AT501347A1 - Verfahren und set zur evaluierung der allergensensibilität eines individuums - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit einer Allergen-Immuntherapie.

Eine Allergie ist eine Immun-Fehlfunktion, wobei ein Individuum übersensibilisiert ist, so dass es auf typischerweise an sich harmlose Substanzen, Allergene genannt, immunologisch reagiert. Der Hauptantikörper, der an allergischen Reaktionen beteiligt ist, ist IgE. Jedes Individuum hat verschiedene IgE-Antikörper, und jede allergene Substanz stimuliert die Produktion ihres eigenen spezifischen IgE. Ein IgE-Antikörper, der an ein bestimmtes Allergen bindet, reagiert daher nur gegen dieses Allergen. Die konstante Region (Fc-Region) von IgE kann an spezifische Rezeptoren von Zellen binden, die Histamin oder andere Entzündungs-Vermittler, Cytokine und/oder Proteasen in das Umge-bun.gs-öewebe freisetzen können. Histamin-freisetzende Zellen sind hauptsächlich Mast- und basophile Zellen. Die Freisetzung von Histamin wird initiiert, wenn Zellen-gebundenes IgE durch ein Allergen kontaktiert und mit diesem vernetzt wird.

Insbesondere Histamin verursacht die allergischen Haupt-Reaktionen. Beispielsweise stimuliert in der Nase, in den Augen und Nebenhöhlen freigesetztes Histamin Niesen, Nasenrinnen und Augenjucken; in den Lungen freigesetzt, bewirkt es eine Verengung und Anschwellen der Auskleidung der Luftwege und die Sekretion von dickem Schleim; in der Haut, Ausschläge und Nesselsucht; und im Verdauungsystem Magenkrämpfe und Durchfall.

Typische Allergene stammen von Pflanzenpollen, wie Weidelgras („rye grass"), Ambrosie („ragweed"), Wiesenlieschgras („ti-mothy grass") und Birkenpollen, Schimmelpilz-Sporen, Arzneistoffe, wie Penicilline, Sulfonamide, Salicylate und Lokalanaesthe-tika, Nahrungsmittel, wie Nüsse, essbare Meerestiere, Eier, Erbsen, Bohnen, Erdnüsse und andere Gemüse, Milch, Insektenprodukte, wie Bienenstich-Gift, Wespenstich-Gift, Küchenschaben-Ca-lyx („cockroach calyx") und Staubmilben, und Tierhaar und -hautschuppen.

Es gibt eine Reihe medizinischer Behandlungen für Allergien. Drei Methoden werden vor allem regelmäßig in der medizinischen Praxis verwendet: Chemotherapie, Immuntherapie und alternative medizinische Methoden.

Bei der Chemotherapie werden antagonistische Arzneistoffe verwendet, um die Wirkung allergischer Mediatoren zu blockieren, wobei die Aktivierung von Zellen und Degranulationsprozesse

NACHGEREICHT - 2 - c ···· ·· ··· • · verhindert werden. Diese inkludieren Antihistamine, Cortison, Adrenalin (Epinephrin), Theophyllin und Cromolyn-Natrium. Diese Arzneistoffe helfen, die Allergiesymptome zu lindern, spielen aber nur eine geringe Rolle bei der chronischen Linderung der Funktionsstörung. Sie können eine zwingende Rolle bei der akuten Erholung von jemandem, der an Anaphylaxis leidet, spielen.

In der alternativen Medizin werden eine Reihe von Behandlungen von jenen, die die Behandlung von Allergien, insbesondere die traditionelle chinesische Medizin, praktizieren, als wirksam angesehen. Jedoch ist keine davon durch Beweise von guter Qualität belegt.

Die vielversprechendste Therapieform ist vermutlich die Immuntherapie. Im Laufe einer Immuntherapie wird ein Individuum allmählich gegen zunehmend größere Dosen des in Frage stehenden Allergens geimpft. Dies kann entweder die Schwere verringern oder die Überempfindlichkeit vollständig eliminieren. Alternativ können monoklonale anti-IgE-Antikörper injiziert werden. Diese Antikörper binden an freies IgE und geben Signale zur Zerstörung solcher Quellen ab. Sie binden nicht an IgE, das bereits an den Fc-Rezeptor an Basophilen und Mastzellen gebunden ist, da dies die allergische Entzündungsreaktion stimulieren würde.

Die bei der Allergen-Immuntherapie verwendeten Proteine und Glykoproteine werden üblicherweise aus Materialien, wie Pollen, Schimmelpilze, Fell und Insekten-Gifte extrahiert. Auf Basis der klinischen Evaluierung erfolgen wiederholte subkutane Injektionen einer Lösung des krankheitsbewirkenden Allergens oder eines Derivats davon ein- oder zweimal pro Woche in steigenden Dosen, bis eine Erhaltungsdosis erreicht ist. Diese Erhaltungsdosis wird dann alle 2 bis 4 Wochen injiziert.

Um eine Immuntherapie erfolgreich durchzuführen, muss eine Überwachung des Verlaufs dieser Therapie durchgeführt werden.

Beispielsweise ist in Wantke et al. (Clin. Exp. Allergy 23 (1993), 992-995) ein Verfahren zur Überwachung einer Immuntherapie für allergische Rhinokonjunktivitis geoffenbart. Darin analysierten die Autoren die spontane Histamin-Freisetzung, d.h. die Freisetzung ohne Zugabe eines Allergens, bei Patienten vor und nach der Immuntherapie und zeigten, dass die Histamin-Freisetzung ins Blut nach Einwirkung des Allergens nach viermona-tiger Behandlung signifikant verringert war. Dieses Verfahren kann jedoch nicht verwendet werden, um Änderungen in der Emp-

MACHGEREICHT ····

- 3 - findlichkeit gegenüber einem bestimmten Allergen und die spezifische Wirksamkeit der Behandlung zu beurteilen.

Stephan et al. (Allergy 44 (1989), 453-459) untersuchten die Wirkung der Bienengift-Immuntherapie über einen Zeitraum von mehr als fünf Jahren durch Analysieren der Allergen-induzierten Histamin-Freisetzung in Vollblut. Die Autoren dieser Studie setzten jedoch die Ergebnisse der Histamin-Freisetzung nicht in Korrelation mit einem klinischen Parameter, z.B. Hautempfindlichkeit, und folglich wurden keine Daten gezeigt, die die Verwendung des Tests zur Messung und zur Wiedergabe einer klinischen Empfindlichkeit gegen ein bestimmtes Allergen recht-fertigen würden. Weiters wurden keine vor und nach Behandlung erhaltenen Proben untereinander verglichen.

Yuta et al. (Arerugi 51 (2002), 634-648) untersuchten die Histamin-Freisetzung aus basophilen Zellen, um eine Immuntherapie allergischer Rhinitis zu evaluieren. Die Autoren analysierten Proben zu Beginn der Behandlung und zum Zeitpunkt von sechs Monaten nach Beginn der Immuntherapie und konnten die positive Wirkung der Therapie zeigen. In diesem Artikel wurden vor und nach Behandlung erhaltene Proben analysiert, und die Autoren konnten nur zeigen, dass das Eilprotokoll („rush proto-col") zu einer Erschöpfung der Zellen führt, aber keine Verringerung der Histamin-Freisetzung zeigt. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, dass die Eil-Immuntherapie („rush immunotherapy") schon funktioniert, bevor „blockierende Antikörper" durch Immuntherapie induziert werden, d.h., manchmal nach Stunden und ein paar Tagen. Dies kann als Erschöpfung von Zellen interpretiert werden. Jedoch ist die Beurteilung der Auswirkung blockierender Antikörper, die nach mehrwöchiger Behandlung auftreten, wichtig. Folglich muss ein Test, in welchem die IgG-Antikörper noch vorhanden sind, z.B. Vollblut, verwendet werden. Dagegen wurden bei Yuta et al. die Zellen gewaschen, und folglich konnte die störende Einwirkung von blockierendem IgG nicht gemessen werden.

Zusätzlich zur Histamin-Freisetzung sind auch andere Methoden für die Beurteilung der Basophilen- und Mastzellen-Ak-tivierung bekannt, die das Messen der Freisetzung von Leutrienen (Van Rooyen & Anderson, R.J.Immunol. Methods 2004, 288, 1-7), Tryptase (Taira M. et al., J. Asthma, 2002, 39, 315-322) und anderer Mastzellen oder basophiler Produkte, die nach Allergenspezifischer Aktivierung der Mastzellen und Basophilen frei-_ | NACHGEREICHT \ - 4 - • ·

gesetzt werden, inkludieren. Weiters kann auch die Aufwärts-Re-gulierung von Aktivierungs-Markern, wie CD63 und CD203c, die sich aus der Einwirkung eines Allergens auf ein Individuum ergibt, durch Strömungs-Zytometrie gemessen werden (Hauswirth A.W., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2002, 110, 102-109).

Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, in vitro-Mittel und Methoden zur möglichst genauen Überwachung der klinischen Effizienz und des Fortschritts einer Allergen-Immun-therapie und Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums vorzusehen.

Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Evaluierung der Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums und/oder der klinischen Wirksamkeit einer Allergen-Immuntherapie vor, umfassend die Schritte: - Vorsehen von mindestens zwei Proben von einem Individuum, das einer Immuntherapie mit mindestens einem reinen Allergen oder einem Derivat davon unterzogen wurde oder unterzogen werden soll, wobei die Proben Zellen enthalten, die Mediatoren als Antwort auf dieses Allergen freisetzen können, - Kontaktieren der Probe mit dem Allergen oder dem Derivat davon, und - Bestimmen der Mengen der aus der Probe freigesetzten Mediatoren und Evaluieren der Allergen-Empfindlichkeit des Individuums vor der Therapie und/oder der klinischen Wirksamkeit der Immuntherapie durch Vergleichen dieser Mengen.

Die Evaluierung der Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums und/oder der klinischen Wirksamkeit sowie des Fortschritts einer Allergen-Immuntherapie ist wichtig, um eine wirksame Behandlung zu garantieren, beispielsweise durch Veränderung der Dosis und/oder der Zeitintervalle des verabreichten Allergens. Daher wird ein verlässliches Verfahren zur Überwachung der Immuntherapie benötigt, welches die Empfindlichkeit eines Individuums gegenüber einer bestimmten Art von Allergen vor und im Verlauf einer Immuntherapie direkt widerspiegelt. Es zeigte sich, dass die Messung der Menge an IgE, die spezifisch an ein Allergen bindet, nicht geeignet ist, um den Grad der Sensibilisierung eines Individuums für eine bestimmte Art von Allergen zu bestimmen, da es keine direkte Korrelation zwischen der Menge an IgE, die in einem Individuum vorhanden ist, und der Mediator-Freisetzung aus Mast- und basophilen Zellen gibt. Daher ist die

NACHGEREICHT ·· ·· ·· ··

Freisetzung von Mediator einer Probe eines Individuums, die Me-diator-freisetzende Zellen aufweist, bevorzugt. Man fand überraschenderweise, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vergleichbare, wenn nicht identische, Ergebnisse erbrachte wie der traditionell verwendete Haut-Empfindlichkeits-Test.

Die von einem Individuum gelieferten Proben werden vorzugsweise mit demselben Allergen, welches für die Immuntherapie verwendet wird, kontaktiert. Es ist jedoch auch möglich, die Immuntherapie mit einem Allergen-Extrakt durchzuführen und die Therapie mit im Wesentichen gereinigten („reinen") Allergenen zu überwachen.

Natürlich kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden, um den Fortschritt einer Allergen- Immuntherapie zu überwachen, indem die Allergen-Empfindichkeit eines Individuums im Laufe der Therapie bestimmt wird. „Allergene" gemäß der vorliegenden Erfindung sind Moleküle oder Mischungen von Molekülen, die die Erzeugung spezifischer Antikörper (IgE) induzieren, welche dafür verantwortlich sind, die Mediator-Freisetzung aus einer Mediator-freisetzenden Zelle auszulösen und folglich allergische Auswirkungen im Individuum zu verursachen. Natürlich können „Allergene" auch die Erzeugung von anderen Antikörpern als IgE (z.B. IgG) induzieren. Die beim Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Allergene sind jedoch vorzugsweise gereinigt, d.h. die Allergene bestehen im Wesentlichen aus einem einzigen Allergen-Molekül, wobei der Grad der Reinheit 90% (Gew./Gew.), vorzugsweise 95% (Gew./Gew.), am meisten bevorzugt 99% (Gew./Gew.), überschreitet. Infolge der Verwendung von im Wesentlichen gereinigten oder isolierten Allergenen ist es möglich, die Menge der bei der Immuntherapie sowie bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Allergene auf reproduzierbare Weise zu bestimmen und zu dosieren. Dagegen enthalten Allergen-Extrakte unterschiedliche Konzentrationen des spezifischen Allergens, je nach den spezifischen Reinigungsbedingungen. Weiters können Allergen-Extrakte auch mehr als ein Allergen enthalten, die im Extrakt in verschiedenen Konzentrationen vorhanden sein können (die Menge des Allergens, an dem ein Interesse besteht, ist nicht genau definierbar) und können weiters Kreuzreaktionen hervorrufen.

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Außerdem können Allergen-Extrakte Verunreinigungen oder Substanzen enthalten, die die Stabilität des Extrakts beeinflussen können. Dieses Problem kann auch durch Verwendung von im Wesentlichen gereinigten oder „reinen" Allergenen vermieden werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Mediatoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Histamin, Tryptase, Prostaglandinen, Leukotrienen, insbesondere Cysteinyl-Leukotrienen, kationischem eosinophilem Protein, Cytokinen, wie Interleukinen (IL), insbesondere IL-2R, CD63, CD203c und Kombinationen davon.

Die allergische Reaktion eines Individuums nach Einwirkung eines Allergens auf das Individuum wird vor allem durch das Freisetzen von Mediatoren durch Mastzellen verursacht. Diese Mediatoren erzeugen die frühen Symptome einer allergischen Reaktion (z.B. Niesen, Juckreiz) und stimulieren die Produktion und Infiltration von zirkulierenden Leukozyten (z.B. Eosinophilen) in lokales Gewebe. Die Mediatoren können aus den Zellen durch Degranulation (Histamin und Proteasen) freigesetzt werden, oder nach Neosynthese dieser Mediatoren (Quraishi S.A. et al., JAOA Supplement 5, 104:S7-S15). Gemäß der vorliegenden Erfindung können auch Aktivierungs-Marker - neben Mediatoren - bestimmt werden (z.B. Yoshimura C. et al., (2002) J. Allergy Clin. Immu-nol. 109:817-23).

Die Probe ist vorzugsweise Blut oder Fraktionen davon, Bindegewebe, Nasen-, Bronchien-, Haut- oder Darm-Biopsie-Materi-al.

Mediator-freisetzende Zellen kann man im Blut und in Fraktionen davon, in Binde- und mehreren anderen Geweben finden. Man stellte überraschenderweise fest, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Hautempfindlichkeit genau wider-spiegelt, wenn man reine Allergene verwendet, insbesondere, wenn Vollblut verwendet wird. Dagegen korrelierten Messungen von spezifischem IgE nicht mit der Hautempfindlichkeit. Daher kann die bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Probe eine Blutprobe (vorzugsweise heparinisiertes Blut) oder Bindegewebe sein.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Zellen aus der Probe isoliert.

Vorteilhaft werden die Mediator-freisetzenden Zellen aus der Probe isoliert. Infolge dieser Isolierung können andere mögli-

NACHGEREICHT - 7 - • · ·· ·· cherweise störenden Substanzen, die in der Probe vorhanden sind, entfernt werden. Insbesondere in Anbetracht der Tatsache, dass Blut beispielsweise freigesetzten Mediator enthalten kann, der während des Bestimmens der Menge des nach Kontakt mit einem Allergen in die Probe freigesetzten Mediators einen hohen Hintergrund liefern kann. Dieses Problem kann durch Messen der Menge an Mediator, der in der Probe vorhanden ist, bevor diese einem Allergen ausgesetzt wird, vermieden werden.

Vorzugsweise sind diese Zellen Mast- und/oder basophile und/oder eosinophile Zellen.

Mast- und basophile Zellen sind jene Zellen, die die meisten Mediatoren freisetzen, insbesondere Histamin, wenn sie einem Allergen ausgesetzt werden. Mastzellen findet man in Bindegeweben der Haut, Lunge und des Magendarm-Trakts, wogegen man basophile Zellen im Blut findet. Diese Zellen können mit bekannten Verfahren isoliert und bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Isolations-Protokolle für Mastzellen findet man in Jamur MC et al. (J. Histochem. Cyto-chem. 1997, 45:1715-1722), Massey WA (J. Immunol. 1991, 147:1621-7), Isolations-Protokolle für basophile Zellen in Valent P. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1989, 86, 5542-5546).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Probe weiters Immunglobuline (lg), insbesondere Immunglobulin G (IgG).

Das Verfahren sollte vorzugsweise mit Proben durchgeführt werden, die IgG enthalten, z.B. Vollblut-Proben. Das Vorhandensein von IgG in solchen Proben ist bevorzugt, da es die Messung der Beeinflussung von blockierendem IgG ermöglicht, während diese Zellen dem Allergen ausgesetzt sind. Im Laufe einer Aller-gen-Immuntherapie werden IgGs, die gegen Allergen gerichtet sind, erzeugt. Diese IgGs binden an das Allergen, wenn ein Individuum mit dem Allergen kontaktiert wird, und verhindern, dass das Allergen an IgE bindet. Da die Erzeugung von Allergen-bindenden IgGs daher bei der Reaktion eines Individuums auf ein Allergen eine direkte Rolle spielt und somit die Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums beeinflusst, sollte die Probe vorzugsweise IgGs enthalten.

Um die Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums oder die klinische Wirksamkeit einer Allergen-Immuntherapie zu evaluieren, werden die Proben vorzugsweise bevor und nachdem das In-

NACHGEREICHT - 8 - ·· ·· ; · · ♦ • · · · ··· ♦·♦ ·· ♦· dividuum einer Iitimuntherapie unterzogen wurde vorgesehen.

Um die Wirksamkeit einer Immuntherapie zu überwachen und zu evaluieren, ist es notwendig, die Empfindlichkeit eines Individuums gegenüber einem Allergen vor und im Laufe der Therapie zu bestimmen. Daher wird die Mediator-Freisetzung in verschiedenen Stadien der Therapie bestimmt. Im Verlauf der Therapie nimmt die Empfindlichkeit gegenüber einem Allergen idealerweise ab. Weiters kann die Bestimmung der Mediator-Freisetzung an einem oder mehreren Zeitpunkten vor der Immuntherapie nützlich für die Dosierung des Allergens im Verlauf der Therapie sein.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Proben vorgesehen, nachdem das Individuum einer Immuntherapie unterzogen wurde.

Natürlich kann eine Immuntherapie auch alleine durch Analysieren von Proben nach der ersten Verabreichung eines Medikaments, das ein Allergen umfasst, evaluiert werden.

Vorzugsweise wird die mindestens eine Probe vorgesehen nach einem Maximum von 1 Stunde, 2 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden, 5 Tagen, 10 Tagen, 4 Wochen, 6 Monaten, 12 Monaten, 24 Monaten und 36 Monaten, nachdem das Individuum einer Immuntherapie unterzogen wurde.

Die zu analysierende Probe kann nach einer bestimmten Zeitdauer nach der ersten Verabreichung des Allergens vorgesehen werden. Auch die Zeitintervalle zwischen den einzelnen Bestimmungen der Mediator-Freisetzung können vorzugsweise innerhalb des Bereichs von 1 Stunde, 2 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 2 Tagen, 5 Tagen, 1 Woche, 2 Wochen, 4 Wochen, 2 Monaten, 4 Monaten, 6 Monaten, 12 Monaten und 24 Monaten variiert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Allergen rekombinant erzeugt.

Eine wirksame Allergen-Immuntherapie und ein genaues Verfahren zum Bestimmen der Freisetzung von Mediator wird vorzugsweise mit einem Allergen, das rekombinant erzeugt wird, durchgeführt. Aufgrund der Gentechnik ist es möglich, ein spezifisches Allergen in großer Menge herzustellen und dieses Allergen zu isolieren. Allergene werden gewöhnlich direkt aus der Quelle, die das Allergen enthält (z.B. Pollen) isoliert, und da das Allergen in einem Extrakt enthalten ist, ist dieses Allergen immer Teil einer Mischung verschiedener allergener und potentiell aller-gener Substanzen. Sogar gereinigte ..natürliche Alleraene" be-

NACHGEREICHT - 9 - ·· ·· • · · · stehen aus mehreren Isoformen, von welchen einige sogar hypo-oder nicht-allergen sein können und daher falsche Testergebnisse liefern (Ferreira F. et al., J. Exp. Med. 1996, 183, 599-609). Dieses Problem kann durch die rekombinante Herstellung von Allergenen vermieden werden. Das für die Verabreichung an ein Individuum verwendete Allergen kann auch bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Dieses Allergen umfasst vorzugsweise mindestens eine Deletion, mindestens eine Substitution oder mindestens eine Insertion.

Auch hypoallergenes Allergen oder Derivate davon können verwendet werden, wenn sich die Frage stellt, ob der Patient während der Behandlung auf diese Derivate sensibilisiert werden kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Allergen durch Umordnen („reshuffling") der Fragmente dieses Allergens mittels Gentechnik modifiziert.

Die Probe wird vorzugsweise mit verschiedenen Konzentrationen des Allergens kontaktiert.

Die Menge des Mediators, der von einer Mediator-frei-setzenden Zelle freigesetzt wird, hängt von der beim Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Konzentration des Allergens ab. Je höher die Konzentration des Allergens ist, die zur Induktion der Freisetzung einer bestimmten Menge an Mediator verwendet wird, desto geringer ist die Empfindlichkeit der von einem Individuum bereitgestellten Zellen, und umgekehrt. Daher erfordert die Bestimmung der Menge des freigesetzten Mediators die Verwendung unterschiedlicher Allergen-Konzentrationen.

Vorzugsweise wird die Konzentration des Allergens ausgewählt im Bereich von Ing/ml bis 100pg/ml, vorzugsweise im Bereich von lpg/ml bis 10pg/ml.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die gesamte Mediator-Menge der Zellen, die in der von einem Individuum vorgesehenen Probe enthalten sind, bestimmt.

Um die Menge des gesamten Mediators, der in den Zellen vorhanden ist, zu bestimmen, werden diese Zellen lysiert, z.B. durch mehrere Auftau- und Gefrier-Zyklen. Die festgestellte Menge an Mediator gibt den Mediator an, der potentiell von diesen Zellen freisetzbar ist, welcher Wert verwendet werden kann, um den Grad der zellulären Sensibilisierung der Zellen gegen ein bestimmtes Allergen zu bestimmen.

NACHGEREICHT

Ein Grad der zellulären Sensibilisierung ist vorzugsweise definiert durch Bestimmen der Konzentration des Allergens, die die Freisetzung von 10%, vorzugsweise 30%, der Gesamtmenge des Mediators der Zellen induziert.

Der Grad der zellulären Sensibilisierung ist ein Indikator des Fortschritts der Immuntherapie, weil er die Konzentration zeigt, bei welcher eine Zelle 10%, vorzugsweise 20%, 25%, 30%, der Gesamtmenge an in der Mediator-freisetzenden Zelle vorhandenem Mediator freisetzt. Im Verlauf einer erfolgreichen Aller-gen-Immuntherapie sollte die Konzentration des verwendeten Allergens ansteigen, weil eine hohe Konzentration von Allergen, die eine bestimmte Menge an Mediator aus diesen Zellen freisetzt, anzeigt, dass die Zellen weniger empfindlich sind als bei einer vorherigen Messung. Auch die Dosis, die eine maximale Freisetzung des Mediators induziert, kann evaluiert werden. Dies macht es möglich, eine Dosis/Antwort-Kurve zu erzeugen und die Verschiebung dieser Kurve im Laufe einer Allergen-Immuntherapie zu messen.

Daher wird die Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums und/oder die klinische Wirksamkeit der Allergen-Immuntherapie vorzugsweise durch Beobachten des Grades der zellulären Sensibilisierung im Verlauf der Immuntherapie evaluiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Mediator in der Probe durch ein immunologisches und/oder ein chromatographisches Verfahren bestimmt, vorzugsweise ist das Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radioimmunoassay (RIA), Enzyme-linked Immunosorbens-Assay (ELISA) , Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, Immunfluoreszenz-Strö-mungs-Zytometrie und Kombinationen davon.

Alle diese Verfahren wurden etabliert, um der klinischen Empfindlichkeit näher zu kommen. Jedoch wurde keine dieser Methoden verwendet, um sich ein reines Allergen hinsichtlich Serologie, basophiler Aktivierung und Haut-Empfindlichkeit anzusehen (z.B. Pierkes M. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1999) 103:326-32; Di Lorenzo G. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1997) 100:832-7).

Bevorzugte, bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Allergene umfassen alle wesentlichen Protein-Allergene, verfügbar z.B. unter www.alleroen.orq/list.htm. Besonders bevorzugte

NACHGEREICHT - 11 - ···· ··

Gruppen von Ällergenen gemäß der vorliegenden Erfindung inkludieren Profiline, insbesondere Phi p 12, Birken-Allergene, insbesondere Bet v 4, Staubmilben-Allergene, insbesondere Der p2, Vorratsmilben-Allergene, insbesondere Lep d 2, Wiesenlieschgras-Allergene, insbesondere Phi p 7, und die in Tabelle 1 aufgezähl-ten Allergene.

Tabelle 1: bevorzugte, bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Allergene (inklusive Referenz-Beispiele)

ALLERGENE

Spezies-Name

NACHGEREICHT

Allergen-Name Biochem.ID oder Mol. -Gew. cDNA oder Literaturstelle, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr Ambrosia artemisiifolia Beifußblättrige Ambrosie („short ragweed”) Amb a 1 Antigen E 8 C 8, 20 Amb a 2 Antigen K 38 C 8, 21 Amb a 3 Ra3 11 C 22 Amb a 5 Ra5 5 C 11, 23 Amb a 6 Ra 6 10 C 24, 25 Amb a 7 Ra7 12 P 26 Ambrosia trifida Dreilappige Ambrosie („ giant ragweed") Amb t 5 Ra5G 4,4 c 9, 10, 27 Artemisia vulgaris Beifuß („mugwort") Art v 1 27-29 c 28 Art v 2 35 P 28A Art v 3 Lipid-Transfer-Protein 12 P 53 Art v 4 Profilin 14 c 29 Helianthus annuus Sonnenblume Hel a 1 34 29A Hel a 2 Profilin 15,7 c Y15210 Mercurialis annua Mer a 1 Profilin 14-15 c Y13271 Caryophyllales Chenopodium album Heißer Gänsefuß („larnb' s-quarters”, „pigweed"), Che a 1 17 c AY049012, 29B - 12 ·· ♦ · ·· • · • ···· ·· ·· • · • · • · • · • · • · • t ·· · · | • · • · • · • · • · T • · · ··· ·· ·· Z 9 · • #· • • · • ··

Weißer Gänsefuß („white goosefoot")

Che a 2 Profilin

Che a 3 Polcalcin

Salsola kali

Kali-Salzkraut („Russian-thistle”)

Sal k 1

Rosales

Humulus japonicus

Japanischer Hopfen („Japanese hop")

Hum j 4w

Parietaria judaica

Par j 1 Lipid-Transfer-Protein 1 Par j 2 Lipid-Transfer-Protein 2 Par j 3 Profilin

Parietaria officinalis

Par ο 1 Lipid-Transfer-Protein B. Gräser Poales

Cynodon dactylon Bermudagras („Bermuda grass”)

Cyn d 1

Cyn d 7

Cyn d 12 Profilin

Cyn d 15

Cyn d 22w Enolase

Cyn d 23 Cyn d 14

Cyn d 24 Pathogenese-verwandt.P. Dactylis glomerata Knäuelgras („orchard grass")

Dac g 1 AgDgl

Dac g 2

Dac g 3

Dac g 5

Festuca pratensis Wiesenschwingel („meadow fescue")

Fes p 4w

Holcus lanatus

Wolliges Honiggras („velvet grass")

Hol 1 1

14 C AY082337 10 C AY082338 43 P 29C

C AY335187 15 C vgl.Liste d.Isoallergene C vgl.Liste d.Isoallergene C vgl.Liste d.Isoallergene 15 29D 32 C 30, S83343 C 31, X91256 14 C 31a, Y08390 9 c AF517686 Daten anhängig 9 C AF517685 21 P anhängig 32 P 32 11 C 33, S45354 C 33A, 025343 31 P 34 60 C Z27084

NACHGEREICHT - 13 - ·· • · • · • ··♦· ·· • · • ♦ • · • • · • ♦ • · • · • · • · • · • · # • ··· ·· • · • “ · ·· • ·· • Λ Λ

Lolium perenne

Ausdauerndes Weidelgras („rye grass")

Lol P 1 Gruppe I 27 C 35, 36 Lol P 2 Gruppe II 11 P 37, 37A, X73363 Lol P 3 Gruppe III 11 P 38 Lol P 5 Lol p IX, Lol p Ib 31/35 C 34, 39 Lol p 11 hom: Trypsin-Inhibitor 16 39A Phalaris aquatica Wasserglanzgras („canary grass") Pha a 1 c 40, S80654 Phleum pratense Wiesenlieschgras (,, ,timothy") Phi P 1 27 c X78813 Phi P 2 c X75925, 41 Phl P 4 P 41A Phi P 5 Ag25 32 c 42 Phl P 6 c Z27082, 43 Phl P 11 Trypsin-Inhibitor hom. 20 c AF521563, 43A Phl P 12 Profilin c X77583, 44 Phl P 13 Polygalacturonase 55-60 c AJ238848 Poa pratensis Wiesen-Rispengras i („Kentucky blue grass”) Poa P i Gruppe I 33 P 46 Poa P 5 31/34 c 34, 47

Sorghum halepense Aleppohirse („Johnson grass")

Sor hl C 48 C. Bäume Arecales

Phoenix dactylifera Dattelpalme 14,3 C Asturias p.c. 17 C S50892 17 C vgl.Liste d.Isoallergene 15 C M65179

Pho d 2 Profilin

Fagales

Ainus glutinosa Erle

Aln g 1 Betula verrucosa Birke Bet V 1 Bet V 2 Profilin

NACHGEREICHT • 0 14 " 0 • 0 • · t • 0000 • · ♦··· 00 _ · · 0# 0 0 ♦ 0 00 •00 0 • 0 0 0 000 0 • 0

Bet v 3 C X79267 Bet v 4 8 c X87153, S54819 Bet v 6 h: Isoflavon-Reduktase 33,5 c vgl.Liste d.Isoallergene Bet v 7 Cyclophilin 18 P P81531 Carpinus betulus Hainbuche („hornbeam” Car b ) 1 17 c vgl.Liste d.Isoallergene Castanea sativa Ess-Kastanie („chestnut”) Cas s 1 22 P 52 Cas s Cas s 5 Chitinase 8 Lipid-Transfer-Protein 9,7 P 53 Corylus avellana Hasel Cor a 1 17 c vgl.Liste d.Isoallergene Cor a 2 Profilin 14 c Cor a 8 Lipid-Transfer-Protein 9 c Cor a 9 IIS Globulin-artiges Protein 40/? c Beyer p.c. Cor a 10 Luminal-bindend. Prot. 70 c AJ295617 Cor a 11 7S Vicilin-artiges Prot. 48 c AF441864 Quercus alba Weißeiche („White oak") Que a 1 17 P 54 Lamiales Oleaceae Fraxinus excelsior Esche Fra e 1 20 P 58A, AF526295 Ligustrum vulgare Liguster („privet") Lig v 1 20 P 58A Olea europea Olive Oie e 1 16 c 59, 60 Oie e 2 Profilin 15-18 c 60A Oie e 3 9,2 60B Oie e 4 32 P P80741 Oie e 5 Superoxid-dismutase 16 P P80740 Oie e 6 10 c 60C, U86342 Oie e 7 7 P 60D, P81430 Oie e 8 Ca2+-bind. Protein 21 c 60E, AF078679 Oie e 9 beta-1,3-Glucanase 46 c AF249675 Oie e 10 Glycosyl-Hydrolase hom. 11 c 60F, AY082335

NACHGEREICHT ·· Μ · ···· ·· «· ····· ····· • · · ··· · · ·· « • · · ····· · ··· ··· • · · ♦ ··· · · - 15 -

Syringa vulgaris

Flieder Syr v 1 20 P 58A

Plantaginaceae Plantago lanceolata Spitzwegerich („English plantain")

Pia 11 18 P P842242

Pinales

Cryptomeria japonica

sugi Cry j 1 41-45 C 55, 56 Cry j 2 C 57, D29772 Cupressus arisonica Zypresse Cup a 1 43 C A1243570 Cupressus sempervirens Gemeine Zypresse („common cypress") Cup s 1 43 C vgl.Liste d.Isoallergene Cup s 3w 34 C Ref. anhängig Juniperus ashei Berg-Zeder („mountain cedar") Jun a 1 43 P P81294 Jun a 2 c 57A, AJ404653 Jun a 3 30 P 57B, P81295 Juniperus oxycedrus Stechwacholder („prickly juniper") Jun o 4 hom: Calmodulin 29 c 57C, AF031471 Juniperus sabinoides Bergzeder („mountain cedar") Jun s 1 50 P 58 Juniperus virginiana Virginische Rotzeder („eastern red cedar") Jun v 1 43 P P81825, 58B

Platanaceae Platanus acerifolia

Gewöhnliche Platane („London plane tree")

Pia a 1 18 P P82817 Pia a 2 43 P P82967 Pia a 3 Lipid-Transfer-Protein 10 P Iris p.c D. Milben Acarus siro Arthropode Milbe Aca s 13 Fettsäure-bind. Prot. 14* c AJ006774 1 NACHGEREICHT j ·· · ···· ·· - 16 -

Blomia tropicalis Milbe Bio t 1 Cystein-Protease 39 C AF277840 Bio t 3 Trypsin 24* C Cheong p.c. Bio t 4 alpha-Amylase 56 C Cheong p.c. Bio t 5 c U59102 Bio t 6 Chymotrypsin 25 c Cheong p.c. Bio t 10 Tropomyosin 33 c 61 Bio tll Paramyosin 110 c AF525465, 61A Bio t 12 Btlla c U27479 Bio t 13 Bt6, Fettsäure-bind. Prot. c U58106 Bio t 19 anti-mikrobiell.Pep. hom. 7,2 c Cheong p.c. Dermatophagoides farinae Amerikanische Hausstaubmilbe („American house dust Der f 1 Cystein-Protease mite") 25 c 69 Der f 2 14 c 70, 70A, vgl.Liste t Der f 3 Trypsin 30 c Isoallerge: 63 Der f 7 24-31 c SW:Q26456, 71 Der f 10 Tropomyosin c 72 Der f 11 Paramyosin 98 c 72A Der f 14 mag3, Apolipophorin c D17686 Der f 15 98k Chitinase 98 c AF178772 Der f 16 Gelsolin/Villin 53 c 71A Der f 17 Ca-bind. EF-Protein 53 c 71A Der f 18w 60k Chitinase 60 c Weber p.c. Dermatophagoides microceras Hausstaubmilbe („house dust mite") Der m 1 Cystein-Protease 25 P 68 Dermatophagoides pteronyssinus Europäische Hausstaubmilbe („European house dust mite") Der p 1-Antigen PI, Cystein-Protease 25 c 62, vgl.Liste d. Der p 2 14 c Isoallergene 62A-C, vgl.Liste d. Isoallergene

Der P 3 Trypsin 28/30 C 63 Der P 4 Amylase 60 P 64 Der P 5 14 C 65 Der P 6 Chymotrypsin 25 P 66 Der P 7 22/28 C 67 - 17 - - 17 - 67A 67B Y14906 Epton p.c. vgl.Liste d.Isoallergene AF149827 72B,vgl.Isoallergenliste

Der p 8 Glutathion-Transferase C

Der p 9 kollagenolytische Serin-pro. P

Der p 10 Tropomyosin 36 C

Der p 14 Apolipophorin-artiges Prot. C

Euroglyphus maynei

Milbe Eur m 2 C

Eur m 14 Apolipophorin 177 C

Glycyphagus domesticus Vorratsmilbe („storage mite")

Gly d 2 C

Lepidoglyphus destructor Vorratsmilbe („storage mite")

Lep d 2 Lep < d 1 15 C 73, 74, 74A, vgl. Isoallergenliste Lep d 5 c 75, AJ250278 Lep d 7 c 75, AJ271058 Lep d 10 Tropomyosin c 75A, AJ250096 Lep d 13 c 75, AJ250279 Tyrophagus putrescentiae Vorratsmilbe („storage mite ") Tyr p 2 c 75B, Y12690 E. Tiere Bos domesticus Hausrind („domestic cattle" ) Bos d 2 Ag3, Lipocalin 20 c 76, vgl.Isoallergenlist (vgl. auch Nahrungsmittel) Bos d 3 Ca-bind. S100 hom. 11 c L39834 Bos d 4 alpha-Lactalbumin 14,2 c M18780 Bos d 5 beta-Lactoglobulin 18,3 c X14712 Bos d 6 Serumalbumin 67 c M73993 Bos d 7 Immunglobulin 160 77 Bos d 8 Caseine 20-30 77 Canis familiaris (Canis domesticus) Can f 1 25 c 78, 79 Hund Can f 2 27 c 78, 79 Can f 3 Albumin c S72946 Can f 4 18 P A59491

NACHGEREICHT ···· ··· · φ - 18 -

Equus caballus

Hauspferd („domestic horse")

Equ c 1 Lipocalin 25 C U70823 Equ c 2 Lipocalin 18,5 P 79A, 79B Equ c 3 Ag3 - Albumin 67 C 79C, X74045 Equ c 4 17 P 79D Equ c 5 AgX 17 P Goubran Botros p.c

Felis domesticus Katze (Speichel)

Fel d 1 cat-1 38 C 15 Fel d 2 Albumin C 79E, X84842 Fel d 3 Cystatin 11 C 79F, AF238996 Fel d 4 Lipocalin 22 C AY497902 Fel d 5w Immunglobulin A 400 Adedoyin p.c. Fel d 6w Immunglobulin M 800- 1000 Adedoyin p.c. Fel d 7w Immunglobulin G 150 Adedoyin p.c. Cavia porcellus Meerschweinchen Cav P 1 Lipocalin-Homolog 20 P SW:P83507, 80 Cav P 2 17 P SW:P83508 Mus musculus Maus (Harn) Mus m 1 MUP 19 C 81, 81A Rattus norvegius Ratte (Harn) Rat n 1 17 C 82, 83 F. Fungi (Schimmelpilze) 1. Ascomycota 1.1 Dothideales Alternaria alternata

NACHGEREICHT

Alt a 1 28 C U82633 Alt a 2 25 C 83A, U62442 Alt a 3 Hitzeschock-Prot. 70 C 087807, Ü87808 Alt a 4 prot. Disulfid-Isomerase 57 C X84217 Alt a 6 saures ribosomales Prot. P2 11 C X78222, 087806 Alt a 7 YCP4 Protein 22 C X78225 Alt a 10 Aldehyd-Dehydrogenase 53 C X78227, P42041 Alt a 11 Enolase 45 C 082437 Alt a 12 saures ribosomales Prot. Pl 11 C X84216 • · • · • · • · • · • · • · • · • · • · • • • · ··· • • · · · M • · · • · · • · · · · • · · ·· • · • · • · · • - 19 - Cladosporium herbarum Cla h 1 13 83B, 83C Cla h 2 23 83B, 83C Cla h 3 Aldehyd-Dehydrogenase 53 c X78228 Cla h 4 saures ribosomales Prot. P2 11 c X78223 Cla h 5 YCP4 Protein 22 c X78224 Cla h 6 Enolase 46 c X78226 Cla h 12 saures ribosomales Prot. PI 11 c X85180 1.2 Eurotiales Aspergillus flavus Asp fl 13 alkalische Serin-Protease 34 84 Aspergillus fumigatus Asp f 1 18 c M83781, S39330 Asp f 2 37 c U56938 Asp f 3 peroxisomales Protein 19 c 020722 Asp f 4 30 c AJ001732 Asp f 5 Metalloprotease 40 c Z30424 Asp f 6 Mn-Superoxid-dismut. 26, 5 c 053561 Asp f 7 12 c AJ223315 Asp f 8 ribosomales Prot. P2 11 c AJ224333 Asp f 9 34 c AJ223327 Asp f 10 Asparagin-Protease 34 c X85092 Asp f 11 Peptidyl-Prolyl-Isomerase 24 84A Asp f 12 Hitzeschock-Prot. P90 90 c 85 Asp f 13 alkalische Serin-Protease 34 84B Asp f 15 16 c AJ002026 Asp f 16 43 c g3643813 Asp f 17 c AJ224865 Asp f 18 vakuoläre Serin-Protease 34 84C Asp f 22w Enolase 46 c AF284645 Asp f 23 L3 ribosomales Protein 44 c 85A, AF464911 Aspergillus niger Asp n 14 beta-Xylosidase 105 c AF108944 Asp n 18 vakuoläre Serin-Protease 34 c 84B Asp n 25 3-Phytase B 66- 100 c 85B, P34754 Asp n ? 85 c Z84377 Aspergillus oryzae Asp o 13 alkalische Serin-Protease 34 c X17561 Asp o 21 TAKA-Amylase A 53 c D00434, M33218

NACHGEREICHT

» ·· · ♦··· ·· I • · · · · · · · • · · · ♦ ♦ · · ·

• · ♦ ··♦· ♦ ··· I • · · · · ♦ · - 20 -

Penicillium brevicompactum

Pen b 13 alkalische Serin-Protease 33 86Ά Penicillium chrysogenum (vormals P. notatum) Pen ch 13 alkalische Serin-Protease 34 87 Pen ch 18 vakuoläre Serin-Protease 32 87 Pen ch 20 N-Acetyl-Glucosaminidase 68 87A Penicillium citrinum Pen c 3 peroxisomal. Mem.-Prot. 18 86B Pen c 13 alkalische Serin-Protease 33 86A Pen c 19 Hitzeschock-Prot. P70 70 C U64207 Pen c 22w Enolase 46 C AF254643 Pen c 24 Elongationsfaktor 1 beta C AY363911 Penicillium oxalicum Pen o 18 vakuoläre Serin-Protease 34 87B 1.3 Hypocreales Fusarium culmorum

Fus c 1 ribosomales Prot. P2 11* C AY077706 Fus c 2 Thioredoxin-artiges Prot. 13* C AY077707 1.4 Onygenales Trichophyton rubrum Tri r 2 C 88 Tri r 4 Serin-Protease C 88 Trichophyton tonsurans Tri t 1 30 P 88A Tri t 4 Serin-Protease 83 C 88 1.5 Saccharomycetales Candida albicans 40 C 89 29 C AY136739 20 C J04984, J04985

Cand a 1

Cand a 3 peroxisomales Protein Candida boidinii

Cand b 2 2. Basidiomycotina 2.1 Hymenomycetes Psilocybe cubensis Psi c 1 Psi c 2 Coprinus comatus

Cyclophilin 16 89Ά

NACHGEREICHT

Schopftintling („shaggy cap") Cop c 1 Leucin-Zipper-Protein 11 C AJ132235 Cop c 2 AJ242791 Cop c 3 AJ242792 Cop c 5 AJ242793 Cop c 7 AJ242794

2.2 ürediniomycetes Rhodotorula mucilaginosa Rho m 1 Enolase 47 C 89B Rho m 2 vakuoläre Serin-Protease 31 C AY547285 2.3 Ustilaginomycetes Malassezia furfur Mala f 2 MF1, peroxisomales 21 C AB011804, 90 Membran-Protein Mala f 3 MF2, peroxisomales 20 C AB011805, 90 Membran-Protein Mala f 4 Mitochondrien-Malat-Dehydrogenase 35 C AF084828, 90A Malassezia sympodialis Mala s 1 C X96486, 91 Mala s 5 18* C AJ011955 Mala s 6 17* C AJ011956 Mala s 7 C AJ011957, 91A Mala s 8 19* C AJ011958, 91A Mala s 9 37* C AJ011959, 91A Mala s 10 Hitzeschock-Prot. 70 86 C AJ428052 Mala s 11 Mn-Superoxid-Dismut. 23 C AJ548421 3. Deuteromycotina 3.1 Tuberculariales Epicoccum purpurascens (vormals E. nigrum) Epi p 1 Serin-Protease 30 P SW:P83340, , 91B G. Insekten Aedes aegyptii Stechmücke Aed a 1 Apyrase 68 C L12389 Aed a 2 37 C M33157 Apis mellifera

NACHGEREICHT ·· · ···« ·· • · • · - 22 -

Honigbiene Äpi m 1 Phospholipase A2 16 C 92 Api m 2 Hyaluronidase 44 C 93 Api m 4 Melittin 3 C 94 Api m 6 7-8 P Kettner p.c Api m 7 CUB Serin-Protease 39 C ÄY127579 Bombus pennsylvanicus Hummel („bumble bee") Bom p 1 Phospholipase 16 P 95 Bom p 4 Protease P 95 Blattelia germanica Deutsche Schabe Bla g 1 Bd90k C Bla g 2 Asparagin-Protease 36 C 96 Bla g 4 Calycin 21 c 97 Bla g 5 Glutathion-Transferase 22 c 98 Bla g 6 Troponin C 27 c 98 Periplaneta americana Amerikanische Schabe Per a 1 Cr-PXI c Per a 3 Cr-PI 72-78 c 98A Per a 7 Tropomyosin 37 c Y14854 Chironomus kiiensis Mücke Chi k 10 Tropomyosin 32,5* c AJ012184 Chironomus thummi thummi Mücke Chi t 1-9 Hämoglobin 16 c 99 Chi t 1.01 Komponente III 16 c P02229 Chi t 1.02 Komponente IV 16 c P02230 Chi t 2.0101 Komponente I 16 c P02221 Chi t 2.0102 Komponente IA 16 c P02221 Chi t 3 Komponente II-beta 16 c P02222 Chi t 4 Komponente IIIA 16 c P02231 Chi t 5 Komponente VI 16 c P02224 Chi t 6.01 Komponente VIIA 16 c P02226 Chi t 6.02 Komponente IX 16 c P02223 Chi t 7 Komponente VIIB 16 c P02225 Chi t 8 Komponente VIII 16 c P02227 Chi t 9 Komponente X 16 c P02228 ............ : fnachgereicht ·· ·· · Μ·· ·· ·« • · · · · ····· * · · ··· ·· ·· · - 23 -

Ctenocephalides felis felis Katzenfloh

Cte f 1

Cte f 2 Mlb 27 C AF231352 Cte f 3 25 C Thaumetopoea pityocampa Pinienprozessionsspinner (, Tha p 1 ,pine processionary moth") 15 P PIR:A59396 Lepisma saccharina Silberfischchen Lep s 1 Tropomyosin 36 C AJ309202 Dolichovespula maculata Langkopfwespe („white face Dol m 1 hörnet") Phospholipase Al 35 C 100 Dol m 2 Hyaluronidase 44 c 101 Dol m 5 Antigen 5 23 c 102, 103 Dolichovespula arenaria Gelbwespe („yellow hörnet") Dol a 5 1 Antigen 5 23 c 104 Polistes annularies Wespe („wasp") Pol a 1 Phospholipase Al 35 P 105 Pol a 2 Hyaluronidase 44 P 105 Pol a 5 Antigen 5 23 c 104

99A

Polistes dominulus (Mittelmeer-Papierwespe („Mediterranean paper wasp")

Pol d 1 Hoffman P Pol d 4 Serin-Protease 32-34 C Hoffman P Pol d 5 P81656 Polistes exclamans Wespe („wasp") Pol e 1 Phospholipase Al 34 P 107 Pol e 5 Antigen 5 23 C 104 Polistes fuscatus Wespe („wasp") Pol f 5 Antigen 5 23 C 106 Polistes gallicus Wespe („wasp") Pol g 5 Antigen 5 24 C P83377 Polistes metricus Wespe („wasp") Pol m 5 Antigen 5 23 C 106

Vespa crabo

NACHGEREICHT * · · · ···· · ··· ··· ···· ··· · ·

Europäische Hornisse („European hörnet") Vesp c 1 Phospholipase 24 - 34 P 107 Vesp c 5 Antigen 5 23 C 106 Vespa mandarina Asiatische Riesenhornisse („giant Asian hörnet") Vesp m 1 Vesp m 5 Vespula flavopilosa Wespe („yellowjacket") Ves f 5 Antigen 5 1 23 c Hoffman p.c. P81657 106 Vespula germanica Wespe („yellowjacket") Ves g 5 Antigen 5 23 c 106 Vespula maculifrons Wespe („yellowjacket") Ves m 1 Phospholipase Al 33,5 c 108 Ves m 2 Hyaluronidase 44 P 109 Ves m 5 Antigen 5 23 c 104 Vespula pennsylvanica Wespe („yellowjacket") Ves p 5 Antigen 5 23 c 106 Vespula squamosa Wespe („yellowjacket") Ves s 5 Antigen 5 23 c 106 Vespula vidua Wespe („wasp") Ves vi 5 Antigen 5 23 c 106 Vespula vulgaris Wespe („yellowjacket") Ves v 1 Phospholipase Al 35 c 105A Ves v 2 Hyaluronidase 44 P 105A Ves v 5 Antigen 5 23 c 104 Myrmecia pilosula Australische „jumper ant" Myr p 1 c X70256 Myr p 2 c S81785 Solenopsis geminata tropische Feuerameise („tropical fire ant") Sol g 2 Sol g 4 Solenopsis invicta Hoffman p.c Hoffman p.c

NACHGEREICHT I

Feuerameise („fire ant" ) Sol i 2 13 C 110, 111 Sol i 3 24 C 110 Sol i 4 Solenopsis saevissima Brasilianische Feuerameise („Brazilian fire ant") Sol s 2 Triatoma protracta Raubwanze („California kissing bug”) 13 c 110 Hoffman p.c. Tria p 1 H. Nahrungsmittel Gadus callarias Dorsch („cod") Procalin 20 c AF179004, 111A Gad c 1 Salmo salar Atlantischer Lachs Allergen M 12 c 112, 113 Sal s 1 Parvalbumin Bos domesticus Hausrind („domestic cattle") 12 c X97824 Bos d 4 alpha-Lactalbumin 14,2 c M18780 (Milch) Bos d 5 vgl. auch Tiere beta-Lactoglobulin 18,3 c X14712 Bos d 6 Se rum-Albumin 67 c M73993 Bos d 7 Immunglobulin 160 77 Bos d 8 Gallus domesticus Huhn Caseine 20-30 77 Gal d 1 Ovomucoid 28 c 114, 115 Gal d 2 Ovalbumin 44 c 114, 115 Gal d 3 Ag22, Conalbumin 78 c 114, 115 Gal d 4 Lysozym 14 c 114, 115 Gal d 5 Metapenaeus ensis Serum-Albumin 69 c X60688 Garnele Met e 1 Penaeus aztecus Tropomyosin c 008008 Garnele Pen a 1 Penaeus indicus Tropomyosin 36 P 116 Garnele Pen i 1 Tropomyosin 34 c 116A Penaeus monodon nachgereicht] - 26 - - 26 - • · · • · · · · ·

Black Tiger-Garnele

Pen m 1 Tropomyosin 38 C Pen m 2 Arginin-Kinase 40 C AF479772, 117 Todarodes pacificus Kalmar („squid") Tod p 1 Tropomyosin 38 P 117A Helix aspersa Braune Gartenschnecke („brown garden snail") Hel as 1 Tropomyosin 36 C Y14855, 117B Haliotis midae Seeohr („abalone") Hai m 1 49 117C Rana esculenta essbarer Frosch Ran e 1 Parvalbumin-alpha 11,9* C AJ315959 Ran e 2 Parvalbumin-beta 11,7* C AJ414730 Brassica juncea Sereptasenf („oriental mustard") Bra j 1 2S Albumin 14 C 118 Brassica napus Rapssamen („rapeseed") Bra η 1 2S Albumin 15 P 118A, P80208 Brassica rapa Rübe („turnip") Bra r 2 hom: Prohevein 25 P81729 Hordeum vulgare Gerste Hör v 15 BMAI-1 15 C 119 Hör v 16 alpha-Amylase Hör v 17 beta-Amylase Hör v 21 gamma-3 Hordein 34 C 119A, SW:P80198 Secale cereale Roggen Sec c 20 Secalin Triticum aestivum Weizen Tri a 18 Agglutinin Tri a 19 omega-5 Gliadin 65 P vgl. Isoallergenliste PIR:A59156 Zea mays Mais („maize, corn") Zea m 14 Lipid-Transfer-Prot. 9 P P19656 Oryza sativa Reis Ory s 1 c 119B, 031771

INACHGEREICHT • · Μ · ···· ·· ·· ····· ····« • · · ··· ·· ·· · • · · · ···· · ··· ··· ···· · · · · · - 27 - hom: Bet v 1 Profilin hom: Bet v 1

Apium graveolens Sellerie Api g 1

Api g 4 Api g 5

Daucus carota Karotte Dau c 1

Dau c 4 Profilin Corylus avellana Haselnuss 16* C Z48967 AF129423 55/58 P P81943 16 C 117D, vgl. Isoallergen liste C AF456482

Cor a 1, .04 hom: Bet v 1 Cor a 2 Profilin Cor a 8 Lipid-Transfer-Protein Malus domestica Apfel Mal d 1 hom: Bet v 1 Mal d 2 hom: Thaumatin Mal d 3 Lipid-Transfer-Protein Mal d 4 Profilin Pyrus communis Birne Pyr c 1 hom: Bet v 1 Pyr c 4 Profilin Pyr c 5 hom: Isoflavon-Reduktase 17 C vgl.Liste d.Isoallergene 14 c AF327622 9 c AF329829 c vgl.Liste d.Isoallergene c AJ243427 9 c Pastorello p.c. 14,4* c vgl.Liste d.Isoallergene 18 c AF05730 14 c AF129424 33,5 c AF071477 32 c Z78202

Persea americana

Avocado Pers a 1 Endochitinase

Prunus armeniaca

Aprikose

Pru ar 1 hom: Bet v 1

Pru ar 3 Lipid-Transfer-Protein

Prunus avium Süßkirsche C U93165

9 P

Pru av 1 hom: Bet v 1 c 066076 Pru av 2 hom: Thaumatin C 032440 Pru av 3 Lipid-Transfer-Protein 10 C AF221501 Pru av 4 Profilin 15 C AF129425 Prunus domestica Europäische Pflaume („European plum”) Pru d 3 Lipid-Transfer-Protein 9 P 119C

Prunus persica

NACHGEREICHT ·· · · · t · · · Μ ·· ····· ····· • ·· ··· · · ·· ι • · · · ···· · ··· ··« • · · · ··· · · - 28 -

Pfirsich Pru p 3 Lipid-Transfer-Protein

Pru p 4 Profilin Asparagus officinalis Spargel

Aspa ο 1 Lipid-Transfer-Protein

Crocus sativus

Safran („saffron crocus") Cro s 1

Lactuca sativa

Salat

Lac s 1 Lipid-Transfer-Protein

Vitis vinifera

Traube Vit v 1 Lipid-Transfer-Protein

Musa x paradisiaca

Banane Mus xp 1 Profilin

Ananas comosus

Ananas („pineapple")

Ana c 1 Profilin Ana c 2 Bromelain

Citrus limon

Zitrone Cit 1 3 Lipid-Transfer-Protein

Citrus sinensis Orange („sweet orange")

Cit s 1 Germin-artiges Protein Cit s 2 Profilin Cit s 3 Lipid-Transfer-Protein Litchi chinensis

Litchi Lit c 1 Profilin

Sinapis alba gelber Senf („yellow mustard")

Sin a 1 2S Albumin Glycine max Sojabohne Gly m 1 HPS Gly m 2 Gly m 3 Profilin Gly m 4 (SAM22) PR-10 Vigna radiata Mungbohne

Vig r 1 PR-10 Protein

Arachis hypogaea 10 P P81402 14 c vgl. Isoallergenliste 9 21 9 P 119D Varasteh A-R p.c. Vieths p.c. 9 P P80274 15 c AF377948 15 c AF377949 22,8* c 119E-G, D14059 9 P Torrejon p.c. 23 P Torrejon p.c. 14 P Torrejon p.c. 9 P Torrejon p.c. 15 c AY049013 14 c 120 7 P 12 0A 8 P A57106 14 c vgl.Liste d.Isoallergene 17 c X60043, 120B 15 c AY792956

NACHGEREICHT ·· M • · · · • • ···· ·· ·· • · · · · • • · · • · • · · · · • • · · ···· • ··· ··· • • · · • • · · · Erdnuss Ara h 1 - 29 Vicilin 63,5 C L34402 Ara h 2 Conglutin 17 c L77197 Ara h 3 Glycinin 60 c AF093541 Ara h 4 Glycinin 37 c AF086821 Ara h 5 Profilin 15 c AF059616 Ara h 6 hom: Conglutin 15 c AF092846 Ara h 7 hom: Conglutin 15 c AF091737 Ara h 8 PR-10 Protein 17 c AY328088 Lens culinaris Linse Len c 1 Vicilin 47 c vgl.Liste d.Isoallergene Len c 2 Samen biotinyliertes Prot. 66 P 120C Pisum savitum Erbse Pis s 1 Vicilin 44 c vgl.Liste d.Isoallergene Pis s 2 Convicilin 63 c anhängig Actinidia chinensis Kiwi Act c 1 Cystein-Protease 30 P P00785 Act c 2 Thaumatin-artiges Protein 24 P SW:P81370, 121 Capsicum annuum Paprika („bell pepper") Cap a lw Osmotin-artiges Protein 23 c AJ297410 Cap a 2 Profilin 14 c AJ417552 Lycopersicon esculentum Tomate Lyc e 1 Profilin 14 c AJ417553 Lyc e 2 b-Fructofuranosidase 50 c vgl. Isoallergenliste Lyc e 3 Lipid-Transfer-Prot. 6 c 081996 Solanum tuberosum Kartoffel Sola t 1 Patatin 43 P P15476 Sola t 2 Cathepsin D-Inhibitor 21 P P16348 Sola t 3 Cystein-Protease-Inhibitor 21 P P20347 Sola t 4 Asparagin-Protease-lnhibitor 16+4 P P30941 Bertholletia excelsa Paranuss („Brazil nut") Ber e 1 2S Albumin 9 c P04403, M17146 Ber e 2 IIS Globulin-Santen-Speicherprotein 29 c AY221641 Juglans nigra Schwarznuss („black walnut") Jug η 1 2S Albumin 19* c AY102930 Jug n 2 Vicilin-artiges Prot. 56* c AY102931

\ NACHGEREICHT > ♦♦ · • · · · • · ♦ · · • ♦ · ·♦·< • · · · ···· ·· ·· • · · · - 30 -

Juglans regia

Echte Walnuss („English walnut")

Jug r 1 2S Albumin C U66866 Jug r 2 Vicilin 44 c AF066055 Jug r 3 Lipid-Transfer-Protein 9 P Pastorello Anacardium occidentale Cashew-Nuss Ana ο 1 Vicilin-artiges Protein 50 c vgl. Isoallergen-Liste Ana o 2 Legumin-artiges Protein 55 c AF453947 Ana o 3 2S Albumin 14 c AY081853 Ricinus communis Rhizinussamen („Castor Ric c 1 bean") 2S Albumin c P01089 Sesamum indicum Sesam Ses i 1 2S Albumin 9 c 121A, AF240005 Ses i 2 2S Albumin 7 c AF091841 Ses i 3 7S Vicilin-artiges Globulin 45 c AF240006 Ses i 4 Oleosin 17 c AAG23840 Ses i 5 Oleosin 15 c AAD42942 Cucumis melo Kantaloupmelone („muskmelon") Cuc m 1 Serin-Protease 66 c D32206 Cuc m 2 Profilin 14 c AY271295 Cuc m 3 Pathogenese-verw. P. PR-1 16* P P83834 I. Andere Anisakis Simplex Nematode

Ani s 1 24 P 121B, A59069 Ani s 2 Paramyosin 97 C AF173004 Ani s 3 Tropomyosin 41 C 121C, Y19221 Ani s 4 9 P P83885 Argas reflexus Taubenzecke („ pigeon tick Arg r 1 17 C AJ697694 Ascaris suum Wurm Asc s 1 10 P 122 Carica papaya Papaya Car p 3w Papain 23,4* C 122A, M15203 Dendronephthya nipponica

| NACHGEREICHT • · ·· • ···· ·» «· • • 1 · • • · · · · • • · · • · • · · · · • • · · ···· • ··· ··· • • · · • • · · · Weichkoralle („soft coral' Den η 1 - 31 ') 53 P 122B Hevea brasiliensis Gummi (Latex) Hev b 1 Elongations faktor 58 P 123, 124 Hev b 2 1,3-Glucanase 34/36 c 125 Hev b 3 24 P 126, 127 Hev b 4 Komponente des 100- P 128 Microhelix-Komplexes Hev b 5 115 16 c U42640 Hev b 6.01 Hevein-Präkursor 20 c M36986, p02877 Hev b 6.02 Hevein 5 c M36986, p02877 Hev b 6.03 C-terminales Fragment 14 c M36986, p02877 Hev b 7.01 hom: Patatin aus B-Serum 42 c U80598 Hev b 7.02 hom: Patatin aus C-Serum 44 c AJ223038 Hev b 8 Profilin 14 c vgl.Liste d.Isoallergene Hev b 9 Enolase 51 c AJ132580 Hev b 10 Mn Superoxid-dismut. 26 c vgl.Liste d.Isoallergene Hev b 11 Klasse 1-Chitinase c vgl.Liste d.Isoallergene Hev b 12 Lipid-Trans fer-Protein 9,3 c AY057860 Hev b 13 Esterase 42 P P83269 Homo sapiens Human-Autoallergene Hom s 1 73* c Y14314 Hom s 2 10,3* c X80909 Hom s 3 20,1* c X89985 Hom s 4 36* c Y17711 Hom s 5 42,6* c P02538 Triplochiton scleroxylon Abachi („obeche") Trip s 1 Klasse 1-Chitinase 38,5 P Kespohl p.c.

Literaturstellen: 1 Marsh, D.G., und L.R. Freidhoff. 1992. ALBE, an allergen da-tabase. IUIS, Baltimore, MD, Edition 1.0. 2 Marsh, D. G., L. Goodfriend, T. P. King, H. Lowenstein, und T.

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| NACHGEREICHT ·· ♦· · ···· ·♦ #· ····· · t · · · • ·· · · · · ♦ ♦ · · • · · · ···· · ··· ···· ··· · · - 35 - 27 Goodfriend L, Choudhury AM, Klapper DG, Coulter KM, Dorval G, DelCarpio J, Osterland CK. Ra5G, a homologue of Ra5 in giant ragweed pollen: isolation, HLA-DR-associated activity and amino acid sequence. Mol Immunol 22: 899-906, 1985. 28 Himly M, Jahn-Schmid B, Dedic A, Kelemen P, Wopfner N, Altmann F, van Ree R, Brisa P, Richter K, Ebner C, Ferreira F. Art v 1, the major allergen of mugwort pollen, is a modular glyco-protein with a defensin-like and a hydroxyproline-rich domain. FASEB J 17: 106-108, 2003. 28A Nilsen, B. Μ., K. Sletten, M. O'Neill, B. Smestead Paulsen, und H. van Haibeek. 1991. Structural analysis of the glyco-protein allergen Art v II from pollen of mugwort (Artemesia vulgaris) . J. Biol. Chem. 266:2660-2668. 29 Wopfner N, Willeroidee M, Hebenstreit D, van Ree R, Aalbers M, Brisa P, Thalhamer J, Ebner C, Richter K, Ferreira F. Molecular and immunological characterisation of profilin from mugwort pollen. Biol Chem 383: 1779-1789, 2002. 29A Jimenez A, Moreno C, Martinez J, Martinez A, Bartolome B, Guerra F, Palacios R 1994. Sensitisation to sunflower pollen: only an occupational allergy? Int Arch Allergy Immunol 105:297-307. 29B Barderas R, Villalba M, Lombardero M, Rodriguez R. Identification and characterisation of Che a 1 allergen from Chenopodium album pollen. Int Arch Allergy Immunol 127: 47-54, 2002. 29C Carnis J, Fernändez-Caldas E, Casanovas M, Lahoz C, Coläs C. Immunochemical characterisation of Salsola kali pollen extracts. Allergy 56, Supplement 68: 274, 2001.

NACHGEREICHT ·· ·· · ···· ♦· ·· ····· ····· • · · ··· ·· ·· · • · · » ·♦·· · ··· ··· • * · · ··· · · - 36 - 29D Giuliani A, Pini C, Bonini S, Mucci N, Ferroni L, Vicari G: Isolation and purification of a major allergen from Parietaria officinalis pollen. Allergy 42: 434-440, 1987. 30 Smith,P.M., Suphioglu,C., Griffith,I.J., Theriault,K., Knox,R.B. und Singh,M.B. 1996. Cloning and expression in yeast Pichia pastoris of a biologically active form of Cyn d 1, the major allergen of Bermuda grass pollen. J. Allergy Clin. Immu-nol. 98:331-343. 31 Suphioglu, C., Ferreira, F. und Knox, R.B. 1997. Molecular cloning and immunological characterisation of Cyn d 7, a novel calcium-binding allergen from Bermuda grass pollen. FEBS Lett. 402:167-172. 31a Asturias JA, Arilla MC, Gomez-Bayon N, Martinez J, Martinez A, und Palacios R. 1997. Cloning and high level expression of Cynodon dactylon (Bermuda grass) pollen profilin (Cyn d 12) in Escherichia coli: purification and characterisation of the allergen. Clin Exp Allergy 27:1307-1313. 32 Mecheri, S., G. Peltre, und B. David. 1985. Purification and characterisation of a major allergen from Dactylis glomerata pollen: The Ag Dg 1. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78:283-289. 33 Roberts, A.M., L.J. Bevan, P.S. Flora, I. Jepson, und M.R. Walker. 1993. Nucleotide sequence of cDNA encoding the Group II allergen of Cocksfoot/Orchard grass (Dactylis glomerata), Dac g II. Allergy 48:615-623. 33a Guerin-Marchand,C., Senechal,H., Bouin,A.P., Leduc-Brodard,V., Taudou,G., Weyer,A., Peltre,G. und David,B. 1996. Cloning, sequencing and immunological characterisation of Dac g 3, a major allergen from Dactylis glomerata pollen. Mol. Immu-

NACHGEREICHT » Μ · ···· ·* #« « · · | · ····· • · · · · · · · ·· · • · · · ···· · ··· ·«· • t · · ··· · · - 37 -nol. 33:797-806. 34 Klysner, S., K. Welinder, H. Lowenstein, und F. Matthiesen. 1992. Group V allergens in grass pollen IV. Similarities in amino acid compositions and amino terminal sequences of the group V allergens from Lolium perenne, Poa pratensis and Dacty-lis glomerata. Clin. Exp. Allergy 22: 491-497. 35 Perez, M., G. Y. Ishioka, L. E. Walker, und R. W. Chesnut. 1990. cDNA cloning and immunological characterisation of the rye grass allergen Lol p I. J. Biol. Chem. 265:16210-16215. 36 Griffith, I. J., P. M. Smith, J. Pollock, P. Theerakulpisut, A. Avjioglu, S. Davies, T. Hough, Μ. B. Singh, R. J. Simpson, L. D. Ward, und R. B. Knox. 1991. Cloning and sequencing of Lol p I, the major allergenic protein of rye-grass pollen. FEBS Letters 279:210-215. 37 Ansari, A. A., P. Shenbagamurthi, und D.G. Marsh. 1989. Complete amino acid sequence of a Lolium perenne (perennial rye grass) pollen allergen, Lol p II. J. Biol. Chem. 264:11181-11185. 37a Sidoli,A., Tamborini,E., Giuntini,I., Levi,S., Volonte,G., Paini,C., De Lalla,C., Siccardi,A.G., Baralle,F.E., Galliani,S. und Arosio,P. 1993. Cloning, expression, and immunological characterisation of recombinant Lolium perenne allergen Lol p II. J. Biol. Chem. 268:21819-21825. 38 Ansari, A. A., P. Shenbagamurthi, und D. G. Marsh. 1989. Complete primary structure of a Lolium perenne (perennial rye grass) pollen allergen, Lol p III: Comparison with known Lol p I and II sequences. Biochemistry 28:8665-8670. 39 Singh, Μ. B., T. Hough, P. Theerakulpisut, A. Avjioglu, S.

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INACHGEREICHT

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NACHGEREICHT ·· ·· · ···· ·· ·· ♦ · · · · ····· * · · ··· · · ·· · • · · · ···· · ··· ··· • · · · ··· · f - 58 - 119 Mena, M., R. Sanchez-Monge, L. Gomez, G. Salcedo, und P. Carbonero. A major barley allergen associated with baker's asth-ma disease is a glycosylated monomeric inhibitor of insect al-pha-amylase: cDNA cloning and chromosomal location of the gene. Plant Molec. Biol. 20: 451-458, 1992. 119A Palosuo K, Varjonen E, Kekki OM, Klemola T, Kalkkinen N, Alenius H, Reunala T. Wheat omega-5 gliadin is a major allergen in children with immediate allergy to ingested wheat. J. Allergy Clin. Immunol. 108: 634-638, 2001. 119B Xu H, Theerakulpisut P, Goulding N, Suphioglu C, Singh M. B. Bhalla P. L. Cloning expression and immunological character-isation of Ory s 1, the major allergen of rice pollen. Gene 164: 255-259, 1995. 119C Pastorello EA, Ortolani C, Farioli L, Pravettoni V, Ispano M, Borga A, Bengtsson A, Incorvaia C, Berti C, Zanussi C. All-ergenic cross-reactivity among peach, apricot, plum, and cherry in patients with oral allergy syndrome: an in vivo and in vitro study. J. Allergy Clin. Immunol. 94: 699-707, 1994. 119D Diaz-Perales A, Tabar AI, Sanchez-Monge R, Garcia BE, Gomez B, Barber D, Salcedo G. Characterisation of asparagus allergens: a relevant role of lipid transfer proteins. J Allergy Clin Immunol 110: 790-796, 2002. 119E Galleguillos F, Rodriguez JC. Asthma caused by bromelin in-halation. Clin Allergy 8: 21-24, 1978. 119F Baur X. Studies on the specificity of human IgE-antibodies to the plant proteases papain and bromelain. Clin Allergy 9: 451-457, 1979. 119G Gailhofer G, Wilders-Truschnig M, Smolle J, Ludvan M. Asth-

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60 182, 2000 121C Asturias JA, Eraso E, Martinez A. 2000. Is tropomysoin an allergen in Anisakis? Allergy 55:898-890. 122 Christie, J. F., B. Dunbar, I. Davidson, und M. W. Kennedy. 1990. N-terminal amino acid sequence identity between a major allergen of Ascaris lumbricoides and Ascaris suum and MHC-re-stricted IgE responses to it. Immunology 69:596-602. 122A Baur X, König G, Bencze K, Fruhmann G. Clinical Symptoms and results of skin fest, RAST and bronchial provocation fest in thirty-three papain workers: evidence for strong immunogenic po-tency and clinically relevant 'proteolytic effects of airborne papain'. Clin Allergy 12: 9-17, 1982. 122B Onisuka R, Kamiya H, Muramoto K, Goto R, Inoue K, Kumamoto K, Nakajima Y, Iida S, Ishigami F. Purification of the major allergen of red soft coral (Dendronephthya nipponica). Int Arch Allergy Immunol 125: 135-143, 2001. 123 Czuppon AB, Chen Z, Rennert S, Engelke T, Meyer HE, Heber M, Baur X. The rubber elongation factor of rubber trees (Hevea bra-siliensis) is the major allergen in latex. J Allergy Clin Immu-nol 92:690-697, 1993. 124 Attanayaka DPSTG, Kekwick RGO, Franklin FCH. 1991. Molecular cloning and nucleotide sequencing of the rubber elongation factor gene from hevea brasiliensis. Plant Mol Biol 16:1079-1081. 125 Chye ML, Cheung KY. 1995. J 1,3-glucanase is highly ex-pressed in Laticifers of Hevea brasiliensis. Plant Mol Biol 26:397-402. 126 Alenius H, Palosuo T, Kelly K, Kurup V, Reunala T, Makinen-

NACHGEREICHT • · · · • · · · · • · · ♦··· • · · ·

61

Kiljunen S, Turjanmaa K Fink J. 1993. IgE reactivity to 14-kD and 27-kD natural rubber proteins in Latex-allergic children with Spina bifida and other congenital anomalies. Int Arch Al-lergy Immunol 102:61-66. 127 Yeang HY, Cheong KF, Sunderasan E, Hamzah S, Chew NP, Hamid S, Hamilton RG, Cardosa MJ. 1996. The 14.6 kD (REF, Hev b 1) and 24 kD (Hev b 3) rubber particle proteins are recognised by IgE from Spina Bifida patients with Latex allergy. J Allerg Clin Immunol in press. 128 Sunderasan E, Hamzah S, Hamid S, Ward MA, Yeang HY, Cardosa MJ. 1995. Latex B-serum J-l,3-glucanase (Hev b 2) and a component of the microhelix (Hev b 4) are major Latex allergens. J nat Rubb Res 10:82-99.

Die Kenntnis der Nukleinsäure-Sequenzen, die für diese Allergene codieren, ermöglicht ihre rekombinante Herstellung. Daher werden besonders diese Allergene bevorzugt bei Immuntherapien und bei Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set zur Evaluierung der Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums und/oder der klinischen Wirksamkeit einer Allergen-Immun-therapie für mindestens eine Allergie, umfassend - mindestens ein Allergen zum Induzieren einer Mediator-Freisetzung von Zellen, die den Mediator als Antwort auf ein Allergen freisetzen können, - Mittel zur Detektion des Mediators, und - gegebenenfalls mindestens einen Mediator-Standard.

Das hierin vorgesehene Set umfasst mindestens ein Allergen, welches zur Induktion der Freisetzung eines Mediators aus in einer Probe enthaltenen Mediator-freisetzenden Zellen verwendet werden kann. Der freigesetzte Mediator wird dann direkt oder vorzugsweise - nach dem Entfernen fester Teile der Probe - im Überstand der Reaktionsmischung nachgewiesen. Gegebenenfalls sind auch Mittel zur Detektion von IgE-Molekülen, die das Allergen binden, im Set gemäß der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. IgE ist fähig, ein bestimmtes Allergen zu binden und,

·♦ ·» · ···· ·· ·· ····· ····· • · · ··· · · ·· · • · · · ···· · ··· «·· ···· ··· · ♦ - 62 - wenn es an eine Mediator-freisetzende Zelle und das Allergen gebunden ist, die Freisetzung von Mediator aus diesen Zellen zu vermitteln. IgE, das für ein Allergen spezifisch ist, wird jedoch normalerweise nicht im Blut nachgewiesen und wird nur erzeugt, wenn eine Person gegen ein Allergen sensibilisiert wird. Um die Menge des Mediators in der Probe (für die Herstellung einer Standard-Kurve) genau zu bestimmen, kann ein Mediator-Standard gegebenenfalls Teil des Sets sein.

Vorzugsweise sind die Zellen Mastzellen und/oder basophile und/oder eosinophile Zellen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Allergen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Profilinen, insbesondere Phi p 12, Birken-All-ergenen, insbesondere Bet v 4, Staubmilben-Allergenen, insbesondere Der p2, Vorratsmilben-Allergenen, insbesondere Lep d 2, Wiesenlieschgras-Allergenen, insbesondere Phi p 7, und den in Tabelle 1 aufgezählten Allergenen.

Die Mittel zur Detektion von Mediatoren sind vorzugsweise Antikörper.

Ein wie oben erwähnter Mediator wird vorzugsweise durch immunologische Verfahren nachgewiesen. Daher kann das Set mindestens einen Antikörper vorsehen, der spezifisch einen Mediator binden kann. Vorzugsweise werden Enzyme-linked Immuno-Sorbens-Assays (ELISA), Radioimmunoassays (RIA) oder „Lateral Flow Devices" verwendet.

Die vorliegende Erfindung wird weiters durch die folgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht, ohne darauf eingeschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt den Zusammenhang zwischen den Ergebnissen einer intradermalen Endpunkt-Titration (x-Achse: Allergen-Konzentration, die die erste positive Reaktion ergibt) und rBet v 1-spezi-fischem Serum-IgE (y-Achse: kE/1 CAP System).

Fig. 2 zeigt den Zusammenhang zwischen den Ergebnissen einer basophilen Histamin-Freisetzung (x-Achse: Allergen-Konzentration, die 30% Histamin-Freisetzung ergibt) und rBet v 1-spezi-fischem Serum-IgE (y-Achse: kE/1 CAP System).

Fig. 3 zeigt den Zusammenhang zwischen den Ergebnissen einer intradermalen Endpunkt-Titration (x-Achse: Allergen-Konzentrati-on, die die erste positive Reaktion ergibt) und den Ergebnissen einer basophilen Histamin-Freisetzung (y-Achse: Allergen-Kon-

NACHGEREICHT ·· • ♦ · • · · • · ·

• · ♦ « • · • ·

63 zentration, die 30% Histamin-Freisetzung ergibt).

Fig. 4 zeigt den Zusammenhang zwischen Bet v 1-spezifischem IgE, mittels CAP bestimmt (x-Achse: kE/1) und rBet v 1-spezifischem IgE, mittels einer markierten alpha-Kette bestimmt (y-Achse: Zählungen pro Minute (counts per minute, c.p.m.); 1:5 Serum-Verdünnung .

BEISPIELE

Beispiel 1:

Die Vernetzung von an Effektor-Zellen (Mastzellen und Basophilen) gebundenen IgE-Antikörpern durch Allergene ist ein wesentlicher Vorgang für die Induktion der unmittelbaren Symptome der Typ I-Allergie (Kawakami T., et al., Nat. Rev. Immu-nol. (2002) 2:773-86). Wie in den klassischen Versuchen von Prausnitz und Küstner beschrieben (Prausnitz C., et al., Centralbe F Bact 1 Abt Orig (1921) 86:160-8), hängt dieser Vorgang von drei Haupt-Faktoren ab, d.h. Allergen-spezifischen IgE-Antikörpern, Effektor-Zellen und Allergenen. Weil die Charakterisierung der IgE-Antikörper die Entwicklung diagnostischer Tests für die Messung genauer Mengen der Allergen-spezifischen IgE-Antikörper ermöglicht, wurde in mehreren Untersuchungen der Zusammenhang der Allergen-spezifischen Serum-IgE-Mengen und der biologischen Empfindlichkeit auf Allergene bei allergischen Patienten erforscht (Stenius B., et al., Clin. Allergy (1971) 1:37-55; Bryant D.H., et al., Clin. Allergy (1975) 5:145-57; Pauli G., et al., Clin. Allergy (1977) 7:337-46; Bousquet J., et al., Clin. Allergy (1987) 17:529-36;

Witteman A.M., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1996) 97:16-25; Niederberger V., et al. J. Invest. Dermatol. (2001) 117:848-51; Norman P.S., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1973) 52:210-24; Lichtenstein L.M., et al. J. Allergy Clin. Immunol. (1971) 47:103 (A37)). Es ist wohlbekannt, dass das Vorhandensein von Allergen-spezifischem Serum-IgE eine Vorbedingung für das Auftreten einer Reaktion vom unmittelbaren Typ ist, doch ob die Menge des Allergen-spezifischen IgE mit der Empfindlichkeit vom unmittelbaren Typ gegen das bestimmte Allergen korreliert, war sehr umstritten. Um das Problem anzusprechen, wurden bei fast allen in der Vergangenheit durchgeführten Untersuchungen Allergen-Extrakte, d.h. Mischungen von Allergenen und nicht-allerge-nen Molekülen, verwendet. (Stenius B, et al., Clin Allergy (1971) 1:37-55; Bousquet J, et al., Clin Allergy (1987) 17:529- I naohgereicht \ 36; Norman PS, et al., J Allergy Clin Immunol (1973) 52:210-24; Lichtenstein LM, et al. J Allergy Clin Immunol (1971) 47:103 (A37)). Dies ist der Grund dafür, dass diese Untersuchungen den Zusammenhang zwischen Allergen-spezifischen IgE-Mengen und biologischen Aktivitäten auf molekularer Ebene nicht analysieren konnten. Jüngste Untersuchungen unter Verwendung gereinigter natürlicher und rekombinanter Allergene zur erneuten Erforschung der Beziehung zwischen Hautemfindlichkeit und Allergen-spezifischen IgE-Mengen berichten erhebliche Diskrepanzen zwischen diesen Parametern (Witteman A.M. et al., J. Allergy Clin. Immu-nol. (1996) 97:16-25; Niederberger V. et al., J. Invest. Dermatol. (2001) 117:848-51). In diesem Beispiel wurde gereinigtes rekombinantes Bet v 1, das Haupt-Birkenpollen-Allergen, als pa-radigmatisches Hilfsmittel zur weiteren Erforschung des Zusammenhanges zwischen Allergen-spezifischen IgE-Mengen,

Effektor-Zell-Antworten und in vivo-Empfindlichkeit verwendet.

In einer Population von 18 gegen Birkenpollen allergischen Patienten, die aufgrund wohldefinierter klinischer Kriterien ausgewählt wurden, und außerhalb der Pollen-Saison wurden die Hautempfindlichkeit und die basophile Degranulation als Antwort auf festgelegte Mengen von strukturell gefaltetem rekombinantem Bet v 1 quantifiziert. Die Ergebnisse der biologischen und der serologischen Tests wurden verglichen. Für die Messung der Bet v 1-spezifischen IgE-Antikörper-Mengen wurden zwei verschiedene Tests benützt: einer zur Detektion jeglichen Bet v 1-spezi-fischen IgEs, und der andere zur Detektion von Bet v 1-spezifischem IgE, das an Effektor-Zellen binden kann.

Material und Methoden

Population der Studie

Die Untersuchung der Patienten wurde zwischen Jänner und April, vor Beginn der Birkenpollen-Saison, durchgeführt.

Achtzehn Patienten, acht Frauen und 10 Männer im Alter zwischen 28 und 58 Jahren (mittleres Alter: 45,6 Jahre) wurden in der Studie auf Basis der klinischen Vorgeschichte einer Birken-Pollinose und positiver Haut-Prick-Tests auf Birkenpollen-Extrakt inkludiert. Bei allen Patienten war mindestens 3 Jahre zuvor eine moderate bis schwere Rhinokonjunktivitis erstmals diagnostiziert worden. Fünf Patienten hatten leichtes Asthma während der Birkenpollen-Saison und 12 Patienten hatten ein orales Allergie-Syndrom bei Früchten der Rosaceae-Familie (Apfel,

NACHGEREICHT «φ • · t • · · • · · • t · ♦ · · ···· ·· ·« • · · · · · t • ft · ·· ·· · • ···· Φ ··· ··· • · · · · · - 65 -

Pfirsich, Aprikose und Mandeln) und Gemüsen aus der Solanaceae-(Kartoffel, Tomate) und Apiaceae-Familie (Sellerie, Karotte). Skin-Prick-Tests mit einer Standard-Gruppe von Atemwegs-Al-lergenen (Stallergenes, Frankreich), bestehend aus Hausstaubmilben, Mischungen von Pilz-Allergenen, Hunde- und Katzen-Haut-schuppen, Schaben, Gras, Bäumen (einschließlich Birke, Olive und Esche) und Unkraut-Pollen wurden durchgeführt, um das Sensibilisierungs-Profil zu identifizieren. Die Patienten-Charakte-ristika sind in Tabelle 2 gezeigt.

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I NACHGEREICHT

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Gestaltung der Studie

Um den möglichen Zusammenhang zwischen Allergen-spezifischen IgE-Mengen, der Haut-Empfindlichkeit und der basophilen Degranu-lation zu analysieren, wurde den Patienten Blut entnommen und ihre Haut am selben Tag getestet. Die Analysen erfolgten strikt außerhalb der Birkenpollen-Saison, um Wirkungen auf Grund eines saisonbedingten Allergen-Kontakts auszuschließen. Die Patienten durften mindestens 1 Woche vor Durchführung der Studie keine anti-allergischen oder entzündungshemmenden Medikamente nehmen. Keiner der Patienten hatte während der letzten 5 Jahre eine Allergen-spezifische Immuntherapie erhalten. Nach Abgabe einer Einverständnis-Erklärung wurde Blut für eine basophile Histamin-Freisetzung und für Serum-Proben entnommen. Unmittelbar danach wurden intradermale Haut-Tests unter Verwendung der Endpunkt-Titrationsmethode durchgeführt (Grammer L.C., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1985) 76:123-7).

Detektion und Quantifizierung Allergen-spezifischer Antikörper rBet v 1-spezifische IgE-Mengen wurden unter Verwendung des Pharmacia CAP-Systems quantifiziert und als kE/1 ausgedrückt. Zusätzlich wurde eine 125I-markierte rekombinante alpha-Kette des Hochaffinitäts-FceRI zur Quantifizierung von Bet v 1-spezifischem IgE in einem Test auf RAST-Basis unter den Bedingungen eines Allergen-Überschusses verwendet. Die gereinigte alpha-Kette wurde mit Iod markiert unter Verwendung der Chloramin-T-Methode (Sambrook J., et al., Molecular cloning. Cold Spring Harbor:

Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Laffer S. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (2001) 108:409-16). Auf Nitrozellulose aufgepunktetes rBet v 1 (2mg pro Punkt) wurde zwei Serum-Verdünnungen (1:5 und 1:10) der Seren der allergischen Patienten in 50 mMol Natriumphosphat, pH 7,5, das 0,5% Gew./Vol. BSA, 0,5% V/V Tween 20 und 0,05% NaN3 wie beschrieben enthielt (Valenta R. et al., J. Exp. Med. (1992) 175:377-85), ausgesetzt. Die gebundenen IgE-Antikörper wurden mit mit 125I markierter alpha-Kette (100 000 Zählungen pro Minute (cpm)/ml) durch Inkubation über Nacht nachgewiesen und mittels gamma-Zählung quantifiziert. Alle Bestimmungen erfolgten im Duplikat, und die Ergebnisse sind in Mittelwerten (cpm) mit einer Abweichung von weniger als 10% ausgedrückt .

Die Mengen der Allergen-spezifischen Unterklassen IgGl bis

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IgG4 sowie die Mengen des Allergen-spezifischen IgM und IgA wurden mittels ELISA unter Verwendung von Isotypen-spezifischen monoklonalen Antikörpern, wie beschrieben (Vrtala S. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1996) 97:781-7), gemessen. Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte von Duplikat-Bestimmungen dar und sind als OD-Werte gezeigt, die der Menge der gebundenen Antikörper entsprechen.

Basophiler Histamin-Freisetzungs-Test

Der Challenge von Vollblut mit rBet v 1 und anti-IgE als positive Kontrolle wurde in Dosis-Antwort-Form gemäß dem von Tani-saki et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt (Tanisaki Y., et al., Int. Arch'. Allergy Appl. Immunol. (1984) 73:141-5). Zehn Milliliter venöses Blut wurden in eine Plastik-Spritze, die 1 ml Heparin enthielt, aufgezogen. 250 μΐ verschiedener Konzentrationen von rBet v 1 (von 10'4 bis 10 mg/ml) oder anti-IgE (von IO"4 bis 10'3; ε-spezifisch, Dako, Glostrup, Dänemark) wurden in die Teströhrchen zugegeben, die^500 ml Vollblut enthielten, das 1:4 in Tris-Puffer (10 mMol/1 Tris, 136 mMol/1 NaCl, 2,7 mMol/1 KCl, 0,23 mMol/1 MgCl2, 1,8 mMol/1 CaCl2, 5,5 mMol/1 Glucose; pH 7,3) verdünnt war. Die gemischte Lösung wurde 30 min lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt, und die Zellen wurden durch 5-minütiges kaltes Zentrifugieren (4°C) bei 375 x g abgetrennt. 200 μΐ des zellfreien Überstands wurden für die Histamin-Quantifizierung in einem Radioimmunoassay mit acy-lierten monoklonalen Histamin-Antikörpern (Immunotech,

Marseille, Frankreich) verwendet, wie früher beschrieben (Morel A.M., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1988) 82:646-54). Das gesamte Histamin wurde nach Zelllyse durch wiederholtes Auftauen und Gefrieren gemessen. Alle Versuche wurden im Duplikat vorgenommen. Die verwendeten Parameter zur Beschreibung des Grades der basophilen Empfindlichkeit war die niedrigste Allergen-Konzentration, die 30% der gesamten Histamin-Freisetzung induzierte.

Intradermales Testen

Intradermale Schwellen-Hauttests wurden durch Injektion von 0,03 ml 10-facher Verdünnungen von rBet v 1 am seitlichen Teil des Armes durchgeführt. Serien-Verdünnungen wurden aus einer Lösung von 1000 mg/ml zubereitet, und die erste getestete Verdünnung war 10 mg/ml. Die Tests wurden 15 min nach der Injektion abgelesen. Die Fläche der Quaddel und des Erythems wurden aufge- NACHGEREICH f j • Λ ΦΦΦΦ ΦΦ • Λ ΦΦΦΦ ΦΦ Φ Φ

Φ Φ 69 zeichnet. Der Test wurde als positiv angesehen, wenn die induzierte Quaddelfläche größer war als die durch Injektion induzierte Quaddel, und die niedrigste Konzentration des Allergens, die ein positives Test-Ergebnis hervorrief, wurde zum Vergleich mit anderen Parametern verwendet (Grammer L.C., et al., J. All-ergy Clin. Immunol. (1985), 76:123-7).

Statistische Analyse der Daten

Die Korrelation zwischen verschiedenen Parametern wurde mittels Spearman s-nicht-parametrischer Tests unter Verwendung der VisualStats Professional Software (Version 2003) getestet.

Ergebnisse

Geringer Zusammenhang zwischen rBet v 1-spezifischen Immunglobulin E-Mengen und Haut-Empfindlichkeit gegen rBet v 1

Um die rBet v 1-spezifischen IgE-Mengen und die Haut-Empfindlichkeit zu vergleichen, wurden rBet v 1-spezifische IgE-Mengen mittels CAP gemessen und mit der Schwellen-Konzentration von rBet v 1, die eine positive Quaddel-Reaktion im intradermalen Test induzierte, korreliert. Fig. 1 zeigt, dass kein Zusammenhang zwischen Allergen-spezifischen IgE-Mengen und der Haut-Empfindlichkeit (r=-0,007, P=0,977) besteht. Bei einzelnen Patienten wurde eine starke Diskrepanz zwischen Allergen-spezi-fischem IgE und der Haut-Empfindlichkeit beobachtet. Beispielsweise wies Patient 8 eine hohe Bet v 1-spezifische IgE-Menge (79,9 kE/1) auf, zeigte aber eine positive ID-Reaktion erst bei 10 pg/ml rBet v 1 (Tabelle 1). Anderseits hatte Patient 10 geringes rBet v 1-spezifisches IgE (4,5 kE/1), jedoch bei einer 1000-fach höheren Haut-Empfindlichkeit gegen Bet v 1 (positive ID-Test-Reaktion bei 1 ng/ml rBet v 1) als Patient 8. Sieben Patienten (2, 5, 7, 9, 11, 12 und 17) mit ähnlichen rBet v 1-spe-zifischen IgE-Mengen (17,1 26,6 kE/1) wiesen einen extrem breiten Bereich der Haut-Empfindlichkeit gegen rBet v 1 auf (von 3 bis 10'5 pg/ml) (Tabelle 1).

Geringer Zusammenhang zwischen rBet v 1-spezifischen Immunglobulin E-Mengen und rBet v 1-verwandter basophiler Empfindlichkeit

Fig. 2 (IgE vs. 30% Histamin-Freisetzung) zeigt, dass auch ein Zusammenhang zwischen rBet v 1-spezifischen IgE-Mengen und durch Bet v 1-induzierter basophiler Empfindlichkeit fehlt (Fig. 2: r=-0,113, P=0,656). Die Konzentration von rBet v 1, die notwendig war, um 30% Histamin-Freisetzung zu induzieren, vari-

• · · · · · - 70 - ierte von IO”3 bis 1 pg/ml. Für gegebenen Mengen an rBet v 1-spe-zifischem IgE (RAST Klasse 3: 4,51 17,1 kE/1) variierte die Konzentration von rBet v 1, die 30% Histamin-Freisetzung induzierte, 1000-fach (1-10”3 pg/ml) .

Zusammenhang zwischen rBet v 1-induzierter basophiler Histamin-Freisetzung und Haut-Empfindlichkeit

Fig. 3 zeigt, dass die Ergebnisse des intradermalen Testens und der basophilen Histamin-Freisetzungs-Tests mehr Zusammenhängen als die Ergebnisse serologischer und biologischer Tests.

Es gibt einen signifikanten Trend zwischen den Konzentrationen von rBet v 1, die 30% Histamin-Freisetzung hervorrufen, und intradermalen Quaddel-Reaktionen (r=0,614; P=0,007). Patienten mit einem extrem schlechten Zusammenhang zwischen rBet v 1-spezi-fischen IgE-Mengen und Ergebnissen biologischer Tests (z.B. Patienten 8 und 10) zeigten einen besseren Zusammenhang, wenn intradermale Test-Ergebnisse mit basophiler Histamin-Freisetzung verglichen wurden (Tabelle 1). Die Ergebnisse anderer Tests, die durchgeführt wurden, um die Diskrepanzen zwischen serologischen und biologischen Tests zu erklären, sind nachstehend angegeben.

Messungen von alpha-Ketten-gebundenem rBet v 1-spezifischem Immunglobulin E

Um zu untersuchen, ob die Anwesenheit von biologisch inaktivem IgE (z.B. alpha-Ketten-gebundenes IgE) im Serum für die Diskrepanz zwischen Allergen-spezifischen IgE-Mengen und zellulärer sowie in vivo-Sensitivität verantwortlich sein könnte, wurde eine markierte alpha-Kette für die Quantifizierung von Allergen-spezifischem IgE verwendet (Tabelle 1). Es wurde eine gute Korrelation zwischen den Mengen an rBet v 1-spezifischem IgE, wie mittels CAP-Messungen und durch Verwendung markierter alpha-Ketten bestimmt wurde, beobachtet [für 1:5-Verdünnung r=0,888; P=0,000 (Fig. 4) und für 1:10-Verdünnung r=0,626; P=0,005]. Es wurde keine Verbesserung der Korrelation zwischen rBet v 1-spezifischen IgE-Mengen, die mit markierter alpha-Kette bestimmt wurden, und den Ergebnissen der Haut-Empfindlichkeit (für 1:5-Verdünnung: r=-0,108; P=0,670; für 1:10-Verdünnung: r= -0,013; P=0,958) oder zwischen rBet v 1-spezifischen IgE-Mengen, die mit markierter alpha-Kette bestimmt wurden, und den Histamin-Freisetzungs-Tests beobachtet (für 1:5-Verdünnung: r=-0,229; P=0,360 und für 1:10-Verdünnung: r=-0,305; P=0,219).

Messungen von rBet v 1-spezifischen Immunglobulin G-Unter- | bachqereicht

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klassen, Immunglobulin A und Immunglobulin M

Es wurde beschrieben, dass die Seren von auf Bet v 1 allergischen Patienten Bet v 1-spezifische IgG-Antikörper enthalten, die die IgE-Bindung an Bet v 1 stören könnten oder andere Epi-tope am Bet v 1-Molekül als IgE erkennen könnten und folglich keine Auswirkung auf die IgE-Bindung an Bet v 1 haben (Visco V., et al., J. Immunol. (1996) 157:956-62; Denepoux S., et al. FEBS Lett. (2000) 465:39-46). Daher wurden die Mengen an rBet v 1-spezifischem IgG bestimmt (IgGl-IgG4; Tabelle 1). Die Patienten wiesen verschiedene rBet v 1-spezifische IgGl-IgG4-Unterklassen-Reaktionen auf, wobei die stärksten Reaktionen in den Unterklassen IgGl und IgG4 waren. Es wurden keine signifikanten Mengen an rBet v 1-spezifischen IgA und IgM-Antikörpern in den Seren nachgewiesen, was die Möglichkeit ausschließt, dass diese Antikörper-Klassen die IgE-Erkennung von Bet v 1 beeinflussen könnten.

Evaluierung von Bet v 1-spezifischem Immunglobulin E als Prozentsatz des gesamten Immunglobulin E

Wenn Bet v 1-spezifisches IgE nur einen geringen Prozentsatz des gesamten IgE ausmacht, könnte die schwache Histamin-Freisetzung und Haut-Reaktivität dadurch erklärt werden, dass Basophile und Mastzellen vor allem durch IgE besetzt sind, das gegen andere Allergene gerichtet ist. Daher wurden die Gesamt-IgE-Werte bestimmt und der Prozentsatz des Bet v 1-spezifischen IgE berechnet. Die Patienten in diesem Beispiel hatten relativ niedrige Gesamt-IgE-Werte (<168kE/l), und es wurde kein Zusammenhang zwischen einem geringen Prozentsatz an Bet v 1-spezifischem IgE und schwachen biologischen Reaktionen gefunden. Beispielsweise machte bei Patient 11, der eine hohe Empfindlichkeit zeigte, das Bet v 1-spezifische IgE nur 20% des gesamten IgE aus. Anderseits war Patient 13 weniger empfindlich, obwohl 62,6% des gesamten IgE gegen Bet v 1 gerichtet waren (Tabelle 1).

Diskussion

Die Frage, ob Allergen-spezifische IgE-Antikörper-Mengen,

Effektor-Zellen-Empfindlichkeiten und die klinische Empfindlichkeit korrelieren, bleibt umstritten. Mehrere Untersuchungen zeigten eine signifikante Korrelation von Allergen-spezifischen Serum-IgE-Antikörpern mit Allergen-induzierten Reaktionen vom unmittelbaren Typ selbst dann, wenn eine komplexe Mischung verschiedener allergener und nicht-allergener Komponenten verwendet

NACHGEREICHT • · φ» · ···· ·· ·♦ • · φ» · ···· ·· ·♦

- 72 - wurde, welche es schwer machen, Hauttests und RAST zu vergleichen (Stenius B., et al., Clin. Allergy (1971) 1:37-55; Bousquet J., et al., Clin Allergy (1987) 17:529-36; Norman, P.S., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1973) 52:210-24; Lichtenstein L.M. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1971) 47:103 (A37)). Kürzlich zeigten andere Untersuchungen unter Verwendung gereinigter Allergene (Witteman A.M., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1996) 97:16-25) und rekombinanter Allergene (Niederberger V, et al. J. Invest. Dermatol. (2001) 117:848-51) beträchtliche Diskrepanzen zwischen Antikörpermengen und biologischer Empfindlichkeit.

Eine klinische Studie unter Verwendung eines bestimmten gereinigten und strukturell gefalteten Allergens (z.B. dem Haupt-Birkenpollen-Allergen, Bet v 1) zur Untersuchung des Verhältnisses zwischen spezifischem IgE, Basophilen-Degranulation und Hautempfindlichkeit auf molekularer Ebene wurde durchgeführt.

Man fand eine gute Übereinstimmung zwischen den drei Methoditee»* und der klinischen Relevanz der Birken-Empfindlichkeit; jedoch wurden große Diskrepanzen zwischen den Mengen an Allergen-spezi-fischem IgE, der Basophilen-Empfindlichkeit und der Empfindlichkeit in vivo (d.h. der Haut-Empfindlichkeit, wie mittels Endpunkt-Titration bestimmt) festgestellt. Bei bestimmten Patienten wurden sehr geringe spezifische IgE-Mengen, jedoch eine hohe Empfindlichkeit bei der Basophilen-Degranulation und den Hauttests, und umgekehrt, beobachtet. Eine Überprüfung der Literatur offenbart die geringe Anzahl von Studien, die Hauttests, basophile Histamin-Freisetzung und die spezifischen IgE-Mengen vergleichen. Die wenigen zur Verfügung stehenden Studien zeigten sehr unterschiedliche Ergebnisse und wurden mit rohen Allergen-Extrakten durchgeführt. Beispielsweise stellten Norman et al. (Norman P.S., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1973) 52:210-24) fest, dass die drei Tests hinsichtlich der Diagnose von Ambrosiei „ragweed") -Heuschnupfen untereinander gut übereinstimmten. Lichtenstein et al. (Lichtenstein L.M., et al. J. Allergy Clin. Immunol. (1971) 47:103(A37)) stellten eine quantitativ signifikante Beziehung zwischen Hauttests und Histamin-Freisetzung fest. Bei diesem Beispiel wurde jedoch keine Messung von spezifischem IgE durchgeführt. Die Reaktion sensibilisierter Leukozyten und Mastzellen auf ein Antigen kann von einer großen Vielfalt von Faktoren abhängen.

Eine Möglichkeit für eine niedrige Sensibilität und eine

MACHGEREICHT geringe Freisetzung von Histamin wäre, dass nur ein geringer Anteil des gesamten Serum-IgE das Allergen-spezifische IgE ausmacht. Daher wurden die IgE-Gesamtmengen bestimmt und der Prozentsatz von Allergen-spezifischem IgE berechnet. Man fand jedoch eine Verbindung zwischen niedrigen Prozentsätzen Allergen-spezifischer IgE-Reaktionen und einer geringen biologischen Aktivität. Die Möglichkeit, dass ein niedriger Prozentsatz des spezifischen IgE aus dem gesamten IgE für geringe biologische Reaktionen gegenüber dem bestimmten Allergen verantwortlich sein könnte, kann bei polysensibilisierten Subjekten von größerer Wichtigkeit sein (Norman P.S., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1973) 52:210-24; Conroy M.C., et al., J. Immu-nol. (1977) 118:1317-21; MacGlashan D.W. Jr., et al., J. Immunol. (1986) 136:2231-9).

Um sich mit der Möglichkeit zu befassen, dass die Diskrepanz zwischen Allergen-spezifischen IgE-Mengen und biologischen Test-Ergebnissen auf das Vorhandensein Allergen-reaktiver IgE-Anti-körper, die nicht an Mastzellen und Basophile binden können und daher keine Freisetzung der biologischen Mediatoren induzieren, zurückzuführen sein könnte, wurden auch IgE-Messungen mit gereinigter rekombinanter alpha-Kette der Hochaffinitäts-FceR für IgE durchgeführt. Dies beruhte auf der Annahme, dass die alpha-Kette biologisch aktives IgE detektiert, das an FcsRI an Effektor-Zellen binden und eine Mediator-Freisetzung induzieren kann. Weiters kann in Seren vorhandener löslicher FcsRI an IgE binden und eine biologisch inaktive Form von IgE erzeugen. Die Ergebnisse Allergen-spezifischer IgE-Messungen, die mit gereinigter alpha-Kette durchgeführt wurden, zeigten auch das Fehlen einer Verbindung zwischen der Größe der IgE-Mengen und der biologischen Empfindlichkeit. Eine andere Möglichkeit, die man derzeit nicht ausschließen kann, ist, dass Allergen-spezifische Antikörper einer anderen Klasse als IgE die Bindung für Allergene störte.

Es gibt mehrere andere Faktoren, die für die Diskrepanz zwischen Allergen-spezifischen IgE-Mengen und den biologischen Reaktionen verantwortlich sein können, aber sie können nicht angesprochen werden, nicht einmal in in einem System, bei welchem gereinigte Allergene verwendet werden. Sie umfassen interindividuelle Unterschiede in den Basophilen- und Mastzellen-Emp-findlichkeiten wegen der Variabilität der IgE-Rezeptor-Zellober- NACHGEREICHT ! ·· ·· · ···· ·· ·♦ ····· · · · · · • · · ··· ·· t · · • · · · ···· · ··· ··· ···· ··· · · -*74**- flächen-Dichte, einem Parameter, der durch Serum-IgE-Mengen reguliert wird (Conroy M.C., et al., J. Immunol. (1977) 118:1317-21; Malveaux F.J., et al., J. Clin. Invest. (1978) 62:176-81; Dembo M., et al., J. Immunol. (1978) 121:345-53; MacGlashan D.W. Jr., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1999) 104:492-8). Verschiedene Zell-Empfindlichkeiten wurden durch variable Verschiebungen der Dosis-Antwort-Kurven gezeigt (gemessen mit 50% oder 30% Empfindlichkeit) im Falle ähnlicher Gesamt- und Äntigen-spe-zifischer IgE-Serum-Konzentrationen (Conroy M.C., et al., J. Immunol. (1977) 118:1317-21; MacGlashan DW Jr., J. Allergy Clin. Immunol. (1993) 91:605-15).

Weiters zeigte es sich, dass Personen mit äquivalenten Anzahlen von IgE-Molekülen auf Basophilen 0-100% ihres Histamin-Gehalts freisetzen können (Conroy M.C., et al., J. Immunol. (1977) 118:1317-21). Dasselbe wurde für Haut-Mastzellen beobachtet (Petersen L.J., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1996) 97:672-9; Bordignon V., et al., Invest. Allergol. Clin. Immunol. (2000) 10:78-82). Außerdem zeigte es sich, dass frühe Signal-Ereignisse stattfinden, an welchen Sykkinase und IP3-Produkte beteiligt sind, welche nicht mit der Menge an spezifischem IgE oder der Basophilen-Empfindlichkeit in Verbindung stehen (MacGlashan D.W. Jr., J. Allergy Clin. Immunol. (1993) 91:605-15; Miura K., et al., J. Immunol. (2001) 167:7027; MacGlashan D.W. Jr., J. Immunol. (2003) 170:4914-25). Jüngste Beweise lassen darauf schließen, dass Mastzellen auch über Toll-like-Rezeptoren beeinflusst sein können (Marshall J.S., et al., Int. Arch. Allergy Immunol. (2003) 132:87-97). Das für die Versuche verwendete rBet v 1-Präparat enthielt jedoch keine Endotoxine.

Schließlich ist es noch möglich, dass das Vorhandensein von IgE-Antikörpern mit verschiedenen Affinitäten oder Bindungs-Spezifitäten für Epitope, die unterschiedliche anaphylaktische Aktivität induzieren, die serologischen und biologischen Testergebnisse beeinflusst haben könnte.

Zusammenfassend zeigt diese Studie auf molekularer Ebene, dass Allergen-spezifische Serum-IgE-Mengen nicht unbedingt mit der biologischen Empfindlichkeit in Beziehung stehen müssen, wie mittels Zell- und in vivo-Tests festgestellt wurde. Man fand jedoch einen moderaten Zusammenhang zwischen den Haut-Tests und den basophilen Histamin-Freisetzungs-Tests. NACHGEREiC;.. ···· *»

• f · # · ♦ · · · · • ·♦♦ ♦·· - 75 -

Beispiel 2:

Um die Empfindlichkeit eines Patienten vor der Therapie zu bestimmen, um die Wahl der richtigen Dosis zu ermöglichen, wird ein Vollblut-Basophilen-Histamin-Freisetzungs-Test verwendet. Hochempfindliche Patienten bekommen geringere Dosen injiziert als weniger empfindliche Patienten. Vor der Behandlung wird eine Dosis-Antwort-Kurve mit gereinigtem Allergen erstellt. Parallel dazu werden Zellen mit anti-IgE stimuliert, um die gesamte Zell-Empfindlichkeit zu bestimmen, die die Empfindlichkeit gegenüber dem Allergen beeinflussen kann. Der Erfolg der Behandlung sollte kontrolliert werden, nachdem IgG-Antikörper gegen das Allergen nachweisbar werden, was gewöhnlich nach 4-8-wöchiger Behandlung der Fall ist. Da die Blockierung von IgG-Äntikörpern für die Verringerung der Empfindlichkeit verantwortlich sein kann, kann es günstig sein, parallel dazu die IgG-Mengen gegen das bestimmte Allergen zu bestimmen. Wiederum wird eine Dosis-Antwort mit dem gereinigten Allergen und anti-IgE bestimmt. Entweder wird die Dosis, die die maximale Zell-Aktivierung ergibt (d.h., die maximale Histamin-Freisetzung oder CD203c-Aufwärtsregulierung) verglichen, oder es wird die Dosis festgestellt, die einen bestimmten Grad an Aktivierung ergibt, und mit dem vor Behandlung erhaltenen Testergebnis verglichen. Die Materialien und Methoden sind so wie in Beispiel 1 beschrieben.

NACHGEREICHT

Claims (24)

1. • ···· ·· ·· • · · · · · · • ·· · · · · · • ···· · ··· ··· • · · · · · - 76 - Patentansprüche: 1. Verfahren zur Evaluierung der Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums und/oder der klinischen Wirksamkeit einer Al-lergen-Immuntherapie, umfassend die Schritte - Vorsehen von mindestens zwei Proben von einem Individuum, das einer Immuntherapie mit mindestens einem reinen Allergen oder einem Derivat davon unterzogen wurde oder unterzogen werden soll, wobei die Proben Zellen enthalten, die Mediatoren als Antwort auf dieses Allergen freisetzen können, - Kontaktieren der Probe mit dem Allergen oder dem Derivat davon, und - Bestimmen der Mengen der aus der Probe freigesetzten Mediatoren und Evaluieren der Allergen-Empfindlichkeit des Individuums vor der Therapie und/oder der klinischen Wirksamkeit der Immuntherapie durch Vergleichen dieser Mengen.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mediatoren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Histamin, Tryptase, Prostaglandinen, Leukotrienen, insbesondere Cy-steinyl-Leukotrienen, kationischem eosinophilem Protein, Cytokinen, wie Interleukinen (IL), insbesondere IL-2R, CD63, CD203c und Kombinationen davon.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Blut oder Fraktionen davon, Bindegewebe, Nasen-, Bronchien-, Haut- oder Darm-Biopsie-Material ist.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen aus der Probe isoliert werden.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Mast- und/oder basophile und/oder eo sinophile Zellen sind.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe weiters Immunglobuline (lg), insbesondere Immunglobulin G (IgG) umfasst.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn- I nachgereioht ···· ·· • ·

   • · • · · ··· ··· • ' · 77 ·· zeichnet, dass die Proben vorgesehen werden, bevor und nachdem das Individuum einer Immuntherapie unterzogen wurde.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn zeichnet, dass die Proben vorgesehen werden, nachdem das Indivi duum einer Immuntherapie unterzogen wurde.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, dass die mindestens eine Probe vorgesehen wird nach einem Maximum von 1 Stunde, 12 Stunden, 24 Stunden, 10 Tagen, 4 Wochen, 6 Monaten und 36 Monaten, nachdem das Individuum einer Immuntherapie unterzogen wurde.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen rekombinant erzeugt wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen mindestens eine Deletion, mindestens eine Substitu tion oder mindestens eine Insertion umfasst.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen durch Umordnen („reshuffling") der Fragmente des Allergens mittels Gentechnik modifiziert wird.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit verschiedenen Konzentrationen des Allergens kontaktiert wird.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Allergens ausgewählt wird im Bereich von lng/ml bis 100pg/ml, vorzugsweise im Bereich von lpg/ml bis 10pg/ml.
15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass weiters die gesamte Menge des Mediators der Zellen bestimmt wird.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Grad der zellulären Sensibilisierung definiert wird durch Bestimmen der Konzentration des Allergens, die die Freisetzung Inachgerbc ·»·· ·· • · · · · ····· ♦ · · ··· ·· · · · • · · · »··· · ··· ··· • » t · · · · · · von 10%, vorzugsweise 30%, der Gesamtmenge des Mediators der Zellen induziert.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums und/oder die klinische Wirksamkeit einer Allergen-Immuntherapie durch Beobachten des Grades der zellulären Sensibilisierung im Verlauf der Immuntherapie evaluiert wird.
18. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mediator in der Probe durch ein immunologisches und/oder ein chromatographisches Verfahren bestimmt wird.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Radioimmunoassay (RIA), Enzyme-linked Immunosorbens-Assay (ELISA) , Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, Immunfluoreszenz-Strö-mungs-Zytometrie und Kombinationen davon.
20. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen ausgewählt wird aus der Gruppe der Profiline, insbesondere Phi p 12, Birken-Allergene, insbesondere Bet v 4, Staubmilben-Allergene, insbesondere Der p2, Vorratsmilben-Allergene, insbesondere Lep d 2, Wiesenlieschgras-Allergene, insbesondere Phi p 7.
21. 21. Set zur Evaluierung der Allergen-Empfindlichkeit eines Individuums oder der klinischen Wirksamkeit einer Allergen-Immuntherapie für mindestens eine Allergie, umfassend - mindestens ein Allergen zum Induzieren einer Mediator-Freisetzung von Zellen, die den Mediator als Antwort auf ein Allergen freisetzen können, - Mittel zur Detektion des Mediators, und - gegebenenfalls mindestens einen Mediator-Standard.
22. 22. Set nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Mastzellen und/oder basophile und/oder eosinophile Zellen sind. I nachgereicht • · · · • · · · · m · · ····

    ··♦ 79
23. 23. Set nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Profilinen, insbesondere Phi p 12, Birken-Allergenen, insbesondere Bet v 4, Staubmilben-Allergenen, insbesondere Der p2, Vorrats-milben-Allergenen, insbesondere Lep d 2, Wiesenlieschgras-Allergenen, insbesondere Phi p 7.
24. 24. Set nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Detektion des Mediators ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern.