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Es ist Absicht, wenn hier und in der folgenden Beschreibung der Ausdruck "Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa" und nicht der Ausdruck "Mikroorganismus der Gattung Beggiatoa" verwendet wird. Die Gattung Beggiatoa gehört zur Klasse der "gliding bacteria", welche den Myxobakterien der Familie der Beggiatoaceen zugeordnet werden (s. Bergey 1 s Manual of Determinative
Bacteriology, Eighth Edition, Waverly Press, Baltimore, USA 1974, S. 112 bis 114). Wie man diesem
Werk entnehmen kann, welches auf diesem Gebiet Ansehen geniesst, ist die Klassifizierung der Mikro- organismen dieser Gattung wegen der geringen sicheren verfügbaren Informationen etwas mit Vor- sicht zu geniessen.
Es erscheint deshalb nicht angeraten, sich auf einen so präzisen wissenschaft- lichen Ausdruck wie "Gattung" zu beschränken, wenn man die Unsicherheit der Klassifizierung der fraglichen Mikroorganismen kennt. Der Ausdruck "Mikroorganismen vom Typ Beggiatoa" be- zieht sich also hier auf fadenbildende Bakterien, welche für schwefelhaltige Sole und Wässer charakteristisch sind und deren ungefärbte Fäden - da sie aufeinander gleiten - beweglich und aus
Zellenketten gebildet sind, wie dies beispielsweise bei den Bakterien, die in die Gattung Beggiatoa klassifiziert werden, der Fall ist.
Der Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa wird durch Isolation von Baregin gewonnen. Es wurde festgestellt, dass eine solche Isolierung auf eine spezielle Art möglich ist und dass die dabei erhältlichen Stämme kultivierbar sind und eine präzise feststellbare bakteriostatische Aktivität besitzen. Es wurde schliesslich auch festgestellt, dass das Problem ihrer Konservierung in zufriedenstellender Weise gelöst werden kann.
Zur Isolierung eines Stamms kann man so vorgehen, dass man eine Probe von Baregin auf eine gelosehaltiges Nährmedium aufbringt, 5 bis 36 h bei einer Temperatur von 20 bis 500C inkubiert, eine Zone, wo die Fäden eines Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa frei von Verunreinigungen sind, herausschneidet, diese Zone auf ein mit dem ersten identischen Gelose enthaltendes Nährmedium aufbringt und die Operationen der Inkubation, des Herausschneidens und Wiedereinsetzens zwei-bis dreimal wiederholt.
Vorzugsweise besteht das für die Isolierung verwendete Gelose enthaltende Nährmedium aus 1 bis 4 g Hefeextrakt und 10 bis 20 g Agar/l Wasser.
Gleichfalls enthält das für die Kultivierung bevorzugte wässerige Nährmedium 1 bis 4 g Hefeextrakt, 0, 1 bis 0, 3 Calciumchlorid und 0, 2 bis 1 g Natrium-oder Ammoniumacetat/1 Wasser. Um die Kultur zu schützen, kann dem Medium beispielsweise Katalase in einer Menge von 5 bis 20 Internationalen Einheiten (IE) je ml zugesetzt werden. Der Mikroorganismus kann bei einer Temperatur von 20 bis 500C während 5 bis 36 h bei einem p-Wert von 6 bis 8 kultiviert werden.
Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung bei einer Temperatur von 30 bis 40 C während 8 bis 10 h beim neutralen pH-Wert.
Der Stoff mit bakteriostatischer Aktivität, der durch das erfindungsgemässe Verfahren erhalten worden ist, kann im Rohzustand beispielsweise für Hautmassagen oder als Bestandteil von kosmetischen Produkten für die Haut verwendet werden. Die Biomasse kann auch in trockener Form konserviert werden. Sie wird vorzugsweise wegen ihrer schwachen Natur und ihres geringen Feststoffgehalts durch Lyophilisation getrocknet.
Die folgenden Beispiele, welche der Erläuterung dienen, gestatten ein besseres Verständnis der Natur und der Bedeutung der Erfindung. Der Name"Beggiatoa"wird dabei systematisch verwendet und soll im Sinne des Ausdrucks "Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa" verstanden werden.
Beispiel 1 : Isolierung von Stämmen
Eine frische Bareginflocke von den Thermes Nationaux d'Aix-les-Bains wird in die Mitte einer Petri-Schale gebracht, die 20 ml Gelose enthaltendes Medium enthält, das nach folgendem Rezept hergestellt worden ist :
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<tb>
<tb> Hefeextrakt <SEP> (Difco) <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> (Bacto-Difco) <SEP> 15 <SEP> g
<tb> filtriertes <SEP> Thermalwasser <SEP> aus <SEP> Aix <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 900 <SEP> ml.
<tb>
Die Schale wird dann 30 h lang in einen Wärmeschrank mit SDOC eingebracht. Eine Untersuchung mit einem schwach vergrössernden Mikroskop lässt die Anwesenheit von spiralenförmigen
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Strukturen, die für Beggiatoa charakteristisch sind, erkennen und zeigt eine Beweglichkeit der Mikroorganismen auf Grund deren Gleitfähigkeit. Einige sind sogar mit dem blossen Auge sichtbar. Die mikroskopische Untersuchung zeigt ausserdem Zonen, in denen die Beggiatoa-Fäden frei von Verunreinigungen erscheinen. Eine dieser Zonen wird mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten und auf eine frische Agarplatte der gleichen Zusammensetzung wie die erste gelegt, wobei darauf geachtet wird, dass die die Beggiatoa-Fäden aufweisende Oberfläche gegen die frische Oberfläche der neuen Agarplatte zu liegen kommt.
Nun wird erneut 24 h bei 30 C inkubiert. Das Herausschneiden, Umsetzen und Inkubieren wird noch zweimal wiederholt. Auf diese Weise wird eine reine Beggiatoa-Kultur erhalten.
Beispiel 2 : Konservierung der Stämme
Es werden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise 10 Stämme isoliert. Sie unterscheiden sich voneinander durch den Durchmesser ihrer Fäden, ihrer Schnelligkeit im Gleiten und der Form ihrer Kolonien aus Agar. Sie werden mit Erfolg auf drei verschiedenen Wegen während einer kurzen, einer mittleren oder einer langen Periode konserviert.
2. 1.) Kurze Periode : Die Platte wird im Kühlschrank bei 40C konserviert, wobei die Petri-Schale sorgfältig wasserdicht verschlossen wird. Der Stamm wird alle 10 Tage überführt, da der Agar eine Tendenz zum Eintrocknen zeigt.
2. 2.) Mittlere Periode : Es wird ein halbflüssiges Medium mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt :
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<tb>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 2 <SEP> g
<tb> CaCl. <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Natriumacetat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 2 <SEP> g
<tb> filtriertes <SEP> Thermalwasser <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Nach Sterilisation des Mediums wird von Pilzen stammende Katalase in einer Menge von 10 IE/ml zugegeben. Die Katalaselösung wird vorher durch kalte Filtration durch ein Milipore-Filter mit mikroskopischen Poren von 0, 22 pm sterilisiert.
Ein kleiner Würfel des Beggiatoa enthaltenden Agars wird in ein Reagenzglas eingebracht,
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1 ml/Reagenzglas2. 3.) Lange Periode : Es wird eine 24-h-Kultur in einem gerührten Medium in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise hergestellt. Hierauf wird sie zentrifugiert. Die Ausfällung wird mit einer sterilen Ringer-Lösung gewaschen. Dann wird die Ausfällung gefroren und lyophilisiert. Sie wird mehrere Monate im Kühlschrank in einem gut verschlossenen Behälter aufbewahrt. Bei Rehydratation sind die Fadenbruchstücke dazu fähig, sich zu entwickeln.
Beispiel 3 : Kultivierung von Stämmen 3. 1.) Inokulum : Ein kleiner Agarwürfel mit einer Kantenlänge von 5 mm wird aus einer gemäss Beispiel 1 erhaltenen Platte herausgeschnitten. Hierauf wird er in einen 500 ml fassenden Kolben eingebracht, der 100 ml des folgenden Mediums enthält :
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<tb>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Calciumchlorid <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Ammoniumacetat <SEP> l <SEP> g
<tb> filtriertes <SEP> Thermalwasser <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Dieses Medium besitzt einen p-Wert von 6, 6. Der Kolben wird auf einen Orbitalschüttler befestigt, der mit 150 Umdr/min bei einem Kreisradius von 1, 25 cm läuft. Der Kolben wird dort 16 h bei 30 C belassen. Dann wird die erhaltene Kultur mit Hilfe eines Mischers vom Typ Sorvall- - Omnimixer 15 bis 30 s unter sterilen Bedingungen homogenisiert. Die erhaltene Kultur stellt das Inokulum dar.
3. 2). Kultivierung : 5 ml des obigen Inokulums werden in einen 500 ml fassenden Kolben eingebracht, der 100 ml des gleichen Mediums enthält, wie es für die Herstellung des Inokulums verwen-
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det worden ist. Der Kolben wird 24 h bei 30 C auf dem Orbitalschüttler inkubiert. Es werden
0, 8 g Trockenmasse von Beggiatoa/1 Kultur erhalten. Durch Wiederholung dieser Operation mit verschiedenen Stämmen und unter Veränderung der Bedingungen innerhalb der geeigneten Grenzen werden Ausbeuten zwischen ungefähr 0, 5 und 2 g trockenem Beggiatoa/1 Kultur erhalten.
3. 3.) Kontrolle des Wachstums : Die klassische Methode der Nephelometrie, welche auf Bakterienkulturen anwendbar ist, ist bei Beggiatoa wegen seines Wachstums in Form von Flocken nicht anwendbar. Es wird deshalb eine an den betreffenden Fall angepasste Methode verwendet. Es werden alle 2 h Kulturproben entnommen und im Mischer vom Typ Sorball-Omnimixer homogenisiert.
Ihre optische Dichte wird bei 600 nm auf einem Spektralphotometer abgelesen. Die homogenisierte Probe bildet nur sehr langsam ein Sediment und gestattet eine brauchbare Ablesung. Auf diese Weise wird ein Anhaltspunkt auf das Wachstum in direkter Abhängigkeit mit der Anzahl der Zellen erhalten.
3. 4) Bestimmung des Trockengewichts : Die klassische Trocknung im Ofen ergibt bei Beggiatoa keine reproduzierbaren Resultate. Der Grund hiefür ist vermutlich der sehr hohe Wassergehalt.
Aus diesem Grunde werden zur Erzielung reproduzierbarer Resultate nicht weniger als 400 ml Kultur durch Lyophilisation getrocknet.
3. 5.) Bestimmung der bakteriostatischen Aktivität : die klassische Methode der Bestimmung der bakteriostatischen Aktivität des Public Health Laboratory Service Committee, welche in British Med. J. 408 [1965] beschrieben ist, ergibt in diesem speziellen Fall keine zufriedenstellenden Resultate auf Grund der Tatsache, dass dieser Test in einem Reagenzglas ausgeführt wird. Beggiatoa ist in der Tat äusserst aerob, weshalb die Sauerstoffkonzentration in einem Reagenzglas unzufriedenstellend ist. Die Methode wird deshalb angepasst, indem in Schüttelkolben gearbeitet wird, um den Sauerstoffübergang zu verstärken.
Es werden 3 Kolben mit einem Fassungsvermögen von 50 ml vorbereitet, die jeweils 18 ml Nährbouillon (Nutrient Broth Difco) enthält. Die Kolben werden in der ersten und in der zweiten Serie jeweils mit 0, 4 ml einer 24-h-Kultur eines pathogenen Stamms inokuliert. Es werden die drei pathogenen Stämme Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Escherichia coli ATCC 11755 und Staphylococcus aureus ATCC 12600 verwendet.
Es werden Proben des bakteriostatischen Produkts hergestellt, indem eine Kultur zentrifugiert wird, die gemäss Beispiel 3, Ziffer 2, jedoch nur in 8 h erhalten worden ist. Die erhaltene Biomasse wird zentrifugiert und wieder in einem Volumen physiologischer Lösung suspendiert, das gleich dem Volumen des bei der Zentrifugierung verbleibenden Überstands ist. Die die Biomasse enthaltende Lösung und der Überstand werden jeweils in Proben von 2 ml unterteilt.
Den Kolben der ersten Reihe werden 2 ml physiologische Lösung, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugesetzt. Den Kolben der zweiten Reihe werden nur 2 ml der physiologischen Lösung zugegeben. Den Kolben der dritten Reihe, welche nicht mit einem Pathogen inokuliert worden ist, werden 2 ml der physiologischen Lösung, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugesetzt.
Die Kolben werden bei 370C auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Nach 16 h wird ihre optische Dichte bei 600 nm gemessen. Die optischen Dichtemessungen der Kolben entsprechend den Reihen 1, 2 und 3 liefern entsprechende Parameter A, B und C. Die Differenz A bis C, abgezogen von B und dann dividiert durch B und multipliziert mit 100, ergibt die bakteriostatische Aktivität der Biomasse in % Inhibierung.
Auf die gleiche Weise wird die bakteriostatische Aktivität des überstands bestimmt, indem den Kolben der ersten und der dritten Reihe 2 ml Überstand an Stelle von 2 ml physiologischer Lösung, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugegeben werden.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
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<tb>
<tb>
Pathogen <SEP> Aktivität <SEP> der <SEP> Biomasse <SEP> Aktivität <SEP> des <SEP> Überstands
<tb> (% <SEP> Inhibierung) <SEP> (% <SEP> Inhibierung)
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 70 <SEP> 41
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> 100 <SEP> 45
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 70 <SEP> 11
<tb>
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Beispiel 4 : Vergleich
Zum Vergleich wird in der in Beispiel 3, Ziffer 5, beschriebenen Weise die bakteriostatische Aktivität von natürlichem Baregin bestimmt. Nach einer 16 h dauernden Inkubation wird eine prozentuale Inhibierung von 100,83 und 96% gegenüber P. aeruginosa, S. aureus und E. coli gefunden.
Mit andern Worten heisst das, die bakteriostatische Aktivität der gemäss der Erfindung hergestellten Biomasse ist nahezu genauso stark wie diejenige von Baregin. Dies stellt ein bemerkenswertes Resultat dar, wenn man bedenkt, dass die vorliegende Biomasse in einer guten Ausbeute im industriellen Massstab hergestellt werden kann, während das Baregin nur langsam in sehr geringen Mengen erhältlich ist. Die Aktivität des gemäss der Erfindung erhaltenen Überstands ist zwar geringer, ist aber trotzdem von Interesse.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines Stoffs mit bakteriostatischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa durch Isolation aus Baregin gewinnt, in einem Stickstoff und Mineralstoffe enthaltendem wässerigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen und unter Rühren kultiviert, die Biomasse gewinnt und gegebenenfalls lyophilisiert.