AT332551B - Verfahren zur herstellung eines antilipoid-a-serums - Google Patents

Description

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   R-Mutantenstämme enthalten defekte Lipopolysaccharide. Die 0-spezifischen Ketten sind nicht vorhanden und das Kernpolysaccharid ist, abhängig von den Stellen der Mutation, in mehr oder weniger vollständiger Form vorhanden. 



   Die Immunisierung von Tieren mit Bakterien oder isolierten Lipopolysacchariden führt zur Bildung spezifischer Antilipopolysaccharidantikörper. Sie betreffen hauptsächlich Determinanten im Zuckerteil des Moleküls. Zirkulierende Antikörper mit Antilipoid A-Spezifität wurden noch nicht festgestellt. 



   Wie bereits erwähnt, ist das Lipoid A Hauptbaustein aller Lipopolysaccharide und strukturell identisch oder ähnlich bei allen Enterobacteriaceae. Die Bildung von Antikörpern gegen die allgemeine Lipoid A-Struktur der Lipopolysaccharide wurde bisher nicht beschrieben und es wurde auch bislang kein Versuch unternommen, durch Immunisierung mit Lipoid A zirkulierende Antikörper mit Lipoid A-Spezifität zu erzeugen. 



   Überraschenderweise wurde gefunden, dass Lipoid A in Säugetieren als Immunogen wirkt und dass dadurch Antikörper gebildet werden, die spezifisch mit Lipoid A reagieren. Diese Tatsache kann man sich zunutze machen, um erfindungsgemäss Sera, die Antilipoid A-Antikörper enthalten, herzustellen. Dadurch wird es ermöglicht, eine grosse Reihe von Infektionskrankheiten wirksam zu bekämpfen. 



   Zur Gewinnung von Lipoid A für die erfindungsgemässe Infektionsbehandlung von Säugetieren werden Bakterien auf an sich bekannte Weise gezüchtet und dann die Kulturen abgetötet. Die Bakterien können auf bekannte Weise isoliert werden. Aus diesen Bakterien gewinnt man die Lipopolysaccharide, die man dann hydrolysiert, wobei man Lipoid A erhält. 



   Für die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens vorgesehene Injektionsbehandlung von Säugetieren kann man Zusammensetzungen verwenden, die das Lipoid A und an sich bekannte Trägerstoffe enthalten. Man kann weiterhin hydrolysierte und nicht-hydrolysierte Bakterien mit Lipoid A oder alkalibehandeltem Lipoid A überziehen und alle diese Präparationen Säugetieren injizieren, um erfindungsgemäss antikörperhältige Sera herzustellen. Die von den Serumspendern gewonnenen Rohsera können zur Prophylaxe und Therapie für Infektionskrankheiten verwendet werden. 



   Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Lipoid A enthaltenden Injektionspräparate können wie folgt erhalten werden :
1. Bakterien :
Die für die Gewinnung von Lipoid A benötigten Bakterien können in üblicher Weise gezüchtet werden. 



   2. Lipopolysaccharide :
Lipopolysaccharide können aus Glattformbakterien nach dem Phenol/Wasser-Verfahren oder aus
Rauhformbakterien nach dem   Phenol/Chloroform/Petroläther-Verfahren   extrahiert werden. 



   3. Lipoid   A :  
Freies Lipoid A wird durch Hydrolyse des entsprechenden Lipopolysaccharids in verdünnter Säure,   z. B.   in   l% iger-Essigsäure   bei 1000C während 2 h hergestellt. Das wasserunlösliche freie Lipoid A wird mehrere Male mit destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. In solchen
Präparationen kann kein 2-Keto-3-desoxycotonat (KDO) festgestellt werden. Lipoid A kann durch
Zugabe von Triäthylamin   (l jul)   zu einer Suspension von Lipoid A in Wasser (2 mg/2 ml) solubilisiert werden. Zur Solubilisierung von Lipoid A kann man auch andere Amine und andere basisch reagierende Stoffe verwenden. 



   4. Alkalibehandeltes Lipoid At
Modifizierte Lipoid A-Präparate werden durch Behandlung von Lipoid A mit alkalischen Mitteln erhalten. So wird   z. B.   freies Lipoid A in   0, 25 n-Natriumhydroxyd 1 h   bei   560C   erwärmt. Das unlösliche Material wird entfernt und die überstehende Flüssigkeit wird mit Essigsäure neutralisiert, wobei sich ein Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird entfernt und die überstehende Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert. Ausgefallenes Material wird erneut durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit, die lösliches, alkalibehandeltes Lipoid A enthält, gefriergetrocknet. 



   5. Mit Lipoid A überzogene Bakterien :
Zur Herstellung von mit Lipoid A überzogenen Bakterien wird Lipoid A in destilliertem Wasser   (1     mg/ml)   suspendiert und durch Zugabe von Triäthylamin   (1jul/2 ml) solubilisiert.   Aliquote Teile dieser Lösungen werden mit 2 ml einer Suspension der Bakterien in destilliertem Wasser   (1   mg/2 ml) vermischt, und dann wurde die Mischung getrocknet. Auf diese Weise erhält man Bakterien, die mit
10,100 oder   500 jug   Lipoid A pro 1 mg Trockengewicht überzogen sind. 



   Auf ähnliche Weise werden hydrolysierte Bakterien mit Lipoid A überzogen. Zur Hydrolyse werden die 
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 Vakuum getrocknet und wie oben beschrieben mit Lipoid A überzogen. 



   Das so erhaltene Lipoid A und die Lipoid A-Präparationen wurden beim folgenden Beispiel verwendet. 



  Selbstverständlich ist es möglich, Lipoid A auch noch auf andere Weise zu modifizieren. 



   Bei den vorliegenden Versuchen wurden unbehandelte, wie auch mit Lipoid A überzogene Bakterien als Antigene verwendet. 

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   Weiterhin setzte man in Kontrollversuchen als Antigene frische, in der Wärme abgetötete Bakterien ein und verwendete ausserdem noch unvollständiges Freund's Adjuvans allein. Es wurden antibakterielle Sera gegen Sund   R-Formbakterien   hergestellt. 



   Beispiel : Herstellung von Antilipoid A-Antikörper. 



   Weissen Kaninchen aus Neuseeland mit einem Körpergewicht von 2 bis 2, 5 kg wurden 4 intravenöse Injektionen des Antigens mit unterschiedlichen Mengen verabreicht : 
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<tb> 1. <SEP> Tag <SEP> 100 <SEP> jug <SEP> 
<tb> 3. <SEP> Tag <SEP> 200 <SEP> 
<tb> 7. <SEP> Tag <SEP> 300 <SEP> jug <SEP> 
<tb> 1l. <SEP> Tag <SEP> 500 <SEP> jug. <SEP> 
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 Am 16. Tag wurde den Tieren durch Herzpunktur Blut entnommen, das dann näher untersucht wurde. Das 
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 von 7 Wochen durchgeführt. 10 Tage danach wurde aus der Ohrvene Blut entnommen. Das Verhältnis von Bakterien zu Lipoid A betrug   2 : 1   (Gew. /Gew.). 



   Zum Nachweis der Wirksamkeit wurden weisse Mäuse mit 0, 2 ml Serum (Titer 1 : 30. 000) intravenös behandelt. 



   Absorption und Desorption von Antilipoid A-Antikörper. 



   Erythrozyten, die entweder mit Lipoid A oder mit alkalibehandeltem Lipoid A sensibilisiert sind, ergeben im wesentlichen die gleichen Ergebnisse. Der Einfachheit halber wird im allgemeinen alkalibehandeltes Lipoid A verwendet, um die Erythrozyten zu überziehen. 



   Antilipoid A-Serum   (1   ml) wird mit gepackten, mit Formalin behandelten roten Zellen (0, 1 ml), die mit alkalibehandeltem   Lipoid A (100 f. lg)   sensibilisiert sind, vermischt. Die Mischung wird bei Zimmertemperatur 15 min gerührt und dann werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt. 



   Zur Desorption der Antilipoid A-Antikörper werden die Zellen nach der Absorption in einen   0, 1 m-Glycin-HCI-puffer (pffWert : 2, 2 ;   2 ml) bei Zimmertemperatur 1 h gerührt. Nach dem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit mit Natriumhydroxyd neutralisiert und durch Ultrafiltration auf das ursprüngliche Volumen   (1   ml) eingeengt. 



   Antilipoid A-Aktivität verschiedener Immunsera. 



   Um die Antilipoid A-Aktivität in dem entsprechenden Serum zu bestimmen, wird der passive Hämolyseversuch durchgeführt, wobei man rote Blutzellen verwendet, die mit alkalibehandeltem Lipoid A aus S. minnesota R345 überzogen sind. Im allgemeinen führt die subkutane Immunisierung in unvollständigem Freund's Adjuvans zu einem   geringfügig   höheren Antilipoid A-Titer, verglichen mit dem intravenösen Immunisierungsschema. Mit beiden Methoden erhält man die besten Ergebnisse, wenn man hydrolysierte Aalmonella minnesotaR595-Bakterien, die mit Lipoid A überzogen sind, als Antigen verwendet. Man erhält ebenfalls gute Ergebnisse, wenn man mit hydrolysierten Bakterien oder mit nicht-hydrolisierten Bakterien, die mit Lipoid A überzogen sind, immunisiert.

   Immunisierung mit entweder mit Phenol getöteten oder mit wärmegetöteten Bakterien führt zu niedrigen Werten der Antilipoid A-Aktivität. Im Präblutserum oder nach der Injektion mit unvollständigem Feund's Adjuvans kann man keine Antikörper feststellen. 



   Spezifische Absorption und Desorption von Lipoid A-Antikörper. 



   Die Spezifität eines Antilipoid A-Serums wird durch Absorption mit formalinbehandelten Erythrozyten, die mit Lipoid A sensibilisiert sind (aus S. minnesota R345) untersucht. 



   Das absorbierte Serum enthält keine Antilipoid A-Aktivität, während man bei Vergleichsprobe (Behandlung mit nicht-sensibilisierten Erythrozyten) keinen Titerabfall beobachtet. 



   Die absorbierten Antilipoid A-Antikörper können dissoziiert werden, indem man die mit Lipoid A überzogenen Zellen mit Glycin-HCl-Puffer mit PH 2, 2 inkubiert. Es wird eine beträchtliche Menge der Antilipoid A-Aktivität wiedergewonnen. 



   Serologische Kreuzreaktionen zwischen Lipoid A und verschiedenen Lipopolysacchariden der S- und R-Formen. 



   Die Fähigkeit von Antilipoid A-Serum, mit S- und R-Lipopolysacchariden von Salmonella- und E. coli-Stämmen zu reagieren, wird im passiven Hämolysetest mit rosten Zellen, die mit diesen Präparationen sensibilisiert sind, untersucht. Alle S- und R-Formen der Lipopolysaccharide reagieren mit dem Antilipoid A-Serum. Um die Spezifität dieser Kreuzreaktionen zu beweisen, werden die Lipopolysaccharide verschiedener Bakterien mit dem gleichen Serum nach Absorption mit Lipoid A geprüft. Dabei tritt in keinem Fall eine Kreuzreaktion auf.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : EMI4.1 gegebenfalls mit Alkali vorbehandeltes, an einen Träger gebundenes Lipoid A Säugetieren injiziert und aus diesen durch Blutentnahme das Antilipoid A-Serum gewinnt.