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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes.
Höhere Organismen sind durch ein Immunsystem ausgezeichnet, das es vor potentiell gefähr- lichen Substanzen oder Mikroorganismen schützt. Wenn eine Substanz (Antigen) in den Körper eindringt, wird es als "fremd" erkannt und mit Hilfe des Immunsystems eliminiert. Auch "entartete" körpereigene Zellen werden vom Immunsystem üblicherweise erkannt und aus dem Verkehr gezogen.
Das adaptive Immunsystem des Menschen besteht aus zwei wesentlichen Komponenten, der humoralen und der zellulären Immunität. Die adaptive Immunantwort beruht auf der klonalen
Selektion von B-und T-Lymphozyten und erlaubt im Prinzip die Erkennung jedes beliebigen Anti- gens sowie den Aufbau eines immunologischen Gedächtnisses. Diese Merkmale des adaptiven
Immunsystems werden generell bei Impfungen nutzbringend angesprochen.
Jede B-Zelle produziert einen Antikörper mit bestimmter Bindungsspezifität. Dieser Antikörper befindet sich als spezifischer Rezeptor auch in der Membran der ihn produzierenden B-Zelle. Die humorale Immunantwort gegen als fremd erkannte Antigene beruht auf der selektiven Aktivierung derjenigen B-Zellen, die solche Antikörper produzieren, die an Epitope des jeweiligen Antigens binden können. Für die Antikörpervielfalt spielen DNA-Rearrangements im Verlauf der B-Zelldiffe- renzierung eine entscheidende Rolle.
Im menschlichen Serum befinden sich in grosser Menge Antikörper verschiedenster Spezifitä- ten, Isotypen und Subklassen. Die Gesamtkonzentration aller Immunglobuline im Serum beträgt
15-20 mg/ml; d. h., dass ca. 100 g Immunglobuline verschiedenster Spezifitäten dauernd im Blut zirkulieren. Es ist nicht möglich, die genaue Anzahl aller Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität anzugeben, das Repertoir von unterschiedlichen B-Zell-Klonen in einem Menschen liegt bei etwa
109. Ein bestimmter Antikörper kann im Allgemeinen verschiedene, einander ähnliche Antigene binden, wenn auch mit unterschiedlicher Affinität und Avidität.
Das Immunsystem muss mit Hilfe endogener Regulationsmechanismen eine Homöostase be- züglich der Verteilung und Gewichtung dieser verschiedenen Spezifitäten aufrecht erhalten. Ein wesentlicher Mechanismus dafür ist das "idiotypische Netzwerk" (Ann. Immunol. 125C :
373-89 (1974)). Gegen jeden Idiotyp eines Antikörpers, welcher seine Bindungsspezifität bestimmt, gibt es anti-idiotypische Antikörper, die also an den Idiotyp des ersten Antikörpers im Sinne einer
Antigenerkennung binden. Nach diesem Erklärungsmodell sind die Wechselwirkungen zwischen den Idiotyp-spezifischen Rezeptoren auf Lymphozyten für die Regulation des Immunsystems verantwortlich.
Diese Wechselwirkungen finden offensichtlich tatsächlich statt, da gezeigt worden ist, dass im Zuge einer Immunantwort auch anti-idiotypische Antikörper gegen die durch die Im- munantwort primär induzierten Antikörper entstehen. Da es gegen jeden Antikörper anti-idiotypi- sche Antikörper gibt, sind Lymphozyten gegenüber Idiotypen von Antikörpern grundsätzlich nicht tolerant.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, in das Immunsystem einzugreifen.
1. Passive Antikörpertherapie:
Für therapeutische Zwecke ist es möglich, Antikörper, die notwendig sind, um eine bestimmte Funktion innerhalb eines Organismus zu erfüllen, diesem Organismus zuzuführen. Diese Art der Anwendung wird passive Immuntherapie genannt und kann bei verschiedenen medizinischen Indikationen eingesetzt werden, z. B. bei Krebs-Immuntherapie (Immunol. Today (2000), 21:403), Vergiftungen (Toxicon (1998), 36 :823; (1994), 49 :41), Infektionen(Clin. Infect. Dis.
(1995), 21:150). In diesen Fällen können Antikörper eingesetzt werden, die entweder aus entspre- chend immunisierten Tieren stammen oder über Immortalisierung von Immunglobulin-Genen durch verschiedene biologische oder molekularbiologische Techniken aus Zellen gewonnen werden können (z. B. Hybridoma-Technik, Phage-Display-Technik, etc. ).
Die passive Antikörpergabe hat den Nachteil, dass sie nicht langanhaltend wirkt, da die Wir- kung mit dem natürlichen Abbau der verabreichten Antikörper im Empfängerorganismus abnimmt.
2. Aktive Immunisierung:
Zur Modulation des Immunsystems kann man mit Antigenen immunisieren. Antigene sind Mo- leküle, Molekül-Komplexe oder ganze Organismen, an welche Antikörper binden können.
Nicht alle Antigene rufen eine Immunantwort hervor, d. h. nicht alle Antigene sind immunogen.
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Bestimmte kleine Moleküle werden vom Immunsystem nicht registriert (Haptene), solche kleinere
Moleküle kann man dem Immunsystem in geeigneter Form präsentieren und sie dadurch immuno- gen machen. Eine derartige Methode ist die Kopplung des Haptens an ein immunogenes Molekül, ein sogenanntes "Trägermolekül".
Andere nicht-immunogene Antigene sind sogenannte "Selbst-Antigene", also Strukturen, die vom Immunsystem als körpereigene Substanzen erkannt werden. Immunisierung mit derartigen
Antigenen führt üblicherweise zu keiner spezifischen Immunreaktion. Im Fall von Tumor- assoziierten Antigenen ist die Tatsache, dass diese Antigene eigentlich "Selbst-Antigene" sind, eine der grössten Schwierigkeiten bei der Entwicklung eines potenten Impfstoffes.
Eine aktive Immunisierung gegen Krankheitserreger wie Viren oder Bakterien mittels komplet- ter Antigene ist nur möglich, wenn die Krankheitserreger abgeschwächt oder abgetötet werden. Bei abgeschwächten Krankheitserregern besteht die Gefahr, dass es zur Reversion kommt, d. h., dass die abgeschwächten Krankheitserreger wieder zu virulenten Formen werden können. Eine Lösung eines derartigen Problems könnte die Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern als Surrogat- Antigen zur Immunisierung sein (Int. Arch. Allergy Immunol. (1994), 105:211).
Aktive Immunisierung mit anti-idiotypischen Antikörpern wurde auch zur Behandlung von Aller- gien vorgeschlagen (Int. Arch. Allergy Imunol. (1999), 118:119).
Antikörper gegen körpereigene Antigene sind allerdings im Serum eines jeden Menschen vor- handen und werden als "natürliche Autoantikörper" bezeichnet.
Anti-idiotypische Antikörper von solchen natürlichen Autoantikörpern sind an der Regulation dieser Autoantikörper beteiligt (Immunol. Reviews (1989), 110:135; Eur. J. Immunol. (1993), 23 :783).
Eine unzureichende idiotypische Regulation scheint bei einer Reihe von Autoimmunerkrankun- gen eine Rolle zu spielen: - Systemischer Lupus erythematosus (Autoimmunity (1994), 17:149); - Autoimmun Thyroiditis (Eur. J. Immunol. (1993), 23:2945); - Systemische Vaskulitis (J. Autoimmunity (1993), 6:221); - Guillain-Barre-Syndrom (Clin. Immunol. Immunopathol. (1993), 67:192); - anti-Faktor VII:C-Autoimmunerkrankung (Proc. Natl. Acad. Sei., USA (1987), 84:828).
Immunisierung mit idiotypischen Antikörpern, die Autoantigene nachahmen, wurde bei Auto- immunerkrankungen schon durchgeführt (J. Rheumatol. (1999), 26 :2602). Peptide zur Induk- tion von anti-idiotypischen Antikörpern (Proc. Natl. Acad. Sei., USA (1993), 90:8747; Immunology (1999), 96 :333) schon beschrieben.
Immunisierung bei Autoimmunerkrankungen, beruhend auf T-Zell-Rezeptoren (J. Immunol.
(1990), 144 :2167; 6,090,387 ; 6,007,815) wurde ebenfalls schon vorgeschlagen.
Aktive Immunisierung wird auch zum Schutz vor giftigen Substanzen (z.B. bakteriellen Toxi- nen) verwendet. Wenn dabei die Toxine als Impfstoff verwendet werden sollen, müssen Sie vorher abgeschwächt, bzw. inaktiviert werden. Eine derartige Inaktivierung kann aber die Wirksamkeit der Immunantwort beeinflussen. Anti-idiotypische Antikörper als Impfstoffe, die Toxine nachahmen, wurden vorgeschlagen (Int J Clin Lab Res (1992) 22:28; Clin Exp Immunol. (1992)89:378; Immuno- pharmacology. (1993)26:225)
Es wurde auch vorgeschlagen, anti-idiotypische Antikörper zum erstmaligen Immunisieren zu verwenden, um dann mit einem Impfstoff, der allein zu schwach wäre, einen höheren spezifischen Immunisierungseffekt zu erzielen (Virology (1984)136:247).
3. Entzug von Antikörpern und Immunkomplexen aus dem Blut:
Eine Möglichkeit, Antikörper aus dem Blut zu entfernen, ist die Verwendung von Perfusions- systemen (US-PS 5,122,112), die vor allem bei Autoimmunerkrankungen angewendet wurde (The Lancet (20. 10.1979), 824). Derartige extrakorporale Immunadsorptionen stellen jedoch eine grosse Belastung und ein hohes Behandlungsrisiko für Patienten dar, so dass sich diese Methode nicht zur breiten klinischen Therapie eignet.
Aktive Immunisierung zur Modulation kann derzeit mit bestimmten Antigenen durchgeführt wer- den, die entweder zu toxisch oder potentiell infektiös sein können oder aber nicht-immunogen sind.
Eine teilweise Lösung dieses Problems ist die Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern zur Immunisierung. Allerdings ist es notwendig, derartige Antikörper entweder in Zellkultur, bzw. in vitro
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herzustellen oder aber in bestimmten Organismen zu induzieren und dann einem anderen Orga- nismus zu verabreichen.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nachteile des Standes der Technik zu über- winden und Behandlungsmaterialien und Verfahren für eine Vielzahl von Erkrankungen unter
Ausnutzung des Immunsystems eines Patienten zur Verfügung zu stellen. Insbesondere sollen dabei effiziente Behandlungsstrategien für Autoimmunerkrankungen, Allergien und ähnliche Be- schwerden geschaffen werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines autolo- gen, Antikörper-enthaltenden Impfstoffes, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Bereitstellen einer Antikörper-enthaltenden Flüssigkeit aus einer autologen Antikörper- enthaltenden Körperflüssigkeit oder aus autologen Zell- oder Gewebepräparaten, - Behandeln der Antikörper-enthaltenden Flüssigkeit mit einem festen Träger, auf dem
Liganden immobilisiert sind, die Bindungen zu einer bestimmten Gruppe der Antikörper ein- gehen, mit der Massgabe, dass als Liganden keine Antikörper oder deren Fragmente mit gleichem Idiotyp verwendet werden, die gegen Tumor-assoziierte Antigene gerichtet sind, - Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, und - Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper zu einem autologen Impfstoff,
der eine effiziente
Menge von einigen Mikrogramm bis ein Gramm Antikörper enthält.
Der so erhaltene Impfstoff kann nun nunmehr dem Patienten in geeigneter Weise verabreicht werden. Die erfindungsgemäss hergestellten Antikörper lösen die eingangs geschilderten Probleme dadurch, dass zur Induktion von anti-idiotypischen Antikörpern in einem Organismus Antikörper aus eben diesem Organismus verwendet werden. Daher ist weder eine in vitro-Kultivierung von
Zellen zur Herstellung der Antikörper notwendig, noch eine Herstellung in einem fremden Spen- derorganismus.
Gleichwohl ist es auch nicht mehr erforderlich, die erfindungsgemäss erhaltenen Antikörper aus einem Pool oder Plasmapool zu erhalten (vgl. Zouali et al., J. Immunol. 135 (2) (1985), Seiten
1091-1096). Im Gegensatz zu derartigen Antikörperpräparationen aus Pools, bei welchem Antikör- per aus verschiedenen Individuen gesammelt werden, können mit den Antikörperpräparationen gemäss der vorliegenden Erfindung 100 %ig autologe Antikörper enthaltende Impfstoffe hergestellt werden, deren Wirkung im idiotypischen Netzwerk des zu behandelnden Individuums völlig spezi- fisch ist und dadurch effektiver sein kann.
Damit wird eine individuell spezifische Modulation des Immunsystems zielgerichtet auf den je- weils gewünschen Zweck ermöglicht. Durch die Verschiebung des immunologischen Gleichge- wichts durch Verabreichung einer autologen Impfung mit einem erfindungsgemäss hergestellten
Impfstoff wird eine selektive Stimulierung derjenigen B-Zellen gewährleistet, die Antikörper mit einer bestimmten Spezifität produzieren. Die Spezifität kann durch die Art der Isolierung der Anti- körper (durch die Wahl der Liganden) aus einem Individuum festgelegt werden.
Bevorzugterweise sind die Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeiten selbstverständlich Blut, Serum, Lymph-Flüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit und maligne Ergüsse, es können aber genau- so gut autologe Zellen oder Gewebepräparate, welche durch Biopsie gewonnen werden können, mit einer Vielzahl von an sich bekannten Methoden zu erfindungsgemäss zu verwendenden Anti- körper-enthaltenden Flüssigkeiten aufgearbeitet werden. Es werden vor allem diejenigen Körper- flüssigkeiten mit besonders hohem Antikörpergehalt erfindungsgemäss als Ausgangsmaterialien verwendet, wobei natürlich menschliches Serum oder Plasma besonders bevorzugt sind.
Entscheidend für die Spezifität der erfindungsgemäss erhaltenen Impfstoffe bei der Beeinflus- sung des idiotypischen Netzwerkes ist selbstverständlich jeweils die Wahl des Liganden bei der vorliegenden Immunaffinitätsreinigung. Zur Gewinnung von spezifischen Antikörperfraktionen können spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antigene verwendet werden.
Monoklonale Antikörper oder Derivate davon können nach an sich bekannten Methoden, wie z.B.
Hybridomtechnologie, Phagendisplay-Technologie hergestellt werden. (Immunology Today, 2000, 21 : gesamtes Heft 8). Es können aber auch Idiotyp-unabhängige Liganden, die alle oder spezifi- sche Subklassen von Immunglobulin binden können, wie z. B. Protein A, Protein G, anti-human-Fc- Antikörper etc. zur erfindungsgemässen Isolierung von Antikörpern verwendet werden.
Liganden können aber auch andere Substanzen sein, an die Immunglobuline binden können.
Unter Individuen werden gemäss der vorliegenden Erfindung einzelne menschliche oder
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tierische Organismen verstanden, die Körperflüssigkeiten oder Gewebe besitzen, welche Antikör- per enthalten. Bevorzugt wird die erfindungsgemässe Herstellung selbstverständlich in Vertebraten, besonders bevorzugt Säugetiere, insbesondere Menschen, verwendet.
Die Isolierung der Antikörper aus tierischen Körperflüssigkeiten, die Antikörper enthalten (z. B. menschliches Serum) mittels Immunaffinitätsreinigung kann dabei nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen (Clin. Chem. (1999), 45 :593; Chem. Technol. Biotechnol. 48 (1990), 105).
Besonders bevorzugt ist eine Festphasen-Immunaffinitätreinigung. Dabei wird ein spezifischer
Ligand oder ein Gemisch von verschiedenen Liganden an einer Festphase immobilisiert. Die
Festphase kann dabei eine Membran, ein Gel, ein Chromatographiematerial oder ähnliches Mate- rial sein, an das Liganden ohne wesentlichen Verlust der spezifischen Bindungseigenschaften dieser Liganden gekoppelt werden kann (Mol. Biotechnol. (1994) 1 :59). kann z. B. die Bindung von Antikörpern aus Flüssigkeiten von Individuen an die Liganden batchweise oder im Durchfluss- verfahren erfolgen.
Die Immunaffinitätsreinigung kann an einer Chromatographie-Apparatur auto- matisch oder mittels eines manuellen Verfahrens erfolgen, es ist aber auch denkbar, dass das
Verfahren mittels einer einfachen Vorrichtung, die die immobilisierten Liganden enthält, manuell, automatisch oder halbautomatisch durchgeführt wird.
Letztlich ist für die erfindungsgemässe Isolierung von Antikörpern aus einem Individuum nur notwendig, dass die erwünschten Antikörper im Wesentlichen von unerwünschten anderen Stoffen aus dem Körper getrennt werden können. Es ist denkbar, dass diese Aufgabe durch andere
Trennverfahren als Immunaffinitätsreinigung, wie oben beschrieben, gelöst werden kann, wie etwa durch Reaktion von Liganden mit den Antikörpern und anschliessender Abtrennung der spezifi- schen Immunkomplexe von den nicht mit den Liganden komplexierten Substanzen.
Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines autolo- gen Antikörper-enthaltenden Impfstoffes, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Bereitstellen von Antikörper-enthaltender Flüssigkeit aus einem Individuum, - Behandeln der Flüssigkeit mit Liganden, die Bindungen zu einer bestimmten Gruppe der An- tikörper eingehen, mit der Massgabe, dass als Liganden keine Antikörper oder deren Frag- mente mit gleichem Idiotyp verwendet werden, die gegen Tumor-assoziierte Anti-gene ge- richtet sind, - Abtrennung aller Stoffe, die keine Bindung zu den Liganden eingehen, - Behandeln der an die Liganden gebundenen Antikörper mit einem Elutionsmittel, so dass die zu den Liganden gebundenen Antikörper eluiert werden, - Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, in einem Eluat,
und - Aufarbeiten des erhaltenen Eluates zu einem autologen Impfstoff, der eine effiziente Menge von einigen Mikrogramm bis ein Gramm Antikörper enthält.
Die Auswahl der Liganden zur erfindungsgemässen Isolierung von Antikörpern hängt mit von der entsprechenden Anwendung ab. Im Folgenden sind einige Anwendungen beispielhaft erwähnt: * Anwendung bei Autoimmunerkrankungen:
Auto-Antigene als Liganden können beispielsweise zur Isolierung von autoimmunspezifischen Antikörpern aus einem Individuum verwendet werden. Derartig gewonnene Antikörper können nach erfindungsgemässer Anwendung eine Immunantwort in einem Individuum hervorrufen, die besonders die Produktion der spezifischen Auto-Antikörper durch idiotypische Interaktionen herun- terreguliert.
Bei vielen Autoimmunerkrankungen ist die genaue Spezifität der autoreaktiven Antikörper nicht bekannt. Es ist aber nicht unbedingt notwendig, dass Autoantigene als Ligand zur Isolierung auto- immunspezifischer Antikörper nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bei einer Auto- immunerkrankung kann eine Antikörperspezifität extrem überproportional vorhanden sein, so dass durch eine Reinigung der Gesamt-Immunglobulinfraktion (nach bekannten biochemischen Metho- den) aus einem Individuum und anschliessender Formulierung als Impfstoff mit darauffolgender Applikation an das Spenderindividuum vor allem anti-idiotypische Antikörper gegen die überpropor- tional vertretene Antikörper-Spezifität hervorgerufen werden.
' Anwendung bei Allergien:
Zur Herstellung einer patientenspezifischen Antikörper-Vakzine gegen Allergien sind als Ligand
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z. B. anti-lgE-Antikörper oder Teile von solchen Antikörpern mit gleicher Spezifität denkbar. Es sind aber auch Allergene, oder Teile von Allergenen als Ligand denkbar.
@ Anwendung bei toxischen Substanzen :
Zur Reinigung aus einem Individuum von Antikörpern, die eine toxinspezifische Immunantwort auslösen können, können toxinspezifische Antikörper als Liganden verwendet werden. Solche
Antikörper stehen in vielen Fällen als monoklonale zur Verfügung. Es ist aber auch denkbar, dass nicht Antikörper, sondern andere Moleküle, die ganz spezifische bestimmte Toxine (beispielsweise bakterielle Toxine oder niedermolekulare Gifte) binden können, als Ligand für die Reinigung ver- wendet werden.
Anstelle nur einer Ligandenspezies können selbstverständlich mit dem vorliegenden Verfahren auch zwei oder mehrere Liganden mit verschiedener Spezifität auf dem festen Träger immobilisiert werden und auf diese Art Antikörper bei Präparationen mit Spezifitäten erhalten werden, die hin- sichtlich mehrerer Bindungseigenschaften an- bzw. abgereichert sind (Antikörper mit verschiedener
Spezifität). Analog ist auch die serielle Schaltung von mehreren Immunadsorptionsschritten mit jeweils verschiedenen Spezifitäten bevorzugt bei der Herstellung von multispezifischen Impfstoffen gemäss der vorliegenden Erfindung.
Es ist auch möglich, einen festen Träger mit mehreren verschiedenen Liganden zu versehen, die alle auf eine gleiche oder ähnliche Zielsubstanz gerichtet sind (im einfachsten Fall ein polyklo- nales Antikörpergemisch gegen eine bestimmte Antikörperklasse). Gleichwohl können aber auch z.B. verschiedene monoklonale Antikörper gegen ein und dieselbe Zielstruktur auf dem festen
Träger vorgesehen werden.
Besonders bevorzugte Liganden sind gemäss der vorliegenden Erfindung sind Autoantigene wie z.B. doppelsträngige DNA, um patientenspezifische Antikörper gegen ds-DNA von Patienten mit systemischem Lupus erythematosus (SLE) zu behandeln. Faktor VIII oder Teile davon können als Ligand verwendet werden, um stark Faktor VIII bindende Antikörper aus einem Individuum zu
Isolieren und mit dem daraus formulierten Impfstoff die pathogene anti-Faktor VIII Reaktivität eines
Patienten herunterzuregulieren (Semin. Thromb. Hemost. (2000) 26:151). Aus Patienten mit Myas- thenia gravis können individuelle Antikörper durch Immunaffinitätsreinigung mit Acetylcholinrezep- tor oder Teilen davon (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90 :8747) werden, die erfin- dungsgemäss formuliert als autologer Impfstoff denselben Patienten wieder zurückgeimpft werden können.
Insulin als Ligand kann bei der Herstellung eines autologen Impfstoffes gegen Autoimmun Dia- betes (Typl insulin-dependent diabetes mellitus) Diabetes Metab. Res. Rev. (2000) : 16:338.
Myelin basic protein (MBP) oder Teile davon können als Ligand bei der Herstellung eines auto- logen Impfstoffes für Multiple Sklerose Patienten oder Patienten mit anderen immunologisch be- dingten neurologischen Störungen verwendet werden (J. Neuroimmunol. (2001) 113:163).
Verschiedene Ganglioside können als Ligand verwendet werden (bei Patienten mit Guillain- Barre-Syndrom (Intern. Med. (1997) 36 :599) anderen Neuropathien.
Der Vorteil dieser autologen Art der Immunisierung liegt in der inhärenten Berücksichtigung der patientenspezifischen Idiotypen.
Ein weiterer bevorzugter Ligand gemäss der vorliegenden Erfindung ist ein anti-human IgE- Antikörper, mit dem ganz spezifische IgE-Fraktionen gereinigt werden können und die wiederum dem Patienten in geeigneter, immunogener Form verbreicht werden können, um spezifische IgE produzierende Zellen im Patienten zu hemmen. Natürlich können Teile von spezifischen Anti-IgE- Antikörpern, sofern sie die erwünschte Spezifität noch besitzen ebenfalls als Ligand verwendet werden.
Im Bereich der Allergie ist es denkbar, ganz spezifische Allergene, bzw. Teile davon oder anti- idiotypische Antikörper, bzw. andere Moleküle, die Allergene nachahmen als Ligand einzusetzen.
Da die durch Vakzinierung mit autologen Antikörpern induzierte Immunantwort durch die Bin- dungsregion dieser Antikörper, d. h. durch ihren Idiotyp, determiniert wird, können im Prinzip statt intakter Antikörperfraktionen auch Fragmente oder Derivate dieser Antikörper zur Immunisierung eingesetzt werden, solange diese den Idiotyp der jeweiligen Ausgangs-Antikörper beinhalten. Der Begriff "Antikörper" umfasst daher auch Fragmente oder Derivate solcher Antikörper mit der glei- chen Bindungs-Spezifität. Als Beispiele, jedoch nicht auf diese eingeschränkt, seien erwähnt:
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F (ab)2'-Fragmente, F (ab)'-Fragmente, die z. B. nach an sich bekannten biochemischen Methoden (beispielsweise durch enzymatische Spaltung) hergestellt werden können. Der Begriff "Derivat" umfasst dabei z. B.
Antikörperderivate, die nach an sich bekannten chemischen oder biochemi- schen Methoden hergestellt werden können, wie z. B. mit Fettsäuren an freien Aminofunktionen amidierte Antikörper zwecks Erhöhung der Lipophile zur Inkorporation in Liposomen. Insbesondere umfasst der Begriff auch Produkte, die erzeugt werden können durch chemische Kopplung von
Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Molekülen, die die Immunantwort verstärken können, wie z. B. Tetanus-Toxoid, Pseudomonas-Exotoxin, Derivate von Lipid A, GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d.
Die durch eine erste Impfung hervorgerufene Verschiebung des immunologischen Gleichge- wichts kann durch Wiederholungen dieses Vorganges weiter verstärkt werden, z. B. kann einige
Wochen nach Gewinnung der ersten autologen Vakzine durch Immunaffinitätsreinigung erneut
Körperflüssigkeit, z.B. Blut, abgenommen und erneut eine autologe Vakzine präpariert und verab- reicht werden. Dadurch wird auch gewährleistet, dass der jeweilige Status des immunologischen
Gleichgewichts in der individuellen Vakzine immer berücksichtigt ist. Dieser Vorgang kann in geeigneten Abständen immer wieder durchgeführt werden (beispielsweise zunächst alle 4-8 Wo- chen, in weiterer Folge alle 6 Monate), entsprechend einer Verlaufskontrolle des Immunstatus des jeweiligen Patienten durch entsprechende spezifische Testung.
Die hier beschriebene neue Zu- sammensetzung und Methode zur Impfung mit autologen Antikörpern eignet sich grundsätzlich sowohl für therapeutische als auch für prophylaktische Zwecke.
Ein genereller Vorzug der hier beschriebenen Strategie der individuellen autologen Impfung liegt in der Tatsache, dass der immunologische Status des jeweiligen Individuums bezüglich des idiotypischen Netzwerkes berücksichtigt wird, da der entsprechende Impfstoff jeweils aus der individuellen Körperflüssigkeit, z. B. Serum, hergestellt wird. Desweiteren kommt das immunisierte Individuum dabei mit keinen Fremdantigenen in Berührung, sondern wird in geeigneter Form nur mit körpereigenen Bestandteilen behandelt, die eine Modulation des immunologischen Gleichge- wichts bewirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäss die durch Immunaffinitätsrei- nigung erhaltenen Antikörper mit einem geeigneten Vakzineadjuvans formuliert.
Wie bei Impfstoffen üblich, können die autologen Antikörperfraktionen oder deren Fragmente und Derivate mit Vakzine-Adjuvantien gemeinsam formuliert werden. Durch solche Adjuvantien wird die Immunantwort verstärkt. Als Beispiele für Adjuvantien, jedoch nicht auf diese einge- schränkt, seien erwähnt: Aluminium-hältige Adjuvantien, insbesondere Aluminiumhydroxid (z. B.
Alu-Gel), Derivate von Lipopolysaccharid, Bacillus Calmette Guerin (BCG), Saponine und Derivate davon (z. B. QS-21), Liposomenbereitungen, Formulierungen mit zusätzlichen Antigenen, gegen die das Immunsystem bereits eine starke Immunantwort gemacht hat, wie z. B. Tetanus-Toxoid oder Bestandteile von Influenza-Viren, gegebenenfalls in einer Liposomenbereitung.
Die Impfstoffbereitung kann zur Verstärkung der Immunantwort auch mit entsprechenden, vor- zugsweise humanen Zytokinen, die den Aufbau einer Immunantwort unterstützen, verabreicht werden. Hier ist insbesondere, wenn auch nicht ausschliesslich, Granulozyten-Makrophagen- stimulierender Faktor (GM-CSF) zu erwähnen. Dieses Zytokin stimuliert durch Aktivierung von Antigen-prozessierenden Zellen (z. B. dendritische Zellen) eine effiziente Immunantwort.
Gegebenenfalls können die autologen Antikörperfraktionen auch nach an sich bekannten und publizierten Methoden mit autologen, ex vivo-kultivierten dendritischen Zellen inkubiert werden. Die so gepulsten dendritischen Zellen werden anschliessend dem jeweiligen Individuum wieder verab- reicht. Auf diese Weise kann eine besonders effiziente Immunantwort erreicht werden.
In einem bevorzugten Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung beinhaltet demgemäss das Aufarbeiten der Antikörper-Eluate die Zugabe eines Stoffes, ausgewählt aus der Gruppe der Adju- vantien, insbesondere Aluminium-hältige Adjuvantien, Lipopolysaccharid-Derivate, Bacillus Calmet- te Guerin, Liposome oder QS-21 (weitere bevorzugte Adjuvantien sind u. a. in Singh et al., Nat.
Biotechnol. 17 (1999), Seiten 1075-1081 beschrieben), immunstimulierende Zellen, insbesondere dendritische Zellen oder andere Antigen-präsentierende Zellen, aktive Agentien, vorzugsweise Zytokine, insbesondere Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor, Formulierhilfsstoffe, insbesondere Puffersubstanzen, Stabilisatoren oder Lösungsvermittler, oder Mischungen dieser Substanzen, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die in der
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Zusammensetzung enthaltenen Antikörper mit einem Adjuvans gemischt und anschliessend einer
Hitzebehandlung, vorzugsweise bei einer Temperatur von über 80 C, insbesondere zwischen 90 C und 130 C, unterzogen. Das verwendete Adjuvans ist vorzugsweise ein Aluminium-hältiges Adju- vans. Es ist möglich, dass eine derartige Hitzebehandlung das Proteinantigen zwar denaturiert, die immunogenen Teile des Proteins aber durch die Bindung an das Adjuvans dem Immunsystem in der richtigen Form präsentiert werden kann. Es ist aber nicht unbedingt notwendig, die Proteine zu denaturieren, um die Vorteile einer Hitzebehandlung zu erhalten.
Es ist bekannt, dass die thermi- sche Denaturierung von Proteinen nicht nur von der Temperatur, sondern auch von der Zeit, der das Protein dieser Temperatur ausgesetzt ist, abhängt. Darüberhinaus sind noch weitere physika- lisch chemische Parameter, wie z.B. lonenstärke, lonenzusammensetzung, pH-Wert, Art und
Menge der aktiven Oberfläche im Gemisch für die Denaturierung eines Proteins verantwortlich. Es sind Bedingungen bekannt und für beliebige Eluate für den Fachmann leicht optimierbar, bei denen die Antikörper nicht oder nicht vollständig denaturiert werden und/oder andere Effekte, wie z.B. schwächere Desorption von der Oberfläche des Adjuvans, genützt werden können.
Ein weiterer Vorteil einer derartigen Herstellungsweise einer Impfstoffformulierung mit einem
Adjuvans und der darauffolgenden Hitzebehandlung ist, dass in der gesamten Formulierung infek- tiöse Erreger abgeschwächt bzw. inaktiviert werden könnten. Dieser Vorteil kann sowohl in der
Herstellung als auch bei der Lagerung und Distribution der Impfstoffformulierung eine Rolle spie- len. Es ist damit eine grössere Sicherheit in Bezug auf bekannte und unbekannte Erreger von über- tragbaren Krankheiten gegeben. Darüberhinaus ist, bei entsprechender Verpackung eine Abfüllung ohne Konservierungsstoffe möglich, da die mikrobielle Konservierung des Impfstoffes durch Hitze erfolgt ist.
Ein weiterer Vorteil einer derartigen Formulierung ist die mögliche erhöhte Immunogenität der Antikörper, da die Erhitzung eine zumindest teilweise Denaturierung der Antikörper bewirken kann.
Diese erhöhte Antigenität kann im Besonderen bei Proteinen, die vom Immunsystem als eigene
Proteine erkannt werden würden, die Immunogenität erhöhen.
Ein weiterer Vorteil liegt in der zusätzlichen Stabilisierung des Antikörper-Adjuvans-Komplexes durch die Hitzeinaktivierung, d. h. die Desorption des Protein-Antigens erfolgt nicht mehr schnell wie in Antigen-Adjuvans-Formulierungen, die nicht hitzebehandelt worden sind. Dieser Vorteil erlaubt auch einen grösseren zeitlichen Abstand zwischen den einzelnen Immunisierungen.
Demgemäss betrifft eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ein Verfahren, bei welchem ein Protein-Denaturierungsschritt, insbesondere eine Hitzebehandlung, vorgenommen wird, bei welchem die in den Eluaten enthaltenen Proteine zumindest teilweise in ihrer dreidimensionalen Struktur verändert werden, wobei sich vorzugsweise ihre immunogenen Eigenschaften verstärken.
Die erfindungsgemäss hergestellte Zusammensetzung kann nach gängigen Methoden verab- reicht werden, z.B. als Impfstoff durch subkutane oder intramuskuläre Injektion.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend Antikörper, die aus tierischen Körperflüssigkeiten, die Antikörper enthalten, durch Immunaffinitäts- reinigung gewonnen wurden zur Verwendung als autologe Impfstoffe.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahrens zur therapeutischen oder prophy- laktischen Impfung gegen Autoimmunerkrankungen, Infektionskrankheiten, verschiedene Intoxika- tionen und Allergien.
Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung auch einen autologen Impfstoff, der nach dem er- findungsgemässen Verfahren erhältlich ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Individuen, bei welchen ein erfindungsgemäss hergestelltes Präparat in einer effizienten Menge, vorzugsweise einige Mikrogramm bis ein Gramm, an das Individuum, bei dem die Körperflüssigkeit entnommen worden ist, verabreicht wird. Dieses Behandlungsverfahren ist vor allem bei Autoimmunerkrankun- gen, wie z. B. Systemischer Lupus erythematosus, Autoimmun Thyroiditis, Systemischer Vaskulitis, Guillain-Barre-Syndrom und anti-Faktor VII:C-Autoimmunerkrankung, bei Allergien bzw. bei der Prophylaxe von Vergiftungen (wie z. B. mit bakteriellen Toxinen).
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer autologen Antikörperpräparation zur Herstellung eines Mittels zur Immunmodulation.
Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die
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sie jedoch nicht eingeschränkt sein soll, näher erläutert.
Es zeigen: Fig. 1 : der Gewinnung des Impfstoffes.
Fig. 2 : der spezifischen Antikörper-Reaktivitäten nach Immunisierung mit autolo- gem Impfstoff, hergestellt über anti-bovines Serumalbumin als Ligand, bzw. Sepharose.
Fig. 3 : der spezifischen Antikörper-Reaktivität nach Immunisierung mit autologem
Impfstoff, hergestellt über maus-lgG2a als Ligand.
Beispiele:
Beispiel 1:
Dieses Beispiel soll veranschaulichen, dass es möglich ist, das Immunsystem gegen ein belie- biges Protein (in diesem Fall Bovines Serumalbumin, BSA) spezifisch zu modulieren.
Es wurden zwei Gruppen von jeweils 3 Kaninchen mit einer erfindungsgemäss hergestellten Vakzineformulierung immunisiert.
Der autologe Impfstoff für die erste Gruppe wurde durch Reinigen von Immunglobulin aus dem Serum der Kaninchen über eine Affinitätschromatographie-Säule (Kaninchen anti-BSA immobili- siert auf Sepharose) hergestellt. Der autologe Impfstoff für die zweite Gruppe wurde durch Reini- gen von Immunglobulin aus dem Serum von Kaninchen über eine andere Affinitätschroma- tographie-Säule (Sepharose ohne spezifische Liganden) hergestellt.
Die so erhaltenen Immunglobuline wurden als Impfstoff durch Adsorption auf Aluminiumhydro- xid-Gel formuliert und den jeweiligen Kaninchen subkutan verabreicht.
Blutabnahme- und Impf-Schema:
Tag-21: Serumgewinnung
Tag-14: Serumgewinnung
Tag-7: Serumgewinnung
Aus dem Pool der Seren der Tage -21, -14 und-7 wurde der Impfstoff gereinigt
Tag 0 : Tag 0: Immunisierung, subkutan
Tag 14 : Tag 21 : SerumgewinnungHerstellung der Affinitätsmatrix:
In einem ersten Schritt wurde das anti-BSA-Serum von Kaninchen gereinigt:
Dazu wurden die polyklonalen Kaninchen-anti-BSA-Antikörper (in 0,1 M Glycin/HCI-Puffer, pH :2,9; Volumen= 4 ml) gegen Dialysepuffer (0,1 M NaHC03 + 0,5 M NaCI pH=8,0) dialysiert (Slide-A-Lyzero 10K; Pierce/USA).
Methode : . Dialysiert wurde in einem 800 ml Becherglas mit Magnetrührstäb chen am Magnetrührer bei
4 C, wobei der Dialysepuffer viermal erneuert wurde.
. Die Proben wurden danach ankonzentriert durch Zentrifugieren (mit Centricon 10K (Amicon)),
Endvolumen: 0,4-0,6 ml.
Immobilisierung an aktivierte CH-Sepharose:
Materialien : . Activated CH-Sephctrose 4B; Pharmacia Biotech (Code No.: 17-0490-01)
Ligand: polyklonaler anti-BSA-Antikörper (6,6 mg/ml, in Kupplungspuffer) . Kupplungspuffer : 0,1 M NaHC03 + 0,5 M NaC1. pH=8,0 . 1 mM HCI . 1 M Ethanolaminlösung
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. 0,1 M Tris-HCI (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan)-Puffer, pH=8,0 . 0,1 M Tris-HCI-Puffer + 0,5 M NaCl, pH=8,0 . 0,1 M Acetat-Puffer + 0,5 M NaCl. pH=4,0
Kopplungs-Methode:
0,25 g freeze-dried CH-Sepharose 4B wurde in ca. 20 ml 1mM HC1 suspendiert, mit 50 ml
1 mM HC1 gewaschen, danach mit 50 ml Kupplungspuffer gewaschen. Die Sepharose wird in ein
50 ml Falcon-Röhrchen überführt und die Antikörper-Lösung zugegeben. Ein Verhältnis von Gel:Puffer=1:2 ergibt eine passende Suspension für die Kupplung.
Die Suspension wurde ca.
1 Stunde lang geschüttelt. Überschüssiger Antikörper wurde durch Waschen mit 3 x 10 ml Kupp- lungspuffer entfernt. Verbliebene aktive Bindungsstellen wurden mittels einstündiger Inkubation am
Schüttler mit 1 M Ethanolamin blockiert. Danach folgte eine einstündige Inkubation der Sepharose mit 0,1 M Tris-HCI-Puffer (pH=8,0) am Schüttler und folgender Waschzyklus: zuerst Waschen mit
0,1M Acetat-Puffer (pH=4,0) + 0,5 M NaCl. dann mit 0,1M Tris-HCI-Puffer (pH=8,0) + 0,5 M NaCI.
Der Waschzyklus wurde 3 mal durchgeführt.
Herstellung der Affinitätsmatrix für die zweite Gruppe von Kaninchen:
Die Affinitätsmatrix für die zweite Gruppe (Kontrollgruppe) wurde nach der gleichen Prozedur wie oben beschrieben hergestellt. Es wurde anstatt der Antikörperlösung nur Puffer verwendet.
Aktivierte Sepharose is damit ausschliesslich mit Ethanolamin blockiert :
Herstellung der autologen Impfstoffe:
Es wurden jeweils 10 ml Serum der entsprechenden Kaninchen (Pool der Tage-21, -14, und -7) mit den jeweiligen Affinitätsmatrices (0,5 ml Säulenvolumen) aufgereinigt.
Materialien :
Auftragepuffer : PBS + 0,2 M NaCl. pH=7,2
Elutionspuffer: 0,1M Glycin/HCI-Puffer, pH=2,9
Methode :
Auftragen auf die Säule erfolgte mit einer Inkubationszeit von 30 Min. bei +4 C. Das Waschen erfolgte mit Auftragepuffer (1 Waschschritt = 5 ml; 5 Waschschritte). Die Elution erfolgte mit mit 1 ml Elutionspuffer.
Das Eluat wurde mit Carbonatlösung (0,5M NaHC03) neutralisiert, die so gereinigten Proteine wurden mittels Grössentrennungs-Chromatographie analysiert.
Grössentrennungschromatographie:
Die Chromatographie wurde mit einer ZORBAX GF-250 Säule auf einem DIONEX-HPLC- System durchgeführt. Als quantitative Standards wurden folgende Immunglobuline verwendet : - human IgG-Standard (20 mg/ml; Sandoglobulin, 3. 590.009.0) - human IgM-Standard (1,1 mg/ml; SIGMA, cat.l-8260)
Säule: ZORBAX GF 250 (PN: 884973.901)
Laufpuffer : 220 mMol NaP04-Puffer, pH=7,0 + 10% Acetonitrile
Flussrate: 1,000 ml/min
Wellenlänge: 214 nm
Bandweite : 5 nm
Injektionsvolumen: 50 l
Formulierung mit Aluminiumhydroxid:
Die Formulierung der gereinigten, neutralisierten Immunglobuline als Impfstoff erfolgte nach fol- gender Prozedur:
Für jeden Impfstoff wurde ein Centricon Ultrafiltrationseinheit (Centricon 10K von Amicon, USA) verwendet.
Zuerst wurde die Ultrafiltrationseinheit gewaschen (durchzentrifugieren von 1 mM Na-Phosphatpuffer, 0,86 % NaCI, pH 6 (NBK)). Danach wurden 400 l Puffer und Alhydrogel (27 l (für 400 l), Superfos, Dänemark) vorgelegt, das neutralisierte Eluat zugefügt, zentrifugiert und
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gewaschen (mit 5 ml Puffer), sodass das Endvolumen ca. 300 l betrug. Danach folgte Resuspen-
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(10 mg/ml, Sigma), 350 l davon wurden steril abgefüllt. Die Proteinkonzentrationen der einzelnen
Impfstoffe betrug jeweils 40-50 g.
BSA-ELISA:
Es wurden folgende Proben im ELISA analysiert : Tag 0, sowie ein Pool von Tag 14 und
Tag 21. ELISA-Platten (NUNC, Maxisorp (F=96) ; Dänemark) wurden mit 100 l BSA-Lösung (pro
Näpfchen) beschichtet. (BSA-Lösung: BSA (Fa. SIGMA Kat. No A-7638); 10 g/ml in Beschich- tungspuffer). Es wurde 1 Stunde bei 37 C inkubiert. Nach dem Waschen wurde mit 5 % Trocken- milch in PBS blockiert (200 l/ Näpfchen). Inkubation: 30 Min bei 37 C.
Wasch-Schema : - Nach Beschichten, Blockieren und Probeninkubation : 6mal mit Waschpuffer, nach 4. Mal eine Minute inkubiert.
- nach Konjugat : 4mal mit Waschpuffer, 2 mal mit Färbepuffer.
Serumproben wurden seriell verdünnt (in 2% Trockenmilch/PBS). Die Probenverdünnungen (100 pl/Näpfchen) wurden 1 Stunde bei 37 C inkubiert. Als Positivkontrolle und als Standard für eine quantitative Auswertung der ELISA diente eine Verdünnungsreihe des polyklonalen Kanin- chen-anti-BSA-Serums, das für die Affinitätsreinigung verwendet worden war. Nach dem Waschen wurde das Enzymkonjugat (Anti rabbit Ig HRP (Nordic Immunology, #4694)) in entsprechender
Verdünnung (1: 1000 Verdünnungs-Puffer) aufgetragen (100 l/Näpfchen).
Nach einer Inkubation von 30 Min. bei 37 C wurde erneut gewaschen, Substrat zugegeben (pro Näpfchen : 100 l TMB Microwell1 (BioFX, Cat-No:TMBW-0100-01, #0034302)), und nach entsprechender Färbung die
Reaktion gestoppt (mit 30%iger H2S04 50 l/Näpfchen). danach im Photometer die Färbung ge- messen (450 nm). Der Titer bei der halbmaximalen Adsorption von jeder Verdünnungsreihe wurde ermittelt. Die relative Titerveränderung zum Nullserum (Tag 0 ; Zeitpunkt der Immunisierung) für die einzelnen Kaninchen ist in Figur 2 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Kaninchen, die einen autologen Impfstoff, der mittels einer anti-BSA-Affinitätschromatographie hergestellt wurde, eine deutliche Titerverschiebung im BSA-ELISA zeigen.
Beispiel 2 :
Dieses Beispiel soll zeigen, dass es möglich ist, eine bereits vorhandene Immunantwort in einem Individuum spezifisch zu senken. Dazu wurde ein Rhesusaffe, der mit einem monoklonalen Antikörper (HE2, Maus-lgG2a) immunisiert worden war, und eine starke IgG-lmmunantwort gegen Maus-lgG2a entwickelt hat, verwendet. Das Serum dieses Affen wurde an einer Immunaffinitäts- Säule, an der Maus-lgG2a (HE2) als Ligand immobilisiert war, gereinigt. Die derart gereinigten Immunglobuline wurden als Impfstoff auf Aluminiumhydroxid formuliert und dem Spenderaffen subkutan verimpft. Zum Immunisierungszeitpunkt (vor der Vakzinierung), sowie 2 Wochen danach wurde Blut abgenommen, um die spezifische Immunantwort gegen Maus-lgG2a zu bestimmen.
Material und Methoden :
Mikrotiterplatten für ELISA: Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc)
Kopplungspuffer: 0,1 M NaHC03
0,5 M NaCI pH-Wert 8,0 Reinigungspuffer A : + 0,2 M NaCI
Reinigungspuffer B: 0,1 M Glycin / HCI
0,2 M NaCI pH-Wert 2,9
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Bindungspuffer : 15 mM Na2C03
35 mM NaHC03
3 mM NaN3 pH-Wert : 9,6
PBS : 138 mM NaCI
1,5 mM KH2PO4
2,7 mM KCI
6,5 mM Na2HP04 pH-Wert : 7,2
Waschpuffer A: 2% NaCI 0,2% Triton X-100 in PBS
Waschpuffer B : 0,05 % Tween 20 in PBS
Blockierungspuffer A : 5 % foetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) in PBS
Blockierungspuffer B: 1 % Rinderserumalbumin
0,1 % NaN3 in PBS Verdünnungspuffer A : 2%foetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) in PBS
Verdünnungspuffer B : Färbepuffer :
mM Zitronensäure
51,4 mM Na2HP04 pH-Wert : 5,0
Substrat: 40 mg o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
100 ml Färbepuffer
20 l H202 (30%)
Stopplösung: 4 N H2S04
Formulierungspuffer: 10 % PBS, pH = 5,5
90 % physiologische NaCI-Lösung
Durchführung:
Die hier beschriebene Methode zur autologen Impfung wurde an einem Rhesusaffen erprobt, der eine starke Immunantwort gegen Maus IgG2a machte (0,5 mg Maus IgG2a (HE2) absorbiert auf 1,67 mg Aluminumhydroxid in 0,5 mL 1 mM Phosphat-Puffer, pH 6,0/155 mM NaCI) wurde jeweils an den Tagen 1,15, 29 und 57 subkutan an einen Rhesusaffen verimpft. Die Seren von verschiedenen Zeitpunkten wurden mittels ELISA auf Maus-lgG2a-spezifische Antikörper getestet (siehe unten). Die Antikörper waren am Ende des Impfschemas vor allem vom IgG-Typ.
Es wurden diesem Rhesusaffen 10 ml peripheres Blut abgenommen und daraus Serum gewonnen. Zur Im- munaffinitätsreinigung der Antikörperfraktion aus dem Serum dieses Rhesusaffen wurde zunächst eine Immunaffinitätsmatrix nach folgender Vorschrift hergestellt.
Die ganze Prozedur wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt : g CH-Sepharose 4B (Pharmacia) wurden für 15 Minuten in 20 ml 1 mM HC1 suspendiert. Das Gel wurde dann mit 1 Liter 1 mM HCI und anschliessend mit 200 ml Kopplungspuffer auf einem Sinterglasfilter AG3 gewaschen. 100 mg muriner Antikörper HE2 (Maus-lgG2a) wurden gegen 5 Liter Kopplungspuffer dialysiert und mit Kopplungspuffer auf 5 mg/mi eingestellt. Diese Lösung wurde mit der Gelsuspen-
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sion in einem verschlossenen Gefäss vermischt. Ein Verhältnis von Gel : Puffer von 1 : ergibt eine für die Kopplung geeignete Suspension. Diese Suspension wurde 24 Stunden bei 4 C rotiert.
Anschliessend wurde der Überschuss des Liganden mit 3 x 30 ml Kopplungspuffer weggewaschen.
Überbleibende reaktive Gruppen wurden durch einstündige Inkubation bei 4 C mit 1 M Ethanol- amin geblockt. Dann wurde das Gel für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem 0,1 M Tris-
HCI-Puffer rotiert. Letztlich wurde das Gel mit 3 Zyklen von Puffern mit alternierendem pH gewa- schen. Jeder Zyklus besteht aus 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4, mit 0,5 M NaCI, und anschlie- #end 0,1 M Tris-HCI-Puffer, pH 8, mit 0,5 M NaCI. Das Gel wurde bei 4 C aufbewahrt. Die Immun- affinitätsreinigung der Antikörperfraktion aus Serum eines Rhesusaffen erfolgte nach folgender
Vorschrift unter sterilen Bedingungen : Die Immunaffinitätsreinigung wurde auf einem FPLC-System (Pharmacia) durchgeführt, 1 ml des nach obiger Vorschrift erhaltenen Gels wurde in eine Pharma- cia HR5/5 Säule gefüllt. 5 ml Serum wurden 1:10 mit dem Reinigungspuffer A verdünnt.
Diese
Lösung wurde mit 1 ml/Minute über die Säule gepumpt und mit Reinigungspuffer A nachgewa- schen, bis die UV-Basislinie des Detektors wieder erreicht ist (280 nm). Gebundene Immunglobuli- ne wurden dann mit Reinigungspuffer B eluiert und die Fraktion mit 1 M Na2HPO4 unmittelbar nach
Desorption neutralisiert. 50 l der so gereinigten Antikörperfraktion wurden auf einer Grössentren- nungssäule (SEC, Zorbax 250 GF) analysiert. Als Laufmittel wurde 220 mM Phosphatpuffer, pH 7 + 10% Acetonitril verwendet. Die Gesamtmenge der Antikörperfraktion betrug ca. 40 g (bestimmt mittels SEC im Vergleich zu einem Standard).
Die so gewonnene Antikörperfraktion wurde in einem ELISA bezüglich der Bindung an Antikörper HE2 (der zur Affinitätsreinigung als Ligand verwendet wurde) getestet : 100 l Aliguots des für die Affinitätsreinigung eingesetzten Maus IgG2a Antikörpers (Antikörper HE2 ; mit 10 g/ml in Bindungspuffer) wurden in den Näpfchen einer Mikrotiterplatte 1 Stunde bei 37 C inkubiert. Nach sechsmaligem Waschen der Platte mit
Waschpuffer A wurden je 200 l des Blockierungspuffers A zugesetzt und 30 Minuten bei 37 C inkubiert. Nach Waschen der Platte wie oben beschrieben wurden je 100 l Aliguots der zu testen- den affinitätsgereinigten Antikörperfraktion sowie normales Humanimmunglobulin in gleicher Kon- zentration als Negativkontrolle in Verdünnungen von 1 :4 bis1:65 000 in Verdünnungspuffer A
1 Stunde bei 37 C inkubiert.
Nach Waschen der Platte wie oben beschrieben wurden je 100 l des
Peroxidase-konjugierten Ziegen-anti-Human-Ig-Antikörpers (Zymed) in einer Verdünnung von
1:1000 in Verdünnungspuffer A zugesetzt und 30 Minuten bei 37 C inkubiert. Die Platte wurde viermal mit Waschpuffer A und zweimal mit Färbepuffer gewaschen. Die Antikörperbindung wurde durch Zusatz von je 100 l des spezifischen Substrats nachgewiesen und die Farbreaktion durch Zugabe von je 50 l Stopplösung nach ca. 3 Minuten abgebrochen. Die Auswertung erfolgte durch Messen der optischen Dichte (OD) bei 490nm (Wellenlänge der Referenzmessung ist 620nm). Die affinitätsgereinigte Antikörperfraktion zeigt eine deutliche Bindung an den Maus IgG2a-Antikörper, während normales Human-Immunglobulin praktisch nicht bindet.
Die durch Affinitätsreinigung erhaltene Antikörperfraktion wurde mit Aluminiumhydroxid als Ad- juvans nach folgender Vorschrift formuliert:
3 ml der nach Affinitätschromatographie erhaltenen Antikörperlösung (enthält ca. 40 g Anti- körper) wurden mit 1 mg Aluminiumhydroxid (wässerige Suspension ; Alhydrogel, Superfos) ver- setzt und die Suspension in einem "FILTRON" Zentrifugenröhrchen (Microsep TM, cut-off 10KD) bei 4000 x g 30 Minuten lang zentrifugiert. Anschliessend wurde 2 x mit je 1 ml des Formulierungs- puffers aufgeschlämmt und bei 4000 x g 30 Minuten lang zentrifugiert. Die Suspension wurde mit Formulierungspuffer auf 0,5 ml aufgefüllt und die so erhaltene Suspension steril abgefüllt. Der Rhesusaffe, aus dessen Serum obiger autologer Impfstoff gewonnen wurde, wurde mit diesem Impfstoff subkutan in den Rücken geimpft.
Vor dieser ersten Impfung wurden 5 ml Blut zur Serum- gewinnung (zur Bestimmung des Ausgangswertes für die Charakterisierung der Immunantwort) abgenommen. Zwei Wochen danach wurden erneut 10 ml Blut zur Serumgewinnung abgenom- men.
Es wurde die Bindung des Serumimmunglobulins dieses immunisierten Affen an Maus IgG2a wie oben im ELISA bestimmt. Wie in Figur 3 zu sehen ist, sinkt nach der Immunisierung mit dem autologen Impfstoff die Maus IgG2a Reaktivität.