DD140701A5 - Verfahren zur isolierung und reinigung von immunologisch wirksamen polyribosylribitolphosphat - Google Patents
Verfahren zur isolierung und reinigung von immunologisch wirksamen polyribosylribitolphosphat Download PDFInfo
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Description
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Vaccinen zur Immunisierung gegen Infektionen durch Haemophilus influenzae Typ b, wie Meningitis. Im einzelnen bezieht sie sich auf (1) ein Verfahren zur Isolierung des antigehen Polysaccharids PoIyribosyl-ribitol-phosphat (PRP) aus Haemophilus influenzae Typ b-Kultüren und (2) ein Verfahren zur Herstellung einer · Kombinationsvaccine, die PRP- und B. pertussis-Antigene enthält. Das PRP gemäß der Erfindung ist auch in Verbindung mit anderen nichtphatog.enen Stämmen von Bakterien wie E. coli, B. subtilis, S. aureus, B. punilus und L· plantarum zur Auslösung einer tAntikörperreaktion bei Warmblütern wirksam.
Ch^akteristilc den bekannten technischen Lösungen
Das gereinigte Polyribitol-phosphat (PRP) aus Haemophilus influenzae Typ b wird als Schutzimmunogen untersucht. Eine wirksame Antigenreaktion ist jedoch bei jungen Tieren und Kindern noch nicht erreicht worden. Bei dem bekannten Verfahren zur Reinigung v/erden Ethanol und Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon) verwendet. Die Verunreinigungen, . Endotoxine und pyrogenen Substanzen v/erden durch Verwendung von kaltem Phenol oder Chloroform und t-Butanol entfernt, die zum Verlust der Antigennatur dieses Polysaccharids führen können.
Ziel der Erfindung ' ' ' ·
Es wurde nun ein neues Verfahren für die Isolierung und Reinigung von immunologisch aktivem PRP aus Haemophilus · influenzae Typ b gefunden.
Das noch zu beschreibende Verfahren hat gegenüber den bekannten Arbeitsweisen eindeutige Vorteile, da alle Verunreinigungen (Nucleinsäuren, Proteine und Endotoxine) durch eine Behandlung mit Hydroxylapatit entfernt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von PRP führt zu einem Polysaccharid mit höherem Molekulargewicht als die bisher bekannten Verfahren.
Das nach dem neuen Verfahren hergestellte PRP ist außerdem, was noch wichtiger ist, im Gegensatz zu dem nach bekannten -Arbeitsweisen hergestellten PRP für Warmblüter in hohem Maße immunogen.
Darlegung des Wesens der Erfindung Die Entfernung von Verunreinigungen (Proteinen, Nucleinsäuren und Endotoxinen) des Polysaccharids PRP wird durch Behandlung des teilweise gereinigten Polysacchärids mit einem phosphathaltigen Adsorbens erreicht, das unter den angegebenen Bedingungen das Polysaccharid nicht adsorbiert.
Die weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer kombinierten PRP- und Pertussis-Vaccine, die bei jungen Tieren in·hohem Maße immunogen wirkt.
.(X) Isolierung und Reinigung von Polyribosylribitolphoshat, dem Hüllenpolys.accharid von Haemophilus influenzae Typ b
Es werden zwei Stämme von Haemophilus influenzae Typ b verwendet. Der Rab-Stamm ist von Grace Leidy, Babies Hospital, 'Columbia University, New York City, New York, erhalten worden.
Der CK-Stamm ist von einem Patienten im Waterbury Hospital, Waterbury, Conn, isoliert worden.· Die Organismen werden mehreren Passagen durch Mäuse unterworfen, um ihre Virulenz zu gewährleisten. Sie werden bei der Autopsie aus dem Gehirngewebe von Mäusen isoliert, und zu ihrer Weiterzüchtung wird eines der folgenden Medien verwendet: 3,7-prozentiges Gehirnherzinfusions-(BHI) (Difco Lab., Detroit, Mich.)-Medium oder 5-prozentiger BHI-Agar, ergänzt durch 0,01 % Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) (P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis.) und 1 % (Volumen/Volumen) defibriniertes Pferdeblut (Animal Blood Center, Syracuse, N. Y.). Zur WeiterZüchtung werden Anteile von 1 ml auf Ampullen verteilt, lyophil.i- ' siert und bei -70 0C gelagert.
Für die Züchtung· der Organismen verwendetes Grundmedium ist 3,7-prozentiges BHI. Das Grundmedium wird mit TO mg NAD und 20 mg Hemin (Eastman Kodak, Rochester, N. Y.) je Liter ergänzt. Je 50 ml Impfkultur v/ird 1 % (Volumen/Volumen) def ibriniertes Pferdeblut zugesetzt. Die Ergänzungsstoffe werden frisch zubereitet und durch eine Ο,45μ Nalgene-Filter-Einheit (Nalge Sybron Corp., Rochester, N. Y.) vor Verwendung filtriert. Für die Züchtung des Organismus in einem 14 1-Fermentationsgefäß wird das Medium außerdem noch mit 0,5 % ' Glucose ergänzt.
Zur Herstellung von Organismen zum Besamen wird 1 ml gefrorene Stammkultur aufgetaut und zu 50 ml des angereicherten BHI-Mediums, das mit defibriniertem Pferdeblut und NAD ergänzt ist, gegeben. Die Kultur wird 8 Stunden bei 37 0C auf einer Rundschüttelvorrichtung mit 150 Umdrehungen/Mxnute gezüchtet. Die Organismen werden als 1-prozentiges Inokulum zu Anteilen von je 500 ml des angereicherten BHI-Mediums in 2 1-Kolben gegeben, die dann bei 37 0C unter mäßigem Schütteln auf einer Rundschüttelvorrichtung 8 Stunden (zur Isolierung von PRP) oder 14 Stunden (als Saatkulturen) inkubiert werden.
Die Fermentation eines jeden Anteils in einem 14 1-Fermentationsgefäß wird durch aseptische überführung von 700 ml der Saatkultur zu 7 1 des angereicherten BHI-Mediums, das mit Hemin anstelle von defibriniertem Pferdeblut ergänzt ist, eingeleitet. Die Kultur wird ständig bei 37 + 1 0C gehalten. Unter Rühren mit 150- Umdrehungen/Minute wird ein Luftstrom von 0,25 1 Luft je Liter Medium und Minute aufrechterhalten. Während der Züchtung werden 0,001 % eines Siliconentschäumers (FD-82, Hodag Chemical Corp.) je nach Bedarf zugegeben. Die Züchtung der Kulturen wird fortgeetzt, bis nur noch exponentielles Wachstum (8 bis 10 χ 10 lebende Zellen/ml) erfolgt, gewöhnlich etwa 8 Stunden, und dann wird die Züchtung 'durch Zugabe von 0,4 % Formaldehyd und Stehenlassen über Nacht bei 4'0C beendet.
Die wie oben beschrieben erhaltene Maische wird bei 4 0C 30 Minuten bei 27 000 . g zentrifugiert. Die zellfreie überstehende - Flüssigkeit wird abgetrennt und folgendermaßen behandelt:
Stufe 1, Ethanolfällung ' · ' .
Die überstehende Flüssigkeit der Kultur wird bis zu einer Endkonzentration von 4 % mit Natriumacetat versetzt. Nach Einstellen des pH-Werts der Lösung auf 6,0 bis 6,2 werden 44 1 3A-Ethanol unter kräftigem Rühren bei 4 0C langsam zugegeben. Die Mischung wird mit Eisessig auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und dann 12 Stunden bei 3 0C stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird durch Dekantieren -und Zentrifugieren gewonnen, wodurch rohes PRP erhalten, v/ird.
Stufe 2, Behandlung mit Hexadecyltrimethylarnmoniumbromid (Cetavlo
Der nach Stufe 1 erhaltene Niederschlag wird in pyrogenfreiem destilliertem Wasser gelöst und zur Entfernung des Rückstands zentrifugiert. Die klare braune Lösung wird dann langsam zu .100 ml einer 10-prozentigen wäßrigen Lösung von Hexadecyltrimethylammoniumbromid bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % unter Vermischen gegeben. Die' Mischung wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Niederschlag aus Nucleinsäuren und PRP-Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Komplex wird mit 2 1 0,3m Natriumchlorid vermischt. Die trübe Lösung wird zur Entfernung unlöslicher Stoffe, wie der Nuclein-Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Salze zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt, wodurch das PRP-Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Salz ausfällt. Die Mischung wird 1 Stunde gerührt, und der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen und dann in 2 1 0,3m Natriumchloridlösung gelöst.
Stufe 3, Ethanolfällung
Hexadecy 1 tr ime thy la mi or.iumbromid und die verunreinigenden Nucleinsäuren und Proteine werden durch wenigstens zweimalige Ethanolfällung weiter entfernt. Das PRP wird, wie in Stufe 1 beschrieben, gefällt, während Hexadecyltrimethylammoniumbromid in der alkoholischen Lösung gelöst wird. Das PRP wird abzentrifugiert, in 2 1 pyrogenfreiem destillierten Wasser gelöst und dann wie oben beschrieben wieder gefällt. Der schließlich erhaltene PRP-Niederschlag wird in 20 millimolarem Natriumphosphat, pH 6,8, gelöst.
Die Verunreinigungen (zum· Beispiel Nucleinsäuren, Proteine und Endotoxine) in den teilweise gereinigten PRP-Präparaten werden selektiv durch Adsorption an einem Calciumphosphat enthaltenden Adsorbens, wie Hydroxylapatit /3Ca3(PO.)„.Ca(OH)2_/ entfernt. .
Die Erfindung beruht auf der Wahrnehmung, daß das Polysaccharid PRP durch das Calciumphosphatadsorbens, das Phosphatpuffer (20 mM) mit einem pH-Wert von 6,7 bis 6,9 oder einen Phosphatpuffer (50 mM) mit einem pH-Wert von 5,8 enthält, im Gegensatz zu den Verunreinigungen, wie Nucleinsäuren, Proteinen und Endotoxinen, unter diesen Bedingungen nicht adsorbiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann absatzweise oder im Säulenbetrieb durchgeführt werden. Beim absatzweisen Arbeiten wird der Hydroxylapatit zu dem teilweise gereinigten PRP-Präparat (in 20 mM Phosphat, pH 6,9) gegeben. Nach gründlichem Vermischen wird zur Entfernung nicht erwünschter Feststoffe (Adsorbens und die daran adsorbierten Verunreinigungen) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise wenigstens zwei weitere Male unterworfen. Die erhaltene Lösung wird durch Milliporfilter filtriert, gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. . .
Beim Säulenbetrieb wird das teilweise gereinigte PRP in 20 mM Phosphatpuffer (pH wenigstens 5,8) auf eine Säule.aufgegeben, die das Adsorbens Hydroxylapatit enthält, das mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 5,8, equilibriert v/orden ist, und mit einem stufenweise abgeänderten Natriumphosphatpuffer (pH 5,8) von 20 mM bis 100 mM eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen werden auf Pentose (Polyribosylribitolphosphat) geprüft. "... Diejenigen Fraktionen, die bezüglich Pentose positiv sind, 'werden gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. .
(II) Verfahren zur Herstellung einer Kombinationsvaccine aus PRP aus H. influenzae Typ b und B. pertussis-Antigenen
Zur Herstellung einer PRP-Vaccine wird wie oben beschrieben hergestelltes lyophilisiertes PRP in einer Konzentration von 20 μ9/πι1 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaiiumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01 % Thimerosal) gelöst. Die Vaccine wird durch 0,45 μ-Milliporfiltereinheiten steril filtriert, in Glasphiolen eingebracht und bei 4 0C gelagert. . :
Eine konzentrierte Lösung des PRP wird durch Lösen abgewogener vorbestimmter Mengen des Polysaccharids in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaiiumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01 % Thimerosal) hergestellt. Diese konzentrierte Lösung von PRP wird dann mit frischen B. pertussis-Zellsuspensionen.vermischt, wodurch die Stammlösung erhalten wird. Die Kennzeichen von B. pertussis Stamm 138 sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, VIII, Herausgeber Buchanan and Gibbons, WMS and Wilkins Co., Maryland, USA/ .1974, auf Seite 283 angegeben. Dieser Stamm ist bei der American Type Culture Collection, Maryland, V.St.A. unter der Hinterlegungsnummer 10380 erhältlich. Die Kombinationsvaccine in dieser Stammlösung enthält 200 \xq PRP und etwa 70 Opacitätseinheiten (op) Zellen/ml. Die Stammlösung wird zur Enttoxifizierung von Pertussis-Antigenen 90 Tage bei 4 0C stehengelassen, ehe das fertige Produkt. (Vaccine) hergestellt wird, das 10 μ9 PRP und 3,5 op-Einheiten Pertussis-Zellen/0,5 ml Dosis enthält.
Ausführungsbeispiele
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.
.Beispiel.1
2,5 g Hydroxylapatit (z.B. Bio. Gel HTP, Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.) werden zu 250 ml teilweise gereinigten PRP-Präparaten (nach Hexadecyltrimethylammoniumbromid- und Ethanolbehandlungen), die etwa 1,0 mg PRP/ml enthalten, in'20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,9, gegeben und 1 Stunde
in einem eiskalten Wasserbad (1 bis 4 0C) vermischt. Die Mischung wird im Sorvall. RC2-B 30 Minuten bei 1600 . g zentri- fugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dann durch ein 0,65 μ-Milliporfilter geleitet und zwei weitere Male der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise unterworfen, wobei jedes Mal mit 2,5 g Hydroxylapatit behandelt wird. Die erhaltene Lösung wird durch 0,65 μ und 0,45 μ Milliporfilter filtriert, gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt zeigt eine starke immunogene Wirksamkeit (vgl. weiter unten, Kombinationsvaccine und Tierversuch) und enthält nur äußerst wenig Verunreinigungen, v/ie Nucleinsäuren, Proteine und Endotoxine (vgl. Tabelle I) Es werden etwa 170 mg lyophilisiertes PRP erhalten, was etwa 70 .% des eingesetzten Polysaccharids entspricht. Das PRP muß unter geeigneten ..Bedingungen, zum Beispiel bei 4 0C, in einem Exsikkator über Phosphorpentoxid und Kieselgel gelagert werden.
Ein teilweise gereinigtes PRP mit einem PRP-Gehalt von 300 mg wird in 100 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8 (d. h. 3 mg PRP/ml) gelöst. Diese Lösung wird bei Zimmertemperatur auf eine Säule (5,0 χ 45 cm) Hydroxylapatit (Bettvolumen etwa 250 ml, mit 20 mM .Natriumphosphatpuffer; pH 5,8, equilibriert) aufgegeben und mit 20 mM, 50 mM und 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8, eluiert. Die mit 20 mM und 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 5,8) eluierten Fraktionen (200 ml), die pentosepositiv sind (Pentosebestimmung nach der Orcin-Methode) erhaltenen Fraktionen werden gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Es werden etwa 206 mg lyophilisiertes Produkt, PRP, erhalten.
Die Reinheit des Polysaccharids PRP wird durch Bestimmung des Maßes der Verunreinigung mit Nucleinsäuren, Proteinen und Endotoxinen geprüft. Die Proteinkonzentration wird nach der Methode von Lowry, et al. in J. Biol. Chem. 193:265
(1951) mit Rinderserumalbumin als Standard ermittelt. Nucleinsäure wird durch die Absorption der PRP-Lösung bei 260 nm bestimmt. Die Absorption von 50 μg Nucleinsäure in 1 ml Wasser in einer Zelle mit einem Lichtweg von 1 cm wird 1,0 gleichgesetzt. Das Molekulargewicht wird mittels Sepharose 4B- oder 2B-GeIfiltration an Säulen von 1,5 χ 90 cm (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) ermittelt. Die Werte des Verteilungskoeffizienten (Kd) werden aus dem durch die Orcinreaktion (Herbert, et al., Methods in Microbiology, Bd. 5B, 285-291) entwickelten Elutionsbild berechnet.
T a-b e lie- I
Prüfung
Endotoxin
Mol. GröjSe Pentose Arbeitsweise (Kd) (%)
Nucleinsäure Protein Kaninchen-Pyrogen-
test°'
Limulus-Lysat-Testd
Beispiel 2 0,44
36,0
33,8
0,7
0,7
10,0 10,0
1/400 1/1000
a) Unter Verwendung von Sepharose 2B und 4B, Molekulargewicht 2 x'10
b) Unter Verwendung von Sepharose 4B
c) μg PRP/kg Körpergewicht (Kaninchen), die kein Fieber verursachen
d) Reziproke Verdünnung von PRP (lOO μg. PRP/ml) verglichen mit Bureau of Biologies El (Endotoxin-Standard)'
Beispiel 1 bezieht sich.auf die Merkmale von Haemophilus influenzae Typ b CK-Stamm, ATCC 31551
Beispiel 2 bezieht sich auf die Merkmale von Haemophilus influenzae Typ b Rab-Stamm, erhältlich von Babies Hosp. Columbia Univ. New York, N.Y., USA
Eine Kombinationsvaccine, die PRP aus H. influenzae Typ b und B. pertussis-Antigenen enthält, wird.folgendermaßen hergestellt: 140 mg PRP (wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt) werden in 350 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaliumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01 % Thimerosal) gelöst und durch 0,4 5 μ-Milliporfilter filtriert. Diese konzentrierte PRP-Lösung (400 μg/ml) wird zur Herstellung einer Kombinationsvaccine verwendet, die aus PRP- und B. pertussis-Antigenen besteht.
150 ml der konzentrierten PRP-Lösung (400 μg/ml) werden mit 150 ml einer frischen Zellsuspension von B, pertussis (Stamm 138) in PBS, pH 7,0 (enthaltend 149 Opacitäts(op)-Einheitszellen/ml) versetzt, wodurch die Stammlösung der Kombinationsvaccine erhalten wird. Diese Stammlösung, 300 ml, wird bei 4 0C gehalten, bis der Endotoxingrad von Pertussis vermindert ist (wenigstens 90 Tage). Die Sterilität·der Stammlösung wird mit Thioglycollatmedien bei 32 bis 33 0C geprüft. Der pH-Wert der Stammlösung nach einer Inkubation von 90 Tagen wird geprüft und auf 7,0 +_ 1 eingestellt. Das für Tierversuche verwendete Fertigprodukt (Vaccine) wird durch Verdünnen der vereinigten Stammlösung mit PBS hergestellt und enthält 10 μ9 PRP und 3,5 op-Einheiten Pertussiszellen/O,5 ml (Dosis).
Die Ergebnisse der Antikörperreaktion auf diese Kombinationsvaccine bei jungen Ratten sind in den Figuren 1 und 2 wiedergegeben. ' .
Die Stammlösung von PRP (400 μg/ml) wird durch Auflösen von 30 mg des wie in Beispiel. 1 beschrieben hergestellten PRP in
20871
75 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Filtrieren durch 0,45 μ-Milliporfilter hergestellt. Zu 25 ml die ser konzentrierten PRP-Lösung wird ein gleiches Volumen, d. h 25 ml Frischzellensuspension von B. pertussis (Stamm 138) in PBS, pH 7,0 (enthaltend 149 op-Einheiten Zellen/ml) gegeben, wodurch die Stammlösung der Kombinationsvaccine erhalten wird Diese Stammlösung (5O ml) wird wenigstens 90 Tage bei 4 0C stehengelassen. Die Sterilität der Stammlösung wird wie oben erwähnt, mit Thioglykollatmedien geprüft. Der pH-Wert der Stammlösung beträgt 7,0 +_ 1. Das für Tierversuche verwendete Fertigprodukt (Vaccine) wird durch Verdünnen der Kombinations stammlösung mit PBS hergestellt und enthält 10^g PRP und 3,7 op-Einheiten Pertussiszellen/0,5 ml (Dosis).
Die PRP-Stammlösung (200 μg/ml in PBS, pH 7,0) wird wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Die Pertüssisstammlösung (enthaltend 75 op-Einheiten/ml) wird durch Verdünnen von 25 ml Frischzellensuspension von B. pertussis (149 op-Einheiten/ml) mit einem gleichen Volumen PBS hergestellt. Beide Stammlösungen werden voneinander getrennt 90 Tage oder etwas länger bei 4 0C inkubiert. Die Kombinationsvaccine wird unter Verwendung von 14 ml PRP-Stammlösung (200 μg/ml), 14 ml (enttoxifizierter) Stammlösung von Pertussis-Antigenen (75 op-Einheiten/ml) und 112 ml PBS hergestellt (Endvolumen 140 ml). Diese für Tier- versuche verwendete Vaccine enthält 10 μg PRP und 3,7 op-Einheiten B. pertussis/0,5 ml (Dosis). .
Die Ergebnisse der Antikörperreaktion auf diese Kombinationsvaccine bei jungen Ratten erscheinen in Figur 3 und in Ta- · belle II. .
T '& b e 1 1 e II
Vaccine
Dosis einfach oder mehrfach
3. Woche nach Injektion (-fache Erhöhung durch Vorimmunisierung
Woche nach Injektion 0 ' 1 2
Phosphatgepufferte Salzlösung
Pertussis
PRP (K) (Beispiel 1) (M)
PRP (K) (3 mo) . (S)'
Pertussis (3 mo) (M) . (Beispiel 5)
PRP (K)+ Perussis (S)
(3 mo) (Beispiel 4) (M)
| 99 | 116 | 107 | 158 |
| 113 | 108 | 117 | 149 |
| 110 | 136 | 148 | 142 |
| 108 | 136 | 132 | 147 |
| 101 | 135 | 1002 | 1771 |
| 93 | 146 | 135 | 140 |
| 119 | 154 | 751 · | 1410 |
1,6 1,3
1,3
1,4
17,5
1,5 11,8
a) 10 μg PRP oder 3,5 op Einheiten Pertissus/Dosis (0,5 ml)
b) -bester Wert 2. und 3. Woche (Mehrfachinjektion)
c) Mittelwert von 10 Ratten
d) Einfachinjektion
Claims (2)
- Pate nt ansprüche1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von immunologisch wirksamem Polyribosylribitolphosphat (PRP), dem Hüllpolysaccarid von Haemophilus influenzae Typ b durch Fermentation von Stämmen des Organismus Haemophilus influenzae Typ b unter an sich bekannten Bedingungen, Isolierung des PRP durch übliche Ethanolfällung und weitere an sich bekannte Isolierung des PRP als Hexadecyltrimethylammoniumbromidkomplex, dadurch gekennzeichnet, daßPRP durch Zugabe von Hydroxylapatit /3Ca3(PO4)2Ca(OH)__/ in einem 20 millimolaren Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 - 7,0, Vermischen bei einer Temperatur von 2 - 1O°C, Zentrifugieren, Abtrennen der überstehenden Flüssigkeit und wenigstens zweimaliges Wiederholen dieser Maßnahmen, Filtrieren der überstehenden Flüssigkeit und anschließendes Dialysieren gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser und Lyophilisieren gereinigt wird.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das PRP durch Säulenchromatographie in einem 0,02m Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,8 unter Verwendung von Hydroxylapatit /3Ca., (PO.) 2~.Ca(OH)2_/, Elution mit einem abgestuften 0,02m bis 0,05m Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,8, Isolierung von Fraktionen.durch Analyse auf PRP, Dialyse dieser Fraktionen gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser und Lyophilisieren gereinigt wird.
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|---|---|---|---|---|
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| CA1209036A (en) * | 1982-08-20 | 1986-08-05 | Joseph S.C. Kuo | Combined haemophilus influenzae and diphtheria, pertussis, tetanus vaccine |
| US4744982A (en) * | 1982-08-24 | 1988-05-17 | Hunter Kenneth W | Human monoclonal antibody reactive with polyribosylribitol phosphate |
| DE69113564T2 (de) * | 1990-08-13 | 1996-05-30 | American Cyanamid Co | Faser-Hemagglutinin von Bordetella pertussis als Träger für konjugierten Impfstoff. |
| HU9400426D0 (en) * | 1991-08-16 | 1994-05-30 | Merck & Co Inc | Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide |
| SG47725A1 (en) * | 1992-10-27 | 1998-04-17 | American Cyanamid Co | Combination pediatric vaccine with enhanced immunogenicity of each vaccine component |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3395219A (en) * | 1964-12-11 | 1968-07-30 | Merck & Co Inc | Process for production of pertussis antigen |
| IL24946A (en) * | 1965-01-19 | 1969-05-28 | Merck & Co Inc | Process for preparing antibodies in cilus pertussis |
| US3465078A (en) * | 1965-10-21 | 1969-09-02 | Sydney Z Spiesel | Method of recovering antigens from bordetella pertussis cells |
| NL174267B (nl) * | 1969-05-20 | Roussel Uclaf | Verbetering van de werkwijze voor de bereiding van een somatisch antigeen volgens het nederlandse octrooischrift 169754 en werkwijze ter bereiding van een farmaceutisch preparaat. | |
| US3636192A (en) * | 1970-01-13 | 1972-01-18 | Us Army | Meningococcal polysaccharide vaccines |
| FR2253499B1 (de) * | 1973-12-10 | 1977-11-04 | Fabre Sa Pierre | |
| DE2461439C3 (de) * | 1974-12-24 | 1980-03-20 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel |
| US3978209A (en) * | 1975-03-24 | 1976-08-31 | Merck & Co., Inc. | Endotoxin free meningococcus polysaccharides |
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