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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuen cyclische 9'-Thia- peptidergotalkaloiden der Formel
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oder Benzyl bedeutet, in Form der freien Basen oder ihrer Säureadditionssalze.
Die Verbindungen der Formel (I) können in Form von zwei Isomerengruppen vorliegen, nämlich als Verbindungen mit der Konfiguration 8R und mit der Konfiguration 8S. Die Verbindungen
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tionssalzen, indem man einer flüssigen Kultur von Claviceps purpurea L-Thiazolidin-4-cabonsäure oder ein Salz dieser Säure zugibt, und die erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre Säureadditionssalze überführt.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden :
Als Stämme können Stämme von Claviceps purpurea verwendet werden, sowie solche, die aus einem Ausgangsstamm von Claviceps purpurea durch Mutation, unter Einwirkung von Strahlen oder Behandlung mit mutagenen Substanzen oder Selektion gewonnen werden können.
Zur Herstellung von 9'-Thiaergotamin und 9'-Thiaergotaminin wird beispielsweise als bevorzugter Ergotamin/Ergotaminin produzierender Stamm die Claviceps purpurea Mutante NRRL 12043 verwendet. Eine Kultur davon wurde am 20. 9. 1979 beim United States Department of Agriculture (Northern Regional Research Center), Peoria, Ill., USA, unter Kulturnummer NRRL 12043 deponiert.
Zur Herstellung von 9'-Thiaergocristin und 9'-Thiaergocristinin wird als bevorzugter Ergocristin/Ergocristinin produzierender Stamm die Claviceps purpurea Mutante NRRL 12044 verwendet. Eine Kultur davon wurde am 20. 9. 1979 bei der oben erwähnten Deponierungsstelle unter der Kulturnummer NRRL 12044 deponiert.
Die zur Herstellung der übrigen Verbindungen der Formel (I) verwendbaren Stämme sind bekannt und stehen ebenfalls der Öffentlichkeit zur Verfügung.
Charakteristikum und fermentative Gewinnung der Stämme NRRL 12043 und 12044 a) Charakteristikum des Stammes NRRL 12043
Der Ausgangspilzstamm wurde aus einem auf Bromus im Wallis (Schweiz) gefundene Sklerotium, welches Ergotamin enthielt, isoliert. Durch mehrere mutagene Behandlungsschritte, unter Verwendung von Ultraviolettstrahlen und Chemikalien, gelangte man zu dem erfindungsgemäss verwendeten Stamm NRRL 12043, welcher folgendermassen charakterisiert werden kann :
Es wird ein kleines Mycelstück des Stammes NRRL 12043 im Zentrum einer Agarplatte mit einem Medium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung ausgeimpft :
60 g Saccharose, 10 g Asparagin, 0, 5 g Casamino-Acids (Difco), 0, 25 g KH2P04'0, 25 g MgS04. 7H20, 0, 125 g KC1, 16 mg FeS04. 7H20, 10 mg ZnS04. 7H20, 15 g Agar und dest. Wasser
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messer, nach 14 Tagen von etwa 5 cm und nach 20 Tagen von etwa 8 cm Durchmesser entstanden. Die Kolonie ist gewölbt und leicht gefaltet. Der Rand ist diffus. Die Farbe der Kolonie ist im Zentrum beigeviolett und am Rand beigegrau. Eine 20 Tage alte Kolonie enthält
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pro cm2 zirka 1. 108 Konidien.
Diese sind oval und haben Dimensionen von 6 bis 12 x 4 bis 7 11m. b) Charakteristikum des Stammes 12044
Der Ausgangspilzstamm wurde aus einem auf Roggen in Nordamerika gefundenem Sklerotium, welches Ergocristin enthielt, isoliert. Durch mehrere mutagene Behandlungsschritte, unter Verwen- dung von Ultraviolettstrahlen und Chemikalien, gelangte man zu dem erfindungsgemäss verwendeten
Stamm NRRL 12044, welcher folgendermassen charakterisiert werden kann.
Es wird ein kleines Mycelstück des Stammes NRRL 12044 im Zentrum einer Agarplatte mit einem Medium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung ausgeimpft :
70 g Malzextrakt, 30 g Kartoffeln, 15 g Agar und dest. Wasser ad 1 1. Der PH-Wert beträgt
5, 3 bis 5, 7. Das Medium wird 20 min bei 1200C sterilisiert. Bei 240C ist nach 7 Tagen eine
Kolonie von etwa 2 cm Durchmesser, nach 14 Tagen von etwa 4 cm und nach 20 Tagen von etwa
5 cm Durchmesser entstanden.
Das Mycel ist flach gewölbt und mit einem weissen, in den Luftraum ragenden, watteartigen
Hyphengeflecht bedeckt. Im Zentrum wird ein kraterförmiger Höcker von etwa 1 cm Durchmesser ausgebildet. Von ihm gehen radiale Falten aus. Das dem Agar aufliegende Mycel ist violett gefärbt. Es entstehen konzentrische Zonen mit stärkerer und solche mit schwächerer Pigmentierung.
Der Rand ist diffus. Ein 20 Tage altes Mycel enthält pro cm2 zirka 1. 108 Konidien. Diese streuen in ihren Dimensionen ziemlich stark (5 bis 12 x 3 bis 7 (im ; meist jedoch 5 bis 6x3 j m).
Das Mycel enthält keine Alkaloide.
Vermehrung und Impfstoffherstellung : a) NRRL 12043
Vermehrung und Impfstoffherstellung des Stammes NRRL 12043 können in der Weise erfolgen, dass man von einer der oben beschriebenen Kolonien die Konidien in sterilem Wasser abschwemmt und damit Schrägagarröhrchen mit dem Agarmedium beimpft, bestehend aus : 70 g Malzextrakt, 30 g Kartoffeln, 15 g Agar und dest. Wasser ad 1 1. Der PH-Wert beträgt 5, 3 bis 5, 7. Das Medium wird 20 min bei 120 C sterilisiert. Nach 14 Tagen enthält eine solche Schrägagarkultur (12 ml Medium in einem Reagenzglas von 18 mm Durchmesser und 20 cm Länge, keilförmig ausgelegt) etwa 1. 10 Konidien.
Von einer solchen Schrägagarkultur werden Konidien in sterilem Wasser aufgeschwemmt und dabei eine Konzentration von 106 -107 Sporen/mI hergestellt. Mit je 0, 5 ml dieser Suspension werden Schrägagarröhrchen mit dem gleichen Medium gleichmässig beimpft.
Diese Kulturen werden bei 24 C während 14 Tagen bebrütet. Hierauf werden sie bei-40 C gelagert. b) NRRL 12044
Vermehrung und Impfstoffherstellung des Stammes NRRL 12044 können in der Weise erfolgen, dass man von einer der oben beschriebenn Kolonien die Konidien in sterilem Wasser abschwemmt und damit Sehrägagarröhrchen mit dem oben beschriebenen Agarmedium beimpft. Nach 18 Tagen enthält eine solche Schrägagarkultur (12 ml Medium in einem Reagenzglas von 18 mm Durchmesser und 20 cm Länge, keilförmig ausgelegt) etwa 1 bis 2. 109 Konidien. Von einer solchen Schrägagarkultur werden Konidien in sterilem Wasser aufgeschwemmt und dabei eine Konzentration von 106¯107 Sporen/ml hergestellt.
Mit je 0, 5 ml dieser Suspension werden Schrägagarröhrchen mit
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bebrütet. Hierauf werden sie bei-40 C gelagert.
Vorkulturen
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Sporen erst über Vorstufe (n) heranzuzüchten, bevor das Produktionsmedium angeimpft wird. Anfänglich soll man ein Medium wählen, in welchem gute Sporenkeimung und ein schnelles Mycelwachstum stattfindet. Für ein solches Medium sind geeignet : eine Kohlenstoffquelle in reichlicher Konzentration in Form eines Mono- oder Disaccharids, gegebenenfalls in Kombination mit einem Polyalkohol, eine Stickstoffquelle in Form einer Aminosäure oder eines Ammoniumsalzes, ferner Mineralsalze, Spurenelemente und komplexe Zusätze aus pflanzlichen Samen. Das PH wird vorteilhaft zwischen 5 und 7 eingestellt.
Das Medium wird in der ersten Stufe mit Konidien reichlich beimpft und auf der Schüttelmaschine oder in Fermentern von verschiedenen Grössen bei 22 bis 26 C während 4 bis 7 Tagen inkubiert. Es entsteht eine dichte Kultur aus lockeren, watteartigen,
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2 bis 3 mm messenden, unpigmentierten Mycelflocken, welche aus langen Hyphen von 3 bis 6 (im Durchmesser bestehen.
Hauptkulturen
Mit einem Teil der in einer oder gegebenenfalls mehreren Vorstufen erhaltenen Kultur wird das Produktionsmedium beimpft, welches vorteilhaft eine solche Zusammensetzung aufweist, dass in kurzer Zeit ein hohes Mycelgewicht erreicht wird. Als beste und billigste Kohlenstoffquelle hat sich Saccharose erwiesen, als Stickstoffquelle Ammoniumsalze, wie Oxalat, Citrat, Succinat und Formiat. Ferner sollen Mineralsalze und als Spurenelemente Eisen und Zink zugegen sein.
Die Kulturen werden entweder in Erlenmeyerkolben oder in Fermentern von verschiedenen Grössen durchgeführt. Wichtig ist eine gute Belüftung. Die optimale Temperatur liegt bei 24 C.
Am Anfang der Alkaloidbildung, normalerweise zwischen dem 3. und 6. Tag der Hauptkultur, werden 1 bis 5 g/l L-Thiazolidin-4-carbonsäure oder eines Salzes dieser Säure, z. B. des Kalium-, Natrium- oder Ammoniumsalzes, zur Hauptkultur gegeben. Hierauf werden die Kulturen weiter während 6 bis 12 Tagen bebrütet. Es entsteht im Verlaufe von 9 bis 18 Tagen eine dichte Kultur, die hauptsächlich aus 0, 5 bis 3 mm langen und 0, 1 bis 1 mm dicken zylindrischen kompakten Mycelpartikeln neben feinen Flocken besteht. Die Mycelpartikel zeigen in ihrer Struktur das Bild eines plectenchymatischen Gewebes aus kugeligen oder polyedrischen bis kurzzylindrischen,
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Kulturfiltrat ist ebenfalls bräunlich gefärbt.
Wenn sich die Zunahme des Gewichtes und des Alkaloidgehaltes des Mycels verringert, können nach an sich bekannten Methoden die Alkaloide mit organischen Lösungsmitteln aus dem gesamten Kulturbrei extrahiert werden, oder man trennt das Mycel durch Filtration oder Zentrifuga- tion vom Filtrat und extrahiert beide Teile separat. Der Hauptanteil der Peptidalkaloide ist im Mycel angereichert.
Isolierung der Verbindungen der Formel (I)
Diese schwefelhaltigen Ergotpeptide lassen sich aus der Kulturbrühe, aus dem Kulturfiltrat oder aus dem Mycel durch bekannte extraktive Verfahren isolieren. Die Reinigung erfolgt unter
Anwendung üblicher Reinigungsschritte, z. B. durch Fällungen aus aktiven mit inaktiven Lösung- mitteln oder durch Überführen in schwerlösliche Salze. Besonders geeignet sind bekannte Reinigungsverfahren, z. B. Chromatographie an Aluminiumoxyden, Kieselgelen, quervernetzten Dextrangelen zur Molekularfiltration in den jeweils geeigneten Lösungsmittelsystemen. Wie die bekannten Ergotpeptide sind auch diese neuen 9'-Thiaergotpepide gegen Tageslicht empfindlich. In freier Form und in polaren Lösungsmitteln isomerisieren sie bis zu einem bestimmten Gleichgewicht in die jeweils andere Form.
In Salzform, wie sie z. B. mit Methansulfonsäure hergestellt werden können, sind 9'-Thiaergotamin und 9'-Thiaergocristin über längere Zeit stabil.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen sind in der Literatur bisher nicht beschrieben worden. Sie weisen im Tierversuch interessante pharmakologische Eigenschaften auf und können daher als Heilmittel verwendet werden. Insbesondere zeigen diese Verbindungen eine dopaminrezeptorenstimulierende Wirkung. Die dopaminergenen Eigenschaften konnten an Ratten, bei denen durch eine 6-Hydroxydopamin-Injektion in die substantia nigra eine unilaterale Verletzung der nigro-neostriatalen Dopaminbahn erzeugt wurde, mit Dosen zwischen etwa 0,5 bis 100 mg/kg festgestellt werden (Methode nach U. Ungerstedt, Acta physiol. scand. Suppl. 367,69-93 [1971]).
Nach Verabreichung des Wirkstoffes war eine deutliche Aktivierung dadurch erkennbar, dass die Ratten in Richtung der nicht denervierten Seite rotierten. Die neuen Substanzen können auf Grund ihrer dopaminergen Eigenschaften zur Behandlung von Parkinsonismus Anwendung finden.
Ferner besitzen die neuen Verbindungen eine prolaktinsecretionshemmende Wirkung. So hemmen sie bei der Ratte die Implantationen nach subkutaner Applikation von Dosen zwischen 0, 01 bis 1 mg/kg und die Laktation mit Dosen von 1 bis 10 mg/kg p. o. (Lit. : Experientia 34, 1330 [1978]). Die neuen Substanzen können auf Grund ihrer prolaktinsecretionshemmenden Eigenschaften, z. B. zur Laktationshemmung, Galaktorrhoehemmung, zur Behandlung des hyperprolaktinaemischen Hypogonadismus und der Akromegalie oder zur Behandlung von Prolaktinomen Anwendung finden.
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p.1, 156-173 [1978]). Überdies bewirken sie bei 0, 3 mg/kg i. p. eine Erhöhung des Glukosestoffwech- sels in Hirnnervenkernen sensorischer Informationsverarbeitung (Methode nach L.
Solokoff, Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981, 1, 7-36, H. E. Savaki et al., Brain Research 1982,
233,347 und J. McCulloch et al., Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981, , 133-136).
Auf Grund dieser Resultate sind die neuen Substanzen für die Behandlung der senilen Demenz, insbesondere im Frühstadium, und zur Vigilanzerhöhung geeignet.
Ausserdem besitzen die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen vasokonstruktorische
Aktivität, welche in vitro an Spiralstreifen der Arteria carotis externa des Hundes (E. Müller- - Schweinitzer, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 292,113-118 [1976]), mit Dosen ab
10 nM/l gezeigt werden kann. Auf Grund ihrer vasokonstriktorischen Wirkung werden die neuen
Substanzen zur Behandlung der Migräne verwendet.
Ferner bewirken sie an der Ratte mit zerstörtem Gehirn und Rückenmark (Brit. J. Pharmac.
Chemother. 30 [1967], 78-87) mit einer Dosis von etwa 5 bis etwa 50 gg/kg i. v. einen langanhaltenden pressorischen Effekt, verbunden mit einer Blutdrucksteigerung. An der Mellander-Katze (Engiologica 3 [1966], 77-99) bewirken sie eine starke, dosisabhängige und langanhaltende Konstriktion der Kapazitätsgefässe in Dosen von etwa 0, 5 bis etwa 50 tg/kg i. a. Auf Grund dieser Aktivität können die Substanzen als venentonisierende Mittel Anwendung finden.
Schliesslich bewirken die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen auf Grund der Ergebnisse am Schlaf/Wachzyklus eine serotoninerge Wirkung. Im Hinblick auf diese Wirkung und die Ergebnisse am Ungerstedt-Modell können sie als Antidepressiva, vor allem bei älteren Leuten, Anwendung finden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen enthalten, können unter Verwendung von in der Pharmazie gebräuchlichen Hilfs- und Trägerstoffen hergestellt werden.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden und sind unkorrigiert.
Beispiel ! : 9'-Thiaergotamin und 9'-Thiaergotaminin :
1. Züchtung des Stammes NRRL 12043 a) Vorkultur
Die Konidien einer Schrägagarkultur des Claviceps purpurea Stammes NRRL 12043 (etwa 109) werden in 10 ml sterilem Wasser suspendiert. Mit 1 ml dieser Konidiensuspension werden 200 ml eines Vorkulturmediums folgender Zusammensetzung
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<tb>
<tb> g/l
<tb> Saccharose <SEP> 100
<tb> teilweise <SEP> entfettetes <SEP> Baumwollsamenmehl <SEP> 10
<tb> Ammoniumoxalat <SEP> 3
<tb> Ca <SEP> (N03) <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> KH2 <SEP> PO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> MgS04. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> KCl <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP>
<tb> FeS0 <SEP> 7H20 <SEP> 0,0166
<tb> ZnS04.
<SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 0068
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> l,
<tb>
welches sich in 500 ml Erlenmeyerkolben befindet, angeimpft ; das PH wird mit NH40H auf 6, 5
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eingestellt. Das Medium wird 20 min bei 1200 sterilisiert. Diese Vorkultur wird bei 24 rotierend 5 Tage geschüttelt (180 Umdr/min, 5 cm Kreis).
Am Ende des Wachstums hat die Kultur einen PH-Wert von 5,3 und ein Myceltrockengewicht von 22 g/l. b) Hauptkultur
Mit 10 ml der Vorkultur werden 50 ml eines Hauptkulturmediums folgender Zusammensetzung
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<tb>
<tb> g/l
<tb> Saccharose <SEP> 240
<tb> Ammoniumoxalat <SEP> 9,6
<tb> Ca <SEP> (NO <SEP> . <SEP> 4H2O <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> MgS0. <SEP> 7H <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> KH2P04 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> KCl <SEP> 0,312
<tb> FeSO <SEP> 4. <SEP> 7H2 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0252
<tb> ZnS04. <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 0102 <SEP>
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> l,
<tb>
welches sich in 500 ml Erlenmeyerkolben befindet, angeimpft ; das PH wird mit NH 40H-25%ig auf 6,2 eingestellt. Das Medium wird 20 min bei 1100 sterilisiert.
Diese Kultur wird bei 24 auf einer Rundschüttelmaschine (180 Umdr/min, 5 cm Kreis) inkubiert. Nach 4 Tagen Bebrütungszeit werden pro Kultur 90 mg L-Thiazolidin-4-carbonsäure zugegeben. Die Kulturen werden noch 10 Tage auf der Rundschüttelmaschine inkubiert. Nach beendeter Fermentation werden die Kulturen abfiltriert. Das Mycelium wird schonend getrocknet. Das Trockenmycelgewicht der Hauptkultur beträgt 85 g/l. Der Alkaloidgehalt beträgt 12 mg/g. Der Anteil an 9'-Thiaergotamin und 9'-Thiaergotaminin beträgt 10% des Gesamtalkaloidgehaltes.
2. Isolierung der Titelverbindungen
500 g Trockenmycel werden zweimal mit je 1600 ml Methanol und 2% konz. Ammoniak sowie zweimal mit je 1200 ml Methanol während je 5 min mit einem Ultra-Turrax-Gerät homogenisiert und die vereinigten Filtrate im Vakuum bei max. 400 Badtemperatur eingedampft (zirka 50 g weinroter Rückstand). Dieser Rückstand wird in 500 ml Methanol gelöst und in einem Chromatographierohr von 10 cm Durchmesser durch 500 g Aluminiumoxyd der Aktivitätsstufe II filtriert, mit 2000 ml Methanol nachgewaschen und das gesamte Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft (25 g gelber Schaum). Dieser Rückstand wird nun an der 200fachen Menge Kieselgel (Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm) in Methylenchlorid +2% Methanol chromatographisch aufgetrennt. Die Fraktionsrückstände werden dünnschichtchromatographisch untersucht und diejenigen Fraktionen, welche nur
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Rr-Werte9'-Thiaergotamin
Die Fraktionen, die nach dünnschichtchromatographischer Analyse und entsprechend ihrem Rf-Wert nur 9'-Thiaergotamin enthalten, werden in Essigester gelöst, durch eine Talkschicht blankfiltriert und nach Konzentrierung im Vakuum mit wenig Hexan versetzt, wobei das Alkaloid auskristallisiert. Umkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel liefert reine Kristalle von
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:Chloroform).
9'-Thiaergotaminmethansulfonat :
180 mg 9'-Thiaergotamin werden in wenig Äthanol gelöst und mit einer alkoholischen Lösung, enthaltend 29 mg Methansulfonsäure, versetzt, wobei das Alkaloid als Methansulfonat auskristallisiert. Umkristallisation aus Methanol liefert ein reines, weisses Salz. Fp. : ab 211 (Zersetzung) ;
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519'-Thiaergotaminin : Die Chromatogrammfraktionen mit dünnschichtchromatographisch einheitlichem Fleck und
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Rf-Wert (s. Tabelle 1) werden in Essigester gelöst, vereinigt und durch eine Talkschicht klarfiltriert. Die konzentrierte Lösung wird mit wenig Hexan versetzt, wobei das Alkaloid in weisser kristalliner Form ausfällt.
Umkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel ergibt die reine
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Tabelle 1 Dünnschichtchromatographische Rf-Werte im Vergleich zu
Ergotamin (Et) und Ergotaminin (Et-in)
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<tb>
<tb> Schicht <SEP> und <SEP> Fliessmittel <SEP> Thia-Et <SEP> Et <SEP> Thia-Et-in <SEP> Et-in <SEP>
<tb> Alox <SEP> 1) <SEP>
<tb> Essigester/sek.
<SEP> Butanol <SEP> (9/1) <SEP> 0,44 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 0,59
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (9/1) <SEP> 0,58 <SEP> 0,50 <SEP> 0,69 <SEP> 0,63
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (19/1) <SEP> 0,30 <SEP> 0,24 <SEP> 0,58 <SEP> 0,46
<tb> Kieselgel <SEP> 2) <SEP>
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (85/15) <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP> 0,43 <SEP> 0,31
<tb> Methy <SEP> lenchlorid/Methanol <SEP> (93/7) <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP> 0, <SEP> 52
<tb>
1) Aluminiumoxyd-Fertigplatten Merck F 254 (Typ E) 2) Kieselgel-Fertigplatten Merck F 254
Auf Dünnschichtplatten erscheinen die Substanzflecken im UV-Licht 254 nm als blauviolette und bei 366 nm als hellblaue Flecken. Auch können sie mit Joddämpfen als braune Flecken erkannt werden.
Das für die Ergotpeptide typische van Urk-Reagens bewährt sich ausgezeichnet zur Detektion der Substanzflecken. Nach dem Besprühen erscheinen diese Verbindungen mit blauvioletter Farbe, die durch Einwirkung des Tageslichtes oder durch Überströmen mit einem Hauch Königswasserdämpfen intensiviert werden.
Beispiel 2 : 9'-Thiaergocristin und 9'-Thiaergocristinin
1. Züchtung des Stammes NRRL 12044
Der Stamm NRRL 12044 wird analog wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet. Das Trockenmycelgewicht der Hauptkultur beträgt 80 g/l. Der Alkaloidgehalt beträgt 10 mg/g. Der Anteil an Titelverbindungen beträgt 8% des Gesamtalkaloidgehaltes.
2. Isolierung der Titelverbindungen
500 g Trockenmycel werden zweimal mit je 1500 ml Methanol und 2% konz. Ammoniak und zweimal mit je 1500 ml Methanol mit einem Ultra-Turrax-Gerät je 5 min homogenisiert. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum bei max. 400 Badtemperatur eingedampft (190 g weinroter Rückstand). Nach dem Lösen in 900 ml Methanol wird durch eine 10 cm hohe Schicht aus 600 g Aluminiumoxyd (basisch, Aktivitätsstufe 2) filtriert, mit 2000 ml Methanol nachgewaschen und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft (108 g). Dieser Rückstand wird nun in Methanol an 3000 g quervernetzten Dextrangelen zur Molekularfiltration in Methanol chromtographiert, woraus 156 mg reines Gemisch von 9'-Thiaergocristin/-cristinin erhalten werden.
Die Trennung dieser beiden Verbindungen erfolgte durch bekannte chromatographische Methoden an Kieselgel (Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm) mit Methylenchlorid + 2% Methanol.
9'-Thiaergocristin :
Die Fraktionsrückstände, die nach dünnschichtchromatographischer Analyse und entsprechend ihrem Rf-Wert (vgl. Tabelle 2) nur 9'-Thiaergocristin enthalten, werden vereinigt und aus Benzol
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: 14609'-Thiaergocristinin :
Die Chromatogrammfraktionen, die sich dünnschichtchromatographisch einheitlich zeigen und den Substanzfleck mit den entsprechenden Rf-Werten (s. Tabelle 2) aufweisen, werden vereinigt
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(c = 0, 51 in Chloroform).
Tabelle 2
Dünnschichtchromatographische Rf-Werte im Vergleich zu
Ergocristin (Ec) und Ergocristinin (Ec-in)
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<tb>
<tb> Schicht <SEP> und <SEP> Fliessmittel <SEP> Thia-Ec <SEP> Ec <SEP> Thia-Ec-in <SEP> Ec-in
<tb> Alox <SEP> 1) <SEP>
<tb> Essigester/sek. <SEP> Butanol <SEP> (9/1) <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0,78 <SEP> 0,70
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (9/1) <SEP> 0,68 <SEP> 0,62 <SEP> 0,69 <SEP> 0,66
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (19/1) <SEP> 0,50 <SEP> 0,42 <SEP> 0,58 <SEP> 0, <SEP> 47
<tb> Kieselgel <SEP> 2)
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (85/15) <SEP> 0,37 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0,56 <SEP> 0,48
<tb> Methylenchlorid/Methanol <SEP> (93/7) <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP> 0,41 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP>
<tb>
1) Aluminiumoxyd-Fertigplatten Merek F 254 (Typ E)
2) Kieselgel-Fertigplatten Merck F 254
Zur Detektion der Substanzflecken s.
Beispiel l.
Beispiel 3 :
Analog zu den Beispielen 1 und 2 können auch das 9'-Thia-a-ergokryptin und das 9'-Thia- -a-ergokryptinin hergestellt werden, indem man einen Ergokryptin/Ergokryptinin produzierenden Stamm verwendet.
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: Fp. :formamid).
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The invention relates to a process for the preparation of new cyclic 9'-thipeptideergotalkaloids of the formula
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or benzyl means in the form of the free bases or their acid addition salts.
The compounds of formula (I) can exist in the form of two isomer groups, namely as compounds with the 8R configuration and with the 8S configuration. The connections
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tion salts by adding a liquid culture of Claviceps purpurea L-thiazolidine-4-cabonic acid or a salt of this acid and converting the compounds obtained into their acid addition salts, if desired.
The method according to the invention can be carried out as follows:
Strains of Claviceps purpurea can be used as well as those which can be obtained from a parent strain of Claviceps purpurea by mutation, exposure to radiation or treatment with mutagenic substances or selection.
For the production of 9'-thiaergotamine and 9'-thiaergotaminin, for example, the Claviceps purpurea mutant NRRL 12043 is used as the preferred ergotamine / ergotaminin-producing strain. A culture of this was deposited on September 20, 1979 at the United States Department of Agriculture (Northern Regional Research Center), Peoria, Ill., USA, under culture number NRRL 12043.
The Claviceps purpurea mutant NRRL 12044 is used as the preferred strain producing ergocristin / ergocristinin for the production of 9'-thiaergocristine and 9'-thiaergocristine. A culture of this was deposited on September 20, 1979 at the above-mentioned depository under the cultural number NRRL 12044.
The strains which can be used to prepare the other compounds of the formula (I) are known and are likewise available to the public.
Characteristic and fermentative production of the strains NRRL 12043 and 12044 a) Characteristic of the strain NRRL 12043
The parent mushroom strain was isolated from a sclerotium found on Bromus in Valais (Switzerland), which contained ergotamine. Through several mutagenic treatment steps, using ultraviolet rays and chemicals, the strain NRRL 12043 used according to the invention was obtained, which can be characterized as follows:
A small piece of mycelium from strain NRRL 12043 in the center of an agar plate is inoculated with a medium of the composition given below:
60 g sucrose, 10 g asparagine, 0.5 g casamino acids (Difco), 0.25 g KH2P04'0, 25 g MgS04. 7H20, 0, 125 g KC1, 16 mg FeS04. 7H20, 10 mg ZnS04. 7H20, 15 g agar and dist. water
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knife, after 14 days of about 5 cm and after 20 days of about 8 cm in diameter. The colony is domed and slightly folded. The edge is diffuse. The color of the colony is beige violet in the center and beige gray on the edge. Contains a 20 day old colony
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per cm2 approx. 108 conidia.
These are oval and have dimensions of 6 to 12 x 4 to 7 11m. b) Characteristic of strain 12044
The parent mushroom strain was isolated from a sclerotium found on rye in North America containing ergocristine. Through several mutagenic treatment steps, using ultraviolet rays and chemicals, the one used according to the invention was obtained
Strain NRRL 12044, which can be characterized as follows.
A small piece of mycelium from strain NRRL 12044 in the center of an agar plate is inoculated with a medium of the composition given below:
70 g malt extract, 30 g potatoes, 15 g agar and dist. Water ad 1 1. The pH value is
5, 3 to 5, 7. The medium is sterilized at 1200C for 20 min. At 240C there is one after 7 days
Colony approximately 2 cm in diameter, approximately 14 cm after 14 days and approximately 20 days
5 cm in diameter.
The mycelium is flatly arched and with a white, cotton-like, protruding into the air space
Hyphae covered. A crater-shaped bump about 1 cm in diameter is formed in the center. It has radial folds. The mycelium lying on the agar is colored violet. Concentric zones with stronger and weaker pigmentation are created.
The edge is diffuse. A 20 day old mycelium contains about 1. 108 conidia per cm2. The dimensions of these vary considerably (5 to 12 x 3 to 7 (in most cases, however, 5 to 6x3 j m).
The mycelium contains no alkaloids.
Multiplication and vaccine production: a) NRRL 12043
Multiplication and vaccine production of the strain NRRL 12043 can be carried out by washing the conidia from one of the colonies described above in sterile water and inoculating slant agar tubes with the agar medium, consisting of: 70 g malt extract, 30 g potatoes, 15 g agar and least Water ad 1 1. The pH value is 5.3 to 5. 7. The medium is sterilized at 120 C for 20 min. After 14 days, such an inclined agar culture (12 ml of medium in a test tube 18 mm in diameter and 20 cm in length, laid out in a wedge shape) contains about 1.10 conidia.
Such a slant agar culture is used to suspend conidia in sterile water, producing a concentration of 106-107 spores / ml. With 0.5 ml of this suspension, slant agar tubes are inoculated evenly with the same medium.
These cultures are incubated at 24 C for 14 days. Then they are stored at -40 ° C. b) NRRL 12044
Multiplication and vaccine production of the strain NRRL 12044 can be carried out by washing off the conidia in one of the colonies described above in sterile water and inoculating very agar tubes with the agar medium described above. After 18 days, such an inclined agar culture (12 ml of medium in a test tube 18 mm in diameter and 20 cm in length, laid out in a wedge shape) contains about 1 to 2. 109 conidia. Such an inclined agar culture is used to suspend conidia in sterile water, producing a concentration of 106-107 spores / ml.
Inclined with 0.5 ml of this suspension are inclined agar tubes
EMI2.1
incubated. Then they are stored at -40 ° C.
Precultures
When carrying out the method according to the invention, it has proven to be advantageous to grow the spores only via the preliminary stage (s) before the production medium is inoculated. Initially, one should choose a medium in which good spore germination and rapid mycelium growth take place. For such a medium are suitable: a carbon source in abundant concentration in the form of a mono- or disaccharide, optionally in combination with a polyalcohol, a nitrogen source in the form of an amino acid or an ammonium salt, furthermore mineral salts, trace elements and complex additives from vegetable seeds. The pH is advantageously set between 5 and 7.
The medium is inoculated with conidia in the first stage and incubated on the shaker or in fermenters of various sizes at 22 to 26 C for 4 to 7 days. A dense culture of loose, cotton-like,
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2 to 3 mm measuring, unpigmented mycelium flakes, which consist of long hyphae of 3 to 6 (in diameter.
Main crops
Part of the culture obtained in one or, if appropriate, several precursors is used to inoculate the production medium, which advantageously has a composition such that a high mycelium weight is reached in a short time. Sucrose has proven to be the best and cheapest carbon source, ammonium salts such as oxalate, citrate, succinate and formate as nitrogen sources. Mineral salts and iron and zinc are also believed to be present as trace elements.
The cultures are carried out either in Erlenmeyer flasks or in fermenters of various sizes. Good ventilation is important. The optimal temperature is 24 C.
At the beginning of the alkaloid formation, usually between the 3rd and 6th day of the main culture, 1 to 5 g / l of L-thiazolidine-4-carboxylic acid or a salt of this acid, e.g. B. the potassium, sodium or ammonium salt added to the main culture. The cultures are then incubated for 6 to 12 days. Over the course of 9 to 18 days, a dense culture is formed which mainly consists of 0.5 to 3 mm long and 0.1 to 1 mm thick cylindrical compact mycelium particles in addition to fine flakes. The structure of the mycelium particles shows the image of a plectenchymatic tissue made of spherical or polyhedral to short cylindrical,
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Culture filtrate is also brownish in color.
If the increase in the weight and alkaloid content of the mycelium decreases, the alkaloids can be extracted from the entire culture slurry with organic solvents using known methods, or the mycelium can be separated from the filtrate by filtration or centrifugation and the two parts extracted separately. The majority of the peptide alkaloids are enriched in the mycelium.
Isolation of the Compounds of Formula (I)
These sulfur-containing ergot peptides can be isolated from the culture broth, from the culture filtrate or from the mycelium by known extractive processes. The cleaning takes place under
Use of common cleaning steps, e.g. B. by precipitation from active with inactive solvents or by conversion into poorly soluble salts. Known cleaning methods, e.g. B. Chromatography on aluminum oxides, silica gels, cross-linked dextran gels for molecular filtration in the appropriate solvent systems. Like the known ergot peptides, these new 9'-thiaergot peptides are sensitive to daylight. In free form and in polar solvents, they isomerize to the other form up to a certain equilibrium.
In salt form, as z. B. can be prepared with methanesulfonic acid, 9'-thiaergotamine and 9'-thiaergocristine are stable over a long period.
The compounds obtainable according to the invention have not previously been described in the literature. They have interesting pharmacological properties in animal experiments and can therefore be used as medicinal products. In particular, these compounds show a dopamine receptor stimulating effect. The dopaminergic properties could be determined in rats in which a unilateral violation of the nigro-neostriatal dopamine web was produced by a 6-hydroxydopamine injection into the substantia nigra, with doses between approximately 0.5 to 100 mg / kg (method according to U. Ungerstedt, Acta physiol. Scand. Suppl. 367.69-93 [1971]).
After administration of the active ingredient, a clear activation was recognizable by the fact that the rats rotated in the direction of the undenervated side. Due to their dopaminergic properties, the new substances can be used to treat Parkinsonism.
Furthermore, the new compounds have an inhibitory effect on prolactin secretion. They inhibit implantations in rats after subcutaneous application of doses between 0.01 and 1 mg / kg and lactation with doses of 1 to 10 mg / kg p. o. (Lit .: Experientia 34, 1330 [1978]). The new substances can due to their prolactin secretion-inhibiting properties, for. B. for lactation inhibition, galactorrhoea, for the treatment of hyperprolactinaemic hypogonadism and acromegaly or for the treatment of prolactinomas.
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p.1, 156-173 [1978]). In addition, at 0.3 mg / kg i. p. an increase in glucose metabolism in cranial nerve nuclei of sensory information processing (method according to L.
Solokoff, Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981, 1, 7-36, H.E. Savaki et al., Brain Research 1982,
233,347 and J. McCulloch et al., Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981,, 133-136).
Based on these results, the new substances are suitable for the treatment of senile dementia, especially in the early stages, and for increasing vigilance.
In addition, the compounds obtainable according to the invention have vaso-structural ones
Activity which in vitro on spiral strips of the external carotid artery of the dog (E. Müller- - Schweinitzer, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 292, 113-118 [1976]), with doses
10 nM / l can be shown. Because of their vasoconstrictive effect, the new ones
Substances used to treat migraines.
They also have an effect on the rat with destroyed brain and spinal cord (Brit. J. Pharmac.
Chemother. 30 [1967], 78-87) with a dose of about 5 to about 50 gg / kg i. v. a long-lasting pressor effect combined with an increase in blood pressure. On the Mellander cat (Engiologica 3 [1966], 77-99), they cause a strong, dose-dependent and long-lasting constriction of the capacity vessels in doses of about 0.5 to about 50 tg / kg i. a. Due to this activity, the substances can be used as venon toning agents.
Finally, the compounds obtainable according to the invention have a serotoninergic effect based on the results on the sleep / wake cycle. In view of this effect and the results of the Ungerstedt model, they can be used as antidepressants, especially in older people.
Pharmaceutical compositions which contain the compounds obtainable according to the invention can be prepared using auxiliaries and excipients customary in pharmacy.
In the following examples, which explain the invention in more detail, all the temperatures are given in degrees Celsius and are uncorrected.
Example! : 9'-thiaergotamine and 9'-thiaergotamine:
1. Breeding strain NRRL 12043 a) pre-culture
The conidia of a slant agar culture of the Claviceps purpurea strain NRRL 12043 (about 109) are suspended in 10 ml of sterile water. With 1 ml of this conidia suspension, 200 ml of a preculture medium of the following composition
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<tb>
<tb> g / l
<tb> sucrose <SEP> 100
<tb> partially <SEP> degreased <SEP> cottonseed flour <SEP> 10
<tb> ammonium oxalate <SEP> 3
<tb> Ca <SEP> (N03) <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> KH2 <SEP> PO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> MgS04. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> KCl <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP>
<tb> FeS0 <SEP> 7H20 <SEP> 0.0166
<tb> ZnS04.
<SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 0068
<tb> distilled <SEP> water <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> l,
<tb>
inoculated in 500 ml Erlenmeyer flasks; the pH is adjusted to 6.5 with NH40H
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set. The medium is sterilized at 1200 for 20 min. This preculture is shaken at 24 rotating for 5 days (180 rev / min, 5 cm circle).
At the end of growth, the culture had a pH of 5.3 and a mycelium dry weight of 22 g / l. b) Main culture
With 10 ml of the pre-culture 50 ml of a main culture medium of the following composition
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<tb>
<tb> g / l
<tb> sucrose <SEP> 240
<tb> ammonium oxalate <SEP> 9.6
<tb> Ca <SEP> (NO <SEP>. <SEP> 4H2O <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> MgS0. <SEP> 7H <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> KH2P04 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> KCl <SEP> 0.312
<tb> FeSO <SEP> 4. <SEP> 7H2 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0252
<tb> ZnS04. <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 0102 <SEP>
<tb> distilled <SEP> water <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> l,
<tb>
inoculated in 500 ml Erlenmeyer flasks; the pH is adjusted to 6.2 with NH 40H-25%. The medium is sterilized at 1100 for 20 min.
This culture is incubated at 24 on a rotary shaker (180 rev / min, 5 cm circle). After 4 days of incubation, 90 mg of L-thiazolidine-4-carboxylic acid are added per culture. The cultures are incubated on the rotary shaker for another 10 days. After the fermentation has ended, the cultures are filtered off. The mycelium is gently dried. The dry mycelium weight of the main culture is 85 g / l. The alkaloid content is 12 mg / g. The proportion of 9'-thiaergotamine and 9'-thiaergotaminin is 10% of the total alkaloid content.
2. Isolation of the title compounds
500 g of dry mycelium are concentrated twice with 1600 ml of methanol and 2% each. Ammonia and twice with 1200 ml of methanol for 5 min each with an Ultra-Turrax device and the combined filtrates in vacuo at max. 400 bath temperature evaporated (approx. 50 g wine-red residue). This residue is dissolved in 500 ml of methanol and filtered through 500 g of aluminum oxide of activity level II in a chromatography tube of 10 cm in diameter, washed with 2000 ml of methanol and the entire filtrate is evaporated to dryness in vacuo (25 g of yellow foam). This residue is now separated by chromatography on 200 times the amount of silica gel (grain size 0.063 to 0.2 mm) in methylene chloride + 2% methanol. The fraction residues are examined by thin layer chromatography and those fractions which only
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Rr values 9'-thiaergotamine
The fractions, which after analysis by thin layer chromatography and according to their Rf value only contain 9'-thiaergotamine, are dissolved in ethyl acetate, filtered through a talc layer and mixed with a little hexane after concentration in vacuo, the alkaloid crystallizing out. Recrystallization from the same solvent gives pure crystals of
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:Chloroform).
9'-thiaergotamine methanesulfonate:
180 mg of 9'-thiaergotamine are dissolved in a little ethanol and an alcoholic solution containing 29 mg of methanesulfonic acid is added, the alkaloid crystallizing out as methanesulfonate. Recrystallization from methanol gives a pure, white salt. Mp: from 211 (decomposition);
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519'-thiaergotaminin: the chromatogram fractions with a thin layer chromatographically uniform spot and
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The Rf value (see Table 1) is dissolved in ethyl acetate, combined and filtered through a talcum layer. A little hexane is added to the concentrated solution, the alkaloid precipitating in white crystalline form.
Recrystallization from the same solvent gives the pure one
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Table 1 Thin-layer chromatographic Rf values compared to
Ergotamine (Et) and Ergotaminin (Et-in)
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<tb>
<tb> Layer <SEP> and <SEP> eluent <SEP> Thia-Et <SEP> Et <SEP> Thia-Et-in <SEP> Et-in <SEP>
<tb> Alox <SEP> 1) <SEP>
<tb> ethyl acetate / sec.
<SEP> butanol <SEP> (9/1) <SEP> 0.44 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 0.59
<tb> toluene / iso-propanol <SEP> (9/1) <SEP> 0.58 <SEP> 0.50 <SEP> 0.69 <SEP> 0.63
<tb> toluene / iso-propanol <SEP> (19/1) <SEP> 0.30 <SEP> 0.24 <SEP> 0.58 <SEP> 0.46
<tb> silica gel <SEP> 2) <SEP>
<tb> toluene / iso-propanol <SEP> (85/15) <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP> 0.43 <SEP> 0.31
<tb> Methy <SEP> lenchlorid / methanol <SEP> (93/7) <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP> 0, <SEP> 52
<tb>
1) Merck F 254 aluminum oxide prefabricated panels (type E) 2) Merck F 254 prefabricated silica gel panels
On thin-layer plates, the substance spots appear in UV light 254 nm as blue-violet and at 366 nm as light-blue spots. They can also be recognized as brown spots with iodine vapors.
The van Urk reagent, which is typical of Ergot peptides, has proven itself extremely well for detecting substance stains. After spraying, these compounds appear with a blue-violet color, which are intensified by exposure to daylight or by overflowing with a touch of aqua regia.
Example 2: 9'-thiaergocristine and 9'-thiaergocristine
1. Breeding strain NRRL 12044
The strain NRRL 12044 is grown analogously to that described in Example 1. The dry mycelium weight of the main culture is 80 g / l. The alkaloid content is 10 mg / g. The proportion of title compounds is 8% of the total alkaloid content.
2. Isolation of the title compounds
500 g of dry mycelium are concentrated twice with 1500 ml of methanol and 2% each. Ammonia and homogenized twice with 1500 ml of methanol each with an Ultra-Turrax device for 5 min. The combined filtrates are vacuumed at max. 400 bath temperature evaporated (190 g wine red residue). After dissolving in 900 ml of methanol, the mixture is filtered through a 10 cm high layer of 600 g of aluminum oxide (basic, activity level 2), washed with 2000 ml of methanol and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo (108 g). This residue is now chromotographed in methanol on 3000 g of crosslinked dextran gel for molecular filtration in methanol, from which 156 mg of pure mixture of 9'-thiaergocristine / -cristinine are obtained.
These two compounds were separated by known chromatographic methods on silica gel (particle size 0.063 to 0.2 mm) with methylene chloride + 2% methanol.
9'-thiaergocristine:
The fraction residues which, according to analysis by thin layer chromatography and corresponding to their Rf value (see Table 2), only contain 9'-thiaergocristine are combined and made from benzene
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<Desc / Clms Page number 7>
: 14609'-thiaergocristine:
The chromatogram fractions, which are shown uniformly by thin layer chromatography and have the substance stain with the corresponding Rf values (see Table 2), are combined
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(c = 0.51 in chloroform).
Table 2
Thin layer chromatographic Rf values compared to
Ergocristin (Ec) and Ergocristinin (Ec-in)
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<tb>
<tb> Layer <SEP> and <SEP> superplasticizer <SEP> Thia-Ec <SEP> Ec <SEP> Thia-Ec-in <SEP> Ec-in
<tb> Alox <SEP> 1) <SEP>
<tb> ethyl acetate / sec. <SEP> butanol <SEP> (9/1) <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0.78 <SEP> 0.70
<tb> toluene / iso-propanol <SEP> (9/1) <SEP> 0.68 <SEP> 0.62 <SEP> 0.69 <SEP> 0.66
<tb> toluene / iso-propanol <SEP> (19/1) <SEP> 0.50 <SEP> 0.42 <SEP> 0.58 <SEP> 0, <SEP> 47
<tb> silica gel <SEP> 2)
<tb> toluene / iso-propanol <SEP> (85/15) <SEP> 0.37 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0.56 <SEP> 0.48
<tb> Methylene chloride / methanol <SEP> (93/7) <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP> 0.41 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP>
<tb>
1) Merek F 254 aluminum oxide prefabricated panels (type E)
2) Merck F 254 prefabricated silica gel plates
For the detection of the substance stains see.
Example 1
Example 3:
Analogously to Examples 1 and 2, the 9'-thia-a-ergocryptin and the 9'-thia-a-ergocryptinin can also be produced using an ergocryptin / ergocryptinin-producing strain.
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: Mp: formamide).