AT408069B

AT408069B - Stoffgemisch

Info

Publication number: AT408069B
Application number: AT36099A
Authority: AT
Original assignee: Tichonov Alexandros
Priority date: 1999-03-03
Filing date: 1999-03-03
Publication date: 2001-08-27
Also published as: ATA36099A

Description

Die Erfindung betrifft ein Stoffgemisch.

Der Anteil von hormonabhängigen Geschwülsten (Tumoren) an bösartigen Neubildungen im menschlichen Körper ist zahlenmässig erheblich Als die häufigsten Formen gelten der Gebarmutterkrebs (bis zu 80% der Geschwülste der weiblichen Geschlechtsorgane), der Milchdrüsen- krebs (in einigen Ländern die häufigste Geschwulstart bei Frauen), Krebs der Eierstöcke (bis zu
16% der Geschwülste der weiblichen Geschlechtsorgane), Krebs der Vorsteherdrüse (2 bis 3% aller Geschwülste bei Männern). Seltener kommen in der klinischen Praxis Krebs von Leber und Thymus vor. Die Behandlung von hormonabhängigen Geschwülsten ist öfters operativer Art. Jedoch sind in vielen Fällen wegen der Ausbreitung der Geschwulst die Bestrahlung und Chemotherapie notwendig.

Der Erfolg von der Arzneimitteltherapie hängt grossteils von der zytostatischen und/oder zytotoxischen Wirkung der Geschwulst-Präparate auf die Krebszellen ab. Das onkofetale Eiweiss des menschlichen Blutserums Alpha-Fetoprotein (im Folgenden kurz : AFP genannt) findet für diese Ziele seit langem schon Anwendung. Bekannt ist AFP für sein selektives Eindringen in die Geschwulstzellen, welche auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für dieses Eiweiss (Rezeptorendozytose) besitzen ; hierbei sind die normalen Zellen eines erwachsenen Organismus nicht zur AFP-Resorption geeignet [1, 2]. Erstmals hat Doktor Deutsch der Universität in Madison (Staat Viskonsin, USA) das AFP zur gezielten Beförderung des Zytostatikums Daunomizin verwendet [3].

In Russland geht die zweite Etappe der klinischen Prüfungen des Anttgeschwutstpräparates auf Basis von einem fetalen menschlichen AFP (als Transporteiweiss) und einem kovalenten Doxorubicin-Estron-Ver- bund (als Zytostatikum) im onkologischen wissenschaftlichen Blochin-Zentrum in Moskau erfolgreich zu Ende [4].

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Stoffgemisch mit verbesserter und spezifischer Wirkung gegen insbesondere hormonabhängige Geschwülste zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Stoffgemisch gelöst, welches onkofetales Alpha-Fetoprotein (AFP) und ein Zytotoxikum aus der Gruppe der polychlorierten Biphenyle, aus der Gruppe der polychlorierten Dibenzofurane und/oder aus der Gruppe der polychiorier- ten Dibenzodioxine enthält.

Es hat sich gezeigt, dass ein Stoffgemisch der erfindungsgemässen Zusammensetzung die biologische Aktivität der freien (nicht im Gemisch mit AFP) erfindungsgemäss vorliegenden Zytotoxika erheblich erhöht. Weiters weist das erfindungsgemässe Stoffgemisch eine hohe Selektivität in Bezug auf verschiedene Zell linien auf
Bevorzugt stammt das Zytotoxikum aus der Gruppe von Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD), 1, 2, 3, 7, 9-Pentachlordibenzofuran, 2, 3, 4, 7, 8-Pentachlordibenzofuran, 2, 3, 7, 8- Tetrachlordibenzofu- ran sowie 1, 3, 6, 8-Tetrachlordibenzofuran. Besonders bevorzugt ist das Zytotoxikum Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD).

TCDD stellt eine der toxischsten chemischen Verbindungen dar [5-7]. Die Eignung von TCDD zum Töten der Zellen nach einem apoptotischen Mechanismus (programmierbares Zugrundegehen von Zelle, PCD) ist bekannt [8, 9]. Insbesondere kommt diese apoptotische TCDD-Wirkung bei Zellen von hormonabhängigen Organen und Geweben zum Ausdruck. Insbesondere werden in diesem Zusammenhang Gebärmutter, Milchdrüse, Thymus, Eierstöcke und Vorsteherdrüse erwähnt [9-12]. Es wurde entdeckt, dass das TCDD in vitro und in vivo eine ausserordentlich hohe zytotoxische Aktivität gegenüber menschlichen Krebszellen der Milchdrüse, Gebärmutter und Eierstöcke aufweist [13-15]. Aber bis vor kurzem blieben für eine klinische Anwendung von TCDD zwei Hauptprobleme ungelöst.

1) Eine geringe TCDD-Löslichkeit im wässrigen Medium (TCDD ist eine hochhydrophobe Verbindung, was seine Anwendung in wassrigen Systemen verhindert).

2) Die ungenügende Selektivität von TCDD auf Zielzellen (eine TCDD-lnJektion in den Körper führt neben einer geschwulsthemmenden Aktivität zur Entstehung vielfacher toxischen Systemreaktionen).

Es wurde nun gefunden, dass TCDD imstande ist, sich an menschliches fetales AFP zu binden. Als Folge entsteht ein nichtkovalentes AFP-TCDD-Konjugat in einem molaren Verhältnis von AFP : TCDD = 1 : 2.

Es zeigt sich, dass In diesem Konjugat eine Steigerung der TCDD-Löslichkeit in wässrigen Medien etwa um das 5000-fache im Vergleich zu freiem TCDD erreicht werden kann. Durch den

Einsatz von AFP als Transporteiweiss kann weiters eine hohe spezifische Selektivität in Bezug auf verschiedene Zielzellen erreicht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das erfindungsgemässe Stoffgemisch als Iyophili- siertes Pulver vor. Es hat sich gezeigt, dass das Konjugat aus AFP und TCDD als Iyophilisiertes
Pulver über längere Zeit ohne Änderung des Verhältnisses AFPITCDD und ohne Einbussen an bio- logischer Aktivität lagerbar ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird auch durch ein Arzneimittel gelöst, welches das erfindungsgemässe Stoffgemisch enthält. Weiters wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Arzneimittel zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung von hormonabhängigen Geschwülsten, insbesondere Tumoren, gelöst, welches ein erfindungsgemässes Stoffgemisch ent- hält.

Es zeigt sich, dass das erfindungsgemässe Arzneimittel gegenüber den Zellen des mensch- lichen T-Zellen-Lymphoms CEM, den menschlichen Krebszellen der Milchdrüse MCF-7 und menschlichen Hepatomzellen HepG2 eine ausgesprochen gute zytotoxische Aktivität in vitro entwickelt. Erfindungsgemässe Arzneimittel können zur Behandlung der Gebärmuttergeschwulst, von
Milchdrüsenkarzinom, von Eierstöcken-, Vorsteherdrüse-, Leber-, Hoden- und Thymuskrebs verwendet werden.

Mit dem vorliegenden erfindungsgemässen Stoffgemisch sowie dem erfindungsgemässen Arzneimittel wird es somit ermöglicht, ein Verfahren zur Unterdrückung des Krebszellenwachstums von hormonabhängigen Organen zur Verfügung zu stellen.

Zur Herstellung eines erfindungsgemässen Stoffgemisches wird bevorzugt ein molarer Überschuss an Zytotoxikum in Dioxan aufgelöst, dieser Lösung die benötigte Menge an AFP gelöst in Phosphatpuffer langsam zugegeben, die Reaktionsmasse inkubiert und der gebildete Komplex auf einer Säule von überschüssigem Ausgangsmaterial und Verunreinigungen abgetrennt.

Als Ergebnis des Verfahrens wird ein stabiler, nicht kovalenter TCDD/AFP-Verbund mit einem molaren Verhältnis von Liganden zu Eiweiss gleich 2 : 1 erzielt. Dieser Verbund weist eine hohe Wasserbeständigkeit auf. Die Messungen ergaben, dass das TCDD/AFP-Verhältnis bei einer Lagerung des erzeugten Verbundes in wässriger Pufferlösung bei einer Temperatur von +4 C zumindest 15 bis 20 Tage stabil bleibt.

Nach einer Lyophilisation aus dem wässrigen Puffer im Beisein von Mannitol als Stabilisator und bei einer Lagerung unter Inertgas bei einer Temperatur von-70 C wurden innerhalb von 60 Tagen weder Änderungen am Verhältnis TCDD/AFP noch Einbussen an biologischer Aktivität festgestellt.

Im Falle der Verwendung einer Standardmethode, die zur Erzeugung eines Überschusses an gebundenem TCDD und sowie zur Abtrennung von überschüssigem freiem TCDD vom erzeugten Verbund mittels Gel-Filtration dient, hängt der TCDD-Gehalt Im AFP-hältigen Verbund von der ursprünglichen Eiweisskonzentration, dem Verhältnis des Probevolumens zu Säulenvolumen und - geometrie, dem verwendeten Elutionsmittel und anderen Faktoren ab. Üblicherweise lag die TCDD-Konzentration im erzeugten Verbund bei 2 bis 7 ig/rn !. Durch den Einsatz von modernen Membraneinrichtungen zur Eiweisskonzentrierung lässt sich die TCDD-Konzentration auf 10 bis 30 jlg/ml ohne wesentliche Verluste oder Änderungen in der Stöchiometrie des Verbundes steigern.

Beispiele
1) Erhalt von menschlichem Aloha-Fetoorotein (AFP) :
Fraktionierung mit Ammoniumsulfat :
Es wurde nach der Prüfung auf Hepatitis B-Antigene, Syphilis und AIDS ein Nabelserum nach einer normalen Geburt bei einer Schwangerschaftsdauer von 32 bis 40 Wochen erhalten. Die aus diesen Tests negativ ausfallenden Serumproben wurden eingefroren und bis zur Verwendung bei einer Temperatur von-70 C aufbewahrt. Vor dem Beginn der AFP-Ausscheidung wurde das Serum aufgetaut (12 Stunden bei +4 C). Die unlöslichen Bestandteile wurden mit einer Zentrifuge beseitigt (Zentrifuge J2-21, Rotor JA-14 Beckman, USA ; 30 Minuten, 10 000 Ulmin).

Dem Überstand wurde unter Rühren und Abkühlen mit Eis eine kalte gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung bis

zum Erreichen der 30%igen Sättigung zugemischt. Nach der Zugabe der notwendigen Sulfatmenge wurde die Lösung zur Sedimentbildung ruhig in einem Kühlschrank bei +4 C über Nacht stehen gelassen. Das Sediment wurde wiederum mit einer Zentrifuge (40 min, 10 000 Ulmin) abgetrennt. Dem Überstand wurde unter Rühren und Abkühlen mit Eis trockenes Ammoniumsulfat bis zum Erreichen der 70%igen Sättigung zugemischt.

Nach der Zugabe der notwendigen Sulfatmenge wurde die Lösung zur Sedimentbildung ruhig in einem Kühlschrank bei +4 C über Nacht stehen gelassen Das Sediment wurde wiederum mit einer Zentrifuge (45 min, 10 000 U/min) abgetrennt. Das erhaltene Sediment wurde in einer 10 mM Natriumphosphat-Lösung pH 7. 3 (das Endvolumen betrug gewöhnlich 65-70% vom Ausgangs-Serumvolumen) gelöst und zur Beseitigung vom Ammoniunsulfat gegen 10 110 mM Phosphatpuffer in einer semipermeablen Membran vom Typ "künstliche Niere" dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung zentrifugiert (45 min, 10 000 Ulmin) und die erhaltene helle Lösung auf die Affinitätschromatographiesäule mit den zum AFP spezifischen monoklonalen Antikörper aufgetragen.

Ausscheidung monoklonaler Antikörper
Ascites-Flüssigkeit (100-150 ml) wurde aufgetaut und das Sediment mit der Zentrifuge (Rotor JA-20,500 U/min, 20 Minuten) abgetrennt. Der Flüssigkeit wurde unter Rühren und Abkühlen mit Eis das gleiche Volumen von gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung zugegeben und die Mischung für 12 Stunden bei +4 C stehen gelassen. Das Sediment wurde durch Zentrifugation auf übliche Weise abgetrennt. Die Flüssigkeit wurde abgelassen, das Sediment in 100 mi 20 mM Phosphatpuffer, der 150 mM Natriumchlorid enthält, pH 7, 3 (PSP) aufgelöst. Um das Ammoniumsulfat zu beseitigen, wurde gegen denselben Puffer dialysiert. Dann wurde die Lösung auf eine mit Protein A modifizierte Agarose ( (Protein A Sepharose (Pharmacia, Schweden)) gefüllte Säule (1, 6 x 10 cm) aufgetragen.

Das Eiweiss im Eluat wurde mittels Photometer bei 280 nm (Unicord Sll (LKB, Schweden)) detektiert. Nach dem Auftragen wurde die Säule mit PSP bis zur Stabilisierung der Detektor- Basislinie gewaschen und die Antikörper aus der Säule mit 0, 1 M Natriumcitrat-Buffer, pH 4, 0 eluiert. Unmittelbar nach der Elution des Proteinpeaks aus der Säule wurde das Eluat mittels gedünnter NaOH-Lösung auf einen neutralen pH-Wert gebracht und die Lösung auf der PolycarbonatMembran (PM-30 (Amikon, Niederlande)) konzentriert.

Vorbereitung der Affinitätschromatographiesäute
Das Affinitätssorbens (100-140 ml) auf der Basis von monoklonalen Antikörpern und modifizierter Agarose ( (Sepharose CL-4B (LKB-Pharmacia, Schweden)) wurde gemäss der Standardmethode für die Aktivierung von modifizierter Agarose (Sepharose) mit Bromcyan in Aceton mit Triethylamin als Katalysator [16] erhalten. Nach der Konjugation mit monoklonalen Antikörpern wurden die Nebenprodukte der Reaktion vom Sorbens abgewaschen, in die Säule mit einem Durchmesser von 50 mm gepackt und mit PSP abgeglichen.

Affinitätschromatographie
Die das AFP enthaltende Ammoniumsulfat-Fraktion wurde nach der Dialyse innerhalb von 12-14 Stunden auf die Affinitätschromatographiesäule aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit 0, 1 M Tris-Chloridbuffer, pH 8, 2, gewaschen, bis kurz vor der völligen Elution des ungebundenen Proteins. Das Zielprotein wurde mit demselben Puffer mit einem Anteil von 4 M Harnstoff eluiert.

Das Protein im Eluat wurde mit einem Durchgangsphotometer bei 280 nm detektiert. lonenaustausch-Chromatographie
Der Proteinpeak wurde nach der Affinitätschromatographiesäule ggf. nach Korrektur des pHWertes unmittelbar auf die mit 0, 1 M Tris Chlorid-Puffer, pH 8, 2, abgeglichene lonenaustauschSäule (1, 6 x 15 cm) mit kovalent gebundenem Diethylaminoethylgruppen ( (DEAE-ToyoPearl M650 (Toyo Soda, Japan)) aufgetragen. Nach dem Auftragen der ganzen Probe wurde die Säule mit demselben Puffer durch Erhöhung der Kaliumchlorid-Konzentration (von 0 bis 0, 6 M) eluiert.

Gelpermeations-Chromatograph le
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einer Ultraschalizelle mittels einer Polycarbonat-Membran ( (PM-10 (Amicon, Niederlande)) konzentriert. Eine Säule (2, 6 x 150 cm) gefüllt mit einer Matrix aus mit N, N'-Methylenbis (acrylamid) vernetzten Dextranketten ( (Sephacryl S200HR (LKB-Pharmacia Schweden)) wird mit PSP, dem 0, 02% Natriumazid zugesetzt worden, abgeglichen. Die Probe wird aufgetragen und die Saule mit demselben Puffer eluiert. Das Protein wurde entsprechend dem photometrischen Profil ausgewählt Die Fraktionen, die AFP in monomerer Form enthielten, wurden vereinigt, auf der Membran (PM-10 (Amikon, Niederlande)) bis zur Dichte 2-4 mg/ml konzentriert, Iyophilisiert, die die Abfüllung des Lyophilisas in Ampullen erfolgt unter Stickstoffumgebung.

Die Aufbewahrung der Ampullen erfolgt bei -70oC.

2) Herstellung des nicht-kovalenten Koniuoates aus TCDD und AFP :
TCCD (0, 8-0, 9 mg/mi) wurde in Dioxan aufgelöst. Die Lösung wurde in Stickstoffumgebung bei +4 C aufbewahrt. Die TCDD-Lösung in Dioxan wurde der AFP-Lösung mit einer Proteinkonzentration von 1, 5-2, 0 mg/mI in PSP langsam unter Rühren zugegeben, so dass die Endkonzentration an Dioxan 5% (v/v) nicht überstieg. Die Reaktionsmasse wurde 1 bis 6 Stunden bei 30-35 C inkubiert.

Nach dem Inkubationsende wurde das gebildete Konjugat aus AFP-TCDD von den niedrigmolekularen Beimischungen durch Gelchromatographie ( (Sephadex G-25 sf (Pharmacia, Schweden)) abgetrennt. Die Säule war mit PSP das 10% Acetonitril (v/v) enthielt abgeglichen. Jene Fraktionen, die das Zielkonjugat enthielten, wurden vereinigt und bei +4 C bis zu einer qualitativen bzw. quantitativen Analyse, in der Regel nicht mehr als 24 Stunden, aufbewahrt. Für eine längere Lagerung wurde der Lösung trockenes Mannit (bis 10%) zugegeben, die Mischung über einen Ultrafilter (0, 22 m) gefiltert, in Glasampullen abgefüllt und Iyophilisiert. Nach dem Trocknen wurden die Ampullen mit sterilem Stickstoff oder Argon gefüllt, mit einem Wasserstoffbrenner dichtgelötet und bei -700C eingelagert.

3) Quantitative Bestimmung vom TCDD mittels Reversed Phase-Chromatographie
Die Ermittlung des TCDD-Gehaltes im erzielten Konjugat wurde anhand einer extra hierfür entwickelten chromatographischen Methode mit einem äusseren Standard durchgeführt. Die Analyse dauerte von 3 bis 15 min, die Nachweisgrenze lag bei 10 ng, der Variationskoeffizient bei 4%. Ein typisches Chromatogramm, welches bei der TCDD-Detektion in seinem Konjugat mit AFP erhalten wurde, ist in Fig. 1 dargestellt.

Die quantitative und qualitative Bestimmung von TCDD wurde mittels Reversed Phase-
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man, USA)), einem Schlaufeninjektor (M-7125) mit einem Schlaufenvolumen von 500 111 (Rhedyne, USA), einer HPLC-Reversed Phase-Säule mit Oktyl-Gruppen (Ultraspere Octyl, 3 jim, 0, 46 x 7, 5 cm) und einem spektrophotometrischen Detektor ( (M-167 (Beckman, USA)). Die Fläche der chromatographischen Peaks und die Bearbeitung der Analysenergebnisse wurden unter Verwendung des chromatographischen Programms "GOLD Personal Chromatograph" (Beckman, USA) durchgeführt.

Die Trennung wurde im System. A = 0, 1 M Ammoniumacetat, pH 6, 0, 10% Gehalt an Aceto- nitril (v/v) ;
B = 50 : 50 = Acetonitril : lsopropanol durchgeführt.

Die Analyse wurde bei einer Flussgeschwindigkeit von 1, 5 ml/min nach einer Gradientenelution von 65 bis 85% der B-Komponente, Retentionszeit 10 min, durchgeführt. Bei genügenden TCDDKonzentrationen in den Proben (mehr als 1 pM) wurde die Analyse gemäss einer isokratischen Elu- tion bei 75% von B durchgeführt. In diesem Fall betrug das Probevolumen höchstens 20 111 und die Analysezeit verringerte sich auf 3 Minuten. Um eine qualitative Bestimmung durchzuführen, wurden auf die Säule von 5 bis 500 111 einer Lösung des TCDD : AFP-Konjugats aufgetragen.

Es wurde gleichzeitig ein äusserer Standard unter Verwendung einer TCDD-Lösung in Dioxan (Konzentration 0, 1-0, 2 mg/mi) bestimmt : Den Mittelwert erhielt man aufgrund dreier paralleler Konzentrationsbestimmungen sowohl in den Proben, als auch in Standardlösungen, Die Fehler wurden nach der

Methode kleinster Quadrate errechnet.

4) Prüfung biologischer Aktivität in vitro.

Zellenzüchtung
Für den biologischen Test von TCDD und dessen Konjugat mit AFP wurden verwendet : Menschliches T-Lymphozyten der Zellinie CEM, Karzinom menschlicher Milchdrüse Linie MCF-7 und menschliches Hepatom Linie HepG2. Die Zellen der Linie CEM wurden in Kunststofffläschchen (Costar, USA), in flüssigem RPMI 1640-Medium ohne L-Glutamin und mit Natriumbicarbonat (Sigma, USA) mit einem Gehalt von 10% embryonalem Kälberserum (Gibco, USA), 100 Einhei-
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kultiviert. Die Zellinie MCF-7 wurde bei gleichen Bedingungen, jedoch mit dem Dulbecco's modified Eagle's Medium mit L-Glukose, Natrium Bicarbonat, Pyridoxin Hydrochlorid, ohne L-Glutamin (DMEM (Sigma)) gezüchtet.

Bestimmung der zytotoxischen Aktivität :
Um die Toxizität von TCDD und seinem nichtkovalenten Komplex mit AFP einzuschätzen, wurde eine Aussaat von Zellen in 96-Wells Mikrotiterplatten (Costar) mit je 15 000 Zellen pro Well unter Zusatz verschiedener Konzentrationen der zu testenden Verbindungen vorgenommen. Diese wurden unter Standardbedingungen für 72 Stunden inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem MMT-Test nach der Mosmann-Methode [17] festgestellt. 2 Stunden vor dem Inkubationende wurde jedem Well je 50 ut 1 Lösung MTT-Bromid (= (3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (Sigma, USA)) im Medium für Zelizüchtung in einer Konzentration von 1 mg/mi zugegeben.

Nach der Färbung wurde das Medium entfernt, die ausgefallenen Formazan-Kristalle In 150 J Dimethylsulfoxid aufgelöst und die Farbungsintensität mittels Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 540 nm mit dem mehrkanaligen Spektrophotometer (Labsystem, Finland) gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde in Prozent zur entsprechenden Kontrollgruppe bestimmt.

5) Ergebnisse der Prüfung auf die biologische Aktivität
Die biologische Aktivität des Konjugates aus TCDD und AFP gegenüber freiem TCDD wurde nach seiner toxischen Wirkung auf menschliche Tumorzellen unterschiedlicher Herkunft beurteilt.

Für sämtliche untersuchte Zell linien ist die Zytotoxizität des TCDD/AFP-Verbundes wesentlich höher als diejenige von freiem Dioxin Dagegen war die Differenz in der Empfindlichkeit der Zellen für die Wirkung des freien TCDD je nach Zellinie wesentlich geringer (IC50 =0, 7-8 M).

Durch die höchste Empfindlichkeit für die Wirkung des Verbundes zeichnen sich die T-Lymphozyten der Zellinie CEM (IC50 < 0, 50 nM) aus. Einigermassen stabiler sind die Zellen des Adenokarzinoms der Milchdrüse MCF-7 (IC50 = 18 nM). Die niedrigste Empfindlichkeit bei dem Versuch zeigten die Hepatomzellen der Zellinie HepG2 (IC50 = 52 nM).

In den Fig. 2a, 2b und 2c sind diese Ergebnisse graphisch zusammengefasst. Auf der Ordinate ist die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen in % und auf der Abszisse die Menge an Wirksubstanz (Konjugat AFP/TCDD oder freies TCDD) in nM aufgetragen. Die Kurven zeigen jeweils die Ergebnisse bei einer Behandlung mit dem erfindungsgemässen Konjugat aus AFP und TCDD (Kurve mit Kreisen) sowie bei einer Behandlung mit freiem TCDD (Kurve mit Quadraten).

Die Ergebnisse lassen sich tabellarisch wie folgt zusammenfassen

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<tb>
<tb> Zelllinie <SEP> IC50 <SEP> bei <SEP> Behandlung <SEP> mit <SEP> IC50 <SEP> bei <SEP> Behandlung <SEP> mit
<tb> Konjugat <SEP> TCDD/AFP <SEP> (nM) <SEP> freiem <SEP> TCDD <SEP> (nM)
<tb> Menschliche <SEP> T-Lymphozyten <SEP> < 1 <SEP> 712
<tb> der <SEP> Zelllinie <SEP> CEM <SEP>
<tb> Menschliche <SEP> Zellen <SEP> des <SEP> 18 <SEP> 7000
<tb> Adenokarzinoms <SEP> der <SEP> Milchdüse <SEP> der <SEP> Linie <SEP> MCF-7
<tb> Menschliche <SEP> Hepatomzellen <SEP> 52 <SEP> 10400
<tb> der <SEP> Linie <SEP> HepG2
<tb>

In Fig. 3 sind die Angaben über die relative Toxizität von Dioxin und seines AFP-Verbundes für diese Ze) !linien dargestellt.

In der Koordinatenachse sind in dieser Abbildung das Verhältnis der Hemm-Konstanten des TCDD/AFP-Konjugates zu freiem Dioxin (IC50 (TCDD/AFP) IIC50 (TCDD) dargestellt. In Fig. 4 sind die IC50-Werte des TCDD/AFP-Konjugates für die gleichen Zelllinien graphisch dargestellt. Man sieht daran, dass die Differenz zwischen den mehr und weniger empfindlichen Zelilinien viel höher liegt als im Falle der relativen Toxizität.

Aufgrund dieser Erkenntnisse kann man den durchaus begründeten Schluss ziehen, dass die Erzeugung des TCDD/AFP-Konjugates nicht nur die Steigerung der Löslichkeit von organischen Toxinen im Wasser, sondern auch eine erhebliche Erhöhung der biologischen Selektivität gegen- über Tumorzellen von unterschiedlichen menschlichen Organen und Geweben zur Folge hat. Dies lässt sich ohne weiteres anhand des Vergleiches der Toxizität eines freien Dioxins mit dem TCDD/AFP-Verbund für mehr oder weniger empfindliche Zelllinien (z. B. CEM und HepG2) veranschaulichen. Im Falle von Dioxin liegt diese Differenz nur beim 15-fachem (10400 : 712), während beim Konjugat dieser Wert zumindest 100mal so gross ist (52 : 0. 5 = 104)
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PATENTANSPRÜCHE : 1. Stoffgemisch, enthaltend onkofetales Alpha-Fetoprotein (AFP) und ein Zytotoxikum aus der Gruppe der polychlorierten Biphenyle, aus der Gruppe der polychlorierten Dibenzo- furane und/oder aus der Gruppe der polychlorierten Dibenzodioxine.

Claims

2. Stoffgemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytotoxikum aus der Gruppe von Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD), 1, 2, 3, 7, 9-Pentachlordibenzofuran, 2, 3, 4, 7, 8-Pentachlordibenzofuran, 2, 3, 7, 8-Tetrachlordibenzofuran sowie 1, 3, 6, 8-Tetra- chlordibenzofuran stammt.

3. Stoffgemisch nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytotoxikum Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) ist.

4 Stoffgemisch nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass AFP und TCDD in einem nicht-kovalenten Konjugat im Molverhaltnis AFP : TCDD 1 : 2 vorliegen.

5. Stoffgemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es als Iyophilisiertes Pulver vorliegt.

6. Arzneimittel, enthaltend ein Stoffgemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Arzneimittel zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung von hormonabhängigen Geschwulsten, insbesondere Tumoren, enthaltend ein Stoffgemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 5.