AT384437B - Verfahren zur herstellung von neuen cyclischen 9'-thiapeptidergotalkaloiden - Google Patents

Description

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   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuen   cyclische     9'-Thia-   peptidergotalkaloiden der Formel 
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 oder Benzyl bedeutet, in Form der freien Basen oder ihrer Säureadditionssalze. 



   Die Verbindungen der Formel (I) können in Form von zwei Isomerengruppen vorliegen, nämlich als Verbindungen mit der Konfiguration 8R und mit der Konfiguration 8S. Die Verbindungen 
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 tionssalzen, indem man einer flüssigen Kultur von Claviceps purpurea   L-Thiazolidin-4-cabonsäure   oder ein Salz dieser Säure zugibt, und die erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre Säureadditionssalze überführt. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden :
Als Stämme können Stämme von Claviceps purpurea verwendet werden, sowie solche, die aus einem Ausgangsstamm von Claviceps purpurea durch Mutation, unter Einwirkung von Strahlen oder Behandlung mit mutagenen Substanzen oder Selektion gewonnen werden können. 



   Zur Herstellung von 9'-Thiaergotamin und   9'-Thiaergotaminin   wird beispielsweise als bevorzugter Ergotamin/Ergotaminin produzierender Stamm die   Claviceps   purpurea Mutante NRRL 12043 verwendet. Eine Kultur davon wurde am 20. 9. 1979 beim United States Department of Agriculture (Northern Regional Research Center), Peoria, Ill., USA, unter Kulturnummer NRRL 12043 deponiert. 



   Zur Herstellung von 9'-Thiaergocristin und   9'-Thiaergocristinin   wird als bevorzugter   Ergocristin/Ergocristinin   produzierender Stamm die Claviceps purpurea Mutante NRRL 12044 verwendet. Eine Kultur davon wurde am 20. 9. 1979 bei der oben erwähnten Deponierungsstelle unter der Kulturnummer NRRL 12044 deponiert. 



   Die zur Herstellung der übrigen Verbindungen der Formel   (I)   verwendbaren Stämme sind bekannt und stehen ebenfalls der Öffentlichkeit zur Verfügung. 



   Charakteristikum und fermentative Gewinnung der Stämme NRRL 12043 und 12044 a) Charakteristikum des Stammes NRRL 12043
Der Ausgangspilzstamm wurde aus einem auf Bromus im Wallis (Schweiz) gefundene Sklerotium, welches Ergotamin enthielt, isoliert. Durch mehrere mutagene Behandlungsschritte, unter Verwendung von Ultraviolettstrahlen und Chemikalien, gelangte man zu dem erfindungsgemäss verwendeten Stamm NRRL 12043, welcher folgendermassen charakterisiert werden kann :
Es wird ein kleines Mycelstück des Stammes NRRL 12043 im Zentrum einer Agarplatte mit einem Medium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung ausgeimpft :

  
60 g Saccharose, 10   g Asparagin, 0, 5   g Casamino-Acids   (Difco),     0, 25   g   KH2P04'0, 25   g   MgS04. 7H20, 0, 125   g   KC1,   16 mg   FeS04. 7H20,   10 mg   ZnS04. 7H20,   15 g Agar und dest. Wasser 
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 messer, nach 14 Tagen von etwa 5 cm und nach 20 Tagen von etwa 8 cm Durchmesser entstanden. Die Kolonie ist gewölbt und leicht gefaltet. Der Rand ist diffus. Die Farbe der Kolonie ist im Zentrum beigeviolett und am Rand beigegrau. Eine 20 Tage alte Kolonie enthält 

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 pro   cm2 zirka 1. 108   Konidien.

   Diese sind oval und haben Dimensionen von 6 bis 12 x 4 bis 7   11m.   b) Charakteristikum des Stammes 12044
Der Ausgangspilzstamm wurde aus einem auf Roggen in Nordamerika gefundenem Sklerotium, welches Ergocristin enthielt, isoliert. Durch mehrere mutagene Behandlungsschritte, unter Verwen- dung von Ultraviolettstrahlen und Chemikalien, gelangte man zu dem erfindungsgemäss verwendeten
Stamm NRRL 12044, welcher folgendermassen charakterisiert werden kann. 



   Es wird ein kleines Mycelstück des Stammes NRRL 12044 im Zentrum einer Agarplatte mit einem Medium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung ausgeimpft :
70 g Malzextrakt, 30 g Kartoffeln, 15 g Agar und dest. Wasser ad 1 1. Der PH-Wert beträgt
5, 3 bis 5, 7. Das Medium wird 20 min bei 1200C sterilisiert. Bei   240C   ist nach 7 Tagen eine
Kolonie von etwa 2 cm Durchmesser, nach 14 Tagen von etwa 4 cm und nach 20 Tagen von etwa
5 cm Durchmesser entstanden. 



   Das Mycel ist flach gewölbt und mit einem weissen, in den Luftraum ragenden, watteartigen
Hyphengeflecht bedeckt. Im Zentrum wird ein kraterförmiger Höcker von etwa 1 cm Durchmesser ausgebildet. Von ihm gehen radiale Falten aus. Das dem Agar aufliegende Mycel ist violett gefärbt. Es entstehen konzentrische Zonen mit stärkerer und solche mit schwächerer Pigmentierung. 



   Der Rand ist diffus. Ein 20 Tage altes Mycel enthält pro   cm2 zirka 1. 108   Konidien. Diese streuen in ihren Dimensionen ziemlich stark (5 bis 12 x 3 bis 7   (im ;   meist jedoch 5 bis   6x3 j m).   



  Das Mycel enthält keine Alkaloide. 



   Vermehrung und Impfstoffherstellung : a) NRRL 12043
Vermehrung und Impfstoffherstellung des Stammes NRRL 12043 können in der Weise erfolgen, dass man von einer der oben beschriebenen Kolonien die Konidien in sterilem Wasser   abschwemmt   und damit   Schrägagarröhrchen   mit dem Agarmedium beimpft, bestehend aus : 70 g Malzextrakt, 30 g Kartoffeln, 15 g Agar und dest. Wasser ad 1 1. Der PH-Wert beträgt 5, 3 bis 5, 7. Das Medium wird 20 min bei   120 C   sterilisiert. Nach 14 Tagen enthält eine solche Schrägagarkultur (12 ml Medium in einem Reagenzglas von 18 mm Durchmesser und 20 cm Länge, keilförmig ausgelegt) etwa   1.     10   Konidien.

   Von einer solchen Schrägagarkultur werden Konidien in sterilem Wasser aufgeschwemmt und dabei eine Konzentration von   106 -107 Sporen/mI   hergestellt. Mit je 0, 5 ml dieser Suspension werden   Schrägagarröhrchen   mit dem gleichen Medium gleichmässig beimpft. 



  Diese Kulturen werden bei   24 C   während 14 Tagen bebrütet. Hierauf werden sie   bei-40 C   gelagert.   b)   NRRL 12044
Vermehrung und Impfstoffherstellung des Stammes NRRL 12044 können in der Weise erfolgen, dass man von einer der oben beschriebenn Kolonien die Konidien in sterilem Wasser abschwemmt und damit   Sehrägagarröhrchen   mit dem oben beschriebenen Agarmedium beimpft. Nach 18 Tagen enthält eine solche Schrägagarkultur (12 ml Medium in einem Reagenzglas von 18 mm Durchmesser und 20 cm Länge, keilförmig ausgelegt) etwa 1 bis 2. 109 Konidien. Von einer solchen Schrägagarkultur werden Konidien in sterilem Wasser aufgeschwemmt und dabei eine Konzentration von 106¯107   Sporen/ml   hergestellt.

   Mit je 0, 5 ml dieser Suspension werden Schrägagarröhrchen mit 
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 bebrütet. Hierauf werden sie   bei-40 C   gelagert. 



   Vorkulturen
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Sporen erst über   Vorstufe (n) heranzuzüchten,   bevor das Produktionsmedium angeimpft wird. Anfänglich soll man ein Medium wählen, in welchem gute Sporenkeimung und ein schnelles Mycelwachstum stattfindet. Für ein solches Medium sind geeignet : eine Kohlenstoffquelle in reichlicher Konzentration in Form eines   Mono- oder Disaccharids,   gegebenenfalls in Kombination mit einem Polyalkohol, eine Stickstoffquelle in Form einer Aminosäure oder eines Ammoniumsalzes, ferner Mineralsalze, Spurenelemente und komplexe Zusätze aus pflanzlichen Samen. Das PH wird vorteilhaft zwischen 5 und 7 eingestellt.

   Das Medium wird in der ersten Stufe mit Konidien reichlich beimpft und auf der Schüttelmaschine oder in Fermentern von verschiedenen Grössen bei 22 bis   26 C   während 4 bis 7 Tagen inkubiert. Es entsteht eine dichte Kultur aus lockeren, watteartigen, 

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 2 bis 3 mm messenden, unpigmentierten Mycelflocken, welche aus langen Hyphen von 3 bis   6 (im   Durchmesser bestehen. 



   Hauptkulturen
Mit einem Teil der in einer oder gegebenenfalls mehreren Vorstufen erhaltenen Kultur wird das Produktionsmedium beimpft, welches vorteilhaft eine solche Zusammensetzung aufweist, dass in kurzer Zeit ein hohes Mycelgewicht erreicht wird. Als beste und billigste Kohlenstoffquelle hat sich Saccharose erwiesen, als Stickstoffquelle Ammoniumsalze, wie Oxalat, Citrat, Succinat und Formiat. Ferner sollen Mineralsalze und als Spurenelemente Eisen und Zink zugegen sein. 



  Die Kulturen werden entweder in Erlenmeyerkolben oder in Fermentern von verschiedenen Grössen durchgeführt. Wichtig ist eine gute Belüftung. Die optimale Temperatur liegt bei   24 C.   



   Am Anfang der Alkaloidbildung, normalerweise zwischen dem 3. und 6. Tag der Hauptkultur, werden 1 bis 5   g/l   L-Thiazolidin-4-carbonsäure oder eines Salzes dieser Säure,   z. B.   des Kalium-, Natrium- oder Ammoniumsalzes, zur Hauptkultur gegeben. Hierauf werden die Kulturen weiter während 6 bis 12 Tagen bebrütet. Es entsteht im Verlaufe von 9 bis 18 Tagen eine dichte Kultur, die hauptsächlich aus 0, 5 bis 3 mm langen und 0, 1 bis 1 mm dicken zylindrischen kompakten Mycelpartikeln neben feinen Flocken besteht. Die Mycelpartikel zeigen in ihrer Struktur das Bild eines plectenchymatischen Gewebes aus kugeligen oder polyedrischen bis kurzzylindrischen, 
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Kulturfiltrat ist ebenfalls bräunlich gefärbt. 



   Wenn sich die Zunahme des Gewichtes und des Alkaloidgehaltes des Mycels verringert, können nach an sich bekannten Methoden die Alkaloide mit organischen Lösungsmitteln aus dem gesamten Kulturbrei extrahiert werden, oder man trennt das Mycel durch Filtration oder Zentrifuga- tion vom Filtrat und extrahiert beide Teile separat. Der Hauptanteil der Peptidalkaloide ist im Mycel angereichert. 



   Isolierung der Verbindungen der Formel   (I)  
Diese schwefelhaltigen Ergotpeptide lassen sich aus der Kulturbrühe, aus dem Kulturfiltrat oder aus dem Mycel durch bekannte extraktive Verfahren isolieren. Die Reinigung erfolgt unter
Anwendung üblicher Reinigungsschritte,   z. B.   durch Fällungen aus aktiven mit inaktiven Lösung- mitteln oder durch Überführen in schwerlösliche Salze. Besonders geeignet sind bekannte Reinigungsverfahren, z. B. Chromatographie an Aluminiumoxyden, Kieselgelen, quervernetzten Dextrangelen zur Molekularfiltration in den jeweils geeigneten Lösungsmittelsystemen. Wie die bekannten Ergotpeptide sind auch diese neuen 9'-Thiaergotpepide gegen Tageslicht empfindlich. In freier Form und in polaren Lösungsmitteln isomerisieren sie bis zu einem bestimmten Gleichgewicht in die jeweils andere Form.

   In Salzform, wie sie   z. B.   mit Methansulfonsäure hergestellt werden können, sind   9'-Thiaergotamin   und 9'-Thiaergocristin über längere Zeit stabil. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen sind in der Literatur bisher nicht beschrieben worden. Sie weisen im Tierversuch interessante pharmakologische Eigenschaften auf und können daher als Heilmittel verwendet werden. Insbesondere zeigen diese Verbindungen eine dopaminrezeptorenstimulierende Wirkung. Die dopaminergenen Eigenschaften konnten an Ratten, bei denen durch eine 6-Hydroxydopamin-Injektion in die substantia nigra eine unilaterale Verletzung der nigro-neostriatalen Dopaminbahn erzeugt wurde, mit Dosen zwischen etwa 0,5 bis 100 mg/kg festgestellt werden (Methode nach U. Ungerstedt, Acta   physiol. scand.   Suppl. 367,69-93 [1971]). 



  Nach Verabreichung des Wirkstoffes war eine deutliche Aktivierung dadurch erkennbar, dass die Ratten in Richtung der nicht denervierten Seite rotierten. Die neuen Substanzen können auf Grund ihrer dopaminergen Eigenschaften zur Behandlung von Parkinsonismus Anwendung finden. 



   Ferner besitzen die neuen Verbindungen eine prolaktinsecretionshemmende Wirkung. So hemmen sie bei der Ratte die Implantationen nach subkutaner Applikation von Dosen zwischen 0, 01 bis 1 mg/kg und die Laktation mit Dosen von 1 bis 10 mg/kg   p. o. (Lit. :   Experientia 34, 1330 [1978]). Die neuen Substanzen können auf Grund ihrer prolaktinsecretionshemmenden Eigenschaften,   z. B.   zur Laktationshemmung, Galaktorrhoehemmung, zur Behandlung des hyperprolaktinaemischen Hypogonadismus und der Akromegalie oder zur Behandlung von Prolaktinomen Anwendung finden. 

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 p.1, 156-173 [1978]). Überdies bewirken sie bei 0, 3 mg/kg   i. p.   eine Erhöhung des Glukosestoffwech- sels in Hirnnervenkernen sensorischer Informationsverarbeitung (Methode nach L.

   Solokoff, Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981, 1, 7-36, H. E. Savaki et al., Brain Research 1982,
233,347 und J. McCulloch et al., Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981,   ,   133-136). 



   Auf Grund dieser Resultate sind die neuen Substanzen für die Behandlung der senilen Demenz, insbesondere im Frühstadium, und zur Vigilanzerhöhung geeignet. 



   Ausserdem besitzen die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen vasokonstruktorische
Aktivität, welche in vitro an Spiralstreifen der Arteria carotis externa des Hundes   (E.   Müller- - Schweinitzer, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 292,113-118   [1976]),   mit Dosen ab
10 nM/l gezeigt werden kann. Auf Grund ihrer vasokonstriktorischen Wirkung werden die neuen
Substanzen zur Behandlung der Migräne verwendet. 



   Ferner bewirken sie an der Ratte mit zerstörtem Gehirn und Rückenmark (Brit. J. Pharmac. 



   Chemother. 30 [1967], 78-87) mit einer Dosis von etwa 5 bis etwa 50   gg/kg i. v.   einen langanhaltenden pressorischen Effekt, verbunden mit einer Blutdrucksteigerung. An der Mellander-Katze (Engiologica 3 [1966], 77-99) bewirken sie eine starke, dosisabhängige und langanhaltende Konstriktion der Kapazitätsgefässe in Dosen von etwa 0, 5 bis etwa 50   tg/kg i. a.   Auf Grund dieser Aktivität können die Substanzen als venentonisierende Mittel Anwendung finden. 



   Schliesslich bewirken die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen auf Grund der Ergebnisse am Schlaf/Wachzyklus eine serotoninerge Wirkung. Im Hinblick auf diese Wirkung und die Ergebnisse am Ungerstedt-Modell können sie als Antidepressiva, vor allem bei älteren Leuten, Anwendung finden. 



   Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen enthalten, können unter Verwendung von in der Pharmazie gebräuchlichen Hilfs- und Trägerstoffen hergestellt werden. 



   In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden und sind unkorrigiert. 



   Beispiel   ! : 9'-Thiaergotamin   und   9'-Thiaergotaminin :  
1. Züchtung des Stammes NRRL 12043 a) Vorkultur
Die Konidien einer Schrägagarkultur des Claviceps purpurea Stammes NRRL 12043 (etwa 109) werden in 10 ml sterilem Wasser suspendiert. Mit 1 ml dieser Konidiensuspension werden 200 ml eines Vorkulturmediums folgender Zusammensetzung 
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<tb> 
<tb> g/l
<tb> Saccharose <SEP> 100
<tb> teilweise <SEP> entfettetes <SEP> Baumwollsamenmehl <SEP> 10
<tb> Ammoniumoxalat <SEP> 3
<tb> Ca <SEP> (N03) <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> KH2 <SEP> PO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> MgS04. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 
<tb> KCl <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP> 
<tb> FeS0 <SEP> 7H20 <SEP> 0,0166
<tb> ZnS04.

   <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 0068
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> l,
<tb> 
 welches sich in 500 ml Erlenmeyerkolben befindet, angeimpft ; das PH wird mit   NH40H   auf 6, 5 

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 eingestellt. Das Medium wird 20 min bei   1200   sterilisiert. Diese Vorkultur wird bei   24  rotierend   5 Tage geschüttelt (180 Umdr/min, 5 cm Kreis).

   Am Ende des Wachstums hat die Kultur einen PH-Wert von 5,3 und ein Myceltrockengewicht von 22   g/l.     b)   Hauptkultur
Mit 10 ml der Vorkultur werden 50 ml eines Hauptkulturmediums folgender Zusammensetzung 
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<tb> 
<tb> g/l
<tb> Saccharose <SEP> 240
<tb> Ammoniumoxalat <SEP> 9,6
<tb> Ca <SEP> (NO <SEP> . <SEP> 4H2O <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> MgS0. <SEP> 7H <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP> 
<tb> KH2P04 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP> 
<tb> KCl <SEP> 0,312
<tb> FeSO <SEP> 4. <SEP> 7H2 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0252
<tb> ZnS04. <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 0102 <SEP> 
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> l,
<tb> 
 welches sich in 500 ml Erlenmeyerkolben befindet, angeimpft ; das PH wird mit NH 40H-25%ig auf 6,2 eingestellt. Das Medium wird 20 min bei   1100   sterilisiert.

   Diese Kultur wird bei   24    auf einer Rundschüttelmaschine (180 Umdr/min, 5 cm Kreis) inkubiert. Nach 4 Tagen Bebrütungszeit werden pro Kultur 90 mg L-Thiazolidin-4-carbonsäure zugegeben. Die Kulturen werden noch 10 Tage auf der Rundschüttelmaschine inkubiert. Nach beendeter Fermentation werden die Kulturen abfiltriert. Das Mycelium wird schonend getrocknet. Das Trockenmycelgewicht der Hauptkultur beträgt 85 g/l. Der Alkaloidgehalt beträgt 12 mg/g. Der Anteil an 9'-Thiaergotamin und 9'-Thiaergotaminin beträgt 10% des Gesamtalkaloidgehaltes. 



   2. Isolierung der Titelverbindungen
500 g Trockenmycel werden zweimal mit je 1600 ml Methanol und 2% konz. Ammoniak sowie zweimal mit je 1200 ml Methanol während je 5 min mit einem Ultra-Turrax-Gerät homogenisiert und die vereinigten Filtrate im Vakuum bei max. 400 Badtemperatur eingedampft (zirka 50 g weinroter Rückstand). Dieser Rückstand wird in 500 ml Methanol gelöst und in einem Chromatographierohr von 10 cm Durchmesser durch 500 g Aluminiumoxyd der Aktivitätsstufe II filtriert, mit 2000 ml Methanol nachgewaschen und das gesamte Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft (25 g gelber Schaum). Dieser Rückstand wird nun an der 200fachen Menge Kieselgel (Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm) in Methylenchlorid +2% Methanol chromatographisch aufgetrennt. Die Fraktionsrückstände werden dünnschichtchromatographisch untersucht und diejenigen Fraktionen, welche nur 
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   Rr-Werte9'-Thiaergotamin
Die Fraktionen, die nach dünnschichtchromatographischer Analyse und entsprechend ihrem Rf-Wert nur 9'-Thiaergotamin enthalten, werden in Essigester gelöst, durch eine Talkschicht blankfiltriert und nach Konzentrierung im Vakuum mit wenig Hexan versetzt, wobei das Alkaloid auskristallisiert. Umkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel liefert reine Kristalle von 
 EMI5.3 
 :Chloroform). 



    9'-Thiaergotaminmethansulfonat :   
180 mg   9'-Thiaergotamin   werden in wenig Äthanol gelöst und mit einer alkoholischen Lösung, enthaltend 29 mg Methansulfonsäure, versetzt, wobei das Alkaloid als Methansulfonat auskristallisiert. Umkristallisation aus Methanol liefert ein reines, weisses Salz. Fp. : ab 211  (Zersetzung) ; 
 EMI5.4 
   519'-Thiaergotaminin :    Die Chromatogrammfraktionen mit dünnschichtchromatographisch einheitlichem Fleck und 

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 Rf-Wert (s. Tabelle   1)   werden in Essigester gelöst, vereinigt und durch eine Talkschicht klarfiltriert. Die konzentrierte Lösung wird mit wenig Hexan versetzt, wobei das Alkaloid in weisser kristalliner Form ausfällt.

   Umkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel ergibt die reine 
 EMI6.1 
 
Tabelle 1 Dünnschichtchromatographische Rf-Werte im Vergleich zu
Ergotamin (Et) und Ergotaminin (Et-in) 
 EMI6.2 
 
<tb> 
<tb> Schicht <SEP> und <SEP> Fliessmittel <SEP> Thia-Et <SEP> Et <SEP> Thia-Et-in <SEP> Et-in <SEP> 
<tb> Alox <SEP> 1) <SEP> 
<tb> Essigester/sek.

   <SEP> Butanol <SEP> (9/1) <SEP> 0,44 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 0,59
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (9/1) <SEP> 0,58 <SEP> 0,50 <SEP> 0,69 <SEP> 0,63
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (19/1) <SEP> 0,30 <SEP> 0,24 <SEP> 0,58 <SEP> 0,46
<tb> Kieselgel <SEP> 2) <SEP> 
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (85/15) <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP> 0,43 <SEP> 0,31
<tb> Methy <SEP> lenchlorid/Methanol <SEP> (93/7) <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP> 0, <SEP> 52
<tb> 
   1) Aluminiumoxyd-Fertigplatten Merck   F 254 (Typ E)   2)   Kieselgel-Fertigplatten Merck F 254 
Auf Dünnschichtplatten erscheinen die Substanzflecken im UV-Licht 254 nm als blauviolette und bei 366 nm als hellblaue Flecken. Auch können sie mit Joddämpfen als braune Flecken erkannt werden.

   Das für die Ergotpeptide typische van Urk-Reagens bewährt sich ausgezeichnet zur Detektion der Substanzflecken. Nach dem Besprühen erscheinen diese Verbindungen mit blauvioletter Farbe, die durch Einwirkung des Tageslichtes oder durch Überströmen mit einem Hauch Königswasserdämpfen intensiviert werden. 



   Beispiel   2 : 9'-Thiaergocristin   und 9'-Thiaergocristinin
1. Züchtung des Stammes NRRL 12044
Der Stamm NRRL 12044 wird analog wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet. Das Trockenmycelgewicht der Hauptkultur beträgt 80 g/l. Der Alkaloidgehalt beträgt 10 mg/g. Der Anteil an Titelverbindungen beträgt 8% des Gesamtalkaloidgehaltes. 



   2. Isolierung der Titelverbindungen
500 g Trockenmycel werden zweimal mit je 1500 ml Methanol und 2% konz. Ammoniak und zweimal mit je 1500 ml Methanol mit einem Ultra-Turrax-Gerät je 5 min homogenisiert. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum bei max. 400 Badtemperatur eingedampft (190 g weinroter Rückstand). Nach dem Lösen in 900 ml Methanol wird durch eine 10 cm hohe Schicht aus 600 g Aluminiumoxyd (basisch, Aktivitätsstufe 2) filtriert, mit 2000 ml Methanol nachgewaschen und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft (108 g). Dieser Rückstand wird nun in Methanol an 3000 g quervernetzten Dextrangelen zur Molekularfiltration in Methanol chromtographiert, woraus 156 mg reines Gemisch von   9'-Thiaergocristin/-cristinin   erhalten werden.

   Die Trennung dieser beiden Verbindungen erfolgte durch bekannte chromatographische Methoden an Kieselgel (Korngrösse 0, 063 bis 0, 2 mm) mit Methylenchlorid + 2% Methanol. 



    9'-Thiaergocristin :   
Die Fraktionsrückstände, die nach   dünnschichtchromatographischer   Analyse und entsprechend ihrem Rf-Wert (vgl. Tabelle 2) nur 9'-Thiaergocristin enthalten, werden vereinigt und aus Benzol 
 EMI6.3 
 

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    : 14609'-Thiaergocristinin :   
Die Chromatogrammfraktionen, die sich dünnschichtchromatographisch einheitlich zeigen und den Substanzfleck mit den entsprechenden Rf-Werten (s. Tabelle 2) aufweisen, werden vereinigt 
 EMI7.1 
 (c = 0, 51 in Chloroform). 



   Tabelle 2
Dünnschichtchromatographische Rf-Werte im Vergleich zu
Ergocristin (Ec) und Ergocristinin (Ec-in) 
 EMI7.2 
 
<tb> 
<tb> Schicht <SEP> und <SEP> Fliessmittel <SEP> Thia-Ec <SEP> Ec <SEP> Thia-Ec-in <SEP> Ec-in
<tb> Alox <SEP> 1) <SEP> 
<tb> Essigester/sek. <SEP> Butanol <SEP> (9/1) <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0,78 <SEP> 0,70
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (9/1) <SEP> 0,68 <SEP> 0,62 <SEP> 0,69 <SEP> 0,66
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (19/1) <SEP> 0,50 <SEP> 0,42 <SEP> 0,58 <SEP> 0, <SEP> 47
<tb> Kieselgel <SEP> 2)
<tb> Toluol/iso-Propanol <SEP> (85/15) <SEP> 0,37 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0,56 <SEP> 0,48
<tb> Methylenchlorid/Methanol <SEP> (93/7) <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP> 0,41 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 
<tb> 
 
1) Aluminiumoxyd-Fertigplatten Merek F 254 (Typ E)
2) Kieselgel-Fertigplatten Merck F 254 
Zur Detektion der Substanzflecken s.

   Beispiel   l.   



   Beispiel 3 :
Analog zu den Beispielen 1 und 2 können auch das   9'-Thia-a-ergokryptin   und das   9'-Thia-   -a-ergokryptinin hergestellt werden, indem man einen Ergokryptin/Ergokryptinin produzierenden Stamm verwendet. 
 EMI7.3 
   : Fp. :formamid).  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung von neuen cyclischen 9'-Thiapeptidergotalkaloiden der Formel EMI7.4 <Desc/Clms Page number 8> worin entweder Rl für Methyl steht und R2 Isobutyl oder Benzyl bedeutet, oder Rl für Äthyl steht und R2 Benzyl bedeutet, oder Rl für Isopropyl steht und R2 Isopropyl, sek. Butyl, Isobutyl oder Benzyl bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man einer flüssigen Kultur von Claviceps purpurea L-Thiazolidin-4-carbonsäure oder ein Salz dieser Säure zugibt, und die erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre Säureadditionssalze überführt.