AT366411B - Verfahren zur herstellung einer neuen antibakte- riellen verbindung und deren salzen und estern - Google Patents

Description

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   Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer neuen antibakteriellen Verbindung, die durch das Bakterium Pseudomonas fluorescens gebildet wird, und deren Salzen und Estern. 



   In der GB-PS Nr. 1, 395, 907 ist ein Verfahren zur Isolierung antibakterieller Verbindungen aus dem Bakterium Pseudomonas fluorescens beschrieben und beansprucht, wobei eine derartige Verbindung Pseudomonsäure genannt wird ; sie besitzt die Formel 
 EMI1.1 
 und wird im folgenden   als "Pseudomonsäure A" bezeichnet.   



   Es wurde nun gefunden, dass eine weitere antibakterielle Verbindung aus Pseudomonas fluorescens isoliert werden kann ; diese Verbindung kann aber auch aus Pseudomonsäure A hergestellt werden. 



   Demgemäss bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel 
 EMI1.2 
 und deren pharmazeutisch verwendbaren Salzen und Estern. 



   Die erfindungsgemäss erhältliche Verbindung der Formel (II) wird im   folgenden"Pseudomon-   säure C" bezeichnet. Man nimmt an, dass sie absolute stereochemische Formel 
 EMI1.3 
 aufweist, wobei beide Doppelbindungen in trans- oder E-Konfiguration sind. 



   Geeignete pharmazeutisch verwendbare Salze der Pseudomonsäure C sind Metallsalze,   z. B.   



  Aluminiumsalze, Alkalimetallsalze, wie Natrium- oder Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Kalziumoder Magnesiumsalze, und Ammonium- oder substituierte Ammoniumsalze, beispielsweise jene, die mit nied. Alkylamin, wie Triäthylamin,   Hydroxy-nied. alkylaminen,   wie 2-Hydroxyäthylamin, Bis- (2-   -hydroxyäthyl)-amin   oder Tri-(2-hydroxyäthyl)-amin, Cycloalkylaminen, wie Bicyclohexylamin, oder 
 EMI1.4 
 

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 b)   C 3-7-Cycloalkyl,   gegebenenfalls substituiert mit    C, 6-Alkyl;   c) Aryl ; d) Heterocyclyl. 



  Der   Ausdruck "Aryl" umfasst   Phenyl und Naphthyl, gegebenenfalls bis zu fünffach substituiert 
 EMI2.1 
 gruppe, insbesondere Methyl, Äthyl, n-oder Isopropyl, n-,   sek.-, iso-oder tert. Butyl ;   eine Halo-   gen- (C )-alkylgruppe,   wie Trifluormethyl, 2, 2, 2-Trichloräthyl ; eine Aminoalkylgruppe, wie Aminomethyl, 2-Aminoäthyl ; eine   Hydroxymethyl-oder Hydroxyäthylgruppe ;   eine Phenylgruppe ; eine substituierte Phenylgruppe oder eine Benzylgruppe sein. 



   Bevorzugte Ester sind die    C, - 6-Alkylester.   



   Pseudomonsäure C und ihre Salze und Ester weisen antibakterielle Wirksamkeit auf. Insbesondere stark wirksam sind sie gegen Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae und Mycoplasma sp ; sie sind daher wertvoll bei der Behandlung von   Atmungs- und   venerischen Krankheiten sowie bei mycoplasmainduzierten menschlichen und tierischen Erkrankungen. Weiterhin besitzen die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen gegenüber Pseudomonsäure A den Vorteil, dass sie bei sauren Bedingungen stabil und bei alkalischen Bedingungen stabiler sind. 



   Bei Menschen sind die Infektionen, gegen welche Pseudomonsäure C und deren Salze und Ester besonders nützlich sind, venerische Krankheiten. Da es sich bei den erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen nicht um ein   ss-Lactamantibiotikum   handelt, sind sie gegen ss-lactamasebildende Stämme von N. gnorrhoeae, gegen welche Standardbehandlungen mit Penicillin- und Cephalosporinantibiotika nicht zweckmässig sind, wirksam. Pseudomonsäure C kann auch wirksam bei der Behandlung von Atmungsinfektionen, wie chronischer Bronchitis und bakterieller Meningitis, nichtspezifischer Urethritis und Pneumonie sein. Bei Tieren kann sie im allgemeinen als Wachstumsförderer oder zur Behandlung von Mastitis bei Rindern sowie zur Behandlung von Mycoplasmainfektionen bei Tieren, wie Truthähnen, Hühnern und Schweinen, verwendet werden. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen werden somit zur Herstellung von pharmazeutischen oder Veterinärzusammensetzungen verwendet, die Pseudomonsäure C oder ein Salz oder einen Ester hievon zusammen mit einem pharmazeutisch oder veterinär geeigneten Träger oder Exzipienten enthalten. 



   Die Zusammensetzungen können für jede Verabreichung formuliert werden und hängen von der behandelten Krankheit ab. Sie können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten, Lutschtabletten oder flüssigen Präparaten, wie oralen oder sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen, sein. 



   Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in Einheitsdosisform sein und herkömmliche Exzipienten, wie Bindemittel, z. B. Sirup, Akaziengummi, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon ; Füllstoffe, z. B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Kalziumphosphat, Sorbit oder Glycin ; Schmiermittel, z. B. Magnesiumstearat, Talk, Polyäthylenglykol oder Kieselerde ; Desintegriermittel, z. B. Kartoffelstärke ; oder annehmbare Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. 



  Die Tabletten können nach bekannten pharmazeutischen Standardverfahren überzogen werden. Orale flüssige Präparate können beispielsweise in Form von wässerigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups oder Elixieren sein oder sie können als Trockenprodukt für die Rekonstitution mit Wasser oder einem andern geeigneten Träger vor der Verwendung hergestellt werden. 



  Derartige flüssige Präparate können herkömmliche Additive, wie Suspendiermittel, z. B. Sorbit, Sirup, Methylzellulose, Glucosesirup, Gelatine, hydrierte essbare Fette ; Emulgiermittel, wie Lecithin, Sorbitanmonooleat oder   Akaziengummi ; nichtwässerige   Träger (die essbare öle einschliessen können), z. B. Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester, wie Glycerin, Propylenglykol oder Äthyl- 

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 alkohol ; Konservierungsmittel, z. B. Methyl-oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure, und gegebenenfalls Geschmacks- und Farbstoffe, enthalten. 



   Suppositorien enthalten herkömmliche Suppositoriengrundstoffe, z. B. Kakaobutter oder ein anderes Glycerid. 



   Für die parenterale Verabreichung werden flüssige Einheitsdosierungsformen hergestellt, wobei die Verbindung und ein steriler Träger verwendet werden ; Wasser wird bevorzugt. Die Verbindung kann je nach dem Träger und der angewendeten Konzentration im Träger entweder suspendiert oder gelöst werden. Bei der Herstellung von Lösungen kann die Verbindung in Wasser für die Injektion gelöst und vor dem Einfüllen in eine geeignete Phiole oder Ampulle und Verschliessen derselben durch Filtrieren sterilisiert werden. Vorteilhafterweise werden Hilfsstoffe, wie Lokalanästhetika, Konservierungsmittel und Pufferstoffe im Träger gelöst. Um die Stabilität der Zusammensetzung zu erhöhen, kann diese nach dem Einfüllen in die Phiole gefroren und das Wasser unter Vakuum entfernt werden. Das gefriergetrocknete Pulver wird dann in der Phiole versiegelt.

   Parenterale Suspensionen werden praktisch auf die gleiche Weise hergestellt, wobei jedoch die Verbindung, an Stelle im Träger gelöst zu werden, in diesem suspendiert wird ; dabei kann die Sterilisierung nicht durch Filtration erfolgen. Die Verbindung kann dadurch sterilisiert werden, dass man sie vor dem Suspendieren im sterilen Träger Äthylenoxyd aussetzt. Vorteilhafterweise wird der Zusammensetzung ein oberflächenaktives Mittel oder ein Netzmittel zugesetzt, um die gleichförmige Verteilung der Verbindung zu erleichtern. 



   Die Zusammensetzungen können 0, 1 bis 99 %-Masse, vorzugsweise 10 bis 60 %-Masse, der aktiven Verbindung, je nach Art der Verabreichung, enthalten. Wenn die Zusammensetzungen in Form von Dosiseinheiten vorliegen, enthält jede Einheit vorzugsweise 50 bis 500 mg des aktiven Bestandteiles. Die Dosis für einen erwachsenen Menschen beträgt vorzugsweise 100 mg bis 3 g täglich, beispielsweise 250 mg bis 2 g täglich, je nach der Art und der Häufigkeit der Verabreichung. 



   Anderseits kann Pseudomonsäure C oder ein Salz oder ein Ester hievon als Teil der Gesamtnahrung verabreicht werden. In diesem Fall kann die Menge der verwendeten Verbindung weniger als 1 %-Masse der Nahrung, vorzugsweise nicht mehr als 0, 5 %-Masse, betragen. Die Nahrung für Tiere kann aus normalen Futtermitteln bestehen, welchen die Verbindung zugesetzt worden ist, oder sie kann zu einer Vormischung zugegeben werden. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen werden dadurch hergestellt, dass man Pseudomonas fluerescens NCIB 10586 unter aeroben Bedingungen auf oder in einem Kulturmedium, das anorganische Salze und Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs und Stickstoffs enthält, züchtet, bis das Kulturmedium zumindest feststellbare antibakterielle Wirksamkeit zeigt, das Kulturmedium ansäuert, mit einem organischen Lösungsmittel für die im Kulturmedium gelösten aktiven Materialien extrahiert, gegebenenfalls Pseudomonsäure A durch fraktionierte Kristallisation entfernt und danach (i) Pseudomonsäure C oder ein Salz hievon von andern aktiven Materialien abtrennt und gegebenenfalls danach die abgetrennte Säure verestert oder (ii) die aktiven Materialien verestert,

   einen Ester der Pseudomonsäure C von Estern anderer aktiver Materialien abtrennt und gegebenenfalls danach den abgetrennten Ester unter
Bildung der Pseudomonsäure C oder eines Salzes hievon hydrolysiert. 



   Beim erfindungsgemässen Verfahren erfolgt die Kultivierung, bei der Pseudomonas fluorescens NCIB 10586 (NCIB = National Collection of Industrial Bacterial) gezüchtet wird, in konventioneller Weise. Es sei bemerkt, dass jeder Stamm dieses Organismus verwendet werden kann. 



   Nach Beendigung der Fermentation werden die aktiven Materialien, einschliesslich Pseudomonsäure C, vom angesäuerten wässerigen Kulturmedium in ein geeignetes Lösungsmittel extrahiert. 



   Vorzugsweise besteht die Extraktion in der Extraktion des Kulturmediums nach Ansäuerung 
 EMI3.1 
 lischer Pufferlösung und einschliesslich Rückextraktion der letzteren nach Ansäuerung mit einem organischen Lösungsmittel. Geeignete Lösungsmittel können durch Versuche gefunden werden ; Beispiele sind Isobutylmethylketon, Chloroform und vorzugsweise Äthylacetat. 



   Die Pseudomonsäure C kann dann von andern, bei der Fermentation gebildeten aktiven Materialien entweder direkt (obige Stufe a) oder durch Verestern der Mischung und Abtrennen des Esters der Pseudomonsäure C (obige Stufe b) getrennt werden. 

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   Das beim erfindungsgemässen Verfahren ausser Pseudomonsäure C am meisten gebildete Material ist Pseudomonsäure A. 



   Wenn diese letztere in wesentlichen Mengen vorhanden ist, wird vorzugsweise der Grossteil durch Kristallisation von Pseudomonsäure A, gegebenenfalls mit Animpfen, aus einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Diäthyläther, entfernt. 



   Wenn die Alternative (i) durchgeführt   wird, kann Pseudomonsäure   C direkt durch Chromato- graphie von der verbliebenen Mischung entweder als freie Säure selbst oder als Salz hievon abgetrennt werden. Bei Chromatographie auf Silikagel wird Pseudomonsäure C leicht vor Pseudomonsäure A eluiert und die Fraktionen können demnach identifiziert werden. 



   Die abgetrennte Pseudomonsäure C oder ein Salz hievon kann wie folgt verestert werden :
Die Veresterung kann beispielsweise durch Umsetzen der Säure oder eines Salzes hievon a) mit dem geeigneten Halogen, Sulfat oder Alkansulfonat des Alkohols in Anwesenheit eines
Lösungsmittels, wie Aceton, Dimethylsulfid oder Dimethylsulfoxyd und Kalzium- oder Ka- liumcarbonat oder mit dem Halogenid in Anwesenheit von Hexamethylphosphoramid ; oder b) durch Phasenübertragungs-Katalysemethoden mit dem Halogenid und/oder Sulfat des Alko- hols in wässeriger und/oder organischer Lösung in Anwesenheit eines quaternären Ammo- niumsalzes, wie Tetrabutylammoniumbisulfat oder-halogenid oder Benzyltrimethylammonium- halogenid ; oder c) mit einem Diazoalkan, erfolgen. 



   Die Hydrolyse eines Esters der Pseudomonsäure C kann eine chemische Hydrolyse, beispielsweise selektive alkalische Hydrolyse, oder enzymatische Hydrolyse, beispielsweise durch Verwendung von Bakers-Hefe, sein. 



   Wenn die Alternative (ii) durchgeführt wird, wird die Mischung der aktiven Materialien zuerst verestert, vorzugsweise nach Entfernen des Grossteiles der Pseudomonsäure A durch Kristallisation. Es kann jede oben beschriebene Veresterungsmethode angewendet werden. Es ist zweckmässig,    Cl -. -Alkylester   der Verbindungen in der Mischung, vorzugsweise Methylester, zu bilden. 



   Die erhaltene Estermischung kann dann chromatographiert und der gewünschte Ester der Pseudomonsäure C dadurch abgetrennt werden. Wenn die freie Säure oder ein Salz hievon gewünscht wird, können diese durch chemische oder enzymatische Hydrolyse des abgetrennten Esters gebildet werden. 



   Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese hierauf beschränkt sein soll. 



   Beispiel 1 : Pseudomonsäure C durch Fermentation a) Fermentation
Pseudomonas fluorescens, Stamm NCIB 10586, wurde auf Schrägagar kultiviert und mit sterilem Wasser überschwemmt. Zu dem folgenden Samenmedium wurde eine Probe zugesetzt : 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Oxoid-Hefeextrakt <SEP> 2 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Glucose <SEP> 0, <SEP> 11% <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Dinatriumhydrogenorthophosphat <SEP> 0,26% <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Kaliumdihydrogenorthophosphat <SEP> 0,24% <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> 
 
Dieses wurde über Nacht bei   280C   gezüchtet und dann zum Animpfen des folgenden Produktionsmediums verwendet :

   
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> Getreideweiche <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Glucose <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Glycerin <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.) <SEP> 
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.) <SEP> 
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> Kaliumdihydrogenorthophosphat <SEP> 0,04 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Dinatriumhydrogenorthophosphat <SEP> 0,065 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Manganchlorid <SEP> R <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 0003% <SEP> (Masse/Vol. <SEP> )
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 0375% <SEP> (Masse/Vol. <SEP> )
<tb> P2000 <SEP> zum <SEP> Vermindern <SEP> des <SEP> Schäumens.
<tb> 
 



   Die Fermentation wurde während 48 h bei 25 C durchgeführt, als die Produktion praktisch beendet war. Nach Abzentrifugieren der Zellen wurde die überstehende Flüssigkeit in Äthylacetat bei PH 3 verteilt. Die Äthylacetatlösung wurde getrocknet (MgS04) und auf ein kleines Volumen eingedampft, worauf Äther zugesetzt und Pseudomonsäure A kristallisieren gelassen wurde. b) Isolierung von Pseudomonsäure C
Die Mutterlaugen aus der obigen Kristallisation wurden zu einem Öl eingedampft und auf präparativen 20 x 20 cm Silikageldünnschichtchromatographieplatten chromatographiert, wobei mit Chloroform : Isopropanol : Essigsäure (80 : 20 : 0,   5)   entwickelt wurde. Die Bande oberhalb Pseudomonsäure A vom   Rf 0,   65 wurde entfernt und wie oben wieder chromatographiert, wobei Pseudomonsäure C erhalten wurde. 



   Berechnet für   CHO, :   C 64, 4, H 9, 2% gefunden : C 64,0, H 9,   3%.   vmax   (CHClg) :   3430 (breit), 1710,1650, 1220 (breit), 1153,1110, 1050 und 977   cm-'   
 EMI5.2 
    (ÄtOH) :25, 9   (C7'), 24, 7 (C3'), 20, 4 (C14), 19,2 (C15), 16,7 (C17). 



   Beispiel 2 : Isolierung von Methylpseudomonat C
Das restliche Öl von den Mutterlaugen von Beispiel 1 a) (zirka 5 g) wurde in 50 ml Methanol gelöst und mit 50 ml Wasser verdünnt, worauf der PH-Wert mit wässerigem Natriumhydroxyd auf 7 eingestellt wurde. Nach Eindampfen zur Trockne wurde eine Lösung des Rückstandes in 50 ml Dimethylformamid, 5 Tropfen Hexamethylphosphoramid und 5 ml Methyljodid über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand zwischen 50 ml Äthylacetat und 20 ml Wasser aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit gesättigter Kochsalzlösung, wässerigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet   (MgSO..)   und zu einem Öl eingedampft, aus welchem etwas Methylpseudomonat A kristallisierte.

   Das verbleibende Öl wurde zweimal auf Kieselerde (20 g und dann 15 g, Type 60) chromatographiert, wobei mit einem Gradienten von 0 bis 4% Methanol/Chloroform eluiert wurde. Fraktionen, die praktisch reines Methylpseudomonat C enthielten (Rf 0,46, Kieselerde-Dünnschichtchromatographie, Chloroform/Methanol   9 : 1, Methylpseudomonat A, Rf 0, 42) wurden vereinigt und auf 4 g Kieselerde (Type 60) unter An-   wendung eines Gradienten von 0 bis 3% Methanol/Chloroform chromatographiert (destilliert aus Phosphorpentoxyd). Die Fraktionen, die reines Methylpseudomonat C enthielten (durch Dünnschichtchromatographie) wurden vereinigt und zu einem Öl (50 mg) eingedampft, das sich als Methylpseudomonat C erwies. 



   Dünnschichtchromatographie in Chloroform/Methanol (9 :   1)   zeigte eine Komponente bei Rf = 0, 46 und ein einziges Peak durch Hochdruckflüssigchromatographie, vmax   (chia)   : 3400, 2900,2850, 1720, 1710, 1650,1150 und 980   cm-1 ;   

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 EMI6.1 
 m/e (relative Intensität) : 499 (100%, M+ +1 durch   C. I.).   



  Beispiel 3 : Pseudomonsäure C aus Methylpseudomonat C 
 EMI6.2 
 
230 mg Methylpseudomonat C aus Beispiel 2 wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und mit 120 ml   Q, 05M   Phosphatpuffer verdünnt und dann über Nacht mit 6 g Baker-Hefe gerührt. Die Mischung wurde filtriert, zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 50 ml Äthylacetat und 50 ml Wasser gelöst. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und die vereinigten wässerigen Schichten mit 5M HC1 auf PH 3 angesäuert und mehrere Male mit Äthylacetat extrahiert. Nach Trocknen wurden die vereinigten Extrakte zu einem Öl eingedampft.

   Chromatographie auf 8 g Silikagel H (Type 60) unter Eluieren mit einem Gradienten von 0 bis 6% Methanol/Chloroform ergab 150 mg (67%) Pseudomonsäure C, die chromatographisch und spektroskopisch mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Material identisch war. 
 EMI6.3 
 :Kaliumcarbonat und 21 ml Methyljodid bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft, dann in   Äthylacetat/Wasser   aufgenommen und wie im Beispiel 2 aufgearbeitet, wobei Methylpseudomonat C erhalten wurde. 



   Der Methylester kann wie in Beispiel 3 hydrolysiert werden. 



   Beispiel 5 : Natriumpseudomonat C (Natrium-10,11-deoxypseudomonat A)
Eine Lösung von 0, 330 g Methylpseudomonat C in 20 ml destilliertem Tetrahydrofuran und 20 ml   10N   Natriumhydroxydlösung wurde 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Tetrahydrofuran wurde im Vakuum entfernt, wobei eine trübe wässerige Lösung erhalten wurde, die mit Äther-Äthylacetat gewaschen wurde, um nichtumgesetzten Ester zu entfernen. Die wässerige Schicht wurde mit Natriumchlorid gesättigt, mit Äthylacetat bedeckt und mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 1, 5 angesäuert. Die Äthylacetatschicht wurde abgetrennt, mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4) und zur Trockne eingedampft. Die erhaltene Pseudomonsäure C wurde in Wasser/Tetrahydrofuran suspendiert und 10N Natriumhydroxydlösung wurde bis zu einem PH-Wert von 7, 5 zugesetzt.

   Die erhaltene wässerige Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml trockenem Methanol gelöst und filtriert und überschüssiger trockener Äther wurde dem Filtrat unter Rühren zugesetzt. Der erhaltene weisse Niederschlag von Natriumpseudomonat C wurde gesammelt und im Vakuum getrocknet ; Ausbeute 0, 153 g. Die Verbindung war durch   Dünnschichtchromatographie   und Hochdruckflüssigchromatographie homogen ; 
 EMI6.4 
 

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Beispiel 6 : Natriumpseudomat C
1 g Methylpseudomonat C wurde in 50 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Wasser gelöst und der
PH-Wert auf 12 eingestellt und 2 1/2 h lang dabei gehalten. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, zur Trockne eingedampft und dann in 30 ml Wasser wieder gelöst und mit Äthylacetat gewaschen.

   Die wässerige Fraktion wurde auf einen PH-Wert von 2 angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Nach Trocknen   (MgSO 4)   wurden die vereinigten Extrakte im Vakuum eingedampft. 



  Das erhaltene Öl (0, 55 g) wurde mit 95 mg   (1   Äquivalent) Natriumbicarbonat in 20 ml Wasser/20 ml Methanol behandelt und zur Trockne eingedampft. Das Natriumsalz wurde in Äthanol (Minimum) gelöst und tropfenweise zu 300 ml Äther zugesetzt und der Niederschlag abfiltriert (0, 58 g,   57%) ;   
 EMI7.1 
 smal(C3'-C8'), 20,3 (C14), 19,4 (C15), 16, 6 (C17). 



   Berechnet für C26H43O8Na.H2O: C 59, 5, H   8, 6,   Na 4, 4% gefunden : C 59, 4, H   8, 4,   Na   4, 9%.   



   Biologische Daten
1. Antibakterielle Wirksamkeit - menschliche Organismen
Tabelle I zeigt das antibakterielle Spektrum von Natriumpseudomonat C und Methylpseudomonat C, ausgedrückt als minimale Hemmungskonzentration (pg/ml), gemessen durch Serienverdünnung in Nähragar enthaltend 5% mit Schokolade versetztes Pferdeblut. 



   Tabelle I 
 EMI7.2 
 
<tb> 
<tb> Organismus <SEP> minimale <SEP> Hemmungskonzentration <SEP> (ug/ml)
<tb> Natriumpseudo- <SEP> Methylpseudomonat <SEP> C <SEP> monat <SEP> C <SEP> 
<tb> E. <SEP> coli <SEP> NCTC <SEP> 10418 <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP> 
<tb> E. <SEP> coli <SEP> ESS <SEP> 1,0 <SEP> 2,5
<tb> P. <SEP> mirabilis <SEP> 889 <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP> 
<tb> K.

   <SEP> aerogenes <SEP> A <SEP> > 100 <SEP> > 100
<tb> Ps <SEP> aeruginosa <SEP> NCTC <SEP> 10701 <SEP> > 100 <SEP> > 100
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 1633 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Haemophilus <SEP> infl <SEP> uenzae <SEP> Ql <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> < 0, <SEP> 2
<tb> Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> Wy <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,5
<tb> Neisseria <SEP> flavescens <SEP> 6633 <SEP> 0,2 <SEP> 0,5
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> < 0, <SEP> 2
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 9755 <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP> 
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP> 
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> Oxford <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> < 0, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Staph.

   <SEP> aureus <SEP> Russell <SEP> 0,2 <SEP> 0,5
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 Tabelle I (Fortsetzung) 
 EMI8.1 
 
<tb> 
<tb> Organismus <SEP> minimale <SEP> Hemmungskonzentration <SEP> (pg/ml)
<tb> Natriumpseudo-Methylpseudomonat <SEP> C <SEP> monat <SEP> C <SEP> 
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 1517 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> I <SEP> 100 <SEP> > 100
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> A <SEP> 64/848 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> B <SEP> 2788 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> C <SEP> 2761 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Strep. <SEP> pneumoniae <SEP> CN33 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 
 
2.

   Antimycoplasmawirksamkeit
Methylpseudomonat C besitzt in vitro gegen Mycoplasmen von menschlichen und veterinären Quellen gute Antimycoplasmawirksamkeit, wie in Tabelle Il gezeigt. 



   Methode :
Die minimalen Hemmungskonzentrationen (MIC) von Methylpseudomonat C wurden in Mikrotiterplatten durch eine Modifikation des metabolischen Hemmungstests (Taylor-Robinson, 1967) bestimmt. 



  Die Verbindungen wurden serienmässig in sterilem entionisiertem Wasser verdünnt, um einen Konzentrationsbereich von 250 bis 0, 5 pg/ml zu erhalten. Mycoplasmabrühe, enthaltend 1% (Masse/Vol. ) Glucose und 0, 005% (Masse/Vol. ) Phenolrot, wurde in einer Stärke zugesetzt, um dessen Verdünnung durch die wässerige Heilmittellösung zu kompensieren. Etwa 104 kolonienbildende Einheiten an Mycoplasma wurden zu jeder Konzentration des Heilmittels zugesetzt. Heilmittelfreie infizierte, nichtinfizierte und    PH-Kontrollöcher   wurden in jeder Platte angebracht. Die Platten wurden mit einem Zellophanband verschlossen und 7 Tage lang bei 370C bebrütet. Die minimale Hemmungskonzentration war die niedrigste Konzentration der Verbindung, die eine Farbänderung in der Mycoplasmabrühe verhinderte, bewirkt durch den Metabolismus. 



   Bezug : Taylor-Robinson, 1967.   Mycoplasmas   of varios hosts and their antibiotic sensitivities ;   Post. Grad. Med. J., Suppl. (Maroh),   100. 



   Tabelle   II   
 EMI8.2 
 
<tb> 
<tb> Mycoplasma <SEP> MIC <SEP> (pg/ml) <SEP> 
<tb> M. <SEP> gallisepticum <SEP> S. <SEP> 6 <SEP> 62,5
<tb> M. <SEP> synoviae <SEP> 25204 <SEP> < 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> M. <SEP> Pulmonis <SEP> JB <SEP> < 0, <SEP> 5
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> Läber <SEP> < 0,5
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> 427a <SEP> 1,0
<tb> M. <SEP> fermentans <SEP> MW <SEP> KL4 <SEP> < 0, <SEP> 5
<tb> 
 
Die Tabelle III zeigt MIC-Werte für Natriumpseudomonat C und Methylpseudomonat C gegen weitere Mycoplasmaarten, bestimmt in einer Friis-Brühe unter Verwendung der Mikrotitermethode. 

 <Desc/Clms Page number 9> 

 



  Tabelle III 
 EMI9.1 
 
<tb> 
<tb> Organismus <SEP> MIC <SEP> (ug/ml) <SEP> 
<tb> Methylpseudo- <SEP> Natriumpseudo- <SEP> 
<tb> monat <SEP> C <SEP> monat <SEP> C <SEP> 
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> Str. <SEP> 11 <SEP> > 10 <SEP> > 10
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> J2206/183b <SEP> > 10 <SEP> 10
<tb> M. <SEP> dispar <SEP> H225 <SEP> 10 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> M. <SEP> dispar <SEP> NCTC <SEP> 10125 <SEP> 50 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> 427a <SEP> > 10 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> ATCC <SEP> 15492 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 
<tb> M. <SEP> fermentans <SEP> MWKL4 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP> < 0, <SEP> 02 <SEP> 
<tb> M. <SEP> pulmonis <SEP> JB <SEP> 0, <SEP> 312 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP> 
<tb> 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung der neuen Pseudomonsäure C der Formel EMI9.2 und deren pharmazeutisch verwendbaren Salzen und Estern, dadurch gekennzeichnet, dass man Pseudomonas flurescens NCIB 10586 unter aeroben Bedingungen auf oder in einem Kulturmedium, das anorganische Salze und Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs und Stickstoffs enthält, züchtet, bis das Kulturmedium zumindest feststellbare antibakterielle Wirksamkeit zeigt, das Kulturmedium ansäuert, mit einem organischen Lösungsmittel für die im Kulturmedium gelösten aktiven Materialien extrahiert, gegebenenfalls Pseudomonsäure A durch fraktionierte Kristallisation entfernt und danach (i) Pseudomonsäure C oder ein Salz hievon von andern aktiven Materialien abtrennt und gegebenenfalls danach die abgetrennte Säure verestert oder (ii) die aktiven Materialien verestert,

   einen Ester der Pseudomonsäure C von Estern anderer aktiver Materialien abtrennt und gegebenenfalls danach den abgetrennten Ester unter Bildung der Pseudomonsäure C oder eines Salzes hievon hydrolysiert.