml Aceton gefällt, durch Dekantieren abgetrennt, mit 100 ml Aceton verrieben und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 1, 16 g. Der Festkörper wird in 3 ml Wasser gelöst und 3 Tage gekühlt, während welcher Zeit sich ein kristalliner Festkörper ausscheidet. Dieses Material wird abgelöst und gerührt, worauf die Mischung in Eis gekühlt und zentrifugiert wird ; die flüssige Phase wird dekantiert. Es wird 1 ml Wasser zugesetzt und Zentrifugieren sowie Dekantieren werden wiederholt. Der Festkörper wird mit 5 ml Aceton verrieben und im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute beträgt 70 mg 7- (a-Thienylacetamido) - -3-(4'-cyanopyridinomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure; Absorptionsmaxima im UV-Spektrum bei 2 : 32 und 236 mu (e -20600 bzw . 11300); antibiotische Wirksamkeit entsprechend 500 Penicillin G-Einheiten/mg.
Beispiel 8: α-Thienylmethyl-4-carbomethoxypyridin-cephalosporin CA.
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25 g Natriumsalz von 7- (a-Thienylacetamido) -cephalosporansäure werden in 250 ml Wasser gelöst und zur Lösung werden 50 g Methylisonicotinat zugegeben. Die Mischung wird 41 h auf 370 C erhitzt und dann im Vakuum zur Trockne gebracht. Der Rückstand wird viermal mit 1250 ml-Anteilen Aceton verrieben und dann im Vakuum getrocknet. Ausbeute = 18, 13 g.
Das unreine Produkt wird in 40 ml Wasser gelöst und die Lösung wird gekühlt. Die dabei erhaltenen Feststoffe werden abfiltriert (etwa 4 g), aus 40 ml Wasser umkristallisiert, mit 40 ml Aceton verrieben und im Vakuum getrocknet. Ausbeute = 1, 6 g 7- (a-Thienylacetamido) -3- (4'-carbomethoxypyridino) - - 3-cephem-4-carbonsäure mit Maxima im UV-Absorptionsspektrum bei 226und263 mil (C = 18600 bzw.
12030) sowie einer antibiotischen Aktivität von 430 Penicillin G-Einheiten/mg.
Beispiel 9 : α-Thienylmethyl-3-cyanopyridin-cephalosporin CA.
3 g Natriumsalz von 7- (a-Thienylacetamido)-cephalosporansäure werden mit 6 g 3-Cyanopyridin während 17, 5 h in der im Beispiel 7 angegebenen Weise zur Reaktion gebracht.
Der Rückstand aus der Reaktionsmischung wiegt 2, 69 g und wird in 5, 3 ml Wasser gelöst, zur Abscheidung von Feststoffen gekühlt, dekantiert, mit 2 ml Wasser verrieben, zentrifugiert, dekantiert und erneut mit 10 ml Aceton verrieben, dekantiert, und unter Vakuum getrocknet. DieAusbeutebeträgt 0, 47 g 7-(α-Thienylacetamido)-3-(3'-cyanopyridino)-3-cephem-4-carbonsäure vom F. = 127-1280 C.
Die UV-Absorptionsmaxima liegen bei 235 und 264 my (E = 14700 bzw. 10750) und die antibiotische Aktivität beträgt 407 Penicillin G-Einheiten/mg.
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10 : 7- ( < x-Thienylacetamido)-3-pyridinomethyl-3-cephem-4-carbonsäure.Kaliumthiocyanat und 100 g Pyridin in 500 ml Wasser wird unter Verwendung von 10 ml sirupöser Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 6, 5 eingestellt und dann auf 600 C während 6 h unter Rühren erhitzt.
Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt und mit 25%obigem Amberlite LA-1 (einem flüssigen organischen Anionenaustauscher auf Aminbasis, der in der Acetatform verwendet wird) in Methylisobutylketon, einmal mit 1, 01 und einmal mit 0, 75 I gewaschen, wobei die Kontaktzeit in jedem Falle etwa 20 min beträgt. Abschliessend wird mit 500 ml Methylisobutylketon gewaschen.
Die gewaschene wässerige Schicht wird mit Kristallen der 7- (a-Thienylacetamido) -3-pyridino- methyl-3-cephem-4-carbonsäure beimpft und über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Der dabei erhaltene kristalline Festkörper wird abfiltriert, zweimal mit kleinen Volumsmengen kalten Wassers und dann mit einem Überschuss von Äthyläther gewaschen sowie unter Vakuum getrocknet. Man erhält 41 g 7-(α-Thienylacetamido)-3-pyridinomethyl-3-cephem-4-carbonsäure in Form des inneren Salzes.
Analyse :
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<tb>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 54, <SEP> 92% <SEP> H <SEP> = <SEP> 4, <SEP> 12% <SEP> N <SEP> = <SEP> 10, <SEP> 11% <SEP> S <SEP> = <SEP> 15, <SEP> 43% <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 54, <SEP> 65% <SEP> H <SEP> = <SEP> 4, <SEP> 36% <SEP> N <SEP> = <SEP> zes <SEP> = <SEP> 14, <SEP> 31% <SEP>
<tb> 14, <SEP> 700 <SEP> ; <SEP> 0. <SEP>
<tb>
Das Reaktionsprodukt zeigt in Infrarot-Absorptions- und Kernmagnetresonanzspektrum, die mit der erwarteten Struktur in Übereinstimmung stehen. Es hat ein durch Titration ermitteltes scheinbares Molekulargewicht von 425 und einen pKa-Wert von 3, 2. Im UV-Absorptionsspektrum zeigt es Maxima bei 239 und 252 mit, wobei molare Extinktionskoeffizienten von 15160 bzw. 13950 vorliegen. Im biologischen Test zeigt es gegen penicillinempfindliche Staphylococcen eine Aktivität entsprechend 1590 Penicillin G-Einheiten/mg.
Die Verbindungen, wie sie gemäss der Erfindung erhalten werden, sind durch Beständigkeit gegen- über der zerstörenden Wirkung der Penicillinase, minimale Toxizität, hohe Aktivität gegen ein breites Spektrum von grampositiven pathogenen Keimen, niedrige, aber wirksame Aktivität gegen zahlreiche gramnegative pathogene Keime und anhaltende (prolongierte) Wirksamkeit nach intramuskulärer Injektion gekennzeichnet, wobei diese Wirksamkeit 7 - 14 Tage oder länger dauert.
Die Verbindungen sind gegen penicillinresistenten Staphylococcus aureus hoch aktiv, sogar in Gegenwart von Serum. In der nachstehenden Tabelle sind die Bereiche der minimalen Hemmkonzentration (MIC) der Verbindungen nach den Ausführungsbeispielen angegeben, wobei die Ermittlungen in beiden Fällen in Gegenwart und in Abwesenheit von Menschenblutserum und gegenüber vier klinisch isolierten penicillinresistenten Staphylococcus aureus-Stämmen nach der Gradientplattenmethode durchgeführt wurden.
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<tb>
<tb>
MIC <SEP> in <SEP> ml <SEP> : <SEP>
<tb> Beispiel
<tb> Nr. <SEP> : <SEP> ohne <SEP> Serum <SEP> : <SEP> mit <SEP> Serum <SEP> : <SEP>
<tb> 1 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 0, <SEP> 4-0. <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 5-2, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0-2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 1, <SEP> 0-3, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 0-2, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 0, <SEP> 9-4, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 8-1, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 0, <SEP> 8-1, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 0, <SEP> 3-0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 7-1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0,
<SEP> 3 <SEP>
<tb>
Die Verbindungen sind auch in hohem Masse gegen hämolytische Streptococcen wirksam, wie durch die folgenden Angaben veranschaulicht wird, die eine mittlere wirksame Dosis (EDso) gegen ss-hämolytischen Streptococcus-Stamm C203 an Mäusen angeben, wobei die Verabfolgung oral 1 h nach der Infektion und ein weiteres Mal 4 h später durchgeführt wurde :
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> ED, <SEP> mg/kg, <SEP> x2
<tb> Nr. <SEP> :
<SEP>
<tb> 1 <SEP> 1, <SEP> 05 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 12, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 8 <SEP> < <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 1, <SEP> 1
<tb>
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Hemmkonzentrationen von Verbindungen nach den Ausführungsbeispielen 1 - 9 gegen eine Anzahl von gramnegativen Organismen, ermittelt nach der Gradientplattenmethode, an :
EMI6.4
<tb>
<tb> MIC <SEP> in <SEP> γ/ml:
<tb> Organismus <SEP> : <SEP> Beispiel <SEP> :
<SEP>
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP>
<tb> Shigella
<tb> sonnei <SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> 23 <SEP> 18 <SEP> 14 <SEP> 22 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 15
<tb> Shigella <SEP> N-9x <SEP> 3,6 <SEP> 19 <SEP> 23 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> 13 <SEP> 43 <SEP> 44
<tb> E. <SEP> coli <SEP> N-10x <SEP> 5 <SEP> 25 <SEP> 49 <SEP> 23 <SEP> 16 <SEP> 21 <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 15
<tb> E. <SEP> coli <SEP> N-26x <SEP> 4 <SEP> 19 <SEP> 25 <SEP> 19 <SEP> 15 <SEP> 18 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 15
<tb> Klebsiella
<tb> pneumoniae <SEP> 4 <SEP> 16 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 11
<tb> K.
<SEP> pneumoniae
<tb> K-1x <SEP> 3 <SEP> 19 <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 15 <SEP> 7 <SEP> 2 <SEP> 29
<tb> Aerobacter
<tb> aerogenes <SEP> 4 <SEP> 21 <SEP> 8 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 17 <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 13
<tb> x <SEP> = <SEP> klinisch <SEP> isoliert.
<tb>
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Die Verbindung des Beispiels 10 zeigt gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen minimale Hemmkonzentrationen wie die folgenden :
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> : <SEP> MIC, <SEP> y/ml <SEP> : <SEP>
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Shigella <SEP> sp. <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0,1 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0, <SEP> 0078 <SEP>
<tb>
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Process for the preparation of new cephalosporin derivatives
The invention relates to a process for the production of antibiotically active cephalosporin derivatives.
Among the compounds with the core of the products of the cephalosporin C-type there are those of the class of the cephalosporin CA which contain a methyl-tert-amino substituent in the 3-position of the thiazine ring which forms an inner salt or zwitterion.
The new compounds produced by the process according to the invention belong to the class of cephalosporin CA compounds, for which the cephalosporin CA itself is the prototype:
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The new compounds according to the invention can be represented by the following formula
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are illustrated, wherein R is a-thienyl, ss-thienyl, a-furyl or ss-furyl, m and n are O or 1 and Rl, which symbolizes a substituent in the 3- or 4-position of the pyridine ring, a cyano, Carboxyl, carbamyl, N-methylcarbamyl, carbo (C1-C4) -alkoxy, hydroxy or (C1-C4) - alkanoyl radicals mean they also include the salts thereof with pharmaceutically acceptable acids.
When naming the new compounds which are prepared by the process according to the invention, it is customary to use the basic structure of the saturated, ring-condensed β-lactamthiazine as "Cepham"
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and to name the compounds as derivatives thereof, the designation "Cephem" indicating the basic structure with a single olefinic bond. According to this system, cephalosporin CA is itself known as 7- (5'-aminoadipamido) -3-pyridinomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid
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tion 7 located radicals as well as the pyridine compound, which is used to substitute the acetoxy group in position 3, to be emphasized.
7- (α-Thienylacetamido) -3- (4'-carbamylpyridinomethyl) -3-cephem-4-carboxylic acid can be referred to as α-thienylmethylisonicotinamide-cephalosporin CA.
The following compounds illustrate examples of cephalosporin CA compounds which can be prepared according to the invention:
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-Thienylmethyl-3-butyrylpyridine-cephalosporin CAss-Furylisobutylnicotinat-cephalosporin CA and the salts thereof with pharmaceutically acceptable acids, for example hydrochloride, hydro-
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can conveniently be obtained from the analogous cephalosporin C compound, which has the desired acylamido group in position 7 and the characteristic acetoxymethyl group in position 3, by mixing in aqueous solution with an excess of the corresponding substituted pyridine and reacting at elevated temperature.
The reaction is expediently carried out at pH values of about 3 to 8.5, preferably at pH values of 6 to 7, and at temperatures of about 40 to about 1000.degree. C., preferably about 50-75.degree. Under the preferred conditions a reaction time of 4 to 8 hours is generally sufficient. Low temperatures take longer, while higher temperatures can cause the product to degrade. The cephalosporin C compound can be used in the form of the free acid or as a salt. The pyridine compound should be used in at least an equimolar ratio to the cephalosporin C compound and preferably in a substantial excess, e.g.
B. in a molar ratio of 3: 1 to 10: 1 or more, in order to achieve the highest possible degree of conversion of the cephalosporin C compound; the used excess can be conveniently recovered and reused. Under the reaction conditions, the acetoxy group is split off and replaced by the substituted pyridine compound, the latter being linked to the remaining methylene group directly with the ring nitrogen atom and a quaternary ammonium derivative is formed, which again with the carboxyl group
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in position 4 forms an inner salt.
The desired product can be conveniently obtained from the reaction mixture by evaporation to dryness under vacuum, trituration with acetone to remove starting materials, and repeated precipitation from aqueous solution by addition of acetone. In many cases it is advisable to recrystallize the product directly from aqueous solution by dissolving it in water at an elevated temperature and then cooling the solution.
The desired cephalosporin C starting material can be conveniently obtained by acylating 7-aminocephalosporanic acid with an acylating agent of the desired structure under conventional conditions. A suitable acylating agent is the corresponding thienyl or furyl substituted acyl chloride or bromide. The acylation is carried out in water or in an appropriate organic solvent, preferably under essentially neutral conditions and in particular
EMI3.1
i.e. aqueous 50 vol. acetone and sufficient sodium bicarbonate are mixed to promote dissolution, the concentration of 7-aminocephalosporanic acid being about 1 to about
EMI3.2
Warm up to room temperature,
whereupon it is acidified to a pH of about 2 and extracted with ethyl acetate or some other immiscible solvent. The ethyl acetate extract is adjusted to a pH of about 4.5 using potassium hydroxide or another base and extracted with water. The aqueous solution is separated off and concentrated to dryness. The residue is taken up in the smallest possible amount of water and the acylated product is precipitated by adding a large excess of acetone and, if necessary, ether. The crystalline material obtained is filtered off, washed with acetone and dried.
The acylation of the 7-amino group can also be carried out with the corresponding carboxylic acid if this is used together with an equimolar proportion or a larger amount of a carbodiimide, the acylation taking place at temperatures customary in such cases.
Any of the carbodiimides are effective for this purpose in which the effective residue is the -N = C = N- structure. Illustrative examples include N, N'-diethylcarbodiimide, N, N'-di-n-propylcarbodiimide, N, NI -diisopropylcarbodiimide, N, N1-dicyclohexylcarbodiimide, N, N'-diallylcarbodiimide, N, N'-bis.
- (p-Dimethylaminophenyl) carbodiimide, N-ethyl-N'- (4 "-ethylmorpholinyl) -carbodiimide, and the like, and other suitable carbodiimides such as are disclosed in U.S. Patents Nos. 2,938, 892 and No. 3, 065, 224 are described.
The acylation of the 7-amino group can also be carried out with an activated derivative of the corresponding carboxylic acid, expediently the corresponding acid anhydride, or a mixed anhydride, the azide or an activated ester. Other suitable derivatives can easily be determined.
The invention is explained in more detail with reference to the following exemplary embodiments, which are merely illustrative, but in no way restrictive. The antibiotic activities given below were determined against Staphylococcus aureus 209 P using an appropriate modification of the method of Higgens et al., Antibiotics 0; 0 Chemotherapy, 3,50-54 (Jan [1953]) and Loo et al., Journal of Bacteriology, 50,701-709 [1945].
Example 1: (X-Thienylmethylisonicotinamide cephalosporin CA.
A mixture of 101 g of the sodium salt of 7- (a-thienylacetamido) -cephalosporanic acid, 200 g of isonicotinamide and 11% of water is heated to 37.50 ° C. for 40 hours and then brought to dryness under vacuum. The residue is triturated three times with acetone (10 l, 5 l and 5 l). The material, which is insoluble in acetone and weighs 105 g, is mixed with 300 ml of water, warmed slightly, cooled and filtered.
The water-insoluble material is stirred with 700 ml of acetone, then separated off and air-dried. The product obtained, which weighs 32 g, is dissolved in hot water and recrystallized. 18.4 g of 7 - (α-thienylacetamido) -3- (4'-carbamylpyridinomethyl) -3-cephem--4-carboxylic acid with a melting point of 147 to 1500 C (decomp.) With maxima in the UV are obtained. Absorption spectrum at 233 and 262 ma = 16650 and 13550).
A recrystallized sample of the product showed an antibiotic activity of 690 penicillin G units per mg. The product is stable in solution (10 μg / ml) in 1/10 molar phosphate buffer in the pH range from 4.5 to 7.5 at 40 ° C. for one month.
Example 2: α-Thienylmethylnicotinamide-cephalosporin CA.
<Desc / Clms Page number 4>
1.0 g of the sodium salt of 7- (a-thienylacetamido) -cephalosporanic acid and 2.0 g of nicotinamide are dissolved in 50 ml of water. The resulting solution is adjusted to a pH of 2.5 using In hydrochloric acid and the mixture is heated to 400 ° C. for 18 hours. The mixture is then evaporated to dryness in vacuo. The residue is triturated twice with acetone (100 ml and 50 ml). The acetone-insoluble material is dissolved in 3.5 ml of water and reprecipitated by adding 36.5 ml of acetone. The solids are triturated with 40 ml of acetone and dried under reduced pressure.
420 mg of 7- (a-thienylacetamido) -3- (3'-carbamylpyridinomethyl) -3-cephem-4-carboxylic acid are obtained with maxima in the UV absorption spectrum at 232 and 260 mg (e = 10,700 and 7750, respectively). The antibiotic effectiveness is 260 penicillin G units / mg.
Example 3: a-Thienylmethyl-3-hydroxypyridine-cephalosporin CA '
200 mg of 7- (a-thienylacetamido) -3 - (3 l-hydroxypyridinomethyl) -3 -cephem -4- carboxylic acid are obtained according to Example 2 by reacting 1.0 g of the sodium salt of 7- (a-thienylacetamido) -cephalo- sporanic acid prepared with 2.0 g of 3-hydroxypyridine. The reaction product showed maxima in the UV absorption spectrum at 236 and 322 mg! (= 12000 or 2200) and an antibiotic effectiveness of 200 penicillin G units / mg.
Example 4: α-Thienylmethyl-3- (N'-methylcarbamyl) -pyridine-cephalosporin CA.
370 mg of 7- (<x-thienylacetamido) -3- (3'- [N "-methylcarbamyl] pyridinomethyl) -3-cephem-4-carboxylic acid are obtained according to Example 2 by reacting 1.0 g of the sodium salt of 7 - (a-Thienylacet-amido) -cephalosporanic acid with 2.0 g of 3- (N'-methylcarbamyl) -pyridine. The reaction product has maxima in the UV absorption spectrum at 235 and 260 mu (e = 13500 and 8,900) and an antibiotic activity of 260 penicillin G units / mg.
A recrystallized sample of the reaction product showed an antibiotic activity of 570 penicillin G units / mg.
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Boric acid are obtained by reacting 1.0 g of the sodium salt of 7- (a-thienylacetamido) cephalosporanic acid with 2.0 g of 4- (N'-methylcarbamyl) pyridine at pH 2.9, the procedure and reaction conditions as can be used in example 2. A 340 mg portion of the product thus obtained is purified by dissolving in 2 ml of water, precipitating with 40 ml of acetone, filtering off, triturating with 40 ml of acetone and drying under vacuum.
The yield of purified product is 220 mg; the absorption maxima in the UV spectrum are 232 and 264 mu (e = 11600 and 6550, respectively), the antibiotic activity is 490 penicillin G units / mg.
EMI4.2
and the pH is adjusted to 2.8 using In hydrochloric acid. 6 g of 4-cyanopyridine are added to the solution and the mixture is heated to 400 ° C. for 20 hours. The reaction product is evaporated to dryness in vacuo and the residue is triturated with acetone portions of 500, 250 and 250 ml and then dried in vacuo. Yield 2.75g.
The solid obtained in this way is dissolved in 4 ml of water, triturated with 80 ml of acetone and dried under vacuum. Yield 1.75 g. The solid is redissolved in 4 ml of water, precipitated with 100 ml of acetone, separated off by decantation, triturated with 100 ml of acetone and dried in vacuo. Yield 1.16 g. The solid is dissolved in 3 ml of water and cooled for 3 days, during which time a crystalline solid separates out. This material is peeled off and stirred and the mixture is cooled in ice and centrifuged; the liquid phase is decanted. 1 ml of water is added and centrifugation and decanting are repeated. The solid is triturated with 5 ml of acetone and dried in vacuo.
The yield is 70 mg of 7- (a-thienylacetamido) -3- (4'-cyanopyridinomethyl) -3-cephem-4-carboxylic acid; Absorption maxima in the UV spectrum at 2: 32 and 236 mu (e -20600 and 11300, respectively); antibiotic effectiveness equivalent to 500 penicillin G units / mg.
Example 8: α-Thienylmethyl-4-carbomethoxypyridine-cephalosporin CA.
<Desc / Clms Page number 5>
25 g of the sodium salt of 7- (a-thienylacetamido) -cephalosporanic acid are dissolved in 250 ml of water and 50 g of methyl isonicotinate are added to the solution. The mixture is heated to 370 ° C. for 41 h and then brought to dryness in vacuo. The residue is triturated four times with 1250 ml portions of acetone and then dried in vacuo. Yield = 18.13g.
The impure product is dissolved in 40 ml of water and the solution is cooled. The solids obtained are filtered off (about 4 g), recrystallized from 40 ml of water, triturated with 40 ml of acetone and dried in vacuo. Yield = 1.6 g of 7- (a-thienylacetamido) -3- (4'-carbomethoxypyridino) - - 3-cephem-4-carboxylic acid with maxima in the UV absorption spectrum at 226 and 263 mil (C = 18600 and
12030) and an antibiotic activity of 430 penicillin G units / mg.
Example 9: α-Thienylmethyl-3-cyanopyridine-cephalosporin CA.
3 g of the sodium salt of 7- (a-thienylacetamido) -cephalosporanic acid are reacted with 6 g of 3-cyanopyridine for 17.5 hours in the manner indicated in Example 7.
The residue from the reaction mixture weighs 2.69 g and is dissolved in 5.3 ml of water, cooled to separate solids, decanted, triturated with 2 ml of water, centrifuged, decanted and triturated again with 10 ml of acetone, decanted, and under vacuum dried. The yield is 0.47 g of 7 - (α-thienylacetamido) -3- (3'-cyanopyridino) -3-cephem-4-carboxylic acid with a melting point of 127-1280 ° C.
The UV absorption maxima are 235 and 264 my (E = 14700 and 10750, respectively) and the antibiotic activity is 407 penicillin G units / mg.
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10: 7- (<x -thienylacetamido) -3-pyridinomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid. Potassium thiocyanate and 100 g of pyridine in 500 ml of water are adjusted to a pH of 6.5 using 10 ml of syrupy phosphoric acid and then heated to 600 ° C. for 6 h with stirring.
The reaction mixture is cooled and washed with 25% Amberlite LA-1 above (a liquid organic amine-based anion exchanger used in the acetate form) in methyl isobutyl ketone, once at 1.01 and once at 0.75 I, the contact time in each Trap is about 20 min. Finally, it is washed with 500 ml of methyl isobutyl ketone.
The washed aqueous layer is inoculated with crystals of 7- (a-thienylacetamido) -3-pyridino-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid and left to stand overnight in the refrigerator. The resulting crystalline solid is filtered off, washed twice with small volumes of cold water and then with an excess of ethyl ether and dried under vacuum. 41 g of 7 - (α-thienylacetamido) -3-pyridinomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid are obtained in the form of the inner salt.
Analysis:
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<tb>
<tb> calculates <SEP>: <SEP> C <SEP> = <SEP> 54, <SEP> 92% <SEP> H <SEP> = <SEP> 4, <SEP> 12% <SEP> N <SEP > = <SEP> 10, <SEP> 11% <SEP> S <SEP> = <SEP> 15, <SEP> 43% <SEP>
<tb> found <SEP>: <SEP> C <SEP> = <SEP> 54, <SEP> 65% <SEP> H <SEP> = <SEP> 4, <SEP> 36% <SEP> N <SEP > = <SEP> zes <SEP> = <SEP> 14, <SEP> 31% <SEP>
<tb> 14, <SEP> 700 <SEP>; <SEP> 0. <SEP>
<tb>
The reaction product shows infrared absorption and nuclear magnetic resonance spectra which are consistent with the expected structure. It has an apparent molecular weight, determined by titration, of 425 and a pKa value of 3.2. In the UV absorption spectrum it shows maxima at 239 and 252, with molar extinction coefficients of 15160 and 13950, respectively. In the biological test it shows an activity against penicillin-sensitive staphylococci corresponding to 1590 penicillin G units / mg.
The compounds as obtained according to the invention are characterized by resistance to the destructive action of penicillinase, minimal toxicity, high activity against a broad spectrum of gram-positive pathogens, low but effective activity against numerous gram-negative pathogens and persistent ( prolonged) effectiveness after intramuscular injection, this effectiveness lasting 7-14 days or longer.
The compounds are highly active against penicillin-resistant Staphylococcus aureus, even in the presence of serum. In the table below, the ranges of the minimum inhibitory concentration (MIC) of the compounds according to the working examples are given, the determinations in both cases being carried out in the presence and in the absence of human blood serum and against four clinically isolated penicillin-resistant Staphylococcus aureus strains using the gradient plate method.
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb>
MIC <SEP> in <SEP> ml <SEP>: <SEP>
<tb> example
<tb> No. <SEP>: <SEP> without <SEP> serum <SEP>: <SEP> with <SEP> serum <SEP>: <SEP>
<tb> 1 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP >
<tb> 2 <SEP> 0, <SEP> 4-0. <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 5-2, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0-2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP >
<tb> 5 <SEP> 1, <SEP> 0-3, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 0-2, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 0, <SEP> 9-4, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 8-1, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 0, <SEP> 8-1, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 0, <SEP> 3-0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 7-1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0,
<SEP> 3 <SEP>
<tb>
The compounds are also highly effective against hemolytic streptococci, as illustrated by the following data, which indicate a mean effective dose (ED 50) against ss-hemolytic Streptococcus strain C203 in mice, with administration orally 1 hour after infection and was carried out again 4 hours later:
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<tb>
<tb> Example <SEP> ED, <SEP> mg / kg, <SEP> x2
<tb> No. <SEP>:
<SEP>
<tb> 1 <SEP> 1, <SEP> 05 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 12, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 8 <SEP> <<SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 1, <SEP> 1
<tb>
EMI6.3
Inhibitory concentrations of compounds according to Examples 1 - 9 against a number of gram-negative organisms, determined by the gradient plate method, on:
EMI6.4
<tb>
<tb> MIC <SEP> in <SEP> γ / ml:
<tb> Organism <SEP>: <SEP> Example <SEP>:
<SEP>
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP>
<tb> Shigella
<tb> sonnei <SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> 23 <SEP> 18 <SEP> 14 <SEP> 22 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 15
<tb> Shigella <SEP> N-9x <SEP> 3,6 <SEP> 19 <SEP> 23 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> 13 <SEP> 43 <SEP> 44
<tb> E. <SEP> coli <SEP> N-10x <SEP> 5 <SEP> 25 <SEP> 49 <SEP> 23 <SEP> 16 <SEP> 21 <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 15th
<tb> E. <SEP> coli <SEP> N-26x <SEP> 4 <SEP> 19 <SEP> 25 <SEP> 19 <SEP> 15 <SEP> 18 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 15th
<tb> Klebsiella
<tb> pneumoniae <SEP> 4 <SEP> 16 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 11
<tb> K.
<SEP> pneumoniae
<tb> K-1x <SEP> 3 <SEP> 19 <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 15 <SEP> 7 <SEP> 2 <SEP> 29
<tb> Aerobacter
<tb> aerogenic <SEP> 4 <SEP> 21 <SEP> 8 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 17 <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 13
<tb> x <SEP> = <SEP> clinically <SEP> isolated.
<tb>
<Desc / Clms Page number 7>
The compound of Example 10 shows minimal inhibitory concentrations against a variety of microorganisms such as the following:
EMI7.1
<tb>
<tb> Organism <SEP>: <SEP> MIC, <SEP> y / ml <SEP>: <SEP>
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Shigella <SEP> sp. <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0.1 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0, <SEP> 0078 <SEP>
<tb>