AT408447B - Verfahren zur enzymatischen lactosespaltung mittels membrandiffusionsreaktoren - Google Patents

Description

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   Die gegenständliche Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Lactosespaltung mit- tels Membrandiffusionsreaktoren. 



   Mit Hilfe eines solchen Verfahrens können einerseits Lactoselösungen behandelt werden und können andererseits Milch und Milchprodukte, wie Magermilch oder Molke, zu lactosereduzierten
Produkten verarbeitet werden. 



   Da etwa 75 % der erwachsenen   Weltbevölkerung   lactoseintolerant sind, besteht ein sehr gro- sser Bedarf an lactosereduzierten Milchprodukten. Zudem hat es sich herausgestellt, dass die Lac- tose der Milch oftmals auch von Tieren nicht vertragen wird, weswegen mit lactosearmen Milch- produkten In der Tierzucht bemerkenswerte Vorteile hinsichtlich der Ernährung und des Wachstums der Tiere erzielt werden. Schliesslich wird darauf verwiesen, dass es bei Anhebung des Feststoffgehaltes der Milch auf über 30 % zu einer Destabilisierung der Proteinphase kommen kann. Ähnliche Nachteile ergeben sich   z. B.   in der Speiseeisindustrie, da es deshalb, da das Protein wegen der Kristallisation der Lactose bei niedrigen Temperaturen nur schwer wieder suspendiert werden kann, nicht möglich ist, Milch mit einem hohen Feststoffgehalt zu verwenden.

   Ausserdem führt die Lactosekristallisation zu einer sog. Sandigkeit des Eises. 



   Lactose ist ein Disaccharid, weiches durch das Enzym   ss-Gtycosidase,   wie ss-Glucosidase und   ss-Galactosidase,   in seine Bestandteile Glucose und Galactose gespalten werden kann. Die direkte Zugabe dieser Enzyme wird von vielen Konsumenten abgelehnt. Da sie zudem auch sensorische
Nachteile mit sich bringen kann, wurde nach anderen Möglichkeiten zur enzymatischen Spaltung der Lactose gesucht. 



   Aus der DE 2151534 A1 ist es bekannt, ein Enzym auf oder in Trägern zu immobilisieren und die Milch oder das Milchprodukt mit diesen Feststoffen in Perkolationsanlagen zu behandeln. Es hat sich jedoch gezeigt, dass diese Anlagen zur Verblockung durch die Bestandteile der Milch neigen und dass ausserdem ein   mikrobieller   Befall der Milch bzw. der Molke nur schwer zu verhindern ist. Zudem ist die Sterilisation der Anlagen äusserst aufwendig, insbes. im Hinblick darauf, dass bei Hitzebehandlungen auch das verwendete Enzym geschädigt wird. 



   Eine Verbesserung auf diesem Gebiet schien in der Verwendung von Membrandiffusionsreaktoren zusammen mit mesophilen Enzymen zu liegen. In derartigen Reaktoren ist die Milch von der Enzymlösung durch eine Membran, deren Porengrösse eine Diffusion der Lactose in die   Enzymlö-   sung und eine Rückdiffusion der Spaltprodukte in die lactosearme Milch gestattet, getrennt. Es wird hiezu auf P. Czermak, BioEngineering 8, Seiten 47 bis 52, verwiesen. Prozesse dieser Art können bei Temperaturen bis zu maximal   45 C   ablaufen. 



   Membrandiffusionsreaktoren sind häufig als Hohlfaser-Reaktoren ausgebildet, in weichen das zu behandelnde Produkt im Inneren der Fasern, welche von der   Permeatiösung   umgeben sind, strömt. Dabei ist das Enzym in der Permeatlösung enthalten. Bei Membrandiffusionsverfahren wird durch die Trennung der   lactosehaltigen     Substratlösung   von der Enzymlösung neben mehreren anderen Vorteilen auch eine mögliche Inaktivierung des Enzyms durch die Milchbestandteile, nämlich durch Proteine und Restfette, verhindert. Von Bedeutung ist weiters die mögliche Erhöhung der Langzeitstabilität des Enzyms durch getrennte Behandlung der Enzymlösung sowie die Vereinfachung des Prozesses deshalb, da eine nachfolgende Abtrennung des Enzyms aus dem Produktstrom nicht erforderlich ist. 



   Auch bei diesen Anlagen besteht naturgemäss die Gefahr der mikrobiellen Infektion. Um diese zu vermeiden, wurde die Verwendung von dampfsterilisierbaren Membrandiffusionsreaktoren vorgeschlagen. Es wird hiezu auf P. Czermak,   DECHEMA-Biotechnol.   Conf. 2, Seiten 133 bis 145,   Elsevier   Applied Science, London 1991, verwiesen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass diese Reaktoren so aufwendig und teuer sind, dass sie für industrielle Verfahren derzeit nicht in Frage kommen. 



   Der gegenständlichen Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, durch welches die den bekannten Verfahren anhaftenden Nachteile vermieden werden. Dies wird   erfindungsgemäss   dadurch erzielt, dass als Enzym zur Lactosespaltung ein thermostabiles Enzym oder ein Gemisch thermostabiler Enzyme verwendet wird und dass das Verfahren bei einer Temperatur zwischen 50"C und   850C   durchgeführt wird. 



   In diesem Temperaturbereich, welcher der Pasteurisierungstemperatur gleichkommt, wird das Wachstum der meisten Mikroorganismen unterdrückt. Beim Arbeiten in einem Membrandiffusionsreaktor ergibt sich aufgrund der höheren Temperaturen eine gesteigerte Lactosediffusion, was zu einer besseren Ausnützung der Membran führt. 

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   Vorzugsweise wird als Enzym eine thermostabile   ss-Glycosidase, z. B.   eine   ss-Galactosidase   bzw. ss-Glucosidase, aus einem rekombinanten Mikroorganismus, verwendet. Eine solche ss-Glycosidase wird z. B aus Sulfolobus solfataricus oder Pyrococcus furiosus gewonnen. Es wird hiezu auf die Literaturstellen Enzyme and Microbial Technology 17 992-997,1995 von M. Moracci, R. Nucci, F. Febbraio, C. Vaccaro, N. Vespa, F. La Cara und M. Rossi, sowie"Journal of Bacteriology",   Dec. 1995 p. 7105-1711   von   W. G. B. Voorhorst, R. 

Claims (16)

1. L. Eggen, E. J. Luesink und W. M. de Vos, verwiesen. Für diesen Zweck können jedoch auch andere thermostabile, lactosespaltende Enzyme eingesetzt werden. Eine Arbeitstemperatur von 500C bis 85 C bedeutet, dass immer noch extrem thermophile Mikroorganismen im Permeat vorliegen können. Es hat sich daher als vorteilhaft erwiesen, das Permeat mindestens teilweise sterilzufiltrieren und bzw. oder mit UV-Licht zu bestrahlen. Hierdurch ergibt sich die Möglichkeit einer kontinuierlichen Verfahrensführung, da die Anlage häufig stillgelegt und gereinigt werden muss. Die gegenständliche Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zur enzymatischen Lactosespaltung mit Hilfe mesophiler Enzyme bei einer Temperatur von maximal 500C in einem Membrandiffusionsreaktor, bei weichem Verfahren erfindungsgemäss das Permeat mindestens teilweise sterilfiltriert und bzw. oder mit UV-Licht bestrahlt wird. Dadurch ergibt sich gleichfalls der Vorteil der kontinuierlichen Verfahrensführung. Beide Sterilisationsverfahren, nämlich die Sterilfiltration und die UV-Bestrahlung, sind an sich zum Zweck der Befreiung von Mikroorganismen bekannt, jedoch wurden sie bisher im Zusammenhang mit der Lactosespaltung in Membrandiffusionsreaktoren nicht eingesetzt. Dies ist offenbar darauf zurückzuführen, dass nur eine sehr sorgfältig Verfahrensführung dazu führt, dass nicht gleichzeitig mit der Abtötung von Mikroorganismen auch die Enzyme inaktiviert werden. Zu den Membrandiffusionsverfahren wird darauf verwiesen, dass die erforderliche Membranflache und die Kosten der Enzymibsung Faktoren sind, weiche die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens stark beeinflussen. Jede Massnahme, durch welche die Stabilität der Enzymlösungen erhöht wird, ist als wesentliche Einsparung anzusehen. Da die Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen die Enzyme inaktivieren können, trägt eine kontinuierliche Sterilisation der Permeatiösung ganz wesentlich zur Stabilisierung der Enzymlösung bei. Die Membranfläche, welche zur Herstellung einer bestimmten Menge lactosearmer Milch pro Zeiteinheit erforderlich ist, hängt in erster Linie von der Lactosediffusionsgeschwindigkeit ab. Dabei spielen neben verschiedenen chemisch-physikalischen Faktoren, wie Temperatur, Lactosekonzentration usw., auch modulspezifische bzw. membranspezifische Eigenschaften eine wichtige Rolle. Hierzu gehören beispielsweise der Hohlfaserdurchmesser, die Porengrösse der Membran und das Membranmaterial. Bei der Entwicklung der erfindungsgemässen Technologie stellt somit die Auswahl eines geeigneten Membranmoduls einen wichtigen Aspekt dar. Es wird ausserdem darauf verwiesen, dass die angeführten Einflussfaktoren teilweise voneinander abhängig sind. So kann beispielsweise durch die Erhöhung der Enzymkonzentration eine teilweise Reduzierung der Membranfläche erreicht werden. Bel einer gewünschten Qualität des Endproduktes (Hydrolysegrad) ist somit nur die Gesamtwirtschaftlichkeit für die Auswahl der Verfahrensführung ausschlaggebend. Das erfindungsgemässe Verfahren ist nachstehend anhand von Diagrammen und Darstellun- gen näher erläutert. Es zeigen : EMI2.1 cosidase aus Pyrococcus furiosus, Fig.

2 die schematische Darstellung einer mit Membrandiffusionsverfahren arbeitenden Anlage, Fig. 3 die schematische Darstellung einer mit Membrandiffusionsverfahren arbeitenden Anlage, bei welcher das Permeat durch eine Sterilfiltration und bzw. oder eine UV-Bestrah- lungseinheit geführt wird, und Fig. 4 eine graphische Darstellung des Einflusses der UV-Bestrahlung auf Keimzahl und Enzymaktivität. Die vorzugsweise verwendeten Enzyme wurden aus rekombinanten E. coli gewonnen. Beispielsweise erfolgte die Produktion der ss-Glycosidase aus Pyrococcus furiosus durch Fermentation des rekombinanten E. coli BL 21 (DE3). Aus dem in Fig. 1 dargestellten Diagramm ist ein typischer Fermentationsverlauf ersichtlich. Unter Optimalbedingungen lag die Halbwertszeit des Enzyms aus <Desc/Clms Page number 3> S. solfataricus bei ca. 10 Tagen, wogegen das Enzym aus Pyrococcus furiosus unter den gleichen Bedingungen mehr als zwei Monate stabil war. Das pH-Optimum lag in beiden Fällen zwischen 5, 0 und 6, 0, was für die Anwendung zur Lactosespaltung in Milch (pH ca 6, 6) nahezu optimal ist Der Einfluss von hohen Ionenkonzentrationen bewirkt bei vielen mit Enzymen arbeitenden Prozessen eine Reduktion der Enzymaktivität. In der Milch sind im Durchschnitt insgesamt ca 200 mM Kalium, Calcium, Magnesium und Natrium enthalten. Im vorliegenden Fall reduziert sich die Aktivität der ss-Giycosidase aus S. solfataricus auf ca 85 %, wogegen die Aktivität der ss-Glycosidase aus P. furiosus um mehr als ein Drittel reduziert wird. Diese Werte sind für die Durchführung des erfin- dungsgemässen Verfahrens durchaus zufriedenstellend. Was die Produktion der Enzyme betrifft, so wurden im Schüttelkolben 3000 Ull Kulturlösung bzw. 24500 U/1 erzielt. Im 151-Fermenter konnte die Ausbeute für die ss-Gtycosidase aus P. furiosus auf mehr als das Vierfache erhöht werden. Die Überprüfung und Optimierung der Verfahrensbedingungen erfolgten an einer Laboranlage eines Membrandiffusionsreaktors, welcher nachstehend anhand der Fig. 2 erläutert ist. Die Milch wird kontinuierlich aus einem Vorratsbehälter 1, welcher sich in einem Kühlbad 2 befindet, ent- nommen und über eine Pumpe 3 und einen Wärmetauscher 4 in den Membrandiffusionsreaktor M geleitet. Währenddessen wird die Enzymlösung aus einem Enzymbehälter 5 im Gleichstrom ebenfalls durch den Membranreaktor M geleitet. Wesentlich sind der Druck und die Temperatur der Anlage, welche u. a. mit Hilfe von Temperaturfühlern 6 und Manometern 7 überwacht werden. Die Enzymlösung wurde über das externe Vorratsgefäss im Kreis gepumpt. Als Basis für die vorliegenden Arbeiten wurden vorerst folgende verfahrenstechnische Parameter gewählt : Porengrösse entsprechend ca. 5000 Dalton ("cut off') Faserinnendurchmesser ca. 200 Mikrometer spezifische Hydrolyse- ca. 2 Liter Milch pro m2 Leistung Membranfläche und Stunde (bei ca. 80 % Hydrolysegrad) Es zeigte sich jedoch, dass für das erfindungsgemässe Verfahren auch Membranen mit grösseren Poren (entsprechend ca. 10000 Dalton) eingesetzt werden können. Allerdings waren bei einer Porengrösse entsprechend ca. 30000 Dalton bereits Enzymverluste merkbar. Der Innendurchmesser der Fasern konnte auch bei 500 Mikrometer liegen. Versuche ergaben, dass dabei eine etwa gleiche Hydrolyseleistung wie bei einem Innendurchmesser der Fasern von 200 Mikrometer erzielbar war. In Fig. 3 ist eine Anlage gemäss Fig. 2 dargestellt, wobei zusätzlich die Permeatlösung in einer Vorrichtung 8 einer Sterilfiltration bzw. in einer Vorrichtung 9 einer UV-Bestrahlung ausgesetzt wird. Aus dem Diagramm gemäss Fig. 4 ist ersichtlich, dass bei Einwirkung von UV-Licht die Keimzahl innerhalb kürzester Zeit rasch absinkt. Die Enzymaktivität bleibt jedoch nahezu stabil, was für die Verwendbarkeit dieses Behandlungsverfahrens ausschlaggebend ist. Nachstehend sind sowohl für die Lactosehydrolyse mit thermostabilen Enzymen als auch für das analoge Verfahren mit mesophilen Enzymen jeweils Beispiele angegeben. BEISPIEL 1 Lactosehvdrolvse mit thermostabilen Enzymen In einer Anlage gemäss Fig. 2 wurde die Magermilch mit Hilfe eines Wärmetauschers auf ca. 65 C (338 K) erwärmt und durch den Hohlfasermodul gepumpt. Die Hohlfasern hatten einen Innendurchmesser von ca. 0, 0005 m. Der Milchdurchfluss wurde auf ca. 0, 002 m3 pro m2 Membranfläche und Stunde eingestellt, wobei ein Hydrolysegrad von etwa 80% erzielt wurde. Wie dies aus Fig 2 ersichtlich ist, wird die Enzymlösung im Kreis gepumpt, wobei die Temperatur von ca. 338 K eingehalten wurde. Bei dieser relativ hohen Prozesstemperatur wird das Wachstum von Mikrorganismen weitgehend verhindert. Die Lactosehydrolyse kann somit über einen längeren Zeitraum kontinuierlich geführt werden. Die Halbwertszeit des eingesetzten thermophile rekombinanten Enzyms aus Pyrococcus furiosus betrug ca. zwei Wochen. In diesen Abständen wurde die <Desc/Clms Page number 4> gesamte Anlage einer Reinigung und Spülung unterzogen. BEISPIEL 2 Lactosehvdrolvse mit mesophilen Enzymen A. Sterilfiltration der Enzvmlösung Die verfahrenstechnische Durchführung des Prozesses erfolgte in einer Anlage gemäss Fig. 3. Die Anlage entspricht mit Ausnahme der Zusatzeinrichtungen für die Sterilfiltration bzw. die UVBestrahlung im wesentlichen der Anlage von Beispiel 1. Die Milch wurde mittels eines Wärmetauschers auf ca. 300C (303 K) erwärmt und durch einen Hohlfasermodul gepumpt. Die Hohlfasern wiesen den gleichen Innendurchmesser wie in der Anlage von Beispiel 1 auf und der Milchdurchfluss wurde in der gleichen Weise eingestellt. Da bei einer Temperatur von 30 C die Mikroorganismen nahezu ideale Wachstumsbedingungen in der zuckerhaltigen Enzymlosung vorfinden, ist ein kontinuierlicher Prozess ohne Sterilisation nahezu nicht durchführbar. Deshalb wurde die Enzymlösung kontinuierlich sterilfiltriert. Im vorliegenden Fall wurde ein "Cross-flow"-Mikrofiltrationsmodul mit einer Porengrösse von ca. 0,2 m eingesetzt. Wesentlich dabei war, dass die Mikroorganismen vom eingesetzten Filter zurückgehalten wurden und dass die Enzyme den Sterilfilter ungehindert passieren konnten. B. UV-Bestrahluna der Enzvmlösuna In diesem Beispiel wurde die Enzymlösung mittels UV-Bestrahlung (254 nm) in einer handels- üblichen zylindrischen Bestrahlungskammer mit regelbarer Bestrahlungsteistung behandelt. Die Bestrahlungslampe hatte eine Leistung von 25 Watt. Die Einstellung der Bestrahlungsdosis musste sehr sorgfältig erfolgen, um die Enzymlösung dabei nicht wesentlich zu inaktivieren. C. Sterilfiltration und UV-Bestrahluna der Enzvmlösuna Die Effizienz des Systems konnte dadurch gesteigert werden, dass das Verfahren mit Sterilfiltration und UV-Bestrahlung der Enzymlösung durchgeführt wurde. Die Gesamtkeimzahl konnte über mehrere Stunden auf einem sehr niedrigen Niveau gehalten werden. Die Lebensdauer der Enzyme betrug einige Tage. PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur enzymatischen Lactosespaltung mittels Membrandiffusionsreaktoren, da- durch gekennzeichnet, dass als lactosespaltendes Enzym ein thermostabiles Enzym oder ein Gemisch thermostabiler Enzyme verwendet wird und dass das Verfahren bei einer Temperatur zwischen 50 C und 85 C durchgeführt wird. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym eine thermo- stabile ss-Glycosidase, wie eine ss-Gatactosidase bzw. eine ss-Glucosidase, aus einem rekombinanten Mikroorganismus verwendet wird.

3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym eine thermo- stabile ss-Gtycosidase, vorzugsweise aus Sulfolobus solfataricus oder Pyrococcus furiosus, verwendet wird.

4. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym eine rekombi- nante thermostabile ss-Glycosidase, vorzugsweise aus E. coli BL21 (DE3), Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis oder Lactococcus lactis, verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Membrandiffusionsreaktor durchgeführt wird, wobei die Enzymlösung im Per- meatraum vorliegt, und dass das Permeat mindestens teilweise sterilfiltriert und/oder mit UV-Licht bestrahlt wird.

6. Verfahren zur enzymatischen Lactosespaltung in Membrandiffusionsreaktoren, bei wei- chem als lactosespaltendes Enzym ein mesophiles Enzym oder ein Gemisch mesophiler Enzyme verwendet wird, die Enzymlösung im Permeatraum vorliegt und die Reaktions- <Desc/Clms Page number 5> temperatur maximal 50"C beträgt, dadurch gekennzeichnet, dass das Permeat mindestens teilweise sterilfiltriert und/oder mit UV-Licht bestrahlt wird.

7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sterilfiltration bei einer Porengrösse von ca. 0, 2 11m vorgenommen wird.

8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die En- zymlösung durch ein"Cross-f "Cross-flow"-Mikrofiltrationsmodul geleitet wird.

9. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Permeat über die Sterilfiltration und/oder UV-Bestrahlung im Kreis geführt wird.

10. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es kontinuierlich durchgeführt wird.

11 Verfahren zur Herstellung eines lactosereduzierten Milchproduktes, gekennzeichnet durch die Anwendung eines der Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 10.

12. Verfahren nach Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangssubstrat Milch jeglicher Fettstufe verwendet wird.

13. Verfahren nach Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangssubstrat Molke sowie Molkefraktionen verwendet werden.

14. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangssubstrat Lactoselösungen verwendet werden.

15 Verfahren nach einem der Patentansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangssubstrate vorkonzentriert werden.

16. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranen zur Vermeidung von Enzymverlusten durch Milchproteine oder andere Protei- ne vorbelegt werden.