AT500379A2 - Tau-proteine - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft Alzheimer-Krankheit und andere Tauopa thien.

Alzheimer-Krankheit (Alzheimer's disease, AD) ist die häufigste chronische neurodegenerative Erkrankung, die klinisch durch einen progressiven und irreversiblen Verlust kognitiver und behavioristischer Funktionen gekennzeichnet ist. Die Krankheit kann mehr als 10 Jahre lang andauern, wobei sie von geringfügigen Symptomen zu extrem schweren Manifestationen voranschreitet. AD befällt etwa 10% der Bevölkerung mit einem Alter von über 65 Jahren und 20% der Bevölkerung mit einem Alter von über 80 Jahren. Als Folge des Wachstums westlicher Gesellschaften nimmt die Anzahl der betroffenen Personen zu: es gibt bereits über fünf Millionen Erkrankte alleine in den USA, und bis zum Ende des Jahres 2000 wird es auf der gesamten Welt etwa 18 Millionen Menschen mit Demenz geben. Man denkt, dass etwa zwei Drittel der Fälle, d.h. 12 Millionen, durch Alzheimer-Krankheit verursacht sein werden. Es ist nach Herzerkrankungen, Krebs und Schlaganfällen die viert-häufigste Todesursache in der westlichen Welt. Die Anzahl der Menschen, die an Demenz leiden, steigt rasch. Bis zum Jahre 2025 wird es in der entwickelten Welt doppelt so viele Menschen mit Demenz geben wie im Jahre 1980. Die Kosten, die der Gesellschaft durch die Fürsorge für die Betroffenen entstehen, sind enorm. Beispielsweise werden die Kosten für die US-Gesell-schaft für die Diagnostizierung und Behandlung von AD, vor allem für die Betreuung, derzeit auf US$ 80 Milliarden pro Jahr geschätzt. Derzeit gibt es weder einen präsymptomatischen Diagnose-Test, noch eine Heilung für AD. Die Krankheit wird daher nach dem Auftreten von Symptomen klinisch vor allem durch das Ausschließen anderer Formen von Demenz diagnostiziert. Eine Ansammlung klassischer Merkmale, seniler (neuritischer) Plaques und Neurofi-brillen-Verflechtungen (neuro-fibrillary tangles, NFT) im AD-Gehirn, die vor 93 Jahren vom bayrischen Psychiater Alois Alzheimer im Jahre 1907 beobachtet wurden, sind noch immer das neu-ropathologische Merkmal der AD.

Der gemeinsame Nenner der intrazellulären neurofibrillären Strukturen (Neurofibrillen-Verflechtungen, Neuriten-Dystrophie und Neuropil-Fäden) sind gepaarte, Helix-förmige Fäden (PHFs).

Die Haupt-Protein-Untereinheit der PHFs ist das Mikrotubulus-as-soziierte Protein Tau in abnorm hyperphosphorylierter Form (Grundke-Iqbal et al., 1986; Wischik et al., jL900 a,b) . Nouronon ..

I NACHGEREICHT 2 mit neurofibrillären Veränderungen degenerieren, und das Ausmaß der Degeneration steht in direktem Verhältnis mit dem Grad der Demenz bei den betroffenen Individuen (Blessed et al., 1968).

Normales Tau ist ein Mikrotubulus-assoziiertes Protein, das hauptsächlich an Axonen verteilt ist. Das Tau-Protein nimmt Teil an der Modulation des Zusammenbaues, der räumlichen Organisation und dem Verhalten von Mikrotubuli (MT) in Neuronen und vermutlich in Glia-Zellkörpern (Drewes et al., 1998; Drubin und Kirschner, 1986; Lo-Presti et al., 1995). Die Tau-Proteine werden von einem einzigen Gen codiert, das sich am Chromosom 17 befindet, aber sie werden als multiple Isoformen in Gewebsextrakten von Gehirnen Erwachsener nachgewiesen (Goedert et al., 1989; Himmler A., 1989; Kosik et al., 1989). Die Heterogenität der Tau-Proteine ist teilweise auf alternatives Spleißen zurückzuführen, was zu sechs Isoformen im erwachsenen menschlichen Gehirn führt. Diese unterschiedlichen Isoformen unterscheiden sich durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von 29- oder 58-Aminosäure-Inserts in der Amino-terminalen Region und durch die Addition oder Deletion eines Tandem-Repeats (das entweder 3- oder 4-mal wiederholt sein kann) in einer Carboxy-terminalen Region von Tau, die als Mikrotubulusbindende Domäne bezeichnet wird. Diese Region besteht aus unperfekten Repeats von 31 oder 32 Aminosäureresten. Bei Menschen enthält die kleinste Tau-Isoform 352 Aminosäurereste mit drei Tandem-Repeats in der MT-bindenden Domäne und keine Amino-termi-nalen Inserts, wogegen die größte Isoform 441 Reste mit vier Repeats und beiden Amino-terminalen Inserts enthält. Der Einfachheit halber beziehen sich alle Nummerierungen in dieser Patentanmeldung auf die längste Human-Tau-Protein-Isoform, htau40, die alle Inserts (441 Aminosäuren lang) gemäß Goedert et al. (1989) enthält.

Man weiß, dass eine Reihe von neurologischen Erkrankungen filamentöse Zelleinschlüsse haben, die das Mikrotubulus-assozi-ierte Protein Tau enthalten, z.b. Alzheimer-Krankheit (AD), progressive supranukleare Paralyse (PSP), corticobasale Degeneration (CBD), Pick-Krankheit (Pick's disease, PiD) und eine Gruppe verwandter Krankheiten, die kollektiv als frontotemporale Demenzen mit Parkinsonismus in Verbindung mit Chromosom 17 (FTDP-17) gezeichnet werden, amyotrope laterale Sklerose (ALS), Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD), Dementia pugilistica (DP), Gerstmann-Straussler-Scheinker-Krankheit (GSSD), Levy-Körperchen-Krankheit

I nachgereicht I 3 und Huntington-Krankheit (Dickinson et al., 1998; DiFiglia et al., 1997; Forno, 1986; Hirano und Zimmerman, 1962; Nishimura et al., 1995; Prusiner 1996; Reed et al., 1998; Roberts, 1998; Schmidt et al., 1996; Shankar et al., 1989; Spillantini et al., 1998). Obwohl die Ätiologie, klinischen Symptome, pathologischen Befunde und die biochemische Zusammensetzung von Einschlüssen bei diesen Krankheiten unterschiedlich sind, kristallisieren sich doch Hinweise heraus, die nahelegen, dass die an der Aggregation normaler Zellproteine beteiligten Mechanismen zur Bildung verschiedener filamentöser Einschlüsse vergleichbar sind. Man nimmt an, dass eine anfängliche Konformationsänderung des Mikrotubulusassoziierten Proteins Tau, das eine Erzeugung von Nuklei oder Keimkristallen für eine Filamentansammlung initiiert, ein Schlüsselereignis ist. Dieser Vorgang kann durch die post-translatio-nale Modifizierung normaler Proteine, durch Mutation oder Deletion bestimmter Gene und durch Faktoren, die normale Proteine binden und somit ihre Konformation verändern, beeinflusst werden. Das Tau-Protein ist sehr hydrophil. Es kann aus Gehirngewebe oder gezüchteten Zellen leicht extrahiert werden. Im Vergleich dazu ist filamentöses Tau, das aus mit Alzheimer Krankheit befallenem Gehirngewebe extrahiert wird, relativ unlöslich. Außer der Phosphorylierung unterscheiden sich unlösliches und normal-lösliches Tau im Ausmaß der post-translationalen Modifizierungen, zu welchen die Glykosylierung, Glyzierung, Allgegenwart und Razemisierung zählen (Kenessey et al., 1995; Ko et al., 1999; Mori et al., 1987; Wang et al., 1996; Yan et al., 1994).

Der Mechanismus, mittels welchem Tau-Protein modifiziert wird, um an der Filament-Bildung bei AD teilzunehmen, ist unbekannt. Tau ist eines der löslichsten Proteine, die bekannt sind (Cleveland 1977 a,b; Lee et al., 1988), und daher ist seine Aggregation bei AD besonders rätselhaft. Die Phosphorylierung von Tau beeinflusst die Fähigkeit von Tau, Aggregate zu bilden und hat entweder stimulierende oder hemmende Auswirkungen, was vermutlich von der Stelle der Phosphorylierung abhängt (Crowther et al. , 1994; Schneider et al., 1999). Viele in vitro-Untersuchungen zeigen, dass in Anwesenheit des Reduktionsmittels Dithiothreit (DTT), ungesättigter freier Fettsäuren, RNA oder Glykosaminogly-kanen, normales Tau zu Filamenten transformiert werden kann (Go-edert et al., 1996; Kampers et al., 1996; Perez et al., 1996; Wilson und Binder, 1997). Weiters kann der Prozess der Filament- | nachgereicht 1 4

Bildung auch durch die Anwesenheit von vernetztem Tau, das durch Oxidation an Cys 322 erzeugt wurde, beschleunigt werden (Schweers et al., 1995). Zu den Parametern die bei verschiedenen Filament-Ansammlungs-Studien variiert wurden, zählten die Tau-Protein-Konzentration, und der pH-Wert, und die Ionenstärke der Inkubation ist um ein vielfaches höher als sie im Zytoplasma unter physiologischen Bedingungen besteht. Die Untersuchung von in vi-tro-gebildeten Tau-Filamenten durch Scan-Transmissions-Elektro-nenmikroskopie (STEM) zeigte, dass diese Filamente sich von nativ gepaarten Helix-förmigen Filamenten unterschieden (Ksiezak-Re-ding, 1998) . In Abwesenheit von Glykanen oder RNA sind keine PHF-artigen Filamente in Proben nachweisbar, die unphosphoryliertes oder phosphoryliertes Wildtyp-Tau, normales Tau, enthalten. Untersuchungen von chemisch vernetztem, mit Heparin behandeltem Tau weisen darauf hin, dass die Behandlung mit Heparin beim Tau-Protein eine Konformationsänderung induziert (Paudel und Li, 1999) . Insgesamt legen die in vitro-Daten nahe, dass (a) die Mikrotubulus-bindende Domäne für die Ansammlung von Tau-Filamenten wichtig ist, und dass (b) die Bildung von Tau-Filamenten (eine) Konformationsänderung (en) von Tau erfordern. Gleichzeitig zeigen diese Untersuchungen, dass keine der beschriebenen Tau-Modifizierungen alleine fähig ist, filamentöse Tau-Bildungen zu induzieren, die mit dem klinischen Bild von Alzheimer-Krankheit übereinstimmen. Eine Identifizierung und Beschreibung von Faktoren, die für die Initiierung von Veränderungen von Tau wichtig sind, welche zur Filament-Bildung bei Krankheitszuständen führen, wäre für die Entwicklung präsymptomatischer Diagnose-Marker und therapeutischer Mittel zum Eingreifen in die Progression von Tauopathien wichtig.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verlässliches Arzneimittel-Ziel ("drug target") für ein frühes therapeutisches Eingreifen bei Alzheimer-Krankheit und anderen Tauopathien vorzusehen. Weiters ist es erwünscht, einen spezifischen monoklonalen Antikörper vorzusehen, der zu einer spezifischen Detektion und Wechselwirkung mit diesem Arzneimittel-Ziel fähig ist. Dieser Antikörper sollte nicht nur für die präsymptomatische Detektion des Moleküls geeignet sein, sondern auch zur Hemmung und Eliminierung dieses Moleküls, und somit sollte er zur präsymptomatischen Diagnose, Behandlung und Prävention von Alzheimer-Krankheit und anderen Tauopathien geeignet sein.

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Diese Ziele werden mit der vorliegenden Erfindung angesprochen, welche gemäß einem Aspekt einen Antikörper mit einer Spezifität für abnorme Formen von Tau-Proteinen, die sich in der Konformation von normalem Tau unterscheiden, betrifft, wobei dieser Antikörper für normales Tau-Protein unspezifisch ist. Solche abnormen Formen von Tau-Proteinen stellen eine neue Familie von Molekülen dar, intra- und extra-neuronal lokalisierte lösliche und unlösliche, vorzugsweise abnorm trunkierte, Formen von Tau-Proteinen, die sich in ihrer Konformation von normalem Tau unterscheiden (Novak et al., 1991, 1993). Mit der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass diese hinsichtlich der Konformation unterschiedlichen Formen von Tau-Proteinen, die in der vorliegenden Beschreibung "Tauone" genannt werden, Keimkristalle, Nukleationszentren, in einem sich selbst-fortpflanzenden Prozess filamentöser Tau-Bildungen sind, der mit dem klinischen Bild von Alzheimer-Krankheit übereinstimmt; somit sind Tauone wichtige Ziele für Alzheimer-Krankheit. Die Tauone gemäß der vorliegenden Erfindung können abnorm trunkierte Tau-Proteine sein. Die biologische Aktivität von Tauonen kann in vitro und im Inneren von Neuronen durch Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung gehemmt werden. Diese Antikörper haben die Fähigkeit, die Anwesenheit von Tauonen in den präsymptomatischen Stadien I, II und III der AD zu färben, was sie für eine präsymptomatische Diagnose dieser Krankheit geeignet macht. Für die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist es von kritischer Bedeutung, dass nur die hinsichtlich ihrer Konformation unterschiedliche Form des Tau-Proteins (d.h., das "Tauon") von diesem Antikörper erkannt wird, wogegen das normale Tau-Protein nicht an die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung bindet.

Im Laufe der vorliegenden Erfindung wurden AD-trunkierte Formen des Mikrotubulus-assoziierten Proteins Tau zur Homogenität gereinigt, und es wurde nachgewiesen, dass sie ein Hauptteil filamentöser Tau-Isolate aus von Alzheimer-Krankheit betroffenen Neuronen waren. Die Aminosäuresequenz-Daten wiesen darauf hin, dass das Gerüst der Tauone von jenem des Proteins Tau nicht unterscheidbar ist, jedoch immunologisch von normalem humanem Tau durch die unterschiedliche Konformation, wie sie durch die Kon-formations-spezifischen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung geoffenbart wurde, unterschieden werden konnten. Spezifische Beispiele für solche Antikörper sind der

I NAemFRPinuT I monoklonale Antikörper DC-11, der von der Hybridom-Zelllinie erzeugt wird, welche in der European Collection of Cell Cultures (ECACC) unter der Hinterlegungsnummer 00082216 hinterlegt wurde, und der monoklonale Antikörper DC-ll/I, der von der Hybridom-Zelllinie DC-ll/I erzeugt wird, welche in der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 00082215 hinterlegt wurde. Diese Familie der monoklonalen Antikörper, die mit der vorliegenden Erfindung vorgesehen wird, ist durch die Erkennung einer Tauon-spezifischen Konformation ohne Erkennung normalen, humanen, löslichen Taus definiert. Die im Vergleich zu normalem, humanem Tau verschiedene Konformation wurde bei den bisher getesteten Proben von Patienten mit Alzheimer-Krankheit pathologisch einer abnormen Trunkierung am N-Terminus oder am C-Terminus oder an beiden Termini des Tau-Moleküls zugeschrieben. Interessanterweise war die unterschiedliche Konformation unabhängig von der Tau-Iso-Form und vom Grad der Phosphorylierung vorhanden. Die unabdingbaren pathologischen Erfordernisse für Tauone zum Erhalt ihrer typischen Konformation ist das Vorhandensein von Prolin-reichen und Mikrotubulus-bindenden Domänen und von (einer) trunkierten, flankierenden Region (en) . Weiters könnten Tauone von normalem, humanem Tau durch ihre pathologischen Aktivitäten unterschieden werden, nämlich, dass Tauone einen Keimkristall, ein Nukleationszentrum, darstellen, welches eine Tau-Aggregation initiiiert, und dass Tauone Mikrotubuli, die aus normalem Tau und Tubulin zusammengefügt sind, zerlegen. Tauone, die mit Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere monoklonalen Antikörpern der DC-11-Familie, vorinkubiert worden waren, zeigten keine Zerlegungsfähigkeit oder fügten Mikrotubuli aus normalem Tau und Tubulin zusammen. Außerdem bewirken Tauone nach Mikroinjektion in differenzierte Human-Neuronen eine wesentliche Verdrängung von endogenem Tau aus der durch Mikrotubuli gebundenen Tau-Fraktion, eine Retraktion neuronaler Prozesse und eine Degeneration der Zellen. Wenn Tauone zusammen mit monoklonalen Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung mikroinjiziert werden, wurden keine neurodegenerativen Veränderungen in differenzierten Neuronen beobachtet. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Antikörper, insbesondere die monoklonalen DC-ll-Antikörper, die Aktivität der Tauone intraneuronal hemmen und daher als intrazelluläre Arzneistoffe verwendet werden könnten (beispielsweise als therapeutische intrazelluläre Antikörper, Intrakörper). Immunohistologisch

I NIAnH^PRPiouT I treten Tauone, wie man mit den Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung sieht, schon in den präsymptomatischen Stadien I, II und III in Prä-a-Neuronen auf, sowohl in der transenthorinalen als auch in der enthorinalen Region von AD, und daher konnten nach korrekter Tracer-Kopplung die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung für die intravitale präsymptomatische Diagnose von AD verwendet werden.

Vorzugsweise weist der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung eine Spezifität von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 90%, zur konformationsmäßig verschiedenen Form von Tau ("Tauon") im Vergleich zum Antikörper DC-11 auf. Die Spezifität kann mittels jedes Standard-Tests, der für die Detektion der Spezifität von Antikörpern verfügbar ist, getestet werden, z.B. ELISA-Tests, Radioimunoassays, Atomkraftmikroskopie mit cantilever-gebundenen Bindungspartnern usw.

Im Allgemeinen sind alle Antikörper, die mit dem konformationsmäßig verschiedenen Tau-Protein, insbesondere mit abnorm trunkierten Formen davon, jedoch nicht mit normal löslichem Tau spezifisch reaktiv sind, im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.

Vorzugsweise heißt es vom erfindungsgemäßen Antikörper, dass er mit einem Molekül "spezifisch reaktiv" ist, wenn er mit einem Molekül eine Bindung eingehen kann, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu koppeln. Der Ausdruck "Epitop" soll jenen Teil eines Antigens bezeichnen, der von einem Antikörper erkannt und gebunden werden kann. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop haben. Ein "Antigen" kann bei einem Tier die Produktion von Antikörpern induzieren, die fähig sind, an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Die oben erwähnte spezifische Reaktion soll anzeigen, dass das Antigen auf hoch-selektive Weise mit seinem entsprechenden Antiköper eine Immunreaktion eingehen wird und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die von anderen Antigenen hervorgerufen werden.

Besonders bevorzugte Antikörper gemäß der Erfindung stammen von den hinterlegten Hybridom-Zelllinien DC-11 (ECACC-Hinterle-gungsnummer 00082216) und DC-ll/I (ECACC-Hinterlegungsnummer 00082215) und weisen eine hohe Spezifität und Selektivität auf und werden mit konformationsmäßig verschiedenen Formen von Tau ("Tauon"), aber nicht mit normal löslichem Tau reagieren. Die Spezifität kann mittels jedes Standard-Tests, der zur Detektion

I NACHGEREICHT 8 einer Antikörper-Spezifität verfügbar ist, getestet werden, z.B. ELISA-Test, Radioimmunoassays usw. "Antikörper", wie hierin verwendet, soll intakte Moleküle und Fragmente davon, sowie synthetische und biologische Derivate davon, wie z.B. Fab, F(ab')2, und Fv-Fragmente, die frei oder ex-primiert sind, z.B. an der Oberfläche von filamentösen Phagen an pIII oder pVIII oder anderen Oberflächen-Proteinen, oder an der Oberfläche von Bakterien, die an ein Antigen binden können, inkludieren. Den Fab-, F(ab')2- und Fv-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie werden schneller aus dem Blutkreislauf eliminiert und können eine geringere unspezifische Gewebebindung des Antikörpers aufweisen. Weiters kann der Fv-An-tikörper (oft als Minikörper bezeichnet) leicht so erzeugt werden, dass er an seinem C-Terminus einen spezifischen Tracer aufweist, und er kann für eine frühe intravitale präsymptomatische Diagnose von AD verwendet werden, da Stadium I, II und III von AD, das von den Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung erkannt wird, nicht mit einem Abbau intellektueller Fähigkeiten verbunden ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden monoklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper-Fragmente bevorzugt. Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem anderen Aspekt auch Hybridom-Zelllinien, die einen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugen.

Der Ausdruck "Tau", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich auf die längste Isoform des humanen, Mikro-tubulus-assoziierten Proteins Tau, das alle alternativ gespleißten Inserts enthält, wie in M. Goedert et al., 1989, beschrieben.

Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Anmeldung betrifft die Erfindung eine abnorm trunkierte Form von Tau-Protein, die eine konformationsmäßig verschiedene Form von Tau-Protein ist, wobei diese konformationsmäßig verschiedene Form von Tau-Protein für einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung spezifisch erkennbar ist.

| NACHGEREICHT

Demgemäß ist die vorliegende Erfindung auf eine neue Familie von Molekülen gerichtet, eine intra- und extraneuronal lokalisierte, lösliche und unlösliche, abnorm trunkierte Form von Tau-Proteinen, die sich vom normalen Tau in ihrer Konformation unterscheiden und "Tauone" genannt werden. 9 "Tauone" sind daher in ihrer Konformation unterschiedliche Formen des Tau-Proteins, die von den Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung spezifisch erkannt werden. Tauone, die bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und können durch weitere Aminosäuren flankiert sein (vgl. SEQ ID Nr. 2, 3). Die Tauone sind zweckmäßig im Bereich von etwa 100 bis 400 Aminosäuren und repräsentieren trun-kierte Formen des Tau-Proteins in diesem Bereich. Die Tauone gemäß der vorliegenden Erfindung können am N- oder C-Terminus oder an beiden Termini abnorm trunkiert sein (vgl. Figs. 2-13). Der Ausdruck "abnorm trunkiert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Tau-Peptide ("Tauone"), die bei krankhaften Neuronen bei AD mit Tauon-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die mit der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, identifiziert wurden.

Abnorm trunkierte Formen humaner Tau-Proteine - Tauone -können durch Verwendung irgendeiner der zahlreichen, wohlbekannten synthetischen rekombinanten Techniken hergestellt werden.

Kurz gesagt werden die meisten der Techniken, die zur Transformation von Zellen, Konstruktion von Vektoren, Extraktion von Messenger-RNA, Herstellung von cDNA-Bibliotheken u. dgl., verwendet werden, auf dem Gebiet in großem Umfang praktiziert, und den meisten Fachleuten sind die Standard-Quellenmaterialien, die spezifische Bedingungen und Vorgangsweisen beschreiben, bekannt. Der Einfachheit halber können jedoch die folgenden Absätze als Richtlinie dienen.

Das am häufigsten verwendete Prokaryonten-System für die Herstellung rekombinanter Proteine bleibt E. coli, es können jedoch auch andere Mikrobenstämme verwendet werden, wie Bazillen, z.B. Bacillus subtilis, verschiedene Spezies von Pseudomonas, oder andere Bakterienstämme. In solchen Prokaryonten-Systemen werden Plasmid-Vektoren verwendet, die Replikationsstellen und Steuerungssequenzen enthalten, welche von einer mit dem Wirt kompatiblen Spezies abstammen. Zu den allgemein verwendeten pro-karyontischen Steuer-Sequenzen zählen Promotoren für die Transkriptions-Initiierung, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Ribosomen-Bindungsstellen-Sequenzen.

Eine große Vielfalt von eukaryontisehen Wirten sind jetzt auch für die Herstellung rekombinanter Fremd-Proteine erhältlich. Wie bei Bakterien, können eukaryontische Wirte mit Expressionssystemen transformiert werden, die das gewünschte Protein direkt

NACHGEREICHT - 10 - M« • · erzeugen, doch häufiger werden Signal-Sequenzen vorgesehen, um die Sezernierung des Proteins zu bewirken. Eukaryontische Systeme haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie Introne prozessieren können, die in den Genom-Sequenzen, die für Proteine höherer Organismen codieren, Vorkommen können. Eukaryontische Systeme stellen auch eine Vielfalt von Prozessierungs-Mechanismen zur Verfügung, die beispielsweise zu einer Glykosylierung, Oxidation oder Derivatisierung bestimmter Aminosäurereste, einer Konforma-tionsSteuerung usw. führen.

Zu den allgemein verwendeten eukaryontisehen Systemen gehören Hefe, Insektenzellen, Säugerzellen, Vogelzellen und Zellen höherer Pflanzen. Die Liste ist nicht vollständig. Geeignete Promotoren sind erhältlich, die mit jeder dieser Wirt-Arten kompatibel und zur Verwendung mit dieser brauchbar sind, sowie auch Terminations-Sequenzen und Verstärker, wie z.B. der Baculovirus-Polyhedron-Promotor. Wie oben können die Promotoren entweder konstitutiv oder induzierbar sein. Beispielsweise kann im Säuger-System der MTII-Promotor durch Zugabe von Schwermetall-Ionen induziert werden.

Die Details für die Konstruktion von ExpressionsSystemen, die für einen gewünschten Wirt geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Für die rekombinante Produktion des Proteins, wird die dafür codierende DNA zweckmäßig in das Expressionssystem der Wahl ligiert, und das System wird dann in die kompatible Wirtszelle transformiert, die dann gezüchtet und unter Bedingungen gehalten wird, bei welchen die Expression der Fremdgens stattfindet. Die Tauone dieser Erfindung, die auf diese Weise erzeugt werden, werden aus der Kultur entweder durch Lysieren der Zellen oder aus dem Kulturmedium, wie es passend und den Fachleuten bekannt ist, gewonnen.

Korrekte Ligationen für die Plasmid-Konstruktion können bestätigt werden, indem zuerst ein geeigneter Wirt mit der Ligati-onsmischung transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder eine andere Antibiotikum-Resistenz oder unter Verwendung von anderen Markern selektiert, je nach der Art der Plasmid-Konstruktion, wie man es auf dem vorliegenden Gebiet versteht.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine Herstellung von Tauonen, insbesondere aus humanen oder rekombinanten Quellen, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere von

I MArHJfSEDCinUT I 11 normalen Tau-Proteinen, sind. Solche Präparationen können mittels Verfahren vorgesehen werden, an welchen ein Immunoaffinitäts-schritt unter Verwendung der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung beteiligt ist. Vorzugsweise enthält die Präparation gemäß der vorliegenden Erfindung mehr als 80% Tauone, insbesondere mehr als 95% Tauone, des Geamtproteins.

Weiters betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Set zur Detektion von Tauonen, abnorm trunkierten Formen des Tau-Proteins, die sich in ihrer Konformation vom normalen Tau unterscheiden, in einer Probe eines Gehirn-Gewebes bei Alzheimer-Krankheit, oder in einer Probe einer einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfassenden Körperflüssigkeit, und einen geeigneten Behälter zum Bereitstellen der Probe. Es ist möglich, die Antikörper in einem Set zur Detektion oder Isolation von Tauonen bereitzustellen. Mit Hilfe von Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung können Tauon-Proteine aus verschiedenen Quellen, einschließlich von Alzheimer-Krankheit befallener Neuronen der transenthorinalen, enthorinalen Region und dem Hippo-campus, detektiert und isoliert werden. Tauone, die auf diese Weise isoliert wurden, können weiter als Immunogen zur Immunisierung von beispielsweise Mäusen für die Konstruktion von Hybridomen verwendet werden, die spezifische monoklonale Antikörper gegen Tauone erzeugen, die normales Tau der vollen Länge nicht erkennen. Dieses Verfahren umfasst das Identifizieren und Freisetzen von Neuronen aus der transenthorinalen, der enthorinalen und der Hippocampus-Region von mit Alzheimer-Krankheit befallenen Gehirn-Geweben in die Lösung, wobei die abnorme Konformation der Tauone erhalten bleibt.

Nach der Herstellung und Reinigung werden die Tauone als Immunogene verwendet und Mäusen in monatlichen Intervallen subkutan injiziert. Milzen aus diesen Tieren werden zur Konstruktion von Hybridomen verwendet, die monoklonale Antikörper gegen Tauone erzeugen. Diese können mittels wohl-etablierter Hybridom-Techni-ken erzeugt werden, die erstmalig von Köhler und Milstein eingeführt wurden (vgl. M. Köhler und C. Milstein, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Pre-Defined Speci-ficity", Nature, 256, S. 495-497, 1975). Nach einer ausreichend langen Immunisierung werden Antikörper-produzierende Lymphozyten aus dem Tier erhalten, entweder aus der Milz, den Lymphknoten oder aus peripherem Blut. Vorzugsweise werden die Lymphozyten aus

fNACHGEREICHT - 12 - • · der Milz erhalten. Die Milz-Lymphozyten werden dann mit einer Myelom-Zelllinie, üblicherweise in Anwesenheit eines Fusionsmittels, wie Polyethylenglykol (PEG), verschmolzen. Jede einer Anzahl von Myelom-Zelllinien kann als Fusionspartner gemäß Standard-Techniken verwendet werden; z.B. die P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653-Myelom-Linien. Die resultierenden Zellen, die die gewünschten Hybridome beinhalten, werden dann in einem selektiven Medium, wie HAT-Medium, gezüchtet, in welchem nicht-fusionierte parentale Myelom- oder Lymphozyten-Zellen schließlich absterben. Nur die Hybridom-Zellen überleben und können unter einschränkenden Bedingungen zum Erhalt isolierter Klone gezüchtet werden. Die Überstände der Hybridome werden auf die Anwesenheit von Antikörper der gewünschten Spezifität gescreent, beispielsweise mittels Immunoassay-Techniken unter Verwendung des Antigens, das zur Immunisierung verwendet worden war. Positive Klone können dann unter einschränkenden Verdünnungsbedingungen oder auf Weich-Agar subkloniert werden, und der erzeugte monoklonale Antikörper kann isoliert werden. Hybridome, die gemäß diesen Verfahren erzeugt wurden, können in vitro oder in vivo (in Aszites-Flüssigkeit) unter Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet bekannt sind, vermehrt werden. Zu den allgemein verwendeten Methoden für die Reinigung von monoklonalen Antikörpern zählen Ammonium-Sulfat-Fällung, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie (vgl. z.B. H. Zola et al., "Techniques for the Production and Characterization of Monoclonal Antibodies", in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, J.G.R. Hurell (Hrsgb.), S. 51-52 (CRC Press 1982)).

Vorzugsweise enthält das Set gemäß der vorliegenden Erfindung weiters Mittel zur Detekion des Bindungsereignisses dieses Antikörpers, der an das konformationsmäßig verschiedene Tau-Protein bindet. Vorzugsweise sind diese Mittel Sekundär-Antikörper, insbesondere spezifisch markierte Sekundär-Antikörper. Auch die Magnetkügelchen-Technik kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, so wie auch andere Protein-identifizierende Methoden, bei welchen Antikörper verwendet werden. Das Verfahren umfasst die Identifizierung von Tauon, das ein abnorm trunkiertes Tau-Protein ist, in einer Testprobe der Person. "Testprobe", wie hierin verwendet, bezeichnet eine biologische Probe von der Person, von welcher man vermutet, dass sie Tauone enthält. Die Testprobe kann ein Gehirngewebe umfassen, das abnorm trunkierte

I NACHGEREICHT I - 13 - • · • I • ♦ t · • t · • · « ·

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Tau-Proteine aufweist, wie Hippocampus-Gewebe oder Gewebe des Stirncortex, oder die Testprobe kann Zerebrospinal-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF) umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Testprobe CSF und ist das identifizierte Protein CSF-Tauon. Die Identifizierung von abnorm trunkierten Tau-Proteinen - Tauonen - umfasst zweckmäßig das Identifizieren von Antigenen in der Test-Probe, die fähig sind, an Antikörper zu binden, welche spezifisch reaktiv sind mit abnorm trunkierten Tau-Proteinen - Tauonen - , die die Sequenz (SEQ ID Nr. 1) enthalten und von Aminosäuren so flankiert sind, dass diese Tauone in einem Längenbereich von 100 bis 400 Aminosäuren liegen und durch eine Tauon-spezifische Konformation, welche vom normalen, löslichen Protein Tau verschieden ist, gekennzeichnet sind, oder an Antikörper, die spezifisch reaktiv sind mit abnorm trunkierten Tau-Proteinen - Tauonen -, die die Sequenz (SEQ ID Nr. 1) umfassen und von Aminosäuren so flankiert sind, dass diese Tauone in einem Längenbereich von etwa 100 bis 400 Aminosäuren liegen und durch eine Tauon-spezifische Konformation, welche vom normalen, löslichen Protein Tau verschieden ist, gekennzeichnet sind. Die Anwesenheit eines Tauons zeigt eine Krankheit an, die mit der Akkumulierung der Tauone bei AD-Patienten und bei anderen Patienten mit Tauopathien assoziiert ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion einer abnorm trunkierten Form von Tau-Protein, welches sich in seiner Konformation vom normalen Tau unterscheidet, in einer Körperflüssigkeit eines Patienten, umfasend das Mischen dieser Körperflüssigkeit mit einem Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, das Detektieren des Vorhandenseins eines Bindungsereignisses zwischen dem Antikörper und dem in seiner Konformation unterschiedlichen Tau-Protein (Tauon), und gegebenenfalls das Messen der Menge des in seiner Konformation verschiedenen Tau-Proteins, das an den Antikörper gebunden ist. Das Vorhandensein eines Tauons zeigt eine Krankheit an, die mit der Akkumulierung der Tauone bei einer Person mit AD und anderen Tauopathien assoziiert ist. Die Körperflüssigkeit eines Patienten kann jede biologische Testprobe von einer Person sein, von welcher man vermutet, dass sie Tauone enthält. Diese Körperflüssig-keit kann Gehirngewebe, wie Hippocampus-Gewebe oder Stirn- oder Cortex-Gewebe oder Zerebrospinal-Flüssigkeit (CSF) sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Körperflüssigkeit CSF i ΜΑΛΚλ 14 • · • · » · • I • · und sind die identifizierten Proteine CSF-Tauone.

Diese Identifizierung von Tauonen kann zweckmäßig mit biochemischen oder zytochemisehen Mitteln oder mit Enzym-Immunoas-says erfolgen, wie sie in vielen Handbüchern der Immunoassay-Produzenten beschrieben sind, wie man es auf diesem Gebiet versteht. Wenn biochemische Mittel verwendet werden, werden vorzugsweise 0,01 bis 10 g, insbesondere 0,5 bis 1 g, Gewebe, das krankhaftes Tau-Protein enthält, verwendet, auf einem Gel laufen gelassen und mittels Western-Blot identifiziert. Man nimmt an, dass eine solche Technik adäquat ist, wenn altersmäßig passende Kontrollen fehlen, bei welchen es sich zeigte, dass sie mit den Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung nicht reaktiv sind. Zytochemische Mittel, Färbung, zeigten bei normalem Gewebe keine Reaktivität. CSF von Patienten mit AD und von Patienten mit neurologischen Erkrankungen, die nicht zu AD gehören, sowie von normalen Individuen wurden mittels ELISA überprüft, um die Tauon-Mengen zu quantifizieren. Die CSF-Tauon-Menge war bei AD-Patienten im Vergleich zu jenen Patienten, die neurologische Erkrankungen hatten, welche nicht zu AD gehören, und zu Kontrollen signifikant erhöht. Bei AD fand man die signifikante Steigerung unabhängig vom Alter, in welchem die Krankheit begann, dem Apolipoprotein-E-Genotyp und dem klinischen Stadium. Western Blots von AD-CSF-Proteinen zeigen mehrere immunoreaktive Banden mit einem apparenten Molekulargewicht zwischen 50 und 15 kD, was mit abnorm trunkierten Tau-Proteinen übereinstimmt. Diese Ergebnisse zeigen an, dass CSF-Tauone die progressive Akkumulierung von krankhaftem Tau, das durch die Progression von AD verursacht ist, reflektieren.

Gemäß einem weiteren Aspekt können die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Patienten mit Alzheimer-Krankheit verwendet werden. Die Antikörper können biotechnisch zu Einzelketten-Mole-külen modifiziert werden, die mit einer Ziel-Sequenz ausgestattet sind, die fähig ist, sie in die Tauone exprimierenden Neuroblastom-Zellen zu liefern. Im vorliegenden AD-Zell-Modell binden Antikörper Tauone und greifen in ihre pathologischen Auswirkungen ein (Sequestration von normalem Tau) und steigern den Abbau abnorm trunkierter Formen des Tau-Proteins. In vitro-Untersuchungen (Sequestration von Tau-Protein, Filamentansammlung, Mikrotubulus-Zerlegung) mit abnorm trunkierten Tau-Proteinen und ihre Korre-

15 lation mit der Schwere der Alzheimer-Krankheit zeigen, dass sie wichtige Arzneimittel-Ziele sind.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und der Figuren, auf die die Erfindung nicht eingeschränkt sein sollte, genauer beschrieben.

Fig. 1 zeigt eine Übersicht über die Tauon-Herstellung;

Fig. 2 zeigt eine zusammengefasste schematische Darstellung von Tauon-Aminosäuresequenzen;

Fig. 3 zeigt Minimal-Tauon;

Fig. 4 zeigt C-terminal trunkiertes Tauon;

Fig. 5 zeigt N-terminal trunkiertes Tauon;

Fig. 6 zeigt eine schematische Tau-Darstellung;

Fig. 7 zeigt Human-Tau 37;

Fig. 8 zeigt Human-Tau 39;

Fig. 9 zeigt Human-Tau 40;

Fig. 10 zeigt Human-Tau 43;

Fig. 11 zeigt Human-Tau 44;

Fig. 12 zeigt Human-Tau 46; und

Fig. 13 zeigt großes Ratten-Tau.

BEISPIELE BEISPIEL 1

Herstellung der monoklonalen Antikörper der DC 11-Familie, die für Tauone spezifisch sind

Herstellung löslicher und unlöslicher Tauone als Antigene für die Immunisierung (Fig. 1)

Zur Isolierung von Tauonen aus Human-AD-Gehirnen wurde eine neue Vorgangsweise entwickelt, die teilweise auf den von Kopke et al., (1993) und Greenberg und Davies (1990) beschriebenen Methoden basiert. Human-Gehirne, die Veränderungen aufwiesen, welche für das I.-III. Braak-Stadium von AD charakteristisch sind, mit kurzer Autopsie-Verzögerung (post mortem delay, PMD) wurden ausgewählt. Blocks des Schläfenlappens einschließlich der enthori-nalen und transenthorinalen Regionen, Amygdala- und Hippocampus-Region wurden ausgewählt. Das Gewebe wurde seziert und sofort in minimales essentielles Medium (Gibco) eingetaucht. Das Gewebe wurde fein zerkleinert und durch ein 150 pm Maschendrahtsieb gedrückt. In diesem Zustand wurde die Gehirnprobe in zwei Aliquots, Probe A und Probe B, geteilt. | NACHGEREICHT \ - 16 - t · • · · • * · • · »I« • · * · » M«

Die Probe A wurde in 20 mM TRIS, pH 8, 0,32 M Saccharose, 10 mM ß-Mercaptoethanol, 5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 5 mM MgSO«, 5 mM Benzamidin, 10 mM Glycerinphosphat, 6 mM Phenylmethylsulfonyl-fluorid, 50 mM Natriumfluorid, 5 pg/ml Leupeptin, 1,5 ug/ml Pep-statin und 2 pg/ml Aprotinin weiter verarbeitet und bei 25.000 x g 35 min lang bei 4°C zentrifugiert, um Zellabfall zu entfernen. Der Überstand wurde dann bei 200.000 x g 40 min lang pelletisiert. Das resultierende Pellet wurde mit 8 M Harnstoff bei Raumtemperatur 70 min lang extrahiert und bei 300.000 x g 45 min lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde 24 h lang gegen das 10 mM TRIS, pH 7,6, unter häufigem Wechseln dialysiert und danach 24 h lang gegen 100 mM MES, 0,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM Dithiotreith, 0,75 mM NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 50 mM NaF, pH 2,7, dialysiert.

Die ausgefällten Proteine wurden durch 40-minütiges Zentrifugieren bei 200.000 x g entfernt. Der 200.000 x g-Überstand wurde gegen 25 mM MES, pH 6,4, 0,5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA und 1 mM Di-thiotreit dialysiert und danach auf einer Cellulose-Phosphat-Säule, die mit demselben Puffer äquilibriert war, fraktioniert. Die Säule wurde mit 2 mg/ml der Proteine beladen und mit 20 ml linearem Gradienten von NaCl (0-1 M) in Äquilibrierpuffer elu-iert. Die mit 0,1-0,8 M NaCl eluierten Proteine wurden mittels Western Blot evaluiert und durch eine Geschwindigkeits-Vakuum-Vorrichtung (speed vac)konzentriert.

Die Probe B wurde in 10 Volumina kalten Puffer (10 mM TRIS, 1 mM EGTA, 0,8 M NaCl, 10% Saccharose, pH 7,4) in einem Glas-Homogenisator gegeben. Nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 27.000 x g bei 4°C wurde der Überstand gewonnen, und das Pellet wurde mit dem Puffer homogenisiert und 30 min lang bei 27.000 x g zentrifugiert. Die 27.000 x g-Überstände der beiden Zentrifugationen wurden vereinigt, auf 1% (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin und 1% (Vol/Vol) ß-Mercaptoethanol eingestellt und bei 37°C 3 h lang auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 35.000 U/min wurde das Pellet in 5 ml Homogenisierungs-Puffer, ergänzt mit 1% Mercaptoethanol, homogenisiert und durch ein 0,45 pm-Filter filtriert. Das Filtrat wurde 1 h lang bei 35.000 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 mM Tris, pH 6,8, resuspendiert und mit 2,5% Ameisensäure 2 min lang extrahiert und danach bei 10.000 x g 10 min lang zentrifugiert, um unlösliches Material zu pelletisieren. Der Überstand wurde

NACHGEREICHT - 17 - < ι · **♦··«· : : : : : : ** * ···'..··..· :. über Nacht bei 4°C gegen 10 mM Tris, pH 7,4, dialysiert und wie zuvor zentrifugiert. Der resultierende Überstand (Fraktion II) wurde unter Verwendung einer Geschwindigkeits-Vakuum-Vorrichtung konzentriert und mittels SDS-PAGE evaluiert, gefolgt von Western Blot. Das Pellet der Probe B nach Extraktion mit 2,5% Ameisensäure, welches unlösliche Tauone enthielt (Fraktion III), wurde gewonnen und für Immunisierungen und Punkt-Assay (dot assay) verwendet. Tauone aus den Fraktionen (I, II und III) wurden ge-poolt und als Antigene (vgl. Fig. 1) für die Immunisierung von Mäusen verwendet.

Herstellung von Hybridomen, die die monoklonalen Antikörper der DC-ll-Familie erzeugen

Sechs Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden in drei Gruppen (A, B, C) eingeteilt. Die ersten beiden Gruppen (A, B) wurden mit 50 pg Antigen in komplettem Freund'schem Adjuvans (Sigma) geprimt und fünfmal in dreiwöchigen Intervallen mit 50 pg desselben Antigens (Ag) in inkomplettem Freund'schem Adjuvans geboostert. In der Gruppe A wurden alle Dosen in die Pfotenballen injiziert, und in der Gruppe B wurden Dosen des Ag subkutan verabreicht. Der dritten Gruppe Mäuse wurde nur einmal eine Dosis direkt in die Milz in PBS injiziert (intra-Spleen-Immunisierung), und die Milzen wurden eine Woche nach einem solchen Primen für die Fusion verwendet. Drei Tage vor der Fusion wurden den Mäusen der Gruppen A und B intravenös 50 pg Immunogen in PBS injiziert. Milzzellen aus immunisierten Mäusen wurden mit NS/O-Myelom-Zellen gemäß der Methode von Kontsekova et al., 1988, fusiioniert. 108 Splenozyten wurden mit 2 x 107 NS/O-Myelom-Zellen (Verhältnis 5:1) gemischt und 1 min lang in 1 ml von 50% PEG 1550 (Serva) in Serum-freiem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% Dimethylsulfoxid, fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in DMEM, enthaltend 20% Pferdeserum, L-Glutamin (2 mM), Hypoxanthin (0,1 mM) , Aminopterin (0,004 mM) , Thymidin (0,016 mM) und Gentamycin (40 E/ml) mit einer Dichte von 2,5 x 105 Milzzellen pro Vertiefung auf Platten mit 96 Vertiefungen resuspendiert. Die Zellen wurden 10 Tage lang bei 37°C inkubiert, und wachsende Hy-bridome wurden auf die Produktion von anti-Tauon-spezifischen monoklonalen Antikörpern mittels ELISA und mittels Immunohisto-chemie gescreent.

Anti-Tauon-Antikörper-Screening mittels ELISA ELISA wurde verwendet, um monoklonale, gegen Tauone gerich-

I maohgereicht I tete Antikörper in Hybridom-Kultur-Überständen zu detektieren.

Als feste Phase wurden Tauone, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, mit einer folgenden Modifikation verwendet. Ein Pool des mit Geschwindigkeits-Vakuum konzentrierten Tau aus Fraktionen wurde durch Elektrophorese auf Polyacrylamid-Gel getrennt, und trunkierte Formen des Tau-Proteins wurden durch Elektroelution gemäß dem Verfahren von Donofrio et al., (1986) gewonnen und mittels SDS-PAGE evaluiert. Mikrotiterplatten wurden über Nacht mit abnorm trunkierten Tau-Proteinen (10 pg/ml, 50 μΐ/Vertiefung) bei 4°C in PBS beschichtet. Nach dem Blockieren mit 1% Mager-Trockenmilch zur Verringerung unspezifischer Bindung wurden die Platten mit Pbs-0,05% Tween 20 gewaschen und mit 50 μΙ/Vertiefung des Kulturüberstandes 1 h lang bei 37°C inkubiert. Gebundene monoklonale Antikörper wurden mit Schaf-anti-Maus-Ig, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (DAKO), detek-tiert. Die Reaktion wurde mit o-Phenylendiamin-Lösung als Peroxidase-Substrat entwickelt und mit 50 μΐ 2 M H2S04 gestoppt. Die Absorption bei 492 nm wurde unter Verwendung eines Multiscan MCC/340 ELISA-Ablesegeräts (Labsystems) gemessen. Ablesungen von mindestens dem doppelten Wert der negativen Kontrollen wurden als positiv angesehen.

Positive Kulturen wurden in Weich-Agar gemäß dem Verfahren von Kontsekova et al., 1991, weiter sub-kloniert. Isolierte Sub-Klone wurden auf die Produktion von spezifischen monoklonalen anti-Tauon-Antikörpern wiederum gescreent.

Immunhistochemisch.es Screening der anti-Tauon-Antikörper

Monoklonale Antikörper, die als positiv im anti-Tauon-ELISA und auf normalem Tau negativ identifiziert worden waren, wurden auf AD-Gehirn-Gewebe hinsichtlich ihrer Spezifität wie folgt wiederum gescreent:

Die bei der Autopsie entfernten Gehirne von AD-Patienten wurden in lcm-Abständen in der Korona-Platte durchschnitten und bei -20°C gelagert. Die Blocks von Hippocampus, enthorinaler, temporaler, frontaler, occipitaler und parietaler Cortex wurden in 4% gepuffertem Paraformaldehyd bei 4°C mehr als 4 Tage lang fixiert. Serien von Frontal-Schnitten (50 pm) wurden auf Vibratom geschnitten und in PBS (pH 7,0) bei 4°C gelagert. Frei schwimmende Vibratom-Schnitte wurden 2-3 min lang mit 98% kalter Ameisensäure vorbehandelt, mit prä-Immunserum in PBS/Triton X 100 inkubiert. Das verwendete Serum stammte von derselben Tier-Spe-

I Μ Λ Λυ/tCDCirMJT zies wie das des Sekundär-Antikörpers. Die Inkubation der Schnitte erfolgte 60 min lang mit dem monoklonalen Antikörper-Positiven im ELISA (wie oben beschrieben) bei 37°C.

Eine Inkubation mit dem zweiten biotinylierten Antikörper (Vectastain Elite-Set, Vector) wurde 1 h lang bei Raumtemperatur vorgenommen. Die Immunreaktionen wurden mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vectastain Elite-Set, Vector) und 6 mg 3-3-Diaminobenzidin-4HCl (SIGMA), 250 mg N1CI2 (MERCK) in 10 ml 0,1 M Acetat-Puffer (pH 6) mit 100 μΐ H2O2 sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde durch Waschen der Schnitte in PBS/Triton (Kiss et al., 1988; Cuello et al., 1993, Thorpe und Kerr, 1994) beendet. BEISPIEL 2

Quantitative Bestimmung der abnorm trunkierten Tau-Proteine (Tauone) unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der DC-11-Familie

Tauone wurden, wie oben beschrieben, isoliert. Die Kombination des monoklonalen Antikörpers DC30 (erkennt sowohl normales als auch pathologisches Tau) und der Familie der monoklonalen DC-11-Antikörper (spezifisch für abnorm trunkiertes Tau) ermöglicht eine Quantifizierung von Tauonen in den getesteten Proben, die aus AD-Gehirnen hergestellt worden waren. Die Antikörper wurden aus Serum-freiem Medium durch Protein A-Säulenchromatographie gereinigt. Die Vertiefungen einer hoch-bindenden Mikrotiter-Platte (Nunc) wurden mit der Mischung aus monoklonalen DC-ll-An-tikörpern mit einer Konzentration von 10 pg/ml (50 μΐ/Vertiefung) in PBS über Nacht bei 4°C beschichtet. Unspezifische Bindung in Vertiefungen wurde durch 60-minütige Zugabe von 200 μΐ 1% Mager-Trockenmilch in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur gesättigt. Die Platten wurden 3 mal mit PBS-0,05% Tween 20 (V/V) gewaschen. Die seriell verdünnten Standards, die rekombinante Tauone in Konzentrationen im Bereich von zwischen 100-1000 pg/ml in PBS enthielten, sowie die Testproben, die AD-Tauone in einer Menge von 50 μΐ enthielten, wurden zugegeben.

Nach 60-minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten gewaschen, und der mit Meerrettich-Peroxidase konjugierte Antikörper DC30, verdünnt 1/5000 in PBS, wurde 60 min lang bei 37°C zugegeben (50 μΐ/Vertiefung). Nach einem letzten Waschen wurden 50 μΐ Orthophenylendiamin-Lösung und 0,003% H2O2 in die Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurden 20 min lang im Dunklen inkubiert. Die Reaktion wurde mit 50 μΐ 2 M H2SO4 gestoppt. Die Ab-

NACHGEREICHT 20

Sorption bei 492 nm wurde im ELISA-Ablesegerät Multiscan MC344 {Labsystems, Finnland) abgelesen.

Die Standard-Kurve für rekombinante Tauone wurde aus den erhaltenen Werten konstruiert, und die entsprechenden Konzentrationen der Tauone in den getesteten Proben wurden aus der Standard-Kurve bestimmt. BEISPIEL 3

Detektion von Tauonen mittels Western Blot unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers DC-11

Gereinigtes, rekombinantes Human-Tau der vollen Länge und abnorm trunkierte Tau-Proteine - Tauone - wurden auf 5-20% Gra-dienten-SDS-Polyacrylamid-Gele geladen und unter denaturierten Bedingungen gemäß Laemmli (1970) laufen lassen. Nach SDS-PAGE wurde der Transfer auf eine Polyvinyl-Difluorid-Membran (mili-pore) in 10 mM CAPS-Puffer, pH 12, 1 h lang bei 350 mA unter Kühlung durchgeführt. Nach dem Blotten wurde die Membran in PBS gewaschen und mit 1% Trocken-Magermilch in Pbs 1 h lang bei Raumtemperatur gewaschen. Transferierte Proteine wurden über Nacht bei 4°C mit monoklonalem Antikörper DC-11 inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS-0,05% Tween 20 (V/V) wurde Ratten-anti-Maus-Immunoglobulin, markiert mit Meerrettich-Peroxidase, mit einer Verdünnung 1/1000 verwendet und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde dann viermal in PBS-Tween 20 gewaschen, mit Substrat-Lösung (12 mg 4-Chlor-l-naphtol, 4 ml Methanol, 16 ml PB, 0,03% V/V H2O2) entwickelt, und die Reaktion wurde in H20 gestoppt. Die Resultate zeigten an, dass der Antikörper DC-11 lediglich abnorm trunkiertes Tau - Tauone, erkannte, dagegen ist der monoklonale Antikörper DC30 ein pan-Tau-Antikörper, der universell alle bekannten Tau-Isoformen aus vielen Spezies erkennt (Mensch, Affe, Rind, Schwein, Ratte, Maus), unabhängig vom Zustand der post-translationalen Modifikationen. BEISPIEL 4

Immunohistochemische Identifizierung von Tauonen

Die monoklonalen Antikörper der DC-ll-Familie sind zur Sichtbarmachung von Tauonen in AD-Gehirnen in verschiedenen Arten der immunohistochemischen Verfahren geeignet.

Lichtmikroskopische Markierung

Die bei der Autopsie entfernten Gehirne von AD-Patienten wurden in lcm-Abständen in der Korona-Platte durchschnitten und bei -20°C gelagert. Die Blocks von Hippocampus, enthorinaler,

I NACHGEREICHT I 21 temporaler, frontaler, occipitaler und parietaler Cortex wurden in 4% gepuffertem Paraformaldehyd bei 4°C mehr als 4 Tage lang fixiert. Serien von Frontal-Schnitten (50 pm) wurden auf Vibratom geschnitten und in PBS (pH 7) bei 4°C gelagert. Frei schwimmende Vibratom-Schnitte wurden 2 min lang mit 98% kalter Ameisensäure vorbehandelt, mit prä-Immunserum in PBS/Triton X 100 inkubiert. Das verwendete Serum stammte von derselben Tier-Spezies wie das des Sekundär-Antikörpers. Die Inkubation der Schnitte erfolgte 60 min lang mit monoklonalem Antikörper DC-11 bei 37°C. Eine Inkubation mit dem zweiten biotinylierten Antikörper (Vectastain Elite-Set, Vector) wurde 1 h lang bei Raumtemperatur vorgenommen. Die Immunreaktionen wurden mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Kom-plex (Vectastain Elite-Set, Vector) und 6 mg 3-3-Diaminobenzidin-4HC1 (SIGMA), 250 mg NiCl2 (MERCK) in 10 ml 0,1 M Acetat-Puffer (pH 6) mit 100 μΐ H202 sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde durch Waschen der Schnitte in PBS/Triton (Kiss et al., 1988; Cu-ello et al., 1993, Thorpe und Kerr, 1994) beendet.

Li ch tmikroskopi sehe Doppelmarki erung

Frei schwimmende Vibratom-Schnitte wurden 2-3 min lang mit 98% kalter Ameisensäure vorbehandelt, mit prä-Immunserum in PBS/Triton X 100 inkubiert. Das verwendete Serum stammte von derselben Tier-Spezies wie das des Sekundär-Antikörpers. Die Schnitte wurden zuerst mit mit Peroxidase konjugiertem monoklonalem Antikörper DC-11 mit einer Verdünnung 1:1000 in Blockierungslösung (5% Pferdeserum, PBS, 0,1% Triton) 60 min lang bei 37°C inkubiert, in 0,06% DAB, 0,01% H202 in PBS (pH 7,2) entwickelt. Die Reaktion wurde durch Waschen der Schnitte in PBS/Triton beendet. Eine Inkubation derselben Schnitte mit dem zweiten monoklonalen Antikörper erfolgte 60 min lang bei 37°C. Inkubation mit dem biotinylierten Antikörper (Vectastain Elite-Set, Vector) erfolgte 1 h lang bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vectastain Elite-Set, Vector) und 0,06% 3-3-diaminobenzidin-4HCl (SIGMA), 0,01% H202, 2,5% NiCl2 (MERCK) in 0,1 M Acetatpuffer sichtbar gemacht und durch Waschen der Schnitte in 0,1 M Acetatpuffer (Kiss et al., 1988; Cuello, 1993) beendet.

Gegenfärhung mit schnellem Kresylviolett

Nach Beendigung der immunohistochemischen Färbung wurden die Schnitte auf Objektträger aus Glas gegeben und 60 min lang in einen Thermostat mit 56°C gegeben. Nach der Inkubation wurden die

I MAn.wrsPRPinm“ I 22

Objektträger 5 min lang in destilliertes Wasser eingetaucht, mit schneller Kresylviolett-Lösung 5-10 min bei 4°C gefärbt, in Wasser gespült und in 96% Ethanol transferiert, bis der Großteil der Kresylviolett-Färbung entfernt war, in Xylen geklärt und mit en-tellan fixiert.

Immunofluoreszenz-Färbung

Frei schwimmende Vibratom-Schnitte (30 um) wurden 2 min lang mit 98% kalter Ameisensäure vorbehandelt, mit prä-Immunserum in PBS/Triton X 100 inkubiert. Die Schnitte wurden zuerst mit dem monoklonalen Primär-Antikörper DC-11 60 min lang bei 37°C inkubiert und danach'30 min lang mit einem FITC-konjugierten Ziegen-anti-Maus-Sekundär-Antikörper (Immunotech), 1:500 in PBS/Triton verdünnt, bei Raumtemperatur gemäß den auf diesem Gebiet verwendeten Standard-Methoden inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit mit TRITC konjugiertem Primär-Antikörper 60 min lang bei 37°C inkubiert und in 0,1% Paraphenylendiamin/Glyzerin-Lösung fixiert. BEISPIEL 5

Mikrotubulus-Ansammlung und Mikrotubulus-Bindungstests mit Tauonen

Tubulin-Reinigung Tübulin wurde aus vom örtlichen Schlachthaus erhaltenen « frischen Schweine-Gehirnen isoliert durch Temperatur-abhängige Zyklen von Mikrotubulus-Polymerisation und -Depolymerisation, gefolgt von Phosphocellulose(Watman Pli Phosphocellulose)-Ionenaustausch-Chromatographie (Valee, 1986) .

Mi kro tubul us-Ansamml ungs-Tes t

Gereinigte Tauone (5 mM) wurden mit zuvor geklärtem, gereinigtem Tubulin (10 mM) und GTP (1 mM) in Sammelpuffer (100 mM PIPES pH 6,9, 2 mM EGTA, 1 mM MgS04) bei +4°C gemischt. Diese Tubulin-Konzentration liegt unter der für spontane Ansandung kritischen Konzentration (Black, 1987). Die Proben wurden in Quartz-Küvetten, die auf 37°C vorgewärmt worden waren, pipettiert. Die Änderung der Trübe wurde spektrophotometrisch in einem thermostatisch gesteuerten Spektrophotometer (LKB) gemessen und als Änderung der OD350 in 10 s-Intervallen für einen Zeitraum von 30 min aufgezeichnet.

Mikrotubulus-Bindungs-Test

Die Bindungskurven von Tauonen mit Mikrotubuli wurden, wie früher beschrieben (Gustke, 1992), gemessen. Gereinigtes Tubulin

NACHGEREICHT 23 wurde bei 37°C in Anwesenheit von GTP (1 mM) und Taxol (20 μΜ) im Bindungs-Puffer (100 mM PIPES pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSCh, 1 mM DTT) 10 min lang inkubiert. Die Mikrotubuli wurden mit Taxol stabilisiert, welches nicht in die Bindung von Tauonen oder normalem Tau-Protein bzw. anderen MAPs eingreift (Valee, 1986; Wallis, 1993), womit die Wirkung der Mikrotululi-Ansammlung eliminiert wurde. Tauone wurden in Konzentrationen von 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM, 15 mM bzw. 20 mM zugegeben. Nach 35-minütigem Zentrifugieren, 43.000 x g, 37°C, wurden die Pellets in P-Puffer (50 mM PIPES, pH 6,9, 1 m EGTA, 0,2 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 mM NaCl) re-suspendiert. Der Überstand und die Pellets wurden auf SDS-PAGE-Gelen (Laemmli, 1970) analysiert, mit Silber gefärbt (Bloom, 1987). Die Gele wurden auf einem HPScanJet (Hewlett-Packard) -Scanner gescannt, und die Analyse wurde auf einem Macintosh-Computer unter Verwendung des öffentlichen Domänen NIH-Image-Programms (entwickelt an den U.S. National Institutes of Health und erhältlich im Internet bei http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) durchgeführt. Die Band-Intensitäten wurden unter Verwendung der Methode der internen Standards und von Eichkurven in Konzentrationen umgewandelt. BEISPIEL 6

Herstellung rekombinanter Tauone

Rekombinante, trunkierte Formen von Tau-Protein wurden unter Verwendung von "Erase a Base System" (Promega) gemäß dem technischen Handbuch hergestellt. Das System basiert auf dem Exonu-klease III-spezifischen Verdau insertierter DNA, beginnend beim 5'-Überhang. Die Verdau-Geschwindigkeit war gleichmäßig bei konstanter Temperatur. Das Tau-Gen wurde in den pET17b-Vektor durch Ndel-EcoRI-Restriktionsstellen kloniert, wodurch pET/T40 erzeugt wurde. An das C-Ende des Gens wurden eine KpnI-Restriktionsstelle und drei Stop-Codons in allen drei Leserahmen stromabwärts der KpnI-Stelle hinzugefügt. Das EcoRI-Enzym läßt 5'-Enden überhängend, das Substrat für exoIII. Kpnl läßt 3'-Enden überhängend, die gegen exoIII-Verdau resistent sind. 1 gg pET/T40-Vektor, doppelt verdaut mit EcoRI, KpnI/NEB und mit Ethanol ausgefällt, wurden in 20 μΐ IxExoIII-Puffer verdünnt und durch 80 E exoIII bei 37°C/Verdau-Geschwindigkeit 450 Basen/Minute verdaut. 2,5 μΐ-Proben wurden nach ExoIII-Addition in 30 s-Intervallen in 7,5 μΐ Sl-Nuklease-Mischung/1,5 E Sl-Nuklease für eine Probe auf Eis transferiert. Die gesammelten Proben wurden bei Raumtemperatur

NACHGEREICHT I 24 30 min lang inkubiert, um übrige Einzelstrang-Schwänze zu entfernen. Klenow-DNA-Polymerase wurde verwendet, um stumpfe Enden zu schaffen. DH5alfa-kompetente Zellen wurden direkt mit Ligati-onsmischungen der Proben transformiert. Die Sub-Klone wurden durch Pstl-Xhol-Restriktion gescreent, und die korrekten Konstrukte wurden unter Verwendung von T7-Primer in pET-Vektor sequenziert.

Expression, Reinigung und Quantifizierung rekombinanter Tauone

Tauone wurden in E. coli BL21(DE3) (Studier, 1986) expri-miert. Einzelne Bakterien-Kolonien wurden in 500 ml LB-AMP (LB-Medium, 100 pg/ml Ampicillin) geimpft. Die Bakterien-Kulturen wurden bei 37°C auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung gezüchtet, bis ihre ODeoo 0,6-0,8 erreichte, und danach durch Zugabe von IPTG (0,4 mM Endkonzentration) induziert. Nach 3 h wurden die Bakterienzellen durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 5,000 g bei 4°C (Sigma 6K15, Rotor 12 500) pelletisiert, und das Pellet der Zellen wurde rasch in flüssigem Stickstoff gefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -70°C gelagert. Für die Herstellung des Zelllysats wurde das Bakterien-Pellet in Puffer A (20 mM PIPES, pH 6,9, 50 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM MgS04, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF) re-suspendiert, die Zellen wurden durch 6-minütige Ultraschallbehandlung auf Eis aufgebrochen, und der Zellabfall wurde durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 45.000 U/min bei +2°C (Rotor TLA-120.2, Beckmann Optima TLX) entfernt. Die Überstände wurden durch 0,22 μπν-Filter (Millipore) filtriert, und die Tauone wurden sofort durch Ionenaustausch-Chromatographie auf einer Phosphocel-lulose(Cellulosephosphat Whatman Pli)-Säule gereinigt. Nach dem Beladen mit der Probe wurde die Säule mit 10 Bett-Volumen des Puffers A gewaschen. Die Tauone wurden mit 20 ml eines linearen Gradienten von NaCl (50 mM-0,5 M) im Puffer A eluiert. Die 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt, und jene, die Proteine enthielten, wurden auf SDS-PAGE identifiziert. Die Tauone enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und gegen PBS 3 x 60 min lang bei 4°C dia-lysiert. Aliquots des Dialysats wurden Vakuum-getrocknet (Speed Vac) und bei -20°C gelagert. Die rekombinanten Tauone wurden mittels PAGE quantifiziert, wobei seriell verdünntes Rinderserumalbumin (BSA) als Massen-Standard-Marker verwendet wurden. Das Gel wurde mit Coomassie-Blue gefärbt, getrocknet, und die Intensität von BSA- und Tau-Banden wurden unter Verwendung von Scion

| NACHGEREICHT 25

Image (Beta 3b, Scion Corp.) berechnet. Die Eichkurve für BSA wurde konstruiert und für die Quantifizierung der Tauone verwendet . BEISPIEL 7

Isolierung von Tauonen aus Human-AD-Gehim

Zur Isolierung von Tauonen aus menschlichen AD-Gehirnen wurde eine neue Vorgangsweise entwickelt, die z.T, auf den von Kopke et al. (1993) und Greenberg und Davies (1990) beschriebenen Verfahren beruhte. Human-Gehirne, die Veränderungen aufwiesen, welche für das I.-III. Braak-Stadium von AD charakteristisch sind, mit kurzer Autopsie-Verzögerung (post mortem delay, PMD) wurden ausgewählt. Blocks des Schläfenlappens einschließlich der enthorinalen und transenthorinalen Regionen, Amygdala- und Hip-pocampus-Region wurden ausgewählt. Das Gewebe wurde seziert und sofort in minimales essentielles Medium (Gibco) eingetaucht. Das Gewebe wurde fein zerkleinert und durch ein 150 μπι Maschendrahtsieb gedrückt. In diesem Zustand wurde die Gehirnprobe in zwei Aliquots, Probe A und Probe B, geteilt.

Die Probe A wurde in 20 mM TRIS, pH 8, 0,32 M Saccharose, 10 mM ß-Mercaptoethanol, 5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 5 mM MgS04, 5 mM Benzamidin, 10 mM Glycerinphosphat, 6 mM Phenylmethylsulfonyl-fluorid, 50 mM Natriumfluorid, 5 pg/ml Leupeptin, 1,5 pg/ml Pepstatin und 2 pg/ml Aprotinin weiter verarbeitet und bei 25.000 x g 35 min lang bei 4°C zentrifugiert, um Zellabfall zu entfernen. Der Überstand wurde dann bei 200.000 x g 40 min lang pelletisiert. Das resultierende Pellet wurde mit 8 M Harnstoff bei Raumtemperatur 70 min lang extrahiert und bei 300.000 x g 45 min lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde 24 h lang gegen das 10 mM TRIS, pH 7,6, unter häufigem Wechseln dialysiert und danach 24 h lang gegen 100 mM MES, 0,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM Dithiotreith, 0,75 mM NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 50 mM NaF, pH 2,7, dialysiert.

Die ausgefällten Proteine wurden durch 40-minütiges Zentrifugieren bei 200.000 x g entfernt. Der 200.000 x g-Überstand wurde gegen 25 mM MES, pH 6,4, 0,5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA und 1 mM Di-thiotreit dialysiert und danach auf einer Cellulose-Phosphat-Säule, die mit demselben Puffer äquilibriert war, fraktioniert.

Die Säule wurde mit 2 mg der Proteine beladen und mit linearem Gradienten von NaCl (0-1 M) in Äquilibrierpuffer eluiert. Die mit 0,1-0,8 M NaCl eluierten Proteine wurden mittels Western Blot I NACHGEREICHT | evaluiert und durch eine Geschwindigkeits-Vakuum-Vorrichtung konzentriert.

Die Probe B wurde in 10 Volumina kalten Puffer (10 mM TRIS, 1 mM EGTA, 0,8 M NaCl, 10% Saccharose, pH 7,4) in einem Glas-Homogenisator gegeben. Nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 27.000 x g bei 4°C wurde der Überstand gewonnen, und das Pellet wurde mit dem Puffer homogenisiert und 30 min lang bei 27.000 x g zentrifugiert. Die 27.000 x g-Überstände der beiden Zentrifugationen wurden vereinigt, auf 1% (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin und 1% (Vol/Vol) ß-Mercaptoethanol eingestellt und bei 37°C 3 h lang unter Schütteln auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 35.000 U/min wurde das Pellet in 5 ml Homogenisierungs-Puffer, ergänzt mit 1% Mercaptoethanol, homogenisiert und durch ein 0,45 pm-Filter filtriert. Das Filtrat wurde 1 h lang bei 35.000 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 mM Tris, pH 6,8, resuspendiert und mit 2,5% Ameisensäure 2 min lang extrahiert und danach bei 10.000 x g 10 min lang zentrifugiert, um unlösliches Material zu pelletisieren. Der Überstand wurde über Nacht bei 4°C gegen 10 mM Tris, pH 7,4, dialysiert und wie zuvor zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde unter Verwendung einer Geschwindigkeits-Vakuum-Vor-richtung konzentriert und mittels SDS-PAGE evaluiert, gefolgt von Western Blot. BEISPIEL 8

Reinigung von normalem Tau aus Human-, Schweine- und Rinder-Gehirageweben

Tau wurde durch die Modifizierung des Verfahrens von Lindwall und Cole, 1984, gereinigt. Das Gehirngewebe (1 mg/ml) wurde in 0,1 mM MES, 0,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 6,5, homogenisiert und 90 min lang bei 4°C mit 100.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 0,5% (V/V) 2-Mercaptoethanol gebracht, 5 min lang bei 100°C erhitzt und 30 min lang auf 4°C mit nachgereicht 20.000 x g zentrifugiert. Dieser zweite Überstand wurde auf 45% Sättigung in (NH^SCh gebracht und wie oben bei 20.000 x g zentrifugiert, und das resultierende Pellet wurde in MES-Puffer ohne NaCl re-suspendiert. Nach Ausfällung mit 2,5% (V/V) Perchlorsäure und einer weiteren Zentrifugation bei 20.000 x g wurde der endgültige Überstand gegen 5 mM Tris, pH 7,4, über nacht bei 4°C dialysiert. BEISPIEL 9

Sequestration und Aggregation von normalem Tau zu Verflechtungen aus Filamenten durch Tauone

Zunehmende Mengen von normalem Tau (5-100 pg/100 μΐ) wurden mit feststehenden Mengen an Tauonen, die aus Fraktion I isoliert worden waren (10 pg/100gl) gemischt. Die Reaktion wurde in einem endgültigen Volumen von 100 ml Bindungspuffer (100 mM MES, pH 7,6, enthaltend 2 mM EGTA, 2% Rinderserumalbumin, 0,5 mM MgCl2, 1 μΜ Aprotinin und 20 μΜ Leupeptin) durchgeführt. Die Mischung wurde 45 min lang bei Raumtemperatur in Wechselwirkung treten lassen, danach auf 150 μΐ 80% Saccharose im Bindungspuffer überlagert und 1 h lang bei 100.000 x g zentrifugiert. Die oberen 150 μΐ wurden entfernt, und der Rest wurde einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um eine Wechselwirkung zwischen Tauonen und normalem Tau durch Radioimmuno-dot-blot-Assay festzustellen. Die Anwesenheit von Tau in der Saccharose-Schicht deutet auf eine Sequestration von gesundem Tau durch Tauone hin. BEISPIEL 10

Hemmung der Neuronen-Degeneration durch die monoklonalen Antikörper der DC-ll-Familie

Neuronale Blastom-Zellen und Wachstumsfaktor werden auf Pe-tri-Schalen in Triplikaten ausplattiert. Die erste Gruppe erhielt Tauone alleine, und die zweite erhielt Tauone und die Mischung der monoklonalen DC-ll-Antikörper.

Detektion der transfektierten Tauone durch Immunofluoreszenz

Die Zellen wurden 5 min lang bei Raumtemperatur in 0,2% Triton X 100, enthaltend 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,6, permeabilisiert. Die Fixierung der Zellen erfolgte 15 min lang in 2% Paraformaldehyd im selben Puffer auf Eis. Die Tauone wurden durch das indirekte Immunofluoreszenz-Avidin-rhodamin-De-tektionssystem (Sigman) detektiert.

Detektion einer frühen Hemmung der neuronalen Differenzierung

Die Zellen wurden mit den Differenzierungs-Induktionsfaktoren gezüchtet. Die Differenzierungshöhen wurden evaluiert. In der Gruppe der Zellen, die Tauone ohne Antikörper aufwiesen, war die Fähigkeit zur Differenzierung deutlich gestört. In der mit einer Mischung aus Tauonen und Antikörpern behandelten Gruppe jedoch war die Differenzierungshöhe vergleichbar mit jener der Zellen aus der Kontrollgruppe, die mit einem irrelevanten Protein behandelt worden waren. 28

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Claims (12)

1. 35 Patentansprüche: 1. Antikörper mit einer Spezifität für abnorme Formen von Tau-Protein, die sich von normalem Tau in ihrer Konformation unterscheiden, wobei dieser Antikörper für normales Tau-Protein unspezifisch ist.
2. 2. Antikörper nach Anspruch 1, der von der hinterlegten Hybri-dom-Zelllinie DC-11 und DC-ll/I stammt, mit den Hinterlegungs-nummern 00082215 und 00082216 beim ECACC.
3. 3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 mit einer Spezifität von mindestens 50%, insbesondere mindestens 90%, für die hinsichtlich ihrer Konformation verschiedenen Formen von Tau, im Vergleich zu dem Antikörper, der von der hinterlegten Hybridom-Zelllinie DC-11 oder DC-ll/I mit den Hinterlegungsnummern 00082215 und 00082216 des ECACC produziert wird.
4. 4. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er ein synthetischer Antikörper ist.
5. 5. Hybridom-Zelllinie, die einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 produziert.
6. 6. Abnorm trunkierte Form von Tau-Protein, welches sich in seiner Konformation von normalem Tau unterscheidet, wobei diese konformationsmäßig verschiedene Form von Tau-Protein durch einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 spezifisch erkennbar ist.
7. 7. Tau-Protein-Form nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein entweder am N-oder am C-Terminus oder an beiden Termini im Vergleich zu normalem Tau abnorm trunkiert ist, und dass diese Formen von Tau-Protein mindestens 100 Aminosäuren bis 400 Aminosäuren der normalen Tau-Protein-Sequenz umfassen.
8. 8. Set zur Detektion oder Isolierung einer abnorm trunkierten Form von Tau-Protein, die sich in der Konformation von normalem Tau unterscheidet, in einer Probe eines Gehirn-Gewebes oder einer Körperflüssigkeit, das einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche I NACHGEREICHT - 36 - • * · • · • · • Μ 1 bis 4 umfasst und einen geeigneten Behälter zum Vorsehen der Probe.
9. 9. Set nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters Mittel zur Detektion des Bindungsereignisses dieser Antikörperbindung an das konformationsmäßig verschiedene Tau-Protein, vorzugsweise Sekundär-Antikörper, insbesondere spezifisch markierte Sekundär-Antikörper, enthält.
10. 10. Set nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters Mittel zur Quantifizierung des konformationsmäßig verschiedenen Tau-Proteins, insbesondere eine Standard-Präparation von konformationsmäßig verschiedenem Tau-Protein, enthält.
11. 11. Verfahren zur Detektion einer abnorm trunkierten Form von Tau-Protein, welches sich in seiner Konformation von normalem Tau unterscheidet, in einem Gehirngewebe oder in einer Körperflüs-sigkeit eines Patienten, welches das Mischen dieser Körperflüs-sigkeit mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Detektieren des Vorhandenseins eines Bindungsereignisses zwischen dem Antikörper und dem konformationsmäßig verschiedenen Tau-Protein, und gegebenenfalls das Messen der Menge an konformationsmäßig verschiedenem Tau-Protein, das an den Antikörper gebunden ist, umfasst.
12. 12. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Patienten mit Alzheimer-Krankheit. DA/fm NACHGEREICHT