DD159645A5 - Verfahren zur herstellung von makroliden - Google Patents

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DD159645A5 DD81230762A DD23076281A DD159645A5 DD 159645 A5 DD159645 A5 DD 159645A5 DD 81230762 A DD81230762 A DD 81230762A DD 23076281 A DD23076281 A DD 23076281A DD 159645 A5 DD159645 A5 DD 159645A5
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Description

Aktenzeichen: X-5141
Vertreter; Patentanwaltsbüro Berlin
Titel der Erfindung; Verfahren zur Herstellung von Makroliden Anwendungsgebiet der Erfindung;
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Makroliden, die wertvolle Arzneimittel sind und sich vor allem durch eine besonders interessante antibiotische Wirksamkeit auszeichnen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;
Die vorliegenden Makrolide ähneln in ihrer Struktur dem als therapeutisches Mittel bekannten Tylosin, das beispielsweise in Tetrahedron Letters, 2339 (1970) beschrieben wird. Tylosin stellt ein sehr bedeutendes Antibiotikum dar. Unab-
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hängig davon besteht jedoch stets die Notwendigkeit zur Entwicklung neuer Antibiotika, und zwar unter anderem allein schon infolge der Möglichkeit der Entwicklung resistenter Stämme im Laufe der Zeit. Weiter können auch entsprechende strukturelle Abwandlungen zu Veränderungen im Spektrum suszeptibler Mikroorganismen führen. Eine chemische Abwandlung der Struktur tylosinähnlicher Makrolide hat sich nun leider jedoch als äußerst schwierig erwiesen. In J. Org. Chem. 44 (12), 2050 bis 2052 (1979) werden beispielsweise die Probleme angesprochen, die bei der Spaltung der Mycinosylglycosidbindung von Tylosin durch chemische Mittel auftreten. Das Hauptaugenmerk der entsprechenden Forschungsarbeiten mit dem Ziel der Schaffung und Untersuchung neuer Strukturen ist daher auf neue, in der Natur vorkommende oder synthetische Mikroorganismen mit der Hoffnung gerichtet, daß sich durch deren Züchtung mit Tylosin verwandte und wirkungsmäßig interessante Strukturen ergeben.
Aufgabe der Erfindung;
Infolge der interessanten Wirksamkeit von Tylosin und des oben angesprochenen ständigen Bedarfs an neuen Antibiotika infolge der im Laufe der Z'eit sich ergebenden Resistenzbildung hat sich die Erfindung nun die Aufgabe gestellt, antibiotisch wirksame und tylosinähnliche Makrolide zu schaffen, die sich durch eine besonders interessante pharmakologische Wirksamkeit, und insbesondere eine wertvolle antibiotische Wirksamkeit auszeichnen.
Darlegung des Wesens der Erfindung;
Die obige Aufgabe wird erfindungsgemäß nun gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung antibiotisch wirksamer Makrolide, die dem Tylosin ähnlich sind, dessen Mycinosyloxybaustein je-
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doch nicht enthalten, und die sich durch submerse aerobe Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces fradiae herstellen lassen.
Im einzelnen wird die obige Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung neuer Makrolide der allgemeinen Formel (I)
•-ΟΗ Ha
worin Q für -CH2OH oder -(JIHO steht, oder eines Acylesters hiervon, oder eines Säureaddxtionssalzes der Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder eines Esters hiervon, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) Streptomyces fradiae NRRL 12171 unter submersen aeroben Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität und Erzeugung des gewünschten Makrolids züchtet oder
(b) 23-De(mycinosyloxy)tylosin mit einem chemischen Reduktionsmittel unter Bildung des Makrolids, worin Q für -CH2OH steht, reduziert und
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(c) durch Ansäuerung oder Veresterung gewünschtenfalls ein Salz oder einen entsprechenden Ester bildet.
Steht in obiger allgemeiner Formel I der Rest Q für -CHO, dann ist das neue Makrolid 23-De(mycinosyloxy)tylosin, das vorliegend einfach auch als De(mycinosyloxy)tylosin oder DMOT bezeichnet wird und die folgende Formel hat:
CHa-* Y-CHa-CH
CHa-f
VtV
Eine weitere erfindungsgemäß herstellbare Verbindung stellt das Dihydroderivat von DMOT dar, nämlich das 20-Dihydro-23-de(mycinosyloxy)tylosin, welches im folgenden abgekürzt auch als Dihydro-DMOT bezeichnet wird, ebenfalls ein antibiotisch wirksames Makrolid ist und die Struktur
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/v
CHs-il γ-CHa-CHaOH
CHa/
CHa-CHei .*. J-OH ? f
/ >-4 CH3 OH
σ ^t-A-CHs .· irCHo
4- O < "*-0H
Μ-»
DMOT und Dihydro-DMOT hemmen das Wachstum von für Tiere pathogenen Mikroorganismen. Sie stellen insbesondere antibakterielle Mittel dar, die sich durch eine besondere Wirksamkeit gegenüber grampositiven Mikroorganismen und Arten von Mycoplasma auszeichnen.
Die Hydroxylgruppen von DMOT und von Dihydro-DMOT, nämlich die in den Stellungen 2"<,/4", 3" und 3 befindlichen Hydroxylgruppen, lassen sich verestern, wodurch wertvolle Acylesterderivate gebildet werden. Ferner kann das Dihydro-DMOT auch an der in Stellung 20 befindlichen Hydroxylgruppe verestert werden. Die Veresterung der Hydroxylgruppe in Stellung 2* verläuft am einfachsten. Beispiele für derartige Ester sind die Ester von Monocarbonsäuren oder die Halbester von Dicarbonsäuren mit jeweils 2 bis 18 Kohlenstoffatomen.
Bei DMOT, Dihydro-DMOT und ihren Acylesterderivaten handelt es sich um basische Verbindungen, die sich durch Behandlung mit Säuren in Säureadditionssalze überführen lassen. Solche Säureaddxtionssalze gehören ebenfalls zur Erfindung.
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Wird im folgenden daher von DMOT-Verbindungen gesprochen, dann versteht man hierunter DMOT, Dihydro-DMOT, ein bestimmtes Acylesterderivat dieser Verbindungen oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz von DMOT, Dihydro-DMOT oder einem Acylesterderivat hiervon.
Die Erfindung bezieht sich ferner auch auf einen neuen Stamm von Streptorayces fradiae, nämlich den Stamm NRRL 12171 von Streptomyces fradiae, sowie auf ein Verfahren zur Herstellung von DMOT oder Dihydro-DMOT durch Züchtung dieses Stammes unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung eines wesentlichen Ausmaßes an antibiotischer Aktivität. DMOT oder Dihydro-DMOT können aus dem basisch gestellten Filtrat der Kulturbrühe mit polaren organischen Lösungsmitteln extrahiert und beispielsweise durch adsorptive oder extraktive Verfahren weiter gereinigt werden.
Die Erfindung ist weiter auch auf ein neues Verfahren zur Herstellung von 23-Deoxy-5-0-mycaminosyltylonolid (im folgenden als DOMT abgekürzt) und 20-Dihydro-23-deoxy-5-O-mycaminosyltylonolid (Dihydro-DOMT) gerichtet, indem man DMOT oder Dihydro-DMOT unter schwach sauren Bedingungen hydrolysiert. Das mit der Abkürzung DOMT bezeichnete 23-Deoxy-5-0-mycaminosyltylonolid hat die folgende Struktur
ί V* 0
• ♦ O
2-« \-CH2-CH
CHa y X-X
CH2-
CHa-CHs-·,
vsv
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Dihydro-DMOT läßt sich durch chemische Reduktion oder durch Fermentation erhalten. Die Herstellung von Dihydro-DMOT durch chemische Reduktion erfolgt durch bekannte Verfahren, beispielsweise durch Behandlung mit einer stöchiometrischen Menge eines chemischen Reduktionsmittels, wie Natriumborhydrid, in einem alkoholischen Lösungsmittel. Dihydro-DMOT kann ferner auch durch Züchtung des vorliegenden Mikroorganismus Streptomyces fradiae NRRL 12171 unter gesteuerten Fermentationsbedingungen gebildet werden.
DMOT und Dihydro-DMOT können in ihren Stellungen 2',4", 3" und 3 durch übliche Behandlung mit Acylierungsmitteln verestert und hierdurch in die entsprechenden Acylesterderivate überführt werden. Dihydro-DMOT läßt sich ferner auch in Stellung 20 verestern. Am einfachsten läuft die Veresterung der in Stellung 21 befindlichen Hydroxylgruppe. Zu hierfür geeigneten Acylierungsmitteln gehören beispielsweise Anhydride, Halogenide (gewöhnlich in Kombination mit einer Base oder einem anderen Säurefänger) und aktive Ester organischer Säuren. Ferner lassen sich solche Acylierungen auch unter Einsatz eines Gemisches aus einer organischen Säure und einem Dehydratisierungsmittel erreichen, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid. Weiter könnei/ι derartige Acylierungen auch enzymatisch durchgeführt werden, wie dies beispielsweise aus US-PS 4 092 473 hervorgeht. Die entsprechenden Acylderivate lassen sich nach ihrer Bildung in bekannter Weise abtrennen und reinigen.
Das 2'-Monoesterderivat läßt sich durch allgemein bekannte selektive Veresterungstechniken herstellen, beispielsweise durch Behandlung des Antibiotikums mit einer stöchiometrischen Menge (oder einer leicht überschüssigen Menge) eines Acylierungsmittels, wie eines Acylanhydrids, bei etwa Raumtemperatur über eine Zeitdauer von etwa 1 bis 24 Stunden bis zur praktischen Beendigung der Veresterung. Der erhaltene 21-
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Monoester kann aus dem Reaktionsgemisch durch übliche Verfahren isoliert werden, beispielsweise durch Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation.
Brauchbare Acylester sind solche organischer Säuren unter Einschluß aliphatischer, cycloaliphatischer, arylischer, aralkylischer oder heterocyclischer Carbonsäuren, Sulfonsäuren und Alkoxycarbonsäuren, die jeweils vorzugsweise 2 bis 18 Kohlenstoffatome, und insbesondere 2 bis 12 Kohlenstoffatome, enthalten.
Zu Beispielen für geeignete Ester gehören Ester von Säuren, wie Essigsäure, Chloressigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isovaleriansäure, Alkoxycarbonsäure, Stearinsäure, Cyclopropancarbonsäure, Cyclohexancarbonsäure, ß-Cyclohexylpropionsäure, 1-Adamantylcarbonsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Phenoxyessigsäure, Mandelsäure oder 2-Thienylessigsäure, von Alky!sulfonsäuren, Arylsulfonsäuren oder Aralkylsulfonsäuren, wobei die Alkylsulfonsäuren und Aralkylsulfonsäuren an ihrem aromatischen Rest gegebenenfalls Substituenten enthalten können, wie Halogen, Nitro oder Niederalkoxy. Zu geeigneten Estern gehören ferner auch die Halbester von Dicarbonsäuren,/wie Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Malonsäure oder Phthalsäure.
Pharmazeutisch unbedenkliche Esterderivate werden bevorzugt. Es sind jedoch auch andere Esterderivate geeignet, wenn auch nur als Zwischenprodukte.
DMOT, Dihydro-DMOT und ihre entsprechenden Acylderivate bilden auch Säureadditionssalze. Die Säureadditionssalze von DMOT, Dihydro-DMOT und ihren Acylderivaten gehören ebenfalls zur Erfindung. Solche Säureadditionssalze eignen sich beispielsweise zur Abtrennung und Reinigung von DMOT, Dihydro-DMOT und ihren Acylderivaten. Darüber hinaus verfügen diese Salze auch über eine bessere Löslichkeit in Wasser.
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Beispiele für geeignete Salze sind solche, die durch übliche Reaktion sowohl mit organischen Säuren als auch mit anorganischen Säuren gebildet werden, beispielsweise mit Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Mucinsäure, D-Glutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glycolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure oder Zimtsäure.
Pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze sind eine besonders bevorzugte Gruppe erfindungsgemäßer Salze. Hierunter werden Salze verstanden, die so wenig toxisch sind, daß sie sich zur chemotherapeutischen Behandlung von Bakterieninfektionen bei warmblütigen Tieren verwenden lassen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf neue Verfahren zur Herstellung von 23-Deoxy-5-0-mycaminosyltylonolid (3) (DOMT) und Dihydro-DOMT durch schwach saure Hydrolyse von DMOT oder Dihydro-DMOT. Die hierfür anzuwendenden schwach sauren Hydrolysebedingungen sind bekannt. Zur Durchführung dieser Hydrolyse lassen sich entsprechende Lösungen mit einem pH-Wert von etwa 4 oder darunter verwenden. Es kann bei Temperaturen von etwa 20 bis 1000C gearbeitet werden. Die zur Durchführung dieser Hydrolyse erforderliche Umsetzungszeit ist abhängig vom pH-Wert des Reaktionsgemisches und der angewandten Temperatur. Bei höheren pH-Werten ist die Reaktionsgeschwindigkeit langsamer, während die Umsetzung bei höheren Temperaturen rascher abläuft. Die Reaktion wird durchgeführt, indem man entweder DMOT oder Dihydro-DMOT solange mit einer schwach sauren Lösung behandelt, bis die Mycarosylgruppe entfernt und das gewünschte DOMT oder Dihydro-DOMT entstanden ist.
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- ίο -
Wahlweise und gelegentlich auch vorzugsweise werden DOMT oder Dihydro-DOMT hergestellt, indem man DMOT oder Dihydro-DMOT in der Fermentationsbrühe, in welcher sie gebildet werden, solange bei den oben beschriebenen schwach sauren Bedingungen umsetzt, bis das DMOT oder das Dihydro-DMOT in DOMT oder Dihydro-DOMT umgewandelt ist. Das auf diese Weise hergestellte DOMT oder Dihydro-DOMT läßt sich in bekannter Weise aus der Fermentationsbrühe isolieren.
DOMT ist identisch mit Deepoxycirramycin A...
Herstellung und Wirksamkeit von Deepoxycirramycin A1 werden in J. Antibiotics 22, (3), 89 bis 99 und 100 bis 105 (1969) beschrieben. Hiernach erfolgt die Herstellung von Deepoxycirramycin A1 durch Behandlung von Cirramycin A1 mit Kaliumiodid in Essigsäure.
Eine andere mögliche Methode zur Herstellung von DOMT geht aus Chemistry Letters 1973, 793 bis 798 hervor. Sie besteht in einer Behandlung des Antibiotikums B-58941 mit Kaliumiodid in Essigsäure unter Bildung eines Produkts, das den darin gemachten Angaben zufolge mit Deepoxycirramycin A1 identisch sein dürfte.
/ DOMT ist ferner auch verwandt mit M-4365 G- (Repromicin) und Rosamicin, und hierbei dürfte es sich um 4·-Hydroxy-M-4365 G2 oder Deepoxy-4l-hydroxyrosamicin handeln (siehe J. Antibiotics 30 (6), 450 bis 454 (1977)). Eine Herstellung von DOMT entweder aus M-4365 G2 oder Rosamicin wäre jedoch unzweckmäßig.
Die Erzeugung von DMOT und Dihydro-DMOT erfolgt, wie oben bereits erwähnt, durch Züchtung eines diese Verbindungen produzierenden Stammes von Streptomyces fradiae unter submersen aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Erzeugung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität. Hierbei wird natürlich das DMOT zuerst gebildet. Das Dihydro-
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DMOT entsteht dann, wenn die Fermentation über eine längere Zeitdauer durchgeführt wird/ so daß es zu einer enzymatischen Reduktion des vorhandenen DMOT kommen kann.
Zum Wachsen von Streptomyces fradiae NRRL 12171 läßt sich irgendeines der verschiedenen Kulturmedien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierung des gewünschten Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Zu bevorzugten Kohlenstoffquellen für eine großtechnische Fermentation gehören beispielsweise Kohlehydrate, wie Dextrin, Glucose, Stärke oder Maismehl, oder auch, öle, wie Sojabohnenöl. Zu bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maismehl, Sojabohnenmehl, Fischmehl oder Aminosäuren. Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien einverleibt sein können, gehören die üblichen löslichen Salze, welche beispielsweise Ionen von Eisen, Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat oder Nitrat liefern.
Im Kulturmedium sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die zum Wachstum und zur Entwicklung des Mikroorganismus erforderlich sind. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in so, hoher Menge vor, wie sie für ein Wachsen des Mikroorganismus erforderlich sind. Besteht das Problem einer zu starken Schaumbildung, dann kann erforderlichenfalls der Zusatz kleiner Mengen (nämlich Mengen von etwa 0,2 ml/1) eines Antischaummittel, wie Polypropylenglykol (mit einem Molekulargewicht von etwa 2000) zu großtechnischen Fermentationsmedien erforderlich sein.
Zur Bildung wesentlicher Mengen an DMOT oder Dihydro-DMOT wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen an DMOT oder Dihydro-DMOT lassen sich auch durch Züchtung in Schüttelkolben erreichen. Infolge der verzögerten Produktion des Antibiotikums bei einer Beimpfung
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großer Tanks mit der Sporenform des Organismus wird vorzugsweise ein vegetatives Impfgut verwendet. Die Herstellung eines solchen vegetativen Inoculums erfolgt durch Beimpfen eines kleinen Volumens an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus, wodurch man zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das hierdurch erhaltene vegetative Inoculum läßt sich dann in einen größeren Tank übertragen. Das für das vegetative Inoculum verwendete Medium kann das gleiche sein wie es auch für größere Fermentationen verwendet wird, es lassen sich hierfür jedoch auch andere Medien einsetzen.
Streptomyces fradiae NRRL 12171 kann bei Temperaturen zwischen etwa 10 und 370C wachsen. Zu einer optimalen Bildung an Antibiotikum scheint es bei einer Temperatur von etwa 280C zu kommen.
Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird auch bei vorliegendem Verfahren durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Für eine entsprechend wirksame Bildung an Antibiotikum soll die prozentuale Luftsättigung bei einer Tankproduktion etwa 30 % oder darüber betragen (bei 280C
und 1 bar Druck).
Die Bildung des Antibiotikums läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Brühe gegenüber Organismen untersucht, von denen man weiß, daß sie gegen diese Organismen empfindlich sind. Ein hierzu brauchbarer Versuchsorganismus ist Staphylococcus aureus ATCC 9144. Der Bioversuch wird normalerweise durch eine automatische turbidometrische Methode durchgeführt. Darüber hinaus läßt sich die Bildung an Antibiotikum auch ohne weiteres durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter UV-Detektion überwachen.
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Nach erfolgter Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man das DMOT oder das Dihydro-DMOT unter Anwendung von in der Fermentationstechnik üblichen Methoden aus dem Fermentationsmedium gewinnen. Der Gewinnung von DMOT oder Dihydro-DMOT geht eine anfängliche Filtration der Fermentationsbrühe voran. Die hierdurch erhaltene filtrierte Brühe läßt sich dann gewünschtenfalls weiter reinigen, wodurch man zum gewünschten Antibiotikum gelangt. Diese Reinigung kann unter Anwendung der verschiedensten Techniken durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren für die filtrierte Brühe besteht darin, daß man den pH-Wert der Brühe auf 9 einstellt, die Brühe mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert, wie Ethylacetat, Amylacetat oder Methylisobutylketon, die organische Schicht mit einer wäßrigen sauren Lösung extrahiert und das Antibiotikum dann durch Basischstellen des wäßrigen Extrakts ausfällt. Das hierdurch erhaltene Antibiotikum kann gewünschtenfalls dann durch Extraktion, Adsorption und/oder Umfällung weiter gereinigt werden.
Der Mikroorganismus
Der erfindungsgemäße neue Mikroorganismus wird erhalten durch chemische Mutagenese eines tylosinproduzierenden Stam·^· mes von Streptomyces fradiae. Der durch Mutagenese erhaltene Mikroorganismus produziert lediglich minimale Mengen Tylosin, bildet DMOT jedoch als überwiegende Komponente.
Der neue Organismus ist zur Charakterisierung mit dem Stamm Streptomyces fradiae M48-E 2724.1 verglichen worden, nämlich einem von Streptomyces fradiae NRRL 2702 abgeleiteten tylosinproduzierenden Stamm. Der Stamm Streptomyces fradiae NRRL 2702 wird in US-PS 3 178 341 beschrieben. Die tylosinproduzierende Kultur von Streptomyces fradiae M48-E 2724.1 wird im folgenden auch einfach als E2724.1 bezeichnet.
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Der neue DNDT- und Dihydro-DMDT-produzierende Stamm NRRL 12171 stellt ebenfalls einen Stamm von Streptomyces fradiae dar. Die Charakterisierung dieses Mikroorganismus erfolgte unter Anwendung der vom Internationalen Streptomyces Projekt zur Charakterisierung von Streptomyces-Arten empfohlenen Methoden (Internal. Journal of Systematics Bacteriology 16 (3), 313 bis 340 (1966)-, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, Seite 815, und Internal. Journal of Systematic Bacteriology 18 (2), 118 (1968)).
Die folgende Beschreibung des DMOT-produzierenden Stammes stellt einen Vergleich seiner charakteristischen Eigenschaften mit den Eigenschaften des tylosinproduzierenden Stammes Streptomyces fradiae E2724.1 dar.
Charakterisierung des Mikroorganismus
Die Sporenkettenmorphologie des neuen Stammes und des Stammes E2724.1 liegt im Abschnitt des Retinaculum-Apertum (RA). Die Haken, Schlaufen und irregulären Spiralen sind kurz und haben im allgemeinen keinen großen Durchmesser. Dies läßt sich am besten auf ISP#2 (Hefe-Malzextrakt-Agar) für den Stamm E2724.1 und auf Czapek-Lösung-Agar für den neuen Stamm beobachten. Die Sporenoberfläche ist glatt. Die Sporenform ist spährisch mit einer mittleren Größe von 0,65 μΐη Durchmesser. Der Durchmesserbereich liegt zwischen 0,61 und 0,71 um.
Die auffälligsten Unterscheide zwischen diesen Stämmen liegen in ihren Züchtungseigenschaften. Der Stamm E2724.1 bildet auf den meisten Medien ziemlich leicht Luftmycelien und ist weiß gefärbt. Der DMOT-produzierende Stamm bildet, wenn überhaupt, nur sehr wenig Luftmycelien. Diese sind dann weiß bis grau gefärbt. Auf den Unterseiten dieser Kolonien sind keine unterscheidbaren Pigmente vorhanden. Sie sind hell bis mittelgelb gefärbt. Die Bildung an Melamoidpigment ist negativ1.
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Die Bildung an Melanoidpigment wird unter Verwendung von ISP#1 (Trypton-Hefeextrakt-Brühe), ISP#6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), ISP#7 (Tyrosin-Agar) und ISP#7 Agar ohne Tyrosin untersucht.
Die wichtigen Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen dem Stamm E2724.1 und dem erfindungsgemäßen Stamm gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.
Tabelle I Vergleich zwischen Streptomyces fradiae E2724.1 und NRRL 12171
Ähnlichkeiten Unterschiede ^*
Sporenkettenmorphologie Kulturcharakteristiken
Sporenoberflächenornamentierung NaCl-Verträglichkeit
Sporengröße pH-Bereich
Fehlen von Chromogenität Temperaturbereich
Fehlen löslicher Pigmente
Wachstum in ausgewählten vegetativen Medien
Stärkehydrolyse '
Negative Reaktion in Magermilch σι
Nitratreduktion '
Positive Katalase
Positive Phosphatase
Negative Urease
Antibiotisches Empfindlichkeitsmuster
Kohlenstoffverwertung
Gelatineverflüssigung
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Wachstumscharakteristiken und Morphologie der Stämme Streptomyces fradiae E2724.1 und NRRL 12171 gehen vergleichsweise aus der folgenden Tabelle II hervor. In den sich daran anschließenden Tabellen sind vergleichend die antibiotischen Empfindlichkeiten (Tabelle III), die Kohlenstoffverwertung (Tabelle IV) und verschiedene physiologische Eigenschaften (Tabelle V) angegeben.
Tabelle II
Wachstumscharakteristiken und Morphologie E2724.1 NRRL 12171
Sporophoren 1 RA
Sporenketten >10
Sporenoberfläche G2 R Am Sp glatt
Sporenform G R Am Sp sphärisch
ISP#2 G R Am Sp gut 87. m. gelb gut 263. "weiß nichts
ISP#3 schlecht 263. weiß schlecht 263. weiß nichts
ISP#4 reichlich 87. m. gelb reichlich 263. weiß nichts
RA
glatt sphärisch
mittelmäßig 87. m. gelb nichts nichts
kein Wachstum
gut
87. m. gelb gut 92. y. weiß nichts
Tabelle II Wachstumscharakteristiken (Fortsetzung)
G R Am Sp E2724.1
ISP#5 G R Am Sp gut 86.1 gelb gut 92. y. weiß nichts
ISP#7 G R Am Sp reichlich 87. m. gelb reichlich 263. weiß nichts
Bennett G R Am Sp schlecht 90. gy. gelb nichts nichts
Calciummalat G R Am Sp gut 263. weiß gut 263. weiß nichts
Czapek gut 87. m. gelb reichlich 263. weiß keines
NRRL 12171
gut
86.1 gelb Spur 93. y. grau nichts
gut
87. m. gelb gut 264.1 grau hellbraun
kein Wachstum
schlecht 92f y. weiß keines keines
gut
87. m. gelb gut 92. y. weiß nichts
Glucose-Asparagin
Am
Sp
Tomatenpaste- G Hafermehl R Am Sp
Tabelle II Wachstumscharakteristiken (Fortsetzung)
E2724.1
kein Wachstum
NRRL 12171 kein Wachstum
reichlich 92. y. weiß reichlich 263. weiß nichts
gut 87. m. gelb
nichts nichts
Die Oberflächenornamentierung wird unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskops bestimmt.
"G = Wachstum, R = Rückseite oder Unterseite der Kolonie, Am = Luftmycel, Sp = lösliches Pigment
Die Zuordnung der Farbbezeichnungen.erfolgt unter Verwendung der Farbkarten ISCC-NBS. (K. L. Kelly und D. B. Judd, "The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106," U.S." Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington, D.C. 20234
Tabelle III
Antibiotische Empfindlichkeit c
Antibiotikum
Konzentration Verbindungsklasse
E2724.1
Chloramphenicol Erythromycin Cephaloridin Lincomycin Polymyxin B Streptomycin Tetracyclin Vancomycin
30 μ9 Nitrophenyl
15 μς Makrolid
30 μg ß-Lactam
2 μ% Lincosaminid 300 Einheiten Peptid
1 0 μg Aminog lycos id
30 μg Tetracyclin
30 μg __ Glycopeptid
NRRL 12171
Bestimmt unter Verwendung von Empfindlichkeitsscheiben, die auf angeimpfte Agarplatten geklotzt sind.
- = Resistenz (keine Hemmzonen) + = Empfindlichkeit (Hemmzonen) S= Spur an Empfindlichkeit
Tabelle IV KohlenstoffVerwertung
a, b
Kohlenstoffquelle
E2724.1
NRRL 12171
Kontrolle: Kein Kohlenstoff Kontrolle: Glucose L-Arabinose D-Fructose D-Galactose i-Inosit D-Mannit Raffinose SaIicin Sucrose D-Xylose D-Rhamnose
- = Keine Verwertung + = Verwertung
^Bestimmt unter Verwendung von Grundmedium gemäß dem Internationalen Streptomyces Projekt (ISP)#9 (Kohlenstoffverwertungsagar) unter Zusatz von durch Filtrieren sterilisierten Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 %. Die Platten werden bei 3O0C bebrütet und nach 7 Tagen sowie nach 12 Tagen ausgewertet.
Tabelle V Verschiedene physiologische Eigenschaften
E2724.1 NRRL 12171
ISP#1 (Chromogenität) - - „,·
ISP#6 (Chromogenität) - -
ISP#7 (Chromogenität) - -
Gelatineverflüssigung - -
Reaktion in Magermilch - . -
pH-Wachstumsbereich1'2 6,1 bis 8,8 6,1 bis 7,8
1 3
Temperaturwachstumsbereich ' 10 bis 37°C 10 bis 3O0C
NaCl-Verträglichkeit1'4 " — 8 % 4 %
Stärkehydrolyse5 + +
Nitratreduktion + +
Katalase + +
Phosphatase + + Urease . -
Bestimmt unter Verwendung von Medium ISP#2 (Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar) sowie unter 7-tägiger Bebrütung.
Ermittelt unter Verwendung folgender Puffer in einer jeweils 0,05-molaren Konzentration: Zitronensäure, pH-Werte 3, 4 und 5t 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, pH-Wert 6> 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, pH = 7; N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, pH = 8; 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-i,3-propandiol, pH = 9; 3-Cyclohexylamino-1,1-propansulfonsäure, pH = 10,
Tabelle V (Fortsetzung)
Der pH-Wert des Agars nach 7-tägiger Bebrütung wird als korrekter Wert angesehen, da einige der verwendeten Puffer ihren eingestellten pH-Wert nicht beibehalten. Die Toxizität der Puffer wird ermittelt, indem man alle Puffer auf pH 7,0 einstellt .und das Wachstum untersucht. Hierbei läßt sich keinerlei Toxizität beobachten.
3Untersucht bei 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 und 55°C
Gemessen durch Zugabe von Natriumchlorid zum Agar in folgenden Mengen: 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 12 Gew.-%
Die Bestimmung der Stärkehydrolyse erfolgt durch Untersuchung der Anwesenheit von ι
Stärke mittels Iod auf Platten von ISP#4 (anorganische Salze-Stärke-Agar) w
Die Enzymuntersuchungen werden unter Befolgung der Methoden von Blazevic und Ederer ' durchgeführt (D. J. Blazevic und G. M. Ederer, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology," John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1975).
230762 2
Auf Basis der oben angeführten charakteristischen Eigenschaften wird der DMOT und Dihydro-DMOT bildende Mikroorganismus, nämlich der Organismus NRRL 12171, als neuer Stamm von Streptomyces fradiae klassifiziert. Er ist in der KuI-turensammlung von Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, hinterlegt und kann von dort unter der Nummer NRRL 12171 frei bezogen werden.
Der Mikroorganismus Streptomyces fradiae NRRL 12171 ist genauso wie auch andere Organismen einer Variation zugänglich. So lassen sich beispielsweise Rekombinanten, Mutanten oder künstliche Varianten des Stammes NRRL 12171 herstellen, indem man diesen Stamm mit verschiedenen bekannten physikalischen und chemischen mutagenen Mitteln behandelt, Wie beispielsweise Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Alle natürlichen und künstlichen Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Streptomyces fradiae NRRL 12171, die die charakteristische Bildung von DMOT beibehalten, können erfindungsgemäß verwendet werden.
/ . Wirksamkeit der DMOT-Verb'indungen
Die DMOT-Verbindungen hemmen das Wachstum pathogener Bakte-: rien, und zwar insbesondere grampositiver Bakterien und Species von Mycoplasma. Aus der folgenden Tabelle VI gehen beispielsweise die Werte für die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC-Werte) hervor, gemessen durch die üblichen Agar-Verdünnungs-Versuche, in denen DMOT (freie Base) bestimmte Bakterien hemmt.
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Tabelle VI Wirksamkeit der freien Base von DMOT in vitro
Organismus MIC (p,g/ml)
Streptococcus pyogenes C203 0,25
Streptococcus pneumoniae Park I 0,13
Streptococcus sp. (Group D) 28 2 0,5
Staphylococcus aureus 3055 1,0
Pasteurella multocida 6,25
Pasteurella hemolytica 25,00
Mycoplasma gallisepticum 0,097
Mycoplasma hyopneumoniae 0;39
Mycoplasma hyorhinis 0,78
(MIC = Minimale Hemmkonzentration)
Die DMOT-Verbindungen haben sich auch in vivo gegenüber experimentellen Bakterieninfektionen als antibiotisch wirksam erwiesen. Zu diesem Zweck verabreicht man Mäusen mit experimentell hervorgerufenen Infektionen zwei Dosen der jeweils zu untersuchenden Verbindung und ermittelt die sich hierdurch ergebende Wirksamkeit in Form des jeweiligen ED50-Wertes (wirksame Dosis in mg/kg, die einen 50 %-igen Schutz der untersuchten Tiere ergibt, J. Bacteriol. 81, 233 bis (1961)). Der hierbei für DMOT erhaltene ED5Q-Wert geht aus der folgenden Tabelle VII hervor.
230762 2
Tabelle VII
ED50-Wert von DMOTa
Streptococcus Untersuchte Verbindung pyogenes C203
Freie Base von DMOT 6,3
Bakterielle Herausforderung
(X-LD50) 268
subkutan, mg/kg χ 2
Zur Verhinderung oder Behandlung von Infektionen durch Mycoplasma bei Geflügel verabreicht man solchen Tieren oral oder parenteral eine wirksame nichttoxische Menge einer DMOT-Verbindung. Die DMOT-Verbindungen werden meistens zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger verabfolgt, beispielsweise dem Trinkwasser der Tiere.
Ausführungsbeispiele: /
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.
Beispiel 1 A. Schüttelkolbenfermentation von DMOT
Ein lyophilisiertes Pellet von Streptomyces fradiae NRRL 12171 wird in 1 bis 2 ml sterilem Wasser dispergiert. Mit einer Teilmenge der hierdurch erhaltenen Lösung (0,5 ml) beimpft
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man dann ein vegetatives Medium (150 ml) folgender Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (%)
Maisquellwasser ' 1/0
Hefeextrakt 0,5
Sojabohnenschrot 0,5
CaCO3 0,3
Sojabohnenöl (roh) 0,45
Deionisiertes Wasser 97,25
Statt dessen kann man auch eine in flüssigem Stickstoff aufbewahrte vegetative Kultur von Streptomyces fradiae NRRL 12171 in jeweils einem Volumen von 1 ml verwenden, rasch auftauen und zum Beimpfen des vegetativen Mediums verwenden.
Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei 29°C über eine Zeitdauer von etwa 48 Stunden in einem verschlossenen Schüttelkasten bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM bebrütet.
Mit dem hierdurch erhaltenen bebrüteten vegetativen Medium (0,5 ml) beimpft man dann 7 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (%)
Rübenmelasse 2,0
Maismehl 1,5
Fischmehl 0,9
Maisgluten 0,9
NaCl · 0,1
J 0,04
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Bestandteile . Menge (%)
CaCO3 0,2
Sojabohnenöl (roh) 3,0
Deionisiertes Wasser 91,36
Das inokulierte Fermentationsmedium wird in einem 50 ml fassenden Kolben bei 290C über eine Zeitdauer von etwa 6 Tagen auf einen geschlossenen Kastenschüttler bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM bebrütet.
» B. Tankfermentation von DMOT
Zur Bildung eines größeren Volumens an Inoculum verwendet man 60 ml des inkubierten vegetativen Mediums, das in ähnlicher Weise wie oben unter Abschnitt A. beschrieben hergestellt wird, zum Beimpfen von 38 1 eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe mit folgender Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (%)
Maisquellwasser j 1,0
Sojabohnenölmehl ' 0,5
Hefeextrakt 0,5
CaCO3 0,3
Sojabohnenöl (roh) 0,5
Lecithin (roh) 0,015
Wasser 97,185
Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt.
Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe wird in einem 6 8 fassenden Tank etwa 47 Stunden bei 29°C bebrütet.
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Mit dem auf diese Weise erzeugten inkubierten Medium der zweiten Stufe (4 1) beimpft man hierauf 40 1 steriles Produktionsmedium folgender Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (%)
Fischmehl 0,9188
Maismehl 1,575
Maisgluten " 0,9188
CaCO3 0,210
NaCl 0,105
(NH4J2HPO4 0,042
Rübenmelasse 2,10
Sojabohnenöl (roh) 3,15
Lecithin 0,0945
Wasser 90,8859
Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 7,2 eingestellt.
Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 68 1 fassenden Tank etwa 5 Tage bei 280C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit ster/ler Luft belüftet, um hierdurch die Menge an gelöstem Sauerstoff zwischen etwa 30 und 50 % zu halten, und es wird mittels herkömmlicher Rührer bei einer Geschwindigkeit von etwa 300 UpM gerührt.
Beispiel 2 Isolierung von DMOT
Die nach Beispiel 1 erhaltene Fermentationsbrühe mit einem pH-Wert von 7,2 wird mittels einer Filterhilfe filtriert. Das erhaltene Filtrat (1450 ml) wird mit Ethylacetat (400 ml) ver-
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setzt. Der pH-Wert der Lösung wird mittels Natriumhydroxid auf 9,1 eingestellt. Die Lösung wird 10 Minuten gerührt, und das Ethylacetat wird dann abgetrennt (durch Filtrieren mittels einer Filterhilfe zur Klärung irgendeiner eventuell entstehenden Emulsion). Das Filtrat wird erneut mit Ethylacetat (200 ml) extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden mit Wasser (200 ml) versetzt, und der pH-Wert dieser Lösung wird dann mit Phosphorsäure auf 4,1 eingestellt. Nach Extraktion wird die wäßrige Schicht abgetrennt und die organische Schicht verworfen. Die wäßrige Schicht wird mit Natriumhydroxid auf pH 9,1 eingestellt und dann unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 100 ml eingeengt. Es entsteht ein amorpher Niederschlag. Nach Stehenlassen über Nacht wird der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wird in Aceton (20 ml) gelöst und die Lösung mit Wasser (75 ml) versetzt. Zur Entfernung des Acetons wird die Lösung unter Vakuum eingeengt. Der hierdurch entstehende Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wodurch man zu etwa 500 mg DMOT gelangt. Aus dem Filtrat erhält man in ähnlicher Weise weitere 260 mg.
Beispiel 3 Herstellung von DOMT
Man löst das gemäß Beispiel 2 hergestellte DMOT (11 g) in einer verdünnten Chlorwasserstoffsäurelösung (Zugabe von HCl zu Wasser,, bis die Lösung einen pH-Wert von 1,8 hat). Die erhaltene Lösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann durch Zusatz von Natriumhydroxid auf pH 9,0 eingestellt. Die basische Lösung wird hierauf mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 9,65 g DOMT gelangt.
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Aus der beiliegenden Zeichnung geht das Infrarotabsorptionsspektrum von DMOT (freie Base) in Chloroform hervor. DMOT ist ein weißer amorpher Feststoff, der bei etwa 1580C erweicht und bei etwa 165 bis 167°C schmilzt. Eine Elementaranalyse ergibt folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff = 62 %, Wasserstoff = 8 %, Stickstoff = 2 %, Sauerstoff = 27 %. DMOT hat die empirische Formel C38H63NO12 und ein Molekulargewicht von etwa 726 (725 gemäß einer Bestimmung durch Massenspektrometrie).
Das Infrarotabsorptionsspektrum von DMOT (freie Base) in Chloroform geht ebenfalls aus der Zeichnung hervor. Bei den im folgenden angegebenen Frequenzen (cm ) lassen sich Absorption smaxima feststellen: 3653 (schmal), 3588 (Schulter), 3470 (breit), 3026 (Schulter), 2998 (Schulter), 2969 (stark), 2932 (stark), 2873 (Schulter), 1709 (stark), 1669 (mittel), 1616 (sehr schmal), 1583 (stark), 1447 (mittel), 1400 (mittel), 1364 (mittel), 1309 (mittel), 1278 (schmal), 1175 (mittel), 1151 (mittel), 1106 (schmal), 1066 (Schulter), 1036 (stark), 1001 (mittel), 982 (mittel), 972 (Schulter), 946 (schmal), 913 (sehr schmal), 891 (sehr schmal), 853 (sehr schmal), 826 (schmal).
Das ültraviolettabsorptionsSpektrum von DMOT in neutralem Ethanol weist ein Absorptionsmaximum bei 283 ran (£= 21 500) auf.
DMOT (freie Base) hat folgenden spezifischen Drehwert: 5 = -62,75° (c = 1, CH3OH).
Eine elektrometrische Titration von DMOT in 66 %-igem wäßrigem Dimethylformamid ergibt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von etwa 7,3.
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Die freie Base von DMOT ist schlecht löslich in Wasser, in den meisten polaren organischen Lösungsmitteln dagegen löslich, wie Aceton, Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Chloroform oder Dimethylsulfoxid. Die Säureadditionssalze von DMOT sind in Wasser besser löslich als die Base von DMOT.
DMOT läßt sich von Tylosin und von DOMT durch Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie unterscheiden. Die ungefähren Rf- und Rx-Werte dieser Antibiotika gehen aus den folgenden Tabellen VIII und IX hervor. In Tabelle VIII ist der Rx-Wert das Verhältnis der Bewegung im Verhältnis zur Bewegung von Tylosin, welchem der Wert 1,0 zugeordnet wird. Die Detektion erfolgt bioautographisch unter Verwendung von Bacillus subtilis.
Tabelle VIII Dünnschichtchromatoqraphie von DMOT
Verbindung
Tylosin DMOT DOMT
Medium: Merck, Darmstadt - Silicagel 60
Lösungsmittel: A = Ethylacetat:Diethylamin (96:4)
B = Aceton:Ethanol (2:1) C = Chloroform:Methanol (3:1)
Ab Rf-Werte B 0 C
,53 ,53 0 ,67
0 ,70 0 ,56 0 ,67
0 ,48 0 ,17 ,24
0 0
2307 6 2 2
Tabelle IX Papierchromatographie von DMOT
Rx-Werte Verbindung ' D E
Tylosin 1,00 . 1,00
DMOT 1,50 1,09
DOMT 0,50 0,97
aPapier: Whatman No. 1 mit 0,75-molarem KH2PO4-PUffer vom pH 4,0 behandelt und getrocknet
Lösungsmittel: D = mit Wasser gesättigtes Ethylacetat
E = mit Wasser gesättigtes n-Butanol
Beispiel 4 Herstellung von Dihydro-DMOT
Man löst das nach Beispiel 2 hergestellte DMOT (50 mg) in einer wäßrigen Isopropylalkohollösung (etwa 40 %, 25 ml). In einer 30 %-igen wäßrigen Isopropylalkohollösung (10 ml) löst man Natriumborhydrid (20 mg). Die Natriumborhydridlösung (1 ml wird dann zur DMOT-haltigen Lösung gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 5 Minuten gerührt, mit Phosphorsäure auf pH 7,5 eingestellt und dann zur Entfernung des Isopropylalkohols unter Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wird mit Chloroform (50 ml) versetzt. Der pH-Wert der wäßrigen Schicht wird auf 7,5 eingestellt. Nach Extraktion wird das Chloroform abgetrennt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man zu Dihydro-DMOT gelangt.
23076 2 2
Beispiel 5 Herstellung von Dihydro-DOMT
Das nach Beispiel 4 hergestellte Dihydro-DMOT wird genauso behandelt wie bei Beispiel 3, wodurch man Dihydro-DOMT erhält.
Beispiel 6 Anderes Verfahren zur Herstellung von DOMT
Zur Herstellung von DOMT aus DMOT behandelt man DMOT in der Fermentationsbrühe, in der es gebildet wird, mit einer schwachen Säure nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. Die Isolierung von DOMT erfolgt nach einem ähnlichen Verfahren wie für DMOT bei Beispiel 2.
Beispiel 7
2' -O-Acetyl-DMOT
Man löst DMOT (5,0 g, 6,9 mMol) in Aceton (150 ml) und behandelt die erhaltene Lösung dann unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit 0,84 ml (8,2 mMol) Essigsäureanhydrid. Nach 17-stündigem Rühren wird das Lösungsmittel unter verringertem Druck verdampft. Der Rückstand wird in einem kleinen Volumen Ethylacetat gelöst und die Lösung über SiIicagel (Waters Prep 500) chromatographiert. Zur Eluierung wird Ethylacetat (4 1) verwendet. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 4,2 g (80 %) 2'-O-Acetyl-DMOT gelangt.
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Beispiel 8 2 '-O-Acetyl-4''-O-phenylacetyl-DMQT
Man löst 2 · -O-Acetyl-DMOT (2,7 g, 3,5 iriMol) in Methylenchlorid (70 ml) und Pyridin (0,8 ml) und behandelt die erhaltene Lösung tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 0,56 ml (3,5 mMol) Phenylacetylchlorid in Methylenchlorid (30 ml). Nach 6-stündigem Rühren wird das Lösungsmittel verdampft, worauf man den Rückstand in Methylenchlorid löst und die Lösung mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt, getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst und die Lösung über Silicagel (Waters Prep 500) chromatographiert. Die Säule wird mit Ethylacetat (4 1) eluiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und dann zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 1,2 g (38 %) 2'-O-Acetyl-4'·-O-phenylacetyl-DMOT gelangt.
Beispiel 9 2'-O-Acetyl-4''-0-isovaleryl-DMOT
In ähnlicher Weise behandelt man auch 1,2 g (1,6 mMol) 2'-O-Acetyl-DMOT in Pyridin (29 ml) unter Rühren bei O0C mit 0,7 m (3,8 mMol) Isovalerylchlorid. Nach üblicher Aufarbeitung wird das Rohprodukt in Toluol gelöst und die Lösung durch Schnellchromatographie über Silicagel chromatographiert. Die Säule wird mit Gemischen aus Toluol-Ethylacetat (9:1 bis 1:2) eluiert, wodurch man zu 0,12 g Produkt gelangt. Die anschließende Eluierung der Säule mit Methylenchlorid ergibt 0,84 g (55 %) 2'-O-Acetyl-4 "-O-phenylacetyl-DMOT.
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Beispiel 10 4''-O-Isovaleryl-DMOT
Man löst 2'-O-Acetyl-4·'-O-isovaleryl-DMOT (0,4 g, 0,47 mMol) in 80 %-igem wäßrigem Methanol (30 ml) und erhitzt die erhaltene Lösung 4,5 Stunden auf Rückflußtemperatur. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 0,13 g (34 %) 41·-O-Isovaleryl-DMOT gelangt.
Beispiel 11 4''-O-Phenylacetyl-DMOT
Man löst 2'-O-Acetyl-4''-O-phenylacetyl-DMOT (0,2 g, 0,23 mMol) in 80 %-igem wäßrigem Methanol (18 ml) und erhitzt die Lösung 5 Stunden auf Rückflußtemperatur. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft, wodurch man 0,16 g (86 %) 4''-O-Phenylacetyl-DMOT erhält.
I Beispiel 12
2'-O-Acetyl-4''-O-propionyl-DMOT
Man löst 2'-O-Acetyl-DMOT (1,0 g, 1,3 mMol) in Pyridin (30 ml) und behandelt die erhaltene Lösung tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur mit 0,6 ml (4,6 mMol) Propionsäureanhydrid. Nach 20 Stunden gibt man weitere 3,0 ml (23 mMol) Propionsäureanhydrid zu und rührt das Reaktionsgemisch dann bei Raumtemperatur noch 26 Stunden. Das Gemisch wird hierauf mit Toluol (30 ml) verdünnt, und die Lösungsmittel werden unter verringertem Druck verdampft. Das zurückbleibende öl wird in Di-
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chlormethan (50 ml) gelöst und die Lösung mit gesättigter Natriuxnbicarbonatlösung extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt, getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird auf eine Silicagelsäule gegeben (Waters Prep 500) und mit einem linearen Gradienten von Toluol (4 1) und Ethylacetat (4 1) eluiert. Hierbei werden zuerst 305 mg 2'-O-Acetyl-3,4''-di-O-propionyl-DMOT und dann 286 mg 2'-O-Acetyl-4''-O-propionyl-DMOT eluiert.
Jede der obigen Verbindungen wird in 80 %-igem wäßrigem Methanol auf Rückflußtemperatur erhitzt, wodurch man zu 411-O-Propionyl-DMOT und 3 , 4 * ' -Di-O-propionyl-DMOT gelangt.

Claims (1)

  1. aes 9
    230762 2
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